EP3568405A1 - Peptide immunomodulateur - Google Patents

Peptide immunomodulateur

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Publication number
EP3568405A1
EP3568405A1 EP18701784.3A EP18701784A EP3568405A1 EP 3568405 A1 EP3568405 A1 EP 3568405A1 EP 18701784 A EP18701784 A EP 18701784A EP 3568405 A1 EP3568405 A1 EP 3568405A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
peptide
amino acid
acid sequence
amino acids
Prior art date
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Pending
Application number
EP18701784.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Khaddouj BENMOUSSA
Elsa BONNAFE
Agnès COSTE
Jérôme Leprince
Bernard Pipy
Michel TREILHOU
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Rouen
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut National Universitaire Jean Francois Champollion
Universite de Toulouse
Original Assignee
Universite de Rouen
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Institut National Universitaire Jean Francois Champollion
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Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Rouen, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Toulouse III Paul Sabatier, Institut National Universitaire Jean Francois Champollion filed Critical Universite de Rouen
Publication of EP3568405A1 publication Critical patent/EP3568405A1/fr
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an isolated peptide, a pharmaceutical composition comprising this peptide and the use of this peptide or composition as a medicament, especially as an anti-infective or anti-cancer agent.
  • One of these strategies is aimed at activating the immune system with the development of immunomodulatory agents capable in particular of reinforcing the action of the immune system against pathogens.
  • the inventors have discovered that the peptide P17 and its derivatives exhibit immunomodulatory activity.
  • the peptide P17 is a peptide present in the venom of the ants Tetramorium bicarinatum. This 13 amino acid peptide was described by Rifflet et al. (Identification and characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium bicarinatum, Peptides 2012 Dec; 38 (2): 363-70) but had not shown any interesting properties. In particular, it had shown no antibacterial property in vitro.
  • P17 and its derivatives increase the release of pro-inflammatory cytokines and promote the secretion of oxygen free radicals.
  • the immunomodulation generated by P17 and its derivatives is such as to eliminate pathogens such as yeast C. albicans and to reduce the proliferation of cancer cells by macrophages derived from human monocytes thus polarized.
  • This immunomodulation is mediated by lectin type C receptors such as the mannose receptor or dectin 1 which mediate the innate immune response against many pathogens.
  • lectin type C receptors such as the mannose receptor or dectin 1 which mediate the innate immune response against many pathogens.
  • These receptors recognize molecular motifs, such as glucans, present on the surface of many pathogens and abnormally expressed on the surface of cancer cells.
  • P17 and its derivatives are therefore particularly promising candidates for the treatment or the prevention of numerous pathologies such as fungal, bacterial, viral or cancerous pathologies.
  • the subject of the present invention is an isolated peptide consisting of a 3 to 39 amino acid sequence derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of :
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising:
  • the present invention also relates to an isolated peptide for use as a medicament; the isolated peptide consisting of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the present invention relates to an isolated peptide consisting of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) sequences of 3 to 39 amino acids comprising at least residues 6 to 8 of SEQ ID NO: 1 and
  • the percent identity of an amino acid sequence is defined as the percentage of amino acid residues in a sequence to be compared that are identical to a reference sequence after sequence alignment, introducing gaps if necessary, to obtain a maximum sequence identity.
  • Sequence alignment to determine the percent identity of a sequence can be achieved in a variety of ways known to those skilled in the art, for example using available public software such as BLAST (Altschul et al, J. Mol Biol., 1990, 215, 403-). This software is preferably used with default settings.
  • said isolated peptide consists of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the peptides according to the invention may have from 3 to 30, from 3 to 26, or more preferably from 5 to 20 amino acids or even more preferably 5 to 15 amino acids.
  • the isolated peptide may have 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 acids amines.
  • said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the peptides according to the invention comprise at least residues 1, 2, 3, 4, 5 or 6 to 8, 9, 10, 11, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1 or have sequences of amino acids having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said peptides comprising at least residues 1, 2, 3, 4, 5 or 6 to 8, 9, 10, 1 1,
  • the peptides according to the invention comprise at least residues 1, 2, 3, 4, 5 or 6 to 8, 9, 10, 11, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1.
  • the peptides have at least 95% identity with said sequence defined above.
  • the peptide is capable of binding to the macrophage membrane derived from monocytes. It can trigger signaling pathways responsible for the production of cytotoxic mediators.
  • the peptide is capable of inducing the production of oxygen free radicals and IL-1 ⁇ by macrophages derived from monocytes.
  • the ability of peptides to induce the production of oxygen free radicals and IL-1 ⁇ can easily be measured by a person skilled in the art. Such tests are described in particular in the Materials and Methods section described below.
  • the peptide consists of a sequence of 5 to 15 amino acids comprising at least residues 5 to 9 of the amino acid sequence SEQ ID NO: 1.
  • the peptide consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, and
  • the peptide consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the peptides are recombinant or synthetic peptides.
  • the peptides may be prepared by standard techniques known to those skilled in the art, in particular by solid or liquid phase synthesis or by expression of a recombinant DNA in a suitable cellular system (eukaryotic or prokaryotic).
  • a suitable cellular system eukaryotic or prokaryotic.
  • the peptides can be synthesized in the solid phase originally described by Merrifield et al (J. Am Chem Soc, 1964, 85: 2149-2154) according to the Fmoc technique and purified by reversed-phase high performance liquid chromatography.
  • peptides are synthetic peptides.
  • the invention encompasses the peptides according to the invention which have undergone a modification since said peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the invention notably encompasses natural or synthetic variant peptides obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the sequence of P17 (SEQ ID NO: 1) since said peptide derived from P17 retains its immunomodulatory properties.
  • the peptides can be amidated at the C-terminal.
  • the peptides can be N-terminal acylated.
  • the peptides are amidated at the C-terminal.
  • C-terminal amide is conventionally meant the presence of an NH 2 group at the C-terminus of the peptide (unsubstituted primary amide).
  • the invention also relates to the C-terminal modified peptides having a modification other than the C-terminal amidation described above, since said modified P17-derived peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the non-substituted primary amide (RCONH 2 ) at the C-terminal end of the C-terminal amide peptide can for example be replaced by a monosubstituted primary amide (RCONHPt ! ) Or a di-substituted primary amide (RCONR ⁇ ).
  • the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and being amidated at the C-terminal is excluded.
  • the invention encompasses peptides derived from P17 or a peptide as defined above in which certain amino acids have been substituted by an amino acid with similar properties.
  • hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 may be substituted with another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V, L, I, M, F, W and unnatural hydrophobic amino acids such as tertioleucine
  • the residues K3, ⁇ 8, ⁇ 10 and / or ⁇ 12 may be substituted with another natural basic amino acid such as R and / or H or non-natural such as ornithine, homolysine and / or para-aminophenylalanine
  • the residues E4 and / or E7 may be substituted with another acidic amino acid such as D or an unnatural acidic amino acid such as paracarboxyphenylalanine.
  • the peptide may for example consist of a variant of P17 or of a P17 derivative as described above in which one or more hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 have been replaced by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V, L, I, M, F, W and unnatural hydrophobic amino acids such as tertioleucine.
  • one or more hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 have been replaced by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V, L, I, M, F, W and unnatural hydrophobic amino acids such as tertioleucine.
  • residues K8, K10 and / or K12 are retained. More preferably, residues K3, K8, K10 and / or K12 are retained.
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1;
  • said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said isolated peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of: ⁇ ) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said isolated peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the present invention also relates to a multimer of peptides according to the invention and / or of the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptides being amidated in C terminal or not.
  • the invention may relate to a dimer or a trimer.
  • the multimer may be a homomer or a heteromer.
  • the present invention also relates to an isolated polynucleotide encoding a peptide as defined above or a peptide P17.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA coding for said peptide.
  • Said sequence may advantageously be modified in such a way that codon usage is optimal in the host in which it is expressed.
  • the present invention also relates to a recombinant vector comprising said polynucleotide.
  • said vector is an expression vector comprising all the elements necessary for the expression of the peptide.
  • said vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, activator, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal, splice site).
  • the present invention also relates to a modified prokaryotic or eukaryotic host cell, comprising a peptide, a polynucleotide or a vector as defined above; the cell can be stably or transiently modified.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition characterized in that it comprises a peptide as defined above and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • composition may also comprise the P17 peptide and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition can comprise
  • a peptide consisting of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the pharmaceutical composition can comprise
  • a peptide consisting of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the peptides of the pharmaceutical composition may have from 3 to 30, from 3 to 26, or more preferably from 5 to 20 amino acids or even more preferably 5 to 15 amino acids.
  • the isolated peptide may have 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids.
  • composition may especially comprise a peptide consisting of a sequence of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: Characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • amino acid sequences comprising at least residues 1, 2, 3, 4, 5 or 6 to 8, 9, 10, 11, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1 and
  • the composition may especially comprise a peptide consisting of a sequence of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • amino acid sequences comprising at least residues 1, 2, 3, 4 or 5 to 9, 10, 1 1, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1 and
  • amino acid sequences having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said sequence in a).
  • the pharmaceutical composition comprises a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and
  • the pharmaceutical composition comprises a peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, and ⁇ ) sequences of 3 to 39 amino acids having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said sequence a).
  • the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 is excluded from the pharmaceutical composition. According to one embodiment, the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and being C-terminal amide is excluded from the pharmaceutical composition.
  • said peptide has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. According to one embodiment of this variant, the peptide has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and is amidated at the C-terminal.
  • the peptides may be recombinant or synthetic peptides.
  • the invention encompasses the peptides according to the invention which have undergone a modification since said peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the invention notably encompasses natural or synthetic variant peptides obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the sequence of P17 (SEQ ID NO: 1) since said peptide derived from P17 retains its immunomodulatory properties.
  • the peptides can be amidated at the C-terminal.
  • the peptides can be N-terminal acylated.
  • the peptides are amidated at the C-terminal.
  • C-terminal amide is conventionally meant the presence of an NH 2 group at the C-terminal end of the peptide (unsubstituted primary amide).
  • the invention also relates to C-terminal modified peptides having a modification other than the C-terminal amidation described above, since said modified P17-derived peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the non-substituted primary amide (RCONH 2 ) at the C-terminal of the amide peptide may for example be replaced by a monosubstituted primary amide (RCONHPt ! ) Or a di-substituted amide (RCONP ⁇ F ⁇ ).
  • the peptides may be natural or synthetic variants obtained by mutation of the abovementioned peptides.
  • the variants may comprise a substitution of the hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V , L, I, M, F, W and non-natural hydrophobic amino acids such as tertioleucine, a substitution of residues K3, K8, K10 and / or K12 by another natural basic amino acid such as R and / or H or not natural, such as ornithine, homolysine and / or para-aminophenylalanine and / or a substitution of residues E4 and / or E7 by another acidic amino acid such as D or an unnatural amino acid such as paracarboxyphenylalanine.
  • the peptide may for example consist of a variant of P17 or of a P17 derivative as described above in which one or more hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 have been replaced by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V, L, I, M, F, W and unnatural hydrophobic amino acids such as tertioleucine.
  • residues K8, K10 and / or K12 are retained. More preferably, residues K3, K8, K10 and / or K12 are retained.
  • the present invention also relates to a multimer of peptides according to the invention, and / or of the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptides being amidated in C terminal or not.
  • the invention may relate to a dimer or a trimer.
  • the multimer may be a homomer or a heteromer.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may for example be a carrier selected from the group consisting of sterile water, saline, glucose, dextrose or buffered solutions.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may also be a diluent, a stabilizer, a preservative, a wetting agent, an emulsifying agent, a buffer, a viscosity enhancing additive.
  • PBS can be excluded from pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition comprises an effective peptide dose for obtaining a prophylactic / therapeutic effect. This dose is determined and adjusted according to factors such as the age, sex and weight of the subject.
  • the pharmaceutical composition is generally administered according to the usual protocols, at doses and for a time sufficient to induce an immunomodulatory effect. Administration may be subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal, inhalation or transdermal.
  • the pharmaceutical composition is in a dosage form adapted to a chosen administration: sterile injectable solution, powder, tablets, capsules, suspension, syrup, suppositories, which are prepared according to the standard protocols.
  • the pharmaceutical composition may further comprise another therapeutic agent.
  • the therapeutic agent may be for example selected from the group consisting of antifungal, anticancer, antiviral, antiparasitic and antibiotic.
  • P17 and its derivatives activate the cytotoxic functions of macrophages derived from human peripheral blood monocytes.
  • the macrophages polarized by P17 or its derivatives have a high capacity for recognition and phagocytosis of pathogens, which express on their walls conserved molecular structures (PAMP), and tumor cells, with altered glycanic patterns, recognized by the receptors.
  • PAMP conserved molecular structures
  • Type C lectin receptors are involved in the innate immune response against many pathogens such as:
  • the invention also relates to a peptide and / or a pharmaceutical composition
  • a peptide and / or a pharmaceutical composition comprising said peptide and a pharmaceutically acceptable excipient for use as a medicament, said peptide consisting of a 3 to 39 amino acid sequence derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 characterized in that said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the invention relates to a method of treatment in a subject to be treated comprising administering to said subject an effective amount of said peptide or pharmaceutical composition comprising said isolated peptide and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the invention also relates to the use of said peptide or pharmaceutical composition comprising said peptide and a pharmaceutically acceptable excipient in the manufacture of a medicament.
  • said peptide for use as a medicament consists of a sequence of 3 to 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptide having an amino acid sequence selected in the group consisting of:
  • Said peptide may have from 3 to 30, from 3 to 26, or more preferably from 5 to 20 amino acids or even more preferably 5 to 15 amino acids.
  • the isolated peptide may have 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids.
  • said peptide may consist of a sequence of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) the amino acid sequences comprising at least residues 1, 2, 3, 4, 5 or 6 to 8, 9, 10, 11, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1 and
  • amino acid sequences having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said sequence in a).
  • said peptide consists of a sequence of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 or 39 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 characterized in said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • amino acid sequences comprising at least residues 1, 2, 3, 4 or 5 to 9, 10, 1 1, 12 or 13 of SEQ ID NO: 1 and
  • amino acid sequences having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said sequence in a).
  • the peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 and
  • said peptide for use as a medicament has an amino acid sequence selected from the group consisting of: a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, and SEQ ID NO: 17, and
  • sequences of 3 to 39 amino acids having at least 70%, 80%, 90% or 95% identity with said sequence a).
  • said peptide has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. According to a preferred embodiment, the peptide has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and is amidated at the C-terminal.
  • the peptide does not have the amino acid sequence SEQ ID NO: 1. According to an alternative embodiment, the peptide is not the peptide which has the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and which is C-terminal amidated.
  • the peptides may be recombinant or synthetic peptides.
  • the invention encompasses the peptides according to the invention which have undergone a modification since said peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the invention notably encompasses natural or synthetic variant peptides obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the sequence of P17 (SEQ ID NO: 1) since said peptide derived from P17 retains its immunomodulatory properties.
  • the peptides can be amidated at the C-terminal.
  • the peptides can be N-terminal acylated.
  • the peptides are amidated at the C-terminal.
  • C-terminal amide is conventionally meant the presence of an NH 2 group at the C-terminal end of the peptide (unsubstituted primary amide).
  • the invention also relates to the C-terminal modified peptides having a modification other than the C-terminal amidation described above, since said modified P17-derived peptide retains its immunomodulatory properties.
  • the non-substituted primary amide (RCONH 2 ) at the C-terminal of the amide peptide may for example be replaced by a monosubstituted primary amide (RCONHRi) or a di-substituted amide (RCONRi R 2 ).
  • the peptides may be natural or synthetic variants obtained by mutation of the abovementioned peptides.
  • the variants may comprise a substitution of the hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V , L, I, M, F, W and non-natural hydrophobic amino acids such as tertioleucine, a substitution of residues K3, K8, K10 and / or K12 by another natural basic amino acid such as R and / or H or not natural such as ornithine, homolysine and / or para-aminophenylalanine and / or a substitution of residues E4 and / or E7 by another acidic amino acid such as D or an unnatural amino acid such as paracarboxyphenylalanine.
  • the peptide may for example consist of a variant of P17 or of a P17 derivative as described above in which one or more hydrophobic amino acids such as residues L1, L6 and L13, F2, 15, 19 and / or A1 1 have been replaced by another hydrophobic amino acid selected from the group consisting of A, V, L, I, M, F, W and unnatural hydrophobic amino acids such as tertioleucine.
  • residues K8, K10 and / or K12 are retained. More preferably, residues K3, K8, K10 and / or K12 are retained.
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said isolated peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the isolated peptide consists of a sequence of 5 to 20 amino acids derived from the amino acid sequence SEQ ID NO: 1; said isolated peptide has an amino acid sequence selected from the group consisting of:
  • the present invention also relates to a multimer of peptides according to the invention, and / or of the peptide having the amino acid sequence SEQ ID NO: 1, said peptides being amidated in C terminal or not.
  • the invention may relate to a dimer or a trimer.
  • the multimer may be a homomer or a heteromer.
  • the inventors have shown that P17 and its derivatives lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Therefore, the subject of the invention is also said peptide or said pharmaceutical composition for their use as a proinflammatory agent.
  • P17-polarized macrophages have overexpression of type C lectin receptors. These receptors are involved in the immune response against many pathogens.
  • the invention relates to said peptide or / and said pharmaceutical composition for its use in the prevention or treatment of a disease caused by a pathogen recognized by type C lectin receptors, preferably by mannose or dectin receptors.
  • Pathogens can be:
  • bacterium selected from the group consisting of Streptococcus pneumoniae, Klebellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans and Mycobacterium tuberculis,
  • Candida albicans a fungus, for example Candida albicans
  • parasite for example parasite selected from the group consisting of Leish mania donovani, Pneumocystis carinii and Trypanosoma cruzi.
  • the invention thus relates to a method for the prevention or treatment of a disease caused by a pathogen recognized by a lectin type C receptor in a subject to be treated comprising administering to said subject an effective amount of said peptide or said pharmaceutical composition comprising said isolated peptide and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the disease caused by a pathogen recognized by a lectin type C receptor is preferably a fungal infection, more preferably a candidiasis.
  • Type C lectin receptors are also involved in the immune response against tumor cells. Therefore, said peptide may be for use as an anticancer agent; in the treatment of cancer.
  • the invention therefore also relates to a method for preventing or treating cancer in a subject to be treated comprising administering to said subject a an effective amount of said peptide or pharmaceutical composition comprising said isolated peptide and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Figure 1 shows the elimination of C. albicans by macrophages derived from human monocytes treated or not treated with P17 in vitro.
  • Figure 2 shows the binding and phagocytosis capacity of C. albicans by macrophages derived from human monocytes treated or not with P17.
  • Figure 3 shows the effect of P17 on the production of oxygen free radicals (RLO) and cytokines, such as NL- ⁇ ⁇ , TNF ⁇ , IL-10 and IL-12, by macrophages derived of human monocytes in response to C. albicans stimulation.
  • RLO oxygen free radicals
  • cytokines such as NL- ⁇ ⁇ , TNF ⁇ , IL-10 and IL-12
  • Figure 4 shows the effect of P17 on protein expression of lectin C-type receptors.
  • FIG. 5 shows the effect of P17 on the expression of marker genes for classical and alternative macrophage differentiation.
  • FIG. 6 shows the effect of P17 on the expression of genes encoding PPAR- ⁇ and its target SRB1, and on the expression of the Dectin-1 and MR membrane receptors in the presence of GW9662, an irreversible antagonist of PPAR- ⁇ in macrophages derived from human monocytes.
  • Figure 7 shows the effect of P17 on the expression of genes encoding enzymes of arachidonic acid metabolism in macrophages derived from human monocytes.
  • Figure 8 shows the effect of P17 on the secretion of LTB4 by macrophages derived from human monocytes.
  • FIGS. 9A-C show the concentration of intracellular calcium induced by P17 compared to negative controls (A), in the presence of pertussis toxin (B) and by desensitizing with fMLP (N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine peptide) (C ).
  • fMLP N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine peptide
  • Figure 10 shows the effect of BAPTA (calcium chelator) on the antimicrobial effect of P17, the release of reactive oxygen species (ROS) and IL-1 ⁇ .
  • BAPTA calcium chelator
  • Figure 11 shows the effect of administration of P17 in vivo on body weight of C. albicans-induced gastrointestinal candidiasis.
  • Figure 12 shows the effect of P17 administration in vivo on gastrointestinal colonization at 6 days post infection.
  • Figures 13A-E show the effect of administration of P17 in infected mice on the ability of their peritoneal macrophages to (AB) eliminate and phagocytose Candida albicans, (C) to produce ROS, and (DE) to release IL- ⁇ and IL-12.
  • Figure 14 schematizes the mode of action of P17.
  • FIG. 15 shows the number of T lymphoma cells (EL4) co-cultured with macrophages treated or not with P17.
  • Figure 16 shows the ability of ROS production of macrophages treated or not treated with P17 in response to EL4 tumor cells.
  • Figure 17 shows the effect of different fragments of P17 on ROS release by macrophages derived from human monocytes in response to C. albicans.
  • Figure 18 shows the effect of different fragments of P17 on the elimination of Candida albicans by macrophages derived from human monocytes.
  • Figure 19 shows the effect of C-terminal amidation of P17 on ROS production by macrophages in response to C. albicans.
  • the peptide P17 used in the figures and examples below is C-terminal amide (presence of an NH 2 group at its C-terminal end). Its sequence was characterized by de novo sequencing using mass spectrometry and Edman degradation (Rifflet et al., 2012). The peptide P17 was synthesized on a Liberty automated peptide synthesizer (CEM, Saclay, France) with a purity higher than 99%. The authenticity and molecular identity of the synthetic peptides were controlled by MALDI-TOF-MS.
  • the macrophages derived from human monocytes were treated or not with the P17 peptide or fragments thereof and then incubated at 37 ° C. for 24 hours. These cells were incubated for 40 min at 37 ° C. with C. albicans (at a ratio of 0.3 yeasts per macrophage) and the unbound yeasts were removed by washing. These macrophages are then incubated at 37 ° C. for 4 h. After incubation, the medium removed and the cells lysed. The colony forming units (CFU) of C. albicans were determined on Sabouraud plates after plating and cultured for 48 h at 37 ° C. Study of the binding and phagocytosis of C. albicans by macrophages derived from human monocytes
  • the macrophages derived from human monocytes were treated or not with the peptide P17 and then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • the macrophages derived from human monocytes were brought into contact with GFP-labeled yeasts (ratio 1/6) and then incubated at 4 ° C. for 20 minutes in order to evaluate the binding. Phagocytosis was evaluated after 1 h of incubation at 37 ° C.
  • the amount of C. albicans bound or ingested by macrophages derived from human monocytes was determined by measuring fluorescence using a fluorimeter (EnvisionPerkin Elmer).
  • the macrophages derived from human monocytes were treated or not with the peptide P17, P17 non-amide or with the fragments of P17 following P17 (1-5), P17 (1-7), P17 (1-9), P17 (1-11), P17 (3-13), P17 (5-13), P17 (7-13) and P17 (9-13); fragments P17 (1-5), P17 (1-7), P17 (1-9), P17 (1-1-1) not being amidated at C-terminal and P17 (3-13) fragments, P17 (5-13), P17 (7-13) and P17 (9-13) being amidated at C-terminal.
  • Macrophages derived from human monocytes thus treated were then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • ROS reactive oxygen derivatives
  • ROS reactive oxygen derivatives
  • the macrophages derived from human monocytes were stimulated with the peptide P17 for 24 hours, then these macrophages activated by the peptide P17 were stimulated with C. albicans at a yeast for macrophage ratio of 3: 1 for 8 h.
  • the production of IL- ⁇ , TNF ⁇ , IL-10 and IL-12 in cell supernatants was determined by ELISA (OptiEIA BD Biosciences).
  • the macrophages derived from human monocytes were treated or not with the peptide P17 (200 ⁇ g / ml) and then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • the collected cells were centrifuged at 1500 rpm for 10 min and the cell pellets were suspended in PBS supplemented with 1% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the cells were labeled with antibodies coupled to different fluorochromes directed against the Dectin-1 receptor (mAb, R & D FAB1859C-100, 1/40), DC-SIGN (mAb, BD Biosciences 551 265, 1/20) CD16 (mAb; PNIM 0814, 1/20), CD36 (mAb, BD Biociences 550 956, 1/40) and the mannose receptor (MR-specific ligand (FITC-conjugated mannose receptor) (Sigma A7790, 1 mg / ml1 / 100)), .
  • the analysis was performed by flow cytometry (Becton Dickinson FACScalibur) on a population of 10,000 cells.
  • Macrophages derived from human monocytes were treated with P17 (200 ⁇ g ml) for 8 h.
  • the DNA preparation was performed using a kit (EZ-10 Spin Total Column RNA Minipreps Super Kit Bio Basic) and following the manufacturer's instructions.
  • the cDNA synthesis was performed according to the manufacturer's instructions (Thermo electron).
  • RT-qPCR was performed on a LightCycler 480 system using the LightCycler SYBR Green I Master (Roche Diagnostics).
  • the primers (Eurogentec) were performed with Primer 3 software.
  • GAPDH mRNA was used as a control.
  • Serially diluted pooled cDNA samples were used as the external standard in each run for quantification.
  • Alox5 antisense ACT-G G A-AAC-ACG -GC A-AAA-AC sense I I -CTC-AAA-GTC-GGC-GAA-GT (SEQ ID NO: 19)
  • Antisense Fcgr3 (CD16) TAC-AGC-GTG-CTT-GAG-AAG-GA (SEQ ID NO: 22)
  • Antisense Fcgr2 (CD32) CCA-AAG-GCT-GTG-CTG-AAA-CT (SEQ ID NO: 24)
  • Antisense Cd36 TGA-TAG-GTG-CAG-CAA-AGC-AC (SEQ ID NO: 26)
  • AAA-AGG-ATC-GTG-TGC-TGC-ATC (SEQ ID NO: 29)
  • Antisense Ptgs2 (COX-2) TGA-GCA-TCT-ACG-GTT-TGC-TG (SEQ ID NO: 30)
  • Pla2g4a (cPLA2) Antisense GCC-TTG-GTG-AGT-GAT-TCA-GCT (SEQ ID NO: 32)
  • CAA-CTT-AGA-AAC-AGC-CAA-ATG-GAA (SEQ ID NO: Sense 35)
  • Alox5ap (FLAP) antisense ACC-CGC-TCA-AAG-GCA-ATG-G (SEQ ID NO: 36)
  • CAC-GAA-AGC-AGG-ACC-CAG-A sense (SEQ ID NO: 37)
  • ATC-TCG-CTC-CTG-GAA-GAT-GG sense (SEQ ID NO: 39)
  • Tgfbl antisense ACT-G AG-GGG-AAG-GGA-CAA-CT SEQ ID NO: 50
  • Antisense Lta4h ACT-GCT-TGG-AGG-ACC-AGA-GA SEQ ID NO: 54
  • Mrc-1 (MR) antisense GGC-GGT-GAC-CTC-ACA-AGT-AT SEQ ID NO: 56
  • GAC-TGC-AGC-AAA-GAC-ATC-CA sense (SEQ ID NO: 59)
  • the intracellular calcium concentration was measured using a Fluo 3-AM fluorescent probe (Molecular Probe). Macrophage derived from human monocytes ( ⁇ 1 .5 10 5) were incubated with 1 .5 1 ⁇ 10 "6 M of Fluo 3-AM for 30 min at 37 ° C.
  • the level of Ca2 + was recorded intracytosolic all 0.5 s for a total period of 3 min after the addition of P17 (200 ⁇ g / ml)
  • P17 200 ⁇ g / ml
  • a second injection of bacterial peptide N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) or P17 was carried out at the end of the fluorescence recording and the level of intracytosolic Ca2 + recorded for 3 min more
  • macrophages derived from human monocytes were pre-incubated with U73122 (2 ⁇ ) gold HBSS without calcium for 10 min before the addition of P17 Fluorescence was quantified using the Envision fluorimetric approach (Perkin Elmer).
  • mice were treated intraperitoneally (ip) with the peptide P17 (10 ⁇ g per mouse) or with saline for the control groups, 1 day before infection with C. albicans, 1 day after the infection and then every 2 days (5 injections). The body weight of each mouse was recorded daily. At day 8 post-treatment (7 days after infection), all mice were euthanized by C0 2 asphyxiation.
  • the esophagus, stomach, cecum and liver were removed aseptically to evaluate C. albicans colonization.
  • the peritoneal macrophages of the mice were removed and their ex vivo abilities to eliminate and phagocytize Candida albicans were determined.
  • the production of ROS, IL- ⁇ and IL-12 by these macrophages in response to Candida albicans was also evaluated.
  • T lymphoma T lymphoma
  • the murine peritoneal macrophages were treated or not with the P17 peptide and then incubated at 37 ° C. for 24 hours. These macrophages were incubated for 40 min at 37 ° C with luminescent T lymphoma cells (EL4-luc) and unbound cells removed by washing. These macrophages are then incubated at 37 ° C. for 4 h. After incubation, the number of T lymphoma cells (EL4-luc) is evaluated by chemiluminescence.
  • Figure 1 shows that the presence of P17 greatly increases the ability of human macrophages to eliminate C. albicans in vitro.
  • mice with P17-treated gastrointestinal candidiasis had less weight loss than untreated mice (Fig. 1 Consistently, gastrointestinal colonization with Candida albicans was significantly lower in P17-treated mice by compared to untreated mice ( Figure 12).
  • Macrophages derived from human monocytes treated with P17 have both a greater ability to recognize and phagocytize C. albicans (FIG. 2).
  • P17 induces a higher production of ROS in response to stimulation by C. albicans and pro-inflammatory cytokines such as IL- ⁇ and TNF ⁇ ( Figure 3).
  • the increase in the production of these cytotoxic mediators by the peptide P17 is associated with the overexpression of lectin type C receptors on the surface of macrophages derived from human monocytes (FIG. 4).
  • P17 improves the anti-tumor response of macrophages.

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Abstract

La présente invention concerne un peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a.

Description

PEPTIDE IMMUNOMODULATEUR
DOMAINE DE L'INVENTION:
La présente invention concerne un peptide isolé, une composition pharmaceutique comprenant ce peptide et l'utilisation de ce peptide ou de cette composition comme médicament, notamment comme anti-infectieux ou anti-cancéreux.
ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE :
Avec l'émergence croissante de pathogènes résistants et la raréfaction des anti- infectieux capables de lutter contre ces infections, la nécessité de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques n'a jamais été aussi urgente.
Une de ces stratégies vise l'activation du système immunitaire avec la mise au point d'agents immunomodulateurs capables notamment de renforcer l'action du système immunitaire contre les pathogènes.
RESUME DE L'INVENTION :
Les inventeurs ont découvert que le peptide P17 et ses dérivés présentaient une activité immunomodulatrice.
Le peptide P17 est un peptide présent dans le venin des fourmis Tetramorium bicarinatum. Ce peptide de 13 acides aminés avait été décrit par Rifflet et al. (Identification and characterization of a novel antimicrobial peptide from the venom of the ant Tetramorium bicarinatum. Peptides. 2012 Dec;38(2):363-70) mais n'avait alors montré aucune propriété intéressante. En particulier, il n'avait montré aucune propriété antibactérienne in vitro.
Les inventeurs ont montré que de manière surprenante P17 et ses dérivés augmentaient la libération de cytokines pro-inflammatoires et favorisaient la sécrétion de radicaux libres oxygénés. L'immuno-modulation générée par P17 et ses dérivés est telle qu'elle permet l'élimination de pathogènes comme la levure C. albicans et la diminution de la prolifération des cellules cancéreuses par des macrophages dérivés de monocytes humains ainsi polarisés
Cette immuno-modulation est médiée par les récepteurs lectine de type C comme le récepteur au mannose ou dectine 1 qui interviennent dans la réponse immunitaire innée contre de nombreux pathogènes. Ces récepteurs reconnaissent des motifs moléculaires, tels que les glucanes, présents sur la surface de nombreux pathogènes et exprimés de manière anormale à la surface des cellules cancéreuses. P17 et ses dérivés sont donc des candidats particulièrement prometteurs pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies telles que les pathologies fongiques, bactériennes, virales ou cancéreuses.
En conséquence la présente invention a pour objet un peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant :
- un peptide selon l'invention
et
-un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a aussi pour objet un peptide isolé destiné à être utilisé comme médicament ; le peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Peptides
La présente invention concerne un peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
Le pourcentage d'identité d'une séquence d'acide aminé est défini par le pourcentage de résidus d'acides aminés dans une séquence à comparer qui sont identiques à une séquence de référence après alignement des séquences, en introduisant des espaces si nécessaire, de façon à obtenir une identité de séquence maximale. Le pourcentage d'identité est ensuite déterminé selon la formule suivante : Pourcentage d'identité = 100 x [1 - (C/R)], tel que C est le nombre de différences entre la séquence de référence et la séquence à comparer sur toute la longueur de la séquence de référence, (i) chaque acide aminé dans la séquence de référence qui n'a pas d'acide aminé correspondant aligné dans la séquence à comparer, (ii) chaque espace dans la séquence de référence et (iii) chaque acide aminé aligné dans la séquence de référence qui est différent d'un acide aminé dans la séquence à comparer constitue une différence, et R est le nombre d'acides aminés dans la séquence de référence sur toute la longueur de l'alignement avec la séquence à comparer (c'est à dire toute la longueur de la séquence de référence), chaque espace généré dans la séquence de référence étant compté comme un acide aminé. L'alignement de séquences en vue de déterminer le pourcentage d'identité d'une séquence peut être réalisé de différentes façons connues de l'homme du métier, par exemple en utilisant des logiciels publics disponibles comme BLAST (Altschul et al , J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Ce logiciel est de préférence utilisé avec des paramètres par défaut.
Selon un mode de réalisation, ledit peptide isolé consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%,
90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
Les peptides selon l'invention peuvent avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.
Avantageusement, ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
De préférence, les peptides selon l'invention comprennent au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 ou ont des séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec lesdits peptides comprenant au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 ,
12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 .
Plus préférablement, les peptides selon l'invention comprennent au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 .
Les positions des résidus d'acides aminés sont indiquées en référence à la séquence de P17 (SEQ ID NO: 1 ).
Selon un mode de réalisation, les peptides présentent au moins 95% d'identité avec ladite séquence définie ci-dessus.
De préférence, le peptide est capable de se lier à la membrane de macrophages dérivés des monocytes. Il peut déclencher des voies de signalisation responsables de la production de médiateurs cytotoxiques.
De préférence, le peptide est capable d'induire la production de radicaux libres oxygénés et d'IL-1 β par des macrophages dérivés de monocytes. La capacité des peptides à induire la production de radicaux libres oxygénés et d'IL-1 β peut aisément être mesurée par un homme du métier. De tels tests sont notamment décrits dans la partie Matériels et Méthodes décrites ci-dessous.
Avantageusement, le peptide consiste en une séquence de 5 à 15 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
Selon un mode de réalisation, le peptide consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :
a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a), à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
Plus préférablement, le peptide consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :
a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a), à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
Les différentes séquences sont résumées dans le tableau 1 ci-dessous :
Nom SEQ ID NO Séquence d'acides aminés
P17 1 LFKEILEKIKAKL
P17(2-13) 2 FKEILEKIKAKL
P17(3-13) 3 KEILEKIKAKL
P17(4-13) 4 EILEKIKAKL
P17(5-13) 5 ILEKIKAKL
P17(6-13) 6 LEKIKAKL
P17(7-13) 7 EKIKAKL
P17(8-13) 8 KIKAKL
P17(9-13) 9 IKAKL
P17(1 -5) 10 LFKEI
P17(1 -6) 1 1 LFKEIL
P17(1 -7) 12 LFKEILE
P17(1 -8) 13 LFKEILEK
P17(1 -9) 14 LFKEILEKI
P17(1 -10) 15 LFKEILEKIK
P17(1 -1 1 ) 16 LFKEILEKIKA
P17(1 -12) 17 LFKEILEKIKAK Tableau 1 : Séquences d'acides aminés
Avantageusement, les peptides sont des peptides recombinants ou de synthèse. Ainsi, les peptides peuvent être préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procaryote). Par exemple, les peptides peuvent être synthétisés en phase solide originellement décrite par Merrifield et al (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-2154) selon la technique Fmoc et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse De préférence, les peptides sont des peptides de synthèse.
De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.
Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal », on entend classiquement la présence d'un groupement NH2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).
L'invention concerne également les peptides modifiés en C terminal ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH2) en C-terminal du peptide amidé en C- terminal peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHPt!) ou un amide primaire di-substitué (RCONR^).
Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et étant amidé en C-terminal est exclu.
En particulier, l'invention englobe les peptides dérivés de P17 ou d'un peptide tel que défini ci-dessus dans lesquels certains acides aminés ont été substitués par un acide aminé aux propriétés similaires. Par exemple, les acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 peuvent être substitués par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine ; les résidus K3, Κ8, Κ10 et/ou Κ12 peuvent être substitués par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine; les résidus E4 et/ou E7 peuvent être substitués par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé acide non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.
Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine .
De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ;
ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : α) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :
a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère.
Polvnucléotides
La présente invention a également pour objet un polynucléotide isolé codant pour un peptide tel que défini ci- dessus ou un peptide P17.
Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant comprenant ledit polynucléotide.
De préférence, ledit vecteur est un vecteur d'expression comprenant tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci - dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d'épissage). La présente invention a également pour objet une cellule hôte procaryote ou eucaryote modifiée, comprenant un peptide, un polynucléotide ou un vecteur tels que définis ci-dessus ; la cellule pouvant être modifiée de façon stable ou transitoire. Composition pharmaceutique
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide tel que défini ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La composition peut également comprendre le peptide P17 et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation alternatif, la composition pharmaceutique peut comprendre
- un peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a)
et
-un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation alternatif, la composition pharmaceutique peut comprendre
- un peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a)
et
-un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Les peptides de la composition pharmaceutique peuvent avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.
La composition peut notamment comprendre un peptide consistant en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 , 2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%,
90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).
Avantageusement, la composition peut notamment comprendre un peptide consistant en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4 ou 5 à 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).
Selon un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend un peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :
a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a). Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend un peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a).
Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 est exclu de la composition pharmaceutique. Selon un mode de réalisation, le peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et étant amidé en C- terminal est exclu de la composition pharmaceutique.
Selon une variante, ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation de cette variante, le peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et est amidé en C-terminal.
Les peptides peuvent être des peptides recombinants ou de synthèse.
De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.
Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal » on entend classiquement la présence d'un groupement NH2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).
L'invention concerne également les peptides modifié en C terminal ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH2) en C-terminal du peptide amidé peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHPt!) ou un amide di-substitué (RCONP^ F^).
Les peptides peuvent être des variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation des peptides précités. Comme indiqué plus haut, les variants peuvent comprendre une substitution des acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine, une substitution des résidus K3, K8, K10 et/ou K12 par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine et/ou une substitution des résidus E4 et/ou E7 par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.
Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tel que la tertioleucine . De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.
La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention, et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère.
L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut par exemple être un support choisi dans le groupe constitué de l'eau stérile, d'une solution saline, du glucose, du dextrose ou des solutions tamponnées. L'excipient pharmaceutiquement acceptable peut également être un diluant, un stabilisant, un conservateur, un agent mouillant, un agent émulsifiant, un tampon, un additif améliorant la viscosité. Le PBS peut être exclu des excipients pharmaceutiquement acceptables.
La composition pharmaceutique comprend une dose efficace de peptide permettant d'obtenir un effet prophylactique/thérapeutique. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l'âge, le sexe et le poids du sujet. La composition pharmaceutique est généralement administrée selon les protocoles usuels, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire un effet immunomodulateur. L'administration peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra-nasale, par inhalation ou par application transdermique.
La composition pharmaceutique se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie : solution stérile injectable, poudre, comprimés, gélules, suspension, sirop, suppositoires, qui sont préparés selon les protocoles standards. La composition pharmaceutique peut comprendre en outre un autre agent thérapeutique. L'agent thérapeutique peut être par exemple sélectionné dans le groupe consistant en un antifongique, un anticancéreux, un antiviral, un antiparasitaire et un antibiotique.
Thérapie
Les inventeurs ont montré que P17 et ses dérivés activaient les fonctions cytotoxiques des macrophages dérivés des monocytes humains de sang périphérique. Ainsi, les macrophages polarisés par P17 ou ses dérivés présentent une forte capacité de reconnaissance et de phagocytose des pathogènes, qui expriment sur leur paroi des structures moléculaires conservés (PAMP), et des cellules tumorales, présentant des motifs glycaniques altérés, reconnus par les récepteurs lectines de type C.
Les récepteurs lectines de type C sont impliqués dans la réponse immunitaire innée contre des nombreux pathogènes tels que :
-des bactéries (Sukhithasri V. et al., Innate immune récognition of microbial cell wall components and microbial stratégies to évade such récognitions, Microbiol
Res. 2013 Aug 25;168(7):396-406, Killick KE et al., Receptor-mediated récognition of mycobacterial pathogens, Cell Microbiol. 2013 Sep;15(9)),
-des champignons et les levures (Vautier S et al., C-type lectin receptors and cytokines in fungal immunity, Cytokine. 2012 Apr;58(1 ):89-99 ; Drummond RA et al.,
The rôle of Dectin-1 in the host defence against fungal infections, Curr Opin Microbiol.
201 1 Aug;14(4):392-9),
-des parasites (Vâzquez-Mendoza A. et al., Parasitic infections: a rôle for C- type lectins receptors, Biomed Res Int. 2013;2013:456352 Epub 2013 Jan 27, Lefèvre
L. et al., The C-type lectin receptors dectin-1 , MR, and SIGNR3 contribute both positively and negatively to the macrophage response to Leishmania infantum.
Immunity. 2013 May 23;38(5):1038-49)
-ainsi que contre des cellules tumorales (Dube DH. Et al., Glycans in cancer and inflammation-potential for therapeutics and diagnostics, Nat Rev Drug Discov.
2005 Jun;4(6):477-88, Aarnoudse CA et al., Récognition of tumor glycans by antigen- presenting cells, Curr Opin Immunol. 2006 Feb;18(1 ):105-1 1 , Chiba S et al.
Récognition of tumor cells by Dectin-1 orchestrâtes innate immune cells for anti-tumor responses, Elife. 2014 Aug 22;3). Par conséquent l'invention concerne également un peptide et/ou une composition pharmaceutique comprenant ledit peptide et un excipient pharmaceutiquement acceptable destiné à être utilisé comme médicament, ledit peptide consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).
L'invention concerne une méthode de traitement chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
L'invention concerne aussi l'utilisation dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide et un excipient pharmaceutiquement acceptable dans la fabrication d'un médicament.
Selon un mode de réalisation, ledit peptide destiné à être utilisé comme médicament consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).
Ledit peptide peut avoir de 3 à 30, de 3 à 26, ou plus préférablement de 5 à 20 acides aminés ou encore plus préférablement 5 à 15 acides aminés. Par exemple, le peptide isolé peut avoir 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés.
Avantageusement, ledit peptide peut consister en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par : a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4, 5 ou 6 à 8, 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).
Avantageusement, ledit peptide consiste en une séquence de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences d'acides aminés comprenant au moins les résidus 1 ,2, 3, 4 ou 5 à 9, 10, 1 1 , 12 ou 13 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences d'acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a).
Selon un mode de réalisation, le peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :
a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 1 1 , SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90%, 95% d'identité avec ladite séquence a). Selon un mode de réalisation préféré, ledit peptide destiné à être utilisé comme médicament a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a).
Selon un mode réalisation préféré, ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation préféré, le peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation alternatif, le peptide n'a pas la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 . Selon un mode de réalisation alternatif, le peptide n'est pas le peptide qui a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 et qui est amidé en C- terminal.
Les peptides peuvent être des peptides recombinants ou de synthèse.
De manière générale, l'invention englobe les peptides selon l'invention ayant subi une modification dès lors que ledit peptide conserve ses propriétés immunomodulatrices. L'invention englobe notamment les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de P17 (SEQ ID NO : 1 ) dès lors que ledit peptide dérivé de P17 conserve ses propriétés immunomodulatrices.
Les peptides peuvent être amidés en C-terminal. Les peptides peuvent être acylés en N-terminal. De préférence, les peptides sont amidés en C-terminal. Par « amidé en C terminal » on entend classiquement la présence d'un groupement NH2 à l'extrémité C terminale du peptide (amide primaire non substitué).
L'invention concerne également les peptides modifiés en C terminale ayant une modification autre que l'amidation en C-terminal décrite ci-dessus dès lors que ledit peptide dérivé de P17 modifié conserve ses propriétés immunomodulatrices. Aussi, l'amide primaire non subsitué (RCONH2) en C-terminal du peptide amidé peut par exemple être remplacé par un amide primaire monosubstitué (RCONHRi) ou un amide di-substitué (RCONRi R2).
Les peptides peuvent être des variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation des peptides précités. Comme indiqué plus haut, les variants peuvent comprendre une substitution des acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine, une substitution des résidus K3, K8, K10 et/ou K12 par un autre acide aminé basique naturel tel R et/ou H ou non naturel tel que l'ornithine, l'homolysine et/ou la para-aminophénylalanine et/ou une substitution des résidus E4 et/ou E7 par un autre acide aminé acide tel que D ou un acide aminé non naturel tel que la paracarboxyphénylalanine.
Le peptide peut par exemple consister en un variant de P17 ou d'un dérivé de P17 tel que décrit ci-dessus dans lequel un ou plusieurs acides aminés hydrophobes tels que les résidus L1 , L6 et L13, F2, 15, 19 et/ou A1 1 ont été remplacés par un autre acide aminé hydrophobe sélectionné dans le groupe consistant en A, V, L, I, M, F, W et des acides aminés hydrophobes non naturels tels que la tertioleucine . De préférence, les résidus K8, K10 et/ou K12 sont conservés. Plus préférablement, les résidus K3, K8, K10 et/ou K12 sont conservés.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Plus préférablement, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 5 à 20 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence en a),
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :
a) SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%,
90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)
et ledit peptide est amidé en C-terminal.
Selon un mode de réalisation, le peptide isolé consiste en une séquence de 5 à 20 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 ; ledit peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué :
a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 5 à 20 acides aminés présentant au moins 70%, 80%, 90% ou 95% d'identité avec ladite séquence a)
et ledit peptide est amidé en C-terminal. La présente invention concerne également un multimère de peptides selon l'invention, et/ou du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , lesdits peptides étant amidés en C terminal ou non. Par exemple, l'invention peut concerner un dimère ou un trimère. Le multimère peut être un homomère ou un hétéromère. Les inventeurs ont montré que P17 et ses dérivés entraînaient la production de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, l'invention a aussi pour objet ledit peptide ou ladite composition pharmaceutique pour leur utilisation comme agent proinflammatoire.
Les inventeurs ont montré que les macrophages polarisés par P17 présentaient une surexpression des récepteurs lectines de type C. Ces récepteurs sont impliqués dans la réponse immunitaire contre de nombreux pathogènes.
Par conséquent, l'invention concerne ledit peptide ou/et ladite composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une maladie causée par un pathogène reconnu par les récepteurs lectines de type C, de préférence par des récepteurs au mannose ou dectine 1 . Les pathogènes peuvent être :
-une bactérie ; par exemple une bactérie sélectionnée dans le groupe consistant en Streptococcus pneumoniae, Klebellia pneumoniae, Cryptococcus neoformans et Mycobacterium tuberculis,
-un champignon, par exemple Candida albicans,
-un parasite ; par exemple des parasite sélectionné dans le groupe constitué de Leish mania donovani, Pneumocystis carinii et Trypanosoma cruzi.
L'invention concerne donc une méthode pour la prévention ou le traitement d'une maladie causée par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La maladie causée par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C est de préférence une mycose, plus préférablement une candidose.
Les récepteurs lectines de type C sont également impliqués dans la réponse immunitaire contre les cellules tumorales. Par conséquent, ledit peptide peut être pour une utilisation comme anti-cancéreux ; dans le traitement du cancer.
L'invention concerne donc également une méthode pour la prévention ou le traitement d'un cancer chez un sujet à traiter comprenant l'administration audit sujet d'une quantité efficace dudit peptide ou de ladite composition pharmaceutique comprenant ledit peptide isolé et un excipient pharmaceutiquement acceptable.
L'invention sera en outre illustrée par les figures et exemples suivants. Cependant, ces exemples et figures ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
FIGURES
La figure 1 montre l'élimination de C. albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains traités ou non par le P17 in vitro.
La figure 2 montre la capacité de liaison et de phagocytose de C. albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains traités ou non par le P17.
La figure 3 montre l'effet de P17 sur la production de radicaux libres oxygénés (RLO) et des cytokines,, telles que NL-Ι β, le TNFa, l'IL-10 et l'IL-12, par des macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à une stimulation par C. albicans.
La figure 4 montre l'effet de P17 sur l'expression protéique des récepteurs lectine de type C.
La figure 5 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes marqueurs de la différenciation classique et alternative des macrophages.
La figure 6 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes codant PPAR-γ et sa cible SRB1 , et sur l'expression des récepteurs membranaires Dectine-1 et MR en présence du GW9662, un antagoniste irréversible de PPAR-γ dans des macrophages dérivés de monocytes humains.
La figure 7 montre l'effet de P17 sur l'expression des gènes codant des enzymes du métabolisme de l'acide arachidonique dans des macrophages dérivés de monocytes humains.
La figure 8 montre l'effet de P17 sur la sécrétion de LTB4 par des macrophages dérivés de monocytes humains.
Les figures 9A-C représentent la concentration en calcium intracellulaire induite par P17 par rapport à des contrôles négatifs (A), en présence de toxine pertussique (B) et en désensibilisant avec du fMLP (peptide N-Formylméthionine-leucyl-phénylalanine) (C).
La figure 10 montre l'effet du BAPTA (chélateur de calcium) sur l'effet antimicrobien de P17, la libération de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) et d'IL-1 β.
La figure 1 1 montre l'effet de l'administration de P17 in vivo sur le poids corporel de souris présentant une candidose gastro-intestinale induite par C. albicans. La figure 12 montre l'effet de l'administration de P17 in vivo sur la colonisation gastrointestinale 6 jours post infection.
Les figures 13A-E montrent l'effet de l'administration de P17 chez des souris infectées sur la capacité de leurs macrophages péritonéaux à (A-B) éliminer et phagocyter Candida albicans, (C) à produire des ROS, et (D-E) à libérer l'IL-β et l'IL-12.
La figure 14 schématise le mode d'action de P17.
La figure 15 montre le nombre de cellules de lymphome T (EL4) en co-culture avec des macrophages traités ou non par P17.
La figure 16 montre la capacité de production de ROS des macrophages traités ou non par P17 en réponse aux cellules tumorales EL4.
La figure 17 montre l'effet de différents fragments de P17 sur la libération de ROS par des macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans.
La figure 18 montre l'effet de différents fragments de P17 sur l'élimination de Candida albicans par des macrophages dérivés de monocytes humains.
La figure 19 montre l'effet de l'amidation C terminale de P17 sur la production de ROS par des macrophages en réponse à C. albicans.
EXEMPLES
Matériel et Méthodes:
Peptide antimicrobien P17
A moins qu'il ne soit précisé autrement, le peptide P17 utilisé dans les figures et les exemples ci-après est amidé en C terminal (présence d'un groupe NH2 à son extrémité C terminale). Sa séquence a été caractérisée par séquençage de novo en utilisant la spectrométrie de masse et la dégradation d'Edman (Rifflet et al. 2012). Le peptide P17 a été synthétisé sur un synthétiseur de peptide automatisé Liberty (CEM, Saclay, France) à une pureté supérieure à 99%. L'authenticité et l'identité moléculaire des peptides synthétiques ont été contrôlées par MALDI-TOF-MS.
Etude de l'élimination de C. albicans par les macrophages dérivés de monocytes humains
Les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 ou des fragments de celui-ci puis incubés à 37°C pendant 24h. Ces cellules ont été incubées pendant 40 min à 37°C avec C. albicans (à un ratio de 0.3 levures par macrophage) et les levures non liées sont éliminées par lavages. Ces macrophages sont alors incubés à 37 °C pendant 4 h. Après incubation, le milieu a été enlevé et les cellules ont été lysées. Les unités formant des colonies (CFU) de C. albicans ont été déterminées sur boites de Sabouraud après étalement et mise en culture pendant 48h à 37 °C. Etude de la liaison et de la phagocytose de C. albicans par les macrophages dérivés de monocytes humains
Pour l'analyse de la liaison et de la phagocytose de C. albicans, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. Les macrophages dérivés des monocytes humains ont été mis en présence avec des levures marquées GFP (ratio 1/6) puis incubés à 4°C pendant 20 minutes afin d'évaluer la liaison. La phagocytose a été évaluée après 1 h d'incubation à 37°C. La quantité de C. albicans liée ou ingérée par les macrophages dérivés des monocytes humains a été déterminée par mesure de la fluorescence en utilisant un fluorimètre (EnvisionPerkin Elmer).
Etude de la production de ROS par les macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans
Pour l'analyse de la production de ROS, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17, P17 non amidé ou avec les fragments de P17 suivants P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ), P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13) et P17(9-13) ; les fragments P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ) n'étant pas amidés en C-terminal et les fragments P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13) et P17(9-13) étant amidés en C-terminal. Puis les macrophages dérivés de monocytes humains ainsi traités ont été incubés à 37°C pendant 24h. La production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino-2,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione (luminol) (Envision; Perkin Elmer). La génération de chimioluminescence a été mesurée en continu pendant 1 h30 après incubation des cellules avec le luminol (66 μΜ) en présence ou non de C. albicans (ratio levures par macrophage : 3:1 ).
Etude de la production de ROS par des macrophages murins en réponse à des cellules tumorales murines de lymphome T (EL4).
Pour l'analyse de la production de ROS, des macrophages péritonéaux murins ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. La production de dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) a été mesurée par chimioluminescence en présence de 5-amino-2,3-dihydro-1 ,4-phthalazinedione (luminol) (Envision; Perkin Elmer). La génération de chimioluminescence a été mesurée en continu pendant 1 h30 après incubation des cellules avec le luminol (66 μΜ) en présence ou non de cellules tumorales de lymphome T EL4.
Etude de la production d'IL-1 β, TNFa, IL-10 et IL-12 par les macrophages dérivés de monocytes humains en réponse à C. albicans
Les macrophages dérivés de monocytes humains ont été stimulés avec le peptide P17 pendant 24h, puis ces macrophages activés par le peptide P17 ont été stimulés avec C. albicans à un ratio levures pour macrophage de 3:1 pendant 8 h. La production d'IL-Ιβ, de TNFa, d'IL-10 et d'IL-12 dans les surnageants cellulaires a été déterminée par ELISA (OptiEIA BD Biosciences).
Evaluation de l'expression protéique des récepteurs lectine de type C
Pour l'analyse du niveau protéique des récepteurs lectine de type C, les macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités ou non avec le peptide P17 (200 μg/ml) puis incubés à 37°C pendant 24h.Les cellules collectées ont été centrifugées à 1 500 rpm pendant 10 min et les culots cellulaires ont été mis en suspension dans du PBS supplémenté avec 1 % de sérum fœtal de veau (FCS). Les cellules ont été marquées avec des anticorps couplés à différents fluorochromes dirigés contre le récepteur Dectine-1 (mAb; R&D FAB1859C-100, 1 /40), DC-SIGN (mAb; BD Biosciences 551 265, 1 /20 ) CD16 (mAb; PNIM 0814, 1/20), CD36 (mAb; BD Biociences 550 956, 1/40) et le récepteur mannose (ligand spécifique de MR (récepteur mannose) conjugué FITC (Sigma A7790, 1 mg/ml1 /100)),. L'analyse a été réalisée par cytométrie en flux (Becton Dickinson FACScalibur) sur une population de 10,000 cellules.
Transcription inverse et PCR en temps réel
Des macrophages dérivés de monocytes humains ont été traités avec P17 (200 μg ml) pendant 8h. La préparation d'ADN a été réalisée en utilisant un kit (EZ-10 Spin Column Total RNA Minipreps Super Kit de Bio Basic) et en suivant les instructions du fabricant. La synthèse d'ADNc a été réalisée selon les instructions du fabricant (Thermo électron). Une RT-qPCR a été réalisée sur un système LightCycler 480 en utilisant le LightCycler SYBR Green I Master (Roche Diagnostics). Les amorces (Eurogentec) ont été réalisées avec le logiciel Primer 3. De l'ARNm de GAPDH a été utilisé comme témoin. Des échantillons dilués en série d'ADNc poolé ont été utilisés comme standard externe dans chaque série pour la quantification.
Les séquences des amorces sont données dans le tableau ci-dessous.
Tableau : Séquences des amorces humaines utilisées en analyse qPCR
Gène
Séquence 5' - 3'
Alox5 antisens ACT-G G A- AAC- ACG -GC A- AAA- AC (SEQ ID NO : 18) sens I I I -CTC-AAA-GTC-GGC-GAA-GT (SEQ ID NO : 19)
Itgam (CD1 1 b) antisens TTG-CAT-CCA-TCT-CAA-ATC-CA (SEQ ID NO : 20)
sens CTC-CCA-AAG-TGC-TGG-GAT-TA (SEQ ID NO : 21 )
Fcgr3 (CD 16) antisens TAC-AGC-GTG-CTT-GAG-AAG-GA (SEQ ID NO :22)
Sens GCA-CCT-GTA-CTC-TCC-ACT-GT(SEQ ID NO : 23)
Fcgr2 (CD32) antisens CCA-AAG-GCT-GTG-CTG-AAA-CT (SEQ ID NO : 24)
Sens TAC-TCC-CCG-CTG-TCA-TTG-TT (SEQ ID NO : 25)
Cd36 antisens TGA-TAG-GTG-CAG-CAA-AGC-AC (SEQ ID NO : 26)
Sens TGT-AAC-CCA-GGA-CGC-TGA-GG (SEQ ID NO : 27)
Clec7a (Dectin-1 ) antisens CCA-AGC-ATA-GGA-TTC-CCA-AAA (SEQ ID NO : 28)
Sens AAA-AGG-ATC-GTG-TGC-TGC-ATC (SEQ ID NO : 29)
Ptgs2 (COX-2) antisens TGA-GCA-TCT-ACG-GTT-TGC-TG (SEQ ID NO : 30)
Sens TGC-TTG-TCT-GGA-ACA-ACT-GC (SEQ ID NO : 31 )
Pla2g4a (cPLA2) antisens GCC-TTG-GTG-AGT-GAT-TCA-GCT (SEQ ID NO : 32)
Sens AG A-TTC- AAG -CCC- AG C- ATG - AAG (SEQ ID NO : 33)
Cd209 (DC-SIGN) antisens GGG-CAT-GGA-GGC-TCC-AC (SEQ ID NO : 34)
CAA-CTT-AGA-AAC-AGC-CAA-ATG-GAA (SEQ ID NO : Sens 35)
Alox5ap (FLAP) antisens ACC-CGC-TCA-AAG-GCA-ATG-G (SEQ ID NO : 36)
sens CAC-GAA-AGC-AGG-ACC-CAG-A (SEQ ID NO : 37)
Gapdh antisens AGG-TCG-GAG-TCA-ACG-GAT-TT (SEQ ID NO : 38)
Sens ATC-TCG-CTC-CTG-GAA-GAT-GG (SEQ ID NO : 39)
111 b antisens CAG-CCA-ATC-TTC-ATT-GCT-CA (SEQ ID NO : 40)
Sens AGG-CAG-AGA-GGG-AAG-GAG-AG (SEQ ID NO : 41 )
II6 antisens TAC-CCC-CAG-GAG-AAG-ATT-GT (SEQ ID NO : 42)
Sens I I I -TCT-GCC-AGT-GCC-TCT-TT (SEQ ID NO : 43)
1112 antisens TGG-GTG-GGT-CAG-GTT-TGA-TG (SEQ ID NO : 44)
Sens GCC-CAG-CTG-CTG-AGG-AGA-GT (SEQ ID NO : 45)
1110 antisens TGC-AAA-ACC-AAA-CCA-CAA-GA (SEQ ID NO : 46)
Sens TCT-CGG-AGA-TCT-CGA-AGC-AT (SEQ ID NO : 47)
111 ra antisens TGG-GAA-TCT-CAG-ATG-GGA-AG (SEQ ID NO : 48)
Sens CTG-TGT-CCC-CCA-GAA-CTT-GT (SEQ ID NO : 49)
Tgfbl antisens ACT-G AG-GGG-AAG-GGA-CAA-CT (SEQ ID NO : 50)
Sens TCG-GTA-CCA-GGT-GAG-GGT-AG (SEQ ID NO : 51 ) p47pnox
antisens CCT-CAT-TGT-CCA-GTG-TGG-TG (SEQ ID NO : 52) Sens TCT-TCC-GTC-TCG-TCA-GGA-CT (SEQ ID NO : 53)
Lta4h antisens ACT-GCT-TGG-AGG-ACC-AGA-GA (SEQ ID NO : 54)
Sens GGA-AAG-CAT-TAG-CAG-GCA-AG (SEQ ID NO : 55)
Mrc-1 (MR) antisens GGC-GGT-GAC-CTC-ACA-AGT-AT (SEQ ID NO : 56)
Sens ACG -AAG -CC A- 1 I I -GGT-AAA-CG (SEQ ID NO : 57)
Ptges (PGES) antisens CAT-GTG-AGT-CCC-TGT-GAT-GG (SEQ ID NO : 58)
Sens GAC-TGC-AGC-AAA-GAC-ATC-CA (SEQ ID NO : 59)
Pparg antisens GCT-GTG-CAG-GAG-ATC-ACA-GA (SEQ ID NO : 60)
Sens GGG-CTC-CAT-AAA-GTC-ACC-AA(SEQ ID NO : 61 )
Tnfa antisens TCC-TTC-AGA-CAC-CCT-CAA-CC (SEQ ID NO : 62)
Sens AGG-CCC-CAG- 1 I I -GAA-TTC-TT (SEQ ID NO : 63) Détermination de la concentration intracellulaire en calcium
La concentration intracellulaire en calcium a été mesurée en utlisant une sonde fluorescente Fluo 3-AM (Molecular Probe). Des macrophages dérivés de monocytes humain (1 .5 χ 105) ont été incubés avec 1 1 .5 χ 10"6 M de Fluo 3-AM pendant 30 min à 37 °C. Le niveau de Ca2+ intracytosolique a été enregistré toutes les 0.5 s pendant une période totale de 3 min après l'ajout de P17 (200 μg/ml). Dans des expériences de désensibilisation, une seconde injection de peptide bactérien N-Formylméthionine- leucyl-phénylalanine (fMLP) ou de P17 a été réalisé à la fin de l'enregistrement de la fluorescence et le niveau de Ca2+ intracytosolique enregistré pendant 3 min de plus. Dans certaines expériences des macrophages dérivés de monocytes humains ont été pré-incubés avec U73122 (2μΜ) or du HBSS sans calcium pendant 10 min avant l'ajout de P17. La fluorescence a été quantifiée en utilisant l'approche basée sur la fluorimétrie Envision (Perkin Elmer).
Modèle expérimental murin de candidose gastrointestinale
Pour les expériences in vivo, une infection gastrointestinale avec la souche C. albicans 98/26135 a été établie par gavage avec 50 x106 de C. albicans par souris (n=8 par groupe). Aucun antibiotique ou traitement immunosuppresseur n'a été utilisé pour faciliter l'infection des muqueuses de la cavité buccale et du tractus gastrointestinal. Les souris ont été traitées par voie intrapéritonéale (i.p.) avec le peptide P17 (10 μg par souris) ou avec une solution saline pour les groupes témoins, 1 jour avant l'infection avec C. albicans, 1 jour après l'infection et puis tous les 2 jours (5 injections). Le poids corporel de chaque souris a été enregistré quotidiennement. Au 8ème jour après le traitement (7 jours après l'infection), toutes les souris ont été euthanasiées par asphyxie au C02.
L'œsophage, l'estomac, le caecum et le foie ont été enlevés de manière aseptisée pour évaluer la colonisation par C. albicans. Les macrophages péritonéaux des souris ont été prélevés et leurs capacités ex vivo à éliminer et phagocyter Candida albicans ont été déterminées. La production de ROS, d'IL-β et d'IL-12 par ces macrophages en réponse à Candida albicans ont aussi été évaluées.
Quantification du nombre de cellules tumorales de lymphome T (EL4) en présence de macrophages murins Les macrophages péritonéaux murins ont été traités ou non avec le peptide P17 puis incubés à 37°C pendant 24h. Ces macrophagesont été incubées pendant 40 min à 37°C avec les cellules de lymphome T luminescente (EL4-luc) et les cellules non liées sont éliminées par lavages. Ces macrophages sont alors incubés à 37 °C pendant 4 h. Après incubation, le nombre de cellules de lymphome T (EL4-luc) est évalué par chimiluminescence.
Résultats:
La figure 1 montre que la présence de P17 augmente considérablement la capacité des macrophages humains à éliminer C. albicans in vitro.
Ces résultats ont été confirmés in vivo sur des souris infectées par C. albicans. En effet, des souris présentant une candidose gastrointestinale traitées par P17 présentaient une perte de poids moindre par rapport à des souris non traitées (figure 1 1 De façon consistante, la colonisation gastrointestinale par Candida albicans était significativement plus faible chez les souris traitées par P17 par rapport à des souris non traitées (figure 12).
Les inventeurs ont cherché à connaître le mécanisme sous-jacent à l'action du P17. Les macrophages dérivés de monocytes humains traités par le P17 présentent à la fois une plus grande capacité à reconnaître et phagocyter C. albicans (figures 2). De plus, P17 induit une plus forte production de ROS en réponse à une stimulation par C. albicans et de cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-Ι β et le TNFa (figure 3). L'augmentation de la production de ces médiateurs cytotoxiques par le peptide P17 est associées à la surexpression des récepteurs lectine de type C à la surface des macrophages dérivés de monocytes humains (figure 4).
P17 améliore la réponse anti-tumorale des macrophages.
Comme le montre la figure 15, en présence des macrophages polarisés par P17 le nombre de cellules tumorales EL4 diminue significativement. Ces résultats révèlent que les macrophages polarisés par P17 présentent une activité cytotoxique importante vis-à-vis des cellules tumorales par rapport à des macrophages non traités.
Cette induction de l'activité cytotoxique des macrophages par P17 vis-à-vis des cellules tumorales est corrélée à une production de ROS augmentée (figure 16). Effets des fragments de P17 sur la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS)et sur l'élimination de Candida albicans par des macrophagesLa capacité d'induire la libération de ROS en réponse à C. albicans des macrophages traités par différents fragments de P17 a été testée.
Les résultats obtenus avec les peptides dont il manque l'extrémité C-terminale (P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 )) montre l'importance de cette extrémité dans l'activation des fonctions cytotoxiques des macrophages par P17 (figures 17- 18). En effet, le traitement des macrophages avec ces fragments n'induit ni la production de ROS, ni l'élimination de Candida albicans.
Les peptides P17(1 -5), P17(1 -7), P17(1 -9), P17(1 -1 1 ) testés n'étaient pas amidés en C terminal contrairement à P17.La différence de libération de ROS entre P17 amidé et P17 non amidé a donc été testée afin de déterminer l'influence de l'amidation C- terminale sur les propriétés pro-inflammatoires de P17. Ces résultats montrent que l'amidation C terminale de P17 est essentielle à son activité pro-inflammatoire (figure 19).
La libération de ROS induite par des fragments dont la partie N-terminale a été délétée (P17(3-13), P17(5-13), P17(7-13), P17(9-13) a également été testée. Seuls les fragments P17(3-13) et P17(5-13) conservent leur activité (figure 17). Ces résultats montrent le rôle prépondérant des acides aminés centraux dans l'activité immunomodulatrice de P17.
Les effets des différents fragments sur l'élimination de C. albicans par les macrophages ont été également été testés. Les résultats sont identiques à ceux obtenus pour la libération de ROS. Les fragments sans partie C-terminale sont inactifs alors que les fragments P17(3-13) et P17(5-13) présentent une activité proche de celle de P17.

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide isolé consistant en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
2. Peptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit peptide a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
3. Peptide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à la membrane de macrophages dérivés des monocytes.
4. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence de 5 à 15 acides aminés comprenant au moins les résidus 5 à 9 de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
5. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué de :
a) SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence a),
à l'exclusion du peptide ayant la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
6. Peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il est amidé en C-terminal.
7. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6
et
-un excipient pharmaceutiquement acceptable.
8. Peptide destiné à être utilisé comme médicament caractérisé en ce que le peptide isolé consiste en une séquence de 3 à 39 acides aminés dérivée de la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 , ledit peptide ayant une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué par :
a) les séquences de 3 à 39 acides aminés comprenant au moins les résidus 6 à 8 de SEQ ID NO : 1 et
b) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence en a).
9. Peptide pour son utilisation selon la revendication 8 caractérisé en ce que le peptide isolé a une séquence d'acides aminés sélectionnée dans le groupe constitué : a) SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID
NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 17 et
β) les séquences de 3 à 39 acides aminés présentant au moins 70% d'identité avec ladite séquence a).
10. Peptide pour son utilisation selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que ledit peptide a la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1 .
11. Peptide pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 caractérisé en ce que ledit peptide est amidé en C-terminal.
12. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation comme agent pro-inflammatoire.
13. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de maladies causées par un pathogène reconnu par un récepteur lectine de type C, de préférence par un récepteurs au mannose ou dectine 1 .
14. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans la prévention ou le traitement d'une mycose, de préférence une candidose.
15. Peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 8 à 1 1 pour son utilisation dans le traitement du cancer.
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