EP3397266A1 - Fragment du facteur h pour son utilisation comme agent anti-angiogénique - Google Patents

Fragment du facteur h pour son utilisation comme agent anti-angiogénique

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EP3397266A1
EP3397266A1 EP16829428.8A EP16829428A EP3397266A1 EP 3397266 A1 EP3397266 A1 EP 3397266A1 EP 16829428 A EP16829428 A EP 16829428A EP 3397266 A1 EP3397266 A1 EP 3397266A1
Authority
EP
European Patent Office
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seq
neovascularization
factor
fragment
acid sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16829428.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Virginie DINET
Frédéric MASCARELLI
Toufik ABACHE
Sylvie Jorieux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Université Paris Descartes
Université Paris Diderot - Paris 7
LFB SA
Sorbonne Université
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Université Paris Descartes
Université Paris Diderot - Paris 7
LFB SA
Sorbonne Université
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Université Paris Diderot - Paris 7, LFB SA, Sorbonne Université filed Critical Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Publication of EP3397266A1 publication Critical patent/EP3397266A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K38/1725—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a or C5a
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct

Definitions

  • Fragment of factor H for use as an antiangiogenic agent is provided.
  • the present invention relates to a complement factor F (FH) fragment for its use in the treatment and / or prevention of a pathology involving neovascularization.
  • FH complement factor F
  • Angiogenesis is a complex physiological mechanism that plays a major role in the genesis of neovascularization involved in various pathologies including the growth of solid tumors, atherosclerosis, rheumatoid arthritis, psoriasis and intraocular neovascular diseases such as retinopathies. proliferative or age-related macular degeneration (AMD) exudative.
  • AMD age-related macular degeneration
  • vascular endothelial growth factor Inhibitors of vascular endothelial growth factor (VEGF) are used in the treatment of various cancers and ocular conditions.
  • VEGF inhibitors are pegaptanib, bevacizumab, ranibizumab, or aflibercept. Although these molecules represent a breakthrough in the treatment of exudative AMD, it turns out that the recovery of vision obtained through these treatments is only transient, retinal edema secondary to neovascularization recurrence and retinal degeneration occurs. continues. In addition, 20-30% of patients respond poorly to these treatments (Rasmussen and Sander, 2014) and show residual exudative signs.
  • VEGF is considered a trophic factor for the survival of EPR cells (Byeon et al., 2010), maintenance of choriocapillaries (Saint-Geniez et al., 2009) and visual functions ( Saint-Geniez et al., 2009). Geniez et al., 2008).
  • treatment by agents Anti-VEGF may result in long-term progressive atrophy of the neural retina, choroid, and EPR in patients with exudative AMD.
  • the invention relates to a fragment of FH for its use in the treatment and / or prevention of a pathology involving neovascularization, said fragment of FH comprising the amino acid sequence represented in SEQ ID N 2.
  • the inventors have demonstrated that the fragments of the FH comprising at least the SCR7 domain, represented in SEQ ID No. 2, inhibits neovascularization, in particular choroidal neovascularization.
  • H factor fragments appear as a new relevant and effective solution for the treatment of pathologies, in particular ocular pathologies, related to excessive vascularization or choroidal neovascularization.
  • the invention therefore proposes a new therapeutic strategy effective for the treatment of patients suffering from ocular pathologies involving excessive vascularization or choroidal neovascularization.
  • FH a glycoprotein involved in the regulation of the alternate pathway of complement. More specifically, FH plays a role in the regulation of the alternative complement pathway by interacting primarily with the C3b molecule.
  • FH, encoded by the FH gene is predominantly synthesized in the liver but can also be expressed locally by different cell types including EPR cells, endothelial cells, and others.
  • FH has repetitive sequences of about 60 amino acids called "SCR domains" (short consensus repeat). The region of the FH involved in the fluid phase regulation of the complement activity of the alternate channel is located at the level of the SCR1-4 domains.
  • FH has C3b binding sites (SCR1-4, SCR6-8, SCR12-14 and SCR19-20) and glycosylated glycans (GAGs) (SCR6-8, and SCR19-20).
  • SCR19-20 is also a link site to C3b and more specifically to C3d.
  • FH also has C-reactive or CRP binding sites (SCR6-8 and SCR 16-20), which is an acute phase protein synthesized primarily by the liver and plays an important role in inflammatory and serves as a biological marker for these.
  • the FH has a Zinc binding site (SCR6-8), important for the oligomerization of CFH.
  • FH binds to C3b competitively with factor B (FB), resulting in accelerated dissociation of alternating C3 (C3bBb) or C5 (C3bBbC3b) convertase, which loses its activity.
  • C3b-linked FH acts as a co-factor for IF, allowing it to cleave C3b into C3bi, a molecule unable to bind to FB to form C3bBb.
  • Deregulation or inactivation of the alternate pathway controlled by FH may result in uncontrolled activation of C3, resulting in the assembly of the terminal components of the complement membrane attack complex or MAC.
  • This complex which is composed of the C5b9 complement proteins, remains bound and forms a transmembrane pore, a cytotoxic component of the complement system, which causes lysis of the target cells.
  • FH can be used to treat certain retinal degenerations because of its anti-inflammatory or antioxidant activity.
  • the document WO2006 / 088950 describes a polymorphism in the FH gene generating the Y402H variant which is associated with the increased risk of developing AMD (Edwards et al., 2005; Hageman et al., 2005; Haines et al. et al., 2005. Klein et al., 2005, Despriet et al., 2006).
  • document WO2011 / 113641 describes the use of FH in the treatment and / or prevention of several pathologies, including ocular pathologies.
  • This application describes a HF activity that relies on its ability to bind to endogenous malondialdehyde, thereby preventing the production of proinflammatory substances.
  • the activity of the FH described in this document is an anti-inflammatory activity, the anti-angiogenic activity of the FH is not described.
  • the strategy proposed by WO2011 / 113641 only aims to treat pathologies comprising an inflammatory component.
  • F H protects the EPR subjected to oxidative stress, in particular through a protective effect on the tight junctions of the EPR cells against oxidative stress, more precisely against the destabilization and disorganization of the tight junctions. retinal cells subjected to oxidative stress.
  • the anti-angiogenic activity of FH is not described.
  • human plasma FH has an anti-angiogenic role in a rat model of laser-induced neovascularization.
  • the present invention differs from this teaching in identifying for the first time fragments of FH, and not the entire FH, with anti-angiogenic activity.
  • FH fragments and not the entire FH, has several advantages.
  • the lower molecular weight of the fragments, compared to the whole protein, allows the injection of a larger molar concentration of active molecules into the eye. Indeed, intraocular administration volumes in AMD treatments are limited (approximately 50 ⁇ in humans). It is therefore advantageous to use smaller active ingredients, in order to be able to increase their numbers, formulated in a small injection volume.
  • the use of fragments makes it possible to limit the glycosylation sites, thus allowing a limitation of the glycosylation variations during their industrial production and thus to ensure, on a large scale, a homogeneity of structure.
  • the fragments of the FH according to the invention not only reduce the surface of neovascularization (ie formation of new vessels) but also make it possible to reinforce the membrane integrity of the neovessels, thus limiting the diffusion of liquid or blood.
  • the peptide sequence of native human FH is shown in SEQ ID NO: 1. This sequence is known to those skilled in the art and is available under UniProtKB accession number - P086031 in the uniProt database.
  • FH fragment is meant a portion of the peptide sequence of factor H.
  • fragment of factor H excludes the entire factor H.
  • this fragment of FH has retained the same biological property of interest as human FH. In other words, it is a part of the peptide sequence of FH exhibiting the anti-angiogenic property of FH.
  • biological property of interest of the FH is meant the anti-angiogenic property of said FH.
  • fragment of the FH according to the invention is meant fragments of the FH comprising at least the SCR domain 7 of human FH.
  • sequence SCR7 of human FH is represented in sequence SEQ ID No. 2. It is as follows:
  • This sequence is encoded by the nucleotide sequence SEQ ID No. 3.
  • the fragment according to the invention preferably comprises the SCR domain 7, fused with the N-terminal or C-terminal domains of the FH.
  • said N-terminal or C-terminal domains of the FH consist respectively of domains SCR 1 to 4 and SCR 19 to 20.
  • the fragment according to the invention preferably comprises an amino acid sequence chosen from: the sequence of the SCR7 domain of human FH, as represented in SEQ ID No. 2 and encoded by the sequence nucleotide SEQ ID NO: 3;
  • polynucleotide according to the invention is meant a nucleic acid sequence encoding a factor H fragment according to the invention.
  • the polynucleotide according to the invention comprises at least one coding sequence for the SCR7 domain of factor H as represented in SEQ ID No. 3.
  • the polynucleotide of the invention comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO. 13.
  • the inventors have identified, for the first time, a novel function of FH fragments as an antiangiogenic agent and the use of such an FH fragment for the treatment of ocular pathologies involving neovascularization.
  • pathologies involving neovascularization encompasses all pathologies that are characterized by abnormal angiogenic activity, i.e. the formation of new blood vessels irrigating a tumor or any other tissue abnormality, including ocular.
  • the terms neovascularization and angiogenesis are synonymous and denote an abnormal and / or excessive vascularization and / or likely to lead to a pathological situation.
  • Such neovascularization is found in several ocular pathologies, including exudative AMD.
  • treatment or “treating” is understood to mean the action of suppressing, reducing or inhibiting the progression of the disease to which this term applies.
  • treatment or “treating” is also understood to mean the action of suppressing, reducing, inhibiting the progression of the appearance of one or more symptoms of the condition or disease to which this term applies.
  • the term "prevention” or “prevention” means the action of avoiding, delaying or limiting the appearance of a pathology or the symptoms of a pathology in a healthy subject, or a subject known to have a predisposition to trigger said pathology.
  • the pathology involving neovascularization is ocular pathology selected from AMD, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, ischemic retinopathy, retinopathy. radiation, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, venous vascular occlusion, non-tumor proliferative vasculopathies and cancer.
  • the pathology involving neovascularization is ocular pathology selected from AMD, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, and cancer.
  • said cancer is selected from the group consisting of vascularized and / or vascular intraocular tumors, proliferative tumor vasculopathies, vascular tumors of vascular or non-vascular origin such as choroidal hemangiomas, proliferations. intraretinal angiomatous, chorioretinal anastomoses or polypoidal vasculopathies.
  • the pathology involving neovascularization is an ocular pathology selected from AMD and choroidal neovascularization.
  • the pathology involving neovascularization is neovascular AMD.
  • neovascular AMD This is indeed a group of patients likely to be treated thanks to the anti-angiogenic activity of the factor H fragments according to the invention demonstrated by the inventors.
  • the pathology involving neovascularization is choroidal neovascularization. secondary to AMD or choroidal neovascularization secondary to severe myopia or intraocular inflammation or choroiditis.
  • AMD Alzheimer's disease
  • AMD is a pathology that first affects the center of the retina, the macula, and in fact causes a loss of precise vision. While preserving peripheral vision, which allows people to navigate globally, AMD affects quality of life significantly. It is the leading cause of irreversible central vision loss in industrialized countries. Age is the primary risk factor for AMD. The EPR in the central part of the retina is considered the first target of AMD. Thus, the damage or loss of function of the EPR causes death of the photoreceptors.
  • AMD is a complex pathology linked to many factors, including environmental and genetic factors. There are two forms of AMD: the atrophic form and the wet form.
  • the atrophic form also called geographic atrophy or dry AMD, results in the progressive disappearance of the cells of the EPR, then to that of the photoreceptors located at the level of the macula.
  • the wet form also called neovascular or exudative, meanwhile, involves a process of angiogenesis and results in a proliferation of new abnormal vessels under the retina. These fragile vessels leak serum, responsible for an uplift of the retina, and / or blood leading to the appearance of retinal hemorrhages.
  • Choroidal neovascularization corresponds to the appearance of choroidal neovessels. It corresponds to a proliferation of abnormal blood vessels under the retina, in the choroidal layer of the eyeball. Abnormal vessels can leak fluids and blood, causing edema and retinal lifting. It is most often translated by:
  • metamorphopsia that is to say, disturbances of vision characterized by deformation of the images
  • a relative or absolute scotoma ie a permanent gap in the visual field
  • Choroidal neovascularization may be choroidal neovascularization secondary to AMD or choroidal neovascularization secondary to severe myopia, intraocular inflammation or infectious or non-infectious choroiditis.
  • MAC formation resulting from activation of the complement pathway has been shown to be responsible for the development of laser-induced choroidal neovascularization in mice (Andreoli et al., 2009). Indeed, the MAC would allow the release of angiogenic factors such as VEGF, FGF-2 and PDGF, resulting in the amplification of the angiogenic process (Andreoli et al., 2009). MAC has also been shown to control VEGF expression in the mouse CNV model (Liu et al., 2011).
  • the invention relates to an amino acid sequence selected from the sequences shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO. 10 and SEQ ID No. 12 for the treatment of a pathology selected from AMD, preferably neovascular AMD, choroidal neovascularization and cancer. All the technical characteristics defined previously apply here.
  • the fragment of the FH according to the invention may be used alone, in combination and / or in combination with other active agents, such as other substances used in the treatment of ocular pathologies, in particular anti-VEGF agents, glucocorticoids, or biological agents such as an anti-factor D antibody. These different active agents can be used in therapeutic combination, and administered in separate, combined, spread or concomitant form.
  • the fragment of FH according to the invention can also be used to prepare a pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of an ocular pathology involving neovascularization.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition for use in the treatment and / or prevention of an ocular pathology selected from AMD, iris neovascularization, intraocular neovascularization, corneal neovascularization, retinal neovascularization, choroidal neovascularization, ischemic retinopathy, radiation retinopathy, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, venous vascular occlusion, non-tumor proliferative vasculopathy and cancer. All the technical features mentioned above are applicable here.
  • the fragments of the FH according to the invention may be combined with any type of pharmaceutically acceptable vehicle or excipient, and optionally with a prolonged diffusion matrix, such as a biodegradable polymer, a biodegradable or non-biodegradable reservoir, particulate systems or implants intraocular or periocular to form a pharmaceutical composition according to the invention.
  • a pharmaceutically acceptable refers to molecular entities and compositions that do not produce an adverse, allergic or other undesired reaction when administered to a mammal, particularly a human.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be solid, semi-solid or liquid.
  • the form of the pharmaceutical compositions, their route of administration, their dosage and their dosage naturally depend on the severity of the ocular pathology and its stage of evolution.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be in any form that can be administered to a patient, and in particular includes liquid or solid forms, typically in the form of eye drops, gel, or oral solution, but also suspensions, lyophilized powders, capsules and tablets. Formulations formulated so that they can be administered are preferred. locally, such as eye drops and gels, or orally such as drinkable solutions, tablets, ampoules.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may also be in a form compatible with an injection, ie a local injection, a mucosal administration, an inhalation, an oral administration and more generally any formulation appropriate for the intended purpose.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in a compatible form for ocular, intraocular, intravitreous, sub-tenonial, subretinal, intra-orbital, subconjunctival, intravenous, intra-ocular administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises from 10% to 90% by weight of a fragment of the FH relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition according to the invention contains from 20 to 60% of a fragment of the FH relative to the total weight of the composition.
  • intravitreous injection is a simple way to release a protein in the posterior segment of the eye to minimize systemic exposure.
  • repeated injection can lead to complications such as haemorrhage, retinal detachments, or cataracts.
  • the pharmaceutical composition of the invention further comprises another active agent, such as, for example, other substances used in the treatment of ocular pathologies.
  • this other active agent may be present in the pharmaceutical composition in a proportion of at least 20% by weight relative to the total weight of said composition.
  • the Factor H fragment according to the invention can be administered in the form of DNA or cDNA for local gene expression.
  • another object of the invention is a polynucleotide comprising the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 for use in the treatment and / or prevention of a pathology involving neovascularization.
  • said polynucleotide comprises a nucleic acid sequence selected from the group consisting of the sequences shown in SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 13.
  • Another subject of the invention is an expression vector comprising the polynucleotide encoding the factor H fragment of the invention, or an expression cassette comprising said polynucleotide for its use in the treatment and / or prevention of a pathology involving neovascularization.
  • the expression vectors suitable for use according to the invention may comprise at least one expression control element operably linked to the nucleic acid sequence.
  • the expression control elements are inserted into the vector and make it possible to regulate the expression of the nucleic acid sequence.
  • expression control elements include lac systems, lambda phage promoter, yeast promoters or viral promoters.
  • Other operational elements may be incorporated, such as a leader sequence, termination codons, polyadenylation signals and sequences necessary for transcription and subsequent translation of the nucleic acid sequence into the host system. It will be understood by those skilled in the art that the correct combination of expression control elements depends on the chosen host system. It will also be understood that the expression vector must contain the additional elements necessary for the transfer and subsequent replication of the expression vector containing the nucleic acid sequence in the host system. Such vectors are easily constructed using conventional or commercially available methods.
  • the expression of the polynucleotide of the invention may, for example, be carried out locally by any method of transferring the vectorized polynucleotide by viral or non-viral methods into any cell of the eye.
  • the invention therefore relates to a composition comprising a polynucleotide according to the invention for use as a gene therapy medicament.
  • the means by which the vector carrying the polynucleotide can be introduced into the cells include microinjection, electroporation, transduction or transfection using DEAE-dextran, lipofection, calcium phosphate or other procedures. known to those skilled in the art.
  • eukaryotic expression vectors that function in eukaryotic cells are used.
  • examples of such vectors include viral vectors such as retroviruses, adenovirus, herpes virus, vaccinia virus, variola virus, poliovirus, lentivirus, bacterial expression vectors or plasmids such as pcDNA5.
  • Viral vectors offer the advantage of good transfection efficiency but do not control the amount of secreted proteins.
  • the encapsulated cell technology has been developed to deliver a therapeutic protein in a controlled, continuous, long-term manner in the posterior segment of the eye.
  • electroporation techniques for specific transfection of the ocular ciliary muscle make it possible to use the ciliary muscle as a reservoir of plasmids encoding therapeutic proteins and thus to express and secrete the fragment according to the invention in intraocular and during an extended duration.
  • the invention in another aspect, relates to a therapeutic method for the treatment of a pathology involving neovascularization, said method comprising administering a fragment of factor H comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. All the technical features mentioned above are applicable here.
  • the invention relates to the use of a fragment of factor H comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 for obtaining a medicament for treating a pathology involving neovascularization.
  • a fragment of factor H comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 for obtaining a medicament for treating a pathology involving neovascularization.
  • the inventors have here demonstrated the therapeutic potential of fragments of FH in relevant models of pathologies involving neovascularization. For this, they produced in cells in culture several fragments of FH. They then proceeded to the purification of these fragments.
  • the assay of the biological activity of the fragments was tested in vitro on the ability of FH (1) fragments to inhibit lysis of sheep erythrocytes induced by the alternative complement pathway (C5b9 complex-related activity), (2) to accelerate the dissociation of the previously formed C3 convertase complex in 96-well ELISA plates (anti-C3 convertase activity), (3) to inactivate, in vitro, the C3b complement molecule by acting as a factor I (FI) cofactor.
  • the inventors measured the inhibition of angiogenesis by the fragments produced in the model of induction of CNV by laser in the rat. This study revealed for the first time and unexpectedly, an anti-angiogenic role of fragments of FH.
  • the inventors have developed fragments of the FH comprising various domains.
  • sequence of SCR domains 1 to 7 of human FH as represented in SEQ ID No. 4, and encoded by the nucleotide sequence SEQ ID No. 5;
  • the nucleic sequences of the FH fragments were cloned in a plasmid vector allowing the expression of these molecules in eukaryotic cells.
  • the secretion of these molecules in the cell culture supernatant is favored by the N-terminal use of a judiciously selected signal peptide (MB7).
  • the production of the fragments is carried out by transient transfection in the human cell line HEK 293F. After 7 days of production in batch mode, the supernatant is harvested, clarified, concentrated and sterile filtered (0.22 ⁇ ).
  • the purification of the FH fragments is carried out by affinity chromatography on a Ni-NTA column or cobalt column by means of the hexahistidine tag added at the C-terminal position of the FH fragments.
  • the Shard FH 1NT18 which does not contain a C-terminal tag, was purified by one or two stages of ion exchange chromatography (SP-Sepharose and Q-Sepharose). The eluted FH fragments were dialyzed against PBS buffer and concentrated if the final absorbance concentration at 280 nm was less than 30 ° C / ml.
  • the anti-C3 convertase activity determines the concentration of FH or FH fragment required to dissociate 50% of the preformed C3bBb3 (IC3) C3 convertase after 32 min incubation at 34 ° C.
  • the generation of C3 convertase is therefore carried out in the wells of a microtiter plate as follows: 100 ⁇ l of a solution of C3b (2.5 ⁇ g / ml) are deposited per well and incubated overnight at 4 ° C; after saturation of the unoccupied binding sites, the step of generating C3 convertase is carried out by adding 4 ⁇ g / ml of factor B (FB), 0.3 ⁇ g / ml of factor D (FD) and 1.5 mM NiC12 and incubating the mixture at 34 ° C for 120 minutes.
  • FB factor B
  • FD 0.3 ⁇ g / ml of factor D
  • NiC12 1.5 mM NiC12
  • the formed C3 convertase is dissociated by adding whole FH or FH fragments at different concentrations for 32 to 34 min at 34 ° C. After washing, the amount of the C3 convertase complex still present is determined by detection of human FB using a goat anti-FB antibody and a goat anti-Ig (H + L) antibody coupled to peroxidase.
  • FH in the fluid phase, acts as an IF cofactor that cleaves C3b. IF breaks the 110 kDa chain of C3b releasing a 43 kDa fragment and thus produces C3bi.
  • the FH or fragments thereof are incubated in different amounts with purified Factor I and C3b (0.14 ⁇ g and 10 ⁇ g, respectively) at 37 ° C for 30 minutes. The reaction is stopped by adding denaturation / reduction buffer containing SDS and incubation for 3 minutes at 95 ° C. Control reaction mixtures containing either C3b or C3b and F1 are also prepared and incubated under the same conditions.
  • the samples are then deposited on 10% polyacrylamide gel in the presence of SDS and subjected to electrophoresis (SDS-PAGE). After staining the Coomassie blue gels, the colored bands corresponding to the cleavage products of the ⁇ chain are scanned, quantified by densitometric analysis and normalized by the values obtained for the uncleaved chain a '.
  • the red blood cells of sheep whose surface is rich in sialic acid, bind the FH by its C-terminal part, thus preventing the formation of C3 convertase and consequently cell lysis.
  • a suspension of sheep red blood cells (1x10 GRM / ml) is taken up in a reaction buffer containing 10 mM EGTA and 7 mM MgCl 2 and placed in the presence of a mixture of normal plasma and depleted FH plasma in order to allow the Alternate complement pathway activation.
  • Increasing concentrations of FH or FH fragments are added prior to induction of alternative complement pathway activation to evaluate the inhibition of GRM lysis by these molecules.
  • the mixture is incubated at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by adding a 10 mM Hepes buffer containing 2 mM EDTA. After centrifugation for 5 minutes at 1730 g, 200 ⁇ l of supernatants are taken for an optical density measurement at 414 nm. The measurement of anti-haemolytic activity is determined as a% of the control, the value of which corresponds to the molar concentration of plasma FH necessary to obtain complete inhibition of the lysis (100%).
  • fragments containing SCRs 1 to 4 have anti-C3 convertase activity.
  • the activity of the minimal fragment "1NT4" is significantly lower than that of the fragments containing the following SCRs (SCRs 5 to 18).
  • anti-haemolytic activity is carried by fragments which consist of SCRs 1 to 4 to inhibit C3-convertase activity and SCR 19-20 to attach to sialic acid residues present on the surfaces of sheep red blood cells .
  • the inventors evaluated the anti-angiogenic activity induced by each of the fragments of the FH described in point I. To do this, they used an in vivo model of choroidal neovascularization (CNV) in Long Evans rats (Janvier Labs, Le Genest - Saint-Isle, France). Material and methods 1. Quantitative test for the determination of choroidal neovascularization.
  • the rats were anesthetized (using a mixture of ketamine / xylazine in a ratio of ⁇ / 100mg) and the eyes were dilated with mydriaticum and anesthetized with tetracaine.
  • Six Argon laser strikes located at two papillae of the optic nerve were performed at regular intervals. Then, the cornea of these rats was protected with the application of a "Goniosol" gel. Then, 3 ⁇ 1 of a saline solution alone or a solution of FH diluted in saline solution were injected into the vitreous eyes of each rat.
  • EPR / choroid / sclera Two injection times were tested: 1- in preventive mode on the same day of the laser and 2- in healing, ie 4 days post-laser. After sacrifice on days 7 or 14 post-laser, rats' eyes were enucleated and then fixed in a solution of paraformaldehyde. Only the posterior part of the eye (EPR / choroid / sclera) was removed and then cut radially. After blocking nonspecific sites with goat serum solution, the EPR / choroid / sclera complexes were labeled with an endothelial cell marker diluted in saline. The EPR / choroid / sclera complexes are then mounted between blade and coverslip using a mounting medium.
  • EPR / choroid / sclera complexes Two injection times were tested: 1- in preventive mode on the same day of the laser and 2- in healing, ie 4 days post-laser. After sacrifice
  • the markings were observed using a confocal "Zeiss” microscope and images of the entire laser impact, called Stacks, were taken. These images were then analyzed using the "ImageJ" software so that the marking surface was quantified for each impact and for each rat eye.
  • at least 3 groups of 4 rats were tested: 1 non-injected rats (control group), 2 rats injected with saline solution (injection test group) and 3 rats injected with a solution of F H.
  • SCR6-8 SCR 6 to 8 SEQ ID No. 12 0% 85%
  • SCR1-4 SCR 1 to 4 SEQ ID No. 14 0% 15%
  • SCR1-6 SCR 1 to 6 SEQ ID No. 16 47% 40%
  • Fragments exhibiting inhibition of choroidal neovascularization also act by inhibiting MAC formation.
  • results show that the rFH1NT7 and rFH7CT20 fragments have the same inhibitory activity of the transcription of angiogenesis genes namely VEGFA, VEGFR1 and VEGFR2 as the entire rFH.
  • the whole FH and the 2 fragments induce an increase in the expression of the gene coding for PEDF, an angiogenesis inhibitory factor.

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Abstract

L'invention concerne un fragment du facteur H du complément pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.

Description

Fragment du facteur H pour son utilisation comme agent anti- angiogénique
La présente invention concerne un fragment du facteur H (FH) du complément pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
L'angiogénèse est un mécanisme physiologique complexe qui joue un rôle majeur dans la genèse de la néovascularisation impliquée dans différentes pathologies incluant la croissance de tumeurs solides, l'athérosclérose, la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis et les pathologies néo-vasculaires intraoculaires comme les rétinopathies prolifératives ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) exsudative.
Des inhibiteurs du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF) sont utilisés dans le traitement de divers cancers et pathologies oculaires. On peut citer comme inhibiteurs du VEGF actuellement disponibles le pegaptanib, le bevacizumab, le ranibizumab, ou encore l'aflibercept. Bien que ces molécules constituent une avancée dans le traitement de la DMLA exsudative, il s'avère que la récupération de la vue obtenue grâce à ces traitements n'est que transitoire, l'œdème rétinien secondaire à la néovascularisation récidive et la dégénérescence rétinienne se poursuit. De plus, 20-30 % des patients répondent faiblement à ces traitements (Rasmussen and Sander, 2014) et présentent des signes exsudatifs résiduels.
D'autre part, si l'excès de VEGF a un effet promoteur de la néovascularisation et de l'œdème associé, en contrepartie, une inhibition totale peut avoir un effet néfaste sur la rétine neurale, la choroïde et les cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine (EPR), et notamment ses jonctions serrées, essentielles au maintien de l'intégrité de l'EPR. En effet, le VEGF est considéré comme un facteur trophique pour la survie des cellules de l'EPR (Byeon et al., 2010), le maintien des choriocapillaires (Saint-Geniez et al., 2009) et les fonctions visuelles (Saint-Geniez et al., 2008). Ainsi, le traitement par les agents anti-VEGF peut entraîner à long terme, une atrophie progressive de la rétine neurale, de la choroïde et de l'EPR chez les patients atteints de DMLA exsudative.
D'ailleurs une augmentation du taux de progression de l'atrophie de l'EPR a été rapportée chez les patients atteints de DMLA exsudative et traités aux anti-VEGF, ce qui souligne l'efficacité insuffisante de ce traitement pour prévenir les conséquences visuelles à long terme de la DMLA (Rosenfeld et al., 2011 ; Lois et al., 2013 ; Kumar et al., 2013 ; Grunwald et al., 2014 ; Young et al., 2014 ; Bhisitkul et al., 2015 ; Channa et al., 2015 ; Schutze et al., 2015).
De plus, il a été montré que des polymorphismes situés sur le gène du
FH entraînent une résistance de certains patients traités avec des anticorps anti- VEGF (Kloeckener-Gruissem et al., 2011 ; Brantley et al., 2007)
Il existe donc un besoin de développer de nouvelles thérapies alliant efficacité et acceptabilité pour le traitement des pathologies impliquant une néovascularisation, et notamment des pathologies oculaires. De manière surprenante, les inventeurs ont identifié, pour la première fois, une nouvelle fonction du FH. Après de longues études, ils ont mis en évidence la capacité de fragments du FH à exercer une activité anti-angiogénique. Une telle activité est particulièrement prometteuse pour le traitement de pathologies impliquant une néovascularisation. Ainsi, dans un premier aspect, l'invention concerne un fragment du FH pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ledit fragment du FH comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2.
En effet, les inventeurs ont mis en évidence le fait que les fragments du FH comprenant a minima le domaine SCR7, représenté en SEQ ID N°2, inhibe la néovascularisation, en particulier la néovascularisation choroïdienne. Aussi, les fragments de facteur H apparaissent comme une nouvelle solution pertinente et efficace pour le traitement de pathologies, en particulier les pathologies oculaires, liées à une vascularisation excessive ou une néovascularisation choroïdienne. L'invention propose donc une nouvelle stratégie thérapeutique efficace pour le traitement de patients souffrant de pathologies oculaires impliquant une vascularisation excessive ou une néovascularisation choroïdienne.
Par "Facteur H" ou "FH" on entend une glycoprotéine intervenant dans la régulation de la voie alterne du complément. Plus spécifiquement, le FH joue un rôle dans la régulation de la voie alterne du complément en interagissant principalement avec la molécule C3b. Le FH, codé par le gène FH, est majoritairement synthétisé dans le foie mais peut également, être exprimé localement par différents types cellulaires incluant les cellules de l'EPR, les cellules endothéliales, et autres. Le FH possède des séquences répétitives d'environ 60 acides aminés appelées " domaines SCR" (short consensus repeat). La région du FH impliquée dans la régulation en phase fluide de l'activité complément de la voie alterne est localisée au niveau des domaines SCR1-4. Le FH possède des sites de liaison au C3b (SCR1-4, SCR6-8, SCR12- 14 et SCR19-20) et aux glycosaminglycannes (GAGs) (SCR6-8, et SCR19-20). Ainsi, le FH peut interagir avec les matrices extracellulaires. Le domaine SCR19-20 est aussi un site de liaison au C3b et plus précisément au C3d. Le FH possède aussi des sites de liaison à la protéine C réactive ou CRP (SCR6-8 et SCR 16-20), qui est une protéine de la phase aiguë synthétisée principalement par le foie et qui joue un rôle important dans les réactions inflammatoires et sert de marqueur biologique à celles-ci. Enfin le FH possède un site de liaison au Zinc (SCR6-8), important pour l'oligomérisation du CFH. Le FH et le Facteur I (FI) régulent la voie alterne du complément par le contrôle de la boucle d'amplification de la voie alterne. Le FH se fixe sur le C3b de façon compétitive avec le facteur B (FB), ce qui entraîne une dissociation accélérée de la C3 (C3bBb) ou de la C5 (C3bBbC3b) convertase alterne, qui perd ainsi son activité. De plus, le FH lié au C3b joue le rôle de co-facteur pour le FI, permettant à celui-ci de cliver C3b en C3bi, molécule incapable de se lier au FB pour former C3bBb. La dérégulation ou l'inactivation de la voie alterne contrôlée par le FH, peut entraîner l'activation incontrôlée de C3, entraînant l'assemblage des composants terminaux du complément en complexe d'attaque membranaire ou MAC. Ce complexe, qui est composé des protéines du complément C5b9, reste lié et forme un pore transmembranaire, composant cytotoxique du système du complément et qui entraine la lyse des cellules cibles.
L'art antérieur décrit que le FH peut être utilisé pour traiter certaines dégénérescences rétiniennes du fait de son activité anti-inflammatoire ou antioxydante. En effet, le document WO2006/088950 décrit un polymorphisme dans le gène du FH générant le variant Y402H qui est associé à l'augmentation de risque de développement de la DMLA (Edwards et al., 2005; Hageman et al., 2005 ; Haines et al., 2005 ; Klein et al., 2005 ; Despriet et al., 2006). De plus, le document WO2011/113641 décrit l'utilisation du FH dans le traitement et/ou la prévention de plusieurs pathologies, dont des pathologies oculaires. Cette demande décrit une activité du FH qui repose sur sa capacité à se lier à au malondialdéhyde endogène, empêchant ainsi la production de substances proinflammatoires. Ainsi, l'activité du FH décrite dans ce document est une activité anti-inflammatoire, l'activité anti-angiogénique du FH n'y est pas décrite. En outre, la stratégie proposée par le document WO2011/113641 vise uniquement à traiter des pathologies comprenant une composante inflammatoire.
Par ailleurs, le document WO2013/140104 décrit un rôle antioxydant du
FH. Il y est notamment décrit que le FH protège l'EPR soumis à un stress oxydatif, notamment grâce à un effet protecteur sur les jonctions serrées des cellules de l'EPR contre le stress oxydatif, plus précisément contre la déstabilisation et la désorganisation des jonctions serrées des cellules rétiniennes soumises à un stress oxydatif. Là encore, l'activité anti- angiogénique du FH n'y est pas décrite.
Dans l'article de Kim et al. (2013), il est montré que le FH plasmatique humain a un rôle anti-angiogénique dans un modèle de néo-vascularisation induite par impact laser chez le rat. La présente invention se démarque de cet enseignement en identifiant pour la première fois des fragments du FH, et non le FH entier, avec une activité anti- angiogénique .
L'utilisation de fragments du FH, et non le FH entier, présente plusieurs avantages. Le plus faible poids moléculaire des fragments, comparé à la protéine entière, permet l'injection d'une plus grande concentration molaire de molécules actives dans l'œil. En effet, les volumes d'administration intra- oculaire dans les traitements de la DMLA sont limités (environ 50 μΐ chez l'Homme). Il est donc avantageux d'utiliser des principes actifs plus petits, afin de pouvoir augmenter leurs nombres, formulés dans un faible volume d'injection. De plus, l'utilisation de fragments permet de limiter les sites de glycosylation, autorisant ainsi une limitation des variations de glycosylation lors de leur production industrielle et donc d'assurer, à grande échelle, une homogénéité de structure. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que les fragments du FH selon l'invention diminuent non seulement la surface de néovascularisation (i.e. formation de nouveaux vaisseaux) mais permettent également de renforcer l'intégrité membranaire des néovaisseaux, limitant ainsi la diffusion de liquide ou du sang.
La séquence peptidique du FH humain natif est représentée en SEQ ID N°l. Cette séquence est connue de l'homme du métier et est disponible sous le numéro d'accession UniProtKB - P086031 dans la base uniProt.
Par "fragment de FH", on entend une partie de la séquence peptidique du Facteur H. Par définition, l'expression "fragment du facteur H" exclut le facteur H entier. Préférentiellement, ce fragment de FH a conservé la même propriété biologique d'intérêt que le FH humain. En d'autres termes, il s'agit d'une partie de la séquence peptidique du FH présentant la propriété anti- angiogénique du FH. Par "propriété biologique d'intérêt du FH", on entend la propriété anti-angiogénique dudit FH.
Par "fragment du FH selon l'invention", on entend les fragments du FH comprenant a minima le domaine SCR 7 du FH humain. La séquence de SCR7 du FH humain est représentée à la séquence SEQ ID N°2. Elle est comme suit:
CYFPYLENGYNQNYGRKFVQGKSIDVACHPGYALPKAQTTVTC MENGWSPTPRC.
Cette séquence est codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°3.
Dans un mode de réalisation préféré, le fragment selon l'invention comprend préférentiellement le domaine SCR 7, fusionné avec les domaines N- terminaux ou C-terminaux du FH.
Dans un autre mode de réalisation préféré, lesdits domaines N-terminaux ou C-terminaux du FH sont constitués, respectivement, des domaines SCR 1 à 4 et SCR 19 à 20.
Dans un autre mode de réalisation préféré, le fragment selon l'invention comprend, préférentiellement, une séquence d'acides aminés choisie parmi : la séquence du domaine SCR7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°2 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°3;
la séquence des domaines SCR 1 à 7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N° 4, et codée par la séquence nucléotidique
SEQ ID N°5;
la séquence des domaines SCR 1 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°6, et codée par la séquence nucléotidique SEQ
ID N°7;
la séquence des domaines SCR 7 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°8, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°9;
- la séquence des domaines SCR 7 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°10, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°11,
la séquence des domaines SCR 6 à 8 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°12, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°13. Par "polynucléotide selon l'invention", on entend une séquence d'acides nucléiques codant pour un fragment du facteur H selon l'invention. Typiquement, le polynucléotide selon l'invention comprend a minima une séquence codante pour le domaine SCR7 du facteur H tel que représenté en SEQ ID N°3.
Préférentiellement, le polynucléotide de l'invention comprend une séquence d'acides nucléiques choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°l l, et SEQ ID N°13.
Les inventeurs ont identifié, pour la première fois, une nouvelle fonction de fragments du FH en tant qu'agent anti-angiogénique et l'utilisation d'un tel fragment du FH pour le traitement de pathologies oculaires impliquant une néovascularisation. Dans le cadre de la présente invention, l'expression "les pathologies impliquant une néovascularisation" englobe toutes les pathologies qui sont caractérisées par une activité angiogénique anormale, i.e. la formation de nouveaux vaisseaux sanguins irrigant une tumeur ou toute autre anomalie tissulaire, notamment oculaire. Dans le cadre de l'invention, les termes néovascularisation et angiogénèse sont synonymes et désignent une vascularisation anormale et/ou excessive et/ou susceptible d'aboutir à une situation pathologique. Une telle néovascularisation se retrouve dans plusieurs pathologies oculaires, parmi lesquelles la DMLA exsudative.
Selon l'invention, on entend par le terme "traitement" ou "traiter", l'action de supprimer, réduire ou inhiber la progression de la maladie à laquelle ce terme s'applique. On entend également par le terme « traitement » ou « traiter », l'action de supprimer, réduire, inhiber la progression de l'apparition d'un ou plusieurs symptômes de la condition ou de la maladie à laquelle ce terme s'applique.
Selon l'invention on entend par le terme "prévention" ou "prévenir" l'action d'éviter, retarder ou limiter l'apparition d'une pathologie ou des symptômes d'une pathologie chez un sujet sain, ou un sujet connu pour avoir une prédisposition à déclencher ladite pathologie. Dans un mode de réalisation préféré, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l'occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne et le cancer.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, des tumeurs vasculaires d'origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales.
Plus préférentiellement, la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA et la néovascularisation choroïdienne.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la pathologie impliquant une néovascularisation est la DMLA de forme néovasculaire. Il s'agit en effet d'un groupe de patients susceptibles d'être traités grâce à l'activité anti-angiogénique des fragments du facteur H selon l'invention mis en évidence par les inventeurs.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la pathologie impliquant une néovascularisation est la néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte ou à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite.
"La dégénérescence maculaire liée à l'âge" ou "DMLA" est une pathologie touchant d'abord le centre de la rétine, la macula, et entraîne de fait une perte de la vision précise. Bien que préservant la vision périphérique, ce qui permet aux personnes atteintes de s'orienter globalement, la DMLA affecte la qualité de vie de façon importante. Elle constitue la première cause de perte de la vision centrale irréversible dans les pays industrialisés. L'âge est le premier facteur de risque de la DMLA. L'EPR dans la partie centrale de la rétine est considéré comme la première cible de la DMLA. Ainsi, les dommages ou la perte de fonction de l'EPR induisent la mort des photorécepteurs. Diverses études ont mis en évidence le fait que la DMLA est une pathologie complexe liée à de nombreux facteurs, notamment environnementaux et génétiques. Il existe deux formes de DMLA: la forme atrophique et la forme humide. La forme atrophique, également appelée atrophie géographique ou DMLA sèche, se traduit par la disparition progressive des cellules de l'EPR, puis à celle des photorécepteurs situés au niveau de la macula. La forme humide, également dénommée néovasculaire ou exsudative, quant à elle, implique un processus d'angiogenèse et se traduit par une prolifération de nouveaux vaisseaux anormaux sous la rétine. Ces vaisseaux fragiles laissent diffuser du sérum, responsable d'un soulèvement de la rétine, et/ou du sang entraînant l'apparition d'hémorragies rétiniennes.
"La néovascularisation choroïdienne" correspond à l'apparition de néovaisseaux choroïdiens. Elle correspond à une prolifération de vaisseaux sanguins anormaux sous la rétine, dans la couche choroïdale du globe oculaire. Les vaisseaux anormaux peuvent laisser échapper des liquides et du sang, provoquant des œdèmes et soulèvement la rétine. Elle se traduit le plus souvent par :
des métamorphopsies (c'est-à-dire des troubles de la vision se caractérisant par une déformation des images), un scotome relatif ou absolu (c'est à dire une lacune immobile dans le champ visuel), et
une gêne visuelle prédominant en vision de près.
Le diagnostic est souvent confirmé par des examens consistant en un fond de l'œil, une angiographie à la fluorescéine et une tomographie en cohérence optique. La néovascularisation choroïdienne peut être une néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte, à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite infectieuse ou non infectieuse.
II a été montré que la formation du MAC résultant de l'activation de la voie du complément est responsable du développement de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser chez la souris (Andreoli et al. 2009). En effet, le MAC permettrait la libération de facteurs angiogéniques tels que le VEGF, FGF-2 et PDGF, entraînant l'amplification du processus angiogénique (Andreoli et al. 2009). Le MAC a été aussi montré comme contrôlant l'expression du VEGF dans le modèle de CNV chez la souris (Liu et al., 2011)
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences représentées en SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N°10 et SEQ ID N°12 pour le traitement d'une pathologie choisie parmi la DMLA, préférentiellement la DMLA de type néovasculaire, la néovascularisation choroïdienne et le cancer. Toutes les caractéristiques techniques définies précédemment s'appliquent ici.
Le fragment du FH selon l'invention peut être utilisé seul, en combinaison et/ou en association avec d'autres agents actifs, tels que d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires, en particulier des agents anti- VEGF, des glucocorticoïdes, ou encore des agents biologiques tels que un anticorps anti facteur D. Ces différents agents actifs peuvent être utilisés en combinaison thérapeutique, et administrés sous forme séparée, combinée, étalée dans le temps ou concomitante. Le fragment du FH selon l'invention peut également être utilisé pour préparer une composition pharmaceutique pour le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire impliquant une néovascularisation. Ainsi, l'invention concerne aussi une composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l'occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici.
Les fragments du FH selon l'invention peuvent être combinés à tout type de véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable, et optionnellement à une matrice à diffusion prolongée, telle qu'un polymère biodégradable, un réservoir biodégradable ou non biodégradable, des systèmes particulaires ou des implants intraoculaires ou péri oculaires pour former une composition pharmaceutique selon l'invention. Le terme "pharmaceutiquement acceptable" se réfère à des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent pas de réaction inverse, allergique ou autre réaction non désirée lorsqu'elles sont administrées à un mammifère, particulièrement un humain. Un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable peut être solide, semi- solide ou liquide. La forme des compositions pharmaceutiques, leur voie d'administration, leur dosage et leur posologie dépendent naturellement de la sévérité de la pathologie oculaire et de son stade d'évolution.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut se présenter sous toute forme administrable à un patient, et inclut notamment les formes liquides ou solides, typiquement sous forme de collyre, de gel, de solution buvable, mais également les suspensions, poudres lyophilisées, capsules et comprimés. On préfère les compositions formulées de manière à pouvoir être administrée localement, comme par exemple les collyres et les gels, ou par voie orale comme les solutés buvables, les comprimés, les ampoules. La composition pharmaceutique selon l'invention peut également se présenter sous une forme compatible avec une injection, i.e. une injection locale, une administration à travers la muqueuse, une inhalation, une administration orale et plus généralement toute formulation appropriée pour le but visé.
De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme compatible pour une administration oculaire, intra- oculaire, intra-vitréenne, sous-ténonienne, sous-rétinienne, intra-orbital, sous- conjonctivale, intraveineuse, intra-artérielle, intramusculaire, intrapéritonéale, topique, sous-cutanée, intra-nasale, orale ou parentérale.
La composition pharmaceutique selon l'invention comprend de 10% à 90% en poids d'un fragment du FH par rapport au poids total de la composition. Préférentiellement, la composition pharmaceutique selon l'invention contient de 20 à 60% d'un fragment du FH par rapport au poids total de la composition.
Parmi les modes d'administration d'une protéine thérapeutique à l'intérieur de l'œil, l'injection intra-vitréale est une manière simple de libérer une protéine dans le segment postérieur de l'œil afin de minimiser l'exposition systémique. Cependant, l'injection répétée peut entraîner des complications telles que des hémorragies, des décollements de la rétine ou la cataracte.
Afin de réduire le nombre d'injection et de maintenir à un niveau constant l'activité de la protéine thérapeutique, d'autres modes d'administration ont été conçus. Notamment, des polymères particulaires ou non et des lipides particulaires (liposomes, micelles, émulsions nanométriques) permettent la libération progressive de la protéine thérapeutique qui est encapsulée, ce qui réduit la toxicité et augmente sa durée de vie. Enfin, la composition pharmaceutique de l'invention comprend en outre un autre agent actif, tel que, par exemple, d'autres substances utilisées dans le traitement des pathologies oculaires. Typiquement, cet autre agent actif peut être présent dans la composition pharmaceutique à raison d'au moins 20% en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Le fragment du Facteur H selon l'invention peut être administré sous forme de DNA ou cDNA pour une expression génique en local. Aussi, un autre objet de l'invention est un polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
Dans un mode de réalisation préféré, ledit polynucléotide comprend une séquence d'acides nucléiques choisie parmi dans le groupe constitué des séquences représentées en SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°l l, et SEQ ID N°13.
Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant le polynucléotide codant pour le fragment du facteur H de l'invention, ou une cassette d'expression comprenant ledit polynucléotide pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation selon l'invention peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à la séquence d'acide nucléique. Les éléments de contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de la séquence d'acide nucléique. Des exemples d'éléments de contrôle d'expression incluent notamment des systèmes lac, le promoteur du phage lambda, les promoteurs de levure ou les promoteurs viraux. D'autres éléments opérationnels peuvent être incorporés, comme une séquence de tête, des codons de terminaison, des signaux de polyadénylation et des séquences nécessaires pour la transcription et la traduction ultérieure de la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. Il sera compris par l'homme de l'art que la combinaison correcte des éléments de contrôle d'expression dépend du système hôte choisi. Il sera également entendu que le vecteur d'expression doit contenir les éléments supplémentaires nécessaires pour le transfert et la réplication ultérieure du vecteur d'expression contenant la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. De tels vecteurs sont facilement construits en utilisant des méthodes conventionnelles ou disponibles dans le commerce.
L'expression du polynucléotide de l'invention peut par exemple être réalisée localement par toute méthode de transfert du polynucléotide vectorisé par des méthodes virales ou non virales dans n'importe quelle cellule de l'œil. L'invention concerne donc une composition comprenant un polynucléotide selon l'invention pour son utilisation comme médicament de thérapie génique. Les moyens par lesquels le vecteur portant le polynucléotide peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAE-dextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression eucaryotes qui fonctionnent dans les cellules eucaryotes sont utilisés. Des exemples de tels vecteurs comprennent les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, adénovirus, virus de l'herpès, virus de la vaccine, virus de la variole, le poliovirus, lentivirus, les vecteurs d'expression bactériens ou des plasmides tels que pcDNA5.
Des vecteurs viraux offrent l'avantage d'une bonne efficacité de transfection mais ne contrôlent pas la quantité de protéines sécrétées. La technologie de cellules encapsulées a été développée afin de pouvoir administrer une protéine thérapeutique de manière contrôlée, continue et à long terme dans le segment postérieur de l'œil. De plus, des techniques d'électroporation pour transfection spécifique du muscle ciliaire oculaire permettent d'utiliser le muscle ciliaire comme un réservoir de plasmides codant pour des protéines thérapeutiques et ainsi d'exprimer et de sécréter le fragment selon l'invention en intraoculaire et pendant une durée prolongée.
Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode thérapeutique pour le traitement d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ladite méthode comprenant l'administration d'un fragment du facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici.
Dans un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un fragment du facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 pour l'obtention d'un médicament destiné à traiter une pathologie impliquant une néovascularisation. Toutes les caractéristiques techniques mentionnées ci-avant sont applicables ici. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif seulement, et ne sauraient limiter la portée de l'invention. EXEMPLE
Les inventeurs ont ici démontré le potentiel thérapeutique de fragments du FH dans des modèles pertinents de pathologies impliquant la néovascularisation. Pour cela, ils ont produits dans des cellules en culture plusieurs fragments du FH. Ils ont ensuite procédé à la purification de ces fragments. Le dosage de l'activité biologique des fragments a été testé in vitro sur la capacité des fragments du FH (1) à inhiber la lyse des érythrocytes de mouton induite par la voie alterne du complément (activité liée au complexe C5b9),(2) à accélérer la dissociation du complexe C3 convertase formée au préalable dans des plaques ELISA 96 puits (activité anti-C3 convertase), (3) à inactiver, in vitro, la molécule du complément C3b en agissant comme cofacteur du Facteur I (FI). Enfin, les inventeurs ont mesuré l'inhibition de l'angiogenèse par les fragments produits dans le modèle d'induction de la CNV par laser chez le rat. Cette étude a permis de mettre en évidence pour la première fois et de façon inattendue, un rôle anti-angiogénique de fragments du FH.
I. Préparation des fragments du facteur H
Les inventeurs ont développé des fragments du FH comprenant divers domaines. la séquence des domaines SCR 1 à 7 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N° 4, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°5;
la séquence des domaines SCR 1 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°6, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°7;
la séquence des domaines SCR 7 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°8, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°9;
la séquence des domaines SCR 7 à 18 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°10, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N011,
la séquence des domaines SCR 6 à 8 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°12, et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°13.
la séquence des domaines SCR 1 à 4 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°14 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°15;
la séquence des domaines SCR 1 à 6 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°16 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°17;
la séquence des domaines SCR 8 à 20 du FH humain, telle que représentée en SEQ ID N°18 et codée par la séquence nucléotidique SEQ ID N°19;
Le nom, la nature et la séquence de ces fragments sont résumés dans le tableau 1 ci-après:
II. Production et purification des fragments du facteur H
Les séquences nucléiques des fragments de FH ont été clonées dans un vecteur plasmidique permettant l'expression de ces molécules dans des cellules eucaryotes. La sécrétion de ces molécules dans le surnageant de culture cellulaire est favorisée par l'utilisation en position N-terminale d'un peptide signal choisi judicieusement (MB7). La production des fragments est réalisée par transfection transitoire dans la lignée cellulaire humaine HEK 293F. Après 7 jours de production en mode batch, le surnageant est récolté, clarifié, concentré puis filtré stérilement (0.22μιη).
La purification des fragments du FH s'effectue par chromatographie d'affinité sur colonne Ni-NTA ou colonne de cobalt par l'intermédiaire du tag hexahistidine ajouté en position C-terminale des fragments de FH. Le fragment FH 1NT18 ne contenant pas de tag en position C-terminale, a été purifié par une ou deux étapes de chromatographie échangeuse d'ions (SP-Sepharose et Q- Sepharose). Les fragments de FH élués ont été soumis à une dialyse contre du tampon PBS puis concentrés si la concentration finale déterminée par absorbance à 280nm était inférieure à 30C^g/ml.
III. Caractérisation in vitro de l'activité fonctionnelle des fragments du FH
Matériel et Méthodes
L'activité anti-C3 convertase, exprimée en EC50, détermine la concentration en FH ou fragment de FH nécessaire pour dissocier 50% de la C3 convertase (C3bBb) préformée (IC50) après 32 min d'incubation à 34°C. Dans un premier temps, la génération de la C3 convertase est donc réalisée dans les puits d'une plaque de microtitration de la façon suivante : 100 μΐ d'une solution de C3b (2,5 μg /ml) sont déposés par puits et incubés une nuit à 4°C ; après saturation des sites de fixation non occupés, l'étape de génération de la C3 convertase est réalisée en ajoutant 4μg/ml de facteur B (FB), 0.3μg/ml de facteur D (FD) et du NiC12 1.5mM et en incubant le mélange à 34°C pendant 120 minutes. Dans un second temps, la C3 convertase formée est dissociée par ajout de FH entier ou de fragments de FH à différentes concentrations pendant 32 à 34 min à 34°C. Après lavage, la quantité du complexe C3 convertase encore présent est déterminé par détection du FB humain à l'aide d'un anticorps de chèvre anti-FB et un anticorps anti-Ig (H+L) de chèvre couplé à la peroxydase.
Le FH, en phase fluide, agit en tant que cofacteur du FI qui clive le C3b. Le FI coupe la chaîne a' de 110 kDa du C3b libérant un fragment a' de 43 kDa et produit ainsi le C3bi. Le FH ou ses fragments sont incubés à différentes quantités avec du Facteur I et du C3b purifiés (0,14 μg et 10 μg, respectivement) à 37°C pendant 30 minutes. La réaction est stoppée par l'ajout d'un tampon de dénaturation / réduction contenant du SDS et incubation 3 minutes à 95°C. Des mélanges réactionnels contrôles ne contenant soit que le C3b soit le mélange C3b et FI sont également préparés et incubés dans les mêmes conditions. Les échantillons sont ensuite déposés sur gel de polyacrylamide 10% en présence de SDS et soumis à une électrophorèse (SDS- PAGE). Après coloration des gels au bleu de Coomassie, les bandes colorées correspondant aux produits de clivage de la chaîne a' sont scannées, quantifiées par analyse densitométrique et normalisées par les valeurs obtenues pour la chaîne non clivé a' .
Les globules rouges de moutons dont la surface est riche en acide sialique, lient le FH par sa partie C-terminale, empêchant ainsi la formation de la C3 convertase et par suite, la lyse cellulaire. Une suspension de globules rouges de moutons (1x10 GRM/ml) est reprise dans un tampon de réaction contenant 10 mM EGTA et 7 mM MgC12 et mise en présence d'un mélange de plasma normal et de plasma dépiété en FH afin de permettre l'activation de la voie alterne du complément.. Des concentrations croissantes de FH ou de fragments de FH sont ajoutés avant l'induction de l'activation de la voie alterne du complément pour évaluer l'inhibition de la lyse des GRM par ces molécules. Le mélange est incubé à 37°C dans un bain maire durant 30 à 35 minutes, puis la réaction est stoppée par ajout d'un tampon Hepes lOmM contenant 2mM d'EDTA. Après centrifugation 5 minutes à 1730g, 200μ1 de surnageants sont prélevés pour une mesure de densité optique à 414nm. La mesure d'activité anti-hémolytique est déterminée en % du contrôle, dont la valeur correspond à la concentration molaire de FH plasmatique nécessaire pour obtenir une inhibition complète de la lyse (100%).
Résultats Tableau 2 : Activités biologiques des fragments du FH
Les résultats présentés dans le tableau ci-dessus montrent que :
seuls les fragments contenant les SCR 1 à 4 ont une activité anti-C3 convertase. De plus, l'activité du fragment minimal " 1NT4 " est significativement plus faible que celle des fragments contenant les SCR suivants (SCR 5 à 18).
de même, seuls les fragments contenant les SCR 1 à 4 ont une activité cofacteur du FI.
l'activité anti-hémolytique est portée par des fragments qui sont constitués des SCR 1 à 4 pour inhiber l'activité C3-convertase et SCR 19-20 pour se fixer aux résidus d'acide sialique présents à la surfaces des globules rouges de moutons.
IV. Analyse de l'inhibition de l'angiogenèse
Les inventeurs ont évalué l'activité anti-angiogénique induite par chacun des fragments du FH décrit au point I. Pour ce faire, ils ont utilisé un modèle in vivo de néovascularisation choroïdienne (CNV) chez des rats Long Evans (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France). Matériel et Méthodes 1. Essai quantitatif pour la détermination de la néovascularisation choroïdienne.
Les rats ont été anesthésiés (à l'aide d'un mélange de kétamine/xylazine dans un ratio de ΙΟΟμΙ/lOOmg) et les yeux ont été dilatés avec du mydriaticum et anesthésiés avec de la tétracaïne. Six impacts laser Argon situés à deux papilles du nerf optique ont été réalisés à intervalles réguliers. Ensuite, la cornée de ces rats a été protégée à l'aide d'une application d'un gel « Goniosol ». Puis, 3μ1 d'une solution saline seule ou d'une solution de FH diluée dans une solution saline ont été injectés dans le vitré des yeux de chaque rat. Deux temps d'injection ont été testés : 1- en préventif soit le jour même du laser et 2- en curatif soit 4 jours post-laser. Après sacrifice aux jours 7 ou 14 post-laser, les yeux des rats ont été énucléés puis fixés dans une solution de paraformaldéhyde. Seule la partie postérieure de l'œil (EPR/choroïde/sclère) a été prélevée puis coupée radialement. Après avoir bloqué les sites non spécifiques avec une solution de sérum de chèvre, les complexes EPR/choroïde/sclère ont été marqués avec un marqueur des cellules endothéliales dilué dans une solution saline. Les complexes EPR/choroïde/sclère sont alors montés entre lame et lamelle à l'aide d'un milieu de montage. Les marquages ont été observés à l'aide d'un microscope confocal « Zeiss » et des images de l'ensemble de l'impact laser, appelées Stacks, ont été prises. Ces images ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel « ImageJ » ainsi la surface de marquage a été quantifiée pour chaque impact et ce pour chaque œil de rat. Pour chaque expérimentation, au moins 3 groupes de 4 rats ont été expérimentés : 1- rats non injectés (groupe témoin), 2- rats injectés avec une solution saline (groupe test de l'injection) et 3- rats injectés avec une solution de FH.
Résultats
Les inventeurs ont mesuré l'inhibition de la néovascularisation choroïdienne conférée par les différents fragments du FH produits. Ces résultats sont résumés dans le tableau 3 ci-dessous : Nom du SCR du FH Séquence Inhibition de la Inhibition de la fragment compris dans d'acides néovascularisation formation de MAC le fragment aminés choroïdienne
FH entier SCR 1 à 20 SEQ ID N° l 76% 85%
" 1NT7" SCR 1 à 7 SEQ ID N°4 73% 69%
" 1NT18" SCR 1 à 18, SEQ ID N°6 67% 59%
"7CT20" SCR 7 à 20 SEQ ID N°8 80% 63%
"7CT18" SCR 7 à 18 SEQ ID N° 10 56% 88%
"SCR6-8" SCR 6 à 8 SEQ ID N° 12 0% 85%
"SCR1-4" SCR 1 à 4 SEQ ID N° 14 0% 15%
"SCR1-6" SCR 1 à 6 SEQ ID N° 16 47% 40%
"8CT20 SCR 8 à 20 SEQ ID N° 18 0% 0%
Ces résultats mettent clairement en évidence que les fragments selon l'invention, c'est-à-dire les fragments comprenant le domaine SCR7 du FH permettent une inhibition maximale de la néovascularisation choroïdienne.
Les fragments présentant une inhibition de la néovascularisation choroïdienne agissent aussi en inhibant la formation de MAC.
A la connaissance des inventeurs, il s'agit des premiers essais montrant un rôle anti-angiogénique des fragments du FH comprenant le domaine SCR7.
Ces fragments apparaissent alors comme particulièrement pertinents pour le développement de stratégies de traitement de pathologies impliquant la néovascularisation.
V- Altération de la signature génique de la CNV par les fragments du FH
Pour évaluer l'activité du rFH et de ses fragments sur la signature génique de la CNV, une analyse quantitative de l'expression des gènes codant pour les molécules de l'angiogénèse dans le complexe rétine/cellules de l'épithélium pigmentaire/choroïde a été réalisée par la méthode de qRT-PCR.
Résultats Les résultats montrent que les fragments rFHlNT7 et rFH7CT20 ont la même activité inhibitrice de la transcription des gènes de l'angiogénèse à savoir VEGFA, VEGFRl et VEGFR2 que le rFH entier. De plus, le FH entier et les 2 fragments induisent une augmentation de l'expression du gène codant pour le PEDF, facteur inhibiteur de l'angiogénèse.

Claims

Revendications
1. Fragment du Facteur H pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation, ledit fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2, fusionné avec les domaines N-terminaux ou C-terminaux du Facteur H.
2. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 1, ledit fragment comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2 fusionnée avec les domaines SCR 1 à 4 du facteur H humain et/ou les domaines SCR 19 à 20 du facteur H.
3. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 1, ledit fragment comprenant une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, et SEQ ID N° 10.
4. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite pathologie impliquant une néovascularisation est choisie dans le groupe constitué de la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l'occlusion vasculaire veineuse, et les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.
5. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, des tumeurs vasculaires d'origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales.
6. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la pathologie impliquant une néovascularisation est une pathologie oculaire choisie dans le groupe constitué de :
la DMLA de forme néovasculaire,
la néovascularisation choroïdienne, et
- les tumeurs oculaires d'origine vasculaire ou non.
7. Fragment du Facteur H pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la pathologie impliquant une néovascularisation est la néovascularisation choroïdienne secondaire à la DMLA ou la néovascularisation choroïdienne secondaire à une myopie forte, à une inflammation intraoculaire ou à une choroïdite infectieuse ou non infectieuse.
8. Composition pharmaceutique comprenant un fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°2, fusionné avec les domaines N-terminaux ou C-terminaux du Facteur H pour une utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie oculaire choisie parmi la DMLA, la néovascularisation de l'iris, la néovascularisation intraoculaire, la néovascularisation cornéenne, la néovascularisation rétinienne, la néovascularisation choroïdienne, la rétinopathie ischémique, la rétinopathie radique, le glaucome néovasculaire, la rétinopathie diabétique, la rétinopathie de la prématurité, l'occlusion vasculaire veineuse, les vasculopathies prolifératives non tumorales et le cancer.
9. Composition pharmaceutique comprenant un fragment du Facteur H comprenant la séquence d'acides aminés représentée en SEQ JD N°2, fusionné avec les domaines N-terminaux ou C-terminaux du Facteur H pour une utilisation selon la revendication 8, dans laquelle ledit cancer est choisi dans le groupe constitué des tumeurs intraoculaires vascularisées et/ ou vasculaires, des vasculopathies prolifératives tumorales, des tumeurs vasculaires d'origine vasculaire ou non telles que les hémangiomes choroidiens, les proliférations angiomateuses intrarétiniennes, les anastomoses choriorétiniennes ou les vasculopathies polypoidales.
10. Polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
11. Polynucléotide pour son utilisation selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit polynucléotide comprend une séquence d'acides nucléiques choisie dans le groupe constitué des séquences représentées en SEQ ID N°5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9 et SEQ ID N° l l .
12. Vecteur d'expression comprenant le polynucléotide comprenant la séquence d'acides nucléiques représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'une pathologie impliquant une néovascularisation.
13. Composition comprenant un polynucléotide comprenant la séquence nucléotidique représentée en SEQ ID N°3 pour son utilisation comme médicament de thérapie génique.
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