EP3325605B1 - Biomasse de thraustochytrides riche en proteines, procede de culture et utilisations - Google Patents

Biomasse de thraustochytrides riche en proteines, procede de culture et utilisations Download PDF

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EP3325605B1
EP3325605B1 EP16750384.6A EP16750384A EP3325605B1 EP 3325605 B1 EP3325605 B1 EP 3325605B1 EP 16750384 A EP16750384 A EP 16750384A EP 3325605 B1 EP3325605 B1 EP 3325605B1
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EP
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biomass
ccap
microalgae
schizochytrium
culture
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Cyril ROLS
Julien PAGLIARDINI
Pierre Calleja
Cécile Gady
Sabrina VANDEPLAS
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Fermentalg SA
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Adisseo France SAS
Fermentalg SA
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/10—General cosmetic use

Definitions

  • the invention falls within the field of cultures of microalgae, particularly Thraustochytrids. It relates to a biomass of Thraustochytrids rich in proteins, its process for obtaining it and its uses in food.
  • soybeans The best known source of vegetable protein used in animal feed is soybeans, generally used in the form of meal, the solid residue remaining after oil extraction.
  • soybean cakes has several disadvantages associated with their origin. Cakes are generally imported from countries that practice intensive soybean cultivation to the detriment of other plants that are a source of biodiversity.
  • GMO genetically modified
  • Animal feeds based on biomass consisting of genetically modified photosynthetic microorganisms are known from WO 2010/051489 .
  • the recombinant enzyme produced by the GMO microorganism has the effect of degrading said biomass to make it compatible with animal feed.
  • Spirulina like chlorella, however, has the disadvantage of low productivity which does not allow the transition to culture in a high yield fermenter. If their culture makes it possible to meet a local and limited demand for traditional food supplements, it does not make it possible to meet a broader objective of industrial production, economically viable, of a source of food proteins whose qualities will allow it to replace the common sources such as soy in animal and human food.
  • protists known to respond to an industrial production capacity in fermenters have long been used for the production of fats rich in polyunsaturated fatty acids such as DHA or EPA, for example.
  • WO 97/37032 WO 2015/004402 Or WO 2012/175027 .
  • the biomasses obtained, including after extraction of the fats do not contain sufficient levels of protein to allow their use as a source of protein in food, at least without additional stages of enrichment with economically costly proteins.
  • the methods used for the extraction of oils can sometimes contaminate the remaining biomass, in particular with organic solvents which make it unsuitable for food consumption.
  • One of the aims of the invention is to provide a new protein source for animal or human food meeting a broad industrial production objective, economically viable, and whose qualities will enable it to replace the usual sources such as soy.
  • the invention shows that under certain culture conditions the Thraustochytrids, known for their use in the production of oils with high levels of polyunsaturated fatty acids (DHA, EPA in particular) are microorganisms capable of producing a large quantity of proteins, which can make it a source of dietary protein similar to soy, especially for animal feed.
  • DHA polyunsaturated fatty acids
  • the invention has as its primary object a biomass of non-genetically modified Thraustochytrids chosen from the genera Aurantiochytrium and Schyzochytrium, of which a majority substantial quantity of Thraustochytrids is not degraded, which comprises, by weight relative to the weight of the dry matter, at least 35% protein, preferably at least 45% protein, possibly up to more than 60% protein, or even more than 75% protein, in particular from 45 to 75% protein.
  • the percentages by weight of proteins can be expressed both in relation to the proteins themselves and in relation to the amino acids contained in said proteins.
  • Said biomass also comprises, by weight relative to the weight of dry matter, less than 20% fat, preferably less than 10% fat, even more preferably less than 7% fat.
  • said biomass is a biomass of non-genetically modified Thraustochytrids chosen from the genera Aurantiochytrium and Schyzochytrium, of which a majority substantial quantity of Thraustochytrids is not degraded, which comprises, by weight relative to the weight of the dry matter, at less than 35%, preferably at least 45%, very preferably from 45% to 60% of proteins and, still by weight relative to the weight of the dry matter, less than 20%, preferably less than 10% of fat, even more preferably less than 7% fat.
  • the invention also relates to the use of a biomass as above or below, in the cosmetics and human or animal food fields, and in particular a food comprising such a biomass.
  • the invention also relates to the biomass according to the invention for its use in therapy.
  • compositions for humans or animals and food, or food compositions for humans or animals, which comprise a biomass according to the invention.
  • biomass advantageously means according to the invention a set of Thraustochytrid cells produced by the culture of said protists, and having the protein and, optionally, fatty acid contents described in the present text, cells which may or may not have retained their physical integrity.
  • said biomass may comprise a quantity of degraded Thraustochytrid cells ranging from 0% to 100%.
  • degraded is meant that said Thraustochytrid cells may have seen their structure and/or their composition modified. For example, they may have undergone a drying step or else a step for harvesting their oil, the important thing being that the biomass comprising these cells has the protein and, optionally, fatty acid contents described in the present text.
  • the biomass has not undergone treatments which modify its amino acid composition during or after harvest. That is to say that the treatments that this biomass undergoes after harvesting do not alter its amino acid composition.
  • the biomass does not undergo a step of enrichment in proteins and/or in amino acids. That is to say, the proteins, peptides and amino acids contained in the biomass according to the invention come from the sole culture of Thraustochytrids. It should be noted that proteins or amino acids not produced by Thraustochytides are likely to be present in the culture medium, in particular in the case of preculture on a medium comprising a yeast extract. The residual quantities of these proteins likely to be present in the biomass, if any, will be in the state of undetectable traces, included in the definition of a biomass which does not undergo protein enrichment and/or in amino acids.
  • the biomass has not undergone treatments which modify its composition in terms of amino acids and fat. That is to say that the treatments that this biomass undergoes after harvesting do not alter its composition in amino acids and fats.
  • the relative composition of amino acids with respect to fat remains substantially constant.
  • Thraustochytrids in the biomass according to the invention have better preservation and digestibility properties than degraded Thraustochytrids.
  • One of the preferred forms of the invention is a biomass comprising a substantially majority amount of Thraustochytrids which are not degraded.
  • Thraustochytrids whose structural and/or chemical integrity may have been altered, such as for example lysed Thraustochytrids, resulting for example from a homogenization process.
  • said biomass may have, by weight relative to the weight of the dry matter, a moisture content of 1% to 95%.
  • said biomass may have, by weight relative to the weight of the dry matter, a moisture content of 70 to 90%, preferably 80 to 85%.
  • said biomass may have, by weight relative to the weight of the dry matter, a moisture content of 1 to 10%, preferably of 2 to 7%.
  • said Thraustochytrids may be of the order Thraustochytriales, preferentially of the subclass Thraustochytriaceae, even more preferentially of a genus which can be chosen from the group comprising the genera Aurantiochytrium, Aplanochytrium, Botryochytrium, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium and Ulkenia.
  • Thraustochytrids are very preferentially non-genetically modified microorganisms.
  • said Thraustochytrids can be chosen from the Aplanochytrium kerguelense species; Aplanochytrium minuta; Aplanochytrium stocchinoi; Aplanochytrium sp. PR24-1 ; Aurantiochytrium limacinum; Aurantiochytrium limacinum AB022107; Aurantiochytrium limacinum HM042909; Aurantiochytrium limacinum JN986842 ; Aurantiochytrium limacinum SL1101 JN986842; Aurantiochytrium mangrovei; Aurantiochytrium mangrovei DQ323157; Aurantiochytrium mangrovei DQ356659; Aurantiochytrium mangrovei DQ367049; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4
  • Botryochytrium radiatum Botryochytrium radiatum Raghukumar 16; Botryochytrium radiatum SEK353; Botryochytrium sp. ; Botryochytrium sp. BUTRBC 143; Botryochytrium sp. Raghukumar 29; Oblongichytrium minutum; Oblongichytrium multirudimentalis; Oblongichytrium sp. ; Oblongichytrium sp.
  • Parieticytrium sarkarianum Parieticytrium sarkarianum SEK351; Parieticytrium sarkarianum SEK364; Parieticytrium sp. ; Parieticytrium sp. F3-1; Parieticytrium sp. H1-14; Parieticytrium sp.
  • NBRC102984 Phytophthora infestans ; Schizochytrium aggregatum DQ323159; Schizochytrium aggregatum DQ356661; Schizochytrium aggregatum; Schizochytrium limacinum; Schizochytrium limacinum OUC166 HM042907; Schizochytrium mangrovei; Schizochytrium mangrovei FB1; Schizochytrium mangrovei FB3; Schizochytrium mangrovei FB5; Schizochytrium minutum; Schizochytrium sp. ATCC20888 DQ367050; Schizochytrium sp. KGS2 KC297137; Schizochytrium sp.
  • SEK 210 Schizochytrium sp. SEK 345; Schizochytrium sp. SEK 346; Schizochytrium sp. SR21; Schizochytrium sp. TIO01; Sicyoidochytrium minutum SEK354; Sicyoidochytrium minutum NBRC 102975 Sicyoidochytrium minutum NBRC 102979; Thraustochytriidae sp. BURABG162 DQ100295; Thraustochytriidae sp. CG9; Thraustochytriidae sp. LY2012 JX847378; Thraustochytriidae sp.
  • Thraustochytrium aggregatum Thraustochytrium aggregatum DQ356662; Thraustochytrium aureum; Thraustochytrium aureum DQ356666; Thraustochytrium gaertnerium; Thraustochytrium kinnei; Thraustochytrium kinnei DQ323165; Thraustochytrium motivum; Thraustochytrium multirudimentale; Thraustochytrium pachydermum; Thraustochytrium roseum ; Thraustochytrium sp. 13A4.1; Thraustochytrium sp. ATCC 26185; Thraustochytrium sp.
  • Thraustochytrium sp. BL14 Thraustochytrium sp. BL2; Thraustochytrium sp. BL3; Thraustochytrium sp. BL4; Thraustochytrium sp. BL5; Thraustochytrium sp. BL6; Thraustochytrium sp. BL7; Thraustochytrium sp. BL8; Thraustochytrium sp. BL9; Thraustochytrium sp. BP3.2.2; Thraustochytrium sp. BP3.3.3; Thraustochytrium sp.
  • CCAP CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA
  • step a) of culturing the Thraustochytrids is carried out in a culture medium and under appropriate conditions to promote the production of proteins and to limit the production of fat.
  • said suitable culture medium is preferably a chemically defined culture medium which comprises a carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source and salts.
  • “chemically defined culture medium” is meant according to the invention a culture medium in which the content of each element is known. Specifically, the invention is aimed at a medium that may not contain rich or complex organic matter.
  • rich or complex organic materials we mean unpurified organic materials, in the form of mixtures for which the exact composition and the concentrations of the various components of the mixture are not known with accuracy, not mastered, and can present a significant variability. from one batch to another.
  • rich or complex organic material mention may be made of yeast extracts or peptones which are products of a protein hydrolysis reaction or else rich mineral materials such as, for example, marine mineral salts or other growth agents. complex, not having a fixed concentration of each of their components.
  • said defined medium may comprise salts chosen from calcium, cobalt, manganese, magnesium, zinc, nickel, copper, potassium, iron, sodium salts, and mixtures thereof.
  • said salts can be chosen from calcium chloride, cobalt chloride, manganese chloride, magnesium sulphate, zinc sulphate, nickel sulphate, copper sulphate, potassium sulphate, ferrous sulphate , potassium sulfate, sodium molybdate, sodium selenite, sodium chloride and mixtures thereof.
  • the medium may also comprise sodium chloride (NaCl), in particular for certain strains of marine origin.
  • NaCl sodium chloride
  • the medium may not include sodium chloride (NaCl), at the very least include a very small quantity of sodium chloride, having less than 3.5 g/ L, preferably less than 1 g/L, more preferably less than 10 mg/L of sodium ions and less than 1 g/L, preferably less than 500 mg/L, more preferably 200 mg/L of ions of chloride.
  • NaCl sodium chloride
  • strains which can accept a culture medium which may not comprise sodium chloride (NaCl), at the very least comprising a very small quantity of sodium chloride the strains of Aurantiochytrium mangrovei, in particular the Aurantiochytrium mangrovei strain CCAP 4062/5.
  • the carbon source of said defined medium may be one (or more) carbohydrate(s), one (or more) acetate(s), one or more alcohols, one or more complex molecules, or any mixture, in any proportion from at least 2 of these sources.
  • said nitrogen source of said defined medium may be chosen from one (or more) salt(s) of nitrate, one (or more) salt(s) of glutamate, one (or more) salt(s) ) ammonium, urea, ammonia or any mixture, in any proportion of at least 2 of these sources.
  • the source of phosphorus of said defined medium may be chosen from phosphoric acid, phosphate salts, advantageously sodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 ), or sodium dihydrogen phosphate (NaH 2 PO 4 ), or potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ), or potassium hydrogen phosphate (K 2 HPO 4 ), or any mixture, in any proportion of at least 2 of these sources.
  • said culture medium may comprise magnesium chloride, advantageously in the form of tetrahydrate (MgCl 2 4H 2 O); calcium chloride, advantageously in the dihydrate form (CaCl 2 2H 2 O); cobalt chloride hexahydrate (CoCl 2 6H 2 O); manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl 2 4H 2 O); magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4, 7H2O); zinc sulphate heptahydrate (ZnSO4, 7H2O); nickel sulphate hexahydrate (NiSO 4 6H 2 O); copper sulphate pentahydrate (CuSO 4 5H 2 O); potassium sulphate (K 2 SO 4 ); ferrous sulphate heptahydrate (FeSO 4 .7H 2 O); boric acid (H 3 BO 3 ); ethylenediaminetetraacetic acid in disodium dihydrate form (Na 2 EDTA
  • the magnesium chloride in said culture medium, may be at a concentration of between 0.008 and 0.012 g/L, advantageously between 0.009 and 0.011 g/L;
  • the calcium chloride can be at a concentration of between 0.40 and 0.70 g/L, advantageously between 0.50 and 0.60 g/L;
  • the cobalt chloride hexahydrate can be at a concentration of between 0.00008 and 0.00013 g/L, advantageously between 0.00009 and 0.00012 g/L;
  • the manganese(II) chloride tetrahydrate can be at a concentration of between 0.008 and 0.013, advantageously between 0.009 and 0.012 g/L;
  • the magnesium sulphate heptahydrate can be at a concentration of between 6 and 10 g/L, advantageously between 7 and 9 g/L;
  • the zinc sulphate heptahydrate can be at a concentration of between 0.008 and 0.013, advantageously 0.009 and 0.0
  • the magnesium chloride is at a concentration of 0.0108 g/L
  • the calcium chloride is at a concentration of 0.55 g/L
  • cobalt chloride hexahydrate (CoCl 2 6H 2 O) is at a concentration of 0.000108 g/L
  • the manganese(II) chloride tetrahydrate is at a concentration of 0.0108 g/L
  • magnesium sulphate heptahydrate is at a concentration of 8.01 g/L
  • zinc sulphate heptahydrate is at a concentration of 0.0108 g/L
  • nickel sulphate hexahydrate is at a concentration of 0.0056 g/L
  • copper sulphate pentahydrate is at a concentration of 0.0072 g/L
  • the potassium sulphate is at a concentration of 2.09 g/L
  • the ferrous sulphate heptahydrate is at a concentration of 0.04 g/L
  • boric acid is at a concentration
  • the first culture step a) of the process can be carried out in discontinuous mode called “batch”, in semi-continuous mode called “fed batch” or in continuous mode.
  • the first step is divided into 2 sub-steps, a first sub-step a1) of growth in the appropriate culture medium followed by a second sub-step a2) of production in which can be added to the culture medium, simultaneously or successively, one or more solution(s) for enrichment in carbon source, nitrogen source and/or phosphorus source so as to maintain in the culture medium non-limiting nitrogen and phosphorus content for growth.
  • the growth substep a1) is carried out until a concentration of carbon source, more particularly of glucose, is less than 20 g/L.
  • the growth sub-step a1) is carried out until a culture density of at least 20 g/L, preferably at least 40 g/L, is obtained, more preferably at least 60 g/L, even more preferably at least 80 g/L
  • the non-limiting nitrogen source content in step a2) is advantageously between 0.5 and 5 g/L, preferably between 0.5 and 2 g/L and the non-limiting phosphorus source content is advantageously between between 0.5 and 5 g/L, preferably 0.5 and 2 g/L.
  • the desired carbon source content for this step a2) may be between 0 and 200 g/L, in particular between 5 or even 10 and 50 g/L.
  • the carbon source content in sub-step a2) is between 0 and 50 g/L, more preferably between 0 and 10 g/L.
  • the culture, the first stage a) of which is divided into two sub-stages a1) and a2) as defined above, is carried out in semi-continuous mode called “fed batch”.
  • Thraustochytrids at densities of more than 20 g/L, and in particular of more than 80 g/L, are well known to those skilled in the art.
  • the culture can be carried out by any known culture technique, for example in flasks or in a reactor, but also in fermenters or even in any container suitable for the growth of protists, particularly Thraustochytrids, such as for example basins of the "raceway" type, provided that said technique makes it possible to implement the required culture conditions.
  • any known culture technique for example in flasks or in a reactor, but also in fermenters or even in any container suitable for the growth of protists, particularly Thraustochytrids, such as for example basins of the "raceway" type, provided that said technique makes it possible to implement the required culture conditions.
  • the culture is carried out in fermenters according to known methods for culturing protists in fermenters.
  • the second step b) of the process allowing the recovery of said biomass can be carried out under appropriate conditions to obtain a biomass which can have the desired moisture content.
  • Said recovery of the protists can be carried out by any technique allowing the recovery of the biomass, in particular filtration methods, gravimetric or under reduced pressure, centrifugation, decantation, or even precipitation methods followed by gravimetric filtration.
  • a subject of the invention is also a biomass capable of being obtained by the method according to the invention as described previously in all its variants.
  • a further subject of the invention is the use of a biomass as described above in the cosmetic, pharmaceutical, human or animal food fields.
  • livestock means in particular grazing animals (in particular cattle reared for meat, milk, cheese and leather; sheep reared for meat, wool and cheese; goats), pigs, rabbits, poultry (chickens, hens, turkeys, ducks, geese and others), equines (ponies, horses, foals), intended to support human activities (transport, leisure) or their food , aquatic animals (eg fish, shrimp, oysters and mussels).
  • grazing animals in particular cattle reared for meat, milk, cheese and leather; sheep reared for meat, wool and cheese; goats
  • pigs rabbits
  • poultry chickens, hens, turkeys, ducks, geese and others
  • equines ponies, horses, foals
  • aquatic animals eg fish, shrimp, oysters and mussels
  • a subject of the invention is also a food, or food composition, for humans or animals, which may comprise a biomass according to the invention as described above.
  • the term “food” is understood to mean any composition which can be used as food for humans or animals, in particular farm animals.
  • the food may only comprise biomass, dried or not, transformed or not, or biomass, dried or not, transformed or not, mixed with any other additive, vehicle or support, used in the field human or animal food, such as for example food preservatives, colorants, flavor enhancers, pH regulators, or even pharmaceutical additives such as for example growth hormones, antibiotics.
  • the present invention relates in particular to feedstuffs for animals and more particularly for livestock.
  • These foods are usually in the form of flours, granules or soups in which the biomass according to the invention is incorporated.
  • food is meant anything that can be used as food for animals.
  • feeds may include, in addition to algal biomass, a nutritional base and nutritional additives.
  • the main part of the animal's food ration is then made up of the "nutritional base” and the algal biomass.
  • This base consists, for example, of a mixture of cereals, proteins and fats of animal and/or vegetable origin.
  • Nutritional bases for animals are suitable for feeding these animals and are well known to those skilled in the art.
  • these nutritional bases include, for example, corn, wheat, peas and soya. These nutritional bases are adapted to the needs of the different animal species for which they are intended. These nutritional bases may already contain nutritional additives such as vitamins, mineral salts and amino acids.
  • Additives used in animal feed can be added to improve certain characteristics of feed, for example to enhance its taste, to make the raw materials of animal feed more digestible or to protect animals. They are frequently used in large intensive farms.
  • the invention relates to food for breeding animals comprising between 1 and 60%, preferably between 1 and 20%, quite preferably between 3 and 8% of a biomass dried or obtained by the process according to the invention.
  • the invention relates to food for breeding animals comprising between 1 and 40%, preferably between 5 and 10% of an undried biomass obtained by the method of the invention.
  • the food is intended for farm animals, in particular cattle, sheep, pigs, rabbits, poultry and equines.
  • the food is intended for aquatic animals, in particular fish, at least up to the fry stage, or even including farmed fish.
  • the food is intended for domestic animals, companion animals and/or recreational animals.
  • the food composition is intended for humans.
  • a subject of the invention is also a cosmetic or pharmaceutical composition for humans or animals comprising a biomass according to the invention as described previously.
  • the cosmetic or pharmaceutical composition may comprise only biomass, dried or not, transformed or not, or biomass, dried or not, transformed or not, mixed with any other additive, vehicle or support, used in the field of cosmetics or pharmacy such as preservatives, dyes, pH regulators, for example.
  • a preculture of Aurantiochytrium mangrovei is carried out on a shaking table (140 rpm) in a thermostatically controlled chamber (26°C), in preculture medium, containing 4 g of extract of yeast as a nitrogen source, and 30 g of glucose as a carbon source. After 48 hours of incubation, the cells are centrifuged for 5 minutes at 3000 g and the pellet of cells rinsed with preculture medium containing neither yeast extract nor any other source of mineral or organic nitrogen. The purpose of this operation is to avoid any contribution of Na + in the main culture via the addition of yeast extract.
  • the preculture corresponds to 1/100 (v/v) of the culture volume of the main solution. In the case of the strain of Schizochytrium sp. CCAP 4062/3, 27 g/l of NaCl are added to this medium.
  • the total biomass concentration is monitored by measuring the dry mass (filtration on a GF/F filter, Whatman, then drying in an oven, at 105° C., for a minimum of 24 h before weighing).
  • Cultures of Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 are carried out in useful 1 to 2 L fermenters (bioreactors) with dedicated automatons and supervision by computer station.
  • composition of the culture medium as well as those corresponding to the addition solutions are as follows: Main Solution Concentration (g/L) KCl 0.36 H 3 BO 3 0.175 MgSO 4 .7H 2 0 6,750 CaCl2.2H20 _ 0.55 KNO 3 0.04667 KH2PO4.7H2O _ _ 0.30940 Na 2 EDTA, 2H 2 O 3,094.10 -3 ZnSO4.7H2O _ 7.3.10 -5 CoCl2.6H2O _ 1.6.10 -5 MnCl 2 .4H 2 O 5.4.10 -4 Na2MoO4.2H2O _ _ 1.48.10 -6 Na 2 SeO 3 1.73.10 -6 NiSO 4 .6H 2 O 2.98.10 -6 CuSO 4.5H 2 0 9.8.10 -6 EDTA-Fe 0.03 Carbon g/L Glucose 55 Nitrogen g/L (NH4 ) 2SO4 7 Addition after autoclave vitamins g/L Thiamine
  • the system is regulated at pH 6 via the addition of base (NaOH, or KOH) and/or acid (sulphuric acid solution).
  • the culture temperature was set at 26°C.
  • the dissolved oxygen pressure was regulated in the medium throughout the culture, by the stirring speed (250 - 1200 rpm), the air flow (0.25 - 1 vvm), even the oxygen flow (0.1 - 0.5 vvm).
  • the regulation parameters, integrated in the supervision PLC, made it possible to maintain a constant pO 2 of between 5% and 30%.
  • the culture time was between 20 and 100 hours, preferably between 25 and 96 hours, for example 50 hours.
  • addition solution 1 3 additions of addition solution 1 were made, as well as additions of solution 2 in order to maintain glucose concentrations between 200 mM and 500 mM.
  • the modification of the procedure is done on the mode of pH regulation by addition of ammonia (NH 4 OH) to avoid the significant contribution of Na + or K + related to the pH regulation by soda or potash, and which could be embarrassing for the valorization of products for animal feed. Part of the nitrogen necessary for the culture of the cells being supplied via the regulation of the pH by ammonia (NH 4 OH).
  • the physicochemical parameters are controlled during the culture thanks to integrated regulators, with maintenance of the pH around a set point of 5, regulation of the temperature at 30°C, and maintenance of the pO 2 around a set point of 30% until maximum agitation and airflow values are reached.
  • the modification of the procedure relates to the mediums and their mode of addition.
  • the continuous culture mode is then started as soon as the biomass reaches 20 g/L in the medium.
  • the feed solution supplied continuously is that described in Table 4 below.
  • Table 4 Compound feed solution (g/L) Glucose, 1H 2 O 110,000 sea salts 15,000 MgSO 4.7H 2 O 4,959 K2SO4 _ 6,129 KH 2 PO 4 11,786 MnCl24H2O _ 3,182.10 -2 ZnSO 4 .7H 2 O 3,182.10 -2 CoCl2.6H2O _ 3.2.10 -4 Na2MoO4.2H2O _ _ 3,200.10 -4 CuSO4.5H2O _ 2,121.10 -2 NiSO4.6H2O _ 1,650.10 -2 FeSO 4 .7H 2 O 1,179.10 -1 thiamin 9,429.10 -2 Vitamin B12 1,530.10 -3 Panthotenate 3,182.10 -2 ( NH4 ) 2SO4 26,518 EDTA 4,092.10 -1
  • the dilution rate used directly impacts the protein content of the biomass (results not shown).
  • the dilution rate used is 0.13 h ⁇ 1 which corresponds to half the maximum growth rate of the strain under the culture conditions used.
  • Cultures of Schizochytrium sp. CCAP 4062/3 are carried out in fermenters as essentially described in Example 1.1, with a culture medium supplemented with NaCl at a level of 27 g/L and 35.6 g/L respectively for the fermenter medium and the addition medium.
  • Cultures of Schizochytrium sp. CCAP 4062/3 are carried out in fermenters as essentially described in Example 1.2, with a culture medium supplemented with NaCl at a level of 27 g/L and 35.6 g/L respectively for the fermenter base medium and the medium addition..
  • the Aurantiochytrium Mangrovei CC4062/5 strain was cultured under the conditions of example 1.2. These conditions are those used in the following examples unless otherwise stated.
  • the microalgal biomass was first analyzed for its proximal composition ((humidity (Internal method EAU-H adapted from EC Regulation g/100g 152/2009 of 27-01-2009 (103°C/4h) - SN), materials fat by hydrolysis (EC Regulation 152/2009 of 01-27-2009 - process B - SN), crude proteins estimated on the basis of the sum of total amino acid concentrations (Directive 98/64/EC, 09/3/99 - Standard NF EN ISO 13903), mineral materials (Regulation CE 152/2009 of 27-01-2009 - SN)), and gross energy (NF EN 14918), total fibers (AOAC 985.29 - SN), insoluble walls (according to method of Carré and Brillouet (1989, Determination of water insoluble cell walls in feeds: interlaboratory study.
  • proximal composition ((humidity (Internal method EAU-H adapted from EC Regulation g/100g 152/2009 of 27-01-2009 (103
  • this microalga is evaluated in vivo for the measurement of the digestibility of its amino acids in the caecectomized rooster (Green et al., 1987).
  • the animals (Isabrown adult roosters) were fed by wet gavage with a mash composed of one of the ingredients tested (tested microalgae or a control soybean meal) and supplemented with wheat starch to obtain a level of 18% protein corresponding to the needs of the animals. Twelve roosters housed in individual cages were used per treatment. Each animal received an average of 171.2 ⁇ 14.5 g of mash after a 24-hour fast.
  • excreta collected up to 48 hours after force-feeding were grouped together by group of 4 roosters in such a way that 3 excreta per treatment were freeze-dried. They were then left at room temperature for a water uptake phase (48 hours) in order to stabilize the moisture content, then weighed, crushed (0.5 mm) and analyzed by the Terpstra method (Terpstra and de Hart, 1974) to their non-uric nitrogen content and for their total amino acid concentrations (JEOL AMINOTAC JLC 500/V). Endogenous amino acid losses have previously been determined by evaluating a protein-deprived diet (ie without any protein intake) based on the same experimental design.
  • Example 2.2 Composition of the CC4062/5 strain cultured for 49 h.
  • Strain CC4062/5 was cultured as mentioned above. The culture was stopped at 49 hours, giving rise to a production of microalgal biomass of a few kilos and with the aim of organizing a preliminary test of digestibility in the animal. This biomass was dried on a cylinder dryer and is in the form of flakes. It is identified as “strain no. 4, 49h culture”.
  • microalgae has a composition of total nitrogenous matter (sum of amino acids) and mineral matter that is slightly higher than that of the control soybean meal.
  • the mineral content of the biomass tested is comparable to the lowest concentrations published and ranging from 7 to 43% DM depending on the families, genera and species of microalgae.
  • the phosphorus and calcium contents are inversely proportioned with 2.3 times more phosphorus and 3.3 times less calcium in the microalgae compared to the control soybean meal.
  • the “strain 4, 49h culture” tested does not contain starch reserves and its concentration in total sugars remains low (1.4% DM) compared to the raw materials conventionally used in animal nutrition. Conversely, its fat content is twice as high as that of soybean meal (11.2 vs. 5.6% DM) and its gross energy is 125 kcal/kg DM higher.
  • microalgae The walls of microalgae have different compositions and structures from those of raw materials of plant origin, and make analyzes of fibers conventionally used unsuitable. Also, the analysis of total fibers (TDF) (Prosky et al., 1988) has the advantage of being less restrictive and the "microalgae, strain 4, culture 49h” has a total fiber percentage of 17.4% DM (which for comparison is of the order of what is analyzed in barley or rye grain) with an insoluble plant wall residue (WICW) measured at 5.2% DM.
  • TDF total fibers
  • WICW insoluble plant wall residue
  • the total protein concentrations reported in Tables 4 to 8 are derived from the sum of the amino acids themselves assayed according to the method described above.
  • the sum of the amino acids - as an estimator of the total proteins of the "microalgae, strain 4, culture 49h" - corresponds to 53.4% DM, with more precisely 21.5% DM of essential amino acids and 32.0% DM non-essential amino acids.
  • Table 6 presents the concentrations of amino acids analyzed in the microalgae and soybean meal and expressed as crude or related to the sum of the amino acids.
  • the concentrations of essential amino acids in the microalgae are slightly higher than those measured in soybean meal (respectively 21.5% DM and 24.0% DM).
  • Example 2.3 Measurement of the digestibility of the amino acids of the biomass (strain CC4062/5 cultured for 49 h)
  • the results of standardized ileal digestibility (DIS) of the amino acids measured in the caecectomized rooster are presented in table 6 as well as the concentrations of digestible amino acids.
  • the digestibilities of nitrogen and of the sum of the amino acids of the microalgae are respectively 80.1 ⁇ 0.3% and 78.4 ⁇ 1.0%, i.e. 9.5 and 10.1 points less than the soybean meal control.
  • the arginine and cystine SIDs of the microalga show the lowest results, respectively 61.0 ⁇ 0.8% and 60.9 ⁇ 3.7%.
  • the digestibility coefficients of the essential amino acids of the microalga range from 80.7 ⁇ 1.8% (DIS threonine) to 88.7 ⁇ 0.6% (DIS histidine).
  • the digestibility of lysine is measured at 85.6 ⁇ 1.3%.
  • These coefficients are of the order of 1.2 (SID histidine) to 7.4 (SID tryptophan) points lower than those measured for the control soybean meal.
  • SID histidine SID histidine
  • 7.4 SID tryptophan
  • Example 2.4 Composition of the CC4062/5 strain cultured for 22 h
  • the CC4062/5 strain was cultured under the same conditions but for a period of 22 hours. It is identified as “strain no. 4, culture 22h”.
  • this biomass was dried on a cylinder dryer and is in the physical form of flakes.
  • microalgae, strain 4, culture 22h has a composition in total nitrogenous matter (sum of amino acids) of 2.3 and 1.3 points higher than those of the control soybean meal and the "microalgae, strain No. 4 , culture 49h”.
  • the phosphorus/calcium ratio is out of balance.
  • the phosphorus and calcium contents are inversely proportioned with 3.6 times more phosphorus and 3.6 times less calcium in the microalgae compared to the control soybean meal.
  • Optimized strain No. 4 (22 h culture) contains 1.5 times more total phosphorus than during a 49 h culture.
  • the fat content is higher than that of soybean meal (8% vs 5.6% DM), and the results confirm that neither starch nor total sugars represent a form of energy storage in this strain #4.
  • Gross energy is measured at 4641 kcal/kg DM, ie 371 kcal/kg DM less vs the soybean meal control.
  • the total fibers (TDF) of the “microalgae, strain 4, culture 22 h” represent 12.7% of the DM with an insoluble plant wall residue (WICW) measured at 2.1% DM.
  • the residue deduced as follows: R (%) 100 - MM (%) - MAT (%) - MG (%) - starch (%) - sugars (%) indicates that the TDF content is lower by 15 .1 points to that of the R thus estimated at 27.8% DM.
  • microalgae, strain 4, culture 22 h presenting 2 points more fat than the soybean meal taken in comparison (Table 7).
  • Table 7 The "microalgae, strain 4, culture 22 h” presenting 2 points more fat than the soybean meal taken in comparison (Table 7).
  • the sum of the amino acids amounts to 54.7% of the DM, with more precisely 23.9% DM of essential amino acids and 30.8% DM of non-essential amino acids.
  • Table 8 presents the concentrations of amino acids analyzed in the microalgae and soybean meal and expressed as crude or related to the sum of the amino acids. The results reflect a relatively balanced amino acid profile of the microalgae compared to the control soybean meal. Glutamic acid, arginine and aspartic acid from the "microalgae, strain 4, culture 22h” are present in greater proportion with values (% sum AA) respectively of 26.75, 9.48 and 8, 26%. The lysine content (% AA sum) is 5.94% with reference to that of the control soybean meal (6.12%).
  • Arginine, methionine and to a lesser extent threonine contribute more strongly to the microalgae protein tested than to that of soybean meal (9.48 vs 7.29%, 2.13 vs 1.36% and 4 .27 vs. 4.01% respectively).
  • the microalgae cultured for 22 hours has 2.4 more points of essential acids in the case of a 49-hour culture, ie the same content as that of the control soybean meal. With the exception of arginine, the essential amino acids are present in a greater proportion of the sum of the amino acids.
  • microalgae, strain 4, culture 22 h has higher methionine, arginine and threonine contents than those of soybeans, while the lysine and valine contents are equivalent or even slightly higher in the microalgal biomass.
  • Example 2.5 Measurement of the digestibility of the amino acids of the biomass (strain CC4062/5 cultured for 22 h)
  • the concentrations of digestible lysine, methionine, arginine, threonine and valine are higher than those of the control soybean meal. They reflect a good quality of the protein of the microalgae tested, superior or equivalent to that of a soybean meal.
  • drying process used does not appear to be a factor denaturing the quality of the protein given the high digestibility coefficients measured for lysine.
  • Example 2.6 determination of the Apparent Metabolizable Energy (EMA) value and of the Apparent Metabolizable Energy corrected for the nitrogen balance (EMAn) of the strain CC4062/5 cultured for 22 h.
  • EMA Apparent Metabolizable Energy
  • EMA Apparent Metabolizable Energy
  • the EMA values were initially corrected by the nitrogen balance on the basis of 18% protein content in animal tissues and using the factor of 8.22 kcal/kg N (Hill and Anderson, 1958) .
  • the value of the parameter for a 100% incorporation of the microalgae was extrapolated from the prediction model, thus making it possible to estimate the EMA and EMAn and the coefficient of apparent phosphorus digestibility of the microalgae.
  • Table 10 presents the results of the digestibility of the dry matter and of the apparent metabolisable energy corrected for the nitrogen balance (AMEn) of the control corn-soya feed as well as of the substituted diets R2 to R6.
  • the apparent digestibility coefficients of nitrogen (CUDa nitrogen), phosphorus (CUDa phosphorus) and calcium (CUDa calcium) and fat (CUDa MG) were estimated by the same method.
  • the dry matter digestibility of different diets is strongly correlated with their ADE values.
  • the ADE of the R1 corn-soya diet is measured at 3398 ⁇ 53 kcal/kg DM.
  • the results show that the MEan value of the R2 diet is equivalent to that of the corn-soya control and reflect that the substitution of up to 4% by microalgae does not impact the energy digestibility of the diet.
  • the EMAn as well as the CUDa nitrogen decrease in a linear fashion with the increasing percentages of substitution (P ⁇ 0.0001).
  • the EMA and EMAn values of the “microalgae, strain 4, 22 h culture” are respectively measured at 2785 kcal/kg DM and 2296 kcal/kg DM. It should be noted that these values are in the range of the average in vivo reference of the measurement of the AME soybean meal of protein class 46, 48 and 50 respectively of 2303 ⁇ 137, 2348 ⁇ 248, 2365 ⁇ 178 kcal / kg MS. Thus, the contribution of this microalgae for its energy supply is similar to that of a standard quality soybean meal.
  • Example 2.7 Choice tests and measurement of consumption in chicks of food comprising the biomass according to the invention
  • test 1 the consumption data at each hour of measurement on the 7th and 9th day of age were analyzed according to a paired test procedure (XLSTAT 2010.4.02 ⁇ Addinsoft 1995-2010) considering that the consumption of a feeder is dependent on the consumption of the other in each cage.
  • the chicks have access to only one type of food, supplemented or not with the microalgae ( figure 6 ).
  • About 400 day-old male chicks (Ross PM3) were weighed and divided into weight classes. Two hundred and forty selected animals are placed in groups of 4 on day 1 in 60 unduplicated cages per block of homogeneous weight (15 blocks of 4 cages) with one feed trough per cage, each with an experimental food (15 repetitions per food). In each cage, the 4 chicks are individually identified. Food and water are distributed ad libitum throughout the trial.
  • the experimental feeds are the corn-soya starter feed supplemented with 0, 5, 10 or 15% microalgae, also used in trial 1 with choice of feed.
  • the consumption results show that the "microalgae, strain 4, 22h culture” tested can be included up to 15% in balanced corn-soya feed without affecting the performance of chicks from 0 to 9 days of age.

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Description

    DOMAINE DE L'INVENTION
  • L'invention se place dans le domaine des cultures de microalgues particulièrement des Thraustochytrides. Elle a pour objets une biomasse de Thraustochytrides riche en protéines, son procédé d'obtention et ses utilisations dans l'alimentation.
    • ETAT DE LA TECHNIQUE
  • On connaît plusieurs sources de protéines végétales pour leur utilisation dans l'alimentation humaine ou animale, directement ou comme compléments alimentaires, pour apporter aux animaux et humains des acides aminés nécessaires à leur métabolisme. Ces sources de protéines sont entendues comme des sources d'acides aminés disponibles pour les animaux ou humains une fois les aliments ingérés.
  • La plus connue des sources de protéines végétales employée dans l'alimentation animale est le soja, généralement employé sous forme de tourteaux, résidu solide restant après extraction de l'huile. Toutefois, l'emploi de tourteaux de soja présente plusieurs inconvénients associés à leur origine. Les tourteaux sont généralement importés de pays qui pratiquent une culture intensive du soja au détriment d'autres végétaux source de biodiversité. En outre, de nombreux pays favorisent la culture de variétés de soja génétiquement modifiées (OGM), que l'on retrouve mélangées aux sojas non OGM dans les tourteaux, ce qui ne permet pas de répondre à une demande croissante de produits alimentaires d'origine végétale sans OGM.
  • Des aliments pour animaux à base de biomasse constituée de microorganismes photosynthétiques génétiquement modifiés sont connus de WO 2010/051489 . L'enzyme recombinante produite par le microorganisme OGM a pour effet de dégrader ladite biomasse pour la rendre compatible avec l'alimentation des animaux.
  • On connaît d'autres sources de protéines végétales, notamment la spiruline ou la chlorelle, employées comme compléments alimentaires chez l'homme.
  • La spiruline, comme la chlorelle, présentent toutefois l'inconvénient d'une faible productivité qui ne permet pas le passage à une culture en fermenteur à rendement élevé. Si leur culture permet de répondre à une demande locale et limitée en compléments alimentaires traditionnels, elle ne permet par de répondre à un objectif de production industrielle plus large, économiquement viable, d'une source de protéines alimentaires dont les qualités lui permettront de remplacer les sources usuelles comme le soja dans l'alimentation des animaux et de l'homme.
  • A l'inverse, les protistes connus pour répondre à une capacité de production industrielle en fermenteurs, sont employés depuis longtemps pour la production de matières grasses riches en acides gras polyinsaturés comme le DHA ou l'EPA, par exemple WO 97/37032 , WO 2015/004402 ou WO 2012/175027 . Or, les biomasses obtenues, y compris après extraction des matières grasses, ne contiennent pas de teneurs suffisantes en protéines pour permettre leur usage comme source de protéines dans l'alimentation, pour le moins sans étapes additionnelles d'enrichissement en protéines économiquement coûteuses. En outre, les méthodes employées pour l'extraction des huiles peuvent parfois contaminer la biomasse restante, notamment avec des solvants organiques qui la rendent inapte à une consommation alimentaire.
  • L'un des buts que vise l'invention est de fournir une nouvelle source de protéines pour l'alimentation animale ou humaine répondant à un objectif de production industrielle large, économiquement viable, et dont les qualités lui permettront de remplacer les sources usuelles comme le soja.
  • L'invention montre que dans certaines conditions de culture les Thraustochytrides, connues pour leur utilisation dans la production d'huiles à fortes teneurs en acides gras polyinsaturés (DHA, EPA notamment) sont des microorganismes aptes à produire une grande quantité de protéines ce qui peut en faire une source de protéines alimentaires similaires au soja, en particulier pour l'alimentation animale.
    • EXPOSE DE L'INVENTION
  • Ainsi l'invention a pour objet premier une biomasse de Thraustochytrides non génétiquement modifiés choisi parmi les genres Aurantiochytrium et Schyzochytrium, dont une quantité substantielle majoritaire de Thraustochytrides n'est pas dégradée, qui comprend, en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 35% de protéines, préférentiellement au moins 45 % de protéines, pouvant aller jusqu'à plus de 60 % de protéines, voire plus de 75 % de protéines, en particulier de 45 à 75 % de protéines.
  • Les pourcentages en poids en protéines peuvent être exprimés tant par rapport aux protéines elles-mêmes que par rapport aux acides aminés contenus dans lesdites protéines.
  • Ladite biomasse comprend également, en poids par rapport au poids de la matière sèche, moins de 20% de matière grasse, préférentiellement moins de 1 0% de matière grasse, encore plus préférentiellement moins de 7% de matière grasse.
  • Selon l'invention ladite biomasse est une biomasse de Thraustochytrides non génétiquement modifiés choisi parmi les genres Aurantiochytrium et Schyzochytrium, dont une quantité substantielle majoritaire de Thraustochytrides n'est pas dégradée, qui comprend, en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 35 %, préférentiellement au moins 45 %, très préférentiellement de 45% à 60% de protéines et, toujours en poids par rapport au poids de la matière sèche, moins de 20%, préférentiellement moins de 10% de matière grasse, encore plus préférentiellement moins de 7% de matière grasse.
  • L'invention concerne également un procédé de production d'une biomasse telle que définie ci-dessus et ci-après, caractérisé en ce qu'il comprend :
    1. a. Une première étape de culture des Thraustochytrides dans un milieu de culture défini comprenant une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore et des sels, ledit milieu défini ne comportant pas de matières organiques riches ou complexes, et ladite première étape a) étant divisée en 2 sous-étapes, une première sous-étape
      • a1) de croissance dans le milieu de culture approprié jusqu'à obtenir des teneurs en source de carbone dans le milieu inférieur à 20 g/L suivie d'une deuxième sous-étape
      • a2) de production dans laquelle on ajoute au milieu de culture, simultanément ou successivement, une ou plusieurs solution(s) d'enrichissement en source de carbone pour maintenir la teneur en source de carbone entre 0 et 50 g/L, en source d'azote pour maintenir la teneur en azote entre 0,5 et 5 g/L et/ou en source de phosphore pour maintenir la teneur en phosphore entre 0,5 et 5 g/L de manière à maintenir dans le milieu de culture des teneurs en azote et en phosphore non limitantes pour la croissance jusqu'à l'obtention d'une densité de culture d'au moins 40 g/L en matière sèche ;
    2. b. une deuxième étape de récupération de la biomasse obtenue à la première étape par séparation de ladite biomasse du milieu de culture (récolte); et, le cas échéant
    3. c. une troisième étape de séchage de la biomasse récupérée à la deuxième étape.
  • L'invention concerne aussi l'utilisation d'une biomasse telle que ci-dessus ou ci-après, dans les domaines cosmétiques et alimentaires humain ou animal, et notamment un aliment comprenant une telle biomasse.
  • L'invention concerne également la biomasse selon l'invention pour son utilisation en thérapie.
  • Elle concerne également des compositions cosmétique ou pharmaceutique pour l'homme ou les animaux et des aliments, ou compositions alimentaires pour l'homme ou les animaux, qui comprennent une biomasse selon l'invention.
    • DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
  • On entend avantageusement par "biomasse" selon l'invention un ensemble de cellules de Thraustochytrides produites par la culture desdits protistes, et présentant les teneurs en protéines et, éventuellement en acides gras décrites dans le présent texte, cellules qui peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique.
  • On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de Thraustochytrides dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que lesdites cellules de Thraustochytrides peuvent avoir vu leur structure et/ou leur composition modifiées. Par exemple elles peuvent avoir subi une étape de séchage ou alors une étape de récolte de leur huile, l'important étant que la biomasse comprenant ces cellules présente les teneurs en protéines et, éventuellement en acides gras, décrites dans le présent texte.
  • Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la biomasse n'a pas subi de traitements qui modifient sa composition en acides aminés au cours ou après récolte. C'est à dire que les traitements que subit cette biomasse après récolte ne viennent pas en altérer la composition en acides aminés. En particulier, la biomasse ne subit pas d'étape d'enrichissement en protéines et/ou en acides aminés. C'est à dire les protéines, peptides et acides aminés contenus dans la biomasse selon l'invention proviennent de la seule culture des Thraustochytrides. Il convient de noter que des protéines ou acides aminés non produits par les Thraustochytides sont susceptibles d'être présents dans le milieu de culture, notamment en cas de préculture sur un milieu comprenant un extrait de levure. Les quantités résiduelles de ces protéines susceptibles d'être présentes dans la biomasse, le cas échéant, le seront à l'état de traces non détectables, inclues dans la définition d'une biomasse qui ne subit pas d'enrichissement en protéines et/ou en acides aminés.
  • Selon un mode plus préféré de l'invention, la biomasse n'a pas subi de traitements qui modifient sa composition en acides aminés et en matière grasse. C'est à dire que les traitements que subit cette biomasse après récolte ne viennent pas en altérer la composition en acides aminés et en matières grasses. En particulier, la composition relative des acides aminés par rapport à la matière grasse reste substantiellement constante.
  • Il a été observé dans certains cas que les Thraustochytrides non dégradées dans la biomasse selon l'invention présentent de meilleures propriétés de conservation et de digestibilité que des Thraustochytrides dégradées. Une des formes préférées de l'invention est une biomasse comprenant une quantité substantiellement majoritaire de Thraustochytrides qui ne sont pas dégradées.
  • Par dégradé on entend selon l'invention des Thraustochytrides dont l'intégrité structurelle et/ou chimique a pu être altérée comme par exemple des Thraustochytrides lysées, résultant par exemple d'un procédé d'homogénéisation.
  • Il n'en demeure pas moins évident qu'une fois produite ladite biomasse pourra être utilisée brute, séchée ou non, ou alors subir tout traitement nécessaire à son utilisation, notamment homogénéisée.
  • Selon l'invention ladite biomasse peut présenter, en poids par rapport au poids de la matière sèche, un taux d'humidité de 1% à 95%.
  • Préférentiellement selon une première variante de l'invention ladite biomasse peut présenter, en poids par rapport au poids de la matière sèche, un taux d'humidité de 70 à 90 %, préférentiellement 80 à 85 %.
  • Préférentiellement encore selon une deuxième variante de l'invention ladite biomasse peut présenter, en poids par rapport au poids de la matière sèche, un taux d'humidité de 1 à 10%, préférentiellement de 2 à 7 %.
  • Selon l'invention lesdits Thraustochytrides peuvent être de l'ordre des Thraustochytriales, préférentiellement de la sous-classe des Thraustochytriaceae, encore plus préférentiellement d'un genre pouvant être choisi dans le groupe comprenant les genres Aurantiochytrium, Aplanochytrium, Botryochytrium, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium et Ulkenia.
  • Les Thraustochytrides sont très préférentiellement des microorganismes non génétiquement modifiés.
  • Avantageusement lesdits Thraustochytrides peuvent être choisis parmi les espèces Aplanochytrium kerguelense ; Aplanochytrium minuta ; Aplanochytrium stocchinoi ; Aplanochytrium sp. PR24-1 ; Aurantiochytrium limacinum ; Aurantiochytrium limacinum AB022107 ; Aurantiochytrium limacinum HM042909 ; Aurantiochytrium limacinum JN986842 ; Aurantiochytrium limacinum SL1101 JN986842 ; Aurantiochytrium mangrovei ; Aurantiochytrium mangrovei DQ323157 ; Aurantiochytrium mangrovei DQ356659 ; Aurantiochytrium mangrovei DQ367049 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Aurantiochytrium sp. AB052555 ; Aurantiochytrium sp. AB073308 ; Aurantiochytrium sp. ATCC PRA276 DQ836628 ; Aurantiochytrium sp. BL10 FJ821477 ; Aurantiochytrium sp. LY 2012 PKU Mn5 JX847361 ; Aurantiochytrium sp. LY2012 JX847370 ; Aurantiochytrium sp. N1-27 ; Aurantiochytrium sp. SD116 ; Aurantiochytrium sp. SEK209 AB290574 ; Aurantiochytrium sp. SEK217 AB290572 ; Aurantiochytrium sp. SEK 218 AB290573 ; Aurantiochytrium sp. 18W-13a ; Botryochytrium radiatum ; Botryochytrium radiatum Raghukumar 16 ; Botryochytrium radiatum SEK353 ; Botryochytrium sp. ; Botryochytrium sp. BUTRBC 143 ; Botryochytrium sp. Raghukumar 29 ; Oblongichytrium minutum ; Oblongichytrium multirudimentalis ; Oblongichytrium sp. ; Oblongichytrium sp. SEK347 ; Parieticytrium sarkarianum ; Parieticytrium sarkarianum SEK351 ; Parieticytrium sarkarianum SEK364 ; Parieticytrium sp. ; Parieticytrium sp. F3-1 ; Parieticytrium sp. H1-14 ; Parieticytrium sp. NBRC102984 ; Phytophthora infestans ; Schizochytrium aggregatum DQ323159 ; Schizochytrium aggregatum DQ356661 ; Schizochytrium aggregatum ; Schizochytrium limacinum ; Schizochytrium limacinum OUC166 HM042907 ; Schizochytrium mangrovei ; Schizochytrium mangrovei FB1 ; Schizochytrium mangrovei FB3 ; Schizochytrium mangrovei FB5 ; Schizochytrium minutum ; Schizochytrium sp. ATCC20888 DQ367050 ; Schizochytrium sp. KGS2 KC297137 ; Schizochytrium sp. SKA10 JQ248009 ; Schizochytrium sp. ATCC 20111 ; Schizochytrium sp. ATCC 20888 ; Schizochytrium sp. ATCC 20111 DQ323158* ; Schizochytrium sp. ATCC 20888 DQ356660 ; Schizochytrium sp. ATCC 20889 ; Schizochytrium sp. ATCC 26185 ; Schizochytrium sp. BR2.1.2 ; Schizochytrium sp. BUCAAA 032 ; Schizochytrium sp. BUCAAA 093 ; Schizochytrium sp. BUCACD 152; Schizochytrium sp. BUCARA 021 ; Schizochytrium sp. BUCHAO 113 ; Schizochytrium sp. BURABQ 133 ; Schizochytrium sp. BURARM 801 ; Schizochytrium sp. BURARM 802 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/5 ;Schizochytrium sp. FJU-512 ; Schizochytrium sp. KH105 ; Schizochytrium sp. KK17-3 ; Schizochytrium sp. KR-5 ; Schizochytrium sp. PJ10.4 ; Schizochytrium sp. SEK 210 ; Schizochytrium sp. SEK 345 ; Schizochytrium sp. SEK 346 ; Schizochytrium sp. SR21 ; Schizochytrium sp. TIO01 ; Sicyoidochytrium minutum SEK354 ; Sicyoidochytrium minutum NBRC 102975Sicyoidochytrium minutum NBRC 102979 ; Thraustochytriidae sp. BURABG162 DQ100295 ; Thraustochytriidae sp. CG9 ; Thraustochytriidae sp. LY2012 JX847378 ; Thraustochytriidae sp. MBIC11093 AB183664 ; Thraustochytriidae sp. NIOS1 AY705769 ; Thraustochytriidae sp. #32 DQ323161 ; Thraustochytriidae sp. #32 DQ356663 ; Thraustochytriidae sp. RT49 DQ323167 ; Thraustochytriidae sp. RT49 DQ356669 ; Thraustochytriidae sp. RT49 ; Thraustochytriidae sp. Thel2 DQ323162 ; Thraustochytriidae sp. Thel2 ; Thraustochytrium aggregatum ; Thraustochytrium aggregatum DQ356662 ; Thraustochytrium aureum ; Thraustochytrium aureum DQ356666 ; Thraustochytrium gaertnerium ; Thraustochytrium kinnei ; Thraustochytrium kinnei DQ323165 ; Thraustochytrium motivum ; Thraustochytrium multirudimentale ; Thraustochytrium pachydermum ; Thraustochytrium roseum ; Thraustochytrium sp. 13A4.1 ; Thraustochytrium sp. ATCC 26185 ; Thraustochytrium sp. BL13 ; Thraustochytrium sp. BL14 ; Thraustochytrium sp. BL2 ; Thraustochytrium sp. BL3 ; Thraustochytrium sp. BL4 ; Thraustochytrium sp. BL5 ; Thraustochytrium sp. BL6 ; Thraustochytrium sp. BL7 ; Thraustochytrium sp. BL8 ; Thraustochytrium sp. BL9 ; Thraustochytrium sp. BP3.2.2 ; Thraustochytrium sp. BP3.3.3 ; Thraustochytrium sp. caudivorum ; Thraustochytrium sp. CHN-1 ; Thraustochytrium sp. FJN-10 ; Thraustochytrium sp. HK1 ; Thraustochytrium sp. HK10 ; Thraustochytrium sp. HK5 ; Thraustochytrium sp. HK8 ; Thraustochytrium sp. HK8a ; Thraustochytrium sp. KK17-3 ; Thraustochytrium sp. KL1 ; Thraustochytrium sp. KL2 ; Thraustochytrium sp. KL2a ; Thraustochytrium sp. ONC-T18 ; Thraustochytrium sp. PJA10.2 ; Thraustochytrium sp. TR1.4 ; Thraustochytrium sp. TRR2 ; Thraustochytrium striatum ; Thraustochytrium striatum ATCC24473 ; Thraustochytrium striatum DQ323163 ; Thraustochytrium striatum DQ356665 ; Thraustochytrium visurgense ; Ulkenia amoeboidea SEK 214 ; Ulkenia profunda ; Ulkenia profunda BUTRBG 111 ; Ulkenia sp ; Ulkenia sp. ATCC 28207 ; Ulkenia visurgensis ; Ulkenia visurgensis BURAAA 141 ; Ulkenia visurgensis ATCC 28208.
  • Préférentiellement selon l'invention les Thraustochytrides peuvent être choisis parmi les genres Aurantiochytrium et Schyzochitrium, préférentiellement parmi les espèces
    • Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Aurantiochytrium CCAP 4062/1 déposée le 21 juin 2013 à la CCAP,
    • Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP,
    • Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 déposée le 28 février 2012 à la CCAP,
    • Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP et
    • Schizochytrium sp. CCAP 4087/5 déposée le 20 mai 2014 à la CCAP.
  • Tous les dépôts ont été faits à la CCAP (CULTURE COLLECTION OF ALGAE AND PROTOZOA (CCAP), SAMS Research Services Ltd., Scottish Marine Institute, OBAN, Argyl PA37 1QA United Kingdom) selon les dispositions du traité de Budapest.
  • Selon une variante préférée de l'invention ladite biomasse peut être une biomasse
    • de Thraustochytrides non génétiquement modifiés choisis parmi les genres Aurantiochytrium et Schyzochitrium, préférentiellement parmi les espèces Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/5 ;
    • ladite biomasse ayant une quantité substantiellement majoritaire de Thraustochytrides qui n'est pas dégradée, et présentant :
    • une teneur en protéines, en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 35% de protéines, préférentiellement au moins 45 % de protéines, pouvant aller jusqu'à plus de 60 % de protéines, voire plus de 75 % de protéines, en particulier de 45 à 75 % de protéines;
    • une teneur en matière grasse, en poids par rapport au poids de la matière sèche, de moins de 20 % préférentiellement de moins de 10 %, très préférentiellement de moins de 7% ; et
    • un taux d'humidité avant séchage de 70 à 90 %, préférentiellement de 80% à 85 % ou un taux d'humidité après séchage est de 1% à 10%, préférentiellement de 2% à 7 %.
  • L'invention a aussi pour objet un procédé de production d'une biomasse telle que décrite précédemment qui comprend :
    1. a) Une première étape de culture des Thraustochytrides dans un milieu de culture approprié et dans des conditions pouvant favoriser la production de protéines à une teneur au moins 35% de protéines, préférentiellement au moins 45 % de protéines, pouvant aller jusqu'à plus de 60 % de protéines, voire plus de 75 % de protéines, en particulier de 45 à 75 % de protéines, et qui, éventuellement, limitent la production de matière grasse à une teneur de moins de 20% de matière grasse en poids par rapport au poids de la matière sèche, préférentiellement moins de 10% de matière grasse, encore plus préférentiellement moins de 7% de matière grasse, jusqu'à l'obtention d'une densité de culture d'au moins 40 g/L en matière sèche, préférentiellement au moins 60 g/L, plus préférentiellement au moins 80 g/L ;
    2. b) une deuxième étape de récupération de la biomasse obtenue à la première étape par séparation de ladite biomasse du milieu de culture ; et, le cas échéant,
    3. c) une troisième étape de séchage de la biomasse récupérée à la deuxième étape.
  • De manière préférentielle, l'étape a) de culture des Thraustochytrides est mise en oeuvre dans un milieu de culture et dans des conditions appropriées pour favoriser la production de protéines et pour limiter la production en matière grasse.
  • Selon l'invention, ledit milieu de culture approprié est de préférence un milieu de culture chimiquement défini qui comprend une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore et des sels.
  • Par "milieu de culture chimiquement défini ", on entend selon l'invention un milieu de culture dans lequel la teneur de chaque élément est connue. Précisément, l'invention vise un milieu pouvant ne pas comporter de matières organiques riches ou complexes. Par matières organiques riches ou complexes on entend des matières organiques non purifiées, se présentant sous la forme de mélanges pour lesquels la composition exacte et les concentrations des divers composants du mélange ne sont pas connues avec exactitude, pas maitrisées, et peuvent présenter une variabilité significative d'un lot à un autre. Comme exemple de matière organique riche ou complexe, on peut citer les extraits de levure ou les peptones qui sont des produits d'une réaction d'hydrolyse de protéines ou encore les matières minérales riches comme par exemple les sels minéraux marins ou autres agents de croissance complexes, n'ayant pas de concentration fixe de chacun de leurs composants.
  • Selon l'invention ledit milieu défini peut comprendre des sels choisis parmi les sels de calcium, de cobalt, de manganèse, de magnésium, de zinc, de nickel, de cuivre, de potassium, de fer, de sodium, et leurs mélanges.
  • Avantageusement lesdits sels peuvent être choisis parmi le chlorure de calcium, le chlorure de cobalt, le chlorure de manganèse, le sulfate de magnésium, le sulfate de zinc, le sulfate de nickel, le sulfate de cuivre, le sulfate de potassium, le sulfate ferreux, le sulfate de potassium, le molybdate de sodium, le sélénite de sodium, le chlorure de sodium et leurs mélanges.
  • Selon une variante de l'invention et selon les souches employées, le milieu peut également comprendre du chlorure de sodium (NaCl), notamment pour certaines souches d'origine marine.
  • Selon cette variante, on peut citer à titre d'exemple de souches marines pouvant admettre un milieu de culture pouvant comprendre du chlorure de sodium, les souches de Schizochytrium sp., en particulier Schizochytrium sp. CCAP 4062/3.
  • Selon une autre variante de l'invention et selon les souches employées, le milieu peut ne pas comprendre du chlorure de sodium (NaCl), à tout le moins comprendre une quantité de chlorure de sodium très faible, ayant moins de 3,5 g/L, de préférence moins de 1 g/L, plus préférentiellement moins de 10 mg/L d'ions de sodium et moins de 1 g/L, de préférence moins de 500 mg/L, plus préférentiellement 200 mg/L d'ions de chlorure.
  • Selon cette variante, on peut citer à titre d'exemple de souches pouvant admettre un milieu de culture pouvant ne pas comprendre du chlorure de sodium (NaCl), à tout le moins comprendre une quantité de chlorure de sodium très faible, les souches d'Aurantiochytrium mangrovei, en particulier la souche Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5.
  • Selon l'invention, la source de carbone dudit milieu défini peut-être un (ou des) glucide(s), un (ou des) acétate(s), un ou des alcools, une ou des molécules complexes, ou tout mélange, en toute proportion d'au moins 2 de ces sources.
  • Selon l'invention, ladite source d'azote dudit milieu défini peut-être choisie parmi un (ou des) sel(s) de nitrate, un (ou des) sel(s) de glutamate, un (ou des) sel(s) d'ammonium, l'urée, l'ammoniaque ou tout mélange, en toute proportion d'au moins 2 de ces sources.
  • Selon l'invention, la source de phosphore dudit milieu défini peut-être choisie parmi l'acide phosphorique, les sels de phosphate, avantageusement de l'hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4), ou du dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4), ou du dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4), ou de l'hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4), ou tout mélange, en toute proportion d'au moins 2 de ces sources.
  • Selon une variante de l'invention ledit milieu de culture pourra comprendre du chlorure de magnésium, avantageusement sous forme de tetrahydrate (MgCl2 4H2O) ; du chlorure de calcium, avantageusement sous forme dihydrate (CaCl2 2H2O) ; du chlorure de cobalt hexahydrate (CoCl2 6H2O) ; du chlorure de manganèse (II) tetrahydrate (MnCl2 4H2O) ; du sulfate de magnésium heptahydrate (MgSO4, 7H2O) ; du sulfate de zinc heptahydrate (ZnSO4, 7H2O) ; du sulfate de nickel hexahydrate (NiSO4 6H2O) ; du sulfate de cuivre pentahydrate (CuSO4 5H2O) ; du sulfate de potassium (K2SO4) ; du sulfate ferreux heptahydrate (FeSO4, 7H2O) ; de l'acide borique (H3BO3) ; de l'acide éthylène diamine tétraacétique sous forme disodique dihydrate (Na2EDTA, 2H2O) ; du molybdate de sodium dihydrate, (Na2MoO4, 2H2O) ; du sélénite de sodium, (Na2SeO3) ; à titre de vitamine de la thiamine, de la cobalamine ou vitamine B12, du panthoténate ou vitamine B5 ; une source de carbone ; une source d'azote ; une source de phosphore.
  • Selon une forme préférée de l'invention, dans ledit milieu de culture le chlorure de magnésium peut être à une concentration comprise entre 0,008 et 0,012 g/L, avantageusement entre 0,009 et 0,011 g/L ; le chlorure de calcium peut être à une concentration comprise entre 0,40 et 0,70 g/L, avantageusement entre 0,50 et 0,60 g/L ; le chlorure de cobalt hexahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,00008 et 0,00013 g/L, avantageusement entre 0,00009 et 0,00012 g/L ; le chlorure de manganèse (II) tetrahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement entre 0,009 et 0,012 g/L ; le sulfate de magnésium heptahydrate peut être à une concentration comprise entre 6 et 10 g/L, avantageusement entre 7 et 9 g/L ; le sulfate de zinc heptahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement 0,009 et 0,012 g/L ; le sulfate de nickel hexahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,004 et 0,007 g/L, avantageusement 0,005 et 0,006 g/L ; le sulfate de cuivre pentahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,005 et 0,009 g/L, avantageusement entre 0,006 et 0,008 g/L ; le sulfate de potassium peut être à une concentration comprise entre 0,5 et 3,5 g/L, avantageusement entre 1 et 3 g/L ; le sulfate ferreux heptahydrate peut être à une concentration comprise entre 0,03 et 0,05 g/L, avantageusement entre 0,035 et 0,045 g/L ; l'acide borique peut être à une concentration comprise entre 0,0155 et 0,0195 g/L, avantageusement entre 0,0165 et 0,0185 g/L ; l'acide éthylène diamine tétraacétique sous forme disodique dihydrate peut être à une concentration comprise entre 0,10 et 0,14 g/L, avantageusement entre 0,11 et 0,13 g/L ; le molybdate de sodium dihydrate peut être à une concentration comprise entre 0,00001 et 0,0003 g/L, avantageusement entre 0,00005 et 0,0002 g/L ; le sélénite de sodium peut être à une concentration comprise entre 0,00000015 et 0,000019 g/L, avantageusement entre 0,00000016 et 0,00000018 g/L ; la thiamine peut être à une concentration comprise entre 0,015 et 0,05 g/L, avantageusement entre 0,025 et 0,04 g/L ; la cobalamine ou vitamine B12 peut être à une concentration comprise entre 0,0004 et 0,00065 g/L, avantageusement entre 0,00045 et 0,00060 g/L ; le panthoténate ou vitamine B5 peut être à une concentration comprise entre 0,008 et 0,013, avantageusement entre 0,009 et 0,012 g/L ; la source de carbone peut être à une concentration comprise entre 45 et 65 g/L, avantageusement entre 50 et 60 g/L ; la source d'azote peut être à une concentration comprise entre 7 et 11 g/L, avantageusement entre 8 et 10 g/L ; la source de phosphore peut être à une concentration comprise entre 2 et 6 g/L, avantageusement entre 3 et 5 g/L.
  • Très préférentiellement selon l'invention, dans ledit milieu de culture le chlorure de magnésium est à une concentration de 0,0108 g/L, le chlorure de calcium est à une concentration de 0,55 g/L ; le chlorure de cobalt hexahydrate (CoCl2 6H2O) est à une concentration de 0,000108 g/L ; le chlorure de manganèse (II) tetrahydrate est à une concentration de 0,0108 g/L ; du sulfate de magnésium heptahydrate est à une concentration de 8,01 g/L ; le sulfate de zinc heptahydrate est à une concentration de 0,0108 g/L ; du sulfate de nickel hexahydrate est à une concentration de 0,0056 g/L ; le sulfate de cuivre pentahydrate est à une concentration de 0,0072 g/L ; le sulfate de potassium est à une concentration de 2,09 g/L ; le sulfate ferreux heptahydrate est à une concentration de 0,04 g/L ; l'acide borique est à une concentration comprise entre 0,0155 et 0,0195 g/L de 0,0175g/L ; l'acide éthylène diamine tétraacétique sous forme disodique dihydrate est à une concentration de 0,12 g/L ; le molybdate de sodium dihydrate, est à une concentration de 0,000108 g/L ; le sélénite de sodium, est à une concentration de 0,000000173 g/L ; la thiamine est à une concentration de 0,032 g/L ; la cobalamine ou vitamine B12 est à une concentration de 0,00052 g/L ; le panthoténate ou vitamine B5 est à une concentration de 0,0108 g/L ; la source de carbone est à une concentration de 55 g/L ; la source d'azote est à une concentration de 9 g/L ; la source de phosphore est à une concentration de 4 g/L.
  • Selon l'invention, la première étape a) de culture du procédé peut être réalisée en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu.
  • Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la première étape est divisée en 2 sous-étapes, une première sous-étape a1) de croissance dans le milieu de culture approprié suivie d'une deuxième sous-étape a2) de production dans laquelle on peut ajouter au milieu de culture, simultanément ou successivement, une ou plusieurs solution(s) d'enrichissement en source de carbone, en source d'azote et/ou en source de phosphore de manière à maintenir dans le milieu de culture des teneurs en azote et en phosphore non limitantes pour la croissance.
  • Selon un mode préféré de réalisation, la sous-étape a1) de croissance est mise en oeuvre jusqu'd'une concentration en source de carbone, plus particulièrement en glucose inférieure à 20 g/L.
  • Selon un autre mode de réalisation, la sous-étape a1) de croissance est mise en oeuvre jusqu'à l'obtention d'une densité de culture d'au moins 20 g/L, préférentiellement d'au moins 40 g/L, plus préférentiellement au moins 60 g/L, encore plus préférentiellement au moins 80 g/L
  • La teneur en source d'azote non limitante dans l'étape a2) est avantageusement comprise entre 0,5 et 5 g/L, préférentiellement entre 0,5 et 2 g/L et la teneur en source de phosphore non limitante est avantageusement comprise entre 0,5 et 5 g/L, préférentiellement 0,5 et 2 g/L. La teneur en source de carbone recherchée pour cette étape a2) pourra être comprise entre 0 et 200 g/L, notamment entre 5 voire 10 et 50 g/L. De manière préférentielle la teneur en source de carbone dans la sous-étape a2) est comprise entre 0 et 50 g/L, plus préférentiellement entre 0 et 10 g/L.
  • De manière préférentielle, la culture dont la première étape a) est divisée en deux sous-étapes a1) et a2) telles que définies ci-dessus est réalisée en mode semi-continu dit "fed batch".
  • Les méthodes et milieux de culture appropriés pour permettre la croissance de Thraustochytrides à des densités de plus de 20 g/L, et en particulier de plus de 80 g/L sont bien connues de l'homme du métier.
  • Selon l'invention, la culture peut être réalisée par toute technique de culture connue, par exemple en fioles ou en réacteur, mais aussi en fermenteurs ou encore dans tout contenant apte à la croissance de protistes, particulièrement de Thraustochytrides, comme par exemple des bassins de type "raceway", à condition que ladite technique permette de mettre en oeuvre les conditions de culture requises.
  • De manière préférentielle, la culture est réalisée en fermenteurs selon les méthodes connues de culture des protistes en fermenteurs.
  • Selon l'invention la deuxième étape b) du procédé permettant la récupération de ladite biomasse peut être réalisée dans des conditions appropriées pour obtenir une biomasse pouvant présenter le taux d'humidité recherché.
  • Ladite récupération des protistes, peut être réalisée par toute technique permettant la récupération de la biomasse, notamment les méthodes de filtration, gravimétrique ou sous pression réduite, de centrifugation, de décantation, ou bien encore des méthodes de précipitation suivie d'une filtration gravimétrique.
  • L'invention a aussi pour objet une biomasse susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention tel que décrit précédemment dans toutes ses variantes.
  • L'invention a encore pour objet l'utilisation d'une biomasse telle que décrite précédemment dans les domaines cosmétiques, pharmaceutiques, alimentaires humain ou animal.
  • Elle concerne en particulier l'utilisation d'une biomasse de Thraustochytrides selon l'invention, telle que décrite ci-dessus et ci-après, pour l'amélioration des performances des animaux. Cette amélioration de la performance peut être évaluée, en particulier, par la mesure de la consmooationde consommation, du gain de poids ou encore du « Feed Conversion Ratio » (rapport de conversion de l'aliment).
  • On pourra distinguer dans l'alimentation animale, l'alimentation des animaux d'élevage, en particulier en élevage industriel et celle des animaux domestiques ou encore des animaux de compagnie ou des animaux dits de « loisir » , comme les poissons d'aquarium ou les oiseaux de volière ou en cage.
  • Par « animal d'élevage » on entend notamment les animaux de pacage (notamment les bovins élevés pour la viande, le lait, le fromage et le cuir ; les ovins élevés pour la viande, la laine et le fromage ; les caprins), les porcins, les lapins, les volailles (les poulets, les poules, les dindes, les canards, les oies et autres), les équidés (poneys, chevaux, poulains), destinés à supporter des activités humaines (transport, loisirs) ou leur alimentation, les animaux aquatiques (par exemple les poissons, les crevettes, les huîtres et les moules). On pourra toutefois distinguer l'alimentation des poissons jusqu'au stade d'alevins, et celles des poissons élevés, y compris les aliments et compositions alimentaires qui leur sont destinées.
  • On les distinguera des animaux domestiques, animaux de compagnie ou animaux de loisir qui comprennent également des mammifères, ruminants ou non, des oiseaux ou des poissons. Ils comprennent en particulier les chiens et les chats.
  • L'invention a aussi pour objet un aliment, ou composition alimentaire, pour l'homme ou les animaux, pouvant comprendre une biomasse selon l'invention telle que décrite précédemment. On entend par « aliment » toute composition qui peut servir à la nourriture de l'homme ou des animaux, en particulier les animaux d'élevage.
  • Selon l'invention l'aliment peut ne comprendre que de la biomasse, séchée ou non, transformée ou non, ou de la biomasse, séchée ou non, transformée ou non, mélangée à tout autre additif, véhicule ou support, utilisé dans le domaine de l'alimentation humaine ou animale, comme par exemple les conservateurs alimentaires, les colorants, les exhausteurs de goût, les régulateurs du pH, ou encore des additifs pharmaceutiques comme par exemple des hormones de croissance, des antibiotiques.
  • La présente invention concerne en particulier des aliments pour animaux et plus particulièrement pour les animaux d'élevage. Ces aliments se présentent habituellement sous la forme de farines, de granulés ou de soupe dans lesquels est incorporée la biomasse selon l'invention. On entend par "aliment" tout ce qui peut servir à la nourriture des animaux.
  • Pour l'élevage intensif des animaux, les aliments peuvent comprendre, en plus de la biomasse algale, une base nutritionnelle et des additifs nutritionnels. L'essentiel de la ration alimentaire de l'animal est alors constituée par la "base nutritionnelle" et la biomasse algale. Cette base est constituée à titre d'exemple par un mélange de céréales, de protéines et de matières grasses d'origine animale et/ou végétale.
  • Les bases nutritionnelles pour animaux sont adaptées à l'alimentation de ces animaux et sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cadre de la présente invention, ces bases nutritionnelles comprennent par exemple du maïs, du blé, du pois et du soja. Ces bases nutritionnelles sont adaptées aux besoins des différentes espèces animales auxquelles elles sont destinées. Ces bases nutritionnelles peuvent déjà contenir des additifs nutritionnels comme des vitamines, des sels minéraux et des acides aminés.
  • Les additifs utilisés en alimentation animale peuvent être ajoutés pour améliorer certaines caractéristiques des aliments, par exemple pour en relever le goût, pour rendre plus digestes les matières premières des aliments pour animaux ou protéger les animaux. Ils sont fréquemment utilisés dans les élevages intensifs de grande envergure.
  • Les additifs utilisés en alimentation animale se déclinent, notamment, dans les souscatégories suivantes (source EFSA):
    • additifs technologiques: par exemple, conservateurs, antioxydants, émulsifiants, stabilisateurs, régulateurs d'acidité et additifs pour l'ensilage;
    • additifs sensoriels: par exemple, arômes, colorants,
    • additifs nutritionnels: par exemple, vitamines, aminoacides et oligo-éléments;
    • additifs zootechniques: par exemple, améliorateurs de digestibilité, stabilisateurs de flore intestinale;
    • coccidiostatiques et histomonostatiques (antiparasitaires).
  • Dans un mode de réalisation, l'invention concerne des aliments pour animaux d'élevage comprenant entre 1 et 60 %, de préférence entre 1 et 20%, de façon tout à fait préférentielle entre 3 et 8 % d'une biomasse séchée ou obtenue par le procédé selon la l'invention.
  • Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne des aliments pour animaux d'élevage comprenant entre 1 et 40 %, de préférence entre 5 et 10% d'une biomasse non séchée obtenue par le procédé de l'invention.
  • Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'aliment est destiné aux animaux d'élevage, en particulier les bovins, les ovins, les porcins, les lapins, les volailles et les équidés.
  • Selon un autre mode particulier de l'invention, l'aliment est destiné aux animaux aquatiques, en particulier aux poissons, au moins jusqu'au stade alevins, voire y compris les poissons d'élevage.
  • Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, l'aliment est destiné aux animaux domestiques, animaux de compagnie et/ou animaux de loisirs.
  • Enfin, selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition alimentaire est destinée à l'homme.
  • L'invention à également pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique pour l'homme ou les animaux comprenant une biomasse selon l'invention telle que décrite précédemment.
  • Selon l'invention la composition cosmétique ou pharmaceutique peut ne comprendre que de la biomasse, séchée ou non, transformée ou non, ou de la biomasse, séchée ou non, transformée ou non, mélangée à tout autre additif, véhicule ou support, utilisé dans le domaine de la cosmétique ou de la pharmacie comme par exemple les conservateurs, les colorants, les régulateurs du pH.
  • L'invention a aussi pour objet l'utilisation de la biomasse telle que décrite précédemment en thérapie, ainsi que dans la prévention et le traitement de la malnutrition.
    • Figure 1 : Schéma expérimental de la mesure de l'Energie Métabolisable Apparente (AME) chez le poulet 23 jours ; (essai 14ALG069)
    • Figure 2 : Schéma expérimental du test de choix et de consommation chez le poussin (7 et 9 jours) ; (essai 14ALG081)
    • Figure 3 : Mesure de la consommation d'aliments à 7 jours d'âge dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081)
    • Figure 4 : Mesure de la consommation d'aliments à 9 jours d'âge dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081)
    • Figure 5 : Mesure de la consommation relative moyenne d'aliments sur les 2 tests (à 7j et 9j) dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081)
    • Figure 6 : Mesure de la performance de croissance (consommation, gain de poids, indice de consommation) des poussins de 0 à 7 jours alimentés d'un régime contrôle maïs-soja vs des aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée (non en conditions de choix) (essai 14ALG081)
    • Figure 7 : Mesure de la performance de croissance (consommation, gain de poids, indice de consommation) des poussins de 0 à 9 jours alimentés d'un régime contrôle maïs-soja vs des aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée (non en conditions de choix) (essai 14ALG081)
    EXEMPLES
  • D'autres aspects et caractéristiques de l'invention pourront apparaitre à la lecture des exemples qui suivent ainsi que dans les figures annexées lesquelles décrivent
    • pour la figure 1, le schéma expérimental de la mesure de l'Energie Métabolisable Apparente (AME) chez le poulet 23 jours ; (essai 14ALG069). Environ 300 poussins males (Ross PM3) de 1 jour ont été installés dans un même parquet et nourris avec un aliment démarrage standard à base de blé, de maïs et de tourteau de soja. A 13 jours d'âge les poulets sont mis à jeun 2h avant d'être pesés et répartis par classe de poids. 120 poulets sont ainsi sélectionnés, installés dans des cages métaboliques individuelles et assignés à l'un des traitements expérimentaux selon leur poids (20 répétitions par régime).
  • Les aliments et l'eau sont distribués ad libitum tout au long de l'essai. Les aliments expérimentaux sont présentés en granulés de diamètre 3,2 mm. Après une période d'adaptation de 7 jours aux régimes et aux cages métaboliques, une période de collecte totale des excrétas, encadrée par des jeûnes de 17h, a été menée pendant trois jours : de j20 à j23. Les excrétas sont collectés individuellement chaque jour, cumulés et stockés à - 20°C. A la fin de l'essai les excrétas collectés sont lyophilisés puis laissés à température ambiante pour une phase de reprise en eau (48h) afin de stabiliser le contenu en humidité avant pesée, broyage (0,5 mm) et analyses.
    • Pour la figure 2, le schéma expérimental du test de choix et du test de consommation chez le poussin (7 et 9 jours) ; (essai 14ALG081). Deux essais expérimentaux ont été conduits en parallèle.
      1. 1) Essai 1 - test de choix : Pour l'essai avec choix de l'aliment, environ 200 poussins mâles (Ross PM3) de 1 jour ont été installés par groupe de 20 environ dans des cages métaboliques dédoublées et nourris avec un aliment de démarrage standard (starter) à base de blé, de maïs et de tourteau de soja. A 6 jours d'âge les poulets sont mis à jeun 2h avant d'être pesés et répartis par classes de poids. Cent-vingt poulets sont ainsi sélectionnés, installés par groupes de 4 dans 30 cages métaboliques dédoublées et assignés au jour 7 à l'un des traitements expérimentaux selon leur poids (10 répétitions par traitement). Chaque cage contient 2 mangeoires contenant des aliments différents, correspondant aux 3 traitements expérimentaux suivants :
        • o Traitement 1 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 5% (mangeoire 2)
        • o Traitement 2 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 10% (mangeoire 2)
        • o Traitement 3 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 15% (mangeoire 2)
  • Les aliments et l'eau sont distribués ad libitum tout au long de l'essai. Les aliments expérimentaux sont présentés en granulés de diamètre 3,2 mm. Une mesure des consommations est réalisée à T0 + 1h, T0 + 2h, T0 + 3 h, T0 + 4h, et T0 + 6h au 7ième et 9ième jour d'âge, avec inversion des mangeoires toutes les heures dans les cages. Entre les deux mesures de consommation (jour 8), les animaux reçoivent l'aliment démarrage blé-maïs-soja.
  • 2) Essai 2- mesure de consommation : dans un deuxième test les poussins n'ont accès qu'à un seul type d'aliment, supplémenté ou non avec la microalgue (figure 6). Environ 400 poussins males (Ross PM3) de 1 jour ont été pesés et répartis par classe de poids. Deux-cent-quarante animaux sélectionnés sont placés par 4 au jour 1 dans 60 cages non dédoublées par bloc de poids homogène (15 blocs de 4 cages) avec une mangeoire par cage, chacune avec un aliment expérimental (15 répétitions par aliment). Dans chaque cage, les 4 poussins sont identifiés individuellement. Les aliments et l'eau sont distribués ad libitum tout au long de l'essai. Les aliments expérimentaux sont l'aliment de démarrage (starter) maïs-soja supplémenté avec 0, 5, 10 ou 15% de microalgue, également utilisés dans l'essai 1 avec choix de l'aliment. Les poids vifs individuels sont mesurés à 1, 7 et 9 jours d'âge. Les refus sont pesés et les consommations par cage mesurées à 7 et 9 jours d'âge. De 0 à 7 jours d'âge, les animaux nourris avec l'aliment contenant 10 % de microalgue ont un gain de poids significativement amélioré par rapport au contrôle et aux deux autres régimes supplémentés.
    • Pour la figure 3, la mesure de la consommation d'aliments à 7 jours d'âge dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081) ;
    • Pour la figure 4, la mesure de la consommation d'aliments à 9 jours d'âge dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081) ;
    • Pour la figure 5, la mesure de la consommation relative moyenne d'aliments sur les 2 tests (à 7j et 9j) dans des conditions de choix (aliment maïs-soja vs aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée) (essai 14ALG081) ;
    • Pour la figure 6, la mesure de la performance de croissance (consommation, gain de poids, indice de consommation) des poussins de 0 à 7 jours alimentés d'un régime contrôle maïs-soja vs des aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée (non en conditions de choix) (essai 14ALG081) ;
    • Pour la figure 7, la mesure de la performance de croissance (consommation, gain de poids, indice de consommation) des poussins de 0 à 9 jours alimentés d'un régime contrôle maïs-soja vs des aliments substitués à 5, 10 et 15% de la microalgue testée (non en conditions de choix) (essai 14ALG081).
    EXEMPLE 1 - Culture des souches Précultures des souches :
  • Une préculture d'Aurantiochytrium mangrovei est réalisée sur table d'agitation (140 t/min) en enceinte thermostatée (26 °C), en milieu de préculture, contenant 4 g d'extrait de levure comme source d'azote, et de 30 g de glucose comme source de carbone. Après 48 heures d'incubation les cellules sont centrifugées 5 minutes à 3000 g et le culot de cellules rincé avec du milieu de préculture ne contenant ni extrait de levure ni aucune autre source d'azote minérale ou organique. Cette opération a pour but d'éviter tout apport de Na+ dans la culture principale via l'ajout d'extrait de levure. La préculture correspond à 1/100 (v/v) du volume de culture de la solution principale. Dans le cas de la souche de Schizochytrium sp. CCAP 4062/3, 27 g/l de NaCl sont ajoutés à ce milieu.
    • Suivi des cultures :
  • La concentration en biomasse totale est suivie par mesure de la masse sèche (filtration sur filtre GF/F, Whatman, puis séchage en étuve, à 105 °C, pendant 24 h minimum avant pesée).
  • Les analyses en contenus lipidiques totaux et des FAMEs sont réalisées selon les méthodes classiquement décrites dans la littérature (Folch et col., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Folch J, et col., J Biol Chem. 1957 May;226(1):497-509. ; Yokoyama et col., Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and érection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov.; Mycoscience, 2007 Vol. 48, pp. 199-211).
    • Exemple 1.1 (comparatif)
  • Des cultures d'Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 sont réalisées dans des fermenteurs (bioréacteurs) de 1 à 2 L utiles avec automates dédiés et supervision par station informatique.
  • La composition du milieu de culture ainsi que celles correspondant aux solutions d'ajout sont les suivantes :
    Solution principale Concentration (g/L)
    KCl 0,36
    H3BO3 0,175
    MgSO4, 7H20 6,750
    CaCl2, 2H20 0,55
    KNO3 0,04667
    KH2PO4,7H2O 0,30940
    Na2EDTA, 2H2O 3,094.10-3
    ZnSO4.7H2O 7,3.10-5
    CoCl2.6H2O 1,6.10-5
    MnCl2.4H2O 5,4.10-4
    Na2MoO4, 2H2O 1,48.10-6
    Na2SeO3 1,73.10-6
    NiSO4.6H2O 2,98.10-6
    CuSO4.5H20 9,8.10-6
    EDTA-Fe 0,03
    Carbone g/L
    Glucose 55
    Azote g/L
    (NH4)2SO4 7
    Ajout après autoclave
    Vitamines g/L
    Thiamine 8,0.10-3
    Vitamine B12 1,3.10-4
    Panthothénate 2,7.10-3
    Solution d'ajout 1 Concentration (g/L)
    K2SO4 31,9
    MgSO4, 7H20 25,8
    KH2PO4,7H2O 61,38
    FeSO4, 7H20 0,61
    (NH4)2SO4 * 138,24
    MnCl2 4H2O 0,165
    ZnSO4.7H2O 0,165
    CoCl2.6H2O 1,6.10-3
    Na2MoO4, 2H2O 1,6.10-3
    CuSO4, 5H2O 0,11
    NiSO4, 6H2O 8,6.10-2
    Na2EDTA, 2H2O 1,81
    Thiamine 0,49
    Vitamine B12 8,0.10-3
    Panthothénate 0,1656
    Solution d'ajout 2 Concentration g/L
    Glucose 750
    KH2PO4 6,4
    (NH4)2SO4* 34
  • Le système est régulé à pH 6 via l'ajout de base (NaOH, ou KOH) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique). La température de culture a été fixée à 26°C. La pression d'oxygène dissous a été régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse d'agitation (250 - 1200 t/min), le débit d'air (0,25 - 1 vvm), voire le débit d'oxygène (0,1 - 0,5 vvm). Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, ont permis de maintenir une pO2 constante comprise entre 5% et 30%. Le temps de culture a été compris entre 20 et 100 heures, de préférence entre 25 et 96 heures, par exemple 50 heures.
  • En cours de culture, 3 ajouts de solution d'ajout 1 ont été effectuées, ainsi que des ajouts de la solution 2 afin de maintenir des concentrations en glucose comprises entre 200 mM et 500 mM.
    • Exemple 1.2 (invention)
  • Des cultures d'Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 sont réalisées dans des fermenteurs comme essentiellement décrit dans l'Exemple1.1.
  • La modification de la procédure se fait sur le mode de régulation pH par ajout d'ammoniaque (NH4OH) pour éviter l'apport important de Na+ ou de K+ liées à la régulation pH par la soude ou la potasse, et qui pourrait être gênant pour la valorisation des produits pour l'alimentation animale. Une partie de l'azote nécessaire à la culture des cellules étant apporté via la régulation du pH par l'ammoniaque (NH4OH).
  • Le milieu utilisé pour cet exemple est décrit dans le tableau 1 ci-dessous. Contrairement au milieu décrit l'exemple 1.1, ce milieu chimiquement défini permet de soutenir la croissance sur l'ensemble de la culture sans limitation nutritionnelles. Tableau 1
    Concentration (g/L)
    chlorure de magnésium 1,08.10-2
    chlorure de calcium 0,55
    chlorure de cobalt hexahydrate (CoCl2 6H2O) 1,08.10-4
    chlorure de manganèse (II) tetrahydrate 1,08.10-2
    sulfate de magnésium heptahydrate 8,01
    sulfate de zinc heptahydrate 1,08.10-2
    sulfate de nickel hexahydrate 5,60.10-3
    sulfate de cuivre pentahydrate 7,20.10-3
    sulfate de potassium 2,09
    sulfate ferreux heptahydrate 4,00.10-2
    acide borique 1,75.10-2
    acide éthylène diamine tétraacétique disodique dihydrate 0,12
    molybdate de sodium dihydrate 1,08.10-4
    sélénite de sodium 1,73.10-7
    thiamine 3,20.10-2
    cobalamine ou vitamine B12 5,20.10-4
    Panthoténate ou vitamine B5 1,08.10-2
    Glucose (source de carbone) 55,00
    Sulfate d'ammonium (source d'azote) 9,00
    dihydrogénophosphate de potassium (source de phosphore) 4,00
    Antimousse 0,40
  • Les paramètres physicochimiques sont contrôlés durant la culture grâce à des régulateurs intégrés, avec un maintien du pH autour d'une consigne de 5, une régulation de la température à 30°C, et un maintien de la pO2 autour d'une consigne de 30% jusqu'à atteinte des valeurs maximales d'agitation et de débit d'air.
  • Pendant la culture des ajouts du milieu d'ajout tel que décrit au tableau 2 ci-dessous, sont réalisés de sorte à maintenir la concentration en glucose dans le milieu de culture comprise entre 20g/L et 50g/L. Tableau 2
    Glucose (source de carbone) 688 g/L
    Sulfate d'ammonium (source d'azote) 76 g/L
    dihydrogénophosphate de potassium (source de phosphore) 39 g/L
    • Exemple 1.3 (invention)
  • Des cultures d'Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/5 sont réalisées dans des fermenteurs dans des conditions de culture comme essentiellement décrit dans l'Exemple 1.1.
  • La modification de la procédure porte sur les milieux et sur leur mode d'ajout.
  • Les cultures sont démarrées en mode batch sur le milieu présenté dans le tableau 3 ci-dessous. Tableau 3
    Composé C° milieu initial
    Glucose +Sel Marin Glucose, 1H2O 55,000 g/L
    sels marins 15,000 g/L
    Sels Minéraux MgSO4, 7H2O 1,683 g/L
    K2SO4 2,080 g/L
    KH2PO4 4,000 g/L
    MnCl2, 4H2O 10,800 mg/L
    ZnSO4, 7H2O 1,080 mg/L
    CoCl2, 6H2O 0,011 mg/L
    Na2MoO4, 2H2O 0,108 mg/L
    CuSO4, 5H2O 0,720 mg/L
    NiSO4, 6H2O 0,560 mg/L
    FeSO4, 7H2O 40,000 mg/L
    Vitamines thiamine 32,000 mg/L
    Vitamine B12 0,520 mg/L
    Panthoténate 10,800 mg/L
    Azote (NH4)2SO4 9,000 g/L
    EDTA Na2EDTA 0,096 g/L
  • Le mode de culture continu est ensuite démarré dès que la biomasse atteint 20 g/L dans le milieu. La solution d'alimentation apportée en continu est celle décrite dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4
    Composé solution d'alimentation (g/L)
    Glucose, 1H2O 110,000
    sels marins 15,000
    MgSO4,7H2O 4,959
    K2SO4 6,129
    KH2PO4 11,786
    MnCl2 4H2O 3,182.10-2
    ZnSO4, 7H2O 3,182.10-2
    CoCl2, 6H2O 3,2.10-4
    Na2MoO4, 2H2O 3,200.10-4
    CuSO4, 5H2O 2,121.10-2
    NiSO4, 6H2O 1,650.10-2
    FeSO4, 7H2O 1,179.10-1
    thiamine 9,429.10-2
    Vitamine B12 1,530.10-3
    Panthoténate 3,182.10-2
    (NH4)2SO4 26,518
    EDTA 4,092.10-1
  • Des essais préliminaires ont montré que le taux de dilution utilisé impacte directement la teneur en protéine de la biomasse (résultats non présentés). Pour cet exemple le taux de dilution utilisé est de 0,13 h-1 ce qui correspond à la moitié du taux de croissance maximum de la souche dans les conditions de culture utilisées.
    • Exemple 1.4 (comparatif)
  • Des cultures de Schizochytrium sp. CCAP 4062/3 sont réalisées dans des fermenteurs comme essentiellement décrit dans l'Exemple 1.1, avec un milieu de culture complété avec du NaCl à hauteur respectivement de 27 g/L et 35,6 g/L pour le milieu pied fermenteur et le milieu d'ajout.
    • Exemple 1.5 (invention)
  • Les cultures de Schizochytrium sp. CCAP 4062/3 sont réalisées dans des fermenteurs comme essentiellement décrit dans l'Exemple 1.2, avec un milieu de culture complété avec du NaCl à hauteur respectivement de 27 g/L et 35,6 g/L pour le milieu pied fermenteur et le milieu d'ajout..
    • Résultats
  • MS (g/l) AA/MS (%) MG/MS (%)
    Soja (graines)* - 40,43 21,80
    Soja (tourteaux)* - 48,80 0,55
    Exemple 1.1 (comparatif) 90,0 30,00 34,30
    Exemple 1.2 (invention) 67,0 57,90 6,10
    Exemple 1.3 (invention) 60,1 35,23 6,56
    Exemple 1.4 (comparatif) 87,0 20,44 45,97
    Exemple 1.5 (invention) 79,9 49,66 13,6
    MS : Matière sèche ; AA : Acides Aminés ;
    * : Valeurs en % rapportées à 100 % de MS selon les valeurs données par l'USDA
  • On constate que les procédés de culture de l'état de la technique destinés à la production de matières grasses enrichies en acides gras polyinsaturés ne permettent pas d'obtenir des compositions à forte teneur en protéines (exprimée en % en poids d'acides aminés par rapport à la matière sèche).
    • Exemple 2 - Nutrition animale Exemple 2.1 (Matériel et Méthodes)
  • La souche Aurantiochytrium Mangrovei CC4062/5 a été cultivée dans les conditions de l'exemple 1.2. Ces conditions sont celles utilisées dans les exemples suivants sauf mention particulière.
    • 2.1.1 - Composition de la biomasse :
  • La biomasse microalgale a d'abord été analysée pour sa composition proximale ((humidité (Méthode interne EAU-H adaptée du Règlement CE g/100g 152/2009 du 27-01-2009 (103°C/4h) - SN), matières grasses par hydrolyse (Règlement CE 152/2009 du 27-01-2009 - procédé B - SN), protéines brutes estimées sur la base de la somme des concentrations en acides aminés totaux (Directive 98/64/CE, 3/09/99 - Norme NF EN ISO 13903), matières minérales (Règlement CE 152/2009 du 27-01-2009 - SN)), et énergie brute (NF EN 14918), fibres totales (AOAC 985.29 - SN), parois insolubles (selon la méthode de Carré et Brillouet (1989, Détermination of water insoluble cell walls in feeds: interlaboratory study. Journal Association of Official Analytical Chemists, 72, 463-467), calcium (NF EN ISO 6869 - mars 2002 - CT), phosphore (Règlement CE 152/2009 du 27-01-2009 - CT), chlorure (Méthode interne adaptée de ISO 1841-2 - juillet 1996 - SN), potassium (Méthode interne - ICP 05/07 - SN), sodium (Méthode interne - ICP 05/07 - SN) et concentrations en acides aminés totaux.
    • 2.1.2 - Mesure de la digestibilité des acides aminés chez le coq caecactomisé:
  • En parallèle, cette microalgue est évaluée in vivo pour la mesure de la digestibilité de ses acides aminés chez le coq caecectomisé (Green et al., 1987). Les animaux (coqs adultes Isabrown) ont été alimentés par gavage humide avec une pâtée composée de l'un des ingrédients testés (microalgue testée ou un tourteau de soja contrôle) et complétée par de l'amidon de blé permettant d'obtenir un niveau de protéines de 18% correspondant au besoin des animaux. Douze coqs logés en cages individuelles ont été utilisés par traitement. Chaque animal a reçu en moyenne 171,2 ± 14,5 g de pâtée après un jeûne de 24h. Les excrétas collectés jusqu'à 48h après gavage ont été regroupés par groupe de 4 coqs de telle façon que 3 excrétas par traitement soient lyophilisés. Ils ont ensuite été laissés à température ambiante pour une phase de reprise en eau (48h) afin de stabiliser le contenu en humidité puis pesés, broyés (0,5 mm) et analysés par la méthode Terpstra (Terpstra et de Hart, 1974) pour leur teneur en azote non urique et pour leurs concentrations en acides aminés totaux (JEOL AMINOTAC JLC 500/V). Les pertes endogènes en acides aminés ont précédemment été déterminées en évaluant un régime protéiprive (c'est-à-dire sans aucun apport en protéines) sur la base du même schéma expérimental. Les résultats corrigés des pertes endogènes basales sont donc exprimés en coefficient de digestibilité iléale standardisée des acides aminés, calculés et soumis à l'analyse statistique comme suit : DIS X F = X F * I D * L F − X E * Q E + X END * I D 10 X F * I D * L F * 1000
    Figure imgb0001
     avec DIS (X)F : coefficient de digestibilité iléale standardisée (%) de l'acide aminé X de la matière première F ; XF : concentration (g/100g) de l'acide aminé dans la matière première ; XE : concentration (g/100g) de l'acide aminé dans les excrétas ; ID: quantité d'aliment consommée (g) ; QE : quantité excrétée (g) ; LF: taux d'incorporation de la matière première dans l'aliment ; XEND : pertes endogènes de l'acide aminé X (g/100g).
  • Les résultats expérimentaux sont d'abord analysés pour l'effet ingrédient selon une procédure ANOVA (XLSTAT 2010.4.02 © Addinsoft 1995-2010), d'après le modèle suivant à 95% d'intervalle de confiance: Yi = μ + ai
    Figure imgb0002
     avec :
    • Y = paramètre
    • µ = moyenne
    • ai = effet de l'ingrédient
  • Pour chaque différences significatives, les moyennes sont analysées par un pair-wise Fisher's LSD test.
    • Exemple 2.2 : Composition de la souche CC4062/5 cultivée durant 49h.
  • La souche CC4062/5 a été cultivée comme mentionné ci-dessus. La culture a été stoppée à 49h, donnant lieu à une production de biomasse microalgale de quelques kilos et dans l'objectif d'organiser un test préliminaire de digestibilité chez l'animal. Cette biomasse a été séchée sur sécheur à cylindre et se présente sous la forme de paillettes. Elle est identifiée « souche n°4, culture 49h ».
  • Les résultats de composition biochimique de la « microalgue, souche 4, culture 49h » sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous et exprimés à la fois en brut et corrigés de la teneur en matière sèche (MS). Tableau 5 (essai 14ALG058): Composition de la microalgue (souche n°4, culture 49h) testée vs un tourteau de soja témoin
    Concentrations (% brut) Concentrations (% matière sèche)
    µA Ttx soja µA Ttx soja
    Matière Sèche, % 94,8 89,5 - -
    Humidité, % 5,2 10,5 - -
    Somme des acides aminés 50,8 46,9 53,4 52,4
    Matières Grasses 10,6 5,0 11,2 5,6
    Cellulose brute n/d 4,2 n/d 4,7
    Matières Minérales 7,3 5,8 7,7 6,5
    Amidon <1,0 n/a <1,1 n/a
    Sucres totaux 1,3 n/d 1,4 n/d
    ADF n/d 3,7 n/d 4,1
    NDF n/d 7,2 n/d 8,0
    Fibres totales (TDF, total dietary fiber) 16,5 n/d 17,4 n/d
    Parois insolubles (WICW, water insoluble cell wall) 4,9 n/d 5,2 n/d
    Calcium 0,118 0,371 0,124 0,414
    Phosphore 1,448 0,598 1,527 0,668
    Chlorure (Cl-) 0,150 n/d 0,158 n/d
    Potassium 1,983 n/d 2,092 n/d
    Sodium 0,068 n/d 0,072 n/d
    (kcal/kg) (kcal/kg MS)
    Energie brute 4870 4486 5137 5012
    nld: non déterminé
    nla: non applicable
    µA : microalgue ; Ttx : Tourteau de Soja
  • Ces résultats montrent que la microalgue présente une composition en matières azotées totales (somme des acides aminés) et matières minérales légèrement supérieure à celles du tourteau de soja témoin. La teneur en minéraux de la biomasse testée est assimilable aux concentrations les plus faibles publiées et allant de 7 à 43 % MS selon les familles, genres et espèces de microalgues. Les teneurs en phosphore et calcium sont inversement proportionnées avec 2,3 fois plus de phosphore et 3,3 fois moins de calcium dans la microalgue par rapport au tourteau de soja témoin. La « souche 4, culture 49h » testée ne contient pas de réserves d'amidon et sa concentration en sucres totaux reste faible (1,4 % MS) comparativement aux matières premières classiquement utilisées en nutrition animale. A contrario, sa teneur en matières grasses est deux fois plus importante que celle du tourteau de soja (11,2 vs 5,6 % MS) et son énergie brute supérieure de 125 kcal/kg MS.
  • Les parois des microalgues présentent des compositions et structures différentes de celles des matières premières d'origine végétales, et rendent les analyses de fibres classiquement utilisées non adaptées. Aussi, l'analyse des fibres totales (TDF) (Prosky et al., 1988) présente l'avantage d'être moins restrictive et la « microalgue, souche 4, culture 49h » présente un pourcentage de fibres totale de 17,4 % MS (ce qui à titre de comparaison est de l'ordre de ce que l'on analyse dans le grain d'orge ou de seigle) avec un résidu en paroi végétale insoluble (WICW) mesuré à 5,2 % de MS.
  • Les concentrations en protéines totales rapportées dans les tableaux 4 à 8 sont issues de la somme des acides aminés eux-mêmes dosés selon la méthode décrite précédemment. La somme des acides aminés -comme estimateur des protéines totales de la « microalgue, souche 4, culture 49h »- correspond à 53,4 % MS, avec plus précisément 21,5 % MS d'acides aminés essentiels et 32,0 % MS d'acides aminés non essentiels. Le tableau 6 présente les concentrations en acides aminés analysés dans la microalgue et le tourteau de soja et exprimées en brut ou rapportées à la somme des acides aminés.
  • Les résultats reflètent un profil en acides aminés de la microalgue relativement équilibré, ce qui rejoint des travaux comparant des profils en acides aminés de différentes microalgues à ceux de sources protéiques dites conventionnelles (Becker, 2007).
  • De façon générale, les concentrations en acides aminés essentiels de la microalgue sont légèrement supérieures à celles mesurées dans le tourteau de soja (respectivement 21,5 % MS et 24,0 % MS). Tableau 6 (essai 14ALG058) : Concentrations en azote total et en acides aminés (% brut), concentrations en acides aminés rapportées à la somme des acides aminés (% somme AA), coefficients de digestibilité iléale standardisée des acides aminés (%) mesurés chez le coq caecectomisé et concentrations en acides aminés digestibles (% brut) de la microalgue testée vs un tourteau de soja témoin.
    [AA] (% brut) AA / somme AA (%) Digestibilité iléale standardisée des AA (%) [AA] digestibles (% brut)
    µA Ttx soja µA Ttx soja µA Ttx soja P-value µA Ttx soja
    Matière Sèche 94,8 89,5 - - - - - - -
    Azote total 10,6 7,8 - - 80,1 ± 0,3 89,6 ± 0,7 < 0,0001 8,49 6,97
    Somme AA 50,8 46,9 - - 78,4 ± 1,0 88,5 ± 1,0 0,001 39,79 41,5 3
    AA essentiels 20,4 21,5
    Méthionine 0,85 0,64 1,67 1,36 85,6 ± 1,3 90,9 ± 1,6 0,023 0,73 0,58
    Lysine 2,30 2,87 4,53 6,12 84,9 ± 1,3 87,6 ± 0,8 0,068 1,95 2,51
    Thréonine 1,71 1,88 3,37 4,01 80,7 ± 1,8 86,0 ± 1,7 0,038 1,38 1,62
    Tryptophane 0,55 0,67 1,08 1,43 82,9 ± 1,7 90,3 ± 1,3 0,009 0,46 0,61
    Arginine 6,83 3,42 13,44 7,29 61,0 ± 0,8 93,2 ± 0,8 < 0,0001 4,17 3,19
    Isoleucine 1,48 2,30 2,91 4,90 85,4 ± 1,2 88,7 ± 1,2 0,048 1,26 2,04
    Leucine 2,52 3,69 4,96 7,87 86,7 ± 1,1 88,5 ± 1,2 0,182 2,18 3,27
    Valine 2,01 2,35 3,96 5,01 87,5 ± 1,6 89,0 ± 1,5 0,389 1,76 2,09
    Histidine 0,66 1,18 1,30 2,52 88,7 ± 0,6 89,9 ± 1,4 0,327 0,59 1,06
    Phénylalanine 1,52 2,48 2,99 5,29 84,6 ± 1,5 89,8 ± 1,0 0,014 1,29 2,23
    AA non essentiels 30,3 25,5
    Cystine 0,55 0,63 1,08 1,34 60,9 ± 3,7 79,7 ± 2,0 0,003 0,34 0,50
    Serine 1,87 2,52 3,68 5,37 76,7 ± 1,6 88,5 ± 1,3 0,001 1,43 2,23
    Proline 1,07 2,14 2,11 4,56 84,3 ± 2,1 87,9 ± 1,3 0,107 0,90 1,88
    Alanine 2,17 2,07 4,27 4,41 84,9 ± 1,1 84,9 ± 1,1 0,992 1,84 1,76
    Ac. Aspartique 3,57 5,49 7,03 11,71 n/d 85,9 ± 0,6 n/d n/d 4,71
    Ac. Glutamique 18,10 8,81 35,63 18,78 73,4 ± 0,7 90,4 ± 0,7 0,0001 13,29 7,96
    Glycine 1,81 2,01 3,56 4,29 78,3 ± 2,3 84,3 ± 1,6 0,036 1,42 1,69
    Tyrosine 1,18 1,78 2,32 3,80 84,2 ± 1,7 89,5 ± 0,6 0,015 0,99 1,59
    µA : microalgue ; Ttx soja : Tourteaux de soja ; [AA] : Concentration en acides aminés
    • Exemple 2.3 : Mesure de la digestibilité des acides aminés de la biomasse (souche CC4062/5 cultivée pendant 49h)
  • Les résultats de digestibilité iléale standardisée (DIS) des acides aminés mesurés chez le coq caecectomisé sont présentés dans le tableau 6 ainsi que les concentrations en acides aminés digestibles. Les digestibilités de l'azote et de la somme des acides aminés de la microalgue sont respectivement de 80,1 ± 0,3 % et de 78,4 ± 1,0 % soit 9,5 et 10,1 points de moins que le témoin tourteau de soja. Les SID arginine et cystine de la microalgue présentent les résultats les plus faibles, respectivement 61,0 ± 0,8 % et 60,9 ± 3,7 %. De façon générale, les coefficients de digestibilité des acides aminés essentiels de la microalgue vont de 80,7 ± 1,8 % (DIS thréonine) à 88,7 ± 0,6 % (DIS histidine). La digestibilité de la lysine est mesurée à 85,6 ± 1,3 %. Ces coefficients sont de l'ordre de 1,2 (SID histidine) à 7,4 (SID tryptophane) points inférieurs à ceux mesurés pour le tourteau de soja contrôle. Cependant, ils reflètent des coefficients de digestibilité élevés, permettant de considérer la microalgue évaluée comme une source protéique de bonne qualité (i.e. ils sont significativement plus élevés que les valeurs de digestibilité des protéines de microalgues rapportées dans la littérature de l'ordre de 55 à 77% (Henman et al., 2012).
    • Exemple 2.4 : Composition de la souche CC4062/5 cultivée pendant 22h
  • La souche CC4062/5 a été cultivée dans les mêmes conditions mais pendant une durée de 22h. Elle est identifiée « souche n°4, culture 22h ».
  • Comme précédemment, cette biomasse a été séchée sur sécheur à cylindre et se présente sous la forme physique de paillettes.
  • Elle a été analysée pour sa composition en proximales, énergie brute, fibres totales, parois insolubles, calcium, phosphore, chlorure, potassium, sodium et concentrations en acides aminés totaux.
  • La composition biochimique de cette « microalgue, souche 4, culture 22h » est présentée dans le tableau 7. Les résultats sont exprimés à la fois en brut et corrigés de la teneur en matière sèche (MS).
  • La « microalgue, souche 4, culture 22h » présente une composition en matières azotées totales (sommes des acides aminés) de 2,3 et 1,3 points supérieure à celles du tourteau de soja témoin et de la « microalgue, souche n°4, culture 49h ».
  • Sa teneur en matières minérales augmente par rapport à une culture plus longue mais reste à un niveau de concentration qui se situe dans la gamme inférieure des valeurs publiées dans la littérature (Skrede et al., 2011).
  • Le ratio phosphore/calcium est déséquilibré. Les teneurs en phosphore et calcium sont inversement proportionnées avec 3,6 fois plus de phosphore et 3,6 fois moins de calcium dans la microalgue par rapport au tourteau de soja témoin. La souche n°4 optimisée (culture 22h) contient 1,5 fois plus de phosphore total que lors d'une culture de 49h. La teneur en matières grasses est supérieure à celle du tourteau de soja (8 % vs 5,6 % MS), et les résultats confirment que ni l'amidon, ni les sucres totaux ne représentent une forme de stockage d'énergie chez cette souche n°4. L'énergie brute est mesurée à 4641 kcal/kg MS, soit 371 kcal/kg MS de moins vs le contrôle tourteau de soja.
  • Les fibres totales (TDF) de la « microalgue, souche 4, culture 22h » représentent 12,7 % de la MS avec un résidu en parois végétales insolubles (WICW) mesuré à 2,1 % MS. En parallèle, le résidu déduit comme suit : R (%) = 100 - MM (%) - MAT (%) - MG (%) - amidon (%) - sucres (%) indique que la teneur en TDF est inférieure de 15,1 points à celle du R ainsi estimé à 27,8 % MS. Ces observations rejoignent d'autres travaux (Lieve et al., 2012) rapportant de l'ordre de 20 à 30% de la quantité de la biomasse sèche non expliquée par la somme des teneurs en matières minérales, lipides, protéines et hydrates de carbone.
  • La « microalgue, souche 4, culture 22h » présentant 2 points de plus de matières grasse que le tourteau de soja pris en comparaison (tableau 7). Tableau 7 (essai 14ALG065): Composition de la microalgue (souche n°4, culture 22h) testée vs un tourteau de soja témoin
    Concentrations en AA (% brut) Concentrations en AA (% matière sèche)
    µA Ttx soja µA Ttx soja
    Matière Sèche 94,6 89,5 - -
    Humidité 5,4 10,5 - -
    Somme des acides aminés 51,7 46,9 54,7 52,4
    Matières Grasses 7,6 5,0 8,0 5,6
    Cellulose brute n/d 4,2 n/d 4,7
    Matières Minérales 9,0 5,8 9,5 6,5
    Amidon <0,5 n/a <0,5 <0,6
    Sucres totaux <0,5 n/d <0,5 <0,6
    ADF n/d 3,7 n/d 4,1
    NDF n/d 7,2 n/d 8,0
    Fibres totales (TDF, total dietary fiber) 12,0 n/d 12,7 n/d
    Parois insolubles (WICW, water insoluble cell wall) 2,0 n/d 2,1 n/d
    Calcium 0,109 0,371 0,115 0,415
    Phosphore 2,279 0,598 2,410 0,668
    Chlorure (Cl-) 0,160 n/d 0,169 n/d
    Potassium 2,238 n/d 2,366 n/d
    Sodium 0,161 n/d 0,170 n/d
    (kcal/kg) (kcal/kg MS)
    Energie brute 4390 4486 4641 5012
    nld: non déterminé ; nla: non applicable ; µA : microalgue ; Ttx soja : Tourteaux de soja ;
  • La somme des acides aminés s'élève à 54,7 % de la MS, avec plus précisément 23,9 % MS d'acides aminés essentiels et 30,8 % MS d'acides aminés non essentiels. Le tableau 8 présente les concentrations en acides aminés analysés dans la microalgue et le tourteau de soja et exprimées en brut ou rapportées à la somme des acides aminés. Les résultats reflètent un profil en acides aminés de la microalgue relativement équilibré par rapport au tourteau de soja contrôle. L'acide glutamique, l'arginine et l'acide aspartique de la « microalgue, souche 4, culture 22h » sont présents en plus forte proportion avec des valeurs (% somme AA) respectivement de 26,75, 9,48 et 8,26 %. La teneur en lysine (% somme AA) est de 5,94 % en référence à celle du tourteau de soja témoin (6,12 %). L'arginine, la méthionine et dans une moindre mesure la thréonine contribuent plus fortement à la protéine de microalgue testée qu'à celle du tourteau de soja (9,48 vs 7,29 %, 2,13 vs 1,36 % et 4,27 vs 4,01 % respectivement). La microalgue cultivée durant 22h présente 2,4 points d'acides essentiels de plus dans le cas d'une culture de 49h soit la même teneur que celle du tourteau de soja contrôle. A l'exception de l'arginine, les acides aminés essentiels sont présents en proportion plus importante de la somme des acides aminés.
  • La « microalgue, souche 4, culture 22h » présente des teneurs en méthionine, arginine et thréonine supérieures à celles du soja tandis que les teneurs en lysine et valine sont équivalentes voire un peu supérieures dans la biomasse microalgale.
    • Exemple 2.5 : Mesure de la digestibilité des acides aminés de la biomasse (souche CC4062/5 cultivée pendant 22h)
  • La mesure de la digestibilité de ses acides aminés chez le coq caecectomisé (Green et al., 1987) de façon identique à celle décrite précédemment (cf. Exemple 2.3).
  • Les résultats de digestibilité iléale standardisée (DIS) des acides aminés de la « microalgue souche 4, culture 22h » mesurés chez le coq caecectomisé sont présentés dans le tableau 8 ainsi que les concentrations en acides aminés digestibles. Les digestibilités de l'azote et de la somme des acides aminés de la microalgue sont respectivement de 85,7 ± 0,7 % et de 87,1 ± 0,4 % soit 3,2 (P = 0,008) et 0,9 (P = 0,190) points de moins que le témoin tourteau de soja. Par rapport à la culture de 49h, la digestibilité de la somme des acides aminés de cette production de « microalgue, souche 4, culture 22h » est significativement augmentée de 8,7 points. Les concentrations en lysine, méthionine, arginine, thréonine, valine digestibles sont supérieures à celles du tourteau de soja contrôle. Elles reflètent une bonne qualité de la protéine de la microalgue testée, supérieure ou équivalente à celle d'un tourteau de soja.
  • Les résultats de mesure de la digestibilité de ses acides aminés chez le coq, montrent que la « microalgue, souche n°4, culture 22h » est une source protéique de bonne qualité. La digestibilité des protéines (somme des acides aminés) est similaire à celle d'un tourteau de soja qui est la source protéique la plus utilisée dans le monde pour l'alimentation des monogastriques.
  • De plus, le procédé de séchage utilisé n'apparait pas comme un facteur dénaturant la qualité de la protéine étant donné les coefficients de digestibilité élevés mesurés pour la lysine.
  • Il est important de noter que la qualité de la protéine s'est significativement améliorée lorsque l'on compare les résultats de la « microalgue, souche n°4, culture 49h » à ceux de la « microalgue, souche n°4, culture 22h ». Notamment, la digestibilité des protéines augmente d'environ 9 points. Tableau 8 (essai 14ALG065): Concentrations en azote total et en acides aminés (% brut), concentrations en acides aminés rapportées à la somme des acides aminés (% somme AA), coefficients de digestibilité iléale standardisée des acides aminés (%) mesurés chez le coq caecectomisé et concentrations en acides aminés digestibles (% brut) de la microalgue testée vs un tourteau de soja témoin.
    [AA] (% brut) AA (%) Digestibilité iléale standardisée des AA (%) [AA] digestibles (% brut)
    µA Ttx soja µA Ttx soja µA Ttx soja P-value µA Ttx soja
    Matière Sèche 94,6 89,5 - - - - - - -
    Azote total 11,5 7,8 - - 85,7± 0,7 88,9± 0,5 0,008 9,86 6,92
    Somme AA 51,7 46,9 - - 87,1± 0,4 88,0± 0,7 0,190 45,06 41,2
    AA essentiels 22,6 21,5
    Méthionine 1,10 0,64 2,13 1,36 90,0 ± 0,4 91,5 ± 0,3 0,015 0,99 0,59
    Lysine 3,07 2,87 5,94 6,12 87,9 ± 0,2 85,6 ± 0,3 0,0001 2,70 2,46
    Thréonine 2,21 1,88 4,27 4,01 87,3 ± 0,3 85,2 ± 1,0 0,045 1,93 1,60
    Tryptophane 0,68 0,67 1,32 1,43 86,0 ± 0,2 89,3 ± 1,1 0,013 0,59 0,60
    Arginine 4,90 3,42 9,48 7,29 79,9 ± 1,1 93,0 ± 0,5 < 0,0001 3,92 3,18
    Isoleucine 1,98 2,30 3,83 4,90 88,2 ± 0,3 88,5 ± 0,5 0,526 1,75 2,04
    Leucine 3,31 3,69 6,40 7,87 89,0 ± 0,2 88,5 ± 0,7 0,341 2,95 3,27
    Valine 2,57 2,35 4,97 5,01 87,1 ± 0,2 85,6 ± 1,2 0,153 2,24 2,01
    Histidine 0,82 1,18 1,59 2,52 88,7 ± 2,1 89,6 ± 0,7 0,578 0,73 1,06
    Phénylalanine 1,96 2,48 3,79 5,29 87,4 ± 0,4 89,8 ± 0,7 0,012 1,71 2,23
    AA non essentiels 29,1 25,5
    Cystine 0,65 0,63 1,26 1,34 69,4 ± 1,2 79,1 ± 2,3 0,006 0,45 0,50
    Serine 2,09 2,52 4,04 5,37 83,0 ± 0,5 87,7 ± 1,0 0,004 1,73 2,21
    Proline 1,66 2,14 3,21 4,56 87,9 ± 0,8 87,2 ± 1,2 0,519 1,46 1,87
    Alanine 2,80 2,07 5,42 4,41 88,8 ± 0,3 84,7 ± 1,0 0,005 2,49 1,75
    Ac. Aspartique 4,27 5,49 8,26 11,71 n/d 85,7 ± 0,8 n/d n/d 4,71
    Ac. Glutamique 13,83 8,81 26,7 5 18,78 84,8 ± 0,7 90,5 ± 0,6 0,001 11,72 7,97
    Glycine 2,34 2,01 4,53 4,29 81,8 ± 0,9 83,3 ± 0,5 0,125 1,92 1,67
    Tyrosine 1,48 1,78 2,86 3,80 86,7 ± 0,1 89,4 ± 0,9 0,016 1,28 1,59
    n/d: non déterminé ; µA : microalgue ; µA : microalgue ; Ttx soja : Tourteaux de soja ; [AA] : Concentration en acides aminés
    • Exemple 2.6 : détermination de la valeur d'Energie Métabolisable Apparente (EMA) et de l'Energie Métabolisable Apparente corrigée du bilan azoté (EMAn) de la souche CC4062/5 cultivée pendant 22h.
  • La mesure de la valeur d'Energie Métabolisable Apparente (EMA) de la microalgue « microalgue, souche 4, culture 22h » a été faite chez le poulet à 3 semaines d'âge (Bourdillon et al., 1990). La méthode dite de substitution a été appliquée à partir d'un régime témoin composé d'une base maïs-soja et d'un premix. De même que les autres matières premières, la microalgue, broyée sur une grille de 3mm a été incorporée à des taux croissants de 4, 8, 12, 16 et 20% en substitution au mélange maïs-soja et en gardant constant le premix dans les régimes.
  • Le tableau 9 présente la formule de l'aliment maïs-soja contrôle ainsi que ses spécifications (Protéine brute = 18%, Energie Métabolisable Apparente = 3200 kcal/kg). Les aliments substitués par la microalgue sont équilibrés (notamment en leur ratio protéine sur énergie) au mieux et sur la base d'hypothèses EMA, acides aminés digestibles et phosphore biodisponible prises pour la microalgue. Tableau 9 (essai 14ALG069): Formule de l'aliment expérimental complémentaire utilisé
    R1
    Basal Maïs-Soja
    Maïs 67,673
    Tourteau de soja 48% 19,742
    Gluten de maïs 60 4,766
    Huile de soja 3,139
    Premix 4,680
    Microalgue 0
    Protéine brute 18
    Matières Grasses 6,201
    Cellulose brute 3,029
    Matières Minérales 2,013
    Lysine 0,80
    Methionine 0,33
    Met+Cys 0,664
    Threonine 0,686
    Tryptophane 0,173
    Arginine 1,066
    Calcium 0,1
    Phosphore total 0,333
    Phosphore disponible 0,078
    Sodium 0,092
    EM, kcal/kg 3200
    • Régime 1: basal maïs-soja (95,32%) + CMV, complément minéraux vitamines (4,68%)
    • Régime 2: basal maïs-soja (91,32%) + CMV (4,68%) + microalgue (4%)
    • Régime 3: basal maïs-soja (87,32%) + CMV (4,68%) + microalgue (8%)
    • Régime 4: basal maïs-soja (83,32%) + CMV (4,68%) + microalgue (12%)
    • Régime 5: basal maïs-soja (79,32%) + CMV (4,68%) + microalgue (16%)
    • Régime 6: basal maïs-soja (75,32%) + CMV (4,68%) + microalgue (20%)
  • Ce gradient d'incorporation permet d'évaluer la valeur EMA de la microalgue par régression linéaire simple. Le dispositif expérimental est décrit en Figure 1. Les valeurs de matière sèche des régimes ont été déterminées après broyage et sur aliments granulés au début et à la fin de la période de bilan. Enfin, les aliments complets et les fèces ont été analysés individuellement pour leur teneur en énergie brute (EB) par calorimétrie.
  • L'EMAn des aliments est calculé de la façon suivante : EMA kcal / kg MS = I × EBi − E × EBƒ I
    Figure imgb0003
     EMAn kcal / kg MS = EMA − 8.22 GP × 0.18 / 6.25 I
    Figure imgb0004
     avec I : quantité d'aliment ingéré (kg MS) ; E : quantité d'excrétas (kg) ; EBi et EBf : énergie brute de l'ingéré (kcal/kg MS) et des fèces (kcal/kg); GP : gain de poids pendant la période de bilan. Les valeurs d'EMA ont dans un premier temps été corrigées par le bilan azoté sur la base de 18% de protéines contenu dans les tissus des animaux et en utilisant le facteur de 8,22 kcal/kg N (Hill et Anderson, 1958). En parallèle, les calculs permettant la correction du bilan azoté ont aussi été faits sur la base du dosage de l'azote total dans les excrétas. Les deux méthodes donnant des résultats non différents, c'est cette dernière méthode qui est considérée dans ce rapport. Les valeurs aberrantes (± 2,5 écarts types de la moyenne) ont été éliminées avant traitement par analyse de variance (ANOVA, SAS 9.1.3 © 2002-2003 by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) selon un schéma factoriel. La digestibilité de la matière sèche (dMS), le coefficient de digestibilité apparente de l'azote (CUDa azote), du phosphore (CUDa phosphore), du calcium (CUDa calcium) et de la matière grasse (CUDa MG) sont calculés de la même façon pour chacun des régimes.
  • Ces résultats ont été analysés par régression selon la procédure de Régression Linéaire ((XLSTAT 2010.4.02 © Addinsoft 1995-2010), d'après le modèle suivant : Yi = β 0 + β jXij + εi
    Figure imgb0005
     Avec :
    • Yi = valeur observée pour la variable dépendante pour l'observation i,
    • β0 = intercept
    • βj = pente de la droite de régression
    • Xij = valeur prise par la variable j pour l'observation i (% d'incorporation de la microalgue),
    • εi = erreur du modèle.
  • La valeur du paramètre pour une incorporation de 100% de la microalgue a été extrapolée à partir du modèle de prédiction, permettant ainsi d'estimer l'EMA et EMAn et le coefficient de digestibilité apparente du phosphore de la microalgue.
  • Le tableau 10 présente les résultats de digestibilité de la matière sèche et de l'énergie métabolisable apparente corrigée du bilan azoté (EMAn) de l'aliment maïs-soja contrôle ainsi que des régimes substitués R2 à R6. Les coefficients de digestibilité apparente de l'azote (CUDa azote), du phosphore (CUDa phosphore) et du calcium (CUDa calcium) et de la matière grasse (CUDa MG) ont été estimés par la même méthode. Tableau 10 (essai 14ALG069): Digestibilité de la Matière Sèche, de l'énergie, et coefficient d'utilisation digestive apparente d'aliments expérimentaux respectivement substitués à 0, 4, 8, 12, 16 et 20% de la microalgue testée (souche n°4, culture 22h) et mesurés chez le poulet de 23 jours d'âge
    Aliments expérimentaux P-value
    Régimes R1 R2 R3 R4 R5 R6
    B M-S B M-S + 4% µA B M-S + 8% µA B M-S + 12% µA B M-S + 16% µA B M-S + 20% µA
    dMS (%)1 75,10 ± 1,20a 74,41 ± 1,09ab 73,53 ± 1,64b 71,64 ± 1,43c 70,17 ± 1,22d 69,56 ± 2,05d < 0,0001
    EMAn (kcal/kg MS)2 3398,0 ± 53a 3379,4 ± 42a 3331,8 ± 64b 3273,6 ± 61c 3218,9 ± 53d 3171,4 ± 72e < 0,0001
    EB/EMAn (%)3 78,35 ± 1,34a 78,05 ± 1,25a 77,71 ± 1,72a 76,19 ± 1,56b 75,00 ± 1,56c 74,72 ± 1,84c < 0,0001
    CUDa azote (%)4 61,79 ± 3,75a 60,24 ± 2,44ab 58,80 ± 4,87b 56,48 ± 3,15c 53,97 ± 2,26d 53,90 ± 3,44d < 0,0001
    CUDa phosphore (%)5 38,00 ± 4,67a 40,78 ±4,36b 41,42 ± 4,87b 36,96 ± 4,89a 37,77 ± 3,38a 37,28 ± 3,83a 0,004
    CUDa calcium (%)6 26,84 ± 5,41a 34,32 ± 5,85b 37,86 ± 5,91ab 34,90 ± 4,61bc 36,74 ± 4,55bcd 38,94 ± 5,01d < 0,0001
    CUDa MG (%)7 85,88 ± 4,2ab 87,17 ± 1,88ac 88,59 ± 2,53c 85,93 ± 3,33a 83,97 ± 3,37bd 83,86 ± 3,14d < 0,0001
    B M-S : Basal Maïs-Soja ; µA : microalgue 1 : Digestibilité de la Matière Sèche (%) ; 2 : Energie Métabolisable Apparente corrigée du bilan azoté (AMEn) ; 3 : Energie brute rapportée à l'AMEn (%) ; 4 : Coefficient de digestibilité apparente de l'azote ; 5 : Coefficient de digestibilité apparente du phosphore ; 6 : Coefficient de digestibilité apparente du calcium, 7 : Coefficient de digestibilité apparente de la Matière Grasse (%)
  • La digestibilité de la matière sèche des différents régimes est fortement corrélée à leurs valeurs d'EMAn. L'EMAn du régime maïs-soja R1 est mesurée à 3398 ± 53 kcal/kg MS. Les résultats montrent que la valeur EMAn du régime R2 est équivalente à celle du contrôle maïs-soja et reflètent que la substitution à hauteur de 4% par la microalgue n'impacte pas la digestibilité de l'énergie du régime. A contrario, et à partir d'une substitution supérieure ou égale à 8% de microalgue, l'EMAn ainsi que le CUDa azote diminuent de façon linéaire avec les pourcentages croissants de substitution (P < 0,0001).
  • L'addition de 4 à 16% de micro algue montre une diminution de l'indice de consommation (IC) sur la période 13-23 jours. Il est à noter aussi que les poulets tendent à moins consommer (à l'exception du R2) pour cependant un gain de poids similaire quel que soit le pourcentage d'incorporation de la microalgue et supérieur à celui mesuré pour le régime contrôle maïs-soja (Tableau 11). Tableau 11 (essai 14ALG069): Gain de poids, consommation et indice de consommation des animaux sur la période 13 à 23 jours alimentés des régimes respectivement substitués à 0, 4, 8, 12, 16 et 20% de la microalgue testée (souche n°4, culture 22h).
    Aliments expérimentaux
    R1 R2 R3 R4 R5 R6
    B M-S B M-S +4% µA B M-S +8% µA B M-S +12% µA B M-S +16% µA B M-S +20% µA
    Gain de poids (g) 460 ± 58,8 a 496 ± 36,5 b 495 ± 90,0 b 516 ± 56,6 b 510 ± 37,5 b 493 ± 44,1 ab
    Consommation (g) 749 ± 82,9 a 756 ± 50,3 a 713 ± 118,8 ab 722 ± 68,0 ab 701 ± 51,9 bc 665 ± 52,8 c
    Indice de consommation (g/g) 1,63 ± 0,063 a 1,53 ± 0,048 b 1,44 ± 0,067 c 1,41 ± 0,060 d 1,37 ± 0,043 de 1,35 ± 0,042 e
    B M-S : Basal Maïs-Soja ; µA : microalgue
  • Les valeurs EMA et EMAn de la « microalgue, souche 4, culture 22h » (tableau 12) sont respectivement mesurées à 2785 kcal/kg MS et 2296 kcal/kg MS. Il est à noter que ces valeurs sont dans la gamme des référence moyenne in vivo de la mesure de l'EMAn tourteau de soja de classe protéique 46, 48 et 50 respectivement de 2303 ± 137, 2348 ± 248, 2365 ± 178 kcal/kg MS. Ainsi, la contribution de cette microalgue pour son apport en énergie est assimilable à celle d'un tourteau de soja de qualité standard. Tableau 12 (essai 14ALG069):
    Microalgue
    EMA, kcal/kg 2635,0 Soybean meal Soybean meal Soybean meal
    EMA, kcal/kg MS 2785,4 Classe protéique 46 48 50
    EMAn, kcal/kg 2172,0 N n=15 n=27 n=80
    EMAn, kcal/kg MS 2296,0 EMAn, kcal/kg MS 2303 ±137 2348 ±248 2365 ±178
    A B
    A : Energie Métabolisable Apparente corrigée ou non du bilan azoté de la microalgue testée et mesurée chez le poulet de 23 jours d'âge.
    B : Valeurs de références in vivo mesurées selon le même modèle et pour différentes classes protéiques de tourteaux de soja (références Adisseo, 2012).
    • Exemple 2.7 : Tests de choix et mesure de consommation chez le poussin d'aliments comprenant la biomasse selon l'invention
  • Dans chacun des essais présentés ci-dessous, la « microalgue, souche 4, culture 22h » comme les autres matières premières, a été broyée sur une grille de 3mm a été incorporée à des taux croissants de 5, 10, et 15% dans le régime maïs-soja, en ajustant la formulation de manière à avoir 4 régimes iso-énergétiques, iso-protéiques et iso-lysine (tableau 13), dont la composition est donnée dans le tableau 14. Tableau 13 (essai 14ALG069): Coefficient de digestibilité apparente du phosphore de la microalgue testée et mesurée chez le poulet de 23 jours d'âge par régression linéaire
    Microalgue
    Phosphore digestible (%MS)1 0,86
    CUDa phosphore (%) 2 35,7
    1 Intervalles de confiance : 0.576% - 1.143%
    2 Calculé selon la formule : CUDa = P digestible (%)/P total aliment (%)
    Tableau 14 (essai 14ALG081): Formules des aliments expérimentaux utilisés dans les tests de consommation et de choix chez le poussin
    %, tel que fournit Aliment contrôle Aliment 5% microalgue Aliment 10% microalgue Aliment 15% microalgue
    Maïs 52,90 54,28 55,67 57,06
    Tourteau de soja 48% 35,40 29,50 23,59 17,69
    Graine de soja extrudée 4,00 4,00 4,00 4,00
    Huile de soja 3,55 3,10 2,65 2,20
    Phosphate bicalcique 1,92 1,78 1,63 1,49
    Carbonate de Calcium 1 , 01 1,13 1 , 25 1,36
    Sel 0,36 0,35 0,34 0,32
    DL-méthionine 0,25 0,24 0,23 0,22
    L-Lysine HCl 0,01 0,02 0,04 0,06
    Premix 0,6 0,6 0,6 0,6
    Microalgue 0 5 10 15
    Protéine brute 22 22 22 22
    Lysine 1,25 1,25 1,25 1,25
    Méthionine 0,58 0,59 0,60 0,61
    Met+Cys 0,95 0,96 0,96 0,96
    Threonine 0,86 0,87 0,88 0,88
    Dig Lysine 1,12 1,12 1,12 1,12
    Dig Méthionine 0,57 0,58 0,58 0,59
    Dig Met+Cys 0,85 0,85 0,85 0,85
    Dig Threonine 0,74 0,75 0,76 0,77
    Dig Tryptophane 0,25 0,24 0,24 0,24
    Calcium 0,95 0,95 0,95 0,95
    Phosphore total 0,72 0,77 0,83 0,88
    Phosphore disponible 0,40 0,40 0,40 0,40
    Energie Métabolisable, kcal/kg 3000 3000 3000 3000
  • Deux essais expérimentaux ont été conduits en parallèle (figure 2). Dans le premier essai (test de choix), la consommation est mesurée lorsque l'animal a le choix entre un aliment supplémenté en microalgue et un aliment starter maïs-soja. Dans le second (mesure de consommation), la consommation est mesurée lorsque l'animal n'a accès qu'à un seul aliment, supplémenté ou non avec la microalgue.
  • Dans l'essai 1, les données de consommation à chaque heure de mesure au 7ième et 9ième jour d'âge ont été analysées selon une procédure de test apparié (XLSTAT 2010.4.02 © Addinsoft 1995-2010) considérant que la consommation d'une mangeoire est dépendante de la consommation de l'autre dans chaque cage.
  • Les données de consommation et de poids de l'essai 2 ont été analysées pour un effet aliment selon une procédure ANOVA (XLSTAT 2010.4.02 © Addinsoft 1995-2010) d'après le modèle suivant à 95% d'intervalle de confiance: Y i = μ + a i + b i Y = paramètre
    Figure imgb0006
     Avec
    • Y = paramètre
    • µ = moyenne
    • ai = effet de l'aliment
    • bi = effet du bloc
  • Pour chaque différence significative, les moyennes sont analysées par un pair-wise Fisher's LSD test.
    • 1) Essai 1 - test de choix
  • Pour l'essai avec choix de l'aliment, environ 200 poussins mâles (Ross PM3) de 1 jour ont été installés par groupe de 20 environ dans des cages métaboliques dédoublées et nourris avec un aliment de démarrage standard (starter) à base de blé, de maïs et de tourteau de soja. A 6 jours d'âge les poulets sont mis à jeun 2h avant d'être pesés et répartis par classes de poids. Cent-vingt poulets sont ainsi sélectionnés, installés par groupes de 4 dans 30 cages métaboliques dédoublées et assignés au jour 7 à l'un des traitements expérimentaux selon leur poids (10 répétitions par traitement). Chaque cage contient 2 mangeoires contenant des aliments différents, correspondant aux 3 traitements expérimentaux suivants :
    • Traitement 1 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 5% (mangeoire 2)
    • Traitement 2 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 10% (mangeoire 2)
    • Traitement 3 : starter maïs-soja (mangeoire 1) et microalgue 15% (mangeoire 2)
  • Les aliments et l'eau sont distribués ad libitum tout au long de l'essai. Les aliments expérimentaux sont présentés en granulés de diamètre 3,2 mm. Une mesure des consommations est réalisée à T0 + 1h, T0 + 2h, T0 + 3 h, T0 + 4h, et T0 + 6h au 7ième et 9ième jour d'âge, avec inversion des mangeoires toutes les heures dans les cages. Entre les deux mesures de consommation (jour 8), les animaux reçoivent l'aliment démarrage blé-maïs-soja.
  • Les résultats démontrent (cf. figures 3-5) que les jeunes animaux n'ont pas présenté de rejet des aliments supplémentés en microalgue et ce, quel que soit le taux d'incorporation. A ces doses, la microalgue ne présente donc aucun problème d'appétence. Les jeunes poussins tendent même à préférer les aliments supplémentés à 5 et 10 % par la microalgue (figure 5) par rapport à l'aliment classique maïs-soja, ce qui s'inverse numériquement lorsque la microalgue est rajoutée à 15%.
    • 2) Essai 2- mesure de consommation
  • Dans un deuxième test les poussins n'ont accès qu'à un seul type d'aliment, supplémenté ou non avec la microalgue (figure 6). Environ 400 poussins males (Ross PM3) de 1 jour ont été pesés et répartis par classe de poids. Deux-cent-quarante animaux sélectionnés sont placés par 4 au jour 1 dans 60 cages non dédoublées par bloc de poids homogène (15 blocs de 4 cages) avec une mangeoire par cage, chacune avec un aliment expérimental (15 répétitions par aliment). Dans chaque cage, les 4 poussins sont identifiés individuellement. Les aliments et l'eau sont distribués ad libitum tout au long de l'essai. Les aliments expérimentaux sont l'aliment de démarrage (starter) maïs-soja supplémenté avec 0, 5, 10 ou 15% de microalgue, également utilisés dans l'essai 1 avec choix de l'aliment. Les poids vifs individuels sont mesurés à 1, 7 et 9 jours d'âge. Les refus sont pesés et les consommations par cage mesurées à 7 et 9 jours d'âge. De 0 à 7 jours d'âge, les animaux nourris avec l'aliment contenant 10 % de microalgue ont un gain de poids significativement amélioré par rapport au contrôle et aux deux autres régimes supplémentés. L'indice de consommation mesuré pour le régime supplémenté à 10% est significativement amélioré par rapport au contrôle et le régime supplémenté à 15% (1,089 vs 1,156). Par ailleurs, la supplémentation en microalgue n'a pas d'effet sur la consommation d'aliment quand on la compare au contrôle maïs-soja (122,6, 125,7, 135,6, 124,6 g respectivement pour le contrôle et les 3 régimes supplémentés de 5 à 15%).
  • Sur la période totale de mesure de 0 à 9 jours d'âge (figure 7), l'effet positif de l'aliment supplémenté avec 10% de microalgue sur le gain de poids et l'indice de consommation se confirme.
  • Les résultats de consommation (en condition de non choix) montrent que la « microalgue, souche 4, culture 22h » testée peut être incluse jusqu'à 15% dans des aliments équilibrés à base de maïs-soja sans affecter les performances des poussins de 0 à 9 jours d'âge.
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    • WO 2010/051489
    • WO 97/37032

Claims (12)

  1. Biomasse de Thraustochytrides non-génétiquement modifiées choisis parmi les genres Aurantiochytrium et Schizochytrium, dont une quantité substantiellement majoritaire de Thraustochytrides n'est pas dégradée, caractérisée en ce qu'elle comprend, en poids par rapport au poids de la matière sèche, au moins 35 % de protéines et moins de 20% de matière grasse et en ce qu'elle n'a pas subi de traitements après récolte qui modifient sa composition en acides aminés et en matière grasse.
  2. Biomasse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 45 % de protéines.
  3. Biomasse selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 60 % de protéines.
  4. Biomasse selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle comprend moins de 10% de matière grasse.
  5. Biomasse selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits Thraustochytrides sont choisis parmi les espèces Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/2 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/3 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/4 ; Aurantiochytrium mangrovei, CCAP 4062/5 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/6 ; Aurantiochytrium mangrovei CCAP 4062/1 ; Schizochytrium sp. 4087/3 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/1 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/4 ; Schizochytrium sp. CCAP 4087/5.
  6. Biomasse selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle présente un taux d'humidité de 1% à 95 %.
  7. Biomasse selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle présente un taux d'humidité de 70% à 90 %.
  8. Biomasse selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle présente un taux d'humidité de 1% à 10%.
  9. Procédé de production d'une biomasse telle que définie dans l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend
    a. Une première étape de culture des Thraustochytrides dans un milieu de culture défini comprenant une source de carbone, une source d'azote, une source de phosphore et des sels, ledit milieu défini ne comportant pas de matières organiques riches ou complexes et ladite première étape a) étant divisée en 2 sous-étapes, une première sous-étape
    a1) de croissance dans le milieu de culture approprié jusqu'à obtenir des teneurs en source de carbone dans le milieu inférieure à 20 g/L suivie d'une deuxième sous-étape
    a2) de production dans laquelle on ajoute au milieu de culture, simultanément ou successivement, une ou plusieurs solution(s) d'enrichissement en source de carbone pour maintenir la teneur en source de carbone entre 0 et 50 g/L, en source d'azote pour maintenir la teneur en azote entre 0,5 et 5 g/L et/ou en source de phosphore pour maintenir la teneur en phosphore entre 0,5 et 5 g/L de manière à maintenir dans le milieu de culture des teneurs en azote et en phosphore non limitantes pour la croissance jusqu'à l'obtention d'une densité de culture d'au moins 40 g/L en matière sèche ;
    b. une deuxième étape de récupération de la biomasse obtenue à la première étape par séparation de ladite biomasse du milieu de culture.
  10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend une troisième étape :
    c. de séchage de la biomasse récupérée à la deuxième étape.
  11. Utilisation d'une biomasse de Thraustochytrides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour l'amélioration des performances des animaux.
  12. Utilisation d'une biomasse de Thraustochytrides selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 dans l'alimentation humaine ou animale.
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