EP3313463A1 - Procédé de préparation de matrices de collagène transparentes - Google Patents

Procédé de préparation de matrices de collagène transparentes

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EP3313463A1
EP3313463A1 EP16741660.1A EP16741660A EP3313463A1 EP 3313463 A1 EP3313463 A1 EP 3313463A1 EP 16741660 A EP16741660 A EP 16741660A EP 3313463 A1 EP3313463 A1 EP 3313463A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
collagen
concentration
solution
matrix
collagen matrix
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16741660.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nadine Nassif
Marie-Madeleine Giraud-Guille
Yan Wang
Marc Robin
Flore SALVIAT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Sorbonne Universite
College de France
Ecole Pratique des Hautes Etudes SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Pierre et Marie Curie
College de France
Ecole Pratique des Hautes Etudes SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Pierre et Marie Curie, College de France, Ecole Pratique des Hautes Etudes SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3313463A1 publication Critical patent/EP3313463A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/34—Materials or treatment for tissue regeneration for soft tissue reconstruction

Definitions

  • Collagen is a family of proteins, widely distributed in the animal kingdom, which accounts for about 30% of vertebrate proteins and is also found in some invertebrates. Collagen is also ubiquitous in a large number of tissues of the same organism where it participates in the structuring of extracellular matrices and provides, in addition to mechanical protection, anchoring points to the surrounding cells. Collagens that organize themselves into fibrils during a process called fibrillogenesis are the most frequently encountered in the tissues and represent ⁇ 90% of all collagens. In physiological conditions, fibrils form ordered three-dimensional buildings.
  • the cornea is the first retractive element of the eye, covering about one-fifth of the surface of the eyeball. Diseases that cloud the cornea are a major cause of blindness. Corneal transplantation from a healthy cornea taken from a deceased donor may cure this, but the failure rate is quite high due to the rejection of foreign tissue by the recipient organism.
  • Corneal substitutes are used but these are generally based on synthetic polymers.
  • the concentration of the collagen solution may be between 10 and 200 mg / mL, advantageously between 10 and 90 mg / mL and more advantageously between 30 and 80 mg / mL.
  • the method is indicated as being suitable for use in the preparation of a fibrillated collagen transparent matrix suitable for use as a biomaterial, in particular as a corneal substitute.
  • the acid solution of collagen is concentrated by centrifugation to a final concentration of between 27 and 45 mg / ml which is then dialyzed against PEG to obtain fibril formation. A ripening period of a few days to 2 months is necessary to obtain a stable and stable matrix.
  • the application WO201 1/151587 describes a particular method for preparing collagen-based homogeneous material by concentration of a collagen solution, comprising a dialysis step. Many possible values are given for the concentration of the coliagen solution: 5, 10, 20, 30, 40 and 250 mg / mL.
  • concentration matrices of about 250 mg / ml.
  • Example 2 the intramuscular implantation of collagen matrices at 20 mg / ml and 40 mg / ml, the preparation of which is not described, is described. In both cases, the matrices obtained are not transparent.
  • the application WO2015 / 049646 describes a process in which the acid solution of collagen comprises a weak acid and a strong acid and in that the concentration is between 10 and 250 mg / mL, preferably between 30 and 200 mg / mL and advantageously between 40 and 200 mg / mL. and 120 mg / mL.
  • the concentration of 45 mg / ml was not achieved and according to FIG. 12, the preferred concentration values appear to be 90 and 120 mg / ml.
  • the present invention relates to a process for preparing a transparent ice of fibrillated coliagene comprising the following steps:
  • the subject of the present invention is a process for preparing a transparent fibrillated coliagene matrix comprising the following steps:
  • a fibrillogenesis step of the coliagen matrix characterized in that the concentration step is conducted i) so as to limit, advantageously to avoid shear stresses, and ii) until a concentration is obtained.
  • concentration step is conducted i) so as to limit, advantageously to avoid shear stresses, and ii) until a concentration is obtained.
  • the coliagen can be of natural, recombinant or synthetic origin.
  • the coliagene is a type I, II, III, IV and / or V coliagene.
  • the coliagen is of type I, III or V, alone or as a mixture.
  • the concentration step may be carried out by evaporation or by dialysis.
  • the concentration is carried out by evaporation.
  • This technique of concentration of coliagen well known to those skilled in the art, consists in evaporating a solution of known volume (or mass) and concentration of diluted coliagene under sterile conditions, for example under a laminar flow hood. The solution is allowed to evaporate to the desired concentration (Helary et al., 2005, Biomaterials, 26, p. 1543). This technique allows a fairly accurate estimate of the concentration during evaporation by simple weighing.
  • the concentration is carried out by dialysis.
  • acid solutions of collagen whose initial concentration is generally less than or equal to 5 mg / ml are brought into contact with a dialysis membrane.
  • the collagen solutions to be concentrated can be placed in a dialysis coil (Knight et al., 1998, J Biomed Mater Res 41, pp. 185-191) or injected in a controlled manner into a cell. dialysis as described in WO201 1/351587. In both cases, the assembly is brought into contact with an osmotically active polymer solution whose molecular weight is greater than the pore size of the dialysis membrane.
  • osmotically active polymer examples include Dextran® and polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the polymer is polyethylene glycol with a molecular weight of 35,000 Da.
  • the concentration step is conducted in such a way as to limit, advantageously, to avoid shear stresses.
  • the concentration step is carried out until a collagen concentration of between 43.5 and 47 mg / ml, preferably of the order of 45 mg / ml, is obtained.
  • of the order of 45 for example means 45 ⁇ 2 mg / ml, preferably 45 ⁇ 1 mg / ml.
  • the acid solution of collagen can be prepared according to techniques known to those skilled in the art, in particular according to the technique described by Gobeaux et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417).
  • the collagen is only in the form of monomer and possibly in the form of aggregates.
  • the acid solution of collagen consists of an aqueous solution of acetic acid.
  • the acid solution of collagen consists of an aqueous solution of acetic acid in the absence of strong acid.
  • the method according to the invention is advantageously used when the concentration of the initial acidic solution, before the concentration step, is between 0.01 mg / ml and 5 mg / ml.
  • the concentration is carried out by evaporation, an acid solution of collagen with a concentration of between 3 and 5 mg / ml is preferred.
  • an acid solution of collagen with a concentration of between 0.5 and 3 mg / ml is preferred.
  • the formation of fibrils in other words the fibrillogenesis step, consists in bringing the collagen matrix into contact with a basic gaseous phase or a neutral or basic liquid.
  • the fibrillogenesis step may be done either in situ by replacing the osmotically active polymer with the gaseous or liquid phase, or by immersing the collagen matrix in a gaseous or liquid phase.
  • the fibrillogenesis step is conducted in such a way as to limit, advantageously practically, avoiding shear stresses.
  • the fibrillogenesis step is carried out by contacting the collagen matrix with ammonia vapors.
  • the method according to the present invention further comprises a step of washing the fibrillated collagen matrix in a buffer solution, for example phosphate buffered solution.
  • a buffer solution for example phosphate buffered solution.
  • the present invention also relates to a process for preparing a transparent collagen matrix comprising the following steps: a) preparation of an acid solution of collagen in an aqueous acetic acid solution at a collagen concentration of between 0, 1 and 5 mg / ml, advantageously between 0.2 and 1 mg / ml;
  • the subject of the invention is also a transparent fibrillated collagen matrix obtainable by a process according to the invention, characterized by a transmittance greater than 0.6, preferably greater than 0.8 at 700 nm.
  • the matrix has blue phases, said blue phases being observed in MOLP.
  • the matrix is of pH greater than or equal to 7.
  • the transparent matrix is understood to mean a matrix whose UV-visible absorption density is equivalent to that of a solution of concentrated non-fibrillated collagen.
  • the matrix according to the invention is stable.
  • the transparent fibrillated collagen matrix is understood to mean a matrix that does not exhibit a substantial change in its transparency, preferably its transmittance at 700 nm, for several months.
  • Such matrices have, for example, been stored for 4 years at 4 ° C. in sterile ultrapure water without impairing transparency.
  • the invention also relates to the use of a transparent fibril collagen matrix thus obtained as a tissue substitute for the manufacture of an artificial tissue or organ, in particular a corneal substitute.
  • This collagen matrix may also be used for the manufacture of a dressing.
  • PEG 50 mg / mL
  • 50 g of PEG 50 g are diluted in a sterile acetic acid solution (500 mM) and supplemented with IL. The solution obtained is stirred until a homogeneous and transparent solution is obtained.
  • -PBS IX 80 g NaCl (Sigma Aldrich®, 142.04 g / mol); 2 g of KC1 (Fluka®, 76.5 g / mol); 28.9 g of Na2HPO4, 12H2O (Sigma Aldrich®, 358.14 g / mol); 2.027 g of NaH 2 PO 4, 1H 2 O (Sigma Aldrich®, 137.99 g / mol) are diluted in distilled water and the solution is then filled to final IL. Finally, 100 mL of 10X PBS is added to 900 mL of distilled water. The IL solution of PBS IX is then sterilized.
  • the pH of the solution is 3.5.
  • the solution can be regularly homogenized by means of a pipette during evaporation. If a dry surface is formed, the addition of a few drops of acetic acid allows to homogenize again all and resume evaporation. A collagen matrix concentrated in collagen at 45 mg / ml is thus obtained.
  • the crystallizer containing the collagen solution at a concentration of 45 mg / ml is placed in a desiccator (5L) in which is also placed a beaker containing an aqueous solution of ammonia (Carlo Erba®, 30 ml, 35.046 g / mol, 28-30%).
  • the whole is left under ammonia vapor in the hermetically sealed desiccator, for 2 hours under a chemical hood.
  • a fibril collagen matrix of pH 10 is obtained.
  • the matrix is stored at 4 ° C in a sterile Falcon® tube containing 1X PBS (40 mL) until use.
  • the method described above can be carried out with collagen extracted from rat tail.
  • Transparent matrices of fibril collagen were obtained from an initial solution of collagen having an ionic strength of 153 mM, 500 mM, 669 mM or 1.2 M.
  • transparent matrices of collagen were obtained from from an initial solution of collagen concentrated to collagen at 1 mg mL.
  • This solution of collagen is injected into a dialysis cell by a Teflon capillary (Dupont® PFA tubing, 0.35 mm internal diameter) using a sterile syringe (Terumo®, 10 mL, without needle).
  • the thrust on the syringe is performed with a syringe pump (Kdscientific®, KDS 101).
  • the dialysis cell consists of a mold (QuixSep® Microdiaiyzers, volume 1 mL) and a dry dialysis membrane rehydrated in boiling water (Spectra Por®, regenerated cellulose MWCO 14000 Da).
  • Dialysis is performed against a solution of polyethylene glycol (PEG, Sigma Aldrich®, 35 kDa, 60 mg / mL, 500 mL) diluted in Purex sterile acetic acid (500 mM). The homogeneity of the solution can be maintained by stirring.
  • PEG polyethylene glycol
  • Sigma Aldrich® 35 kDa, 60 mg / mL, 500 mL
  • Purex sterile acetic acid 500 mM
  • a total volume of 18 mL of the collagen solution is injected.
  • the injection rate is set around 0.2 mL / hour, depending on the "swelling" of the dialysis membrane under the effect of pressure.
  • the time to inject the 18 mL of solution is about 3 to 4 days. Continuous injection of this solution under dialysis allows the concentration of the collagen within the matrix.
  • the shape and size of the matrices depend solely on the mold which constitutes the dialysis cell into which the solution of collagen is injected over time. The operating conditions described above make it possible to obtain a matrix of 1 cm 3 and concentration of a value of 45 mg / ml. A larger mold would involve longer injection times.
  • the plugs and clips constituting the dialysis cell are pre-sterilized by immersion in a beaker containing 90% ethanol (30 minutes).
  • the dialysis membranes are cut to optimal size (about 5 cm in length), then rehydrated by immersion in boiling water and then cooled in sterile water.
  • a sterile syringe (10 mL) is filled with 9 mL of the collagen solution.
  • the dialysis cell and the syringe are connected using a capillary, which will allow a progressive injection of collagen.
  • a sterile cone whose tip is fitted is connected on one side to the tip of the syringe wound with Teflon, and on the other side to the capillary.
  • the dialysis cell is filled with the collagen solution using the syringe (opening upwards), then the membrane is placed against the dialysis cell avoiding bubbles.
  • the cell is closed with a lid that constitutes it.
  • the dialysis caps are immersed in a beaker provided with a magnetized bar containing the PEG solution, while ensuring that only the part containing the dialysis membrane is immersed.
  • the beaker is then placed on a magnetic stirrer (400-500 rpm, at room temperature) to allow homogenization of the PEG concentration across the dialysis membrane.
  • the dialysis cell without the capillary, is placed in a desiccator (5L) in which is also placed a beaker containing an aqueous solution of ammonia (Carlo Erba®, 60 mL, 35.046 g / me, 28-30 %).
  • the dialysis cell is left under ammonia vapor in the hermetically sealed desiccator, for 48 hours under a chemical hood.
  • the matrix is gently removed from the dialysis cap using sterile forceps, and rinsed several times in a sterile container (Corning®, 50 mL, 30x115 mm) containing IX PBS. or sterile ultrapure water (45 mL, for 5 minutes) until a neutral pH (pH to be assessed with pH paper) is obtained.
  • the matrix is stored at 4 ° C in a sterile Falcon® tube containing sterile water (40 mL) until use.
  • Fragans collagen matrices concentrated in collagen at 40 mg / ml, 42 mg / ml, 43.5 mg / ml, 45 mg / ml, 46.8 mg / ml and 48 mg / ml were obtained according to the method described in Example 1 (collagen derived from calves).
  • Figure 1 synthesizes the results of the analysis with the naked eye and polarized light microscopy of collagen matrices at different concentrations between 40 mg / ml and 48 mg / ml collagen.
  • FIG. 2a illustrates the presence of birefringent organizations related to "blue phases" in a concentrated collagen solution at 45 mg / mL. These particular crystalline-liquid phases have heretofore only been described for thermotropic liquid crystals. In solution, collagen is a liquid crystal of iyotrope type. The observation of such a "blue phase” is consistent insofar as it is described in the literature, for thermotropic liquid crystals, as being an intermediate phase between the isotropic phase and the cholesteric phase.
  • FIG. 2b shows the obtaining of a comparable texture in a solution of collagen derived from rat tails concentrated at 45 mg / ml.
  • Figure 2c illustrates the presence of blue phase-related birefringent organizations in a 45 mg / mL fibrillar collagen matrix indicating that this particular organization was retained after fibrillogenesis.
  • the transmittance of the flared collagen matrices was studied by ellipsometry ( Figures 3 and 4). Transmission spectra are obtained using a Ellipsometer (Variable angle spectroscopic ellipsometry (VASE) M-2000U Woollam spectroscopic ellipsometer) between 370 and 1000 nm at an angle of incidence of 0 °. In order to ensure the planarity of the surfaces, the matrices are placed between two glass slides for cr scopie taking as reference the air (Faustini and A. ACS Appî.Mater Interfaces, 2014, 6 (19), pp 17102-171 10).
  • Figure 3 shows the transmittance of the matrices between 370 and 1000 nm.
  • the transmittance of concentration matrices as a function, on the abscissa, of the wavelength in nm: 40 mg / ml (curve 1), 42 mg / ml (curve 2), 43.5 mg ml (Curve 3), 45 mg / mL (Curve 5), 46.8 mg / mL (Curve 4) and 48 mg / mL (Curve 7) as a function of wavelength (370-1000 nm). References are air. For the 45 mg / mL matrix, water was also used as a reference (curve 6). The highest transmittance at any wavelength is obtained with the 45 mg / mL matrix.
  • Figure 4 shows the transmittance of the arrays at 700 nm. It is observed that the transmittance reaches a maximum for fibrillar collagen matrices concentrated at 45 mg / ml and that moving away from the value of 45 mg / ml the transmittance decreases. The matrices concentrated at 40 mg / ml are opaque.
  • Zone 5 illustrates the importance of limiting shear stresses prior to fibrillogenesis.
  • Zone 1 represents a zone of a fibrous collagen matrix concentrated at 45 mg / ml collagen having only undergone the shear stresses related to the manipulations during the concentration step.
  • Zone 1 of the collagen matrix transparent before fibrillogenesis, remains transparent after fibrillogenesis.
  • Zone 2 represents an area of a fibrillated collagen matrix concentrated at 45 mg / ml collagen subjected to the application of local mechanical stress in the form of surface friction using a scalpel before fibrillogenesis.
  • Zone 2 of this collagen matrix, transparent before fibrillogenesis becomes opaque after fibrillogenesis.
  • Zone 3 of this collagen matrix represents an area of a fibrillated collagen matrix concentrated at 45 mg / mL that has been spatulated and has caused local mechanical stress before fibrillogenesis. It is observed that only the edges of this Zone 3 of this matrix have become opaque. The manipulation of the matrix after fibrillogenesis does not cause the appearance of opacity zones.
  • Example 4 Storage of matrices
  • Matrices obtained by the process of the invention from collagen derived from rat tails were stored for 4 years at 4 ° C in sterile ultrapure water without alteration of transparency.
  • the inventors have also kept matrices obtained by the process of the inveniion from collagen * gi ade clinical in PBS at 4 ° C plus a storage medium dedicated to corneas (Cornea cold®, Eurobio, Les Ulis , France) for 3 weeks without altering transparency.
  • a film of salts can form on the surface when the matrices are stored in cold PBS in the case of "clinical grade" collagen, but it is possible to remove it.
  • the precipitation of salts can be avoided and the storage time increased in a Cornea preservation medium (Cornea cold®) always at 4 ° C.

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Abstract

La présente invention a pour- objet un procédé de préparation d'une matrice de collagène fibrille transparente apte à être utilisée comme substitut tissulaire pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE MATRICES DE COLLAGENE TRANSPARENTES
Le collagène est une famille de protéines, largement répandue dans le règne animal, qui représente environ 30% des protéines des vertébrés et est également rencontrée chez certains invertébrés. Le collagène est également ubiquitaire dans un nombre important de tissus d'un même organisme où il participe à la structuration des matrices extracellulaires et assure, en plus d'une protection mécanique, des points d'ancrages aux cellules environnantes. Les collagènes qui s'organisent en fibrilles lors d'un processus nommé fibrillogenèse sont les plus fréquemment rencontrés dans les tissus et représentent ~90% de l'ensemble des collagènes. Dans des conditions physiologiques, les fibrilles forment des édifices tridimensionnels ordonnés.
Dans les tissus vivants, plusieurs types d'organisation de macromolécules biologiques sont rencontrés en fonction des propriétés mécaniques requises (Hulmes D.J.S., Miller A. 1979. Nature, 282, p. 878-880.). Par exemple, une structure en phase cholestérique est observée dans l'os compact et les travées osseuses de l'os spongieux, cette organisation tridimensionnelle du collagène contribue aux propriétés mécaniques de l'os. Elle peut être recréée et stabilisée in vitro. De même il est bien connu que l'organisation des fibrilles de collagène est unidirectionnelle au niveau des tendons, tandis qu'elle se présente localement sous forme de contreplaqué au niveau de la cornée.
La cornée est le premier élément rétractif de l'œil, elle couvre environ un cinquième de la surface du globe oculaire. Les maladies qui opacifient la cornée sont une cause majeure de cécité. La greffe de cornée, à partir d'une cornée saine prélevée sur un donneur décédé, peut y remédier, mais le taux d'échec est assez élevé en raison du rejet des tissus étrangers par l'organisme receveur.
Des substituts de cornée sont utilisés mais ceux-ci sont généralement à base de polymères synthétiques.
Des techniques permettant l'obtention de matrices de collagène fibrillé transparentes ont été décrites.
La demande WO2012/52679 revendique un procédé particulier de fibrillogenèse et la description enseigne que la concentration de la solution de collagène peut être comprise entre 10 et 200 mg/mL, avantageusement entre 10 et 90 mg/mL et plus avantageusement entre 30 et 80 mg/mL. Le procédé est indiqué comme pouvant être utilisé pour la préparation d'une matrice transparente de collagène fibrillé apte à être utilisé comme biomatériau, notamment comme substitut cornéen. Dans l'Exemple 1, line solution acide de collagène est concentrée par centrifugation jusqu'à une concentration finale comprise entre 27 et 45 mg/mL qui est ensuite dialysée contre du PEG afin d'obtenir la formation des fibrilles. Une période de mûrissement de quelques jours à 2 mois est nécessaire pour obtenir une matrice solide et stable.
La demande WO201 1/151587 décrit un procédé particulier de préparation de matériau homogène à base de collagène par concentration d'une solution de collagène, comprenant une étape de dialyse. De nombreuses valeurs possibles sont indiquées pour la concentration de la solution de coliagène : 5, 10, 20, 30, 40 et 250 mg/mL. Dans l'Exemple 1, il est décrit la préparation de matrices de concentration d'environ 250 mg/ml. Dans l'Exemple 2, il est décrit l'implantation intramusculaire de matrices de collagène à 20 mg/mL et 40 mg/mL dont la préparation n'est pas décrite. Dans les deux cas, les matrices obtenues ne sont pas transparentes.
La demande WO2015/049646 décrit un procédé dans lequel la solution acide de collagène comprend un acide faible et un acide fort et en ce que la concentration se situe entre 10 et 250 mg/mL préférentiellement entre 30 et 200 mg/mL et avantageusement entre 40 et 120 mg/mL. Selon la figure 23, la concentration de 45 mg/mL n'a pas été réalisée et d'après la figure 12, les valeurs préférées de concentration paraissent être de 90 et 120 mg/mL.
Aussi, existe-t-il un besoin de mettre au point un procédé simple et rapide qui permette de disposer rapidement d'une matrice transparente de collagène fibrillé présentant la structure la plus proche de la cornée, qui reste transparente sur une longue durée et qui ne nécessite pas de longue période de mûrissement pour être transparente et stable.
Au cours de leurs travaux sur les solutions de collagène, les inventeurs ont mis au point un procédé de préparation de matrices de collagène fibrillé permettant d'obtenir une structure proche de celle de la cornée, sans nécessité de temps de stockage.
Aussi, la présente invention a-t-eile pour objet un procédé de préparation d'une ice transparente de coliagène fibrillé comprenant les étapes suivantes :
a) une étape de préparation d'une solution acide de coliagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de collagène c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de coliagène caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en coliagène comprise entre 43 et 50 mg/ml,
Dans un mode particulier, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente de coliagène fibrillé comprenant les étapes suivantes:
a) une étape de préparation d'une solution acide de coliagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de coliagène
c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de coliagène caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite i) de façon à limiter, avantageusement à éviter les contraintes de cisaillement, et ii) jusqu'à l'obtention d'une concentration en coliagène comprise entre 43 et 50 mg/mL.
Sans vouloir être liés à une théorie particulière, les inventeurs pensent que cette propriété de transparence observée dans cet intervalle est liée à une organisation du coliagène sous une forme de cristal-liquide particulière qui s'apparenterait à une « phase bleue », c'est- à-dire une phase du cristal liquide intermédiaire entre une phase isotrope et une phase cholestérique.
Conformément à l'invention, le coliagène peut être d'origine naturelle, recombinante ou synthétique. Préférentiellement, le coliagène est un coliagène de type I, II, III, IV et/ou V. Avantageusement, le coliagène est de type I, III ou V, seul ou en mélange.
Conformément à l'invention, l'étape de concentration peut être réalisée par évaporation ou par dialyse.
Dans un premier mode particulier, la concentration est réalisée par évaporation. Cette technique de concentration du coliagène, bien connue de l'homme du métier, consiste à mettre à évaporer une solution de volume (ou de masse) et de concentration connues de coliagène dilué en conditions stériles, par exemple sous une hotte à flux laminaire. On laisse évaporer la solution jusqu'à la concentration souhaitée (Hélary et al. 2005. Biomaterials, 26, p.1533- 1543). Cette technique permet une estimation assez précise de la concentration en cours d'évaporation par simple pesée.
Dans un second mode particulier la concentration est réalisée par dialyse. Dans cette technique, les solutions acides de collagène dont la concentration initiale est généralement inférieure ou égale à 5 mg/mL sont mises en contact avec une membrane de dialyse. Dans des modes particuliers, les solutions de collagène à concentrer peuvent être placées dans un boudin de dialyse (Knight et al. 1998. J Biomed Mater Res. 41 , p. 185-191.) ou bien injectées de manière contrôlée dans une cellule de dialyse comme décrit dans le document de brevet WO201 1/351587. Dans les deux cas, l'ensemble est mis en contact avec une solution de polymère osmotiquement actif dont le poids moléculaire est supérieur à la taille des pores de la membrane de dialyse. L'homme du métier peut aisément déterminer les paramètres de dialyse (type de membrane, concentrations en solutés des liquides de contre-dialyse) en s 'appuyant notamment sur les lois régissant les phénomènes de transport à travers les membranes. On peut citer à titre d'exemples de polymère osmotiquement actif le Dextran® et le polyéthylène glycol' (PEG). Avantageusement, le polymère est du poiyéthylènegîycol dont le poids moléculaire est de 35 000 Da.
Au sens de la présente invention l'étape de concentration est conduite de façon à limiter, avantageusement à éviter les contraintes de cisaillement.
Dans un mode avantageux de l'invention, l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43,5 et 47 mg/mL, préférentiel lement de l'ordre de 45 mg/mL. Au sens de la présente invention, de l'ordre de 45 signifie par exemple 45 ± 2 mg/mL, préférentiellement 45 ± 1 mg/mL.
Conformément à l'invention, la solution acide de collagène peut être préparée selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment selon la technique décrite par Gobeaux et ai. (Langmuir, 2007, 23, 6411 -6417). Dans ces solutions, le collagène est uniquement sous forme de monomère et éventuellement sous forme d'agrégats.
Dans un mode préféré de l'invention, la solution acide de collagène est constituée par une solution aqueuse d'acide acétique. Dans un mode particulier de l'invention, la solution acide de collagène est constituée par une solution aqueuse d'acide acétique en l'absence d'acide fort. Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en œuvre lorsque la concentration de la solution acide initiale, avant l'étape de concentration, est comprise entre 0,01 mg/mL et 5 mg/mL. Lorsque la concentration est réalisée par évaporation, une solution acide de collagène de concentration comprise entre 3 et 5 mg/ml est préférée. Lorsque la concentration est réalisée par dialyse une solution acide de collagène de concentration comprise entre 0,5 et 3 mg/ml est préférée. Conformément à l'invention, la formation des fibrilles, autrement dit l'étape de fibrillogenèse consiste à mettre en contact la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique. Dans le cas où la concentration est réalisée par dialyse, l'étape de fibrillogenèse peut se faire soit in situ en remplaçant le polymère osmotiquement actif par la phase gazeuse ou liquide, soit par immersion de la matrice de collagène dans une phase gazeuse ou liquide. Avantageusement, l'étape de fibrillogenèse est menée de façon à limiter, avantageusement pratiquement éviter les contraintes de cisaillement. Selon un mode particulier de l'invention, l'étape de fibrillogenèse est effectuée par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque.
De façon optionnelle, le procédé selon la présente invention comprend en outre une étape de lavage de la matrice de collagène fibrillé dans une solution tampon, par exemple de solution tamponnée au phosphate.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une matrice de collagène transparente comprenant les étapes suivantes : a) préparation d'une solution acide de collagène dans une solution aqueuse d'acide acétique à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/mL, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/mL ;
b) concentration de îa solution acide de collagène par évaporation ou par dialyse jusqu'à obtention d'une concentration en collagène comprise entre 42 et 50 mg/mL, préférablement comprise entre 43 et 47 mg/mL, plus préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL ;
c) formation de fibrilles par mise en contact de la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique, avantageusement par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque. L'invention a également pour objet une matrice de collagène fibrillé transparente susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'invention, caractérisée par une transmittance supérieure à 0,6, de préférence supérieure à 0,8 à 700 nm.
Seion une forme de réalisation avantageuse de l'invention, la matrice présente des phases bleues, lesdites phases bleues étant observées en MOLP.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la matrice est de pH supérieur ou égal à 7.
Au sens de la présente invention, on entend par matrice transparente une matrice dont la densité d'absorption UV-visible est équivalente à celle d'une solution de collagène concentré non fibrillé.
Avantageusement, la matrice selon l'invention est stable. Au sens de la présente invention on entend par matrice transparente de collagène fibrillé stable une matrice qui ne présente pas d'évolution substantielle de sa transparence, préférentiellement de sa transmittance à 700 nm, pendant plusieurs mois. De telles matrices ont par exemple été conservées pendant 4 ans à 4°C dans de l'eau ultrapure stérile sans altération de transparence.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une matrice de collagène fibrille transparente ainsi obtenue comme substitut tissulaire pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée. Cette matrice de collagène peut également connaître une utilisation pour la fabrication d'un pansement.
EXEMPLES
Les solutions utilisées dans les exemples sont décrites ci-après :
-Acide acétique (CH3COOH 500 mM) : 58 mL d'acide acétique glaciale Purex (Carlo Erba®, Pureté >= 99,8%) sont dilués dans 2 L final d'eau distillée. Puis la solution est stérilisée à l'aide d'unité de filtration (Nalgene®, polyethersulfone, taille des pores 0,22μηι).
-PEG (50 mg/mL) : 50 g de PEG (Sigma Aldrich®, Réf. catalogue 94646, 35 kDa) sont dilués dans une solution d'acide acétique stérile (500 mM) et complétée à IL. La solution obtenue est agitée jusqu'à obtention d'une solution homogène et transparente. -PBS IX : 80 g de NaCl (Sigma Aldrich®, 142,04 g/mol); 2 g de KC1 (Fluka®, 76,5 g/mol); 28,9 g de Na2HP04, 12H20 (Sigma Aldrich®, 358,14 g/mol); 2,027 g de NaH2P04, 1H20 (Sigma Aldrich®, 137,99 g/mol) sont dilués dans de l'eau distillée, puis la solution est complétée à IL final. Finalement, 100 mL de PBS 10X sont ajoutés à 900 mL d'eau distillée. La solution de IL de PBS IX est ensuite stérilisée.
Exemple 1 : préparation d'une matrice de collagène fibrille transparente par évaporation
Préparation d'une solution initiale de collagène
Dans cet exemple, une solution de collagène acido-soluble issue de veau de concentration 5 mg/mL en collagène commercialisée par la société SYMATESE sous la référence ACI (N°Baan : S2132380005), numéro de ïot ACI070, est utilisé comme solution initiale de collagène. Le pH de la solution est de 3,5.
Concentration de la solution de collagène par évaporation
100 mL de solution initiale de collagène est placé dans un cristaliisoir de 200 mL stérile préalablement pesé à vide. Le cristaliisoir est laissé ouvert sous une hotte à flux laminaire pendant 12 heures environ. L' évaporation sous hotte permet la concentration du collagène au sein du contenant par l'évaporation de eau présente dans la solution. Une matrice de collagène de concentration 45 mg/mL est obtenue. L'évolution de la concentration en collagène au cours de Pévaporation peut être déterminée en pesant la solution de collagène acido-soluble ou, plus approximativement, en mesurant la baisse de volume au sein du récipient.
La- solution peut régulièrement être homogénéisée grâce à une pipette pendant l'évaporation. Si un iïjm de surface sec se forme, l'ajout de quelques gouttes d'acide acétique permet d'homogénéiser à nouveau l'ensemble et de reprendre l'évaporation. Une matrice de collagène concentrée en collagène à 45 mg/ml est ainsi obtenue.
Le même procédé a été a été reproduit en plaçant 8 ml de la solution initiale de collagène dans un cristallisoir de 10 ml pendant 48 heures. Une matrice de collagène de concentration 45 mg/ml est obtenue.
Fibrillogenèse de solutions de collagène concentrées en présence de vapeurs d'ammoniaque
Le cristallisoir contenant la solution de collagène à une concentration de 45 mg/mL est placée dans un dessiccateur (5L) dans lequel est aussi placé un bêcher contenant une solution aqueuse d'ammoniaque (Carlo Erba®, 30 mL, 35,046 g/mol, 28-30%). L'ensemble est laissé sous vapeurs d'ammoniaque dans le dessiccateur fermé hermétiquement, durant 2 h sous hotte chimique. Une matrice de collagène fibrille de pH 10 est obtenue.
Rinçages des matrices de collagène fibrille
Éventuellement, sous la hotte à flux laminaire, la matrice est rincée avec du PBS IX (100 mL, pH = 7,4, pendant 5 minutes) plusieurs fois de suite jusqu'à obtention d'un pH neutre (pH à évaluer avec du papier pH). La matrice est conservée à 4°C dans un tube Falcon® stérile contenant du PBS IX (40 mL) jusqu'à utilisation.
Le procédé décrit ci-dessus peut être mis en œuvre avec du collagène extrait de queue de rat. Des matrices transparentes de collagène fibrille ont été obtenues à partir d'une solution initiale de collagène présentant une force ionique de 153 mM, 500 raM, 669 mM ou 1,2 M. De même, des matrices transparentes de collagène ont été obtenues à partir d'une solution initiale de collagène concentrée en collagène à 1 mg mL.
Exemple 2 : préparation d'une matrice de collagène fibrille transparente par dialyse
Préparation d'une solution initiale de collagène 8 mL d'une solution de coilagène acido-soluble de Type I (3,2 mg/mL) purifiée à partir de tendons de queues de rats selon Gobeaux et al. (Gobeaux et al. 2007. Langmuir, 23 (11), p. 641 1-6417) sont dilués dans 16 mL d'une solution d'acide acétique stérile Purex (500 mM). On obtient 25 mL solution de coilagène acido-soluble de concentration 1 mg/mL. Le pH de la solution est de 3,5.
Concentration de la solution de coilagène par dialyse
Cette solution de coilagène est injectée dans une cellule de dialyse par un capillaire en téflon (Dupont® PFA tubing, 0,35 mm de diamètre interne) à l'aide d'une seringue stérile (Terumo®, 10 mL, sans aiguille). La poussée sur la seringue est réalisée avec un pousse- seringue (Kdscientific®, KDS 101). La cellule de dialyse est constituée d'un moule (QuixSep® Microdiaiyzers, volume 1 mL) et d'une membrane de dialyse sèche réhydratée dans l'eau bouillante (Spectra Por®, regenerated cellulose, MWCO 14000 Da).
La dialyse est effectuée contre une solution de polyéthylène glycol (PEG, Sigma Aldrich®, 35 kDa, 60 mg/mL, 500 mL) diluée dans de l'acide acétique stérile Purex (500 mM). L'homogénéité de la solution peut être maintenue par agitation.
Un volume total de 18 mL de solution de coilagène est injecté. Au cours de l'expérience, la vitesse d'injection est réglée autour de 0,2 mL/heure, en fonction du « gonflement » de la membrane de dialyse sous l'effet de la pression. Avec le protocole décrit ci-dessus, le temps pour injecter les 18 mL de solution est de 3 à 4 jours environ. L'injection continue de cette solution sous dialyse permet la concentration du coilagène au sein de la matrice. La forme et la taille des matrices dépendent uniquement du moule qui constitue la cellule de dialyse dans laquelle est injectée la solution de coilagène au cours du temps. Les conditions opératoires décrites ci-dessus permettent d'obtenir une matrice de 1 cm3 et de concentration d'une valeur de 45 mg/mL. Un moule plus gros impliquerait des temps d'injection plus grands.
Tout le montage s'effectue sous hotte à flux laminaire afin de préserver l'ensemble en condition stérile. Les bouchons et clips constituant la cellule de dialyse sont préalablement stérilisés par immersion dans un bêcher contenant de l'éthanol 90% (30 minutes). Les membranes de dialyse sont coupées à la taille optimale (environ 5 cm de longueur), puis réhydratées par immersion dans de l'eau en ébullition puis refroidies dans de l'eau stérile. Une seringue stérile (10 mL) est remplie avec 9 mL de la solution de collagène. La cellule de dialyse et la seringue sont reliées à l'aide d'un capillaire, qui permettra une injection progressive du collagène. Afin de rendre le système hermétique un cône stérile dont le bout est ajusté est connecté d'un côté à l'embout de la seringue enroulé de téflon, et de l'autre côté au capillaire.
Finalement, la cellule de dialyse est remplie avec la solution de collagène à l'aide de la seringue (ouverture vers le haut), puis la membrane est posée contre la cellule de dialyse en évitant de former des bulles. La cellule est fermée à l'aide d'un opercule qui la constitue.
Une fois le montage terminé, l'étanchéité des jonctions bouchon/capillaire et capillaire/cône est assurée avec de la cire fondue à l'aide d'un fer à souder.
Les bouchons de dialyse sont plongés dans un bêcher muni d'un barreau aimanté contenant la solution de PEG, tout en s'assurant que seule la partie contenant ia membrane de dialyse soit immergée. Le bêcher est alors placé sur un agitateur magnétique (400-500 rpm, à température ambiante) pour permettre d'homogénéiser la concentration en PEG à travers la membrane de dialyse.
Fibritlogenèse de la solution de collagène concentrée
Une fois l'injection de la solution de collagène terminée, l'injection est arrêtée. L'auto-assemblage des triples hélices de collagène en fibrilles s'effectue par fibrillogenèse sous vapeurs d'ammoniaque. Pour cela, la cellule de dialyse, sans le capillaire, est placé dans un dessiccateur (5L) dans lequel est aussi placé un bêcher contenant une solution aqueuse d'ammoniaque (Carlo Erba®, 60 mL, 35,046 g/moi, 28-30%). La cellule de dialyse est laissée sous vapeurs d'ammoniaque dans le dessiccateur fermé hermétiquement, durant 48h sous hotte chimique.
Finalement, sous la hotte à flux laminaire, la matrice est délicatement retirée du bouchon de dialyse à l'aide d'une pince stérile, et rincée plusieurs fois dans un récipient stérile (Corning®, 50 mL, 30x115 mm) contenant du PBS IX ou de l'eau stérile ultrapure (45 mL, pendant 5 minutes) jusqu'à obtention d'un pH neutre (pH à évaluer avec du papier pH). La matrice est conservée à 4°C dans un tube Falcon® stérile contenant de l'eau stérile (40 mL) jusqu'à utilisation. Ces conditions expérimentales mènent à la synthèse d'une matrice de collagène fibrille biphasée composée d'une phase opaque et d'une phase transparente superposées, cette dernière est retirée par découpe à l'aide d'un bistouri stérile et conservée.
Exemple 3 : caractérisation des matrices obtenues
Des matrices de collagène fibrillé concentrées en collagène à 40 mg/ml, 42 mg/ml, 43,5 mg/mL, 45 mg/mL, 46,8 mg/mL et 48 mg/mL ont été obtenues selon le procédé exposé en Exemple 1 (collagène issu de veau).
Observations à l'œil nu et en microscopie à lumière polarisée (MOLP) La figure 1 synthétise les résultats de l'analyse à l'œil nu et en microscopie à lumière polarisée de matrices de collagène à différentes concentrations comprises entre 40 mg/ml et 48 mg/ml en collagène.
La. figure 2a illustre la présence d'organisations biréfringentes apparentées à des «phases bleues» dans une solution de collagène concentrée à 45 mg/mL. Ces phases cristallines-liquides particulières n'ont, jusqu'à maintenant, été décrites que pour- des cristaux liquides thermotropes. En solution, le collagène est un cristal liquide de type iyotrope. L'observation d'une telle « phase bleue » est cohérente dans la mesure où elle est décrite dans la littérature, pour des cristaux liquides thermotropes, comme étant une phase intermédiaire entre la phase isotrope' et la phase cholestérique. La figure 2b présente l'obtention d'une texture comparable dans une solution de collagène issu de queues de rat concentrée à 45 mg/mL.
La figure 2c illustre la présence d'organisations biréfringentes apparentées à des phases bleues dans une matrice de collagène fibrille à 45 mg/mL indiquant ainsi que cette organisation particulière a été conservée après fibrillogenèse.
Étude de transmittance par ellipsométrie
La transmittance des matrices de collagène flbrillé a été étudiée par ellipsométrie (Figures 3 et 4). Les spectres de transmission sont obtenus en utilisant un Ellipsomètre (Variable angle spectroscopic ellipsometry (VASE) M-2000U Woollam spectroscopic ellipsometer) entre 370 et 1000 nm à un angle d'incidence de 0°. Afin de s'assurer de la planarité des surfaces, les matrices sont placées entre deux lames de verre pour mici scopie en prenant comme référence l'air (Faustini et ai. ACS Appî. Mater. Interfaces, 2014, 6 (19), pp 17102-171 10).
La figure 3 représente la transmittance des matrices entre 370 et 1000 nm. On observe, en ordonnée, la transmittance de matrices de concentrations en fonction, en abscisse, de la longueur d'onde en nm : 40 mg/ml (courbe 1), 42 mg/ml (courbe 2), 43,5 mg mL (Courbe 3), 45 mg/mL (courbe 5), 46,8 mg/mL (courbe 4) et 48 mg/ml (Courbe 7) en fonction de la longueur d'onde (370 à 1000 nm). Les références sont l'air. Pour la matrice à 45 mg/mL, l'eau a également été utilisée comme référence (courbe 6). La transmittance la plus élevée quelle que soit la longueur d'onde est obtenue avec la matrice à 45 mg/mL.
La figure 4 représente la transmittance des matrices à 700 nm. On observe que la transmittance atteint un maximum pour des matrices de collagène fibrillé concentrées à 45 mg/ml et qu'en s'éloignant de la valeur de 45 mg/mL la transmittance diminue. Les matrices concentrées à 40 mg/ml sont opaques.
Exemple 4 : effet d'une contrainte de cisaillement sur une matrice avant fibrillogenèse
La figure 5 illustre l'importance de limiter les contraintes de cisaillement avant fibrillogenèse. La Zone 1 représente mie zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 45 mg/ml en collagène ayant seulement subi les contraintes de cisaillement liées aux manipulations lors de l'étape de concentration. La Zone 1 de la matrice de collagène, transparente avant fibrillogenèse, reste transparente après fibrillogenèse. La Zone 2 représente une zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 45 mg/ml en collagène ayant subi l'application d'un stress mécanique local sous forme de frottements de surface à l'aide d'un scalpel avant fibrillogenèse. La Zone 2 de cette matrice de collagène, transparente avant fibrillogenèse, devient opaque après fibrillogenèse. La Zone 3 de cette matrice de collagène représente une zone d'une matrice de collagène fibrillé concentrée à 45 mg/mL ayant subi un prélèvement à la spatule ayant entraîné un stress mécanique local avant fibrillogenèse. On observe que seuls les bords de cette Zone 3 de cette matrice sont devenus opaques. La manipulation de la matrice après fibrillogenèse n' entraîne pas l'apparition de zones d'opacité. Exemple 4 : stockage des matrices
Des matrices obtenues par le procédé de l'invention à partir de collagène issu de queues de- rat ont été conservées pendant 4 ans à 4°C dans de l'eau ultrapure stérile sans altération de transparence.
Les inventeurs ont également conservé des matrices obtenues par le procédé de l'inveniion à partir de collagène de gi*ade clinique dans du PBS à 4°C augmenté d'un milieu de conservation dédié aux cornées (Cornea cold®, Eurobio, Les Ulis, France) pendant 3 semaines sans altération de transparence.
Une pellicule de sels peut se former en surface lorsque les matrices sont conservées dans du PBS à froid dans le cas du collagène de « grade clinique » mais il est possible de la retirer. La précipitation de sels peut être évitée et le temps de conservation augmenté dans un milieu de conservation dédié aux cornées (Cornea cold®) toujours à 4°C.
Références
Hulmes D.J.S., Miller A. 1979. Nature, 282, p. 878-880.
Hélary et al 2005. Biomaterials, 26, p.1533- 1 43
Gobeaux et al. 2007. Langmuir, 23 (1 ), p. 6411-6417
Knight et al. 1998. J Biomed Mater Res. 41 , p. 185-191
Faustini et al 2014. ACS Appl. Mater. Interfaces, 6 (19), p. 17102-171 10

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une matrice transparente de collagène fibrille comprenant les étapes suivantes:
a) une étape de préparation d'une solution acide de collagène dans un solvant aqueux b) une étape de concentration de la solution acide de collagène
c) une étape de fibrillogenèse de la matrice de collagène caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43 et 50 mg/ml.
2. Procédé selon la revendication caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite de façon à limiter, avantageusement à pratiquement éviter les contraintes de cisaillement.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de concentration est conduite jusqu'à l'obtention d'une concentration en collagène comprise entre 43,5 et 47 mg/ml, préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL.
4. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la solution acide de collagène est constituée par uiie solution aqueuse d'acide acétique.
5. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que la concentration de la solution acide initiale, avant l'étape de concentration, est comprise entre 0,01 mg/ml et 5 mg/ml, avantageusement comprise entre 0,5 et 3 mg/ml.
6. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de concentration est réalisée par évaporation ou par dialyse.
7. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'étape de fibrillogenèse consiste à mettre en contact la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'étape de fibrillogenèse est effectuée par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant en outre une étape de lavage de la matiice de collagène fibrillé dans une solution tampon, par exemple de solution tamponnée au phosphate.
10. Procédé de préparation d'une matrice de collagène transparente selon les revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
d) préparation d'une solution acide de collagène dans une solution aqueuse d'acide acétique à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml ;
e) concentration de la solution acide de collagène par évaporation ou par dialyse jusqu'à obtention d'une concentration en collagène comprise entre 42 et 50 mg/ml, préférablement comprise entre 43 et 47 mg/ml, plus préférentiellement de l'ordre de 45 mg/mL ;
f) formation de fibrilles par mise en contact de la matrice de collagène avec une phase gazeuse basique ou un liquide neutre ou basique, avantageusement par mise en contact de la matrice de collagène avec des vapeurs d'ammoniaque.
11 , Matrice de collagène fibrillé transparente susceptible d'être obtenue par un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle présente une transmittance supérieure à 0,6, de préférence supérieure à 0,8, à 700 nm.
12. Utilisation de la matrice de collagène fibrillé selon la revendication 1 1 pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée.
13. Utilisation de la matrice de collagène fibrillé selon la revendication 1 1 pour la fabrication d'un pansement.
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