WO2012052679A1 - Procede de preparation de collagene fibrille - Google Patents

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WO2012052679A1
WO2012052679A1 PCT/FR2011/052435 FR2011052435W WO2012052679A1 WO 2012052679 A1 WO2012052679 A1 WO 2012052679A1 FR 2011052435 W FR2011052435 W FR 2011052435W WO 2012052679 A1 WO2012052679 A1 WO 2012052679A1
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WO
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collagen
advantageously
concentration
matrix
preparing
Prior art date
Application number
PCT/FR2011/052435
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English (en)
Inventor
Paulo De Sa Peixoto
Gervaise Mosser
Original Assignee
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen

Definitions

  • the subject of the present invention is a process for preparing a transparent matrix of fused coUagene suitable for use as a biomaterial, especially as a corneal substitute.
  • CoUagene is the most abundant protein in mammals. It is a major structural protein of connective tissues, in which it fulfills the role of reinforcement. In fact, the most abundant types of coUagene assemble in the form of fibrils whose resistance, at equal weight, surpasses that of steel. They are associated within supramolecular buildings with many other types of coUagene as well as other partner macro molecules. The fibril framework of coUagene is not only responsible for the cohesion of the tissues but also for their specific architecture which gives them particular mechanical properties. Thus, according to the tissues considered, the coUagene will be organized in a specific way, in order to respond optimally to its functions.
  • the fibrils form supramolecular edifices organized very precisely from the coUagene triplicates in a process called fibrinogenesis.
  • the most remarkable structural characteristic of coUagene fibrils is the axial shift of the component molecules by multiple values of D.
  • Period D is conventionally given for -67 nm and corresponds to 234 ⁇ 1 amino acids, determined by sequence analysis.
  • fibrinogenesis As an extracellular process of self-assembly of coUagene triple helices, mainly governed by classical physicochemical forces.
  • Heat Precipitation (Heat Precipitation) - Traditionally, fibrinogenesis studies have been carried out using neutral saline solutions of coUagene stored at 4 ° C, which have the property of precipitating in the form of fibrillar gel when their temperature rises to 37 ° C. The fibrils composing these gels have the characteristic axial periodicity of the coUagene in the native state. However it has been shown that the product of the precipitation may be inhomogeneous and that some of the triple helices may already be denatured at these temperatures. Concentration - Most in vitro studies of fibrinogenesis reported in the literature relate to diluted solutions, the fibrils of which are optionally concentrated by centrifugation. However, some work from freeze-dried samples, or simply dried and rehydrated afterwards. However, once dehydrated, the collagen disperse poorly in solution.
  • Kuznetsova N. et al. discloses a method for preparing fibrillar collagen which comprises a fibrillogenesis step which is necessarily in the presence of phosphate buffer. This article deals with the effect of enzyme on the fibrilogenesis properties of collagen and does not speak in any case of transparent solid matrix.
  • Giraud-Guille M-M. et al. (C.R. Chimie, 2008, 11, 245-252) review the liquid crystal properties of solubilized collagens as well as the openings in the field of tissue engineering. They report that a dense and organized dense matrix, in which the formed fibrils retain the organization set up in the liquid crystalline phase and have a period of 67 nm, is obtained from a collagen liquid crystal solution when we go from an acid pH to a neutral pH. However, these dense matrices are not transparent.
  • the inventors' team has developed in vitro fibro- genesis techniques from dense collagen solutions (Gobeaux, F. et al., Langmuir, 2007, 23, 6411-6417, J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509-1522).
  • Gobeaux F. et al. J. Mol Biol (2008) cited above
  • the fibrosogenesis is performed by immersing the collagen solutions obtained after dialysis either in a phosphate buffer having an ionic strength of between 24 mM and 1300 mM, or in a phosphate buffer supplemented with NaCl for ionic strengths between 522 and 1200 mM.
  • the matrices obtained with high ionic strength are opaque and those obtained at low ionic strengths are in the form of a loose translucent gel.
  • Collagen also plays a key role in the eye, since it contributes to the optical properties of the sclera and the cornea, respectively opacity and transparency.
  • the cornea consists of an organization in the form of plywood comprising layers consisting of equidistant dense collagen I fibrils. The diameter of these fibrils is very regular (20 nm ⁇ 5 nm) to ensure its transparency.
  • the organization of the cornea is complex, consisting of plywood patches rotating helically over the entire thickness of the stroma. Keratinocytes are distributed between the collagen layers and provide tissue repair when needed.
  • the cornea is the first refractive element of the eye of which it covers about a fifth of the surface. Located at the front of the eye, in front of the iris and the crystalline lens, the cornea is a sort of window through which light enters the eye. She also participates in the adjustment of the vision. Its perfect transparency is a condition sine qua non of good eyesight.
  • the cornea substitutes used in surgery are generally based on synthetic polymers but none of them has the major biochemical element, its density, or its three-dimensional organization. Transplantation of artificial corneas, made of polymers, is still uncommon and in France, the first took place in 2009. A small number of surgical teams perform this type of intervention and the lack of results is often linked to opacity. of the biosynthetic cornea partly linked to the presence of sutures made around the implant.
  • Transparent matrices based on collagen I derived either from cattle (Liu et al., Bio-Macro Molecules, (2006) 7, 1819-1828) or sea cucumber (Cucumaria frondosa international application WO 2007/106812) were synthesized. .
  • the matrices described by Liu et al. are artificially crosslinked and in the sea cucumber fibrils, the proteoglycans that are present play a role in the reinforcement of the matrix and allow to obtain the architecture of the plywood layer of the cornea during synthesis.
  • the subject of the present invention is a process for the preparation of a pure fibrilated collagen matrix comprising a step of fibrinogenesis of a collagen of type I, optionally combined with other types of collagen, such as collagen of type V, in liquid or non-liquid crystalline phase, said step being carried out in an aqueous medium, at a pH of between 3.5 and 12, advantageously between 3.5 and 5.5 in the absence of buffer and agent crosslinking, without the aid of an internal guiding matrix to guide the fibrils during fibrillogenesis and without applying a tension at the end of the fibrils.
  • the collagen solution comprises either a nematic / cholesteric phase, a smectic phase, or any other type of liquid crystal organization.
  • collagen fibrillated collagen having a non-random aggregation of collagen molecules and a period D of about 67 nm.
  • aqueous medium is understood to mean water optionally containing NaCl at a concentration of between 0.01 mM and 300 mM, advantageously between 0.01 mM and 0.05 mM.
  • the term "pure collagen, in particular pure collagen I, is understood to mean a solution of collagen purified according to the standard methods and in particular that described by Gobeaux F. et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). ; it is especially free of crosslinking agents such as aldehydes and polymers of synthetic reinforcements such as polyesters or natural as chitosan.
  • additives such as molecules of interest such as agents for modifying its porosity or collagen surface charges can be added to the material.
  • the collagen may be of natural, recombinant or synthetic origin. It may be commercially available, or may come in particular from skin or tendons from which it is extracted by the acidic or enzymatic route according to techniques known to those skilled in the art.
  • the initial solutions of collagen are prepared according to techniques known to those skilled in the art, in particular according to the technique described by Gobeaux F. et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). In these solutions, the collagen is only in the form of monomers (triple helices) and possibly in the form of aggregates.
  • the collagen concentration of the initial solutions is between 0.1 and 5 mg / ml, advantageously between 0.2 and 1 mg / ml. These initial solutions are then concentrated by techniques known to those skilled in the art, in particular by dialysis or centrifugation.
  • the concentration of the initial solution of collagen after concentration and before fibrinogenesis is between 10 and 200 mg / ml, advantageously between 10 and 90 mg / ml, even more advantageously between 30 and 80. mg / ml and at a pH of between 2.5 and 3.
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a temperature at which the collagen is not denatured, in particular at a temperature of between 15 and 30 ° C, advantageously between 20 ° C and 25 ° C.
  • fibrinogenesis can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by dialysis in the presence of an osmotically active polymer whose molecular weight is greater than the pore size of the dialysis membrane.
  • an osmotically active polymer whose molecular weight is greater than the pore size of the dialysis membrane.
  • Dextran® and polyethylene glycol (PEG) are examples of Dextran® and polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the polymer is polyethylene glycol with a molecular weight of 35000 Da (35 kDa).
  • the polymer concentration is a function of the type of polymer used, its molecular weight and the contact area between the collagen solution and the fibrogenesis solution; it is easily determined by the person skilled in the art with regard to this general knowledge.
  • the method comprises the following steps:
  • the pH is adjusted and controlled with any acid or strong base which increases very little the ionic strength, especially HCl or NaOH.
  • the fimbriated material thus obtained is organized and the period D being 67 ⁇ 4 nm, corresponds to the striation of the natural collagen. It is a material devoid of toxic element, which makes it perfectly biocompatible. Finally it is particularly resistant mechanically.
  • the concentration step b) can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by centrifugation, by filtration, by dialysis or by slow injection.
  • the average fibril diameter is between 10 and 25 nm, more advantageously between 14 and 20 nm.
  • the fibril diameter varies according to the ionic strength of the buffer used for dialysis as described in Gobeaux F. et al. J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509-1522) and the skilled person is able to modify the dialysis conditions to obtain fibrils of larger or smaller diameters without guarantee of transparency or mechanical strength.
  • the present invention also relates to a process for preparing a transparent matrix comprising the following steps:
  • This period of ripening corresponds to the duration of fibrillogenesis necessary to obtain a solid and stable transparent matrix, that is to say without apparent modifications of the characteristics over several months or by immersion in a high ionic strength buffer.
  • This fibrinogenesis period varies from a few days to 2 months, depending on the ionic strength, the temperature, the pH and the PEG concentration which will depend on the type of PEG (molecular weight) chosen.
  • Advantageously fibbrogenesis lasts from 3 weeks to 2 months, advantageously from 20 to 30 days.
  • the synthesized matrices can also be stored in a sterile hydrated atmosphere for several months at 4 ° without apparent changes in their characteristics.
  • the concentration step b) can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by centrifugation, filtration, dialysis or slow injection.
  • the method according to the invention makes it possible, because of the different parameters used which are such that the attractive and repulsive forces in action are balanced, to favor longitudinal rather than transverse growth (small diameter and long fibrils) and to generate a spacing. regular between the fibrils.
  • the subject of the invention is also a transparent matrix that can be obtained by the process according to the invention, said matrix being stable, the average fibril diameter advantageously being between 10 and 25 nm, and even more advantageously between 14 and 20 nm. and the period D being 67 ⁇ 4 nm.
  • the transparent matrix is understood to mean a matrix whose UV-Visible absorption density is equivalent to that of pure unsplit collagen (in monomeric form at pH 2.5).
  • the term "stable matrix” is intended to mean a matrix which does not exhibit any change in the size of the fibrils under physiological conditions (37 ° C., high ionic strength, etc.) and / or in the presence of cells. .
  • the matrices according to the invention do not become opaque when they are brought into contact with a medium having a high ionic strength, in particular a cell culture medium.
  • the subject of the invention is also the use of a transparent matrix thus obtained for the manufacture of artificial tissues or organs, in particular as a corneal substitute, as a support for the growth of cells and their behavioral analysis or as a support for study of bio-mineralization processes.
  • This matrix can also be used in the context of reconstitution of other tissues because its transparency will make it possible to follow the processes of integration of the implant within the patient.
  • the invention also relates to a corneal substitute prepared from a transparent matrix as defined above.
  • FIG. 1 shows a transparent matrix obtained according to the process of the invention:
  • 1A illustrates the mechanical strength of the matrix which is not liquid and its transparency 1B) illustrates the transparency of the matrix according to the invention (we see the black dot drawn on the support where the matrix is placed).
  • FIG. 2 shows a transparent matrix of friable collagen obtained according to the process of the invention observed under an optical microscope between crossed polarizers A) front view in the presence of a wave retardation plate, C) seen in profile in the absence of a blade retardant.
  • the birefringence shows the monolithic organization of the matrix characterized by the unidirectional orientation of the fibrils of the matrix.
  • FIG. 3 is the observation by transmission electron microscopy of an ultra-fine section of a matrix obtained according to the method of the invention.
  • the sample was previously fixed and embedded in resin to make ultra thin sections by microtomy.
  • FIG. 4 is an X-ray diffraction pattern of a transparent matrix of friable collagen obtained according to the process of the invention.
  • the Bragg diffraction peaks correspond to the harmonics of a collagen fibril with an axial organization of 67 ⁇ 4 nm.
  • FIG. 5 is a photograph recorded on a transmission light microscope illustrating the good adaptation of human fibroblasts to a transparent fibrillated collagen matrix obtained according to the method of the invention.
  • the transparency of the matrix allows the study of fibroblasts on a transmission photonic microscope unlike conventional synthesized collagen matrices.
  • Figure 6 illustrates the effects of ionic strength, temperature and pH for a 35 kDa PEG on the structure of the matrices prepared according to the invention.
  • Type I collagen is prepared from tails of young Wistar rats, according to the procedure described by Gobeaux F. et al. ⁇ Langmuir, 2007, 23, 6411-6417).
  • the solution The initial collagen concentration is 4.3 mg / ml and the solvent is 5 mM acetic acid.
  • the pH of the solution is 3.5.
  • 0.7 ml of this solution is concentrated by centrifugation at 3000 g for 8 h in 3KD nanosep® filtration tubes to a final concentration of between 27 and 45 mg / ml depending on the duration of the centrifugation.
  • the centrifugation tube is then used as a dialysis support.
  • the tube filled with the collagen solution is dialyzed against PEG of 35 kDa 60% molecular weight at pH 5 for 20 to 30 days to obtain fibrilogenesis (Cross-striated fibrils).
  • the matrices can then be stored in a hydrated atmosphere at 4 ° C for up to a year without any apparent modification of the characteristics (transparency, mechanics).
  • FIGS. 1A and 1B After 20 to 30 days of fibrilogenesis at 20 ° C., a transparent matrix is obtained (see FIGS. 1A and 1B), in which the fibrils are oriented homogeneously (FIG. 2) and in two orientations indicating the rotational nature of the organization. at the macroscopic scale ( Figure 3).
  • the collagen solutions are transparent to all pH tested after one hour of fibrillogenesis. They mature during the period of fibrillogenesis to give a transparent gel (3 days) then a transparent matrix fribrillée after 20 to 30 days of ripening.
  • the collagen solutions are transparent after one hour of fibrillogenesis and successively become translucent gel (3 days) and translucent foliated matrix (1 month).
  • the collagen solutions become loose and then dense translucent gels (pH 6, 3 days and 1 month respectively) or opaque gels then opaque fibrillated matrices (pH> 7.4 and ripening time> 3 days) .
  • the matrices remain stable then.
  • the collagen solutions become after 1 hour: a transparent gel (pH 5) or an opaque gel (pH> 6) and then become translucent or opaque matrices and fibrillated after 3 days of fibrillogenesis which remain stable thereafter.
  • Stable transparent matrices were also obtained from 45-60 mg / ml collagen solution contacted with water at pH 5 for one hour to effect solvent exchange. During this exchange, the initial solution is diluted (for example, an initial solution at 60 mg / ml collagen passes approximately 40 mg / ml of collagen). After one hour of exchange of the medium, the sample is removed from the water and then allowed to mature in a hydrated atmosphere at 20 ° in a closed chamber (for small Ependorf® tube samples). After one month, transparent matrices having the expected characteristics are obtained.

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Abstract

Procédé de préparation d'une matrice de collagène pur fîbrillé comprenant une étape de fïbrillogenèse d'un collagène de type I, éventuellement associé à un collagène de type V, en phase cristalline liquide ou non, ladite étape étant réalisée dans un milieu aqueux, à un pH compris entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5 en l'absence de tampon et d'agent réticulant, sans l'aide d'une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles lors de la fïbrillogenèse et sans application d'une tension à l'extrémité des fibrilles.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE COLLAGENE FIBRILLE
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente de coUagène fïbrillé apte à être utilisée comme biomatériau, notamment comme substitut cornéen.
Le coUagène est la protéine la plus abondante chez les mammifères. C'est une protéine structurale majeure des tissus conjonctifs, dans lesquels il remplit le rôle d'armature. En effet, les types de coUagène les plus abondants s'assemblent sous la forme de fibrilles dont la résistance, à poids égal, surpasse celle de l'acier. Ils sont associés au sein d'édifices supramoléculaires à de nombreux autres types de coUagène ainsi qu'à d'autres macro molécules partenaires. La trame de fibrilles de coUagène est non seulement responsable de la cohésion des tissus mais aussi de leur architecture spécifique qui leur confère des propriétés mécaniques particulières. Ainsi, suivant les tissus considérés, le coUagène sera organisé de façon spécifique, de manière à répondre de façon optimale à ses fonctions.
Dans des conditions physiologiques, les fibrilles forment des édifices supramoléculaires organisés de façon très précise à partir des triples hélices de coUagène au cours d'un processus nommé fîbrillogenèse. La plus remarquable caractéristique structurale des fibrilles de coUagène est le décalage axial des molécules les composant par des valeurs multiples de D. La période D est classiquement donnée pour -67 nm et correspond à 234±1 acides aminés, déterminés par analyse de séquence.
Les mécanismes de la fîbrillogenèse in vivo sont encore mal connus et plusieurs hypothèses ont été formulées. L'une de ces hypothèses décrit la fîbrillogenèse comme un processus extracellulaire d'auto-assemblage de triples hélices de coUagène, principalement gouverné par des forces physico-chimiques classiques.
La fîbrillogenèse in vitro est réalisée par plusieurs techniques qui sont rappelées par F. Gobeaux (Thèse de doctorat de l'Université Pierre et Marie Cuire http : //tel . archives- oi3vertes.fr/docs/O0/33/74/O2/PDF/TIIESE___FGOBEAUX.pdf) et qui sont les suivantes :
La précipitation induite thermiquement (Heat précipitation) - Traditionnellement, les études sur la fîbrillogenèse ont été réalisées à partir de solutions salines neutres de coUagène conservées à 4°C, qui ont comme propriété de précipiter sous forme de gel fîbrillaire quand leur température est remontée à 37°C. Les fibrilles composant ces gels présentent la périodicité axiale caractéristique du coUagène à l'état natif. Cependant on a montré que le produit de la précipitation pouvait être inhomogène et qu'une partie des triples hélices pouvait déjà se dénaturer à ces températures. Concentration - La plupart des études de la fïbrillogenèse in vitro rapportées dans la littérature concernent des solutions diluées, dont les fibrilles sont éventuellement concentrées par centrifugation. Cependant, certains travaillent à partir d'échantillons lyophilisés, ou simplement desséchés et réhydratés après coup. Or, une fois déshydraté, le collagène se disperse mal en solution.
Kuznetsova N. et al. (J. Biol. Chem., 1999, 274, 36083-36088) décrivent un procédé de préparation de collagène fïbrillaire qui comprend une étape de fïbrillogenèse qui se fait nécessairement en présence de tampon phosphate. Cet article traite de l'effet d'enzyme sur les propriétés de fïbrillogenèse du collagène et ne parle en aucun cas de matrice solide transparente.
Giraud-Guille M-M. et al. (C.R. Chimie, 2008, 11, 245-252) font une revue sur les propriétés cristal liquide des collagènes so lubies ainsi que les ouvertures dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. Ils rapportent qu'une matrice dense fïbrillée et organisée, dans laquelle les fibrilles formées conservent l'organisation mise en place dans la phase cristalinel liquide et présentent une période de 67 nm, est obtenue à partir d'une solution cristal liquide de collagène lorsqu'on passe d'un pH acide à un pH neutre. Toutefois ces matrices denses fïbrillées ne sont pas transparentes.
Ces techniques présentant de nombreux inconvénients, l'équipe des inventeurs a mis au point des techniques de fïbrillogenèse in vitro à partir de solutions denses de collagène (Gobeaux F. et al, Langmuir, 2007, 23, 6411-6417 ; J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509- 1522). Dans l'article de Gobeaux F. et al. (J. Mol. Biol. (2008) déjà cité), la fïbrillogenèse est réalisée par immersion des solutions de collagène obtenues après dialyse soit dans un tampon phosphate ayant une force ionique comprise entre 24 mM et 1300 mM soit dans un tampon phosphate additionné de NaCl pour des forces ioniques entre 522 et 1200 mM. Les matrices obtenues à forte force ionique sont opaques et celles obtenues à faibles forces ioniques se présentent sous forme d'un gel translucide lâche.
Le collagène joue aussi un rôle primordial dans l'œil, puisqu'il contribue aux propriétés optiques de la scléra et de la cornée, respectivement l'opacité et la transparence.
La cornée consiste en une organisation en forme de contreplaqué comprenant des couches constituées de fibrilles de collagène I dense équidistantes. Le diamètre de ces fibrilles est très régulier (20 nm ± 5nm) pour assurer sa transparence. L'organisation de la cornée est complexe, constituée de patches de contreplaqué tournant de façon hélicoïdale sur toute l'épaisseur du stroma. Des kératinocytes sont répartis entre les couches de collagène et assurent la réparation des tissus en cas de besoin. La cornée est le premier élément réfractif de l'œil dont elle couvre environ un cinquième de la surface. Située à l'avant de l'œil, devant l'iris et le cristallin, la cornée est une sorte de fenêtre par laquelle entre la lumière dans l'œil. Elle participe aussi à l'ajustement de la vision. Sa parfaite transparence est une condition sine qua non d'une bonne vue.
Les maladies qui opacifient la cornée sont une cause majeure de cécité. La perte de la vue due à une maladie ou une blessure de la cornée affecte plus de dix millions de personnes dans le monde et c'est aussi la cause la plus fréquente de cécité.
Aujourd'hui, le traitement de choix est l'implantation d'une cornée prélevée sur un cadavre mais le taux d'échec est assez élevé en raison du rejet des tissus étrangers par l'organisme receveur.
Les substituts de cornée utilisés en chirurgie sont généralement à base de polymères synthétiques mais aucun d'entre eux ne présente l'élément biochimique majeur, sa densité, ou son organisation tri-dimensionnelle. Les transplantations de cornées artificielles, en polymères, sont encore peu répandues et, en France, la première a eu lieu en 2009. Un nombre restreint d'équipes chirurgicales réalisent ce type d'intervention et le manque de résultat est souvent lié à une opacité de la cornée biosynthétique liée en partie à la présence des sutures réalisées autour de l'implant.
Des matrices transparentes, à base de collagène I issu soit de bovins (Liu et al., Bio macro molécules, (2006) 7,1819-1828) soit de concombre de mer (Cucumaria frondosa demande internationale WO 2007/106812) ont été synthétisées. Les matrices décrites par Liu et al. sont réticulées artificiellement et dans les fibrilles de concombre de mer, les protéoglycanes qui y sont présents jouent un rôle dans le renforcement de la matrice et permettent d'obtenir l'architecture de la couche de contreplaqué de la cornée lors de la synthèse.
La demande internationale WO 2009/126958 décrit un procédé de fabrication d'un collagène fibrillé qui utilise nécessairement une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles.
Aussi existe-t-il un besoin de mettre au point un procédé simple et rapide qui permette de disposer d'un matériau, fabriqué à partir de la brique biochimique fondamentale du stroma (le collagène I) et présentant la structure la plus proche possible de la cornée, qui soit utilisable comme substitut cornéen, qui soit transparent sur une longue durée et qui ne nécessite pas de pontages.
Au cours de leurs travaux sur les solutions denses de collagène, toujours maintenues hydratées, les inventeurs ont mis au point un procédé de fïbrillogenèse de collagène pur, notamment de collagène I pur permettant d'obtenir des matrices transparentes qui répondent aux exigences souhaitées.
Aussi la présente invention a-t-elle pour objet un procédé de préparation d'une matrice de collagène pur fïbrillé comprenant une étape de fïbrillogenèse d'un collagène de type I, éventuellement associé à d'autres types de collagène, comme le collagène de type V, en phase cristalline liquide ou non, ladite étape étant réalisée dans un milieu aqueux, à un pH compris entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5 en l'absence de tampon et d'agent réticulant, sans l'aide d'une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles lors de la fïbrillogenèse et sans application d'une tension à l'extrémité des fibrilles.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la solution de collagène comprend soit une phase nématique/cholestérique, soit une phase smectique, soit toute autre type d'organisation cristal liquide.
Au sens de la présente invention on entend par collagène fïbrillé un collagène présentant une agrégation non aléatoire des molécules de collagène et une période D d'environ 67 nm.
Au sens de la présente invention, on entend par milieu aqueux de l'eau contenant éventuellement du NaCl à une concentration comprise entre 0,01 mM et 300 mM, avantageusement entre 0,01 mM et 0,05 mM.
Au sens de la présente invention, on entend par collagène pur, notamment collagène I pur, une solution de collagène purifiée suivant les méthodes classiques et notamment celle décrite par Gobeaux F. et al., (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417) ; il est notamment exempt d'agents réticulants comme les aldéhydes et de polymères de renforts synthétiques comme des polyesters ou naturels comme le chitosane. En revanche des additifs comme des molécules d'intérêt tels que des agents permettant de modifier sa porosité ou les charges de surfaces du collagène peuvent être ajoutés au matériau.
Conformément à l'invention, le collagène peut être d'origine naturelle, recombinante ou synthétique. Il peut être disponible dans le commerce, ou peut provenir notamment de la peau ou des tendons d'où il est extrait par voie acide ou enzymatique selon des techniques connues de l'homme du métier.
Les solutions initiales de collagène sont préparées selon des techniques connues de l'homme du métier, notamment selon la technique décrite par Gobeaux F. et al. (Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). Dans ces solutions, le collagène est uniquement sous forme de monomères (triples hélices) et éventuellement sous forme d'agrégats. La concentration en collagène des solutions initiales est comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml. Ces solutions initiales sont ensuite concentrées par des techniques connues de l'homme du métier, notamment par dialyse ou centrifugation.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la concentration de la solution initiale de collagène après concentration et avant fïbrillogenèse est comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml et à un pH compris entre 2,5 et 3.
Le procédé selon l'invention est avantageusement mis en œuvre à une température à laquelle le collagène n'est pas dénaturé, en particulier à une température comprise entre 15 et 30 °C, avantageusement entre 20 °C et 25 °C.
Conformément à l'invention, la fïbrillogenèse peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par dialyse en présence d'un polymère osmotiquement actif dont le poids moléculaire est supérieur à la taille des pores de la membrane de dialyse. On peut citer à titre d'exemple le Dextran® et le polyéthylène glycol (PEG). Avantageusement le polymère est du polyéthylèneglycol dont le poids moléculaire est de 35000 Da (35 kDa). La concentration en polymère est fonction du type de polymère utilisé, de son poids moléculaire et de la surface de contact entre la solution de collagène et la solution de fïbrillogenèse ; elle est facilement déterminée par l'homme du métier au regard de ces connaissances générales.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le procédé comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml,
b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml,
c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthylèneglycol de 35 kDa à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5.
Le pH est ajusté et contrôlé avec tout acide ou base forte qui augmente très peu la force ionique, notamment HC1 ou NaOH.
Le matériau fïbrillé ainsi obtenu est organisé et la période D étant de 67±4 nm, correspond à la striation du collagène naturel. C'est un matériau dépourvu d'élément toxique, ce qui le rend parfaitement biocompatible. Enfin il est particulièrement résistant sur le plan mécanique.
Conformément à l'invention, l'étape b) de concentration peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation, par fîltration, par dialyse ou par injection lente.
Avantageusement le diamètre moyen des fibrilles est compris entre 10 et 25 nm, encore plus avantageusement entre 14 et 20 nm.
Le diamètre des fibrilles varie en fonction de la force ionique du tampon utilisé pour la dialyse comme décrit dans Gobeaux F. et al. J. Mol. Biol. (2008), 376, pp. 1509-1522) et l'homme du métier est capable de modifier les conditions de dialyse pour obtenir des fibrilles de diamètres plus ou moins grands sans garantie de transparence ni de tenue mécanique.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une matrice transparente comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml,
b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml,
c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthylèneglycol de 35 kDa à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5.
d) mûrissement jusqu'à obtention d'une matrice transparente stable.
Cette période de mûrissement correspond à la durée de fïbrillogenèse nécessaire pour obtenir une matrice transparente solide et stable, c'est à dire sans modifications apparentes des caractéristiques sur plusieurs mois ou par immersion dans un tampon haute force ionique. Cette période de fïbrillogenèse varie de quelques jours à 2 mois, en fonction de la force ionique, de la température, du pH et de la concentration en PEG qui elle va dépendre du type de PEG (poids moléculaire) choisi. Avantageusement la fïbrillogenèse dure de 3 semaines à 2 mois, avantageusement de 20 à 30 jours.
Les matrices synthétisées peuvent par ailleurs être stockées en atmosphère hydratée stérile pendant plusieurs mois à 4° sans modifications apparentes de leurs caractéristiques. Conformément à l'invention, l'étape b) de concentration peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par centrifugation, par fïltration, par dialyse ou par injection lente.
Le procédé selon l'invention permet, du fait des différents paramètres utilisés qui sont tels que les forces attractives et répulsives en action s'équilibrent, de favoriser une croissance longitudinale plutôt que transverse (fibrilles de faible diamètre et longues) et de générer un écartement régulier entre les fibrilles.
L'invention a également pour objet une matrice transparente susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, ladite matrice étant stable, le diamètre moyen des fibrilles étant avantageusement compris entre 10 et 25 nm, encore plus avantageusement entre 14 et 20 nm et la période D étant de 67±4 nm.
Au sens de la présente invention, on entend par matrice transparente une matrice dont la densité d'absorption UV- Visible est équivalente à celle du collagène non fîbrillé pur (sous forme monomérique à pH 2.5).
Au sens de la présente invention, on entend par matrice stable, une matrice qui ne présente pas d'évolution de la taille des fibrilles dans des conditions physiologiques (37°C, haute force ionique...) et/ou en présence de cellules. Ainsi les matrices selon l'invention, ne deviennent pas opaques lorsqu'on les met en contact avec un milieu ayant une forte force ionique, notamment un milieu de culture de cellule.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une matrice transparente ainsi obtenue pour la fabrication de tissus ou d'organes artificiels, notamment comme substitut de cornée, comme support pour la croissance de cellules et leur analyse comportementale ou comme support pour l'étude de procédés de bio-minéralisation. Cette matrice peut également être utilisée dans le cadre de reconstitution d'autres tissus car sa transparence permettra de suivre les processus d'intégration de l'implant au sein du patient.
L'invention a également pour objet un substitut de cornée préparé à partir d'une matrice transparente telle que définie précédemment.
L'invention sera mieux comprise à la lumière des exemples et des figures 1 à 5 qui suivent. La figure 1 montre une matrice transparente obtenue selon le procédé de l'invention :
1A) illustre la tenue mécanique de la matrice qui n'est pas liquide et sa transparence 1B) illustre la transparence de la matrice selon l'invention (on voit le point noir dessiné sur le support où est posée la matrice).
La figure 2 montre une matrice transparente de collagène fïbrillée obtenue selon le procédé de l'invention observée au microscope optique entre polariseurs croisés A) vue de face en présence d'une lame retardatrice d'onde, C) vue de profil en absence de lame retardatrice. La biréfringence montre l'organisation monolithique de la matrice caractérisée par l'orientation unidirectionnelle des fibrilles de la matrice.
La figure 3 est l'observation par microscopie électronique à transmission d'une coupe ultra-fine d'une matrice obtenue selon le procédé de l'invention. L'échantillon a été préalablement fixé et enrobé dans de la résine afin d'en effectuer des coupes ultra fines par microtomie. A) Vue à faible grandissement montrant l'alternance de l'orientation des fibrilles de collagène. L'orientation des fibrilles dépend de la méthode de concentration et de la concentration initiale en collagène. b) vue à plus fort grandissement montrant la régulation fine du diamètre des fibrilles et leur espacement régulier.
La figure 4 est un cliché de diffraction X d'une matrice transparente de collagène fïbrillée obtenue selon le procédé d'invention. Les pics de diffraction de Bragg correspondent aux harmoniques d'une fibrille de collagène possédant une organisation axiale de 67±4 nm.
La figure 5 est une photo enregistrée sur un microscope photonique à transmission illustrant la bonne adaptation des fibroblastes humains sur une matrice transparente de collagène fibrillé obtenu selon le procédé de l'invention. La transparence de la matrice permet l'étude des fibroblastes sur un microscope photonique à transmission contrairement aux matrices de collagène synthétisées de manière classique.
La figure 6 illustre les effets de la force ionique, de la température et du pH pour un PEG de 35 kDa sur la structure des matrices préparées selon l'invention.
EXEMPLE 1 : PREPARATION D'UNE MATRICE FÏBRILLÉE TRANSPARENTE DE COLLAGENE
1.1. Mode opératoire
Un collagène de type I est préparé à partir de queues de jeunes rats Wistar, selon le mode opératoire décrit par Gobeaux F. et al. {Langmuir, 2007, 23, 6411-6417). La solution initiale de collagène a une concentration de 4,3 mg/ml et le solvant est de l'acide acétique 5 mM. Le pH de la solution est de 3,5.
0,7 ml de cette solution est concentré par centrifugation à 3 000g pendant 8 h dans des tubes de filtration 3KD Nanosep® jusqu'à une concentration finale comprise entre 27 et 45 mg/ml en fonction de la durée de la centrifugation. Le tube de centrifugation est ensuite utilisé comme support de dialyse. Le tube rempli de la solution de collagène est dialysé contre du PEG de poids moléculaire 35 kDa 60 % à pH 5 pendant 20 à 30 jours afin d'obtenir la fïbrillogenèse (Cross-striated fîbrils). Les matrices peuvent être ensuite stockées en atmosphère hydratée à 4°C jusqu'à un an sans modification apparente des caractéristiques (transparence, mécanique).
1.2. Résultats
Après 20 à 30 jours de fîbrillognèse à 20 °C, on obtient une matrice transparente (voir figures 1A et 1B), dans laquelle les fibrilles sont orientées de manière homogène (figure 2) et suivant deux orientations indiquant la nature rotationnelle de l'organisation à l'échelle macroscopique (figure 3).
L'observation de coupes ultra- fines par microscopie électronique à transmission montre que les fibrilles de collagènes sont espacées régulièrement et que leur diamètre moyen est de l'ordre de 14,4 ± 2,3 nm. Elle montre l'organisation particulière des matrices dans laquelle des bandes de fibrilles de collagène coupées longitudinalement alternent avec des bandes de fibrilles de collagène coupées transversalement (figure 3).
Les données de diffraction des rayons X montrent que les fibrilles présentent les harmoniques caractéristiques du collagène naturel, à savoir, une D-période de 67 nm (figure 4)
Des fîbroblastes mis en culture sur ces matrices fibrillées transparentes adhèrent et se développent bien (figure 5).
La solubilisation dans l'acide acétique 500 mM (pH 2,5) de la matrice fibrillée montre que cette dernière ne contient pas ou sinon qu'une très faible quantité de pontage intermo léculaire . EXEMPLE 2 : CONDITIONS PERMETTANT D'OBTENIR UNE MATRICE FIBRILLÉE TRANSPARENTE DE COLLAGENE
Plusieurs essais ont été réalisés selon l'exemple 1 pour tester les effets de la force ionique, de la température, du pH pour un PEG de 35 kDa. Les résultats sont donnés dans le tableau de la figure 6.
En l'absence de NaCl, les solutions de collagène sont transparentes à tous les pH testés au bout d'une heure de fibrillogenèse. Elles mûrissent pendant la période de fibrillogenèse pour donner un gel transparent (3 jours) puis une matrice transparente fîbrillée au bout de 20 à 30 jours de mûrissement.
A pH 5, en présence de 150 mM de NaCl, les solutions de collagènes sont transparentes après une heure de fibrillogenèse et deviennent successivement gel translucide (3 jours) et matrice fîbrillée translucide (1 mois). A des pH supérieurs, les solutions de collagène deviennent des gels translucides lâches puis denses (pH 6, 3 jours et 1 mois respectivement) ou des gels opaques puis des matrices fibrillées opaques (pH > 7,4 et temps de mûrissement > 3 jours). Les matrices restent stables ensuite.
En présence de 300 mM de NaCl, les solutions de collagène deviennent au bout d' 1 heure : un gel transparent (pH 5) ou un gel opaque (pH > 6) et deviennent ensuite des matrices translucides ou opaques et fibrillées après 3 jours de fibrillogenèse qui restent stables par la suite.
Ainsi à pH élevé et/ou à fortes concentrations en NaCl, le processus de fibrillogenèse est accéléré et favorise la croissance latérale des fibrilles.
Des matrices transparentes stables ont également été obtenues à partir de solution de collagène à 45-60mg/ml mises en contact avec de l'eau à pH 5 pendant une heure afin d'effectuer un échange de solvant. Lors de cette échange, il y a dilution de la solution initiale (par exemple une solution initiale à 60mg/ml en collagène passe approximativement à 40mg/ml de collagène). Après une heure d'échange du milieu, l'échantillon est retiré de l'eau puis laissé mûrir en atmosphère hydraté à 20° dans une enceinte fermée (pour les petits échantillons tube Ependorf®). Au bout d'un mois des matrices transparentes ayant les caractéristiques attendues sont obtenues.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une matrice de collagène pur fibrillé comprenant une étape de fîbrillogenèse d'un collagène de type I, éventuellement associé à d'autres types de collagènes, en phase cristalline liquide ou non, ladite étape étant réalisée dans un milieu aqueux, à un pH compris entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5 en l'absence de tampon et d'agent réticulant, sans l'aide d'une matrice de guidage interne pour orienter les fibrilles lors de la fîbrillogenèse et sans application d'une tension à l'extrémité des fibrilles.
2. Procédé de préparation selon la revendication 1 caractérisé en ce que la concentration de la solution de collagène avant fîbrillogenèse est comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml et à un pH compris entre 2,5 et 3.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2 caractérisé en ce que la température est comprise entre 15 et 30 °C, avantageusement entre 20 °C et 25 °C.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la fîbrillogenèse est réalisée par dialyse en présence d'un polymère, avantageusement en présence de polyéthylène glycol.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml,
b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml, c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthylèneglycol de 35 kDa à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5.
6. Procédé de préparation d'une matrice transparente caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'une solution acide de collagène pur dans un solvant aqueux à une concentration en collagène comprise entre 0,1 et 5 mg/ml, avantageusement entre 0,2 et 1 mg/ml,
b) concentration jusqu'à une concentration en collagène comprise entre 10 et 200 mg/ml, avantageusement entre 10 et 90 mg/ml, encore plus avantageusement entre 30 et 80 mg/ml,
c) formation des fibrilles par dialyse contre du polyéthylèneglycol de 35 kDa à 60 % à pH entre 3,5 et 12, avantageusement compris entre 3,5 et 5,5.
d) mûrissement pendant 3 semaines à 2 mois jusqu'à obtention d'une matrice transparente.
7. Matrice transparente susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce qu'elle est stable, que le diamètre moyen des fibrilles est avantageusement compris entre 10 et 25 nm, encore plus avantageusement entre 14 et 20 nm et que la période D est de 67 nm.
8. Utilisation d'une matrice transparente selon la revendication 7 pour la fabrication d'un tissu ou d'un organe artificiel, notamment d'un substitut de cornée.
9. Substitut de cornée préparé à partir d'une matrice transparente selon la revendication 7.
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