EP3247226A1 - Nouvelle souche de lactobacillus plantarum - Google Patents

Nouvelle souche de lactobacillus plantarum

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Publication number
EP3247226A1
EP3247226A1 EP15823683.6A EP15823683A EP3247226A1 EP 3247226 A1 EP3247226 A1 EP 3247226A1 EP 15823683 A EP15823683 A EP 15823683A EP 3247226 A1 EP3247226 A1 EP 3247226A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seeds
strain
germination
seed
cooking
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15823683.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Annabelle GOYON
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SEB SA
Original Assignee
SEB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SEB SA filed Critical SEB SA
Publication of EP3247226A1 publication Critical patent/EP3247226A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the practice of germination of cereals and legumes, including rice well established in Asia has become popular in the Western world,
  • the sprouted seeds can be used in many dishes, such as salads, soups, stews, drinks and bakery products.
  • Sprouted seeds are considered to have exceptional nutritional value. It is also known that sprouted seeds such as sprouted or partially sprouted brown rice contain significant levels of gamma-amino butyric acid (GABA). GABA is a neurotransmitter of brain cells that plays a role in preventing certain diseases and stimulating the production of growth hormone.
  • GABA gamma-amino butyric acid
  • Germination can be done without sophisticated equipment.
  • the seeds are placed in water at an adequate temperature for several hours. Sprouted seeds can be stored for a few days to over a week in the refrigerator.
  • the germination begins with the imbibition of the seed and ceases as soon as the radicle has pierced the seed coat.
  • the soaking and / or preservation phases of the wet seeds may be favorable for the development of pathogenic microorganisms or alteration.
  • Bacteria such as Escherichia coli or Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Sphingomonas spp., Microbacterium spp. or filamentous fungi belonging in particular to the genus Aspergillus develop. Ingestion of such bacteria can be dangerous for your health.
  • the subject of the present invention is a new isolated strain of the genus
  • Lactobacillus is charatérisée by its capacity to develop in the medium of germination of a seed, and its capacity to limit the development of bacteria like Enterobactericaceae and more particularly E. coli or like Bacillus spp, in case of contamination of said seed during germination compared to germination without Lactobacillus.
  • the subject of the invention is an isolated strain of the genus Lactobacillus plantarum and more particularly the strain NUT-2 deposited with the CNCM on September 4, 2013 under the number CNCM 1-4799.
  • the strain of L. plantarum NUT-2 makes it possible to limit the growth of a strain of E. coli O157: 1-17.
  • the seeds are chosen in particular from the following species: legumes such as beans, lentils, peas, soybeans, Chenopodiaceae such as quinoa or cereals such as wheat, barley, corn corn or rice.
  • the development of the strain according to the invention is characterized by an increase in the number of bacteria over time.
  • This development or bacterial growth can be measured in various ways well known to those skilled in the art. Non-exhaustive examples include dry biomass measurement, counting of cells using the Thoma cell, turbidimetry, solid-state counting (incubation, incubation and enumeration), or measurement of the cellular activity (eg, consumption of a subtrate or a cellular component).
  • the limitation of the development or growth of bacteria in particular E. coli, Enterobactericaceae, and / or Bacillus spp., Is defined by comparing the number of bacteria present in the medium at the end of the germination under conditions identical experimental except for the presence of the strain of the invention, and more particularly of the NUT2 strain.
  • the limitation is here defined at the end of the germination by a reduction in the number of bacteria of at least 0.5 log, preferably 1 log in the presence of the strain of the invention, and more particularly of the NUT2 strain. relative to the number of bacteria measured in the absence of the strain of the invention and more particularly of the strain NUT2.
  • the present invention also relates to a composition comprising a strain according to the invention.
  • the strain like the composition, according to the invention can be used in germination processes.
  • Such a method comprises bringing into contact with the strain or a composition according to the invention, germination medium and seeds.
  • the germination process comprises a first step of dipping the seeds in a dipping medium in the presence of the strain according to the invention at a temperature and for a duration adapted to the nature of the seed. This step can be done in the dark.
  • the first dipping step is made in the presence of the NUT-2 strain deposited with the CNCM on September 4, 2013 under the number CNCM 1-4799 - or a composition comprising said strain.
  • the dipping medium is defined by those skilled in the art depending on the type of seed. It is most often constituted by water.
  • the first stage takes place in room temperature water for 16 hours.
  • the soaking step comprises an activation step during which the germination medium comprising the strain and the seeds is placed at a temperature of between about 35 ° C. and about 40 ° C. for a period of time. a duration of between about two and about four hours.
  • the temperature can vary between 30 ° C and 45 ° C.
  • the duration of this activation step can be between 1:30 and 4:30. This increase in temperature reduces the total soaking time by 6 hours.
  • brown rice can be made by dipping rice grains in water at about 30 ° C-40 ° C, preferably 32 ° C, for a period of time between 2 and 4 hours.
  • a second step, or germination step the soaking medium is removed and the wet seeds are placed in a container which is optionally placed away from light.
  • the seeds are rinsed with water several times during this second stage, the duration of which depends on the nature of the seeds. It is generally between 4 and 48h (about 4 to 8h for quinoa, 16h for rice or 48h for mung bean).
  • the number of rinses is adapted according to the type of seed, it is generally between 1 and 10 rinses, preferably from 1 to 5 rinses.
  • Rinsing is usually done with water.
  • the appearance of the radicle through the seed coat indicates the end of the germination process. This can however be continued according to the wishes of the user, for example until obtaining young shoots.
  • Such a germination process is suitable for all types of seeds and in particular seeds selected from the following species: legumes such as beans, lentils, peas, soybean, chenopodiaceae such as quinoa or cereals such as wheat , barley, corn or rice.
  • the seed germination process can be carried out directly in a seed baking device (or cooker as described for example in the patent application WO2012 / 056171).
  • the cooker may also comprise a germination accessory comprising a removable basket (such as that described in the patent application WO2012 / 056171.
  • the seeds are placed directly in an accessory of the cooker and the accessory placed in the tank of the cooker with water and in the presence of the strain according to the invention during the step of soaking.
  • the wet seeds are left or not in the accessory with or without light for a period of time adapted to the seed that is germinated, ie from 4 to 48 hours and more particularly 30 hours, in particular 32 hours. From time to time, the seeds are washed. When seed germs are visible to the naked eye, a final rinse of the seeds is done. They are then poured into the bowl of the cooker. The water level is adjusted and the bean sprouting stage is started. Cooking is very fast since soaking has already softened the seeds. For germinated rice, the cooking is done at a temperature of the order of 100 ° C.
  • Such a method of preparation makes it possible to obtain a preparation containing much more GABA in the sprouted rice thus cooked (up to 10 times more GABA compared to a normal non-sprouted brown rice).
  • the subject of the invention is a process for cooking seeds comprising the following steps: a step of germination of the seeds as described above and a step of cooking the sprouted seeds obtained in the previous step .
  • the cooking process comprises the following steps: the step of dipping the seeds is carried out in the presence of the strain or the composition according to the invention in a dipping medium at a temperature and during a duration adapted to the nature of the seed,
  • the moist seeds are preferably left out of the light and are regularly rinsed until the appearance of the radicle through the seeds of the seed, - The sprouts obtained previous step are cooked.
  • the soaking step comprises an activation step as described above.
  • At least one step or all the steps of the cooking process is carried out in a cooking device.
  • a cooking device is described in the patent application WO 2012/056171.
  • the process comprises the following steps: the brown rice grains are placed directly in an accessory of the cooking device with water.
  • the isolated strain of the genus Lactobacillus according to the invention is added and mixed with the grains.
  • the accessory is placed back in the tank of the device.
  • This soaking step is carried out at room temperature for 16 hours, after removing water from the container, the wet grains can be left in the accessory in the dark or outside the cooking device for a period of 24 hours at 48h in particular 32h, the grains are washed several times with water, -
  • the seeds are washed one last time with water and and are placed in the tank of the device, the water level is adjusted and ⁇ cooking step is started.
  • Cooking is very fast since soaking has already softened the rice.
  • the cooking is at a temperature of about 100 ° C (between 90 ° C and 110 ° C).
  • the temperature is more precisely between 101 ° C and 108 ° C. At this temperature the nutrients that have multiplied during the seed germination phase are preserved.
  • Fifiure 1 Bio-Preservation Capacity (Impact of inoculation of the L. plantarum NUT-2 strain at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of Koshihikari rice on the total flora, enterobacteria and Bacillus sp after 16 hours of germination).
  • Fifiure 2 Bio-Preservation Capacity (Impact of NUT-2 at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of Chu Cheong rice on total flora, Enterobacteria and Bacillus sp.).
  • Fifiure 3 Impact of the presence of L. plantarum NUT2 at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of rice of the Koshihikari variety following contamination with E. coli O157H7 (10 2 CFU / g of rice ).
  • Fifiure 4 Impact of the presence of L. plantarum NUT2 at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of rice of the Chu Cheong variety following contamination with E. coli O157H7 (10 2 CFU / g of rice).
  • Fifiure 5 Impact of the presence of L. plantarum NUT2 at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of rice of the Koshihikari variety following contamination with E. coli O157H7 (10 1 CFU / g of rice ).
  • Fifiure 6 Impact of the presence of L. plantarum NUT2 at concentrations of 10 5 , 10 6 or 10 7 CFU / g of rice of the Chu Cheong variety following contamination with E. coli O157H7 (10 1 CFU / g of rice).
  • the strain of Lactobacillus plantarum NUT-2 was isolated from the Japanese rice NIPPON BARE paddy.
  • This strain was carried out after enriching the rice in MRS broth (Man, Rogosa and Sharpe) at 35 ° C. ⁇ 2 ° C. for 24 hours under aerobic conditions and isolated on LPSM medium (L. plantarum Selective Medium). at 35 ° C ⁇ 2 ° C for 16 to 24 hours under anaerobic conditions (AnaeroGen system, Oxoid). This strain was then stored at -80 ° C. in glycerolated stocks.
  • this strain was isolated on MRS medium agar supplemented with L-cysteine (0.05% w / v). Petri dishes were incubated at 35 ° C ⁇ 2 ° C for 16 to 24 hours under anaerobic conditions (AnaeroGen system, Oxoid).
  • Etest ® strips were then applied to the agar according to the supplier's recommendations (6 strips per box). After incubation at 35 ° C ⁇ 2 ° C for 24-48 hours, symmetrical inhibition ellipses were observed.
  • CM! was read directly from the scale and expressed in ng / mL at the point where the inhibition ellipse crosses the strip. In the case where the point of intersection of the inhibition ellipse and the strip was located between two graduations, the highest concentration was selected as CM!
  • test readings were therefore performed after 24 hours of growth.
  • Table 2 Interpretation of the results obtained in the determination of Minimal Inhibitory Concentrations (MIC) by the Etest ® method of the L. plantarum NUT-2 strain. The results were interpreted according to the criteria defined by EFSA for L plantarum / L pentosus (The EFSA Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012), 10 (6): 2740).
  • MIC Minimal Inhibitory Concentrations
  • Vancomycin (VA)> 256 Resistant The strain of Lactobacillus plantarum NUT-2 appeared to be sensitive to erythromycin, gentamicin, kanamycin, qinupristin / dalfopristin and streptomycin.
  • Lactobacillus plantarum NUT-2 The strain of Lactobacillus plantarum NUT-2 is resistant to ampicillin, chloramphenicol, clindamycin, tetracycline and vancomycin. like Lactobacillus strains.
  • Example 5 The biopreservation capacity of NUT-2 (impact on the total flora, Enterobacteria and Bacillus spp.) was tested at different concentrations on two rice varieties (Koshihikari and Chu Cheong).
  • Table 4 Decreased development of Enterobacteriaceae and Bacillus sp. depending on the amount of L. plantarum NUT-2
  • Example 6 Impact of the Presence of L. plantarum NUT-2 following contamination with E. coli strain 0157H7 (10 1 and 10 2 CFU / g of rice) tested on two rice varieties (Koshihikari and Chu Cheong).

Landscapes

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Abstract

La présente invention a pour objet une souche isolée du genre Lactobacillus charatérisée par sa capacité à se développer dans le milieu de germination d'une graine, et à limiter le développement de bactéries comme les Enterobactericaceae,et plus particulièrement E. coli,ou comme Bacillus spp,en cas de contamination de ladite graine lors de sa germination comparativement à une germination sans Lactobacillus.

Description

Nouvelle souche de Lactobacillus plantarum
La pratique de la germination des céréales et légumineuses et notamment du riz bien établie en Asie est devenue populaire dans le monde occidental, Les graines ainsi germées peuvent être utilisées dans de nombreux plats, comme les salades, les soupes, les ragoûts, les boissons et les produits de boulangerie.
Les graines germées sont considérées comme ayant une valeur nutritive exceptionnelle. Il est également connu que les graines germées comme le riz brun germé ou partiellement germé contiennent des teneurs importantes en acide gamma- amino butyrique (GABA). Le GABA est un neurotransmetteur des cellules du cerveau qui joue un rôle dans la prévention de certaines maladies et la stimulation de la production de l'hormone de croissance.
La germination peut se faire sans équipement sophistiqué. Les graines sont placées dans de l'eau à une température adéquate pendant plusieurs heures. Les graines germées peuvent être conservées pendant quelques jours à plus d'une semaine au réfrigérateur.
La germination débute avec l'imbibition de la graine et cesse dès que la radicule a percé les téguments de la graine.
Durant la germination, les phases de trempage et/ou de conservation des graines humides peuvent être favorables au développement de microorganismes pathogènes ou d'altération. Il est fréquent que des bactéries comme des conformes tels que Escherichia coli ou Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp., Sphingomonas spp., Microbacterium spp. ou des champignons filamenteux appartenant notamment au genre Aspergillus se développent. L'ingestion de telles bactéries peut s'avérer dangereuse pour la santé. La présente invention a pour objet une nouvelle souche isolée du genre
Lactobacillus charatérisée par sa capacité à se développer dans le milieu de germination d'une graine, et sa capacité à limiter le développement de bactéries comme les Enterobactericaceae et plus particulièrement E. coli ou comme Bacillus spp, en cas de contamination de ladite graine lors de sa germination comparativement à une germination sans Lactobacillus. Selon un mode particulier, l'invention a pour objet une souche isolée de du genre Lactobacillus plantarum et plus particulièrement la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799.
Dans une mise en œuvre particulière de l'invention, la souche de L. plantarum NUT-2 permet de limiter la croissance d'une souche d' E. coli 0157:1-17.
Dans le cadre de la présente invention, les graines sont choisies notamment parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les Chénopodiacées comme le quinoa ou les céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.
Le développement de la souche selon l'invention se caractérise par une augmentation du nombre de bactéries au cours du temps. Ce développement ou croissance bactérienne peut être mesuré de différentes façons bien connues de l'homme du métier. On peut citer de manière non exhaustive : la mesure de la biomasse sèche, le dénombrement des cellules par utilisation de la cellule de Thoma, par turbidimétrie, par comptage sur milieu solide (ensemensement, incubation et dénombrement), ou encore par mesure de l'activité cellulaire (par exemple : consommation d'un subtrat ou d'un constituant cellulaire).
La limitation du développement ou de la croissance des bactéries et notamment d'E.coli, d'Enterobactericaceae, et/ou de Bacillus spp est définie en comparant le nombre de bactéries présentes dans le milieu à l'issue de la germination dans des conditions expérimentales identiques à l'exception de la présence de la souche de l'invention, et plus particulièrement de la souche NUT2. La limitation est ici définie à l'issue de la germination par une réduction du nombre de bactéries d'au moins 0,5 log, de préférence de 1 log en présence de la souche de l'invention, et plus particulièrement de la souche NUT2 par rapport au nombre de bactéries mesuré en absence de la souche de l'invention et plus particulièrement de la souche NUT2.
La présente invention a également pour objet une composition comprenant une souche selon l'invention.
La souche, comme la composition, selon l'invention peuvent être utilisée dans des procédés de germination. Un tel procédé comprend la mise en présence de la souche ou d'une composition selon l'invention, du milieu de germination et des graines. Le procédé de germination comporte une première étape de trempage des graines dans un milieu de trempage en présence de la souche selon l'invention à une température et pendant une durée adaptées à la la nature de la graine. Cette étape peut être effectuée dans l'obscurité. Dans une mise en œuvre particulière la première étape de trempage est faite en présence de la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799 - ou d'une composition comprenant ladite souche. Celle-ci est présente dans une quantité de bactéries comprenant entre 105 à 109 UFC/g de graine, de préférence 107 UFC/g de graine. Le milieu de trempage est défini par l'homme du métier en fonction du type de graine. Il est le plus souvent constitué par de l'eau.
S'agissant du riz brun, la première étape se déroule dans de l'eau à température ambiante pendant 16 heures.
Dans une mise en œuvre particulière du procède de germination l'étape de trempage comprend une étape d'activation durant laquelle le milieu de germination comprenant la souche et les graines est placé à une température comprise entre environ 35°C et envrion 40°C pendant une durée comprise entre environ deux et environ quatre heures. La température peut varier entre 30°C et 45°C. La durée de cette étape d'activation peut être comprise entre lh30 et 4h30. Cette augmentation température permet de réduire le temps total de trempage de 6 heures.
Par exemple l'étape d'activation, du riz brun peut être faite par trempage des grains de riz dans de l'eau à environ 30°C-40°C , de préférence 32°C, pendant une durée comprise entre 2 et 4 heures. Dans une seconde étape, ou étape de germination (proprement dite), le milieu de trempage est enlevé et les graines humides sont placées dans un récipient lequel est éventuellement placé à l'abri de la lumière. Les graines sont rincées à l'eau à plusieurs reprises durant cette seconde étape dont la durée dépend de la nature des graines. Elle est généralement comprise entre 4 et 48h (de l'ordre de 4 à 8h pour le quinoa, 16h pour le riz ou encore 48h pour le haricot mungo). Le nombre de rinçage est adapté en fonction du type de graine, il est généralement compris entre 1 et 10 rinçages, de préférence de 1 à 5 rinçages.
Le rinçage est habituellement fait avec de l'eau.
L'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine indique la fin du procédé de germination. Celui-ci peut cependant être poursuivi en fonction des souhaits de l'utilisateur par exemple jusqu'à l'obtention de jeunes pousses.
Un tel procédé de germination s'adapte à tous les types de graines et notamment les graines choisies parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les chénopodiacées comme le quinoa ou les céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.
Pour une cuisson ultérieure des graines, le procédé de germination des graines peut être effectué directement dans un dispositif de cuisson des graines (ou cuiseur tel que décrit par exemple dans la demande de brevet WO2012/056171). Ainsi, le cuiseur peut comprendre également un accessoire de germination comprenant un panier amovible (comme celui décrit dans la demande de brevet WO2012/056171.
Dans cette mise en œuvre de l'invention, les graines sont placées directement dans un accessoire du cuiseur et l'accessoire placé dans la cuve du cuiseur avec de l'eau et en présence de la souche selon l'invention durant l'étape de trempage.
Puis après avoir enlevé l'eau de la cuve, les graines humides sont laissées ou non dans l'accessoire à l'abri ou non de la lumière pendant une durée adaptée à la graine que l'on fait germer, soit de 4 à 48h et plus particulièrement 30 heures, en particulier 32 heures. De temps en temps, les graines sont lavées. Lorsque les germes des graines sont visibles à l'œil nu, un dernier rinçage des graines est effectué. Elles sont ensuite versées dans la cuve du cuiseur. Le niveau d'eau est ajusté et l'étape de cuisson des graines germées est lancée. La cuisson est très rapide puisque le trempage a déjà fortement ramolli les graines. Pour le riz germé, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100°C
(comprise entre 90 et 110°C), plus précisément entre 101 °C et 108°C. A cette température les nutriments qui se sont multipliés pendant la phase de germination des grains sont préservés.
Un tel mode de préparation permet l'obtention d'une préparation contenant beaucoup plus de GABA dans le riz germé ainsi cuit (jusqu'à 10 fois plus de GABA par rapport à un riz brun normal non germé).
Ainsi, selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de cuisson de graines comprenant les étapes suivantes : une étape de germination des graines tels que décrit ci-dessus et une étape de cuisson des graines germées obtenue à l'étape précédente.
Ainsi, dans une mise en ouvre particulière, le procédé de cuisson comprend les étapes suivantes : l'étape de trempage des graines est réalisée en présence de la souche ou de la composition selon l'invention dans un milieu de trempage à une température et pendant une durée adaptée à la nature de la graine,
Lors de l'étape de germination, les graines humides sont laissées de préférence à l'abri de la lumière et sont régulièrement rincées jusqu'à l'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine, - Les graines germées obtenues à l'étape précédente sont mises à cuire.
Dans une mise en œuvre du procédé de cuisson décrit ci-dessus, l'étape de trempage comprend une étape d'activation telle que décrite plus haut.
Dans une mise en œuvre particulière, au moins une étape ou l'ensemble des étapes du procédé de cuisson est effectué dans un dispositif de cuisson. Un exemple de dispositif de cuisson est décrite dans la demande de brevet WO 2012/056171.
Ainsi, s'agissant du riz brun, le procédé comprend les étapes suivantes : les grains de riz brun sont placés directement dans un accessoire du dispositif de cuisson avec de l'eau. La souche isolée du genre Lactobacillus selon l'invention est ajoutée et mélangée aux grains. L' accessoire est replacé dans la cuve du dispositif . Cette étape de trempage est effectuée à température ambiante pendant 16h, après avoir enlevé l'eau du récipient, les grains humides peuvent être laissées dans l'accessoire à l'abri de la lumière ou en dehors du dispositif de cuisson pour une durée de 24h à 48h en particulier 32h , les grains sont lavées à plusieurs reprises avec de l'eau, - Lorsque les radicules sont visibles à l'oeil nu, les graine sont lavés une dernière fois à l'eau et et sont placées dans la cuve du dispositif, le niveau d'eau est ajusté et Γ étape de cuisson est lancée.
La cuisson est très rapide puisque le trempage a déjà fortement ramolli le riz. De plus, la cuisson se fait à une température de l'ordre de 100°C (comprise entre 90°c et 110°C). Dans un mode de réalisation, la tempétature est plus précisément entre 101°C et 108°C. A cette température les nutriments qui se sont multipliés pendant la phase de germination des grains sont préservés.
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples et les figures suivants.
Fifiure 1 : Capacité de bio-préservation (Impact de l'inoculation de la souche de L. plantarum NUT-2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Koshihikari sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus sp. après 16 heures de germination).
Fifiure 2 : Capacité de bio-préservation (Impact de NUT-2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus sp.). Fifiure 3 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination par E. coli O157H7 (102 UFC/g de riz). Fifiure 4 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par E. coli O157H7 (102 UFC/g de riz).
Fifiure 5 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Koshihikari suite à une contamination par E. coli O157H7 (101 UFC/g de riz).
Fifiure 6 : Impact de la présence de L. plantarum NUT2 à des concentrations de 105, 106 ou 107 UFC/g de riz de la variété Chu Cheong suite à une contamination par E. coli O157H7 (101 UFC/g de riz).
Exemple 1 : isolement de la souche NUT-2
La souche de Lactobacillus plantarum NUT-2 a été isolée à partir du riz japonais NIPPON BARE paddy.
L'isolement de cette souche a été réalisé après enrichissement du riz dans du bouillon MRS (Man, Rogosa et Sharpe) à 35°C ± 2°C pendant 24 heures en aérobiose et isolement sur du milieu LPSM (L. plantarum Sélective Médium) à 35°C ± 2°C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système AnaeroGen, Oxoid). Cette souche a ensuite été conservée à - 80°C dans des stocks glycérolés.
Pour les besoin de l'étude cette souche a été isolée sur du milieu MRS gélosé supplémenté en L-cystéine (0,05 % m/v). Les boites de Pétri ont été incubées à 35°C ± 2°C pendant 16 à 24 heures en anaérobiose (système AnaeroGen, Oxoid).
Exemple 2 : caractérisation de la souche NUT-2 (détermination de la Concentration Minimal Inhibitrice par la méthode de diffusion ETEST (Biomérieux)
La détermination de la plus petite concentration en antibiotique nécessaire pour inhiber la croissance de la bactérie (Concentration Minimale Inhibitrice ou CMI) a été réalisée sur milieu gélosé à l'aide du système Etest®. Ce système repose sur l'utilisation d'une bandelette imprégnée de quantités croissantes d'antibiotique. Dix antibiotiques ont été testés avec cette méthode, les concentrations minimales et maximales varient selon les antibiotiques (Tableau 1). Ces antibiotiques ont été sélectionnés en accord avec les recommandations de l'EFSA (« Update of the criteria used in the assessment of bacterial résistance to antibiotics of human or veterinary importance » - The EFSA Journal (2008) 732, 1-15).
Tableau 1 : Bandelettes Etest® (BioMérieux) utilisées pour la détermination de la CMI.
A partir de colonies isolées sur milieu MRS gélosé supplémenté en L- cystéine (0,05 % m/v), un inoculum a été préparé dans de l'eau physiologique (NaCI 0,85 % - lot 130703) à une densité d'environ 0,5 sur l'échelle de MacFariand. Des boites de Pétri de 140 mm contenant de la gélose Mueiler-Hinton (BioMérieux - n° lot 1002307830 Exp 20130724) ont été ensemencées par inondation avec l'inoculum préparé.
Les bandelettes Etest® ont ensuite été appliquées sur la gélose selon les recommandations du fournisseur (6 bandelettes par boites). Après incubation à 35°C ± 2°C pendant 24 à 48 heures, des ellipses d'inhibition symétriques ont été observées.
La CM! a été lue directement à partir de l'échelle de graduation et exprimée en ng/mL au point où l'ellipse d'inhibition croise la bandelette. Dans le cas où le point d'intersection de l'ellipse d'inhibition et de la bandelette était situé entre deux graduations, la concentration la plus importante a été retenue comme CM!,
Exemple 3 : résultats obtenus avec la souche L plantarum NUT-2
Trois essais indépendants ont été réalisés pour la détermination de la CMI sur les 10 antibiotiques testés. Les lectures des tests ont donc été réalisées après 24 heures de croissance.
Les résultats obtenus, avec la souche de LactobaciiÎus plantarum NUT-2, pour les antibiotiques testés, sont indiqués dans le Tableau 2. L'interprétation des résultats a été réalisée à l'aide des tables fournies avec les bandelettes Etest® (version 16029 B - 2011/01) et des valeurs seuils définies par l'EFSA (Européen Food Safety Autority - Technical guidance- Update of the criteria used in the assessment of bacteriai résistance to antibiotics of human or veterinary importance - Prépare by the Panel on Additives and Products or Substances used in Anima! Feed - The EFSA Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012);10(6):2740).
Tableau 2 : Interprétation des résultats obtenus lors de la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) par la méthode Etest® de la souche de L. plantarum NUT-2. Les résultats ont été interprétés selon les critères définis par i'EFSA pour L plantarum / L pentosus (The EFSA Journal (2008) 732, 1-15 and the EFSA Journal (2012);10(6):2740)
Antibiotique C I (mg/rnL) Interprétation
Ampici!line (AM) 4,0 Résistante
Chioramphénicol (CL) 12,0 Résistante
Ciindamycine (CM) 4,0 Résistante
Erythromycine (EM) 0,38 Sensible
Gentamycine (GM) 16,0 Sensible
Kanamycine (KM) 32,0 Sensible
Qinupristine / dalfopristine 1,0 Sensible
(QDA)
Streptomycine (SM) 128,0 Sensible
Tétracycline (TC) 192,0 Résistante
Vancomycine (VA) >256 Résistante La souche de LactobaciHus plantarum NUT-2 est apparue comme étant sensible à l'érythromycine, à la gentamicine, à la kanamycine, à la qinupristine / dalfopristine et à la streptomycine.
La souche de LactobaciHus plantarum NUT-2 est résistante à l'ampicilline, le chloramphénicol, la clindamycine, la tétracycline et à la vancomycine,. comme les souches de LactobaciHus.
Exemple 4 : caracténsation moléculaire de la souche NUT-2
A partir de colonies isolées, des extractions d'ADN sont réalisées afin de confirmer l'identification de la souche. Une réaction d'amplification par PCR avec des amorces universelles est effectuée sur l'ADN extrait afin d'amplifier la totalité de l'ADN 16S. Cette région de l'ADN est très conservée et la séquence permet de distinguer les différentes espèces bactériennes. Le produit d'amplification obtenu a ensuite été séquencé. La comparaison de la séquence obtenue avec les séquences disponibles dans les banques de données permet d'identifier le genre et l'espèce bactérienne. Les alignements de séquences réalisés dans les bases de données ont permis de démontrer que la souche NUT-2 présente une homologie de 99 % avec l'espèce bactérienne LactobaciHus plantarum. Les résultats de ces alignements de séquence sont indiqués dans le Tableau 3. Tableau 3 : Résultats des alignements de séquence réalisés à partir de la séquence de la souche de bactérie lactique NUT-2. Les souches dont les séquences présentaient les plus fortes homologies avec la séquence de l'échantillon figurent dans le tableau. Les 10 séquences ayant les plus fortes homologies sur un total de 100 séquences ont été retenues. La base de données comportait plus de 1500 séquences d'espèces différentes.
Rang Espèce Séq. Réf. % identité
bactérienne
1 L. plantarum KF149794.1 99,00
2 L. plantarum KF149725.1 99,00
3 L. plantarum KF149647.1 99,00 4 L. plantarum KF149066.1 99,00
5 L. plantarum KF148981.1 99,00
6 L. plantarum KC836733.1 99,00
7 L. plantarum KC836684.1 99,00
8 L. plantarum KC836660.1 99,00
9 L. plantarum KC836659.1 99,00
10 L. plantarum KC836641.1 99,00
L'analyse de la séquence codant pour la totalité de l'ADN 16S a permis d'identifier la souche NUT2 au niveau de l'espèce et de confirmer son appartenance à l'espèce Lactobacillus plantarum.
Exemple 5 : La capacité de biopréservation de NUT-2 (impact sur la flore totale, les Entérobactéries et les Bacillus spp.) a été testée à différentes concentrations sur deux variétés de riz (Koshihikari et Chu Cheong).
Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile (protocole Centre Sensoriel du Goût et de l'Alimentation CSGA). Le riz est ensuite placé dans des flacons avec 20 ml d'eau et 105, 106 ou 107 UFC/g de NUT-2 ont été ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle est constitué de 10 g de riz dans 20 ml d'eau. Les flacons sont placés dans l'obscurité à 30°C pendant 16h. NUT-2, les Entérobactéries et les Bacillus spp et les germes totaux sont dénombrés par dilution et étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les figures 1 et 2. Les résultats montrent une persistance et même une croissance de L. plantarum NUT-2 au cours de la germination et la réduction de la population d'entérobactéries et de Bacillus spp (Tableau 4).
Tableau 4 : diminution du développement d'entérobactéries et de Bacillus sp. en fonction de la quantité de L. plantarum NUT-2
Taux Réduction logarithmique (log riz non inoculé - log riz inoculé) inoculation
Koshihikari Chu Cheong
Entérobactéries Bacillus sp. Entérobactéries Bacillus sp. 10E5 0,8 1,4 2,2 2,4
10E6 3,0 4,3 3,2 > 6,8
10E7 > 6,6 > 5,7 > 6,8 > 6,8
Exemple 6 : impact de la présence de L. plantarum NUT-2 suite à une contamination par la souche E. coli 0157H7 (101 et 102 UFC/g de riz) testée sur deux variétés de riz (Koshihikari et Chu Cheong).
Pour chaque test 10 grammes de riz ont été nettoyés avec de l'eau stérile (protocole CSGA). Le riz est ensuite placé dans des flacons avec 20 ml d'eau et 105, 106 ou 107 UFC/g de NUT-2 ont été ajoutés dans des flacons différents. Le contrôle est constitué de 10 g de riz dans 20 ml d'eau. Les flacons sont placés dans l'obscurité à 30°C pendant 16h. NUT-2, les bactéries E. coli 0157H7 sont dénombrées par dilution et étalement à partir de chaque flacon. Les résultats sont présentés dans les figures 3 à 6.
L'inoculation du riz avec Lactobacillus plantarum NUT-2 permet d'inhiber le développement d'E. coli 0157 :H7 à partir d'une concentration de 106 UFC/g.

Claims

REVENDICATIONS
1. Souche Lactobacillus plantarum caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche NUT-2 déposée auprès de la CNCM le 4 septembre 2013 sous le numéro CNCM 1-4799.
2. Composition caractérisé en ce quelle comprend la souche de Lactobacillus selon la revendication 1.
3. Procédé de germination comprenant une étape de trempage des graines et une étape de germination desdites graines caractérisée en ce que l'étape de trempage comprend la mise en présence de la souche selon la revendication 1 ou la composition selon la revendication 2 avec lesdites graines.
4. Procédé de germination selon la revendication 3 caractérisé en la souche selon la revendication 1 ou la composition selon la revendication 2 est utilisée dans une quantité comprise entre 105 à 109 UFC/g de graine, de préférence 107 UFC/g de graine.
5. Procédé de germination selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que l'étape de trempage comprend une étape d'activation durant laquelle, le milieu de germination comprenant la souche selon la revendication 1 ou la composition selon la revendication 2 est placé à une température comprise entre environ 35°C et environ 40°C pendant une durée comprise entre environ deux heures et environ quatre heures.
6. Procédé de germination selon l'une des revendications 3 à 5 caractérisé en ce que les graines sont choisies notamment parmi les espèces suivantes : les légumineuses comme les haricots, les lentilles, les pois, le soja, les Chénopodiacées comme le quinoa ou les céréales comme le blé, l'orge, le maïs ou le riz.
7. Procédé de cuisson de graines caractérisé en ce qu'il comprend :
une étape de germination des graines mettant en œuvre un procédé selon l'une des revendications 3 à 6 et Une étape de cuisson des graines germées obtenue à l'étape précédente.
8. Procédé de cuisson de graines selon la revendication 7 dans lequel - l'étape de trempage des graines est réalisée en présence de la souche selon la revendication 1 ou la composition selon la revendication 2 dans un milieu de trempage à une température et pendant une durée adaptée à la nature de la graine,
Lors de l'étape de germination, les graines humides sont laissées de préférence à l'abri de la lumière et sont régulièrement rincées jusqu'à l'apparition de la radicule au travers des téguments de la graine, Les graines germées obtenues à l'étape précédente sont mises à cuire.
9. Procédé de cuisson selon la revendication 8 dans lequel l'étape de trempage comprend une étape d'activation selon la revendication 5.
10. Procédé de cuisson selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel au moins une des étapes est réalisée dans un cuiseur.
11. Procédé de cuisson selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel toutes les étapes sont réalisées dans un cuiseur.
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