EP3177710A1 - 3d-zellkultursystem, dessen herstellung und verwendung - Google Patents

3d-zellkultursystem, dessen herstellung und verwendung

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EP3177710A1
EP3177710A1 EP15745401.8A EP15745401A EP3177710A1 EP 3177710 A1 EP3177710 A1 EP 3177710A1 EP 15745401 A EP15745401 A EP 15745401A EP 3177710 A1 EP3177710 A1 EP 3177710A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
cell culture
cell
cryogel
pegda
culture system
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15745401.8A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Friederike GRUHL
Bettina GÖPPERT
Andrew CATO
Antje NEEB
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
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Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut fuer Technologie KIT filed Critical Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Publication of EP3177710A1 publication Critical patent/EP3177710A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties

Definitions

  • the present invention relates to a 3D cell culture system, its production and use for prostate cancer research and the study of potential therapeutics for the treatment of prostate cancer.
  • tissue samples e.g. in the case of prostate cancer by prostatectomy. They offer the advantage of absolute patient proximity and reflect the snapshot of the in vivo situation. These are used as fresh tissue or formalin-fixed, paraffin-embedded material for analysis. However, these tissue samples can not be used for functional studies.
  • ECM extracellular matrix
  • Matrigel also known as Matrigel, is a gelatinous protein mixture which has been used in cell culture for about 30 years. In this mixture are components of the basement membrane, such as laminin, collagen type IV and entactin. On or within the gel, the cells combine and form structures very close to those in vivo. Because of Matrigele find use for studies of cell differentiation, angiogenesis and tumor wax ⁇ tum. However, residues of growth factors or unquantified or partially unknown substances contained in Matrigel, as well as their batch-to-batch fluctuations, make comparability with other studies difficult. Furthermore, Matrigel has an e-modulus of only about 500 Pa, which is well below the modulus of most tumor tissue (4- 130 kPa). For prostate cancer: 65-126 kPa
  • Hydrogels (Holliday, DL et al. Breast Cancer Res 11 (2009), Cunliffe, D. et 'al. Eur J Polym 40, 5-25 (2004), Chen, R. et al. Biomaterials 30, 1954-1961 ( 2009), Villanueva, I. et al., Acta Biomat 5, 2832-2846 (2009), Chevalier, E. et al., J., Ph., 97, 1135-54 (2008)), Hwang Y. et al. "Polyethylene glycol”: "Cryogels as a potential cell scaffolds: effect of polymerization conditions on cryogel microstrueture and properties", J. Mater. Chem., 2010, 20, pp. 345,351, US Pat.
  • Hydrogels of natural components such as collagens, hyaluronates, alginates, agarose and chitosans, provide the cells with a biological environment.
  • Hydrogels a'us synthetic polymers for example polyvinyl caprolactam (PVC1) or Polyethylenglykcol- d 'iacrylatPolyethylenglykcoldiacrylat (PEGDA), are mechanically resilient, but leave a smaller cell adhesion. too. For this reason, surface modification of the polymers often takes place.
  • the object was to propose a method by means of which ' 3D cell culture systems, preferably the described 3D cell culture system, can be provided.
  • This object is achieved with respect to the 3D cell culture system by the features of claim 1, with regard to the method for producing the 3D cell culture system by the features of claim 7 and to the use by the features of claims 12 and 13.
  • the dependent claims each describe advantageous embodiments of the invention.
  • a 3D cell culture system comprising a cyrogel of at least one polyethylene glycol diacrylate (PEGda). Furthermore, the object is achieved by a method for producing a 3D cell culture system from polyethylene glycol diacrylate cryograins with the following method steps. First, a precooled mixture of at least one PEGda is provided in a buffer solution. Subsequently, the addition of at least one polymerization initiator and at least one polymerization catalyst. The mixture is then frozen, yielding a PEGda cryogel.
  • PEGda polyethylene glycol diacrylate
  • cryogel refers in the following to a polymeric gel which is prepared in an aqueous medium at temperatures below 0 ° C.
  • the crystallization of the solvent water
  • cryogels are thawed, with the water in the pores melting and draining away. This will make the porous
  • Polyethylenglykcol diacrylate is one polymer having the -allbuchen empirical formula (C 3 H 3 0) - (C 2 H 4 0) n ⁇ 0- (C 3 H 3 0) with n equal to a natural number greater than or equal to 1 (1) and is described with its average molecular weight, such as PEGda575, PEGda700, PEGda6000.
  • the definition also includes the high-chain polyethylene glycol diacrylates having a molecular mass> 35,000 g / mol.
  • the average molecular weight is hereinafter defined as a molecular mass distribution parameter, wherein the molecular masses of all chain lengths present in a mixture are averaged.
  • PEGda 700 has e.g. a distribution of molecular masses of 675-725 g / mol.
  • the total porosity describes the void volume in% of a porous body.
  • the term total porosity (P) of a material refers to the ratio of the total volume to the volume of the porous body.
  • the porosity can be open, i. individual pores are interconnected (accessible to externally penetrating gases and liquids) or closed, i. the pore spaces are separated from each other.
  • the porosity of the material influences its strength, mechanical properties, volume stability, permeability, water absorption and long-term stability.
  • Mercury porosimeter analyzes enable the determination of the raw and pure density by injecting mercury into a porous substance, whereby the total porosity is calculated. that can.
  • the total porosity (P) was calculated using the ashburn formula (3).
  • dry weight refers to the weight of a body after complete drying.
  • the dry weight is the weight of a material in the dried (ie anhydrous) state.
  • the threshold rate corresponds to the capacity of a body of liquids over time.
  • Threshold potential and source potential are used equivalently.
  • the term describes the percentage swelling liquid receiving a dry material to Puffy ⁇ NEN equilibrium state (equilibrium).
  • PBS phosphate buffered saline
  • H 2 O distilled H 2 O
  • Threshold rate determined in% (4).
  • E modulus Young's modulus
  • kPa kilo-Pascal
  • the deformation behavior of the matrices is determined by tensile and shear forces by means of a tensile tester.
  • the synthesized cryogels are washed three times in distilled H 2 0 immediately after preparation and then placed on a stainless steel block attached to the tensile testing machine.
  • a stamp is moved up to a pre-force of 0.05 N to the PEGda cryogel.
  • the pressure on the PEGda cryogel is increased up to IN and a so-called stress-strain diagram is recorded.
  • this stress-strain diagram the elasticity of the measured PEGda cryogels in the elastic range (Hooke's straight line) of the diagram can be calculated.
  • polymerization initiator refers to a chemical that initiates the process of a radical polymerization reaction.
  • polymerizate catalyst refers to a chemical that is responsible for the crosslinking of acrylic groups during the free radical polymerization reaction.
  • the 3D cell culture system according to the invention has a cryogel of at least one polyethylene glycol diacrylate (PEGda).
  • PEGda polyethylene glycol diacrylate
  • the cryogel according to the invention has an amount of at least 80%, preferably at least 90%, particularly preferably 100% PEGda in the anhydrous state.
  • PEGda be used with different average molecular weights. Their total content in the cryogel is preferably at least 80%.
  • PEGda having an average molecular weight of at least 100 g / mol, preferably at least 150 g / mol, more preferably at least 400 g / mol and at most 10000 g / mol, preferably at most 1500 g / mol, particularly preferably at most 1000 g / mol used.
  • PEGda 700 and / or PEGda 575 are used.
  • cryogels of at least one PEGda and at least one further polymer preferably selected from the following list, polyhydroxyethylene methacrylate, alginate, gelatin, chitosan, collagen are used.
  • the inventive 3D cell culture system consists in one embodiment to a maximum of 10%, preferably to maxima-1 5%, particularly preferably up to 1.5% from PEGda, based on the dry weight of the PEGda-Cryogel- per total mass of the SD cell culture system, wherein the total mass of the 3D cell culture system is composed of its constituent parts. Further ingredients are at least one cell culture medium.
  • the 3D cell culture System is then loaded with cells. In one embodiment, components are added for analysis.
  • PEGda Cryogels are produced homogeneously and reproducibly. They have a high porosity of at least 50%, preferably at least 60%, more preferably at least 70%, and a maximum porosity of 90%, preferably at most 85%, particularly preferably at most 80%. Porosity is determined by mercury porosimeter analysis.
  • the continuous pore network is detected by means of micro-X-ray tomography. Due to the continuous pore network, they enable the supply of nutrients to cells growing in the cryogel, the removal of waste products, the free circulation of peptides, hormones and therapeutics to be tested.
  • the cryogels can be produced in any shape, size and number.
  • the pore size varies depending on the material and synthesis parameters between 1 and 1000 pm, preferably between 10 and 100 pm, more preferably between 50 and 80 pm. This allows a free circulation of peptides and drugs (such as hormones and therapeutics).
  • PEGda700 cryogels have an average pore size of 70 ⁇ m.
  • the pore size, pore geometry and pore distribution can be controlled by using polymers of different chain lengths. In this way, compared to the spheroidal models, a suitable level of sufficient clearance for aggregate formation can be made possible while limiting the size growth of the cell aggregates.
  • the 3D cell culture system has a threshold rate that
  • the 3D cell culture system In order to obtain a model that is as close to the in vivo as possible, the 3D cell culture system must have a modulus of elasticity in the area of the natural tissue.
  • an E-modulus of 60-130kPa determined with a Tensile testing machine, preferred. It could be shown that the PEGda700 cryogels have an E-modulus of about 77 kPa. Thus, they are within the range of elasticity of malignant prostate tissue (65-126 kPa).
  • the cryogel is prepared by a radical polymerization reaction, whereby non-covalent bonds are formed between the aryl groups of the PEGda molecules.
  • the reaction is initiated by at least one polymerization initiator which forms sulfate radicles, preferably ammonium peroxide sulfate APS (CAS number: 7727-54-0).
  • the decomposition of the polymerization initiator produces sulfate radicals which undergo electrophilic attack on carbon atoms having double bonds. This opens the double bonds in the acetyl groups of the PEGda and starts a chain reaction.
  • the at least one polymerization catalyst preferably tetramethylethylenediamine TEMED (CAS number: 110-18-9), promotes the formation of free sulfate radicals by APS, which leads to catalysis of the polymerization reaction.
  • TEMED tetramethylethylenediamine
  • cryogels are used.
  • further substances preferably with RGD sequences by previous attachment to a heterobifunctional, i. a polyethylene glycol provided with at least 2 reactive functional groups, e.g. Acrylic polyethylene glycol N-hydroxysuccinimide (ACRL-PEG-NHS).
  • a method for producing "a SD cell culture system comprising a cryogel of polyethylene glycol diacrylate are proposed.
  • the procedural ⁇ rens Colour a) a pre-cooled mixture of at least one polyethylene glycol diacrylate, and a buffer, preferably PBS + / + (Mg 2+ and Ca 2+ -containing PBS), more preferably PBS - / - (Mg 2+ - and Ca 2+ -free PBS)
  • PBS + / + Mg 2+ and Ca 2+ -containing PBS
  • PBS - / - Mg 2+ - and Ca 2+ -free PBS
  • Pre-cooling allows the synchronization of polymerization reaction and crystallization of the porogen used.
  • This mixture has a temperature of -10 to -40 ° C in one embodiment.
  • the addition of at least one polymerization initiator and at least one polymerization catalyst takes place.
  • the at least one polymerization initiator is ammonium peroxide sulfate.
  • the at least one polymerization catalyst is tetramethylethylenediamine.
  • This mixture is now frozen in process step c).
  • the mixture is frozen at a temperature of -10 to -40 ° C, preferably at -20 ° C.
  • the duration of the freezing step depends on the size of the desired cryo- gel and is finished as soon as the whole gel is frozen.
  • the gels are thawed and present as a finished product.
  • the gels are cut into slices or pieces, with a maximum thickness of 10 mm, preferably a maximum of 5 mm, more preferably a maximum of 3 mm.
  • these gels are then loaded with cells in such a way that the cells are applied on the side perpendicular to the thickness of the gel and then migrate into the gel. With a thickness greater than 10mm, complete migration of the cells can not be ensured.
  • the loadability of the gel with cells increases with decreasing money thickness, since then the nutrient supply and the penetration of the cells into the system works better.
  • the money must be minimally 0.1 mm, preferably 0.5 mm, more preferably at least 1 mm, so that a 3D cell culture system is created and the included cryogel can be processed.
  • the cryogels are subsequently washed, preferably stored with distilled water and under aseptic conditions in cell culture medium until sowing of the cells to be cultured and beyond.
  • the gels are dried after manufacture and are then placed in cell culture medium prior to loading with cells. In it, the cryogel swells up to its final size, taking up the cell culture medium and is then available as a 3D cell culture system.
  • the properties of the chosen PEGda polymer and the method of preparation of the cryogel result in a highly porous structure whose surface area, pore size and connectivity are ideal for the three-dimensional cultivation of cells. Both in growth behavior and in the mode of formation of the cell-cell contacts, the 3D culture in the PEGda cryogel is more similar the tumor as the cells in the 2D culture in the Petri dish or spheroid models with unrestrained spheroid growth. Due to the size of the pores of the selected PEGda polymer of the cryogel, the size of tumor spheroids cultured therein can be limited to a maximum size in PEGda575 cryogels having a maximum size of 370 ⁇ to a deviation of 15%, as shown in FIG. 1 A) and / or B). This avoids that the spheroids reach a diameter that is unfavorable for optimal supply of the cells by permeation of nutrients or active substances inside the spheroids and causes unwanted tent processes such as necrosis
  • Permeation is the process by which a substance (permeate) penetrates or passes through a solid, in this case cell and / or cellular aggregate (spheroid), the driving force being a concentration or pressure gradient
  • the permeability is usually given as a measure of permeation in the unit yg cm-2 min-1 Without external influences, the permeate always moves in the direction of the lower concentration or the lower partial pressure
  • the permeation proceeds in three steps: 1. Sorption at the interface: gases, vapors or chemicals or suspended substances dissolved in liquids are taken up on the surface of the solid, in this case cell and / or cellular structure (spheroid) 2. Diffusion (through the solid, here cell and / or cell bond)
  • Spheroids stronger in response to treatment with DHT The cells in the. Inner parts divide less strongly because their contact with DHT is limited or completely inhibited by permeation into the inner spheroidal layers and their carcinoma cells. This advantageous. Execution resembles the conditions in vivo.
  • the 3D cell culture system finds its use in culturing at least one cell line, preferably selected from prostatic epithelial Prostatastromazellen and primary cells from the prostate and / or a Prostatametastase a patient and tumor cell line and Kombina ⁇ tions thereof, more preferably selected but not limited from the list LNCaP (lymph node metastasis, from a metastasis of a human prostate gland carcinoma, ATCC® CRL-1740 TM), PC-3 (lumbar metastasis, taken from a 62-year-old Caucasian with grade 4 prostate gland carcinoma, ATCC® CRL-1435 TM), DU145 (epithelial cell a human prostate gland carcinoma, taken from a brain metastasis, ATCC® CRL-2698 TM), VCaP (Prostate Vertebral Cancer Cell Obtained from a Lumbar Spine Metastasis of a Patient with Hormone-Resistant Prostate Cancer, Sigma Aldrich®,. Order Number
  • the cell culture takes place with at least two different cell lines, preferably selected from the same list.
  • the 3D Cell culture system as a model for prostate cancer use.
  • Cryogels are cultured in tumor spheroids corresponds to the situation in vivo more than the situation in conventional 2D cell culture systems. These processes involve the co-concentration of contact and uptake of the cells to / from permeating nutrients, oxygen and potential test substances which are supplied to the cells via the cell culture medium. In addition, the growth in proliferation gradients, the increased cell-matrix and cell-cell interaction and the increased paracrine signaling between the cells themselves.
  • the cultivation of cells in cell scaffold carriers such as the claimed cryogels offers a decisive advantage over the cultivation in the cell framework-free, three-dimensional (3D) cell culture system, such as the hanging drops:
  • the sizes of the cell aggregates are not restricted and unpredictable conditions occur in the system which make reproducible results impossible and do not correspond to the situations in vivo, but this is the main advantage of the system present invention, in which in particular for the drug search, the gene expression analysis or molecular biological analysis and diagnostics an in vivo same system is provided.
  • Matrigel gel-like protein mix from the cells of an angel breth-Holm Swarm sarcoma mouse
  • the hydrogel is made of different polymers and their physical properties such as porosity, pore size and elasticity are significantly worse than those of the PEGda cryogels of the invention.
  • a delayed and lower swelling behavior, as well as instability of the PEGda hydrogel are observed.
  • Fig. 2 shows the swelling rate (Sr) of PEGda575 ( ⁇ ) and PEGda700
  • Fig. 4 Cell matrix (PEGda700) contacts after 1 week culture by REM.
  • Fig. 6 shows the tumor volume (V) in mm 2 of the BAG-IL expressing
  • Wild-type cell line (- • -) and the vector-transfected cell line (-0-) are injected into xenograft mouse models at various times (I in days).
  • Fig. 8 shows a comparison of the E-modules (in kPa) of PEG-da575, 700 and 6000 and the PEGda700 hydrogel.
  • FIG. 11 The one-time treatment of LNCaP cells cultured in PEGda cryogels with the anti-androgen enzalutamide.
  • Figure 1 shows the pore structure, distribution, size and homogeneity of PEGda575 cryogels (A), PEGda700 cryogels (B) and PEGda700 hydrogels (C).
  • PEGda575 and PEGda700 cryogels have an enormous swelling rate which already has a stable equilibrium within a few seconds.
  • a source potential of 8 times the dry weight could be shown, for PEGda 575 depending on the medium at 4.5-6 times the dry weight.
  • the hydrogel of PEGda700 (C) has a swelling rate of less than 2 times the dry weight.
  • Hydrogels and cryogels from PEGda 575 (A) and PEGda 700 (B) were synthesized at a defined height (5 mm) and, after synthesis, were washed three times in distilled water. Subsequently, the hydro and cryogels were completely dried and their dry weight determined.
  • Degradation assays were performed to test the long-term stability of the cryogels.
  • the gels are stored in cell medium at 37 ° C. for up to 3 weeks and the weight is determined at regular intervals.
  • Figure 3 there were no significant changes in the PEGda700 cryogels.
  • PEGda700 cryogels were washed after synthesis three times in distilled H 2 O and their weight determined in equilibrium.
  • Phosphate buffered saline PBS - / -
  • PEGda 700 solution 100 mg
  • APS Polymerisationsini- tiators ammonium persulfate
  • TEMED polymerization catalyst tetramethylethylenediamine
  • the rheological properties of the produced PEGda700 cryogels could be represented by the elastic modulus (E) in kilopascals (kPa).
  • PEGda700 cryogels have an E-modulus of about 77 kPa ( Figure 8). Thus, they are within the range of elasticity of malignant prostate tissue (65-126 kPa).
  • mercury porosimeter analyzes were performed. The former enables the determination of the raw and pure density by injecting mercury into the gel, whereby the total porosity can be calculated. This resulted in a porosity of about 74% for PEGda700 cryogels, for example (FIG. 9).
  • Figure 10 shows the cultivation and treatment of LNCaP cells in the conventional 2D cell culture and in PEGda cryogels with the androgen di-hydrotestosterone (DHT, 10-8M) results after 6 days in a marked increase in the proliferation of DHT treated cells under both culture conditions .
  • the treatment of tumor spheroids with the androgen DHT results in a non-concentration-like access of Pr.ostatakarzinomzellen LNCaP to the hormone DHT.
  • Figure 11 shows the treatment of LNCaP cells cultured in PEGda cryogels with the anti-androgen enzalutamide (Xtandi®) (10-5M) resulting after daily treatment with the androgen DHT (10-8M) over a period of 6 days, in a reduced proliferation rate.
  • Xtandi® anti-androgen enzalutamide
  • Embodiment 2 PEGda575-Cryog-ele
  • Cryogels could be represented by the specification of the elasticity (E) modulus in kilo-Pascal (kPa).
  • PEGda575-cryogels besit ⁇ zen an E-modulus of about 76 kPa ( Figure 8). Thus, they are within the range of elasticity of malignant (malignant) prostate tissue (65-126 kPa).
  • mercury Pörosimeter analyzes were performed. The former makes it possible to determine the raw and pure density by injecting mercury into the gel, which can be used to calculate the total porosity. This resulted, for example, in PEGda575 cryogels
  • Porosity of about 77% (Figure 9).
  • Degradation assays were carried out to check the long-term stability of the PEGda575 cryogels. For this purpose, the gels are stored in cell medium at 37 ° C. for up to 3 weeks and the weight is determined at regular intervals. It was recorded no significant modifier ⁇ alteration.
  • the rheological properties of the produced PEGda6000 cryogels can be represented by the expression of the modulus of elasticity (E) in kilo-Pascal (kPa).
  • PEGda6000 cryogels have an E-modulus of about 11 kPa ( Figure 8).
  • E-modulus of about 11 kPa
  • PBS - / - Mg 2+ and Ca 2+ -free phosphate buffered saline
  • PEGda700 solution 18 ml of Mg 2+ and Ca 2+ -free phosphate buffered saline (PBS - / -) are mixed with 2 ml of a 1.12 mg / ml PEGda700 solution.
  • 100 mg of the polymerization initiator ammonium persulfate (APS) and 12 ⁇ of the polymerization catalyst tetramethylethylenediamine (TEMED) are then added to this mixture and polymerized at RT. Thereafter, the contents are removed from the syringe.
  • the formed PEGda700 hydrogel is then cut into uniform slices of about 3 or 5 mm.
  • the rheological properties of the prepared PEGda700 hydrogels could be represented by the elastic modulus (E) in kilo-Pascal (kPa).
  • PEGda700 hydrogels have an E-modulus of about 49kPa ( Figure 8). Thus they are not within the range of elasticity of malignant prostate tissue (65-126 kPa).
  • mercury porosimeter analyzes were carried out. The former enables the determination of the raw and pure density by injecting mercury into the gel, whereby the total porosity can be calculated. For example, this resulted in a porosity of about 24% for PEGda700 hydrogels (FIG. 9).
  • Embodiment 5- Culture of LNCaP Cells in PEGda.700- Cryogels After detection of appropriate sterilization techniques (use of sterile filtered PEGda and sterile filtered PBS and storage of the cryogels under aseptic conditions in cell culture medium with 1% penicillin and streptomycin) and the necessary cell culture conditions (in 6-well plates containing 5 ml of culture medium per sample at 37 ° C. and 5% C0 2 with medium change at 2-day intervals) were cultivated in the produced PEGda700 cryogels (seed: 10 6 cells / 30 ⁇ l culture medium) of the prostate cancer cell line LNCaP. Vitality, proliferation and morphology were examined.
  • LNCaP cells form cell-matrix contacts in PEGda cryogels.
  • LNCaP cells were cultured in PEGda cryogels for 1, 2 and 3 weeks (here: 1 week), then washed three times in PBS (- / -) and in Glutaraldehyde solution (1% in PBS) fixed. The visualization of the cell-matrix contacts was carried out under the scanning electron microscope.
  • Embodiment 6 Interaction of Coactivators such as Bag-IL with the Androgen Receptor (AR)
  • Bag-IL a co-activator of the androgen receptor in prostate tumors, strongly influences both basal and androgen dependent growth.
  • Bag-IL overexpressing LNCaP prostate tumor cells show only marginal growth differences compared to the vector-transfected control. These sub ⁇ differences are probably due to the experimental conditions, since the cell culture systems lack the Mikroumge- environment of the tumor. Cells cultured on plastic often versa ⁇ in the vivp function to reflect.
  • the BAG-IL-expressing cell line has significant Un ⁇ differences in growth behavior in the xenograft animal studies compared to the growth in conventional 2D culture Pet ⁇ rischalen. While in the 2D culture after 6 days only marginal differences in growth in both the presence and in the absence of important for the growth of the tumor cells androgens
  • the cells were trypsinized, washed once with PBS, and seeded in starvation medium (RPMI without phenol red with 3% CCS) at a cell density of 10x10 4 cells / cm 2 on 6well plates. After 48 h (day 1), the cell count was determined by means of a Neubauer counting chamber and the medium was changed to RPMI without phenorot, 2 mM glutamine, 100 U penicillin, 100 ⁇ g streptomycin and mixed with 10-8 M dihydrotestosterone or the same amount (1 ⁇ / ml) ethanol as solvent control. The hormone or ethanol addition was repeated on days 3 and 5 without changing the medium.
  • starvation medium RPMI without phenol red with 3% CCS
  • the determination of the cell number was then carried out on day 6 again with the aid of a Neubauer counting chamber.
  • the growth rate is determined by the quotient of the number of cells at day 6 by the number of cells on day 1.
  • the growth 'tumsrate at day 6 is for the vector: 0.86 (ETOH); 1.47 (DHT) and for BAG-1L: 0.75 (ETOH); 1.53 (DHT).
  • Comparative experiment2 Xenograft culture of LNCaP prostate-morcellllnie

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Zellkultursystem aufweisend ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykoldiacrylat (PEGda). Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat-Cryogel wobei zunächst eine vorgekühlte Mischung aus Polyethylenglykol-diacrylat in einer Pufferlösung bereitgestellt wird und anschließend mindestens ein Polymerisationsinitiators und mindestens ein Polymerisationskatalysators zugegeben werden. Die Mischung wird gefroren und anschließend kann das Cryogel entnommen werden.

Description

3D-ZellkulturSystem, dessen Herstellung und Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein 3D-Zellkultürsystem, dessen Herstellung und Verwendung für die Prostatakrebsforschung und die Untersuchung potentieller Therapeutika zur Behandlung von Prostatakrebs.
Nach heutigem Stand sind Tierversuche die ultima ratio für die abschließende Beurteilung, ob ein Wirkstoff für z.B. die Tumortherapie geeignet ist. Die konventionelle 2D Zellkultur ist nur unzureichend in der Lage, das Verhalten und die Eigen- schaffen von Zellen im Tumor nachzubilden. Hier sind vor allem die dreidimensionale (3D) Vernetzung und die Interaktion mit den umgebenden Stromazellen signifikante Faktoren.. Durch die 3D Zellkultur soll eine bessere Nachbildung der Bedingungen ' für die Tumorzellen gelingen und auf diesem Wege Tierversuche auf ein Minimum eingeschränkt werden.
In der ' umorforschung werden momentan vor allem drei Untersuchungsmethoden eingesetzt (Jung, V. et al. Urologe 47, 199- 1204 (2008),· Zergel, T. et al. Eur Urol 33,. 414-423 (1998), Winter, S. et al. Pros Cancer Pros Dis 6, 204-211 (2003), Ah- mad, I. et al. Exp Rev in mol med 10:16, 1-20 (2008):
Zum einen Klinische Gewebeproben, die z.B. im Fall von Prostatakarzinomen mittels Prostatektomien gewonnen werden. Sie bieten den Vorteil der absoluten Patientennähe und spiegeln die Momentaufnahme der in vivo Situation wieder. Diese werden als Frischgewebe oder Formalin-fixiertes , in Paraffin eingebettetes Material zur Analyse verwendet. Diese Gewebeproben können allerdings nicht für funktionelle Studien eingesetzt werden.
Des Weiteren werden, trotz des hohen Aufwandes und morphologischer Unterschiede, Tiermodelle verwendet . Zu den am häufigs- ten verwendeten Modellen zählen ( immundefiziente ) Mäuse. Obwohl die Aussagekraft und Relevanz anzuzweifeln ist, da es keine eindeutigen Analogien zwischen muriner lobulärer und humaner zonaler Architektur der Prostata gibt, ist der Vorteil durch eine vollständige in vivo-Umgebung unumstritten. Die Einführung von Xenograft-Modellen (Implantation von humanem Karzinomgewebe in immundefiziente Mäuse) lieferte Informatio¬ nen, deren Auswertung jedoch auf Grund der heterogenen Mikro- umgebung, der fehlenden endogenen Immunantwort und der geringen Anzahl an verschiedenen Zelllinien zur Implantation, schwierig ist. Diese Modelle lösen das intrinsische Problem der intratumoralen Heterogenität nicht und weisen zudem auf Grund der enormen Komplexität der einzelnen und der . Heterogenität zwischen den Individuen eine geringe Transparenz auf.
Funktionelle Studien erfolgen in der Regel an den etablierten permanenten Zelllinien. Diese werden meist aus Metastasen generiert und repräsentieren damit bereits weit fortgeschrittene Karzinomzellen. Im Falle des Prostatakarzinoms stehen nur we¬ nige zur Verfügung und diese weichen zudem- stark von den Primärzellen ab. Des Weiteren besteht auf Grund der geringen genetischen LangzeitStabilität die seit einigen Jahren diskutierte Kontroverse zur Aussagekraft über die mit diesen Zelllinien ermittelten Ergebnisse. Erst durch die Einführung von Kokultivierungen mit Fibroblasten und extrazellulärer Matrix konnten erste Erfolge in der Langzeitstabilität genetisch ab- erranter Karzinomzellen erzielt werden. Es ist allgemein anerkannt, dass das Zusammenspiel unterschiedlicher Zelltypen durch Veränderungen der genetischen Ausstattung und sekretori¬ schen Reaktionen, zu unterschiedlichen Ergebnissen führt und die Einzelkultivierung von Prostataepithelzellen keine Rückschlüsse- auf das in vivo Verhalten geben kann. Dennoch' ist es bisher nicht gelungen ein Modellsystem zu entwickeln, dass die vollständige in vivo Situation widerspiegelt.
3D-Kultursysteme (Wells, R.G. Hepatology 47:4, 1394-1400 (2008), Meli, L. et al. Biomaterials 33', 9087-9096 (2012), Hutmacher, D.W. et al. Trends in Biotech 28:3, 125-133 (2009), Yamada, K.M. et al. Cell 130:24, 601-610 (2007)) schließen durch Imitation von Merkmalen, welche in der natürlichen Umgebung der Zellen zu finden sind,, die Lücke zwischen 2D-Zellkultursystemen und Tiermodellen. Zellen, kultiviert auf konventioneller Hartplastik oder einer Glasschicht mit einem Elastizitäts (E) -Modul von mehreren GigaPascal (GPa-) , zeichnen sich durch abweichende Eigenschaften aus, die im Wesentlichen Morphogenese, Genexpression, Wachstum, Beweglichkeit und Differenzierung betreffen. Zusätzlich kommt es zu einer unnatür- liehen Zellpolarisation und zu einer abnormen Produktion von extrazellulären Matrix (EZM) -Proteinen . Während der SD- Kultivierung werden Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen aufgebaut, die helfen molekulare Mechanismen besser zu verstehen. Im Folgenden werden kurz die Vor- und Nachteile der mo- mentan eingesetzten 3D-Zellkultursysteme dargestellt:.
Sphäroid-Modelle (Takagi, A. et al. Anticancer Research 27: 45-54 (-2007), Härma, V. et al. PLoS ONE 5:5, 1-17 (2010), Griffith, L. G. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 211-224
(2006) ) sind 3D-Systeme, die die Eigenschaft vieler Zelltypen zur Aggregation nutzen. Das Prinzip beruht auf der 'Kultivierung adhärenter Zellen auf nicht-adhäsiven Oberflächen, wie z.B. Agarose, oder frei in einem „hängenden Tropfen" Kulturmediums. Die Zellen lagern sich dann in Einzel- oder Kokulturen, als mono- oder multizelluläre Sphäroide, mit einem Durchmesser von mehreren hundert μπι (z.B. etwa 650 μπι bei LNCaP-Zellen) zusammen. Sie werden vor allem als Tumormodell eingesetzt, da maligne Zellen im Allgemeinen nicht nur eine größere Tendenz zur Zellaggregation besitzen, sondern diese sogar als Maligni- tätskriterium herangezogen wird. Hinsichtlich Morphologie und Verhalten der Zellen sind Sphäroide vor allem für das Nachbilden der Situation in avaskulären Mikrotumoren oder ' schlecht versorgten Anteilen größerer Tumore geeignet. Allerdings wurde festgestellt, dass multizelluläre Sphäroide iri Abhängigkeit von den eingesetzten Kultivierungsbedingungen unterschiedliche Typen mit verschiedenen Genexpressionsmustern ausbilden. Des Weiteren entstehen wegen des inhomogenen dreischichtigen Aufbaus aus äußerer, intermediärer und nekrotischer Zone ein ra¬ dialer Sauerstoff- und Nährstoffgradient , sowie ein entgegen-- gesetzter „Abfallstoff"-Gradient .
Basalmembran Matrix (Nyga, A. et al. J. Cell Commun Signal 5, 239-248 (2011), Levental, I. et al. Soft Matter 3, 299-306 (2007), Soofi, S.S. et al. J Struct Biol. 167:3, 216-219
(2009)), auch als Matrigel bekannt, ist ein gelatineartiges Proteingemisch, welches seit, rund 30 Jahren in der Zellkultur Verwendung findet. In diesem Gemisch befinden sich Komponenten der Basalmembran, wie Laminin, Kollagen Typ IV und Entactin. Auf bzw. innerhalb des Gels kommt es zur Vereinigung der Zellen und zur Bildung von Strukturen, welche denen in vivo sehr nahe kommen. Aufgrund dessen finden Matrigele Verwendung für Studien zur Zelldifferenzierung, Angiogenese und Tumorwachs¬ tum. Jedoch erschweren Reste von Wachstumsfaktoren oder nicht- quantifizierten bzw. teilweise auch unbekannten Substanzen, die im Matrigel enthalten sind, sowie ihre Batch-to-Batch-Schwankungen, die Vergleichbarkeit mit anderen Studien. Des Weiteren weist Matrigel ein E-ModuL von nur ca. 500 Pa auf, womit es weit unter dem E-Modul der meisten Tumorgewebe (4- 130 kPa) . Beim Prostatakarzinom: 65-126 kPa
Hydrogele (Holliday, D.L. et al . Breast Cancer Res 11 (2009), Cunliffe, D. et 'al. Eur Polym J 40, 5-25 (2004), Chen, R. et al. Biomaterials 30, 1954-1961 (2009), Villanueva, I. et al. Acta Biomat 5, 2832-2846 (2009), Chevalier, .E. et al . J Pharm Sei 97, 1135-54 (2008 ) ) , Hwang Y. et al. „Polyethylene glycol) cryogels as a potential cell scaffolds: effect of polymeriza- tion conditions on cryogel microstrueture and properties", J. Mater. Chem. , 2010, 20, S. 345.351, US 8709452 B2 "SYNTHETIC BONE GRAFTS" sind wasserenthaltende Polymernet zwerke . Dabei werden die Eigenschaften des Trägermaterials entscheidend durch die Haupt komponente beeinflusst. Es wird zwischen natür- liehen und synthetischen Materialien unterschieden. Hydrogele aus natürlichen Komponenten, wie Kollagene, Hyaluronate, Algi- nate, Agarose und Chitosane, bieten den Zellen eine biologische Ümgebung. Hydrogele a'us synthetischen Polymeren, wie z.B. Polyvinylcaprolactam (PVC1) oder Polyethylenglykcol- d'iacrylatPolyethylenglykcoldiacrylat (PEGda) , sind mechanisch belastbarer, lassen jedoch eine geringere Zelladhäsion . zu . Aus diesem Grund findet häufig eine Oberflächenmodifikation der Polymere statt. Möglich ist dabei eine Integration von funkti- onellen Gruppen an spezifische Loci innerhalb der Polymerketten oder eine Mischung aus Polymeren und bestimmten EZM- Komponenten, wie z.B. PVC1, modifiziert mit Gelatine, deren größere Oberfläche die Zelladhäsion zusätzlich unterstützt. Der Vorteil von synthetisch hergestellten Zellgerüsten liegt in ihrer Variabilität, d.h. je nach Anforderung können diese ihre Oberflächeneigenschaften (hydrophil/hydrophob) und Struktur (Vernetzungsgrad) verändern und dementsprechend das Zellverhalten beeinflussen. Das E-Modul von Hydrogelen liegt allerdings nicht im Bereich der Tumorgewebe und auf Grund der geringen Porosität sind die NährstoffVersorgung und Abtransport der Abfallprodukte erschwert. Die Herstellung von porösen Strukturen ist vor allem mittels Versetzen mit Porogenen durchführbar. Zu diesen gehören Gas (Kohlenstoffdioxid) , Flüssigkeiten (Wasser) und Feststoffe (Paraffin), die anschließend. durch Sublimation, Evaporation oder Schmelzen entfernt werden und eine schwammartiges Polymer hinterlassen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es also, ein SD- Zellkultursystem zur Kultivierung von Tumorsphäroiden bereitzustellen, , das die Nachteile des Standes der Technik überwin- det.
Des Weiteren bestand die Aufgabe, ein Verfahren vorzuschlagen, mit dem 'sich 3D-Zellkultursysteme , bevorzugt das beschriebene 3D-Zellkultursystem, bereitstellen lassen. Diese Aufgabe wird im Hinblick auf das 3D-Zellkultursystem durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst, in Hinblick auf das Verfahren zur Herstellung des 3D-Zellkultursystems durch die Merkmale des Anspruchs 7 und auf die Verwendung durch die Merkmale der Ansprüche 12 und 13. Die Unteransprüche beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
Diese Aufgabe wird durch ein 3D-Zellkultursystem aufweisend ein Cyrogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda) gelöst. Des Weiteren wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus Polyethylenglykol- diacrylat-Cryogelen mit den folgenden Verfahrensschritten gelöst. Zunächst wird eine vorgekühlte Mischung aus mindestens einem PEGda in einer Pufferlösung bereitgestellt. Anschließend erfolgt die Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators . Das Gemisch wird dann gefroren und man erhält ein PEGda-Cryogel .
Der Begriff Cryogel bezieht sich im Folgenden auf ein polyme- res Gel, dass im wässrigen Medium, bei Temperaturen unter 0°C hergestellt wird. Kernpunkt der Cryogelsynthese ist die Kristallisation des Lösungsmittels (Wasser) , dessen wachsende Eiskristalle ein dichtes Netzwerk ergeben und somit die Grundlage für die spätere Porenstruktur schaffen. Nach dem Gefrierpro- zess werden Cryogele aufgetaut, wobei das in den Poren enthal- tene Wasser schmilzt und abläuft. Dadurch wird die poröse
Struktur zugänglich. Cryogele grenzen sich hinsichtlich ihrer Morphologie und Synthese deutlich von Hydrogelert ab. Ihr Name ist auf die Art und Weise ihrer Herstellung zurückzuführen. „Kryos" ist griechisch und steht für Frost oder Eis, somit können Cryogele im übertragenen Sinne als Frost- oder Eisgele bezeichnet werden.
Polyethylenglykcol-diacrylat (PEGda) , ist ein- Polymer mit der -allgemeinen Summenformel (C3H30) - (C2H40) n~0- (C3H30) mit n gleich einer natürlichen Zahl größer/gleich 1 (1) und wird mit seinem mittleren Molekulargewicht beschrieben, wie z.B. PEGda575, PEGda700, PEGda6000. Die Definition umfasst auch die hochket- tigen Polyethylenglykol-diacrylate mit einer Molekularmasse >35.000g/mol.
Die mittlere Molmasse wird im Folgenden definiert als eine Kenngröße der Molekularmassenverteilung, wobei die Molekularmassen sämtlicher in einer Mischung vorliegenden Kettenlängen gemittelt werden. Dabei weist PEGda 700 z.B. eine Verteilung der Molekularmassen von 675-725 g/mol auf.
Die Gesamtporosität bescheibt das Hohlraumvolumen in % eines porösen Körpers. Der Begriff Gesamtporosität (P) eines Materials bezeichnet das Verhältnis aus dem gesamten Volumen zu dem Volumen des porösen Körpers. Die Porosität kann offen sein, d.h. einzelne Poren sind untereinander verbunden (zugänglich für von außen eindringende Gase und Flüssigkeiten) oder geschlossen, d.h. die Porenräume sind voneinander getrennt. Die Porosität des Materials beeinflusst dessen Festigkeit, mechanische Eigenschaften, Volumenstabilität, Permeabilität, Wasseraufnahme und Langzeitstabilität.
Quecksilber-Porosimeter-Analysen ermöglichen über das Einpressen von Quecksilber in eine poröse Substanz die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet wer- den kann. Die Gesamtporosität (P) wurde mit der ashburn Formel (3) berechnet.
(Φ = (1-—)xl00%) (2)
Po
Porosität
Rohdichte
Reindichte
p _ p _ 4 σ cos(0)
PL - Druck des Quecksilbers
PG - Druck des Gases
σ - Oberflächenspannung des Quecksilbers '485 mN/m
Θ - Kontaktwinkel von Quecksilber; Standardwinkel 140°C
Dp - Porendurchmesser Der Begriff Trockengewicht bezeichnet das Gewicht eines Kör-- pers nach vollständiger Trocknung. Das Trockengewicht ist das Gewicht eines Materials im getrockneten (also wasserfreien) Zustand.
Die Schwellrate entspricht der Aufnahmefähigkeit eines Körpers von Flüssigkeiten über Zeit. Die Begriffe Schwellrate,
Schwellpotential und Quellpotential werden äquivalent verwendet. Der Begriff Schwellrate beschreibt die prozentuale Flüssigkeitsaufnahme eines trockenen Materials bis zum geschwolle¬ nen Gleichgewichtszustand (Equilibrium) . Um die Schwellrate von PEGda-Cryogelen zu ermitteln, wurden diese zunächst vollständig getrocknet und anschließend in Zellkulturmedium, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder destilliertem H20 aufbewährt. Nach definierten Zeitpunkten wurden die PEGda- Cryogele aus der Lösung entfernt und gewogen. Das Gewicht wur- de notiert und somit die Zunahme des Eigengewichtes als
Schwellrate in % (4) ermittelt.
Wr = x 100
We (4) Wr - Wasseraufnahmefähigkeit
Wt - Gewicht zu bestimmten Zeitpunkten
Wg - Trockengewicht der Probe
We - Gewicht im Gleichgewichtszustand ( Equilibrium) der; gesättigten Probe
Der Begriff .Elastizitäts-Modul (E-Modul) oder Youngsches Modul, wenn nicht anders angegeben in Kilo-Pascal (kPa) , beschreibt als Materialkennwert den Zusammenhang zwischen Spannung und Dehnung bei der Verformung eines festen Körpers bei linear elastischem Verhalten. Im Folgenden. werden hiermit die rheologischen Eigenschaften der Cryogele dargestellt. Hierbei wird das Deformationsverhalten der Matrizes über Zug- und Scherkräfte mittels einer Zugprüfmaschine ermittelt. Die synthetisierten Cryogele werden direkt nach Herstellung dreimalig in destilliertem H20 gewaschen und anschließend auf einen Edelstahlblock, der an der Zugprüfmaschine angebracht ist, aufgelegt. Anschließend wird ein Stempel bis zu einer Vorkraft von 0,05 N an das PEGda-Cryogel herangefahren. Nachdem die Vorkraft erreicht ist, wird der Druck auf das PEGda-Cryogel bis zu IN erhöht und ein sogenanntes Spannungs-Dehnungsdiagramm aufgenommen. Anhand dieses Spannungs-Dehnungsdiagr mms kann die Elastizität der gemessenen PEGda-Cryogele im elastischen Bereich (Hookesche Gerade) des Diagramms berechnet werden.
Der Begriff Polymerisationsinitiator bezeichnet einen chemischen Stoff, der den Vorgang einer radikalischen Polymerisationsreaktion einleitet.
Der Begriff Polymerisatipnskatalysator bezeichnet einen chemischen Stoff, der für die Vernetzung von Akrylgruppen während der radikalischen Polymerisationsreaktion zuständig ist..
Wenn nicht anders angegeben, finden Reaktionen oder Verfahrensschritte bei Raumtemperatur (25°C) statt. Wenn nicht anders angegeben, finden Reaktionen oder Verfahrensschritte unter Standardatmosphäre (1013,25 hPa) statt. Ausgestaltungen können frei miteinander kombiniert werden.
Das erfindungsgemäße 3D-Zellkultursystem weist ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda) auf. Das Erscheinungsbild des Gels wird während der Synthese durch Variation der Einfriertemperatur, Konzentration und Kettenlänge der Monomere, Auswahl der Polymerisations-katalysatoren und - Initiatoren stark beeinflusst.
Das erfindungsgemäße Cryogel weist im wasserfreien Zustand einen Anteil von mindesten 80 %, bevorzugt mindesten 90 %, besonders bevorzugt 100 % PEGda auf. In einer weiteren Ausgestaltung werden PEGda mit verschiedenen mittleren Molmassen eingesetzt. Deren Gesamtanteil im Cryogel beträgt bevorzugt mindestens 80 %. In einer Ausgestaltung werden PEGda mit einer mittleren Molmasse von mindestens 100 g/mol, bevorzugt mindestens 150 g/mol, besonders bevorzugt mindestens 400 g/mol und maximal 10000g/mol, bevorzugt maximal 1500 g/mol, besonders bevorzugt maximal 1000 g/mol eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden PEGda 700 und/oder PEGda 575 verwendet. Allgemein lässt sich feststellen, je länger die Polymerketten, desto größer die Poren, höher die Porosität und geringer die Elastizität. In einer weiteren Ausgestaltung werden Cryogele aus mindestens einem PEGda und mindestens einem weiteren Polymer, bevorzugt ausgewählt aus folgender Liste Po- lyhydroxyethylenmethacrylat , Alginat, Gelatine, Chitosan, Kollagen verwendet.
Das erfindungsgemäße 3D Zellkultursystem besteht in einer Ausgestaltung zu maximal 10%, bevorzugt zu maxima-1 5 %, besonders bevorzugt zu maximal 1,5 % aus PEGda, bezogen auf das Trockengewicht des PEGda-Cryogel- pro Gesamtmasse des SD-Zellkultursystems, wobei sich die Gesamtmasse des 3D-Zellkultursystems aus seinen Einzelbestandteilen zusammensetzt. Weitere Bestandteile sind mindestens ein Zellkulturmedium. Das 3D-Zellkultur- System wird dann mit Zellen beladen. In einer Ausgestaltung werden noch Komponenten zur Analyse hinzugefügt.
PEGda-Cryogele werden homogen und reproduzierbar hergestellt. Sie besitzen eine hohe Porosität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 70%, und eine maximale Porosität von 90 %, bevorzugt maximal 85%, besonders bevorzugt maximal 80%. Die Porosität wird mittels Quecksilber-Porosimeter-Analyse bestimmt. Das durchgängige Porennetzwerk wird mittels Mikro-Röntgen-Tomographie nachgewiesen. Aufgrund des durchgängigen Porennetzwerks ermöglichen sie die Versorgung von im Cryogel wachsenden Zellen mit Nährstoffen, den Abtransport von Abfallprodukten, die freie Zirkulation von Peptiden, Hormonen, sowie zu testende Therapeutika. Die Cryogele lassen sich in beliebiger Form, Größe und Anzahl herstellen. Die Porengröße variiert je nach' Material und Syntheseparameter zwischen 1 und 1000 pm, bevorzugt zwischen 10 und 100 pm, besonders bevorzugt zwischen 50 und 80 pm. Das ermöglicht eine freie Zirkulation von Peptiden und Wirkstoffen (wie Hormonen und Therapeutika) . PEGda700-Cryogele besitzen eine durchschnittliche Porengröße von 70. pm. Die Porengröße, Porengeometrie und Porenverteilung ist kontrollierbar, indem man Polymere mit unterschiedlichen Kettenlängen verwendet. Auf diese Weise kann, im Vergleich zu den Sphäroidmodellen, ein geeignetes Maß aus ausreichend Freiraum zur Aggregatsbildung bei gleichzeitiger Einschränkung des Größenwachstums der Zellverbände ermöglicht werden.
Das 3D-Zellkultursystem weist eine Schwellrate auf, die
5-15-fachen, bevorzugt 7-10-fachen, besonders bevorzugt 7,5- fachen des Trockengewichtes liegt.
Um ein möglichst in vivo-nahes Modell zu erhalten, muss das 3D-Zellkultursystem ein Elastizitäts-Modul im Bereich des natürlichen Gewebes aufweisen. Für die Untersuchung von Prostatatumoren ist ein E-Modul von 60-130kPa, ermittelt mit einer Zugprüfmaschine, bevorzugt. Es konnte gezeigt werden, dass die PEGda700-Cryogele ein E-Modul von etwa 77 kPa besitzen. Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65-126 kPa) .
Die mit PEGda-Cryogelen generierte Möglichkeit, Zellen innerhalb einer Matrix in dreidimensionalen Zellverbänden zu kultivieren, stellt eine wesentliche Verbesserung bei der Nachbildung des in v vo-Tumors des Tiermodells in Zellkultur dar.
Das Cryogel wird mittels radikalischer Polymerisationsreaktion hergestellt, wobei nicht kovalente Bindungen zwischen den Ak- ryl-Gruppen der PEGda-Moleküle ausgebildet werden. Die Reaktion wird durch mindestens einen Polymerisationsinitiator, der Sulfatradikäle bildet, bevorzugt Ammoniumperöxidsulfat APS (CAS-Nummer: 7727-54-0), eingeleitet. Bei der Zersetzung des Polymerisationsinitiators entstehen Sulfatradikale, die einen elektrophilen Angriff auf Kohlenstoffatome mit Doppelbindungen durchführen. Dadurch werden die Doppelbindungen in den Ak- rylgruppen des PEGda geöffnet und eine Kettenreaktion gestartet. Der mindestens eine Polymerisationskatalysator, bevorzugt Tetramethylethylendiamin TEMED (CAS-Nummer: 110-18-9) fördert hierbei die Bildung freier Sulfatradikale durch APS, was zu einer Katalyse der Polymerisationsreaktion führt. Die Poly- . merisationsreaktion folgt dabei dem allgemeinen Prinzip von Kettenstart, Kettenfortpflanzung und Kettenab-bruchsreaktion, sobald die Sulfatradikale aufgebraucht sind.
Im Falle der radikalischen Polymerisationsreaktion kommt es durch eine erhöhte Zugabe von Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu einer vorzeitigen Polymerisation von PEGda, und eine Kristallisation des Porogens bleibt aus. Folglich werden hydrogel- artige Strukturen gebildet, die keine Poren besitzen. Ist die TEMED- Konzentration zu gering gewählt, bleibt eine Polymerisation aus, oder die Kristallisation des Porogens zerstört eine wünschenswerte, rundporige Struktur der Cryogele. In einer weiteren Ausgestaltung werden verschiedene PEGda Ausgangsstoffe, mit unterschiedlichen mittleren Molekulargewichten verwendet. Durch das Mischen von unterschiedlichen PEGda- Molekülen kann zum einen eine Variation der Porengröße erzielt werden und damit direkt verbunden, Einfluss auf Porosität und Elastizität genommen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung werden Cryogele mit. weiteren Substanzen, bevorzugt mit RGD-Sequenzen durch vorige Anbindung an ein heterobifunktionales , d.h. ein mit mindestens 2 reaktiven funktionellen Gruppen versehenes, Polyethylenglykol , wie z.B. Akryl-Polyethylenglykol-N-Hydroxysuccinimid (ACRL-PEG- NHS) .
Des Weiteren soll ein Verfahren zur Herstellung "eines SD- Zellkultursystems, aufweisend ein Cryogel aus Polyethylengly- kol-diacrylat vorgeschlagen werden. Zunächst wird im Verfah¬ rensschritt a) eine vorgekühlte Mischung aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat und einem Puffer, bevorzugt PBS+/+ (Mg2+- und Ca2+-enthaltendes PBS), besonders bevorzugt PBS -/- (Mg2+- und Ca2+-freies PBS) bereitgestellt. Das Vorkühlen ermöglicht die Synchronisierung von Polymeri-sationsreaktion und Kristallisation des verwendeten Porogens . Diese Mischung weist in einer Ausgestaltung eine Temperatur von -10 bis -40 °C auf.
Anschließend erfolgt im Verfahrensschritt b) die Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators. In einer Ausgestaltung ist der mindestens eine Polymerisationsinitiator Ammoniumperoxidsulfat. In einer weiteren Ausgestaltung ist der mindestens eine Polymerisationskatalysator Tetramethylethylendiamin .
Diese Mischung wird nun im Verfahrensschritt c) eingefroren. In einer Ausgestaltung wird die Mischung bei einer Temperatur von -10 bis -40 °C, bevorzugt bei -20 °C gefroren . · Die Dauer des Gefrierschritts hängt von der Größe des gewünschten Cryo- gels ab und ist beendet, sobald das gesamte Gel -durchgefroren ist .
Nach der Gefrierung werden die Gele aufgetaut und liegen als fertiges Produkt vor. Mit diesem Verfahren erhält man PEGda- Cryogele definierter Größe. In einer Ausgestaltung werden die Gele in Scheiben oder Stücke geschnitten, mit einer Dicke von maximal 10 mm, bevorzugt maximal 5 mm, besonders bevorzugt maximal 3 mm. Diese Gele werden dann in einer weiteren Ausgestaltung so in mit Zellen beladen, dass die Zellen auf der Seite senkrecht zur Dicke des Gels aufgebracht werden und dann in das Gel hineinwandern. Bei einer Dicke größer als 10mm kann kein vollständiges durchwandern der Zellen sichergestellt werden. Die Beladbarkeit des Gels mit Zellen steigt mit sinkender Geldicke, da dann die NährstoffVersorgung und das Eindringen der Zellen in das System besser funktioniert. Die Geldicke muss minimal 0,1 mm, bevorzugt 0,5 mm, besonders bevorzugt mindestens 1 mm betragen, damit ein 3D-Zellkultur-system entsteht und das beinhaltete Cryogel sich verarbeiten lässt.
In einer Ausgestaltung werden die Cryogele anschließend gewaschen, bevorzugt mit destilliertem Wasser und unter aseptischen Bedingungen in Zellkulturmedium bis zur Aussaat der zur kultivierenden Zellen und darüber hinaus gelagert. In einer 'weiteren Ausgestaltung werden die Gele nach der Herstellung getrocknet und werden dann, vor einer Beladung mit Zellen, in Zellkulturmedium gegeben. Darin schwillt das Cryogel unter Aufnahme des Zellkulturmediums auf seine finale Größe an und liegt dann als 3D-Zellkultursystem vor.
Die Eigenschaften des gewählten PEGda-Polymers und die Herstellungsweise des Cryogels resultieren in einer hochporösen Struktur, deren Oberfläche, Porengröße und Konnektivität für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen ideal sind. Sowohl im Wachstumsverhalten wie auch in der Art der Bildung der Zell-Zell-Kontakte ähnelt die- 3D-Kultur im PEGda-Cryogel mehr dem Tumor als den Zellen in der 2D Kultur in der Petrischale oder den Sphäroidmodellen mit ungebremstem Sphäroidwachstum. Durch den Umfang der Poren des gewählten PEGda-Polymers des Cryogels kann die Größe von darin kultivierten Tumorsphäroiden auf eine maximale Größe limitiert werden in PEGda575 Cryogelen mit einer maximalen Größe von370 μπι bis zu einer Abweichung von 15%, wie in Figur 1 A) und/oder B) dargestellt. Dadurch wird vermieden, dass die Sphäroide einen Durchmesser erreichen, der für eine optimale Versorgung der Zellen durch Perme- ation von Nährstoffen bzw. Wirkstoffen im inneren der Sphäroide unvorteilhaft ist und unerwünschte Zeltprozesse wie Nekrose hervorruft.
Unter Permeation ( lateinisch · permeare , durchdringen, durchlaufen, durchwandern^ versteht man den Vorgang, bei dem ein Stoff (Permeat) einen Festkörper, hier Zell und/oder zellverband (Sphäroid) , durchdringt oder durchwandert. Die Triebkraft ist ein Konzentrations- oder Druckgradient. Die Permeabilität wird als Maß der Permeation üblicherweise in der Einheit yg cm-2 min-1 angegeben. Ohne äußere Einflüsse bewegt sich das Permeat immer in die Richtung der geringeren Konzentration bzw. des niedrigeren Partialdrucks . Die Permeation verläuft in drei Teilschritten: 1. Sorption an der Grenzfläche: Gase, Dämpfe oder in Flüssigkeiten gelöste Chemikalien oder suspendierte Stoffe werden an der Oberfläche des Feststoffes, hier Zell und/oder zellverband (Sphäroid), aufgenommen. 2. Diffusion (durch den Festkörper, hier Zell und/oder zellverband'
(Sphäroid) ) : Das Permeat durchdringt (diffundiert) das feste Material, hier Zell und/oder zell'verband (Sphäroid) durch Poren bzw. molekulare Zwischenräume. 3. Desorption : Das Adsorbat entweicht als Gas auf der. anderen Seite des Feststoffes, hier Zell und/oder zellverband (Sphäroid).
Verdeutlicht wird dies durch Figur 10, die Behandlung von beanspruchten Tumorsphäroiden mit dem Androgen DHT [Di- Hydrotestosteron, Sigma Aldrich®] ' resultiert in einem nicht gleichmäßigen durchdringen der jeweiligen Tumorsphäroide mit DHT, daraus folgt ein nicht konzentrationsgleicher Zugang des Hormons DHT zu den einzelnen Karzinomzellen hier Prostatakarzinomzellen LNCaP, des Tumorsphäroiden . Die Folge ist deren Proliferation in Form eines Gradienten. In diesem Proliferati- onsgradienten teilen sich die außen liegenden Zellen des
Sphäroids stärker als Antwort auf die Behandlung mit DHT. Die Zellen im. Inneren teilen sich weniger stark, da deren Kontakt zu DHT durch Permeation in die inneren Sphäroidschichten und deren Karzinomzellen, limitiert bzw. ganz unterbunden wird. Diese vorteilhafte. Ausführung gleicht damit den Verhältnissen in vivo.
Das erfindungsgemäße 3D-Zellkultursystems findet seinen Einsatz bei der Kultivierung mindestens einer Zelllinie, bevorzugt ausgewählt unter Prostataepithelzellen, Prostatastromazellen und Primärzellen aus der Prostata und/oder einer Prostatametastase eines Patienten und Tumorzelllinie und Kombina¬ tionen daraus, besonders bevorzugt ausgewählt aber nicht abschließend aus der Liste LNCaP (Lymphknotenmetastase; aus einer Metastase eines humanen Prostata-Drüsenkarzinoms , ATCC® CRL-1740™) , PC-3 (Lendenmetastase; entnommen einem 62 jährigen Kaukasier mit Grad 4 Prostata-Drüsenkarzinom, ATCC® CRL-1435™) , DU145 (Epithelzelle eines humanen Prostata-Drüsenkarzinom; - entnommen einer Hirnmetastase , ATCC® CRL-2698™) ) , VCaP (Verteb- ral-Krebszelle aus der Prostata, gewonnen aus eine Metastase der Lendenwirbelsäule eines Patienten mit Hormon-resistentem Prostatkrebs, Sigma Aldrich®, .Bestellnummer: 06020201)., RWPE (Zelllinie erhalten durch Transfektion eines Prostata-Epithels eines erwachsenen Kaukasiers mit humanen Papilloma-Viren
(HPV18) und Infektion durch v-K-ras, ATCC® CRL-11609™) und
22Rvl (entnommen aus C R22R, einer Androgen-abhängigen Prosta- takarzinom-Xenograftzellünie, DSMZ® ACC-438). In einer weite¬ ren Ausgestaltung erfolgt die Zellkultur mit mindestens zwei verschiedenen Zelllinien, bevorzugt ausgewählt aus derselben Liste .
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung findet das 3D- . Zellkultursystems als Modell für Prostatakrebs Einsatz. Das Verhalten von Karzinomzellen, die in den beanspruchten
Cryogelen in Tumorsphäroiden kultiviert werden, entspricht der Situation in vivo mehr als der Situation in konventionellen 2D Zellkultursystemen. Zu diesen Prozessen gehört der kozentrati- onsgleiche Kontakt und Aufnahme der -Zellen zu /von permeieren- den Nährstoffen, Sauerstoff und potentielle TestSubstanzen die über das Zellkulturmedium den Zellen zugeführt werden. Außerdem das Wachstum in Proliferationsgradienten, die erhöhte Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktion und die erhöhte pa- rakrine Signalisierung zwischen den Zellen selbst. Die Kultivierung von Zellen in Zellgerüstträgern wie den beanspruchten Cryogelen bietet einen entscheidenden Vorteil gegenüber der Kultivierung im zellgerüstfreien 3dimensionalen (3D) Zellkultursystem, wie den hängenden Tropfen:
Durch die Porengröße . wird die Größe der darin wachsenden
Sphäroide auf eine maximale Größe limitiert. Dadurch wird im
Wesentlichen der Prozess der Nekrose vermieden und eine Kultivierung . von mindestens 3 Wochen gewährleistet. In hängenden Tropfen hingegen, . wachsen besonders aggressive Tumorzellen sehr schnell auf eine Größe heran, in der die Versorgung der Zellen im Inneren des Sphäroids mit Sauerstoff und Nährstoffen des Kulturmediums nicht mehr gewährleistet ist und der unregulierte Zelltod (Nekrose) eingeleitet wird. Sphäroidmodelle wie der hängenden Tropfen, ähneln dem erfindungsgemäßen System nur in der Erzeugung von Sphäroiden. Die Größen der Zellaggre- gate werden jedoch nicht eingeschränkt und es kommt zu unvor- hersagbaren Bedingungen im System, die reproduzierbare Ergebnisse unmöglich machen und den Situationen in vivo nicht entsprechen, genau dieses ist aber der wesentliche Vorteil der vorliegenden Erfindung, in dem insbesondere für die Wirkstoffsuche, die Genexpressionsanalyse oder molekularbiologische Analytik und Diagnostik ein in vivo gleiches System bereitgestellt wird. Verwendung des erfindungsgemäßen SD-Zellkultursystems für die Karzinomforschung, bevorzugt die Prostata? krebsforschung und als Analyseplattform zur Testung oder Suche potenzieller Therapeutika, Figur 11, bzw. als molekularbiologisches System zur Genexpressionsanalyse oder molekularbiologische Analytik in der Karzinomforschung, Figur 11.
Matrigel (gelartiger Proteinmix aus den Zellen eines Engel- breth-Holm-Swarm-Sarkoms der Maus) wird am häufigsten eingesetzt, um 3D-Modelle mit verschiedenen Zelllinien zu generieren. Die Anzahl unbekannter Faktoren und die Schwankungen in der Zusammensetzung von Batch-zu-Batch erschweren aber auch hier die Verlässlichkeit der experimentellen Aussagen. Das Hydrogel wird aus unterschiedlichen Polymeren hergestellt una deren physikalische Eigenschaften wie Porosität, Porengröße und Elastizität sind signifikant schlechter als die der erfindungsgemäßen PEGda-Cryogele . Des Weiteren sind ein verzögertes und geringeres Schwellverhalten, sowie eine Instabilität des PEGda-Hydrogels zu beobachten.
Die Kontrollierbarkeit und Reproduzierbarkeit der Porosität, der gewebeähnlichen Elastizität sowie die Integration extra-^ zellulärer Matrixkomponenten (wie z.B. RGD-Peptid) der Cryo- gele ermöglichen eine in vivo-nahe Mikroumgebung für die 3D- Zellkultivierung .
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 Cryogele aus ' PEGda 575 (A) ' und PEGda 700 (B) sowie ein Hydrogel aus PEGda 700 (C) sowie die Porengröße (G) von 30 Poren der PEGda 575 und PEGda700-Cryogele und (D) Paraffinschnitt der Porenstruktur von PEG- da575 Cryogelen nach Färbung mit Hämatoxylin und (E) Poren in PEGda575 Cryogelen haben einen elliptischen Umfang von mindestens 6β,75μιη bis maximal 371, 65pm.
Fig. 2 die Schwellrate (Sr) von PEGda575 (Ä) und PEGda700
(B) -Cryogelen sowie von PEGda700 Hydrogelen (C) über der Zeit (t in Sekunden) als Dreifachbestimmungen des
Gewichts nach Inkubation in Mg2+- und Ca2+-freier Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) , destilliertem Wasser (H2O dest.) und dem Zellkulturmedium RPMI 1640 + 10% FCS + 1% Pen/Strep + IX L-Glutamin (M) .
Fig. 3 . die Langzeitstabilität der PEGda700-Cryogele bei Inkubation (I) in Zellmedium bei 37 °C für 3 Wochen in Zellkulturmedium mittels Ermittlung der Gewichtsänderung (M in %) zu verschiedenen Zeitpunkten (I in Ta- gen) (T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 3) .
Fig. 4 ■ Zell-Matrix (PEGda700) -Kontakte nach 1 wöchiger Kultur mittels REM.
Fig. 5 Vergleich des relativen, androgenabhängigen Wachstums
(W) von Bag-1L überexprimierenden LNCaP Prostatakarzinomzellen zu einer Vektor-transfizierten Kontrollzelllinie im 2D-Modell. Das Ergebnis zeigt die Mit- telwerte und den Standardfehler dreier in Duplikaten durchgeführter unabhängiger Experimente am Tag 6 mit Ethanol (EtOH) und Dihydrotestosteron (DHT).
Fig. 6 das Tumorvolumen (V) in mm2 der BAG-IL exprimierende
Wildtypzellinie (-·-) und der Vektor-transfizierte Zelllinie ( -0- ) inj iziert in Xenograft-Mausmodelle zu verschiedenen ' Zeitpunkten (I in Tagen). Fig. 7 das Wachstum einer BAG-IL exprimierenden Wildtypzellinie (-·-) und einer Vektor-transfizierten Zelllinie (-0-) ermittelt über die Menge an dsDNA (in relativer Fluoreszenzintensität)' kultiviert in PEGda700-Cryogel analysiert mit pico green assay (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 3) zu verschiedenen Zeitpunkten (I in Tagen) .
Fig. 8 eine Gegenüberstellung der E-Module (in kPa) von PEG- da575, 700 und 6000 sowie dem PEGda700 Hydrogel .
Fig. 9 eine Gegenüberstellung der Porositäten (P) von PEGda
575 und 700 sowie dem PEGda700 Hydrogel. Fig. 10 Die Kultivierung und Behandlung von LNCaP Zellen in der konventionellen 2dimensionalen Zellkultur und in PEGda Cryogelen mit dem Androgen Di-Hydrotestosteron ( DHT , 10-8M)
Fig. 11 Die einmalige Behandlung von LNCaP Zellen, kultiviert in PEGda Cryogelen, mit dem Anti-Androgen Enzaluta- mid.
Zur Untersuchung und Darstellung der Oberflächentopographie, sowie der statistischen Ermittlung der Porengrößen wurde zu¬ nächst die Rasterelektronenmikroskopie (REM) herangezogen.
Nach einer vollständigen Trocknung der Cryo-/Hydrogele wurden, je Synthese, Aufnahmen von 3 Proben durch Rasterelektronenmikroskopie angefertigt. Die Figur 1 zeigt die Porenstruktur, - Verteilung, -große und Homogenität von PEGda575-Cryogelen (A) , PEGda700-Cryogelen (B) und PEGda700-Hydrogelen (C) . Die Matri- zes lassen sich homogen "herstellen, und es sind keine signifikanten Batch-zu-Batch-Abweichungen zu erkennen, was von einer hohen Reproduzierbarkeit zeugt. Des Weiteren zeigen die Auswertungen der Porengröße (G) nach Länge und Breite, dass die Porengröße mit steigendem mittleren Molekulargewicht steigt. (D) Paraffinschnitt der Porenstruktur von PEGda575 Cryogelen nach Färbung mit Hämatoxylin und Darstellung in Graustufen . zur besseren Kontrastierung. Maßstab: 500pm und (E) Poren in PEG- da575 Cryogelen haben einen elliptischen Umfang von mindestens" 66, 75μπι bis maximal 371, 65μπι. (n=100, Berechnung der Ellipsen- umfänge nach der Näherungsformel von Ramanujan)
Wie in Figur 2 gezeigt, weisen PEGda575 und PEGda700-Cryogele eine enorme Schwellrate auf, das innerhalb weniger Sekunden bereits ein stabiles Equilibrium hat. Für PEGda700 konnte ein Quellpotential, das beim 8-fachen des Trockengewichts liegt, gezeigt werden, für PEGda 575 je nach medium beim 4,5-6 fachen des Trockengewichts. Das Hydrogel aus PEGda700 (C) weist eine Schwellrate von weniger als dem 2fachen des Trockengewichts auf. Hydro- und Cryogele aus PEGda 575 (A) und PEGda 700 (B) wurden in definierter Höhe (5mm) synthetisiert und nach Synthese dreimal in destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Hydro- und Cryogele vollständig getrocknet, und ihr Trockengewicht bestimmt. Zur Bestimmung der Schwellrate wurden die Hydro- und Cryogele in destilliertem H2O, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Zellkulturmedium (RPMI1640 + 1% Penicillin/Streptomycin + IX L-Glutamin) für bestimmte Zeiten (5,15,30,60,120,300 s) inkubiert, ihr Gewicht erneut bestimmt und in Triplikaten statistisch ausgewertet. (Auswertung nach Student ' sehen t-Test, Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, n=3) .
Zur Überprüfung der LangzeitStabilität der Cryogele wurden De- gradationsassays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37 °C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Wie in Figur 3 gezeigt, gab es keine signifikanten Veränderungen der PEGda700- Cryogele. PEGda700-Cryogele wurden nach Synthese dreimal in destilliertem H20 gewaschen und ihr Gewicht im Equilibrium be- - stimmt. Um die Langzeitstabilität der PEGda-Cryogele überprüfen zu können, wurden diese unter Standardkulturbedingungen zu bestimmten Zeitpunkten (1,3,7,14,21 Tage) inkubiert (I), ihr Gewicht (M) ausgewogen und in Triplikaten statistisch ausge- wertet. (Auswertung nach student ' sehen t-Test, Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, n=3)
Die Morphologie der LNCaP-Zellen in PEGda-Cryogelen nach 1- wöchiger Kultivierung wurde mittels REM-Aufnahmen durchge¬ führt. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Zellen innerhalb der Cryogelporen sphäroidähnliche Cluster (ca. 60-100 μπι) bilden und die Zellmatrix-Kontakte bereits zu diesem Zeitpunkt erkennbar sind (Figur 4) .
Ausführungsbeispiel 1 - PEGda700-Cryogrele
Es werden zunächst 18 ml Mg2+- und Ca2+-frei.e . Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-/-) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda 700-Lösung vermischt und für 8 min bei -20°C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsini- tiators Ammoniumpersulfat (APS-) und 12 μΐ des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei -20°C einge¬ froren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt das gebildete PEGda700-Cryogel, das dann in gleichmäßige Scheiben von 3 oder 5 mm geschnitten wird.
Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda700- Cryogele konnten über die Angabe des Elastizitäts (E) -Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda700-Cryogele besitzen ein E-Modul von etwa 77 kPa (Figur 8) . Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65-126 kPa) . Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele wurden Quecksilber- Porosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda700-Cryogele eine Porosität von etwa 74% (Figur 9) . Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Students T-Test, Fehlerbalken ent- sprechen der Standardabweichung, n = 15). Zur Überprüfung der Langzeitstabilität der PEGda-700 Cryogele wurden Degradations- .assays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37 °C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Es konnte keine signifikante Veränderung verzeichnet werden.
Figur 10 zeigt, die Kultivierung und Behandlung von LNCaP Zellen in der konventionellen 2dimensionalen Zellkultur und in PEGda Cryogelen mit dem Androgen Di-Hydrotestosteron (DHT, 10- 8M) , resultiert nach 6 Tagen in einem deutlichen Anstieg der Proliferation DHT behandelter Zellen unter beiden Kulturbedingungen. Die Proliferation der DHT behandelten LNCaP Zellen in PEGda Cryogelen ist deutlich niedriger, als bei den entsprechend behandelten Zellen in 2D. (Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler, Auswertung nach dem Student ' sehen t-Test, n=3; p** 0,01). Die Behandlung von Tumorsphäroiden mit dem Androgen DHT resultiert in einem nicht konzentrationsgleichen Zugang der Pr.ostatakarzinomzellen LNCaP zum Hormon DHT. Die Folge ist deren Proliferation in Form eines Gradienten. In diesem Proliferationsgradienten teilen sich die außen liegenden Zellen des Sphäroids stärker als Antwort auf die Behandlung mit DHT als die weiter innen liegenden Zellen. Die Zellen im Inneren teilen sich weniger stark, da deren Kontakt zu DHT durch dessen verminderte Permeation in die Sphäroidmitte limitiert wird. In der 2dimensionalen Zellkultivierung erhält jede Zelle einen uniformen Kontakt zum DHT über das Zellkulturmedium. Dieser Sachverhalt erklärt die höhere Proliferationsrate in 2dimensionalen Zellkultursystemen, verglichen zur Prolife¬ ration von DHT behandelten LNCaP Zellen in PEGda Cryogelen.
Figur 11 zeigt, die Behandlung von LNCaP Zellen, kultiviert in PEGda Cryogelen, mit dem Anti-Androgen Enzalutamid (Xtandi®) (10-5M), resultiert nach einer täglichen Behandlung mit dem Androgen DHT (10-8M), über einen Zeitraum von 6 Tagen, in einer reduzierten Proliferationsrate . (Fehlerbalken repräsentie- ren den Standardfehler, Auswertung nach dem Student ' sehen t- Test, n=3; p*< 0,05)
Ausfühxrangsbeispiel 2 - PEGda575-Cryog-ele
Es werden zunächst 18 ml Mg2+- und Ca2+-freie Phosphat- gepufferte Kochsalzlösung (PBS-/-) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda575-Lösung vermischt und für 8 min bei -20 °C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators 7Ammoniumpersulfat (APS) und 12 μΐ des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei -20 °C eingefroren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt, das gebildete PEGda575-Cryogel, das dann in gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten wird. Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda575-
Cryogele konnten über die Angabe des Elastizitäts (E) -Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda575-Cryogele besit¬ zen ein E-Modul von etwa 76 kPa (Figur 8) . Damit liegen sie innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malig- nem) Prostatagewebe (65-126 kPa) . Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele wurden Quecksilber- Pörosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet wer- den kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda575-Cryogele eine
Porosität von etwa 77 % (Figur 9) . Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Students T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 15). Zur Überprüfung der Langzeitstabilität der PEGda575 Cryogele wurden Degradations- assays durchgeführt. Hierzu werden die Gele in Zellmedium bei 37 °C bis zu 3 Wochen gelagert und in regelmäßigen Zeitabständen das Gewicht ermittelt. Es konnte keine signifikante Verän¬ derung verzeichnet werden. Ausführungsbexspiel 3 - PEGda6000-Cryogele
Es werden zunächst 18 ml Mg2+- und Ca2+-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEG- da6000-Lösung vermischt 'und für 8 min bei -20 °C vorgekühlt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitia¬ tors Ammoniumpersulfat (APS) und 12 μΐ des Polymerisationska- talysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und der Gesamtansatz in einem Gefäß für 3 Stunden bei -20°C eingefroren. Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen und die gebildeten Eiskristalle tauen. Übrig bleibt das gebildete PEGda600Ö-Cryogel, das dann in .gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten wird.
Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda6000- Cryogele können über die Angabe des Elastizitäts (E) -Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda6000-Cryogele besitzen ein E-Modul von etwa llkPa (Figur 8) . Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Cryogele sollten Queck- silber-Porosimeter-Analysen durchgeführt werden, die allerdings aufgrund kollabierender Poren nicht durchgeführt werden konnten .
Ausführungsbeispiel 4 — PEGda.700-Hydrogel
Es werden zunächst 18 ml Mg2+- und Ca2+-freie Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-/-) mit 2 ml einer 1,12 mg/ml PEGda700-Lösung vermischt. Zu dieser Mischung werden dann 100 mg des Polymerisationsinitiators Ammoniumpersulfat (APS) und 12 μΐ des Polymerisationskatalysators Tetramethylethylendiamin (TEMED) hinzugegeben und bei RT auspolymerisiert . Danach wird der Inhalt aus der Spritze entnommen. Das gebildete PEGda700- Hydrogel wird anschließend in gleichmäßige Scheiben von etwa 3 oder 5 mm geschnitten. Die rheologischen Eigenschaften der hergestellten PEGda700-Hydrogele konnten über die Angabe des Elastizitäts (E) -Moduls in Kilo-Pascal (kPa) dargestellt werden. PEGda700-Hydrogele besitzen ein E-Modul von etwa 49kPa (Figur 8) . Damit liegen sie nicht innerhalb des Bereichs der Elastizität von bösartigem (malignem) Prostatagewebe (65-126 kPa) . Zur Charakterisierung der porösen Eigenschaften der Hyd- rogele wurden Quecksilber-Porosimeter-Analysen durchgeführt. Erstgenanntes ermöglicht über Einpressen von Quecksilber in das Gel die Ermittlung der Roh- und Reindichte, womit die Gesamtporosität errechnet werden kann. Hiermit ergab sich z.B. für PEGda700-Hydrogele eine Porosität von etwa 24% (Figur 9) . Die Porosität wurde mit der Washburn Formel berechnet (Stu- dents T-Test, Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung, n = 15) . Auf Grund der geringen Porosität eignen sich die PEG- da700-Hydrogele nicht für die 3D-Zellkultivierung .
Ausfühxrungsbeispiel 5- Kultur von LNCaP-Zellen in PEGda.700- Cryogelen Nach Ermittlung geeigneter Sterilisationstechniken (Verwendung von steril filtriertem PEGda und steril filtriertem PBS sowie Aufbewahrung der Cryogele unter aseptischen Bedingungen in Zellkulturmedium mit 1% Penicillin und Streptomycin) und der notwendigen Zellkulturbedingungen (in 6-well Platten mit 5ml Kulturmedium pro Probe unter 37 °C und 5% C02 mit Mediumwechsel im 2-tägigen Intervall) wurde die Prostatakrebszelllinie LNCaP in den hergestellten PEGda700-Cryogelen kultivieren (Aussaat: 106Zellen/30 μΐ Kulturmedium) . Vitalität, Proliferation und Morphologie wurden untersucht. Nach 14-tägiger Kultivierung in Standarmedien wurden Lebend-Tod-Färbungen zur Ermittlung der Zellvitalität durchgeführt, die eine Lebendrate von min. 80% im Vergleich zur Negativkontrolle (behandelt mit Methanol und UV-Licht) . Die Morphologie der LNCaP-Zellen in PEGda-Cryogelen nach 2-wöchiger Kultivierung wurde mittels Immunfluoreszenz- färbungen des cytoskeletalen Markers α-Tubulin und des epithe¬ lialen Markers EP-CAM durchgeführt. Hierbei konnte festge¬ stellt werden, dass die Zellen innerhalb der Cryogelporen sphäroidähnliche Cluster (ca. 60-100 μπι) bilden. Die Zellmatrix-Kontakte sind in REM-Aufnahmen bereits nach 1-wöchiger . Kultivierung erkennbar (Figur 4) . LNCaP-Zellen bilden Zell- Matrix-Kontakte in PEGda-Cryogelen aus. Um die Ausbildung von Zell-Matrix-Kontakten während der Zellkultivierung zu beobachte, wurden LNCaP-Zellen für 1, 2 und 3 Wochen (hier: 1 Woche) in PEGda-Cryogelen kultiviert, anschließend dreimal in PBS (- /-) gewaschen und in Glutaraldehyd-Lösung (1% in PBS) fixiert. Die Visualisierung der Zell-Matrix-Kontakte erfolgte unter dem Rasterelektronenmikroskop.
Ausführungsbeispiel 6 - Interaktion von Koaktivatoren wie Bag- IL mit de Androgenrezeptor (AR)
Bag-IL, ein Koaktivator des Androgenrezeptors in Prostatatumoren, beeinflusst stark das basale wie auch das androgenabhängige Wachstum. Obwohl mehrere Studien gezeigt haben, dass eine Überexpression von Bag-IL das Prostatatumorzellwachstum fördert, und der Effekt in unabhängigen Tumorversuchen in Mäusen verifiziert werden konnte, zeigen Bag-IL überexprimierende LNCaP-Prostatatumorzellen nur marginale Wachstumsunterschiede im Vergleich zur vektortransfizierten Kontrolle. Diese Unter¬ schiede sind wahrscheinlich auf die experimentellen Bedingungen zurückzuführen, da den Zellkultursystemen die Mikroumge- bung des Tumors fehlt. Zellen, kultiviert auf Plastik, versa¬ gen oft darin, die in vivp-Funktion zu reflektieren. Die gezeigten Versuche mit LNCaP-Prostatatumorzellen, in denen die Wachstumseigenschaften der Zellen in konventionaler 2D- Zellkultur mit denen im Xenografttumor und mit der 3D-Kultur im PEGda700-Cryogel direkt verglichen wurden, zeigen klar, dass diese Struktur eine weitreichende Annäherung an die im Xenpgraft vorhandenen Bedingungen darstellt. Es konnte gezeigt werden, dass eine BAG-lL-expremierende LNCaP-Zelllinie signifikant stärker proliferiert als die nicht-exprimierende Zell¬ linie. Beide Zelllinien wurden 2 Wochen in PEGda700-Cryogelen kultiviert . LNCaP Zellen (Wildtyp und Vektorkontrolle) wurden in einer Konzentration von 10A6 Zellen / 30 μΐ in PEGda-Cryogelen aus¬ gesät und für einen Zeitraum von 2 Wochen kultiviert.' Nach be¬ stimmten Zeitpunkten (0,1, 3, 7, und 14 Tagen)' wurden die Gele geerntet und eine DNA-Isolierung durchgeführt. Der Nachweis der doppelsträngigen DNA erfolgte durch den Fluoreszenzfarbstoff pico green und wurde als Maß für die proliferative Akti¬ vität verwendet. (Auswertung nach student ' sehen t-Test,
Fehlerbalken repräsentieren Standardfehler, p*< 0,05,
p***<0, 001; n=3) .
Wachstumsversuche mit transfizierten LNCaP-Prostatatumorzellen zeigen, dass diese den Tumormarker Bag-IL stabil überexprimie- ren. Die BAG-IL exprimierende Zelllinie weist signifikante Un¬ terschiede im Wachstumsverhalten im Xenograft-Tierversuch im Vergleich zum Wachstum in der herkömmlichen 2D-Kultur auf Pet¬ rischalen. Während in der 2D-Kultur nach 6 Tagen nur marginale Unterschiede im Wachstum sowohl in An- wie auch in Abwesenheit des für das Wachstum der Tumorzellen wichtigen Androgens
Dihydrotestosteron nachweisbar ist (Figur 5), zeigt sich im Tierversuch ein deutlicher Unterschied (Figur 6) , der die Bedingungen im Patienten deutlicher wiederspiegelt. Im PEGda700- Cryogel proliferiert dieselbe Bag-IL überexprimierende Zelllinie signifikant stärker als die vektortransfizierte Kontrollzelllinie (Figur 7) . Der Verlauf der Wachstumskurve reprodu¬ ziert die Ergebnisse des Tumorwachstums in vivo.
Damit wurde der biologische Beweis erbracht, dass Zellkultursysteme mit PEGda70'0-Cryogelen, die gleichen Ergebnisse lie- fern wie Xenograf"t-Mausmodelle und somit als adäquater Ersatz für Tierversuche eingesetzt werden können.
Vergleichsexperiment 1: 2D-Kultur der LNCaP Prostatatnmorzell- linie
Die Zellen wurden trypsiniert, einmal mit PBS gewaschen und in Hungermedium (RPMI ohne Phenolrot mit 3% CCS) in einer Zelldichte von lx 104Zellen/qcm auf 6well-Platten ausgesät. Nach 48h (Tag 1) wurde die Zellzahl mittels einer Neubauerzählkammer bestimmt und das Medium auf RPMI ohne Phenorot, 2 mM Glu- tamin, 100 U Penicillin, 100 μg Streptomycin gewechselt und mit 10-8 M Dihydrotestosterone bzw der gleichen Menge (1 μΐ/ml) Ethanol als Lösemittelkontrolle versetzt. Die Hormon bzw. Ethanolzugabe wurde an den Tagen 3 und 5 wiederholt ohne das Medium zu wechseln. Die Bestimmung der Zellzahl wurde dann am Tag 6 wieder unter Zuhilfenahme einer Neubauer Zählkammer durchgeführt. Die Wachstumsrate ergibt sich aus dem Quotient der Zellzahl am Tag 6 durch die Zellzahl am Tag 1. Die Wachs-' tumsrate am Tag 6 beträgt für den Vektor: 0,86 (ETOH) ; 1,47 (DHT) und für BAG-1L: 0,75 (ETOH); 1,53 (DHT). Vergleichsexperiment2 : Xenograft-Kultur der LNCaP Prostatat - morzellllnie
Für die Xenografttumorexperimente wurden lx 106 Zellen in 100 μΐ RPMI- Medium versetzt mit 10% FCS mit 100 μΐ Matrigel gemischt und subkutan in die Flanke einer Nacktmaus injiziert und das Tumorwachstum zweimal wöchentlich mittels einer
Schieblehre in drei Dimensionen gemessen und das Volumen unter Annahme eines Eliptoiden mittels der Formel V=4/3n*rl*r2*r3 bestimmt.
Tag 26 29 34 37 41 44 47 50 54
VekStar 1,83 2, 60 3, 37 •3, 61 4,28 5,22 6, 20 tor f
BAG1 Star 4, 67 9, 62 14, 5 17, 5 19,0 21,0 21,8 24,5 L t 7 2 8 2 1 2 Literatur
Jung, V. et al . Urologe 47, 199-1204 (2008).
Zergel, T. et al. Eur Urol 33, 414-423 (1998)
Winter, S. et al. Pros Cancer Pros Dis 6, 204-211 (2003)
Ahmad, I. et al. Exp Rev in mol med 10:16, 1-20 (2008)
Wells, R.G. Hepatology 47:4, 1394-1400 (2008)
Meli, L. et al . Biomaterials 33, 9087-9096 (2012)
Hutmacher, D.W. et al. Trends in Biotech 28:3, 125-133 (2009) Yamada, K.M. et al. Cell.130:24, 601-610 (2007)
Takagi, A. et al. Anticancer Research 27: 45-54 (2007)
Härma, V. et al. PLoS' ONE 5:5, 1-17 (2010)
Griffith, L. G. et al. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 211-224 (2006) Nyga, A. et al. J. Cell Commun Signal 5, .239-248 (2011)
Levental, I. et al. Soft Matter 3, 299-306 (2007)
Soofi, S.S. et al. J Struct Biol. 167:3, 216.-219 (2009)
Holliday, D.L. et al. Breast Cancer Res 11 (2009)
Cunliffe, D. et al. Eur Polym J 40, 5-25 (2004)
Chen, R. 'et al. Biomaterials 30, 1954-1961 (2009)
Villanueva, I. et al. Acta Biomat 5, 2832-2846 (2009)
Chevalier, E. et al. J Pharm Sei 97, 1135-54 (2008)

Claims

Ansprüche
1. 3D-Zellkultursys'tem aufweisend ein Cryogel aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat (PEGda).
2. 3D-Zellkultursystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass der Anteil des mindestens einem PEGda im Cryogel mindestens 80% beträgt.
■3. 3D-Zellkultursystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass mindestens ein PEGda mit einer mittleren Molmasse von 200 g/mol bis 10.000 g/mol eingesetzt wird.
4. 3D-Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet dass das Cryogel eine Gesamtporosität von 50 - 90 % aufweist.
5. 3D-Zellkultursystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet dass das Cryogel ein Elastizitäts- Modul im Bereich von 60-130kPa aufweist.
6. Verfahren zur Herstellung eines 3D-Zellkultursystems aus einem Polyethylenglykol-diacrylat-Cryogel mit den Verfahrensschritten:
a) Bereitstellen einer vorgekühlten Mischung aus mindestens einem Polyethylenglykol-diacrylat und einer Pufferlösung,
b) Zugabe mindestens eines Polymerisationsinitiators und mindestens eines Polymerisationskatalysators, c) Gefrieren der Mischung,
d) Entnahme des Cryogels,
e) Aufnahme des Cryogels in' Zellkulturmedium,
f) Entnahme des 3D-Zellkultursystems .
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei als Polymerisationsiniti- ator Ammoniumperoxidsulfat im Verfahrensschritt b) zugefügt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei als Polymerisati- onskatalysator Tetramethylethylendiamin im Verfahrensschritt b) zugefügt wird.
Verwendung des 3D-Zellkultursystems nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 5 als Modell für. die Prostatakrebsforschung urid als Analyseplattform zur Testung potenzieller Therapeutika zur Behandlung von Prostatakrebs.
10. Verwendung des 3D-Zellkultursystems nach Anspruch 9 zur Kultivierung mindestens einer Krebszelllinie ausgewählt aus der Liste LNCaP, PC3, DU145,VCaP, R PE, 22Rvl
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US8709452B2 (en) * 2011-07-15 2014-04-29 The Regents Of The University Of California Synthetic bone grafts

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