EP3137492B1 - Method for producing l-amino acids in corynebacteria using a glycine cleavage system - Google Patents

Method for producing l-amino acids in corynebacteria using a glycine cleavage system Download PDF

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EP3137492B1
EP3137492B1 EP15717860.9A EP15717860A EP3137492B1 EP 3137492 B1 EP3137492 B1 EP 3137492B1 EP 15717860 A EP15717860 A EP 15717860A EP 3137492 B1 EP3137492 B1 EP 3137492B1
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    • C12Y104/04002—Glycine dehydrogenase (decarboxylating) (1.4.4.2)
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    • C12Y108/01—Oxidoreductases acting on sulfur groups as donors (1.8) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.8.1)
    • C12Y108/01004—Dihydrolipoyl dehydrogenase (1.8.1.4), i.e. lipoamide-dehydrogenase
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    • C12Y201/02—Hydroxymethyl-, formyl- and related transferases (2.1.2)
    • C12Y201/0201—Aminomethyltransferase (2.1.2.10)
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01181—Lipoyl(octanoyl) transferase (2.3.1.181)
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    • C12Y208/01—Sulfurtransferases (2.8.1)
    • C12Y208/01008—Lipoyl synthase (2.8.1.8)

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of L-amino acids in corynebacteria, in which a glycine-cleaving system is used.
  • Corynebacterium species are known, these species are usually used bacteria of the species Corynebacterium glutamicum, as this species has been found to be particularly advantageous for the production of L-amino acids.
  • the yield of L-amino acid can be further increased, since the glycine-cleaving system can largely prevent the formation of the unwanted by-product L-glycine.
  • the suppression of the formation of L-glycine or the degradation of excess L-glycine is of particular importance in the production of L-methionine, since L-glycine is obtained as an equimolar by-product.
  • a glycine-cleaving system consists of several subunits, namely the subunits GcvP, GcvT and GcvH. It is a multi-enzyme complex that catalyzes the oxidative decarboxylation and deamination of glycine to carbon dioxide, ammonium ions, and N 5-10 methylene tetrahydrofolate.
  • the glycine dehydrogenase GcvP is a pyridoxal phosphate-containing decarboxylase that releases carbon dioxide and leaves the aminomethyl compound bound to pyridoxal phosphate.
  • the H protein GcvH is a lipoamide-containing aminomethyltransferase.
  • the enzyme GcvT catalyzes the nucleophilic attack of the aminomethyllipoamide by tetrahydrofolate to form N 5-10 -methylene-tetrahydrofolate and release of ammonium ions, leaving completely reduced lipoamide bound to GcvH.
  • Glycine-cleaving systems do not occur in all corynebacteria, but have so far only been described for very few corynebacteria.
  • the production strain C. glutamicum preferred for amino acid production does not possess its own glycine-cleaving system.
  • the glycine-cleaving system from C. jeikeium ( WO 2008/101857 ).
  • a serious disadvantage here is that C. jeikeium is a pathogenic organism.
  • Another disadvantage is that in order to reduce the unwanted by-product glycine, a heterologous construct had to be prepared.
  • the primary object of the present invention was therefore to provide a novel glycine-cleaving system, preferably a glycine-cleaving system which does not originate from a pathogenic organism, the glycine-cleaving system preferably being suitable for incorporation into other corynebacteria, in particular C. glutamicum, suitable is.
  • Another object of the present invention was to provide a corynebacterium which is inherently capable of producing L-amino acids and moreover has its own glycine-cleaving system, so that the production of a heterologous construct - such as in the case of C. glutamicum - not required.
  • Corynebacterium humireducens which is not pathogenic, has its own glycine-cleaving system which differs structurally substantially from the glycine-cleaving systems described hitherto.
  • the strain C. humireducens is described for the first time by Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61, 882-887 ). He was deposited with the DSMZ under the accession number DSM 45392, his 16S rRNA was deposited with EMBL and has accession number GQ421281. The parent strain is a halotolerant, alkaliphilic, humic acid reducing bacterium.
  • a glycine-cleaving system according to the invention preferably comprises at least two, preferably all three, of the abovementioned polypeptides (a) to (c).
  • the glycine-cleaving system also broadly includes the enzymes LpdA, LplA, LipA, LipB and GcvH.
  • Dihydrolipoamide dehydrogenase (LpdA) reoxidizes the GcvH-bound lipoamide.
  • Lipoate protein ligase A catalyzes the lipoylation of GcvH.
  • Lipoic acid synthase catalyzes the synthesis of lipoic acid.
  • Lipoyl [acyl carrier protein] protein N-lipoyltransferase (LipB) catalyzes the transfer of lipoic acid to GcvH.
  • GcvL is a dihydrolipoyl dehydrogenase.
  • a glycine-cleaving system comprises at least two, three or four, preferably all five, of the abovementioned polypeptides.
  • these compounds may also be added to the reaction medium, for example in amounts of up to 15 mM.
  • stringent conditions is meant according to the invention washing at a salt concentration of 1 x SSC and 0.1 wt .-% SDS at a temperature of 80 ° C.
  • the present invention also relates to vectors, in particular cloning and expression vectors, which contain at least one polynucleotide according to the invention.
  • vectors can be incorporated correspondingly into microorganisms, in particular into coryneform bacteria, in particular the genus Corynebacterium, or Enterobacteriaceae, especially the genus Escherichia.
  • Vectors of the invention may contain one or more polynucleotides of the invention.
  • a preferred vector according to the invention contains at least one polynucleotide which codes for an enzyme according to the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH.
  • One Particularly preferred vector contains polynucleotides which code for all three enzymes according to the invention GcvP, GcvT and GcvH.
  • Vectors according to the invention preferably have a suitable promoter and / or suitable promoters and optionally further regulatory elements which enable the expression of polynucleotides according to the invention in the recombinant bacterium, preferably the recombinant Corynebacterium.
  • Polynucleotides according to the invention can furthermore, for the purpose of expression of the encoded genes, also be incorporated into the genome of microorganisms, in particular into the genome of coryneform bacteria, in particular those of the genus Corynebacterium, or into the genome of Enterobacteriaceae, in particular the genus Escherichia.
  • Another subject of the present invention are accordingly also recombinant microorganisms, preferably bacteria, especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium, particularly preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, and Enterobacteriaceae, especially those of the genus Escherichia, the at least one Inventive enzyme and / or at least one polynucleotide according to the invention and / or at least one vector according to the invention and / or a glycine-cleaving system according to the invention and / or polynucleotides encoding a glycine-cleaving system according to the invention.
  • bacteria especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium, particularly preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, and Enterobacteriaceae, especially those of the genus Escherichia
  • a preferred object here are recombinant Corynebakterien, in particular the species C. humireducens and the species C. glutamicum, the at least one enzyme of the invention, preferably all the enzymes of the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH, and / or coding for these polynucleotides and / or contain at least one vector comprising these polynucleotides.
  • a particular object of the present invention are in particular recombinant microorganisms, preferably bacteria, especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium with the exception of the species C. humireducens, especially those of the species C. glutamicum, the at least one enzyme of the invention and / or at least a polynucleotide according to the invention and / or at least one vector according to the invention and / or a glycine-cleaving system according to the invention and / or polynucleotides coding for a glycine-cleaving system according to the invention.
  • a preferred object here are recombinant corynebacteria with the exception of the species C. humireducens, in particular the species C. glutamicum, which contains at least one enzyme according to the invention, preferably all enzymes according to the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH and / or polynucleotides coding for them and / or or at least one vector comprising these polynucleotides.
  • a "recombinant microorganism” or “recombinant bacterium” is to be understood according to the invention as a microorganism or bacterium which has been subjected to at least one genetic engineering measure.
  • the genetic engineering measure may be, in particular, a targeted or undirected mutation, the incorporation of a foreign gene, and / or the overexpression or attenuation of a host or alien gene.
  • a recombinant microorganism according to the invention or a recombinant bacterium according to the invention is characterized by the overexpression or attenuation of at least one gene.
  • Corynebacterium efficiens such as the type strain DSM44549
  • Corynebacterium glutamicum such as the type strain ATCC13032 or the strain R
  • Corynebacterium ammoniagenes such as the strain ATCC6871
  • Corynebacterium humireducens such as strain DSM 45392
  • Corynebacterium pekinese such as strain CGMCC no. 5,361th
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-alanine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-lysine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • the term "attenuation" in the present invention means reducing the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein (polypeptide) or an enzyme encoded by a corresponding DNA in a microorganism, as compared with the parent strain (parent strain) or wild-type strain.
  • the parent strain is the strain on which the mitigation was performed.
  • the attenuation may be achieved by reducing the expression of a polypeptide, for example by using a weak promoter, or by using an allele which codes for a polypeptide having a lower activity and optionally combining these measures.
  • the attenuation can also be achieved by completely inhibiting the expression of the polypeptide, for example by switching off the coding gene.
  • strains are preferably used in the production of threonine, which accordingly contain a feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom FBR ).
  • Hom FBR homoserine dehydrogenase
  • leucine production preferably strains are used, which accordingly contain a feedback-resistant isopropyl malate synthase (LeuA FBR ).
  • LeuA FBR feedback-resistant isopropyl malate synthase
  • strains which accordingly contain a feedback-resistant ornithine carbamoyltransferase (ArgF FBR ).
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions of sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid , Stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerin, methanol and ethanol, and organic acids such as acetic acid or lactic acid.
  • sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions of sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid , Stearic acid and linoleic acid
  • Phosphoric acid potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the organic by-products include substances which are produced by the microorganisms used in the fermentation in addition to the desired L-amino acid and optionally excreted. These include sugars such as trehalose.
  • the partial (> 0% to ⁇ 80%) to complete (100%) or almost complete ( ⁇ 80% to ⁇ 100%) removal of the water (measure a)) is also referred to as drying.
  • Example 1 Alanine and valine production by C. humireducens
  • the type strain of C. humireducens was cultivated in a shake flask approach.
  • the C. humireducens strain was incubated in 10 ml of BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours.
  • 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 660 of 0.2 and cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 48 hours.
  • the type strain of C. humireducens (DSM 45392) was cultured in the shake flask approach.
  • the C. humireducens strain was incubated in 10 ml of BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours.
  • 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 660 of 0.2 and cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 48 hours.
  • the starting concentration of L-glutamate in the medium was 0.78 (+/- 0.1) g / l.
  • Glycine was a minor by-product.

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien, in welchem ein Glycin spaltendes System eingesetzt wird.The present invention relates to a process for the production of L-amino acids in corynebacteria, in which a glycine-cleaving system is used.

Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren, in welchen Bakterien der Gattung Corynebacterium eingesetzt werden, sind dem Fachmann bekannt.Processes for the production of L-amino acids in which bacteria of the genus Corynebacterium are used are known to the person skilled in the art.

Obwohl zahlreiche Corynebacterium-Arten bekannt sind, werden in diesen Verfahren üblicherweise Bakterien der Art Corynebacterium glutamicum eingesetzt, da sich diese Art als besonders vorteilhaft für die Produktion von L-Aminosäuren herausgestellt hat.Although numerous Corynebacterium species are known, these species are usually used bacteria of the species Corynebacterium glutamicum, as this species has been found to be particularly advantageous for the production of L-amino acids.

Ferner wurde herausgefunden, dass durch die Verwendung eines Glycin spaltenden Systems (GCV) die Ausbeute an L-Aminosäure weiter gesteigert werden kann, da durch das Glycin spaltende System die Bildung des unerwünschten Nebenprodukts L-Glycin weitgehend unterbunden werden kann. Die Unterdrückung der Bildung von L-Glycin bzw. der Abbau überschüssigen L-Glycins ist insbesondere bei der Produktion von L-Methionin von besonderer Bedeutung, da hier L-Glycin als äquimolares Nebenprodukt anfällt.Furthermore, it has been found that by using a glycine-cleaving system (GCV), the yield of L-amino acid can be further increased, since the glycine-cleaving system can largely prevent the formation of the unwanted by-product L-glycine. The suppression of the formation of L-glycine or the degradation of excess L-glycine is of particular importance in the production of L-methionine, since L-glycine is obtained as an equimolar by-product.

Ein Glycin spaltendes System besteht aus mehreren Untereinheiten, nämlich den Untereinheiten GcvP, GcvT und GcvH. Es handelt sich um einen Multi-Enzym-Komplex, der die oxidative Decarboxylierung und Deaminierung von Glycin zu Kohlendioxid, Ammoniumionen und N5-10-Methylen-tetrahydrofolat katalysiert.A glycine-cleaving system consists of several subunits, namely the subunits GcvP, GcvT and GcvH. It is a multi-enzyme complex that catalyzes the oxidative decarboxylation and deamination of glycine to carbon dioxide, ammonium ions, and N 5-10 methylene tetrahydrofolate.

Bei der Glycin-Dehydrogenase GcvP handelt es sich um eine Pyridoxalphosphat enthaltende Decarboxylase, die Kohlendioxid freisetzt und die Aminomethyl-Verbindung gebunden an Pyridoxalphosphat zurücklässt.The glycine dehydrogenase GcvP is a pyridoxal phosphate-containing decarboxylase that releases carbon dioxide and leaves the aminomethyl compound bound to pyridoxal phosphate.

Bei dem H-Protein GcvH handelt es sich um eine Lipoamid enthaltende Aminomethyltransferase.The H protein GcvH is a lipoamide-containing aminomethyltransferase.

Das Enzym GcvT katalysiert den nukleophilen Angriff des Aminomethyllipoamids durch Tetrahydrofolat unter Ausbildung von N5-10-methylen-tetrahydrofolat und Freisetzung von Ammoniumionen, wobei vollständig reduziertes Lipoamid gebunden an GcvH zurückbleibt.The enzyme GcvT catalyzes the nucleophilic attack of the aminomethyllipoamide by tetrahydrofolate to form N 5-10 -methylene-tetrahydrofolate and release of ammonium ions, leaving completely reduced lipoamide bound to GcvH.

Glycin spaltende Systeme kommen nicht in allen Corynebakterien vor, sondern sind bisher nur für sehr wenige Corynebakterien beschrieben worden. So besitzt beispielsweise insbesondere der für die Aminosäureproduktion bevorzugte Produktionsstamm C. glutamicum kein eigenes Glycin spaltendes System. Um die Vorteile eines Glycin spaltenden Systems für C. glutamicum nutzbar zu machen, musste ein solches daher aus einem anderen Corynebakterium in C. glutamicum eingebaut und heterolog exprimiert werden. Verwendet hierfür wurde bislang das Glycin spaltende System aus C. jeikeium ( WO 2008/101857 ). Ein gravierender Nachteil ist hierbei, dass es sich bei C. jeikeium um einen pathogenen Organismus handelt. Weiterer Nachteil ist, dass zwecks Abbau des unerwünschten Nebenprodukts Glycin ein heterologes Konstrukt hergestellt werden musste.Glycine-cleaving systems do not occur in all corynebacteria, but have so far only been described for very few corynebacteria. For example, in particular, the production strain C. glutamicum preferred for amino acid production does not possess its own glycine-cleaving system. In order to make use of the advantages of a glycine-splitting system for C. glutamicum, such had to be incorporated from another corynebacterium in C. glutamicum and heterologously expressed. For this purpose, the glycine-cleaving system from C. jeikeium ( WO 2008/101857 ). A serious disadvantage here is that C. jeikeium is a pathogenic organism. Another disadvantage is that in order to reduce the unwanted by-product glycine, a heterologous construct had to be prepared.

Primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein neues Glycin spaltendes System zur Verfügung zu stellen, vorzugsweise ein Glycin spaltendes System, das nicht aus einem pathogenen Organismus stammt, wobei das Glycin spaltende System vorzugsweise zum Einbau in andere Corynebakterien, insbesondere C. glutamicum, geeignet ist.The primary object of the present invention was therefore to provide a novel glycine-cleaving system, preferably a glycine-cleaving system which does not originate from a pathogenic organism, the glycine-cleaving system preferably being suitable for incorporation into other corynebacteria, in particular C. glutamicum, suitable is.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Corynebakterium zur Verfügung zu stellen, das von Hause aus dazu in der Lage ist, L-Aminosäuren zu produzieren und darüber hinaus über ein eigenes Glycin spaltendes System verfügt, so dass die Herstellung eines heterologen Konstrukts - wie im Falle von C. glutamicum - nicht erforderlich ist.Another object of the present invention was to provide a corynebacterium which is inherently capable of producing L-amino acids and moreover has its own glycine-cleaving system, so that the production of a heterologous construct - such as in the case of C. glutamicum - not required.

Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise gefunden, dass die Art Corynebacterium humireducens, die nicht pathogen ist, über ein eigenes Glycin spaltendes System verfügt, das sich strukturell wesentlich von den bisher beschriebenen Glycin spaltenden Systemen unterscheidet.According to the invention, it has now surprisingly been found that the species Corynebacterium humireducens, which is not pathogenic, has its own glycine-cleaving system which differs structurally substantially from the glycine-cleaving systems described hitherto.

Überraschenderweise wurde ferner gefunden, dass das Glycin spaltende System aus Corynebacterium humireducens sehr effektiv ist, so dass im Wildtypstamm Glycin, das ein unerwünschtes Nebenprodukt bei der Aminosäuresynthese darstellt, in der Zelle nicht oder nur in geringer Menge akkumuliert. Durch Verstärkung eines erfindungsgemäßen Glycin spaltenden Systems, insbesondere durch Überexpression, kann die Unterdrückung der Glycin-Nebenproduktbildung entsprechend noch weiter verbessert werden. Insbesondere kann durch Überexpression eines erfindungsgemäßen Glycin spaltenden Systems in anderen Mikroorganismen, insbesondere in C. glutamicum, die Glycin-Nebenproduktbildung ebenfalls wirksam unterdrückt werden.Surprisingly, it has also been found that the glycine-cleaving system of Corynebacterium humireducens is very effective, so that in the wild-type strain glycine, which is an undesirable by-product in amino acid synthesis, is not or only slightly accumulated in the cell. By enhancing a glycine-cleaving system according to the invention, in particular by overexpression, the suppression of glycine by-product formation can be further improved accordingly. In particular, glycine by-product formation can also be effectively suppressed by overexpressing a glycine-cleaving system of the present invention in other microorganisms, particularly C. glutamicum.

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass C. humireducens bereits von Hause aus dazu in der Lage ist, L-Aminosäuren, insbesondere L-Alanin, L-Valin und L-Glutaminsäure, über den eigenen Bedarf hinaus zu produzieren, so dass C. humireducens einen L-Aminosäure-Produktionsstamm mit einem homologen Glycin spaltenden System darstellt, der insbesondere als Ausgangspunkt für die Entwicklung weiterer Produktionsstämme, die über ein wirtseigenes Glycin spaltenden System verfügen, herangezogen werden kann.Furthermore, it has surprisingly been found that C. humireducens is already inherently capable of producing L-amino acids, in particular L-alanine, L-valine and L-glutamic acid, beyond its own requirements, so that C. humireducens has a L-amino acid production strain with a homologous glycine-cleaving system, which can be used in particular as a starting point for the development of other production strains which have an intrinsic glycine-cleaving system.

Der Stamm C. humireducens wird zum ersten Mal beschrieben durch Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61, 882-887 ). Er wurde bei der DSMZ hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 45392, seine 16S rRNA wurde bei EMBL hinterlegt und hat die Zugangsnummer GQ421281. Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um ein halotolerantes, alkaliphiles, Huminsäure reduzierendes Bakterium.The strain C. humireducens is described for the first time by Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2011), 61, 882-887 ). He was deposited with the DSMZ under the accession number DSM 45392, his 16S rRNA was deposited with EMBL and has accession number GQ421281. The parent strain is a halotolerant, alkaliphilic, humic acid reducing bacterium.

Weitere Informationen über C. humireducens sind folgenden Publikationen zu entnehmen: Wu et al. (Microb. Biotechnol. (2013), 6(2), 141-149 ), Lin et al. (Bioresour. Technol. (2013), 136, 302-308 ).More information about C. humireducens can be found in the following publications: Wu et al. (Microb Biotechnol. (2013) 6 (2), 141-149 ) Lin et al. (Bioresour, Technol. (2013), 136, 302-308 ).

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die Enzyme eines Glycin spaltenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

  1. a) ein Enzym GcvP mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40,
  2. b) ein Enzym GcvT mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42,
  3. c) ein Enzym GcvH mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38.
A first subject of the present invention are therefore the enzymes of a glycine-cleaving system selected from the group consisting of:
  1. a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
  2. b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
  3. c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 38.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Glycin spaltendes System umfassend die Enzyme GcvP, GcvT und GcvH, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eines der folgenden Polypeptide umfasst:

  1. a) ein Enzym GcvP mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40,
  2. b) ein Enzym GcvT mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42,
  3. c) ein Enzym GcvH mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38.
A further subject of the present invention is therefore a glycine-cleaving system comprising the enzymes GcvP, GcvT and GcvH, characterized in that it comprises at least one of the following polypeptides:
  1. a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
  2. b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
  3. c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 38.

Vorzugsweise umfasst ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System hierbei mindestens zwei, vorzugsweise alle drei, der zuvor genannten Polypeptide (a) bis (c).A glycine-cleaving system according to the invention preferably comprises at least two, preferably all three, of the abovementioned polypeptides (a) to (c).

Besonders bevorzugt ist hierbei ein Glycin spaltendes System, das folgende drei Polypeptide umfasst:

  1. a) ein Enzym GcvP mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 oder 98 % zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40,
  2. b) ein Enzym GcvT mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 oder 98 % zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42,
  3. c) ein Enzym GcvH mit einer Sequenzidentität von mindestens 95 oder 98 % zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38.
Particularly preferred here is a glycine-cleaving system which comprises the following three polypeptides:
  1. a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
  2. b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
  3. c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 38.

Zu dem Glycin spaltenden System gehören im weiteren Sinne auch die Enzyme LpdA, LplA, LipA, LipB und GcvH.The glycine-cleaving system also broadly includes the enzymes LpdA, LplA, LipA, LipB and GcvH.

Die Dihydrolipoamid-Dehydrogenase(LpdA) reoxidiert das an GcvH gebundene Lipoamid.Dihydrolipoamide dehydrogenase (LpdA) reoxidizes the GcvH-bound lipoamide.

Die Lipoat-Protein-Ligase A (LplA) katalysiert die Lipoylierung des GcvH.Lipoate protein ligase A (LplA) catalyzes the lipoylation of GcvH.

Die Liponsäure-Synthase (LipA) katalysiert die Synthese von Liponsäure.Lipoic acid synthase (LipA) catalyzes the synthesis of lipoic acid.

Die Lipoyl-[Acyl-Carrier-Protein]-Protein-N-Lipoyltransferase (LipB) katalysiert den Transfer der Liponsäure auf das GcvH.Lipoyl [acyl carrier protein] protein N-lipoyltransferase (LipB) catalyzes the transfer of lipoic acid to GcvH.

Bei GcvL handelt es sich um eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase.GcvL is a dihydrolipoyl dehydrogenase.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System daher weiterhin mindestens ein weiteres Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

  1. a) ein Enzym LipA, vorzugsweise ein Enzym LipA mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 48,
  2. b) ein Enzym LipB, vorzugsweise ein Enzym LipB mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 50,
  3. c) ein Enzym Lpd, vorzugsweise ein Enzym Lpd mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 52,
  4. d) ein Enzym LplA, vorzugsweise ein Enzym LplA mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 94,
  5. e) ein Enzym GcvL, vorzugsweise ein Enzym GcvL mit einer Sequenzidentität von mindestens 80 %, vorzugsweise mindestens 85 oder 90 %, insbesondere mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 96.
In a preferred embodiment, therefore, a glycine-cleaving system according to the invention further comprises at least one further enzyme selected from the group consisting of:
  1. a) an enzyme LipA, preferably an enzyme LipA having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 48 .
  2. b) an enzyme LipB, preferably an enzyme LipB having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 50 .
  3. c) an enzyme Lpd, preferably an enzyme Lpd having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 52 .
  4. d) an enzyme LplA, preferably an enzyme LplA having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 94 .
  5. e) an enzyme GcvL, preferably an enzyme GcvL having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, in particular at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 96 ,

In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System hierbei mindestens zwei, drei oder vier, vorzugsweise alle fünf, der zuvor genannten Polypeptide.In a particularly preferred embodiment according to the invention, a glycine-cleaving system according to the invention comprises at least two, three or four, preferably all five, of the abovementioned polypeptides.

Alternativ oder zusätzlich zum Einsatz entsprechender Enzyme, die für eine ausreichende Synthese von Liponsäure und/oder Liponamid sorgen, können diese Verbindungen auch dem Reaktionsmedium zugegeben werden, beispielsweise in Mengen von bis zu 15 mM.Alternatively or in addition to the use of appropriate enzymes which provide sufficient synthesis of lipoic acid and / or lipoamide, these compounds may also be added to the reaction medium, for example in amounts of up to 15 mM.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die für erfindungsgemäße Enzyme und/oder ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System kodieren. Diese Polynukleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

  1. a) ein Polynukleotid (gcvP), das für das Enzym GcvP kodiert und eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise mindestens 80 oder 85 %, insbesondere mindestens 90 oder 95 %, vor allem mindestens 98 oder 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 3162 gemäß SEQ ID NO: 39 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 3162 gemäß SEQ ID NO: 39 ist;
  2. b) ein Polynukleotid (gcvT), das für das Enzym GcvT kodiert und eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise mindestens 80 oder 85 %, insbesondere mindestens 90 oder 95 %, vor allem mindestens 98 oder 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1404 gemäß SEQ ID NO: 41 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 1404 gemäß SEQ ID NO: 41 ist;
  3. c) ein Polynukleotid (gcvH), das für das Enzym GcvH kodiert und eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise mindestens 80 oder 85 %, insbesondere mindestens 90 oder 95 %, vor allem mindestens 98 oder 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 699 gemäß SEQ ID NO: 37 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 699 gemäß SEQ ID NO: 37 ist.
Another object of the present invention are also polynucleotides which encode enzymes according to the invention and / or a glycine-cleaving system according to the invention. These polynucleotides are selected from the group consisting of:
  1. a) a polynucleotide (gcvP) which codes for the enzyme GcvP and has a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, in particular at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of Position 301 to 3162 according to SEQ ID NO: 39 and / or under stringent conditions with a polynucleotide hybridized, the sequence of which is complementary to the sequence from position 301 to 3162 according to SEQ ID NO: 39;
  2. b) a polynucleotide (gcvT) coding for the enzyme GcvT and having a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, in particular at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of Position 301 to 1404 according to SEQ ID NO: 41 and / or hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence from position 301 to 1404 according to SEQ ID NO: 41;
  3. c) a polynucleotide (gcvH) which codes for the enzyme GcvH and has a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, in particular at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of Position 301 to 699 according to SEQ ID NO: 37 and / or hybridized under stringent conditions with a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence from position 301 to 699 according to SEQ ID NO: 37.

Unter "stringenten Bedingungen" ist erfindungsgemäß zu verstehen Waschen bei einer Salzkonzentration von 1 x SSC und 0,1 Gew.-% SDS bei einer Temperatur von 80°C.By "stringent conditions" is meant according to the invention washing at a salt concentration of 1 x SSC and 0.1 wt .-% SDS at a temperature of 80 ° C.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind entsprechend auch Vektoren, insbesondere Klonierungs- und Expressionsvektoren, die mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid enthalten. Diese Vektoren können entsprechend in Mikroorganismen, insbesondere in coryneforme Bakterien, vor allem der Gattung Corynbebacterium, oder Enterobacteriaceae, vor allem der Gattung Escherichia, eingebaut werden.Accordingly, the present invention also relates to vectors, in particular cloning and expression vectors, which contain at least one polynucleotide according to the invention. These vectors can be incorporated correspondingly into microorganisms, in particular into coryneform bacteria, in particular the genus Corynebacterium, or Enterobacteriaceae, especially the genus Escherichia.

Erfindungsgemäße Vektoren können ein oder mehrere erfindungsgemäße Polynukleotide enthalten. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Vektor enthält mindestens ein Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes Enzym ausgewählt aus GcvP, GcvT und GcvH kodiert. Ein besonders bevorzugter Vektor enthält Polynukleotide, die für alle drei erfindungsgemäßen Enzyme GcvP, GcvT und GcvH kodieren.Vectors of the invention may contain one or more polynucleotides of the invention. A preferred vector according to the invention contains at least one polynucleotide which codes for an enzyme according to the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH. One Particularly preferred vector contains polynucleotides which code for all three enzymes according to the invention GcvP, GcvT and GcvH.

Erfindungsgemäße Vektoren verfügen vorzugsweise über einen geeigneten Promotor und/oder geeignete Promotoren sowie gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, die die Expression erfindungsgemäßer Polynukleotide in dem rekombinanten Bakterium, vorzugsweise dem rekombinanten Corynebakterium, ermöglichen.Vectors according to the invention preferably have a suitable promoter and / or suitable promoters and optionally further regulatory elements which enable the expression of polynucleotides according to the invention in the recombinant bacterium, preferably the recombinant Corynebacterium.

Erfindungsgemäße Polynukleotide können weiterhin zwecks Expression der kodierten Gene auch in das Genom von Mikroorganismen, insbesondere in das Genom von coryneformen Bakterien, insbesondere solchen der Gattung Corynebacterium, oder in das Genom von Enterobacteriaceae, vor allem der Gattung Escherichia, eingebaut werden.Polynucleotides according to the invention can furthermore, for the purpose of expression of the encoded genes, also be incorporated into the genome of microorganisms, in particular into the genome of coryneform bacteria, in particular those of the genus Corynebacterium, or into the genome of Enterobacteriaceae, in particular the genus Escherichia.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind entsprechend auch rekombinante Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien, vor allem solche der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art C. humireducens oder C. glutamicum, sowie Enterobacteriaceae, vor allem solche der Gattung Escherichia, die mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System und/oder für ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System kodierende Polynukleotide enthalten.Another subject of the present invention are accordingly also recombinant microorganisms, preferably bacteria, especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium, particularly preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, and Enterobacteriaceae, especially those of the genus Escherichia, the at least one Inventive enzyme and / or at least one polynucleotide according to the invention and / or at least one vector according to the invention and / or a glycine-cleaving system according to the invention and / or polynucleotides encoding a glycine-cleaving system according to the invention.

Ein bevorzugter Gegenstand sind hierbei rekombinante Corynebakterien, insbesondere der Art C. humireducens und der Art C. glutamicum, die mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym, vorzugsweise alle erfindungsgemäßen Enzyme, ausgewählt aus GcvP, GcvT und GcvH, und/oder für diese kodierende Polynukleotide und/oder mindestens einen diese Polynukleotide umfassenden Vektor enthalten.A preferred object here are recombinant Corynebakterien, in particular the species C. humireducens and the species C. glutamicum, the at least one enzyme of the invention, preferably all the enzymes of the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH, and / or coding for these polynucleotides and / or contain at least one vector comprising these polynucleotides.

Ein besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere auch rekombinante Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien, vor allem solche der Gattung Corynebacterium mit Ausnahme der Art C. humireducens, insbesondere solche der Art C. glutamicum, die mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System und/oder für ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System kodierende Polynukleotide enthalten.A particular object of the present invention are in particular recombinant microorganisms, preferably bacteria, especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium with the exception of the species C. humireducens, especially those of the species C. glutamicum, the at least one enzyme of the invention and / or at least a polynucleotide according to the invention and / or at least one vector according to the invention and / or a glycine-cleaving system according to the invention and / or polynucleotides coding for a glycine-cleaving system according to the invention.

Ein bevorzugter Gegenstand sind hierbei rekombinante Corynebakterien mit Ausnahme der Art C. humireducens, insbesondere der Art C. glutamicum, die mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym, vorzugsweise alle erfindungsgemäßen Enzyme, ausgewählt aus GcvP, GcvT und GcvH, und/oder für diese kodierende Polynukleotide und/oder mindestens einen diese Polynukleotide umfassenden Vektor enthalten.A preferred object here are recombinant corynebacteria with the exception of the species C. humireducens, in particular the species C. glutamicum, which contains at least one enzyme according to the invention, preferably all enzymes according to the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH and / or polynucleotides coding for them and / or or at least one vector comprising these polynucleotides.

Unter einem "rekombinanten Mikroorganismus" bzw. "rekombinanten Bakterium" ist erfindungsgemäß ein Mikroorganismus bzw. Bakterium zu verstehen, das mindestens einer gentechnischen Maßnahme unterzogen wurde. Bei der gentechnischen Maßnahme kann es sich hierbei insbesondere um eine zielgerichtete oder ungerichtete Mutation, den Einbau eines wirtsfremden Gens und/oder die Überexpression oder Abschwächung eines wirtseigenen oder wirtsfremden Gens handeln. Vorzugsweise zeichnet sich ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bzw. ein erfindungsgemäßes rekombinantes Bakterium durch die Überexpression oder Abschwächung mindestens eines Gens aus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bzw. ein erfindungsgemäßes rekombinantes Bakterium durch die Überexpression mindestens eines erfindungsgemäßen Enzyms und/oder des für dieses kodierenden Polynukleotids und/oder die Überexpression eines erfindungsgemäßen Glycin spaltenden Systems bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide aus.A "recombinant microorganism" or "recombinant bacterium" is to be understood according to the invention as a microorganism or bacterium which has been subjected to at least one genetic engineering measure. The genetic engineering measure may be, in particular, a targeted or undirected mutation, the incorporation of a foreign gene, and / or the overexpression or attenuation of a host or alien gene. Preferably, a recombinant microorganism according to the invention or a recombinant bacterium according to the invention is characterized by the overexpression or attenuation of at least one gene. In a particularly preferred embodiment, a recombinant microorganism according to the invention or a recombinant bacterium according to the invention is characterized by the overexpression of at least one enzyme according to the invention and / or the polynucleotide coding for it and / or the overexpression of a glycine-cleaving system of the invention or the polynucleotides coding for it ,

Unter "geringer Menge" ist in Bezug auf die Glycin-Bildung vorzugsweise eine Menge von höchstens 0,3 g/l, vorzugsweise von höchstens 0,2 oder 0,1 g/l, besonders bevorzugt von höchstens 0,05 oder höchstens 0,03 g/l, jeweils bezogen auf den Gehalt an akkumuliertem Glycin in der Zelle und/oder im Fermentationsmedium nach Beendigung der Fermentation zu verstehen.By " small amount " with respect to glycine formation is preferably an amount of at most 0.3 g / L, preferably at most 0.2 or 0.1 g / L, particularly preferably at most 0.05 or at most 0, 03 g / l, in each case based on the content of accumulated glycine in the cell and / or to understand in the fermentation medium after completion of the fermentation.

Innerhalb der Gattung Corynebacterium werden erfindungsgemäß Stämme bevorzugt, die auf folgenden Arten beruhen: Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Typstamm DSM44549, Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Typstamm ATCC13032 oder der Stamm R, Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm ATCC6871, Corynebacterium humireducens, wie zum Beispiel der Stamm DSM 45392, sowie Corynebacterium pekinese, wie zum Beispiel der Stamm CGMCC No. 5361.Within the genus Corynebacterium strains are preferred according to the invention based on the following types: Corynebacterium efficiens, such as the type strain DSM44549, Corynebacterium glutamicum, such as the type strain ATCC13032 or the strain R, Corynebacterium ammoniagenes, such as the strain ATCC6871, Corynebacterium humireducens, such as strain DSM 45392, and Corynebacterium pekinese, such as strain CGMCC no. 5,361th

Besonders bevorzugt sind die Arten Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium humireducens. Sofern im Rahmen dieser Anmeldung vom Stamm Corynebacterium humireducens die Rede ist, handelt es sich vorzugsweise um den Stamm DSM 45392 oder um einen davon abgeleiteten Stamm.Particularly preferred are the species Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium humireducens. If in the context of this application of the strain Corynebacterium humireducens is preferably the strain DSM 45392 or a strain derived therefrom.

Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Bezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020. Der Begriff "Micrococcus glutamicus" für Corynebacterium glutamicum war ebenfalls gebräuchlich. Einige Vertreter der Art Corynebacterium efficiens wurden im Stand der Technik auch als Corynebacterium thermoaminogenes bezeichnet, wie zum Beispiel der Stamm FERM BP-1539.Some representatives of the species Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other names. These include, for example: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and Brevibacterium divaricatum ATCC14020. The term "Micrococcus glutamicus" for Corynebacterium glutamicum was also common. Some representatives of the species Corynebacterium efficiens have also been referred to in the art as Corynebacterium thermoaminogenes, such as strain FERM BP-1539.

Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen der Gruppe der coryneformen Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983 )), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p 115-142 . In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK ), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996 )), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991 )), Fudou et al (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1127-1131 (2002 )) und in der US-A-5,250,434 .Information on the taxonomic classification of strains of the group of coryneform bacteria can be found among others Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983 )), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p. 115-142 , In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin / Cummins Publishing Co., London, UK ) Fighter and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996 )), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41, 255-260 (1991 )), Fudou et al (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1127-1131 (2002 )) and in the US-A-5,250,434 ,

Stämme mit der Bezeichnung "ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung "DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung "NRRL" können von der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung "FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung "CGMCC" können vom China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Beijing, China) bezogen werden.Strains designated "ATCC" can be obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, Va, USA). Strains designated "DSM" can be obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). Strains designated "NRRL" can be obtained from the Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Ill., US). Strains named "FERM" can be purchased from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan). Strains named "CGMCC" are available from the China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Beijing, China).

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym und/oder ein für dieses kodierendes Polynukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Glycin spaltendes System und/oder für dieses kodierende Polynukleotide und/oder ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes rekombinantes Bakterium, insbesondere ein erfindungsgemäßes rekombinantes coryneformes Bakterium, besonders bevorzugt ein erfindungsgemäßes rekombinantes Corynebakterium, vor allem ein Corynebacterium der Art. C. humireducens oder C. glutamicum, eingesetzt wird. In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform wird hierbei das mindestens eine erfindungsgemäße Polynukleotid in überexprimierter Form eingesetzt.Another object of the present invention is also a method for overproduction of an L-amino acid, characterized in that in this method at least one enzyme according to the invention and / or a polynucleotide encoding this and / or a glycine-cleaving system according to the invention and / or for this coding polynucleotides and / or a recombinant microorganism according to the invention, preferably a recombinant bacterium according to the invention, in particular a recombinant coryneform bacterium according to the invention, particularly preferably a recombinant corynebacterium according to the invention, above all a Corynebacterium of the species C. humireducens or C. glutamicum. In a preferred embodiment according to the invention, the at least one polynucleotide according to the invention is used in over-expressed form.

Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren ein Glycin spaltendes System umfassend die Enzyme GcvP, GcvT und GcvH eingesetzt wird, wobei das Glycin spaltende System mindestens eines der erfindungsgemäßen Enzyme GcvP, GcvT und GcvH umfasst, und/oder in diesem Verfahren für die Enzyme eines Glycin spaltenden Systems GcvP, GcvT und GcvH kodierende Polynukleotide eingesetzt werden, wobei diese Polynukleotide mindestens eines der erfindungsgemäßen Polynukleotide gcvP, gcvT und gcvH umfassen, und/oder ein rekombinantes Corynebakterium, vorzugsweise der Art C. humireducens oder C. glutamicum, eingesetzt wird, das mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym, vorzugsweise alle drei erfindungsgemäßen Enzyme, ausgewählt aus GcvP, GcvT und GcvH und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid, vorzugsweise alle drei erfindungsgemäßen Polynukleotide, ausgewählt aus gcvP, gcvT und gcvH enthält.A preferred subject matter of the present invention is a process for the overproduction of an L-amino acid, characterized in that a glycine-cleaving system comprising the enzymes GcvP, GcvT and GcvH is used in this process, the glycine-cleaving system of at least one of the enzymes GcvP , GcvT and GcvH, and / or polynucleotides encoding GcvP, GcvT and GcvH glycine-cleavage system enzymes in this method, said polynucleotides comprising at least one of the polynucleotides gcvP, gcvT and gcvH of the invention, and / or a recombinant corynebacterium , preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, which comprises at least one enzyme according to the invention, preferably all three enzymes according to the invention selected from GcvP, GcvT and GcvH and / or at least one polynucleotide according to the invention, preferably all three polynucleotides according to the invention contains gcvP, gcvT and gcvH.

Ein besonders bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren ein Glycin spaltendes System eingesetzt wird, das die erfindungsgemäßen Enzyme GcvP, GcvT und GcvH und/oder für diese Enzyme kodierende Polynukleotide enthält, und/oder in diesem Verfahren ein rekombinantes Corynebacterium, vorzugsweise der Art. C. humireducens oder C. glutamicum, eingesetzt wird, das ein solches Glycin spaltendes System und/oder für dieses kodierende Polynukleotide enthält.A particularly preferred subject of the present invention is a process for the overproduction of an L-amino acid, characterized in that in this process a glycine-cleaving system is used which contains the enzymes of the invention GcvP, GcvT and GcvH and / or polynucleotides encoding these enzymes , and / or in this method a recombinant Corynebacterium, preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, is used which contains such a glycine-cleaving system and / or for this coding polynucleotides.

Unter "L-Aminosäure" sind erfindungsgemäß insbesondere die proteinogenen L-Aminosäuren zu verstehen.According to the invention, "L-amino acid" is to be understood as meaning in particular the proteinogenic L-amino acids.

Die L-Aminosäure ist hierbei vorzugsweise ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L-Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin, besonders bevorzugt ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin. Besonders bevorzugt handelt es sich um L-Methionin.The L-amino acid here is preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of the aspartate family , in particular L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine, particularly preferably selected from L-alanine, L-valine, L-glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine. Particularly preferred is L-methionine.

Die Überproduktion der L-Aminosäure erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise in C. humireducens oder C. glutamicum.The overproduction of the L-amino acid is carried out according to the invention preferably in C. humireducens or C. glutamicum.

Erfindungsgemäße Verfahren zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, dass nur geringe Mengen an Glycin-Nebenprodukt anfallen. Glycin fällt in erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise in einer Menge von weniger als 0,2 g/l, insbesondere in einer Menge von weniger als 0,1 g/l, besonders bevorzugt in einer Menge von weniger als 0,05 g/l an.Processes according to the invention are preferably characterized in that only small amounts of glycine by-product are obtained. Glycine is preferably present in the process according to the invention in an amount of less than 0.2 g / l, in particular in an amount of less than 0.1 g / l, more preferably in an amount of less than 0.05 g / l.

Unter "Überproduzieren" bzw. "Überproduktion" ist erfindungsgemäß in Bezug auf die L-Aminosäure zu verstehen, dass die Mikroorganismen die L-Aminosäure über ihren eigenen Bedarf hinaus produzieren und entweder in der Zelle anreichern oder in das sie umgebende Nährmedium ausscheiden und dort akkumulieren. Vorzugsweise sind die Mikroorganismen hierbei dazu in der Lage ≥ (mindestens) 0,25 g/l, ≥ 0,5 g/l, ≥ 1,0 g/l, ≥ 1,5 g/l, ≥ 2,0 g/l, ≥ 4 g/l oder ≥ 10 g/l der betreffenden L-Aminosäure in ≤ (maximal) 120 Stunden, ≤ 96 Stunden, ≤ 48 Stunden, ≤ 36 Stunden, ≤ 24 Stunden oder ≤ 12 Stunden in der Zelle oder im Nährmedium anzureichern bzw. zu akkumulieren.By "overproduction" or "overproduction" in the present invention with respect to the L-amino acid is meant that the microorganisms produce the L-amino acid beyond its own needs and either accumulate in the cell or precipitate into and accumulate in the surrounding nutrient medium , In this case, the microorganisms are preferably capable of ≥ (at least) 0.25 g / l, ≥ 0.5 g / l, ≥ 1.0 g / l, ≥ 1.5 g / l, ≥ 2.0 g / l, ≥ 4 g / l or ≥ 10 g / l of the relevant L-amino acid in ≤ (maximum) 120 hours, ≤ 96 hours, ≤ 48 hours, ≤ 36 hours, ≤ 24 hours or ≤ 12 hours in the cell or To enrich or accumulate nutrient medium.

Erfindungsgemäße rekombinante Mikroorganismen, in die erfindungsgemäße Polynukleotide und/oder erfindungsgemäße Vektoren eingebracht wurden, besitzen in einer bevorzugten Ausführungsform bereits vor dem Einbau der erfindungsgemäßen Polynukleotide und/oder Vektoren die Fähigkeit eine L-Aminosäure überzuproduzieren. Bei den Ausgangsstämmen handelt es sich bevorzugt um Stämme, die durch Mutagenese und Selektion, durch rekombinante DNA-Techniken oder durch eine Kombination beider Methoden hergestellt wurden.Recombinant microorganisms according to the invention in which polynucleotides according to the invention and / or vectors according to the invention have been introduced have, in a preferred embodiment, the ability to overproduce an L-amino acid even before the incorporation of the polynucleotides and / or vectors according to the invention. The parent strains are preferably strains which have been produced by mutagenesis and selection, by recombinant DNA techniques or by a combination of both methods.

Es ist offensichtlich und bedarf keiner weiteren Erklärungen, dass man zu einem erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismus auch dadurch gelangen kann, indem man einen Wildstamm, in welchem ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder ein erfindungsgemäßer Vektor enthalten ist oder eingebaut wurde, anschließend durch geeignete weitere genetische Maßnahmen dazu veranlasst, die L-Aminosäure zu produzieren bzw. die L-Aminosäure-Produktion zu erhöhen.It is obvious and requires no further explanation that a recombinant microorganism according to the invention can also be obtained by adding a wild strain, in which a polynucleotide according to the invention and / or a vector according to the invention is contained or incorporated, by suitable further genetic measures causes the L-amino acid to be produced and to increase the L-amino acid production.

Überexpression der entsprechenden Polynukleotide bzw. Polypeptide kann die Aminosäureproduktion bestimmter L-Aminosäuren positiv beeinflusst werden.Overexpression of the corresponding polynucleotides or polypeptides, the amino acid production of certain L-amino acids can be positively influenced.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso:

  • a) eine Threonindehydratase (IlvA, EC 4.3.1.19) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 106 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • b) die Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (IlvB), die eine Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 98, aufweist, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • c) eine Isomeroreduktase (IlvC, EC 1.1.1.86) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 100 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • d) eine Dihydroxy-acid Dehydratase (IlvD, EC 4.2.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 102 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • e) eine Transaminase (IlvE, EC 2.6.1.42) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 104 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • f) eine Acetolactat-Synthase (IlvH, EC 2.2.1.6) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 122 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • g) eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.11) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 118 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • h) eine Pantothenat-Synthase (PanC, EC 6.3.2.1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 120 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • i) eine Glutamat-Dehydrogenase (Gdh) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 124 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • j) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 126 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • k) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 128 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • l) eine Glutamat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 130 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • m) eine Isocitrat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 132 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • n) eine Aconitat-Hydrase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 134 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • o) eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 136 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • p) eine Aminopeptidase C (PepC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 138 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • q) eine Pyruvat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 140 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • r) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 142 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • s) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 144 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • t) eine Enolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 146 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • u) eine 2,3-Bisphosphoglycerat-abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 148 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • v) eine Phosphoglycerat-Kinase (Pgk) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 150 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • w) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 152 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • x) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 154 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • y) eine Triosephosphat-Isomerase (TpiA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 156 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • z) eine Fructosebisphosphataldolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 158 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • aa) eine 1-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 160 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • bb) eine 6-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 162 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • cc) eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • dd) eine Cystein-Synthase (CBS, CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ee) eine Cystathionin-Betalyase (AecD) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ff) eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Asd, EC 1.2.1.11) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • gg) die kleinere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • hh) die größere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnF) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ii) eine Serin-Acetyltransferase (CysE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • jj) eine Cystein-Synthase (CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • kk) eine Serin-Hydroxymethyltransferase (GlyA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 44 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ll) eine gegebenenfalls feedbackresistente Homoserin-Dehydrogenase (Hom, EC 1.2.1.11) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • mm) eine gegebenenfalls feedbackresistente Aspartat-Kinase (LysC, EC 2.7.2.4) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • nn) eine Cystathionin-gamma-Synthase (MetB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 56 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • oo) eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • pp) eine Homoserin-O-Acetyltransferase (MetX) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 60 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • qq) eine O-Acetylhomoserin-Lyase (MetY) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 62 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • rr) eine gegebenenfalls feedbackresistente Pyruvat-Carboxylase (Pyc, EC 6.4.1.1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ss) eine gegebenenfalls feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 66 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • tt) eine Phosphoserin-Phosphatase (SerB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 68 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • uu) eine Phosphoserin-Aminotransferase (SerC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 70 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • vv) die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysD) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 74 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ww) eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase (CysH) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 76 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • xx) eine Sulfit-Reduktase (Cysl) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 78 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • yy) eine NADPH-abhängige Glutamatsynthase-beta-Kette (CysJ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 80 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • zz) die große Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysN) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 82 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • aaa) eine Cystathionin-beta-Synthase (CysY) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 84, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • bbb) ein Sulfat-Transporter (CysZ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 86 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
  • ccc) eine 5-Methyltetrahydropteroyl-triglutamat-homocystein-Methyltransferase (MetE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 88 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ddd) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 (PtH1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 90 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • eee) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 (PtH2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 92, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • fff) eine Diaminopimelat-Dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 202 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • ggg) eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA, EC 4.1.1.20) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 164 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • hhh) eine Aspartat-Aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 166, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • iii) ein L-Lysin-Exporter (LysE, Lysin-Efflux-Permease) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 168, sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
  • jjj) eine Dihydropicolinat-Reduktase (DapB, EC 1.3.1.26) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 170 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • kkk) eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 172 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • lll) die Zwf-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Zwf, EC 1.1.1.49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 186 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • mmm) die OpcA-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (OpcA, EC 1.1.1.49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 188 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  • nnn) eine Phosphogluconsäure-Dehydrogenase (Gnd, EC 1.1.1.44) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 174 sowie für diese kodierende Polynukleotide.
The subject of the present invention is therefore likewise:
  • a) a threonine dehydratase (IlvA, EC 4.3.1.19) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 106 and polynucleotides coding therefor,
  • b) the subunit of an acetolactate synthase (IlvB) which has a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 98, as well as polynucleotides coding therefor,
  • c) an isomeroreductase (IlvC, EC 1.1.1.86) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 100 and polynucleotides coding therefor,
  • d) a dihydroxy acid dehydratase (IlvD, EC 4.2.1.9) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 102 and polynucleotides coding therefor,
  • e) a transaminase (IlvE, EC 2.6.1.42) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 104 as well as polynucleotides coding for these,
  • f) an acetolactate synthase (IlvH, EC 2.2.1.6) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 122 and polynucleotides coding therefor,
  • g) a 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.11) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 118 as well as polynucleotides coding for them .
  • h) a pantothenate synthase (PanC, EC 6.3.2.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 120 as well as polynucleotides coding therefor,
  • i) a glutamate dehydrogenase (Gdh) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 124 as well as polynucleotides coding therefor,
  • j) a glutamine synthetase (glutamine synthetase 1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 126 and polynucleotides coding therefor,
  • k) a glutamine synthetase (glutamine synthetase 2) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 128 and polynucleotides coding therefor,
  • l) a glutamate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 130 and polynucleotides coding for these,
  • m) an isocitrate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 132 and polynucleotides coding therefor,
  • n) an aconitate hydrase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 134 as well as polynucleotides coding therefor,
  • o) a citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 136 and polynucleotides coding therefor,
  • p) an aminopeptidase C (PepC) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 138 as well as polynucleotides coding therefor,
  • q) a pyruvate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 140 and polynucleotides coding therefor,
  • r) a pyruvate kinase (pyruvate kinase 1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 142 and polynucleotides coding therefor,
  • s) a pyruvate kinase (pyruvate kinase 2) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 144 as well as polynucleotides coding therefor,
  • t) an enolase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 146 as well as polynucleotides coding therefor,
  • u) a 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase (GpmA) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 148 and polynucleotides coding therefor,
  • v) a phosphoglycerate kinase (Pgk) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 150 and polynucleotides coding therefor,
  • w) a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 152 as well as polynucleotides coding therefor .
  • x) a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 154 and polynucleotides coding therefor .
  • y) a triosephosphate isomerase (TpiA) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 156 and polynucleotides coding therefor,
  • z) a fructose bisphosphate aldolase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 158 and polynucleotides coding therefor,
  • aa) a 1-phosphofructokinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 160 and polynucleotides coding therefor,
  • bb) a 6-phosphofructokinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 162 and polynucleotides coding for these,
  • cc) a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4 and polynucleotides coding therefor,
  • dd) a cysteine synthase (CBS, CysK) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 22 and polynucleotides coding therefor,
  • ee) a cystathionine-beta (AecD) with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 26 as well as polynucleotides coding for these,
  • ff) an aspartate semialdehyde dehydrogenase (Asd, EC 1.2.1.11) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 28 and polynucleotides coding therefor,
  • gg) the smaller subunit of a branched-chain amino acid transporter (BrnE) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 30 and polynucleotides encoding the same,
  • hh) the larger subunit of a branched-chain amino acid transporter (BrnF) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 32 as well as polynucleotides coding therefor,
  • ii) a serine acetyltransferase (CysE) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 34 as well as polynucleotides coding therefor,
  • jj) a cysteine synthase (CysK) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 36 as well as polynucleotides coding therefor,
  • kk) a serine hydroxymethyltransferase (GlyA) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 44 and polynucleotides coding for these,
  • II) an optionally feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom, EC 1.2.1.11) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 46 as well as polynucleotides coding therefor,
  • mm) an optionally feedback-resistant aspartate kinase (LysC, EC 2.7.2.4) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 54 and polynucleotides coding therefor,
  • nn) a cystathionine gamma synthase (MetB) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 56 as well as polynucleotides coding therefor,
  • oo) a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MetF) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 58 as well as polynucleotides coding therefor,
  • pp) a homoserine O-acetyltransferase (MetX) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 60 and polynucleotides coding therefor,
  • qq) an O-acetyl homoserine lyase (MetY) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 62 as well as polynucleotides coding therefor,
  • rr) an optionally feedback-resistant pyruvate carboxylase (Pyc, EC 6.4.1.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 64 and polynucleotides coding therefor,
  • ss) an optionally feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66 as well as polynucleotides coding therefor,
  • t) a phosphoserine phosphatase (SerB) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 68 as well as polynucleotides coding therefor,
  • uu) a phosphoserine aminotransferase (SerC) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 70 as well as polynucleotides coding therefor,
  • vv) the subunit of a sulphate adenylyltransferase (CysD) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 74 as well as polynucleotides coding therefor,
  • ww) an adenosine phosphosulfate reductase (CysH) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 76 and polynucleotides coding for these,
  • xx) a sulfite reductase (Cysl) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 78 and polynucleotides coding therefor,
  • yy) an NADPH-dependent glutamate synthase beta chain (CysJ) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 80 and polynucleotides coding therefor,
  • zz) the large subunit of a sulphate adenylyltransferase (CysN) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 82 as well as polynucleotides coding therefor,
  • aaa) a cystathionine-beta synthase (CysY) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 84, as well as polynucleotides coding for these,
  • bbb) a sulfate transporter (CysZ) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 86 as well as polynucleotides coding therefor,
  • ccc) a 5-methyltetrahydropteroyl triglutamate homocysteine methyltransferase (MetE) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 88 and polynucleotides coding therefor,
  • ddd) a peptidyl-tRNA-hydrolase 1 (PtH1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 90 as well as polynucleotides coding therefor,
  • eee) a peptidyl-tRNA-hydrolase 2 (PtH2) with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 92, as well as polynucleotides coding for these,
  • fff) a diaminopimelate dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 202 as well as polynucleotides coding therefor,
  • ggg) a diaminopimelate decarboxylase (LysA, EC 4.1.1.20) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 164 and polynucleotides coding therefor,
  • hhh) an aspartate aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 166, as well as polynucleotides coding for these,
  • iii) an L-lysine exporter (LysE, lysine efflux permease) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 168, as well as polynucleotides coding therefor,
  • yyj) a dihydropicolinate reductase (DapB, EC 1.3.1.26) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 170 as well as polynucleotides coding therefor,
  • kkk) a glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 172 and polynucleotides coding therefor,
  • lll) the Zwf subunit of a glucose-6-phosphate dehydrogenase (Zwf, EC 1.1.1.49) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 186 and for these coding polynucleotides,
  • mmm) the OpcA subunit of a glucose-6-phosphate dehydrogenase (OpcA, EC 1.1.1.49) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 188 and for these coding polynucleotides,
  • nnn) a phosphogluconic acid dehydrogenase (Gnd, EC 1.1.1.44) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 174 as well as polynucleotides coding for them.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Vektoren, die die zuvor genannten Polynukleotide enthalten, sowie rekombinanten Mikroorganismen, die die zuvor genannten Enzyme und/oder Polynukleotide und/oder Vektoren enthalten. Das betreffende Polypeptid und/oder Polynukleotid liegt hierbei in einer bevorzugten Ausführungsform in dem Mikroorganismus in überexprimierter Form vor. Bei den rekombinanten Mikroorganismen handelt es sich hierbei vorzugsweise um coryneforme Bakterien, vor allem um Corynebakterien, insbesondere solchen der Art C. humireducens oder C. glutamicum.Another subject of the present invention are also vectors containing the aforementioned polynucleotides, as well as recombinant microorganisms containing the aforementioned enzymes and / or polynucleotides and / or vectors. In a preferred embodiment, the polypeptide and / or polynucleotide in question is present in the microorganism in overexpressed form. The recombinant microorganisms are preferably coryneform bacteria, in particular corynebacteria, in particular those of the species C. humireducens or C. glutamicum.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, vorzugsweise ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L-Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin, besonders bevorzugt ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin, vor allem zur Überproduktion von L-Methionin, in welchem mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei, drei oder vier, der genannten Polynukleotide in überexprimierter Form vorliegen, wobei das Verfahren vorzugsweise in Corynebakterien, insbesondere solche der Art. C. humireducens oder C. glutamicum, durchgeführt wird.The present invention therefore also provides a process for the overproduction of an L-amino acid, preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L -Arginine, and L-amino acids of the aspartate family, in particular L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine, more preferably selected from L-alanine, L-valine, L Glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine, especially for the overproduction of L-methionine, in which at least one, preferably at least two, three or four, of said polynucleotides in over-expressed form, the method preferably in Corynebacteria, especially those of the species C. humireducens or C. glutamicum, is performed.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch weitere Polynukleotide aus C. humireducens sowie die durch diese Polynukleotide kodierten Polypeptide. Durch Ausschaltung oder Abschwächung der entsprechenden Polynukleotide bzw. Polypeptide kann die Aminosäureproduktion bestimmter L-Aminosäuren positiv beeinflusst werden.Another subject of the present invention are also other polynucleotides from C. humireducens and the polypeptides encoded by these polynucleotides. By eliminating or attenuating the corresponding polynucleotides or polypeptides, the amino acid production of certain L-amino acids can be positively influenced.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polypeptide ausgewählt aus der folgenden Liste:

  1. a) eine Threonin-Synthase (ThrC, EC 4.2.3.1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 108 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  2. b) eine Isopropylmalat-Synthase (LeuA, EC 2.3.3.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 110 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  3. c) eine Isopropylmalat-Dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 112 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  4. d) die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), die Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 114 bzw. SEQ ID NO: 116 aufweisen sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  5. e) die Untereinheiten einer Succinyl-CoA-Ligase (SucCD, EC 6.2.1.5) mit Sequenzidentitäten von jeweils mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 198 bzw. SEQ ID NO: 200 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  6. f) eine DNA-Bindungsdomäne vom Typ HTH tetR (McbR) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  7. g) eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  8. h) eine Glucose-6-phosphat-lsomerase (Pgi, EC 5.3.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  9. i) eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  10. j) ein D-Methionin bindendes Lipoprotein (MetQ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 sowie für dieses kodierende Polynukleotide,
  11. k) ein Methionin-Transporter (MetP) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
  12. l) ein ATP-abhängiger Methionin-Transporter (MetN) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
  13. m) eine S-Adenosylmethionin-Synthase (MetK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  14. n) eine Methionin-Importsystem-Permease (Metl) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  15. o) eine 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC 4.3.3.7) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  16. p) eine Carboxylat-Amin-Ligase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  17. q) eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase (Mqo, EC 1.1.99.16) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 176 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  18. r) die E1p-Untereinheit eines Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (AceE, EC 1.2.4.1) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 178 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  19. s) eine Citrat-Synthase (GltA, EC 4.1.3.7) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 180 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  20. t) eine Malat-Dehydrogenase (Mdh, EC 1.1.1.37) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 182 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
  21. u) eine UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamat-2,6-diaminopimelat-Ligase (MurE, EC 6.3.2.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 184, sowie für diese kodierende Polynukleotide.
The present invention therefore also relates to polypeptides selected from the following list:
  1. a) a threonine synthase (ThrC, EC 4.2.3.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 108 and polynucleotides coding therefor,
  2. b) an isopropyl malate synthase (LeuA, EC 2.3.3.13) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 110 and polynucleotides coding therefor,
  3. c) an isopropyl malate dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 112 and polynucleotides coding therefor,
  4. d) the subunits of an isopropyl malate isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), the sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequences according to SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 116 and have for these coding polynucleotides,
  5. e) the subunits of a succinyl CoA ligase (SucCD, EC 6.2.1.5) with sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequences according to SEQ ID NO: 198 or SEQ ID NO: 200 as well as for these coding polynucleotides,
  6. f) a DNA binding domain of the type HTH tetR (McbR) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 2 as well as polynucleotides coding therefor,
  7. g) a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4 and polynucleotides coding for these,
  8. h) a glucose-6-phosphate isomerase (Pgi, EC 5.3.1.9) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6 as well as polynucleotides coding therefor,
  9. i) a phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 8 as well as polynucleotides coding therefor,
  10. j) a D-methionine binding lipoprotein (MetQ) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 10 as well as polynucleotides coding therefor,
  11. k) a methionine transporter (MetP) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 12 as well as polynucleotides coding therefor,
  12. l) an ATP-dependent methionine transporter (MetN) with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 14 as well as polynucleotides coding therefor,
  13. m) an S-adenosylmethionine synthase (MetK) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 16 and polynucleotides coding therefor,
  14. n) a methionine import system permease (Metl) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 18 as well as polynucleotides coding therefor,
  15. o) a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (DapA, EC 4.3.3.7) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 20 as well as polynucleotides coding therefor,
  16. p) a carboxylate-amine ligase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 24 and polynucleotides coding therefor,
  17. q) a malate quinone oxidoreductase (Mqo, EC 1.1.99.16) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 176 and polynucleotides coding therefor,
  18. r) the E1p subunit of a pyruvate dehydrogenase complex (AceE, EC 1.2.4.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 178 and polynucleotides coding therefor .
  19. s) a citrate synthase (GltA, EC 4.1.3.7) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 180 as well as polynucleotides coding therefor,
  20. t) a malate dehydrogenase (Mdh, EC 1.1.1.37) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 182 and polynucleotides coding therefor,
  21. u) a UDP-N-acetylmuramoyl-alanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (MurE, EC 6.3.2.13) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 184, as well as for these coding polynucleotides.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Vektoren, die die zuvor genannten Polynukleotide enthalten, sowie rekombinanten Mikroorganismen, die die zuvor genannten Enzyme und/oder Polynukleotide und/oder Vektoren enthalten. Das betreffende Polypeptid und/oder Polynukleotid liegt hierbei in einer bevorzugten Ausführungsform in dem Mikroorganismus in ausgeschalteter oder abgeschwächter Form vor. Bei den rekombinanten Mikroorganismen handelt es sich hierbei vorzugsweise um coryneforme Bakterien, vor allem um Corynebakterien, insbesondere solche der Art C. humireducens oder C. glutamicum, vor allem der Art C. humireducens.Another subject of the present invention are also vectors containing the aforementioned polynucleotides, as well as recombinant microorganisms containing the aforementioned enzymes and / or polynucleotides and / or vectors. In a preferred embodiment, the polypeptide and / or polynucleotide in question is present in the microorganism in an off or attenuated form. The recombinant microorganisms are preferably coryneform bacteria, above all corynebacteria, in particular those of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular of the species C. humireducens.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Methionin-Überproduktionsstämme, neben einem erfindungsgemäßen, vorzugsweise überexprimierten, Glycin spaltenden System bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf:

  • a) ein abgeschwächtes Polynukleotid (mcbR), das für eine DNA-Bindungsdomäne vom Typ HTH tetR (McbR), vorzugsweise für eine DNA-Bindungsdomäne mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2, kodiert,
  • b) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrB-Gen), das für eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39), vorzugsweise für eine Homoserinkinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4, kodiert,
  • c) ein abgeschwächtes Polynukleotid (pgi), das für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase (Pgi, EC 5.3.1.9), vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 kodiert,
  • d) ein abgeschwächtes Polynukleotid (pck), das für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32), vorzugsweise für eine Phosphoenolpyruvat Carboxykinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 kodiert,
  • e) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metQ), das für ein D-Methionin bindendes Lipoprotein (MetQ), vorzugsweise für ein D-Methionin bindendes Lipoprotein mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 kodiert,
  • f) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metP), das für einen Methionin-Transporter (MetP), vorzugsweise für einen Methionin-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 kodiert,
  • g) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metN), das für einen ATP-abhängigen Methionin-Transporter (MetN), vorzugsweise für einen ATP-abhängigen Methionin-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14 kodiert,
  • h) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metK), das für eine S-Adenosylmethionin-Synthase (MetK), vorzugsweise für eine S-Adenosylmethionin-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16 kodiert,
  • i) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metI), das für eine Methionin-Importsystem-Permease (MetI), vorzugsweise für eine Methionin-Importsystem-Permease mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18 kodiert,
  • j) ein abgeschwächtes Polynukleotid (dapA), das für eine 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase (DapA), vorzugsweise für eine 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 kodiert,
  • k) ein überexprimiertes Polynukleotid (CBS), das für eine Cystein-Synthase (CBS), vorzugsweise für eine Cystein-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22 kodiert,
  • l) ein abgeschwächtes Polynukleotid, das für ein cg3031-Homolog, vorzugsweise für ein cg3031-Homolog mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24 kodiert,
  • m) ein überexprimiertes Polynukleotid (aecD), das für eine Cystathionin-Betalyase (AecD), vorzugsweise für eine Cystathionin-Betalyase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26 kodiert,
  • n) ein überexprimiertes Polynukleotid (asd), das für eine Aspartat-semialdehyd-Dehydrogenase (Asd), vorzugsweise für eine Aspartat-semialdehyd-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28 kodiert,
  • o) ein überexprimiertes Polynukleotid (metH), das für eine 5-Methyltetrahydrofolat-Homocysteinmethyltransferase (MetH, EC 2.1.1.13) kodiert,
  • p) ein überexprimiertes Polynukleotid (brnE), das für die kleinere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnE), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30 kodiert,
  • q) ein überexprimiertes Polynukleotid (brnF), das für die größere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnF), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32 kodiert,
  • r) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysE), das für eine Serin-Acetyltransferase (CysE), vorzugsweise für eine Serin-Acetyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34 kodiert,
  • s) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysK), das für eine Cystein-Synthase (CysK), vorzugsweise für eine Cystein-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36 kodiert,
  • t) ein überexprimiertes Polynukleotid (glyA), das für eine Serin-Hydroxymethyltransferase (GlyA), vorzugsweise für eine Serin-Hydroxymethyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 44 kodiert,
  • u) ein überexprimiertes Polynukleotid (hom), das für eine gegebenenfalls feedback-resistente Homoserin-Dehydrogenase (Hom), vorzugsweise für eine Homoserin-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46 kodiert,
  • v) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysC), das für eine gegebenenfalls feedback-resistente Aspartat-Kinase (LysC), vorzugsweise für eine Aspartat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 kodiert,
  • w) ein überexprimiertes Polynukleotid (metB), das für eine Cystathionin-gamma-Synthase (MetB), vorzugsweise für eine Cystathinonin-gamma-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 56 kodiert,
  • x) ein überexprimiertes Polynukleotid (metF), das für eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF), vorzugsweise für eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58 kodiert,
  • y) ein überexprimiertes Polynukleotid (metX), das für eine Homoserin-O-Acetyltransferase (MetX), vorzugsweise für eine Homoserin-O-Acetyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 60 kodiert,
  • z) ein überexprimiertes Polynukleotid (metY), das für eine O-Acetylhomoserin-Lyase (MetY), vorzugsweise für eine O-Acetylhomoserin-Lyase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 62 kodiert,
  • aa) ein überexprimiertes Polynukleotid (pyc), das für eine Pyruvat-Carboxylase (Pyc), vorzugsweise für eine Pyruvat-Carboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64 kodiert,
  • bb) ein überexprimiertes Polynukleotid (serA), das für eine gegebenenfalls feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerA), vorzugsweise für eine D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 66 kodiert,
  • cc) ein überexprimiertes Polynukleotid (serB), das für eine Phosphoserin-Phosphatase (SerB), vorzugsweise für eine Phosphoserin-Phosphatase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 68 kodiert,
  • dd) ein überexprimiertes Polynukleotid (serC), das für eine Phosphoserin-Aminotransferase (SerC), vorzugsweise für eine Phosphoserin-Aminotransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 70 kodiert,
  • ee) ein überexprimiertes Polynukleotid (ald), das für eine Alanin-Dehydrogenase (Ald), vorzugsweise für eine Alanin-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 72 kodiert,
  • ff) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysD), das für die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysD), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 74 kodiert,
  • gg) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysH), das für eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase (CysH), vorzugsweise für eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 76 kodiert,
  • hh) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysl), das für eine Sulfit-Reduktase (Cysl), vorzugsweise für eine Sulfit-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 78 kodiert,
  • ii) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysJ), das für (CysJ), vorzugsweise für eine mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 80 kodiert,
  • jj) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysN), das für die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysN), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 82 kodiert,
  • kk) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysY), das für eine Cystathionin-beta-Synthase (CysY), vorzugsweise für eine Cystathionin-beta-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 84 kodiert,
  • ll) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysZ), das für einen putativen Sulfat-Transporter (CysZ), vorzugsweise für einen Sulfat-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 86 kodiert,
  • mm) ein überexprimiertes Polynukleotid (metE), das für eine 5-Methyltetrahydropteroyl-triglutamat-homocystein-Methyltransferase (MetE), vorzugsweise für ein Protein mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 88 kodiert,
  • nn) ein überexprimiertes Polynukleotid (ptH1), das für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 (PtH1), vorzugsweise für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 90 kodiert,
  • oo) ein überexprimiertes Polynukleotid (ptH2), das für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 (PtH2), vorzugsweise für eine eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 92 kodiert.
In a further preferred embodiment according to the invention, microorganisms or bacteria according to the invention, in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-methionine overproduction strains according to the invention, in addition to an inventive, preferably overexpressed, glycine-cleaving system or the polynucleotides coding for this, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, of the following features:
  • a) an attenuated polynucleotide (mcbR) encoding a DNA binding domain of the type HTH tetR (McbR), preferably for a DNA binding domain having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 2, coded,
  • b) an attenuated polynucleotide (thrB gene) encoding a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39), preferably a homoserine kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4, coded,
  • c) an attenuated polynucleotide (pgi) encoding a glucose-6-phosphate isomerase (Pgi, EC 5.3.1.9), preferably a glucose-6-phosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6 coded,
  • d) an attenuated polynucleotide (pck) encoding a phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32), preferably a phosphoenolpyruvate Carboxykinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 8,
  • e) an attenuated polynucleotide (metQ) encoding a D-methionine binding lipoprotein (MetQ), preferably a D-methionine binding lipoprotein having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 10 encoded,
  • f) an attenuated polynucleotide (metP) which is suitable for a methionine transporter (MetP), preferably for a methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 12 coded,
  • g) an attenuated polynucleotide (metN) encoding an ATP-dependent methionine transporter (MetN), preferably an ATP-dependent methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence coded according to SEQ ID NO: 14,
  • h) an attenuated polynucleotide (metK) which is suitable for an S-adenosylmethionine synthase (MetK), preferably for an S-adenosylmethionine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 16 encoded,
  • i) an attenuated polynucleotide (metI) encoding a methionine import system permease (MetI), preferably a methionine import system permease having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 18 encoded,
  • j) an attenuated polynucleotide (dapA) encoding a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (DapA), preferably a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% the sequence encoded according to SEQ ID NO: 20,
  • k) an overexpressed polynucleotide (CBS) encoding a cysteine synthase (CBS), preferably a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 22 coded,
  • l) an attenuated polynucleotide encoding a cg3031 homolog, preferably a cg3031 homolog having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 24,
  • m) an overexpressed polynucleotide (aecD) encoding a cystathionine betalyase (AecD), preferably a cystathionine betalyase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 26 coded,
  • n) an overexpressed polynucleotide (asd) which is suitable for an aspartate semialdehyde dehydrogenase (Asd), preferably for an aspartate semialdehyde dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 28 encoded,
  • o) an overexpressed polynucleotide (metH) coding for a 5-methyltetrahydrofolate homocysteine methyltransferase (MetH, EC 2.1.1.13),
  • p) an overexpressed polynucleotide (brnE) encoding the smaller subunit of a branched-chain amino acid transporter (BrnE), preferably a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 30 encoded,
  • q) an overexpressed polynucleotide (brnF) encoding the larger subunit of a branched-chain amino acid transporter (BrnF), preferably a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 32 encoded,
  • r) an overexpressed polynucleotide (cysE) which is suitable for a serine acetyltransferase (CysE), preferably for a serine acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 34 coded,
  • s) an overexpressed polynucleotide (cysK) encoding a cysteine synthase (CysK), preferably a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 36 coded,
  • t) an overexpressed polynucleotide (glyA) encoding a serine hydroxymethyltransferase (GlyA), preferably a serine hydroxymethyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 44 coded,
  • u) an overexpressed polynucleotide (hom) which is suitable for an optionally feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom), preferably for a homoserine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 46 encoded,
  • v) an overexpressed polynucleotide (lysC) which is responsible for an optionally feedback-resistant aspartate kinase (LysC), preferably for an aspartate kinase with a Sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 54,
  • w) an overexpressed polynucleotide (metB) which is suitable for a cystathionine gamma synthase (MetB), preferably for a cystathinonin gamma synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 56 encoded,
  • x) an overexpressed polynucleotide (metF) encoding a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MetF), preferably a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% the sequence encoded according to SEQ ID NO: 58,
  • y) an overexpressed polynucleotide (metX) which is suitable for a homoserine O-acetyltransferase (MetX), preferably for a homoserine O-acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 60 encoded,
  • z) an overexpressed polynucleotide (metY) which is responsible for an O-acetyl homoserine lyase (MetY), preferably an O-acetyl homoserine lyase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 62 encoded,
  • aa) an overexpressed polynucleotide (pyc) which is responsible for a pyruvate carboxylase (Pyc), preferably a pyruvate carboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 64 coded,
  • bb) an overexpressed polynucleotide (serA) suitable for an optionally feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA), preferably for a D-3-phosphoglycerate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% coded to the sequence according to SEQ ID NO: 66,
  • cc) an overexpressed polynucleotide (serB) which is suitable for a phosphoserine phosphatase (SerB), preferably for a phosphoserine phosphatase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 68 coded,
  • dd) an overexpressed polynucleotide (serC) suitable for a phosphoserine aminotransferase (SerC), preferably a phosphoserine aminotransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 70 coded,
  • ee) an overexpressed polynucleotide (ald) suitable for an alanine dehydrogenase (Ald), preferably an alanine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 72 coded,
  • ff) an overexpressed polynucleotide (cysD) encoding the subunit of a sulfate adenylyltransferase (CysD), preferably a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 74 coded,
  • gg) an overexpressed polynucleotide (cysH) encoding an adenosine phosphosulfate reductase (CysH), preferably an adenosine phosphosulfate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 76 encoded,
  • hh) an overexpressed polynucleotide (cysl) which is suitable for a sulfite reductase (Cysl), preferably for a sulfite reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 78 coded,
  • ii) an overexpressed polynucleotide (cysJ) coding for (CysJ), preferably one with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 80,
  • jj) an overexpressed polynucleotide (cysN) encoding the subunit of a sulphate adenylyltransferase (CysN), preferably a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 82 coded,
  • kk) an overexpressed polynucleotide (cysY) which is responsible for a cystathionine beta synthase (CysY), preferably a cystathionine beta synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 84 encoded,
  • (ii) an overexpressed polynucleotide (cysZ) encoding a putative sulfate transporter (CysZ), preferably a sulfate transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 86 coded,
  • mm) an overexpressed polynucleotide (metE) encoding a 5-methyltetrahydropteroyl triglutamate homocysteine methyltransferase (MetE), preferably a protein having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 88 encoded,
  • nn) an overexpressed polynucleotide (ptH1) encoding a peptidyl tRNA hydrolase 1 (PtH1), preferably a peptidyl tRNA hydrolase 1 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence coded according to SEQ ID NO: 90,
  • oo) an overexpressed polynucleotide (ptH2) encoding a peptidyl tRNA hydrolase 2 (PtH2), preferably a peptidyl tRNA hydrolase 2 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 92 encoded.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch entsprechend ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Methionin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.A further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-methionine, in which such a microorganism or a bacterium is used.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Valin-Überproduktionsstämme, neben einem erfindungsgemäßen, vorzugsweise überexprimierten, Glycin spaltenden System bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide, mindestens eines, vorzugsweise mindestens 2 oder 3, besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, der folgenden Merkmale auf:

  1. a) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvA-Gen), das für eine Threonindehydratase (IlvA, EC 4.3.1.19), vorzugsweise für eine Threonindehydratase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 106, kodiert,
  2. b) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvB-Gen), das für die Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (IlvB), vorzugsweise für die Untereinheit einer Acetolactat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 98, kodiert,
  3. c) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvN-Gen), das für die gegebenenfalls feedback-resistente Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (IlvN) kodiert,
  4. d) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvC-Gen), das für eine Isomeroreduktase (IlvC, EC 1.1.1.86), vorzugsweise für eine Isomeroreduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 100, kodiert,
  5. e) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvD-Gen), das für eine Dihydroxy-acid Dehydratase (IlvD, EC 4.2.1.9), vorzugsweise für eine Dihydroxy-acid Dehydratase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 102, kodiert,
  6. f) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvE-Gen), das für eine Transaminase (IlvE, EC 2.6.1.42), vorzugsweise für eine Transaminase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 104, kodiert,
  7. g) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvH-Gen), das für eine Acetolactat-Synthase (IlvH, EC 2.2.1.6), vorzugsweise für eine Acetolactat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 122, kodiert,
  8. h) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrB-Gen), das für eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39), vorzugsweise für eine Homoserinkinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4, kodiert,
  9. i) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrC-Gen), das für eine Threonin-Synthase (ThrC, EC 4.2.3.1), vorzugsweise für eine Threonin-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 108, kodiert,
  10. j) ein überexprimiertes Polynukleotid (hom-Gen), das für eine gegebenenfalls feedback-resistente Homoserin-Dehydrogenase (Hom, EC 1.2.1.11), vorzugsweise für eine Homoserin-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46, kodiert,
  11. k) ein abgeschwächtes Polynukleotid (leuA-Gen), das für eine gegebenenfalls feedback-resistente Isopropylmalat-Synthase (LeuA, EC 2.3.3.13), vorzugsweise für eine Isopropylmalat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 110, kodiert,
  12. l) ein abgeschwächtes Polynukleotide (leuB-Gen), das für eine Isopropylmalat-Dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85), vorzugsweise für eine Isopropylmalat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 112, kodiert,
  13. m) abgeschwächtes Polynukleotide (leuCD-Gene), die für die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), vorzugsweise für die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase mit Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 114 und SEQ ID NO: 116, kodieren,
  14. n) ein überexprimiertes Polynukleotid (panB-Gen), das für eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.11), vorzugsweise für eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 118, kodiert,
  15. o) ein überexprimiertes Polynukleotid (panC-Gen), das für eine Pantothenat-Synthase (PanC, EC 6.3.2.1), vorzugsweise für eine Pantothenat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 120, kodiert.
In a further preferred embodiment according to the invention, microorganisms or bacteria according to the invention, in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-valine overproduction strains according to the invention, in addition to an inventive, preferably overexpressed, glycine-cleaving system or the polynucleotide coding for this, at least one, preferably at least 2 or 3, more preferably at least 4 or 5, of the following features:
  1. a) an overexpressed polynucleotide (ilvA gene) which is suitable for a threonine dehydratase (IlvA, EC 4.3.1.19), preferably for a threonine dehydratase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 106, coded,
  2. b) an overexpressed polynucleotide (ilvB gene) encoding the subunit of an acetolactate synthase (IlvB), preferably the subunit of an acetolactate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence coded according to SEQ ID NO: 98,
  3. c) an overexpressed polynucleotide (ilvN gene) which codes for the optionally feedback-resistant subunit of an acetolactate synthase (IlvN),
  4. d) an overexpressed polynucleotide (ilvC gene) encoding an isomeroreductase (IlvC, EC 1.1.1.86), preferably an isomero reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 100, coded,
  5. e) an overexpressed polynucleotide (ilvD gene) suitable for a dihydroxy acid dehydratase (IlvD, EC 4.2.1.9), preferably for a dihydroxy acid dehydratase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 102, encoded,
  6. f) an overexpressed polynucleotide (ilvE gene) which is suitable for a transaminase (IlvE, EC 2.6.1.42), preferably for a transaminase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 104, coded,
  7. g) an overexpressed polynucleotide (ilvH gene) encoding an acetolactate synthase (IlvH, EC 2.2.1.6), preferably an acetolactate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 122, encoded,
  8. h) an attenuated polynucleotide (thrB gene) which is suitable for a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39), preferably for a homoserine kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4, coded,
  9. i) an attenuated polynucleotide (thrC gene) encoding a threonine synthase (ThrC, EC 4.2.3.1), preferably a threonine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 108, encoded,
  10. j) an overexpressed polynucleotide (hom gene) which is suitable for an optionally feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom, EC 1.2.1.11), preferably for a homoserine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100 %, to the sequence according to SEQ ID NO: 46, encoded,
  11. k) an attenuated polynucleotide (leuA gene) encoding an optionally feedback-resistant isopropyl malate synthase (LeuA, EC 2.3.3.13), preferably an isopropyl malate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100 %, to the sequence according to SEQ ID NO: 110, encoded,
  12. l) an attenuated polynucleotide (leuB gene) encoding an isopropyl malate dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85), preferably an isopropyl malate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 112, encoded,
  13. m) attenuated polynucleotides (leuCD genes) encoding the subunits of an isopropyl malate isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), preferably the subunits of an isopropyl malate isomerase with sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequences according to SEQ ID NO: 114 and SEQ ID NO: 116 encode,
  14. n) an overexpressed polynucleotide (panB gene) encoding a 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.11), preferably a 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase having a sequence identity of at least 90 , 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 118, encoded,
  15. o) an overexpressed polynucleotide (panC gene) encoding a pantothenate synthase (PanC, EC 6.3.2.1), preferably a pantothenate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 120, encoded.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Valin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.A further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-valine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Glutamat-Überproduktionsstämme, neben einem erfindungsgemäßen, vorzugsweise überexprimierten, Glycin spaltenden System bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf:

  1. a) ein überexprimiertes Polynukleotid (gdh), das für eine Glutamat-Dehydrogenase (Gdh), vorzugsweise für eine Glutamat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 124, kodiert,
  2. b) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 1), vorzugsweise für eine Glutamin-Synthetase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 126, kodiert,
  3. c) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 2), vorzugsweise für eine Glutamin-Synthetase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 128, kodiert,
  4. d) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamat-Synthase, vorzugsweise für eine Glutamat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 130, kodiert,
  5. e) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Isocitrat-Dehydrogenase, vorzugsweise für eine Isocitrat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 132, kodiert,
  6. f) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Aconitat-Hydrase, vorzugsweise für eine Aconitat-Hydrase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 134, kodiert,
  7. g) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Citrat-Synthase, vorzugsweise für eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 136, kodiert,
  8. h) ein überexprimiertes Polynukleotid (pepC), das für eine Aminopeptidase C (PepC), vorzugsweise für eine Aminopeptidase C mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 138, kodiert,
  9. i) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Dehydrogenase, vorzugsweise für eine Pyruvat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 140, kodiert,
  10. j) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 1), vorzugsweise für eine Pyruvat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 142, kodiert,
  11. k) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 2), vorzugsweise für eine Pyruvat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 144, kodiert,
  12. l) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Enolase, vorzugsweise für eine Enolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 146 kodiert,
  13. m) ein überexprimiertes Polynukleotid (gpmA), das für eine 2,3-Bisphosphoglycerat-abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA), vorzugsweise für eine Phosphoglycerat-Mutase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 148 kodiert,
  14. n) ein überexprimiertes Polynukleotid (pgk), das für eine Phosphoglycerat-Kinase (Pgk), vorzugsweise für eine Phosphoglycerat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 150 kodiert,
  15. o) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 1), vorzugsweise für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 152 kodiert,
  16. p) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 2), vorzugsweise für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 154 kodiert,
  17. q) ein überexprimiertes Polynukleotid (tpiA), das für eine Triosephosphat-Isomerase (TpiA), vorzugsweise für eine Triosephosphat-Isomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 156 kodiert,
  18. r) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Fructosebisphosphataldolase, vorzugsweise für eine Fructosebisphosphataldolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 158 kodiert,
  19. s) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine 1-Phosphofructokinase, vorzugsweise für eine 1-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 160 kodiert,
  20. t) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine 6-Phosphofructokinase, vorzugsweise für eine 6-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 162 kodiert,
  21. u) ein überexprimiertes Polynukleotid (pgi), das für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase, vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 kodiert,
  22. v) abgeschwächte Polynukleotide (sucCD), die für die Untereinheiten einer Succinyl-CoA-Ligase (SucCD, EC 6.2.1.5), vorzugsweise für die Untereinheiten einer Succinyl-CoA-Ligase mit Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 198 bzw. SEQ ID NO: 200 kodieren.
In a further preferred embodiment according to the invention, microorganisms or bacteria according to the invention, in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-glutamate overproducing strains according to the invention, in addition to a glycine-cleaving system according to the invention, preferably overexpressed, or the polynucleotides coding for this, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, of the following features:
  1. a) an overexpressed polynucleotide (gdh) which is suitable for a glutamate dehydrogenase (Gdh), preferably for a glutamate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 124 , coded,
  2. b) an overexpressed polynucleotide which is suitable for a glutamine synthetase (glutamine synthetase 1), preferably for a glutamine synthetase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 126 , coded,
  3. c) an overexpressed polynucleotide which is suitable for a glutamine synthetase (glutamine synthetase 2), preferably for a glutamine synthetase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 128 , coded,
  4. d) an overexpressed polynucleotide encoding a glutamate synthase, preferably a glutamate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 130,
  5. e) an overexpressed polynucleotide coding for an isocitrate dehydrogenase, preferably for an isocitrate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 132,
  6. f) an overexpressed polynucleotide encoding an aconitate hydrase, preferably an aconitate hydrase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 134,
  7. g) an overexpressed polynucleotide coding for a citrate synthase, preferably for a citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 136,
  8. h) an overexpressed polynucleotide (pepC) which codes for an aminopeptidase C (PepC), preferably an aminopeptidase C having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 138 .
  9. i) an overexpressed polynucleotide encoding a pyruvate dehydrogenase, preferably a pyruvate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 140,
  10. j) an overexpressed polynucleotide encoding a pyruvate kinase (pyruvate kinase 1), preferably a pyruvate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 142 , coded,
  11. k) an overexpressed polynucleotide encoding a pyruvate kinase (pyruvate kinase 2), preferably a pyruvate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 144 , coded,
  12. l) an overexpressed polynucleotide coding for an enolase, preferably an enolase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 146,
  13. m) an overexpressed polynucleotide (gpmA) encoding a 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase (GpmA), preferably a phosphoglycerate mutase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence encoded according to SEQ ID NO: 148,
  14. n) an overexpressed polynucleotide (pgk) encoding a phosphoglycerate kinase (Pgk), preferably a phosphoglycerate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 150 coded,
  15. o) an overexpressed polynucleotide encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1), preferably a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 152,
  16. p) an overexpressed polynucleotide encoding a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2), preferably a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% coded to the sequence according to SEQ ID NO: 154,
  17. q) an overexpressed polynucleotide (tpiA) encoding a triosephosphate isomerase (TpiA), preferably a triosephosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 156 coded,
  18. r) an overexpressed polynucleotide which codes for a fructose bisphosphate aldolase, preferably a fructose bisphosphate aldolase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 158,
  19. s) an overexpressed polynucleotide coding for a 1-phosphofructokinase, preferably for a 1-phosphofructokinase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 160,
  20. t) an overexpressed polynucleotide encoding a 6-phosphofructokinase, preferably a 6-phosphofructokinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 162,
  21. u) an overexpressed polynucleotide (pgi) encoding a glucose-6-phosphate isomerase, preferably a glucose-6-phosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6 encoded,
  22. v) attenuated polynucleotides (sucCD) encoding the subunits of a succinyl CoA ligase (SucCD, EC 6.2.1.5), preferably the subunits of a succinyl CoA ligase having sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100 %, to the sequences according to SEQ ID NO: 198 or SEQ ID NO: 200.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Glutamat, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.A further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-glutamate, in which such a microorganism or such a bacterium is used.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Alanin-Überproduktionsstämme, neben einem erfindungsgemäßen, vorzugsweise überexprimierten, Glycin spaltenden System bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf:

  1. a) ein überexprimiertes Polynukleotid (alaD), das für eine Alanin-Dehydrogenase (AlaD), vorzugsweise für eine Alanin-Dehydrogenase aus Corynebakterien kodiert,
  2. b) ein überexprimiertes Polynukleotid (gapA), das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GapA), vorzugsweise für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase aus Corynebakterien kodiert,
  3. c) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (ldhA), das für eine L-Lactat-Dehydrogenase (LdhA), vorzugsweise für eine L-Lactat-Dehydrogenase aus Corynebakterien kodiert,
  4. d) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (ppc), das für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Ppc), vorzugsweise für eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Corynebakterien kodiert,
  5. e) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (alr), das für eine Alanin-Racemase (Alr), vorzugsweise für eine Alanin-Racemase aus Corynebakterien kodiert.
In a further preferred embodiment according to the invention, microorganisms or bacteria according to the invention, in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-alanine overproduction strains according to the invention, in addition to an inventive, preferably overexpressed, glycine-cleaving system or the polynucleotides coding for this, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, of the following features:
  1. a) an overexpressed polynucleotide (alaD) which codes for an alanine dehydrogenase (AlaD), preferably for an alanine dehydrogenase from corynebacteria,
  2. b) an overexpressed polynucleotide (gapA) which codes for a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GapA), preferably for a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from corynebacteria,
  3. c) a switched-off or attenuated polynucleotide (IdhA) which codes for an L-lactate dehydrogenase (LdhA), preferably a Corynebacterium L-lactate dehydrogenase,
  4. d) a switched-off or attenuated polynucleotide (ppc) coding for a phosphoenolpyruvate carboxylase (Ppc), preferably a corynebacterium phosphoenolpyruvate carboxylase,
  5. e) a switched-off or attenuated polynucleotide (alr) which codes for an alanine racemase (Alr), preferably an alanine racemase from corynebacteria.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Alanin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.A further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-alanine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.

In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Lysin-Überproduktionsstämme, neben einem erfindungsgemäßen, vorzugsweise überexprimierten, Glycin spaltenden System bzw. der für dieses kodierenden Polynukleotide, mindestens eines, vorzugsweise mindestens 2 oder 3, besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, der folgenden Merkmale auf:

  1. a) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapA-Gen), das für eine Dihydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC 4.2.1.52), vorzugsweise für eine Dihydrodipicolinat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20, kodiert,
  2. b) ein überexprimierter Polynukleotid (lysC), das für eine vorzugsweise feedback-resistente Aspartat-Kinase (LysC, EC 2.7.2.4), vorzugsweise für eine Aspartat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 kodiert,
  3. c) ein überexprimiertes Polynukleotid (ddh), das für eine Diaminopimelat-Dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16), vorzugsweise für eine Diaminopimelat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 202 kodiert,
  4. d) ein überexprimiertes Polynukleotid (asd-Gen), das für eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Asd, EC 1.2.1.11), vorzugsweise für eine eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28, kodiert,
  5. e) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysA-Gen), das für eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA, EC 4.1.1.20), vorzugsweise für eine Diaminopimelat-Decarboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 164, kodiert,
  6. f) ein überexprimiertes Polynukleotid (aat-Gen), das für eine Aspartat-Aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1), vorzugsweise für eine Aspartat-Aminotransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 166, kodiert,
  7. g) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysE-Gen), das für einen L-Lysin-Exporter (LysE, Lysin-Efflux-Permease), vorzugsweise für einen L-Lysin-Exporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 168, kodiert,
  8. h) ein überexprimiertes Polynukleotid (pyc-Gen), das für eine Pyruvat-Carboxylase (Pyc, EC 6.4.1.1), vorzugsweise für eine Pyruvat-Carboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64, kodiert,
  9. i) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapF-Gen), das für eine Diaminopimelat-Epimerase (DapF, EC 5.1.1.7) kodiert,
  10. j) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapB-Gen), das für eine Dihydropicolinat-Reduktase (DapB, EC 1.3.1.26), vorzugsweise für eine Dihydropicolinat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 172, kodiert,
  11. k) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49), vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 174, kodiert,
  12. l) ein überexprimiertes Polynukleotid (zwf-Gen), das für die Zwf-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Zwf, EC 1.1.1.49), vorzugsweise für eine Zwf-Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 188, kodiert,
  13. m) ein überexprimiertes Polynukleotid (opcA-Gen), das für die OpcA-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (OpcA, EC 1.1.1.49), vorzugsweise für eine OpcA-Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 190, kodiert,
  14. n) ein überexprimiertes Polynukleotid (gnd-Gen), das für eine Phosphogluconsäure-Dehydrogenase (Gnd, EC 1.1.1.44), vorzugsweise für eine Phosphogluconsäure-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 176, kodiert,
  15. o) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (mqo), das für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase (Mqo, EC 1.1.99.16), vorzugsweise für eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 178, kodiert,
  16. p) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (aceE), das für die E1p-Untereinheit eines Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (AceE, EC 1.2.4.1), vorzugsweise für eine E1p-Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 180, kodiert,
  17. q) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (gltA), das für eine Citrat-Synthase (GltA, EC 4.1.3.7), vorzugsweise für eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 182, kodiert,
  18. r) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (mdh), das für eine Malat-Dehydrogenase (Mdh, EC 1.1.1.37), vorzugsweise für eine Malat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 184, kodiert,
  19. s) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (murE), das für eine UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamat-2,6-diaminopimelat-Ligase (MurE, EC 6.3.2.13), vorzugsweise für ein Enzym mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 186, kodiert.
In a further preferred embodiment according to the invention, microorganisms or bacteria according to the invention, in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-lysine overproduction strains according to the invention, in addition to a glycine-cleaving system according to the invention, preferably overexpressed, or the polynucleotide coding for this, at least one, preferably at least 2 or 3, more preferably at least 4 or 5, of the following features:
  1. a) an overexpressed polynucleotide (dapA gene) encoding a dihydrodipicolinate synthase (DapA, EC 4.2.1.52), preferably a dihydrodipicolinate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 20, encoded,
  2. b) an overexpressed polynucleotide (lysC) which is responsible for a preferably feedback-resistant aspartate kinase (LysC, EC 2.7.2.4), preferably for an aspartate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, encodes the sequence according to SEQ ID NO: 54,
  3. c) an overexpressed polynucleotide (ddh) suitable for a diaminopimelate dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16), preferably for a diaminopimelate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 202 encoded,
  4. d) an overexpressed polynucleotide (asd gene) which is useful for an aspartate semialdehyde dehydrogenase (Asd, EC 1.2.1.11), preferably for an aspartate semialdehyde dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 28, encoded,
  5. e) an overexpressed polynucleotide (lysA gene) encoding a diaminopimelate decarboxylase (LysA, EC 4.1.1.20), preferably a diaminopimelate decarboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 164, encoded,
  6. f) an overexpressed polynucleotide (aat gene) encoding an aspartate aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1), preferably an aspartate aminotransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 166, encoded,
  7. g) an overexpressed polynucleotide (lysE gene) encoding an L-lysine exporter (LysE, lysine efflux permease), preferably an L-lysine exporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 168, encoded,
  8. h) an overexpressed polynucleotide (pyc gene) encoding a pyruvate carboxylase (Pyc, EC 6.4.1.1), preferably a pyruvate carboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 64, encoded,
  9. i) an overexpressed polynucleotide (dapF gene) encoding a diaminopimelate epimerase (DapF, EC 5.1.1.7),
  10. j) an overexpressed polynucleotide (dapB gene) encoding a dihydropicolinate reductase (DapB, EC 1.3.1.26), preferably a dihydropicolinate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 172, encoded,
  11. k) an overexpressed polynucleotide encoding a glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49), preferably a glucose-6-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% the sequence according to SEQ ID NO: 174, encoded,
  12. l) an overexpressed polynucleotide (zwf gene) encoding the Zwf subunit of a glucose-6-phosphate dehydrogenase (Zwf, EC 1.1.1.49), preferably a Zwf subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98 %, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 188, encoded,
  13. m) an overexpressed polynucleotide (opcA gene) encoding the OpcA subunit of a glucose-6-phosphate dehydrogenase (OpcA, EC 1.1.1.49), preferably an OpcA subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98 %, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 190, encoded,
  14. n) an overexpressed polynucleotide (gnd gene) encoding a phosphogluconic acid dehydrogenase (Gnd, EC 1.1.1.44), preferably a phosphogluconic acid dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 176, encoded,
  15. o) a switched-off or attenuated polynucleotide (mqo) which is suitable for a malate quinone oxidoreductase (Mqo, EC 1.1.99.16), preferably for a malate quinone oxidoreductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100 %, to the sequence according to SEQ ID NO: 178, encoded,
  16. p) a switched off or attenuated polynucleotide (aceE) encoding the E1p subunit of a pyruvate dehydrogenase complex (AceE, EC 1.2.4.1), preferably an E1p subunit with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 180, encoded,
  17. q) a switched-off or attenuated polynucleotide (gltA) encoding a citrate synthase (GltA, EC 4.1.3.7), preferably a citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 182, encoded,
  18. r) a switched off or attenuated polynucleotide (mdh) which is suitable for a malate dehydrogenase (Mdh, EC 1.1.1.37), preferably for a malate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 184, encoded,
  19. s) a switched off or attenuated polynucleotide (murE) encoding a UDP-N-acetylmuramoyl-alanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (MurE, EC 6.3.2.13), preferably an enzyme with a sequence identity of at least 90 , 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 186, encoded.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Lysin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.A further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-lysine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.

Die zuvor genannten, in erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten bzw. einzusetzenden Polynukleotide und Polypeptide stammen vorzugsweise aus Corynebakterien, insbesondere aus C. glutamicum oder C. humireducens, besonders bevorzugt aus C. humireducens.The aforementioned polynucleotides and polypeptides used or to be used in the method according to the invention are preferably derived from corynebacteria, in particular from C. glutamicum or C. humireducens, more preferably from C. humireducens.

Unter "Überexpression" ist erfindungsgemäß allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins (Polypeptids) oder eines Enzyms, die durch eine entsprechende DNA kodiert werden, in einem Mikroorganismus im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder Wildtypstamm zu verstehen. Unter einem Ausgangsstamm (Elternstamm) versteht man den Stamm, an dem die zur Überexpression führende Maßnahme durchgeführt wurde.According to the invention, "overexpression" generally means an increase in the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein (polypeptide) or an enzyme which is encoded by a corresponding DNA in a microorganism in comparison to the parent strain (parent strain) or wild-type strain. A parent strain is the strain on which the overexpression was performed.

Die Erhöhung der Konzentration oder Aktivität lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden kodierenden Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine Kopie erhöht.The increase in concentration or activity can be achieved, for example, by increasing the copy number of the corresponding coding polynucleotides chromosomally or extrachromosomally by at least one copy.

Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende kodierende Polynukleotid in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem Mikroorganismuns, insbesondere einem coryneformen Bakterium, repliziert wird. Weiterhin kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente) oder Phagen einsetzen. Im Stand der Technik ist eine Fülle geeigneter Vektoren beschrieben.A widely used method of increasing the copy number consists of incorporating the corresponding coding polynucleotide into a vector, preferably a plasmid, which is replicated by a microorganism, in particular a coryneform bacterium. Furthermore, it is possible to use transposons, insertion elements (IS elements) or phages as vectors. The art describes a wealth of suitable vectors.

Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen Bakteriums eingefügt. Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der WO 03/014330 oder WO 03/040373 beschrieben.Another common method of overexpression is chromosomal gene amplification. In this method, at least one additional copy of the polynucleotide of interest is inserted into the chromosome of a coryneform bacterium. Such amplification methods are for example in the WO 03/014330 or WO 03/040373 described.

Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in der Fig. 1 des Übersichtsartikel von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311-323 (2003 )) und in zusammenfassenden Darstellungen wie dem " Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling und Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005 )) oder dem Buch " Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008 )) beschrieben. In gleicher Weise können die von Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999 )) beschriebenen Varianten des dapA-Promotors, beispielsweise der Promotor A25 eingesetzt werden. Weiterhin kann der gap-Promotor von Corynebacterium glutamicum ( EP 06007373 ) verwendet werden. Schließlich können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988 )) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985 )) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 Nukleobasen vom Startkodon, eingefügt werden.Another method of achieving overexpression is to operably linked the corresponding gene or allele to a promoter or to link an expression cassette. Suitable promoters for Corynebacterium glutamicum are, for example, in FIG. 1 of the review article of FIG Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003 )) and in summary presentations such as the Handbook of Corynebacterium glutamicum "(Ed .: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005 )) or the book " Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology "(Ed .: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008 )). In the same way, those of Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999 )) described variants of the dapA promoter, for example, the promoter A25 can be used. Furthermore, the gap promoter of Corynebacterium glutamicum ( EP 06007373 ) be used. Finally, the well-known of Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988 )) and Amann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985 )) promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac and trc. For example, such a promoter may be inserted upstream of the subject gene, typically at a distance of about 1-500 nucleobases from the start codon.

Durch die Maßnahme der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids vorzugsweise um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis vorzugsweise 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Überexpression führenden Maßnahme, erhöht.By the measure of overexpression, the activity or concentration of the corresponding polypeptide is preferably at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, at most, preferably 1000 % or 2000%, based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to the overexpression-inducing procedure.

Die Konzentration eines Proteins kann über 1- und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001 )) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper ( Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 ) und anschließender optischer Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestimmung ( Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39 ; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999 )) bestimmt werden. Die Aktivität kann mit Hilfe eines geeigneten Enzymtest bestimmt werden.The concentration of a protein can be determined by 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software in the gel. A common method for preparing the protein gels in coryneform bacteria and for identifying the proteins is that of Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001 )). The protein concentration can also be determined by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected ( Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ) and subsequent optical evaluation with appropriate software for concentration determination ( Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5: 32-39 ; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999 )). The activity can be determined by means of a suitable enzyme assay.

Der Begriff "Abschwächung" bezeichnet erfindungsgemäß die Verringerung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins (Polypeptids) oder eines Enzyms, die durch eine entsprechende DNA kodiert werden, in einem Mikroorganismus, im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder Wildtypstamm. Als Ausgangsstamm (Elternstamm) wird der Stamm bezeichnet, an dem die Maßnahme der Abschwächung durchgeführt wurde.The term "attenuation" in the present invention means reducing the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein (polypeptide) or an enzyme encoded by a corresponding DNA in a microorganism, as compared with the parent strain (parent strain) or wild-type strain. The parent strain is the strain on which the mitigation was performed.

Die Abschwächung kann erzielt werden, indem die Expression eines Polypeptids, beispielsweise durch Verwendung eines schwachen Promotors, verringert wird oder indem ein Allel verwendet wird, das für ein Polypeptid mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Die Abschwächung kann auch dadurch erreicht werden, indem die Expression des Polypeptids vollständig unterbunden wird, beispielsweise dadurch, dass das kodierende Gen ausgeschaltet wird.The attenuation may be achieved by reducing the expression of a polypeptide, for example by using a weak promoter, or by using an allele which codes for a polypeptide having a lower activity and optionally combining these measures. The attenuation can also be achieved by completely inhibiting the expression of the polypeptide, for example by switching off the coding gene.

Durch die Maßnahme der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids vorzugsweise um mindestens 10%, 25%, 50% oder 75%, maximal um 100%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Abschwächung führenden Maßnahme, reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Abschwächung in der vollständigen Ausschaltung der Expression des betreffenden Polypeptids.By the attenuation measure, the activity or concentration of the corresponding polypeptide is preferably increased by at least 10%, 25%, 50% or 75%, at most 100%, based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to the attenuation-inducing measure, reduced. In a preferred embodiment, the attenuation consists in the complete elimination of the expression of the relevant polypeptide.

Unter feedback-resistenten Enzymen versteht man im Zusammenhang mit der Aminosäureproduktion generell Enzyme, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch die produzierte L-Aminosäure und/oder Analoga davon aufweisen.In the context of amino acid production, the term "feedback-resistant" enzymes generally refers to enzymes which have a lower sensitivity to the inhibition by the produced L-amino acid and / or analogs thereof compared to the wild type.

So versteht man insbesondere unter einer feedback-resistenten Aspartatkinase (LysCFBR) eine Aspartatkinase, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin alleine oder AEC alleine aufweisen. Für die Lysin-Produktion werden entsprechend Stämme, die solche feedbackresistenten bzw. desensibilisierten Aspartatkinasen enthalten, bevorzugt eingesetzt.For example, a feedback-resistant aspartate kinase (LysC FBR ) is understood to be an aspartate kinase which has a lower sensitivity to inhibition by mixtures of lysine and threonine or mixtures of AEC (aminoethylcysteine) and threonine or lysine alone or AEC alone compared to wild-type , For lysine production, strains containing such feedback-resistant or desensitized aspartate kinases are preferably used.

Literaturbekannt sind beispielsweise folgende feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. glutamicum: A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, T311I, R320G, G345D, S381F. Bzgl. feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. glutamicum wird weiterhin auf folgende Veröffentlichungen verwiesen: JP1993184366-A , JP1994062866-A , JP1994261766-A , JP1997070291-A , JP1997322774-A , JP1998165180-A , JP1998215883-A , US5688671-A , EP0387527 , WO00/63388 , US3732144 , JP6261766 , Jetten et al. (1995; Applied Microbiology Biotechnology 43: 76-82 ). Feedback-resistente Aspartatkinasen aus C. glutamicum sind in der NCBI-GenBank unter folgenden Zugangsnummern hinterlegt: E05108, E06825, E06826, E06827, E08177, E08178, E08179, E08180, E08181, E08182, E12770, E14514, E16352, E16745, E16746, I74588, I74589, I74590, I74591, I74592, I74593, I74594, I74595, I74596, I74597, X57226, L16848, L27125.For example, the following feedback-resistant aspartate kinases from C. glutamicum are known from the literature: A279T, A279V, S301F, S301Y, T308I, T311I, R320G, G345D, S381F. Concerning. Feedback-resistant aspartate kinases from C. glutamicum are further referred to the following publications: JP1993184366-A . JP1994062866-A . JP1994261766-A . JP1997070291-A . JP1997322774-A . JP1998165180-A . JP1998215883-A . US5688671-A . EP0387527 . WO00 / 63388 . US3732144 . JP6261766 . Jetten et al. (1995; Applied Microbiology Biotechnology 43: 76-82 ). Feedback-resistant aspartate kinases from C. glutamicum are deposited in the NCBI GenBank under the following accession numbers: E05108, E06825, E06826, E06827, E08177, E08178, E08179, E08180, E08181, E08182, E12770, E14514, E16352, E16745, E16746, I74588 , I74589, I74590, I74591, I74592, I74593, I74594, I74595, I74596, I74597, X57226, L16848, L27125.

Bevorzugt werden erfindungsgemäß folgende feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. humireducens eingesetzt: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T311I, G359D.According to the invention, the following feedback-resistant aspartate kinases from C. humireducens are preferably used: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T311I, G359D.

Ebenso werden bei der Threonin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Homoserin-Dehydrogenase (HomFBR) enthalten.Similarly, strains are preferably used in the production of threonine, which accordingly contain a feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom FBR ).

Ebenso werden bei der Isoleucin-Produktion und Valin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Acetolactat-Synthase enthalten.Likewise, in isoleucine production and valine production, strains are preferably used which accordingly contain a feedback-resistant acetolactate synthase.

Ebenso werden bei der Leucin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Isopropylmalat-Synthase (LeuAFBR) enthalten.Similarly, leucine production preferably strains are used, which accordingly contain a feedback-resistant isopropyl malate synthase (LeuA FBR ).

Ebenso werden bei der Prolin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Glutamat-5-Kinase (ProBFBR) enthalten.Likewise, in proline production, strains are preferably used which accordingly contain a feedback-resistant glutamate-5-kinase (ProB FBR ).

Ebenso werden bei der Arginin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Ornithin-Carbamoyltransferase (ArgFFBR) enthalten.Likewise, in the production of arginine, preferably strains are used which accordingly contain a feedback-resistant ornithine carbamoyltransferase (ArgF FBR ).

Ebenso werden bei der Serin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerAFBR) enthalten.Likewise, strains are preferably used in serine production, which accordingly contain a feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA FBR ).

Ebenso werden bei der Methionin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerAFBR) und/oder feedback-resistente Pyruvat-Carboxylasen (PycFBR) enthalten.Likewise, in the production of methionine, preferably strains are used which accordingly contain a feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA FBR ) and / or feedback-resistant pyruvate carboxylases (Pyc FBR ).

Ebenso werden bei der Tryptophan-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Phospho-2-dehydro-3-Deoxyheptonat-Aldolase (AroGFBR oder AroHFBR) enthalten.Similarly, strains are preferably used in the tryptophan production, which accordingly contain a feedback-resistant phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase (AroG FBR or AroH FBR ).

Hinsichtlich weiterer bevorzugter Eigenschaften des erfindungsgemäß einzusetzenden L-Aminosäuren überproduzierenden C. humireducens-Stamms wird auf die oben zitierte Veröffentlichung von Wu et al. (2011) sowie die weiteren oben genannten Veröffentlichungen verwiesen.With regard to further preferred properties of the C. humireducens strain overproducing L-amino acids to be used according to the invention, reference is made to the above-cited Publication of Wu et al. (2011) and the other publications mentioned above.

Erfindungsgemäße Mikroorganismen, insbesondere Bakterien der Gattung Corynebacterium, können kontinuierlich - wie beispielsweise in der WO 05/021772 beschrieben- oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung bzw. Satzverfahren) oder im Fed-Batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994 )) verfügbar.Microorganisms according to the invention, in particular bacteria of the genus Corynebacterium, can be used continuously - as described, for example, in US Pat WO 05/021772 described batchwise or batchwise or in the fed-batch or repeated-fed-batch process for the production of L-lysine are cultivated. A general summary of known cultivation methods is available in the textbook of Chmiel (Bioprocessing Technology 1. Introduction to Bioprocess Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) or in the textbook of Storhas (bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994 )) available.

Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch " Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981 ) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.The culture medium or fermentation medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are in the handbook " Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981 ) contain. The terms culture medium and fermentation medium or medium are mutually exchangeable.

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder Milchsäure verwendet werden.As the carbon source, sugars and carbohydrates such as e.g. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions of sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid , Stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerin, methanol and ethanol, and organic acids such as acetic acid or lactic acid.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As the nitrogen source, organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate may be used. The nitrogen sources can be used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.

Das Kulturmedium muss weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.The culture medium must further contain salts, for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth. Finally, essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid in addition to the above substances can be used.

Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.The said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich. Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten L-Aminosäure, gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich. Durch die Tätigkeit der Bakterien kommt es zu einer Anreicherung (Akkumulation) der L-Aminosäure im Fermentationsmedium und/oder in den Bakterienzellen.For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used. The pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8. To control the foaming, antifoams, such as, for example, fatty acid polyglycol esters, can be used. In order to maintain the stability of plasmids, suitable, selectively acting substances, such as antibiotics, may be added to the medium. In order to maintain aerobic conditions, oxygen or oxygen-containing gas mixtures, such as air, are introduced into the culture. The use of liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible. Optionally, the fermentation at elevated pressure, for example at a pressure of 0.03 to 0.2 MPa, driven. The temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C. In batch method, the cultivation is continued until a maximum of the desired L-amino acid, has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours. In continuous processes longer cultivation times are possible. The activity of the bacteria leads to an accumulation (accumulation) of the L-amino acid in the fermentation medium and / or in the bacterial cells.

Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den Patentschriften 5,770,409 , US 5,840,551 und US 5,990,350 oder US 5,275,940 .Examples of suitable fermentation media can be found inter alia in the patents 5,770,409 . US 5,840,551 and US 5,990,350 or US 5,275,940 ,

Die Analyse von L-Aminosäuren zur Bestimmung der Konzentration zu einem oder mehreren Zeitpunkt(en) im Verlauf der Fermentation kann durch Trennung der L-Aminosäuren mittels lonenaustauschchromatographie vorzugsweise Kationenaustauschchromatographie mit anschließender Nachsäulenderivatisierung unter Verwendung von Ninhydrin erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958 )) beschrieben. Anstelle von Ninhydrin kann auch ortho-Phtadialdehyd zur Nachsäulenderivatisierung eingesetzt werden. Einen Übersichtsartikel zur lonenaustauschchromatographie findet man bei Pickering ( LC·GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989 )).The analysis of L-amino acids for determining the concentration at one or more times in the course of the fermentation can be carried out by separation of the L-amino acids by ion exchange chromatography, preferably cation exchange chromatography with subsequent post-column derivatization using ninhydrin, as in Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958 )). Instead of Ninhydrin can also be used ortho-Phtadialdehyd for Nachsäulenderivatisierung. A review on ion exchange chromatography can be found at Pickering ( LC · GC (Magazine of Chromatographic Science) 7 (6), 484-487 (1989 )).

Es ist ebenfalls möglich eine Vorsäulenderivatisierung beispielsweise unter Verwendung von ortho-Phtadialdehyd oder Phenylisothiocyanat vorzunehmen und die entstandenen Aminosäurederivate durch Reversed-Phase-Chromatographie (RP) vorzugsweise in Form der Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie (HPLC) aufzutrennen. Eine derartige Methode ist beispielsweise bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979 )) beschrieben.It is also possible Vorsäubnerivatisierung example using ortho-Phtadialdehyd or Phenylisothiocyanat make and the resulting amino acid derivatives by reversed-phase chromatography (RP), preferably in the form of high performance liquid chromatography (HPLC) to separate. Such a method is for example in Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979 )).

Die Detektion erfolgt photometrisch (Absorption, Fluoreszenz).Detection is photometric (absorption, fluorescence).

Eine zusammenfassende Darstellung zur Aminosäureanalyse findet man unter anderem im Lehrbuch " Bioanalytik" von Lottspeich und Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland 1998 ).A summary of the amino acid analysis can be found in the textbook " Bioanalytik "by Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany 1998 ).

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend auch ein Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt:

  1. a) Fermentation der erfindungsgemäßen Mikroorganismen, insbesondere coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder Corynebacterium humireducens, in einem geeignetem Nährmedium, und
  2. b) Akkumulation der L-Aminosäure in dem Nährmedium und/oder in den Zellen der genannten Bakterien.
The invention accordingly also provides a process for preparing an L-amino acid, which comprises carrying out the following steps:
  1. a) fermentation of the microorganisms according to the invention, in particular coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium, more preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium humireducens, in a suitable nutrient medium, and
  2. b) accumulation of the L-amino acid in the nutrient medium and / or in the cells of said bacteria.

Anschließend erfolgt die Bereitstellung bzw. Herstellung oder Gewinnung eines L-Aminosäure haltigen Produktes in flüssiger oder fester Form.Subsequently, the preparation or production or recovery of an L-amino acid-containing product takes place in liquid or solid form.

Durch die Maßnahmen der Fermentation erhält man eine Fermentationsbrühe, welche die betreffende L-Aminosäure enthält.By means of the fermentation, a fermentation broth containing the relevant L-amino acid is obtained.

Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium bzw. Nährmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medien enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der gewünschten L-Aminosäure sicherstellen.A fermentation broth is understood as meaning a fermentation medium or nutrient medium in which a microorganism has been cultivated for a certain time and at a certain temperature. The fermentation medium or the media used during the fermentation contains / contain all substances or Components that ensure an increase of the microorganism and formation of the desired L-amino acid.

Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe dementsprechend

  1. a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse (Zellmasse) des Mikroorganismus,
  2. b) das im Laufe der Fermentation gebildete L-Aminosäure,
  3. c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte, und
  4. d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin oder Salze wie Magnesiumsulfat.
At the conclusion of the fermentation, the resulting fermentation broth contains accordingly
  1. a) the biomass (cell mass) of the microorganism resulting from the multiplication of the cells of the microorganism,
  2. b) the L-amino acid formed during the fermentation,
  3. c) the organic by-products formed during the fermentation, and
  4. d) the components of the fermentation medium or of the starting materials not consumed by the fermentation, such as, for example, vitamins such as biotin or salts such as magnesium sulfate.

Zu den organischen Nebenprodukten gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen neben der gewünschten L-Aminosäure erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu gehören auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.The organic by-products include substances which are produced by the microorganisms used in the fermentation in addition to the desired L-amino acid and optionally excreted. These include sugars such as trehalose.

Die Fermentationsbrühe wird dem Kulturgefäß beziehungsweise dem Fermentationsbehälter entnommen, gegebenenfalls gesammelt, und dazu verwendet, ein L-Aminosäure haltiges Produkt in flüssiger oder fester Form bereitzustellen. Hierfür wird auch der Ausdruck "Gewinnen des L-Aminosäure haltigen Produktes" verwendet. Im einfachsten Fall stellt die L-Aminosäure-haltige Fermentationsbrühe selbst das gewonnene Produkt dar.The fermentation broth is removed from the culture vessel or fermentation vessel, optionally collected, and used to provide an L-amino acid-containing product in liquid or solid form. For this purpose, the expression "recovering the L-amino acid-containing product" is used. In the simplest case, the L-amino acid-containing fermentation broth itself represents the recovered product.

Durch eine oder mehrere der Maßnahmen ausgewählt aus der Gruppe

  1. a) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) Entfernung des Wassers,
  2. b) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) Entfernung der Biomasse, wobei diese gegebenenfalls vor der Entfernung inaktiviert wird,
  3. c) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) Entfernung der im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte, und
  4. d) teilweise (> 0%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3%, ≥ 99,7%) Entfernung der durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe,
aus der Fermentationsbrühe erzielt man eine Konzentrierung bzw. Reinigung der L-Aminosäure. Auf diese Weise werden Produkte isoliert, die einen gewünschten Gehalt an L-Aminosäure aufweisen.By one or more of the measures selected from the group
  1. a) partial (> 0% to <80%) to complete (100%) or nearly complete (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) Removal of the water,
  2. b) partially (> 0% to <80%) to complete (100%) or almost complete (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%) Removal of the biomass, optionally inactivating it before removal,
  3. c) partially (> 0% to <80%) to complete (100%) or almost complete (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99.3%, ≥ 99.7%) removal of organic by-products formed during fermentation, and
  4. d) partially (> 0%) to complete (100%) or almost complete (≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 96%, ≥ 97%, ≥ 98%, ≥ 99%, ≥ 99,3 %, ≥ 99.7%) removal of the components of the fermentation medium or of the starting materials not consumed by the fermentation,
From the fermentation broth, a concentration or purification of the L-amino acid is achieved. In this way, products are isolated which have a desired content of L-amino acid.

Die teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (≥ 80% bis < 100%) Entfernung des Wassers (Maßnahme a)) wird auch als Trocknung bezeichnet.The partial (> 0% to <80%) to complete (100%) or almost complete (≥ 80% to <100%) removal of the water (measure a)) is also referred to as drying.

Durch vollständige oder nahezu vollständige Entfernung des Wassers, der Biomasse, der organischen Nebenprodukte und der nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums gelangt man zu reinen ((≥ 80 Gew.-%, ≥ 90 Gew.-%) oder hochreinen (≥ 95 Gew.-%, ≥ 97 Gew.-%, ≥ 99% Gew.-%) Produktformen der L-Aminosäure. Für die Maßnahmen gemäß a), b), c) oder d) sind im Stand der Technik eine Fülle von technischen Anleitungen verfügbar.Complete or almost complete removal of the water, the biomass, the organic by-products and the unused constituents of the fermentation medium used gives pure ((≥80% by weight, ≥90% by weight) or high purity (≥95% by weight). -%, ≥ 97 wt .-%, ≥ 99% wt .-%) Product Forms of the L-amino acid For the measures according to a), b), c) or d) a wealth of technical instructions are available in the prior art ,

Ausführungsbeispieleembodiments Beispiel 1: Alanin- und Valin-Produktion durch C. humireducens Example 1: Alanine and valine production by C. humireducens

Zur Überprüfung der Alanin- und Valin-Produktion wurde der Typstamm von C. humireducens (DSM 45392) im Schüttelkolbenansatz kultiviert. Dazu wurde der C. humireducens Stamm in 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H2O) als Vorkultur bei 37°C mit 200 rpm 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Schüttelkolbenmedium auf eine OD660 von 0,2 inokuliert und bei 37°C mit 200 rpm, 48 h lang kultiviert. Zur Herstellung dieses Mediums wurden 20 g Ammoniumsulfat, 0,4 g MgSO4*7H2O, 0,6 g KH2PO4 und 10 g Hefeextrakt in 750 ml H2O gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 20% NH4OH auf 7,8 eingestellt und die Lösung anschließend autoklaviert. Anschließend wurden 4 ml einer Vitaminlösung (pH 7 mit NH4OH), bestehend aus 0,25 g/l Thiamin, 50 mg/l Cyanocobalamin, 25 mg/l Biotin und 1,25 g/l Pyridoxin, hinzugefügt. Des Weiteren wurden 140 ml einer sterilfiltrierten 50%igen Glukoselösung und 50 g trockenautoklaviertes CaCO3 hinzugefügt und das Medium anschließend auf einen Liter aufgefüllt.
Nach der Kultivierung wurde jeweils vom Überstand von vier parallelen Kulturen eine HPLC-Analyse zur Bestimmung des Gehaltes an Alanin, Glycin und Valin mit einer Nachweisgrenze von ≥0,01 g/l durchgeführt.To check the alanine and valine production, the type strain of C. humireducens (DSM 45392) was cultivated in a shake flask approach. For this purpose, the C. humireducens strain was incubated in 10 ml of BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours. Subsequently, 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 660 of 0.2 and cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 48 hours. To prepare this medium, 20 g of ammonium sulfate, 0.4 g of MgSO 4 .7H 2 O, 0.6 g of KH 2 PO 4 and 10 g of yeast extract were dissolved in 750 ml of H 2 O. The pH of the solution was adjusted to 7.8 with 20% NH 4 OH and the solution was then autoclaved. Subsequently, 4 ml of a vitamin solution (pH 7 with NH 4 OH) consisting of 0.25 g / l thiamine, 50 mg / l cyanocobalamin, 25 mg / l biotin and 1.25 g / l pyridoxine were added. Furthermore, 140 ml of a sterile-filtered 50% glucose solution and Add 50 g of dry autoclave CaCO 3 and then make up to one liter of medium.
After culturing, an HPLC analysis was carried out on the supernatant of four parallel cultures to determine the content of alanine, glycine and valine with a detection limit of ≥0.01 g / l.

Der Typstamm von C. humireducens produziert nach 48 h Kultivierung in Schüttelkolbenmedium bei 37°C, 200 rpm im Schüttelkolbenmaßstab rund 0,81 g/l Alanin (Netto-Ausbeute: 0,011 gAlanin/gGlukose) und 1,6 g/l Valin (Netto-Ausbeute: 0,022 gvalin/gGlukose) (Tab. 1). Glycin fiel nur in geringer Menge als Nebenprodukt an. Tab. 1: Analytikwerte eines Schüttelkolbenversuches mit dem Typstamm von C. humireducens. Aufgeführt sind die gemessenen Werte nach der Kultivierung mit Zellen und die des leeren Mediums. Alanin (g/l) Valin (g/l) C. humireducens 1,27 1,9 Leer-Medium ohne Zellen 0,46 0,3 The type strain of C. humireducens produced after 48 h of culture in shake flask medium at 37 ° C, 200 rpm in the shaking flask scale about 0.81 g / l alanine (net yield: 0.011 g alanine / g glucose ) and 1.6 g / l valine (Net yield: 0.022 g valine / g glucose ) (Table 1). Glycine was a minor by-product. <B> Table. 1: </ b> Analytical values of a shake flask experiment with the type strain of C. <i> humireducens. </ I> The measured values are given after culturing with cells and those of the empty medium. Alanine (g / l) Valine (g / l) C. humireducens 1.27 1.9 Empty medium without cells 0.46 0.3

Beispiel 3: Glutamat-LeistungstestExample 3: glutamate performance test

Für den L-Glutamat-Leistungstest wurde der Typstamm von C. humireducens (DSM 45392) im Schüttelkolbenansatz kultiviert. Dazu wurde der C. humireducens Stamm in 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H2O) als Vorkultur bei 37°C mit 200 rpm 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Schüttelkolbenmedium auf eine OD660 von 0,2 inokuliert und bei 37°C mit 200 rpm, 48 h lang kultiviert. Zur Herstellung dieses Mediums wurden 20 g Ammoniumsulfat, 0,4 g MgSO4*7H2O, 0,6 g KH2PO4 und 10 g Hefeextrakt in 750 ml H2O gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 20% NH4OH auf 7,8 eingestellt und die Lösung anschließend autoklaviert. Anschließend wurden 4 ml einer Vitaminlösung (pH 7 mit NH4OH), bestehend aus 0,25 g/l Thiamin, 50 mg/l Cyanocobalamin, 25 mg/l Biotin und 1,25 g/l Pyridoxin hinzugefügt. Des Weiteren wurden 140 ml einer sterilfiltrierten 50%igen Glukoselösung und 50 g trockenautoklaviertes CaCO3 hinzugefügt. Daraufhin kamen noch 5 ml einer 400 mM sterilfiltierten Threonin-Stammlösung hinzu und das Medium wurde anschließend auf einen Liter aufgefüllt.For the L-glutamate performance test, the type strain of C. humireducens (DSM 45392) was cultured in the shake flask approach. For this purpose, the C. humireducens strain was incubated in 10 ml of BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours. Subsequently, 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 660 of 0.2 and cultured at 37 ° C. at 200 rpm for 48 hours. To prepare this medium, 20 g of ammonium sulfate, 0.4 g of MgSO 4 .7H 2 O, 0.6 g of KH 2 PO 4 and 10 g of yeast extract were dissolved in 750 ml of H 2 O. The pH of the solution was adjusted to 7.8 with 20% NH 4 OH and the solution was then autoclaved. Subsequently, 4 ml of a vitamin solution (pH 7 with NH 4 OH) consisting of 0.25 g / l thiamine, 50 mg / l cyanocobalamin, 25 mg / l biotin and 1.25 g / l pyridoxine were added. Furthermore, 140 ml of a sterile-filtered 50% glucose solution and 50 g of dry autoclaved CaCO 3 were added. Then 5 ml of a 400 mM sterile-filtered threonine stock solution were added and the medium was then made up to one liter.

Nach der Kultivierung wurde jeweils vom Überstand von vier parallelen Kulturen eine HPLC-Analyse zur Bestimmung des Glutamatgehaltes mit einer Nachweisgrenze von ≥0,01 g/l durchgeführt.After culturing, an HPLC analysis was carried out on the supernatant of four parallel cultures to determine the glutamate content with a detection limit of ≥0.01 g / l.

Der Typstamm von C. humireducens produzierte nach 48 h Kultivierung in Schüttelkolbenmedium bei 37°C, 200 rpm im Schüttelkolbenmaßstab 1,8 (+/-0,6) g/l L-Glutamat. Die Ausgangskonzentration an L- Glutamat im Medium lag bei 0,78 (+/-0,1) g/l. Glycin fiel nur in geringer Menge als Nebenprodukt an.The type strain of C. humireducens produced after 48 hours of culture in shake flask medium at 37 ° C, 200 rpm in a shake flask scale 1.8 (+/- 0.6) g / l L-glutamate. The starting concentration of L-glutamate in the medium was 0.78 (+/- 0.1) g / l. Glycine was a minor by-product.

Claims (15)

  1. Glycine cleavage system comprising the enzymes GcvP, GcvT and GcvH, characterized in that said system comprises at least one of the following polypeptides:
    a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
    b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
    c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 38.
  2. Glycine cleavage system according to Claim 1, characterized in that said system comprises two, preferably all three of the polypeptides mentioned above.
  3. Glycine cleavage system according to Claim 2, characterized in that said system comprises the following polypeptides:
    a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
    b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
    c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 95 or 98% to the sequence according to SEQ ID NO: 38.
  4. Glycine cleavage system according to any of the preceding claims, characterized in that said system comprises at least one further polypeptide selected from the group consisting of:
    a) an enzyme LipA having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 48,
    b) an enzyme LipB having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 50,
    c) an enzyme Lpd having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 52,
    d) an enzyme LplA having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 94,
    e) an enzyme GcvL having a sequence identity of at least 80% to the sequence according to SEQ ID NO: 96.
  5. Polypeptides, which constitute enzymes of a glycine cleavage system, selected from the group consisting of:
    a) an enzyme GcvP having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, particularly at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 40,
    b) an enzyme GcvT having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, particularly at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 42,
    c) an enzyme GcvH having a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85 or 90%, particularly at least 92, 94, 96 or 98%, especially 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 38.
  6. Polynucleotides, which code for enzymes of a glycine cleavage system, selected from the group consisting of:
    a) a polynucleotide (gcvP), which codes for the enzyme GcvP and has a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, particularly at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of position 301 to 3162 according to SEQ ID NO: 39 and/or hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide of which the sequence is complementary to the sequence of position 301 to 3162 according to SEQ ID NO: 39;
    b) a polynucleotide (gcvT), which codes for the enzyme GcvT and has a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, particularly at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of position 301 to 1404 according to SEQ ID NO: 41 and/or hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide of which the sequence is complementary to the sequence of position 301 to 1404 according to SEQ ID NO: 41;
    c) a polynucleotide (gcvH), which codes for the enzyme GcvH and has a sequence identity of at least 70 or 75%, preferably at least 80 or 85%, particularly at least 90 or 95%, especially at least 98 or 100%, to the sequence of position 301 to 699 according to SEQ ID NO: 37 and/or hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide of which the sequence is complementary to the sequence of position 301 to 699 according to SEQ ID NO: 37.
  7. Vector, characterized in that said vector comprises at least one polynucleotide, preferably at least two or three polynucleotides, according to Claim 6.
  8. Recombinant microorganism, characterized in that said microorganism comprises at least one glycine cleavage system according to any of Claims 1 to 4 and/or polynucleotides coding for such a glycine cleavage system and/or at least one polypeptide according to Claim 5 and/or a polynucleotide coding for such a polypeptide or polynucleotides coding for such polypeptides and/or at least one polynucleotide according to Claim 6 and/or a vector according to Claim 7.
  9. Recombinant microorganism according to Claim 8, characterized in that the glycine cleavage system and/or polynucleotides coding for such a system are present in overexpressed form.
  10. Recombinant microorganism according to Claim 8 or 9, characterized in that said microorganism is an L-methionine-overproducing strain having at least one, preferably at least two or three, particularly preferably at least four or five, of the following features:
    a) an attenuated polynucleotide (mcbR), which codes for a DNA binding domain of the type HTH tetR (McbR), preferably for a DNA binding domain having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 2,
    b) an attenuated polynucleotide (thrB gene), which codes for a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39), preferably for a homoserine kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4,
    c) an attenuated polynucleotide (pgi), which codes for a glucose-6-phosphate isomerase (Pgi, EC 5.3.1.9), preferably for a glucose-6-phosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6,
    d) an attenuated polynucleotide (pck), which codes for a phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32), preferably for a phosphoenolpyruvate carboxykinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 8,
    e) an attenuated polynucleotide (metQ), which codes for a D-methionine-binding lipoprotein (MetQ), preferably for a D-methionine-binding lipoprotein having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 10,
    f) an attenuated polynucleotide (metP), which codes for a methionine transporter (MetP), preferably for a methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 12,
    g) an attenuated polynucleotide (metN), which codes for an ATP-dependent methionine transporter (MetN), preferably for an ATP-dependent methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 14,
    h) an attenuated polynucleotide (metK), which codes for an S-adenosylmethionine synthase (MetK), preferably for an S-adenosylmethionine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 16,
    i) an attenuated polynucleotide (metI), which codes for a methionine import system permease (MetI), preferably for a methionine import system permease having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 18,
    j) an attenuated polynucleotide (dapA), which codes for a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase (DapA), preferably for a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 20,
    k) an overexpressed polynucleotide (CBS), which codes for a cysteine synthase (CBS), preferably for a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 22,
    l) an attenuated polynucleotide, which codes for a cg3031 homologue, preferably for a cg3031 homologue having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 24,
    m) an overexpressed polynucleotide (aecD), which codes for a cystathionine beta-lyase (AecD), preferably for a cystathionine beta-lyase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 26,
    n) an overexpressed polynucleotide (asd), which codes for an aspartate semialdehyde dehydrogenase (Asd), preferably for an aspartate semialdehyde dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 28,
    o) an overexpressed polynucleotide (metH), which codes for a 5-methyltetrahydrofolate homocysteine methyltransferase (MetH, EC 2.1.1.13),
    p) an overexpressed polynucleotide (brnE), which codes for the smaller subunit of a transporter for branched-chain amino acids (BrnE), preferably for a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 30,
    q) an overexpressed polynucleotide (brnF), which codes for the larger subunit of a transporter for branched-chain amino acids (BrnF), preferably for a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 32,
    r) an overexpressed polynucleotide (cysE), which codes for a serine acetyltransferase (CysE), preferably for a serine acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 34,
    s) an overexpressed polynucleotide (cysK), which codes for a cysteine synthase (CysK), preferably for a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 36,
    t) an overexpressed polynucleotide (glyA), which codes for a serine hydroxymethyltransferase (GlyA), preferably for a serine hydroxymethyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 44,
    u) an overexpressed polynucleotide (hom), which codes for an optionally feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Hom), preferably for a homoserine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 46,
    v) an overexpressed polynucleotide (lysC), which codes for an optionally feedback-resistant aspartate kinase (LysC), preferably for an aspartate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 54,
    w) an overexpressed polynucleotide (metB), which codes for a cystathionine gamma-synthase (MetB), preferably for a cystathionine gamma-synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 56,
    x) an overexpressed polynucleotide (metF), which codes for a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MetF), preferably for a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 58,
    y) an overexpressed polynucleotide (metX), which codes for a homoserine O-acetyltransferase (MetX), preferably for a homoserine O-acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 60,
    z) an overexpressed polynucleotide (metY), which codes for an O-acetylhomoserine lyase (MetY), preferably for an O-acetylhomoserine lyase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 62,
    aa) an overexpressed polynucleotide (pyc), which codes for a pyruvate carboxylase (Pyc), preferably for a pyruvate carboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 64,
    bb) an overexpressed polynucleotide (serA), which codes for an optionally feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA), preferably for a D-3-phosphoglycerate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66,
    cc) an overexpressed polynucleotide (serB), which codes for a phosphoserine phosphatase (SerB), preferably for a phosphoserine phosphatase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 68,
    dd) an overexpressed polynucleotide (serC), which codes for a phosphoserine aminotransferase (SerC), preferably for a phosphoserine aminotransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 70,
    ee) an overexpressed polynucleotide (ald), which codes for an alanine dehydrogenase (Ald), preferably for an alanine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 72,
    ff) an overexpressed polynucleotide (cysD), which codes for the subunit of a sulphate adenylyltransferase (CysD), preferably for a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 74,
    gg) an overexpressed polynucleotide (cysH), which codes for an adenosine phosphosulphate reductase (CysH), preferably for an adenosine phosphosulphate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 76,
    hh) an overexpressed polynucleotide (cysI), which codes for a sulphite reductase (CysI), preferably for a sulphite reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 78,
    ii) an overexpressed polynucleotide (cysJ), which codes for (CysJ), preferably for one having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 80,
    jj) an overexpressed polynucleotide (cysN), which codes for the subunit of a sulphate adenylyltransferase (CysN), preferably for a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 82,
    kk) an overexpressed polynucleotide (cysY), which codes for a cystathionine beta-synthase (CysY), preferably for a cystathionine beta-synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 84,
    ll) an overexpressed polynucleotide (cysZ), which codes for a putative sulphate transporter (CysZ), preferably for a sulphate transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 86,
    mm) an overexpressed polynucleotide (metE), which codes for a 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine methyltransferase (MetE), preferably for a protein having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 88,
    nn) an overexpressed polynucleotide (ptH1), which codes for a peptidyl-tRNA hydrolase 1 (PtH1), preferably for a peptidyl-tRNA hydrolase 1 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 90,
    oo) an overexpressed polynucleotide (ptH2), which codes for a peptidyl-tRNA hydrolase 2 (PtH2), preferably for a peptidyl-tRNA hydrolase 2 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 92.
  11. Recombinant microorganism according to any of Claims 8 to 10, characterized in that said microorganism is a coryneform bacterium, particularly a Corynebacterium, preferably C. glutamicum or C. humireducens.
  12. Method for overproducing an L-amino acid, characterized in that a glycine cleavage system according to any of Claims 1 to 4 and/or at least one polypeptide according to Claim 5 and/or at least one polynucleotide according to Claim 6 and/or a vector according to Claim 7 and/or a recombinant microorganism according to any of Claims 8 to 11 is used in said method.
  13. Method according to the preceding claim, characterized in that the overproduced L-amino acid is selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, particularly L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of the aspartate family, particularly L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine.
  14. Method according to Claim 13, characterized in that the overproduced L-amino acid is L-methionine.
  15. Method according to any of the preceding claims, characterized in that only low amounts of glycine occur as by-product.
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