JP4168463B2 - Method for producing L-lysine - Google Patents

Description

【００２８】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２９】
E. coliにプラスミドを導入して形質転換するには D.M.Morrisonの方法（Methods in Enzymology, 68, 326, 1979）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970)）等により行うことができる。
【００３０】
上記のようにしてＡＫ野生株からlysCを単離すれば野生型lysCが得られ、ＡＫ変異株からlysCを単離すれば変異型lysCが得られる。
野生型lysCを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を、配列表配列番号３に示す。この塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００３１】
本発明に用いる変異型lysCとしては、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害が解除されたＡＫをコードするものであれば特に制限されないが、野生型ＡＫのアミノ酸配列において、αサブユニットではＮ末端から２７９番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に、βサブユニットではＮ末端から３０番目のアラニン残基に相当するアミノ酸残基がアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられる。ここで、野生型ＡＫのアミノ酸配列としては、具体的にはαサブユニットでは配列表配列番号５に示すアミノ酸配列が、βサブユニットでは配列表配列番号７に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【００３２】
また、上記のアラニン以外かつ酸性アミノ酸以外のアミノ酸残基として好ましいものは、スレオニン残基、アルギニン残基、システイン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基、セリン残基、チロシン残基及びバリン残基が挙げられる。尚、置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わない。
【００３３】
また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型ＡＫのアミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想される。このような酵素の活性に関与しない１又は２以上の位置での１又は２以上のアミノ酸残基の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するＡＫも本発明に使用することができる。このような自然変異を有するＡＫをコードするＤＮＡは、ＡＫを保持する微生物細胞から、例えば配列表の配列番号３に記載の塩基配列の少なくとも一部を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを単離することによって、取得され得る。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは温度が完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ〜（Ｔｍ−３０）℃、好ましくはＴｍ〜（Ｔｍ−２０）℃の範囲で、かつ１×ＳＳＣ、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３４】
さらに、ＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、他の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による人工変異を有するＡＫも使用できる。このような人工変異を有するＡＫをコードするlysCは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が置換、欠失、あるいは挿入されるように塩基配列を改変することによって得られる。また、このような変異を有するlysCは、従来知られている突然変異処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、lysCを含むＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及びlysCを含むＤＮＡを保持する微生物を、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。変異処理した後、変異処理されたＤＮＡ又は変異処理された微生物から、これらがコードし又は産生するＡＫがＡＫ活性を保持し、かつ、ＡＫのアミノ酸配列が変異したものを選択することによって、変異を導入することができる位置、又は変異が生じた位置を決定することができる。導入される変異の位置は、ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に制限されない。また、導入される変異の数は、タンパク質の立体構造における変異されるアミノ酸の位置や種類によっても異なり、ＡＫ活性及びフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、特に制限されないが、通常、１〜２０個、好ましくは１〜１０個である。
【００３５】
上記のような変異を有するＡＫのアミノ酸配列における上記特定のアラニン残基に相当するアミノ酸残基は、当業者であれば容易に特定できる。
【００３６】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００３７】
（２）dapBの取得
dapBを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００３８】
ＤＤＰＲをコードするＤＮＡ配列は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知であり（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたdapBを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００３９】
dapBを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１１に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号１１に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＰＲ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するdapBは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００４０】
E. coliJM109株に後記実施例で得られたdapBを含むプラスミドpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００４１】
（３）dapAの取得
dapAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００４２】
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡ配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X53993参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号１２及び１３に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたdapAを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００４３】
dapAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１４に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１５に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号１５に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＰＳ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するdapAは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００４４】
E. coliJM109株に後記実施例で得られたdapAを含むプラスミドpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００４５】
（４）lysAの取得
lysAを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌染色体からPCRにより調製することができる。ＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。
【００４６】
コリネ型細菌においては、lysAはargS（アルギニル−tRNAシンターゼ遺伝子）とともにオペロンを形成しており、argSの下流にlysAが存在している。lysAの発現は、argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける（Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362 (1993)参照）。これらの遺伝子の塩基配列は、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知であり（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号１６（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)に記載されている塩基配列において塩基番号１１〜３３に相当する）及び配列番号１７（Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)に記載の塩基配列において塩基番号１３７０〜１３９２に相当する）に示す塩基配列を有する各々23merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたlysAを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００４７】
後記実施例では、lysAを増強するために、プロモーター、argS及びlysAを含むＤＮＡ断片を用いたが、argSは本発明に必須ではなく、lysAがプロモーターの直下に連結されたＤＮＡ断片を用いてもよい。
【００４８】
argS及びlysAを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号１８に示す。また、argSがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号１９に、lysAがコードするアミノ酸配列の一例を配列番号２０に示す。本発明には、このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号２０に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＤＤＣ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するlysAは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００４９】
（５）aspCの取得
aspCを含むＤＮＡ断片は、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の微生物の染色体から調製された遺伝子ライブラリーより、ＡＡＴ欠損株の栄養要求性を相補することを指標として調製することができる。コリネ型細菌のＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株が挙げられる。また、エシェリヒア属細菌のＤＮＡ供与菌としては特に制限されないが、E. coli JM109株が挙げられる。
【００５０】
具体的には、コリネ型細菌のaspCを取得する方法はすでに既知であり（特公平6-102028参照）、この方法に従って取得することができる。
【００５１】
また、ＡＡＴをコードするＤＮＡ配列は、E. coliにおいて既知であり（Kuramitsu,S. et al;J.Biochem. 97 (4),1259-1262(1985)参照）、これを基にしてPCR用DNAプライマーを調製することができる。このようなDNAプライマーとして具体的には、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々20merのＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの合成、PCR反応、得られたaspCを含むプラスミドの調製等は、前記のlysCの場合と同様にして行うことができる。
【００５２】
aspCを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列の一例を配列番号２３に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２４に示す。また、aspCを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列の別の例を配列番号３０に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号３１に示す。本発明には、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の他、配列番号２４または３１に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、すなわちＡＡＴ活性に実質的に影響がない限り、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入等による変異を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片も同様に使用できる。このような自然変異又は人工変異を有するaspCは、前記のＡＫ活性、及びＬ−リジン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない変異を有するＡＫをコードするＤＮＡと同様にして取得することができる。
【００５３】
配列番号３０に示す塩基配列を有するaspCは、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のものであって、後記実施例９に記載の方法により、本発明によって初めて得られたものである。従って、本発明は、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。このＤＮＡとして具体的には、配列番号３０に示す塩基配列のうち、少なくとも塩基番号８７９〜２１７４からなる塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。
【００５４】
＜２＞本発明の組換えＤＮＡ及びコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼ（変異型ＡＫ）を保持し、さらにジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするＤＮＡ配列、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列が増強されたコリネ型細菌である。
【００５５】
ここでＤＮＡを「増強する」とは、遺伝子のコピー数を高くする、プロモーターを強力なものを使用する、比活性の高い酵素をコードする遺伝子を使用する、あるいはこれらを組み合わせるなどして、そのＤＮＡによりコードされる酵素の細胞中の活性を高くすることをいう。
【００５６】
変異型ＡＫを保持するコリネ型細菌としては、突然変異によって変異型アスパルトキナーゼを産生するようになったものでもよく、また、変異型lysCを導入することによって形質転換されたものでもよい。
【００５７】
上記ＤＮＡを導入するコリネ型細菌の例としては、例えば次のようなＬ−リジン生産性野生株が挙げられる。
【００５８】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032
（ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020
（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869
（コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990
（ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066
ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)
【００５９】
また、上記菌株以外にも、これらの菌株から誘導されたＬ−リジン生産能を有する変異株等も、宿主として利用できる。この様な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437号、特公平7-112438号参照）、その成長にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株（米国特許第4411997号）。
【００６０】
上記のような宿主においてＬ−リジン生合成遺伝子を増強するには、具体的な例としては、これらの遺伝子をプラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター等を用いて宿主に導入する。その際、低コピー型のベクターを用いてもある程度の増強は期待できるが、マルチコピー型のベクターを用いることが好ましい。そのようなベクターとして、上記pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148及びpAJ440等のプラスミドベクターが挙げられる。また、コリネ型細菌由来のトランスポゾンは、WO02/02627国際公開パンフレット、WO93/18151国際公開パンフレット、欧州特許公開0445385号、特開平6-46867号、Vertes, A. A. et al., Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994)、Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994)、Vertes, A. A. et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994)、Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995)、特開平7-107976号、特開平7-327680号等に記載されている。
【００６１】
尚、本発明において、変異型lysCは必ずしも増強されている必要はなく、前記したように染色体ＤＮＡ上のlysCに変異を有するもの、あるいは変異型lysCが染色体ＤＮＡに組み込まれたものでもよいが、プラスミドベクターを用いて導入されても差し支えない。一方、dapA、dapB、lysA及びaspCは、効率よくＬ−リジンを生産させるためには増強されていることが好ましい。
【００６２】
lysC、dapA、dapB、lysA及びaspCの各遺伝子の導入は、それぞれ別個のベクターを用いて宿主に順次導入してもよく、単一のベクターを用いて２種類、３種類４種類、又は５種類の遺伝子を共に導入してもよい。別個のベクターを用いる場合には、遺伝子の導入の順序は問わないが、宿主での安定な分配保持機構を有し、互いに共存可能なベクターを用いることが好ましい。
【００６３】
特に、aspCをコリネ型細菌に導入するためのベクターとしては、ベクターpVK7を用いることが好ましい。ベクターpVK7は、本発明により提供されるコリネ型細菌用クローニングベクターであって、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。ベクターpVK7は、後記実施例８に記載の方法で構築できる。
【００６４】
変異型ＡＫを保持し、さらにdapB、dapA、lysA及びaspCが増強されたコリネ型細菌は、例えば、変異型lysC、及びdapB、dapA、lysA及びaspCを含み、コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換えＤＮＡを宿主コリネ型細菌に導入することによって、得られる。
【００６５】
上記のような組換えＤＮＡは、例えば、プラスミドベクター、トランスポゾン、ファージベクター等のベクターに、Ｌ−リジン生合成遺伝子の各々を挿入することによって得られる。
【００６６】
宿主への組換えＤＮＡの導入の方法は、プラスミドの場合、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によって行うことができる。トランスポゾンを用いた遺伝子の増幅は、プラスミドにトランスポゾンを搭載させて細胞内に導入し、トランスポゾンの転位を誘導することにより行なうことができる。
【００６７】
本発明のコリネ型細菌は、上記の各遺伝子の他、Ｌ−リジン生合成に関与する他の遺伝子、例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ配列等が増強されてもよい。
【００６８】
＜３＞Ｌ−リジンの製造法
上記のようにしてＬ−リジン生合成遺伝子が増強されたコリネ型細菌を好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造することができる。
【００６９】
使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜やでんぷんの加水分解物などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００７０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００７１】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じてリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００７２】
培養は好気的条件下で30〜90時間実施するのがよく、培養温度は２５℃〜３７℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御することが好ましい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。培養物からのＬ−リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００７３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７４】
【実施例１】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生型lysC及び変異型lysCの取得
＜１＞野生型及び変異型lysCの取得、及びそれらを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株、及びATCC13869株より変異処理により得られたＬ−リジン生産性変異株AJ3445（FERM P-1944）を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。AJ3445株は、変異によりlysCがリジン及びスレオニンによる協奏阻害が実質的に解除されている（Journal of Biochemistry 68, 701-710 (1970)）。
【００７５】
染色体DNAよりPCR法（polymerase chain reaction；White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185(1989)参照）によりlysCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてlysCをコードする約1643bpの領域を増幅すべく、配列番号１及び配列番号２に示す塩基配列を有する23mer及び21merの一本鎖ＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成はApplied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）常法に従って合成した。
【００７６】
PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。増幅された1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。
【００７７】
遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S et al;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅されたlysC断片と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたlysC断片が接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869株由来のlysCを有するプラスミドをp399AKY、Ｌ−リジン生産菌であるAJ3463由来のlysCを有するプラスミドをp399AK9と命名した。
【００７８】
p399AKYおよびp399AK9に、それぞれコリネバクテリウム属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力をもつＤＮＡ断片（以下「Brevi.-ori」と記す）を導入し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能なlysCを搭載したプラスミドを作製した。Brevi.-oriは、これを含み、エシェリヒア・コリと、コリネバクテリウム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なプラスミドベクターpHK4から調製した。pHK4は、pHC4をKpnI（宝酒造（株）製）及びBamHI（宝酒造（株）製）で切断し、Brevi.-ori断片を抽出し、同じくKpnI及びBamHIにて切断したpHSG298に接続することによって構築される（特開平5-7491号公報参照）。pHK4は、宿主にカナマイシン耐性を付与する。尚、pHK4を保持するエシェリヒア・コリHB101は、エシェリヒア・コリ AJ13136と命名され、１９９５年８月１日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5186として寄託されている。
【００７９】
pHK4を、制限酵素KpnI及びBamHIにて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-ori ＤＮＡ断片を同じくBamHIにて切断したp399AKY、p399AK9に接続し、コリネバクテリウム属細菌中で自律複製可能でかつlysCを含むプラスミドを作製した。
【００８０】
p399AKY由来の野生型lysCを含むプラスミドをp399AKYBと命名し、p399AK9由来の変異型lysCを含むプラスミドをp399AK9Bと命名した。p399AK9B、p399AKYB構築の過程を図１に示す。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株であるAJ12036株（FERM BP-734）に変異型lysCプラスミドp399AK9Bを導入した株AJ12691は、１９９２年４月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM P-12918として寄託され、１９９５年２月１０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4999の受託番号で寄託されている。
【００８１】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの野生型lysC及び変異型lysCの塩基配列の決定
野生型lysCを含むプラスミドp399AKY及び変異型lysCを含むプラ スミドp399AK9を各々の形質転換体から調製し、野生型及び変異型lysCの塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci.74,5463(1977)などがある）によった。
【００８２】
p399AKYにコードされている野生型lysCの塩基配列を配列表の配列番号３に示す。一方、p399AK9にコードされている変異型lysCの塩基配列は野生型lysCと比べ、配列番号３において１０５１番目のＧがＡに変化しているという１塩基の変異のみを有していた。コリネバクテリウム・グルタミカムのlysCは、同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていることが知られているが（Kalinowski,J et al;Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204参照）、相同性から判断して本遺伝子も同一のＤＮＡ鎖にα、βの２本のサブユニットが同一のリーディングフレームでコードされていると考えられる。
【００８３】
ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のαサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡ配列と同時に配列表の配列番号４に、アミノ酸配列のみを配列番号５に示す。また、ＤＮＡ塩基配列より推定される野生型ＡＫタンパク質のβサブユニットのアミノ酸配列をＤＮＡと同時に配列表の配列番号６に、アミノ酸配列のみを配列番号７に示す。尚、各サブユニットとも、開始コドンにＧＴＧが用いられており、対応するアミノ酸をメチオニンと表記しているが、これは、メチオニン、バリン、またはフォルミルメチオニンを表すものである。
【００８４】
一方、変異型lysC配列上の変異は、野生型ＡＫタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５、７）において、αサブユニットでは２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、βサブユニットでは３０番目のアラニン残基がスレオニン残基にというアミノ酸残基置換を起こしていることを意味する。
【００８５】
【実施例２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapBの取得
＜１＞dapBの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapBを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムにおいて既知となっている配列（Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照）を基にしてＤＤＰＲをコードする約2.0kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号８及び９に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡ断片を合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された２００１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpCR-Script（Invitrogen社製）を用い、増幅したdapB断片と接続した。この様にしてpCR-Scriptにブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapB断片２００１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapBを有するプラスミドをpCRDAPBと命名した。E. coliJM109株にpCRDAPBを導入して得られた形質転換株AJ13107株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5114の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００８６】
更に、pCRDAPBをEcoRVとSphIで切断する事により、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、pHSG399をHincIIおよびSphIにて切断したものと連結したプラスミドを作成した。この作成したプラスミドをp399DPRと命名した。
【００８７】
作製したp399DPRにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapBを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399DPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapBを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpDPRBと命名した。pDPRB構築の過程を図２に示す。
【００８８】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapBの塩基配列の決定
p399DPRを保持するAJ13107株からプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１１に示す。
【００８９】
【実施例３】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapAの取得
＜１＞dapAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRによりdapAを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、EMBL accession No.X53993参照）を基にしてＤＤＰＳをコードする約1.5kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１２及び１３に記載の塩基配列を有する各々23merのＤＮＡを合成した。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された１４１１ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpCR1000（Invitrogen社製；Bio/Technology 9, 657-663 (1991)参照）を用い、増幅したdapA断片と接続した。DNAの接続はDNAライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpCR1000にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム染色体より増幅されたdapA断片１４１１ｂｐの接続されたプラスミドを作製した。この様にして取得したATCC13869由来のdapAを有するプラスミドをpCRDAPAと命名した。
【００９０】
E. coliJM109株にpCRDAPAを導入して得られた形質転換株AJ13106株は、１９９５年５月２６日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号FERM BP-5113の受託番号で、ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００９１】
作製したpCRDAPAにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なdapAを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みSmaIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をSmaIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをSmaIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくSmaIにて切断したpCRDAPAに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAを含むプラスミドを作製した。このプラスミドをpDPSBと命名した。pDPSB（Km^r）の構築過程を図３に示す。
【００９２】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムdapAの塩基配列の決定
pCRDAPAを保持するAJ13106株からプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号１４に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号１５に示す。
【００９３】
【実施例４】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの取得
＜１＞lysAの取得及びそれを含有するプラスミドの作製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株を染色体ＤＮＡの供与体として用いた。ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCRにより、argS、lysA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 (1990)、Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)参照）を基にしてアルギニル−tRNAシンターゼ及びＤＤＣをコードする約3.6kbの領域を増幅すべく、配列表の配列番号１６及び１７に記載の塩基配列を有する各々23merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された３５７９ｂｐの遺伝子断片のクローン化用のベクターにはpHSG399を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造(株)製）にて切断し、増幅されたlysAを含むＤＮＡ断片と接続した。この様にして取得したATCC13869由来のlysAを有するプラスミドをp399LYSAと命名した。
【００９４】
更に、p399LYSAをKpnI（宝酒造(株)製）とBamHI（宝酒造(株)製）で切断することにより、lysAを含むＤＮＡ断片を抽出した。このＤＮＡ断片を、pHSG299をKpnIとBamHIで切断したものと連結した。得られたプラスミドをp299LYSAと命名した。p299LYSA構築の過程を図４に示す。
【００９５】
得られたp299LYSAにBrevi.-oriを導入し、コリネ型細菌中で自律複製可能なlysAを搭載したプラスミドを作製した。pHK4を制限酵素KpnI及びBamHIで切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp299LYSAに接続し、コリネ型細菌中で自律複製可能でかつlysAを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをpLYSABと命名した。pLYSAB構築の過程を図５に示す。
【００９６】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムlysAの塩基配列の決定
p299LYSAのプラスミドDNAを調製し、実施例１と同様にして塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、この塩基配列のうち、argSがコードするアミノ酸配列及びlysAがコードするアミノ酸配列を、各々配列番号１９及び２０に示す。
【００９７】
【実施例５】
エシェリヒア・コリaspC及びそれを含有するプラスミドの作製
E. coli JM109株を染色体DNAの供与体として用いた。E. coli JM109株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりＰＣＲにより、aspCを含むＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーとしては、E. coliにおいて既知となっている配列（Kuramitsu,S. et al;J.Biochem. 97 (4),1259-1262(1985)参照）を基にして、配列表の配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有する各々２０merの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びPCR反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された１３３１ｂｐの遺伝子断片をＴＡクローニングベクターｐＣＲ１０００にクローン化した。構築したプラスミドをpCRASPCと命名した。
【００９８】
増幅されたaspCを含むＤＮＡの塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号２４に示す。
【００９９】
【比較例１】
変異型lysC及びdapAを併せ持つプラスミドの作製
dapAを有するプラスミドpCRDAPAと変異型lysC及びBrevi.-oriを有するプラスミドp399AK9Bより、変異型lysC、dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するプラスミドを作製した。p399AK9BをSalIにて完全分解した後、平滑末端化し、EcoRIリンカーを接続する事によりSalI部位をEcoRI部位に改変したプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp399AK9BSEと命名した。p399AK9BSEをEcoRIにて部分分解することよって変異型lysCとBrevi.−oriを一つのフラグメントとして切り出した。このフラグメントをpCRDAPAをEcoRIにて切断したものと連結した。得られたプラスミドをpCRCABと命名した。このプラスミドはE. coliとコリネ型細菌中で自律増殖可能で、かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、変異型lysCとdapAを併せ保持しているプラスミドである。pCRCABの作製過程を図６に示す。
【０１００】
【比較例２】
変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
変異型lysCを有するプラスミドp399AK9とdapBを有するプラスミドp399DPRより、変異型lysC、dapBを含むプラスミドを作製した。p399DPRをEcoRVとSphIで切断することにより、DDPRの構造遺伝子を含む１１０１ｂｐの断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIで切断した後平滑末端化し、更にSphIにて切断したものと結合し、変異型lysCとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。このプラスミドをp399AKDDPRと命名した。
【０１０１】
次に、得られたp399AKDPRにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを含むプラスミドpHK4を制限酵素KpnI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みBamHIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をBamHIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをBamHIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくBamHIにて切断したp399AKDDPRに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysCおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pCBと命名した。pCBの構築の過程を図７に示す。
【０１０２】
【比較例３】
dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
dapAを有するプラスミドpCRDAPAをKpnIおよびEcoRIにて切断し、dapAを含むＤＮＡ断片を抽出し、ベクタープラスミドpHSG399をKpnIおよびEcoRIにて切断したものと接続した。得られたプラスミドをp399DPSと命名した。
【０１０３】
一方、dapBを有するプラスミドpCRDAPBをSacIIおよびEcoRIにて切断し、ＤＤＰＲをコードする領域を含む２．０ｋｂのＤＮＡ断片を抽出し、SacIIおよびEcoRIにて切断したp399DPSと接続し、dapAとdapBを併せ持つプラスミドを作製した。得られたプラスミドをp399ABと命名した。
【０１０４】
次に、p399ABにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを含むpHK4を制限酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp399ABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつdapAおよびdapBを含むプラスミドを作製し、pABと命名した。pABの構築の過程を図８に示す。
【０１０５】
【実施例６】
変異型lysC、dapA及びdapBを併せ持つプラスミドの作製
p399DPSをEcoRI、SphIにて分解し、平滑末端化した後、dapAの断片を抽出した。この断片を、p399AK9をSalIにて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、変異型lysCとdapAが共存したプラスミドp399CAを構築した。
【０１０６】
dapBを有するプラスミドpCRDAPBをEcoRIにて切断、平滑末端化した後、SacIにて切断し、dapBを含む2.0kbのＤＮＡ断片を抽出した。dapA及び変異型lysCを有するプラスミドp399CAをSpeIにて切断、平滑末端化した後、SacIにて切断し、抽出したdapB断片と接続し、変異型lysC、dapA及びdapBを含むプラスミドを得た。このプラスミドをp399CABと命名した。
【０１０７】
次に、p399CABにBrevi.-oriを導入した。Brevi.-oriを有するプラスミドpHK4を制限酵素BamHI（宝酒造（株）製）にて切断し、切断面を平滑末端化した。平滑末端化はDNA Blunting kit（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。平滑末端化後、リン酸化済みKpnIリンカー（宝酒造（株）製）を接続し、pHK4よりBrevi.-ori部分のDNA断片をKpnIのみによる切断によって切り出される様改変した。このプラスミドをKpnIにより切断し、生じたBrevi.-oriDNA断片を同じくKpnIにて切断したp399CABに接続し、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapAおよびdapBを併せ持つプラスミドを作製し、pCABと命名した。pCABの構築の過程を図９に示す。
【０１０８】
【実施例７】
変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを併せ持つプラスミドの作製 lysAを有するプラスミドp299LYSAをKpnI及びBamHIにて切断し、平滑末端化した後、lysAの断片を抽出した。この断片を、pCABをHpaI（宝酒造（株）製）にて切断し平滑末端化したものとライゲーションし、コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型lysC、dapA、dapB、及びlysAを併せ持つプラスミドを作製し、pCABLと命名した。pCABL構築の過程を図１０に示す。尚、pCABL中で、lysAの断片はdapBを含むＤＮＡ断片内のHpaI部位に挿入されているが、このHpaI部位は、dapBのプロモーターよりも上流（配列番号１０中塩基番号６１１〜６１６）に位置しており、dapBは分断されていない。
【０１０９】
【実施例８】
aspCを持つプラスミドの作製
aspCをコリネ型細菌に導入するためのベクターには、新規に構築したコリネ型細菌用クローニングベクターpVK7を用いた。pVK7は、以下のようにして、E. coli用ベクターであるpHSG299（Km^r；Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330を結合することによって構築した。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株より調製した。pHSG299を一箇所切断酵素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM330の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVK6、pVK7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。pVK6及びpVK7の構築の過程を図１１に示す。
【０１１０】
構築したシャトルベクターpVK7にaspCを接続した。pCRASPCを制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し、同じく制限酵素EcoRIにて切断したpVK7と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて行った。pVK7にaspCの断片が接続したもののうち、pVK7が持つlacプロモーターの転写方向と順方向に挿入されたものをpOmと命名した。pOmの構築の過程を図１２に示す。
【０１１１】
【実施例９】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムaspCの取得
＜１＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムaspCの単離
aspC活性(ＡＡＴ活性)が消失し、アスパラギン酸要求性となったコリネバクテリウム属に属するアスパラギン酸要求株１０２−７株（I.Shiio and K.Ujikawa; J. Biochem. 84, 647(1978)）に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株の染色体ＤＮＡの各種断片を、コリネバクテリウム属細菌で機能するベクターと連結した遺伝子ライブラリー（国際公開第WO 95/23224号）を導入して形質転換を行った。得られた形質転換体を回収し、２度蒸留水で洗浄した後、窒素源としてアンモニア以外を含まない最少培地Medium10（I.Shiio and K.Ujikawa; J. Biochem. 84, 647(1978)）寒天プレートに数万個塗布し、アスパラギン酸要求性が回復し、当該プレート上で良好な生育を示すものを取得した。前記アスパラギン酸要求性回復株よりプラスミドＤＮＡを回収し、当該プラスミドをpACと命名した。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株をpACで形質転換したところ、その形質転換体はaspC活性が向上した（表１）。活性測定は公知の方法により行った（Sizer,I.W. and Jenkins,W.T.; Meth. Enzymol. vol.5, 677-679(1962)参照）。
【０１１２】
以上の結果、プラスミドＤＮＡ上に存在する約2.5kbのATCC13869株染色体ＤＮＡ断片上にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムaspCが含まれていることが確認された。
【０１１３】
【表１】

【０１１４】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムaspCの解析
2.5kbのＤＮＡ断片の塩基配列は、サンガーら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)）のジデオキシ法に従って行った。決定した塩基配列を配列番号２５に示す。得られた塩基配列をソフトウエア開発株式会社のＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ Ｖｉｒｓｉｏｎ７．３プログラムを用いて解析した。ＯＲＦ（Open Reading Frame）検索の結果、図１３に示す様に互いに逆方向で重なり合う２つのＯＲＦが認められた。配列番号２５に示す塩基配列の８７９番目から８８１番目のＡＴＧ若しくは８９７番目から８９９番目のＡＴＧを開始コドンとし、２１７５番目から２１７７番目のＴＡＧを終始コドンとして順方向にコードされる４３２アミノ酸若しくは４２６アミノ酸からなるＯＲＦをＯＲＦ１と命名し、２１６３番から２１６５番目のＣＡＣの相補鎖ＧＴＧを開始コドンとし、９８４番目から９８６番目のＴＣＡの相補鎖ＴＧＡを終始コドンとして逆方向にコードされる３９３アミノ酸からなるＯＲＦをＯＲＦ２と命名した。
【０１１５】
＜３＞aspCをコードするＯＲＦの決定
この２つのＯＲＦのうち、どちらのＯＲＦにＡＡＴタンパク質がコードされているか確かめるために、pACより、ＰＣＲによりＯＲＦ２の全長を含ます、ＯＲＦ１の全長をコードするＤＮＡ断片を増幅した。増幅に用いたＤＮＡプライマーとしては配列番号２５に記載の配列を基にした、配列番号２６及び２７に記載の塩基配列を有する各々２３ｍｅｒの合成ＤＮＡを用いた。ＤＮＡの合成及びＰＣＲ反応は、実施例１と同様にして行った。増幅された配列番号２５に示す塩基配列の１２６番目より２１８７番目の２０６２ｂｐの遺伝子断片をＴＡクローニングベクターpCR2.1（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローン化した。構築したプラスミドをpCRORF1と命名した。
【０１１６】
同様に、ＯＲＦ２のみの全長をコードする配列番号２５に示す塩基配列の９７５番目より２５１７番目の１５４３ｂｐの遺伝子断片を増幅、クローン化し、pCRORF2と命名した。増幅に用いたＤＮＡプライマーとしては配列番号２８及び２９に記載の塩基配列を有する各々２３ｍｅｒの合成ＤＮＡを用いた。
【０１１７】
クローン化したＤＮＡ断片をコリネバクテリウム属細菌に導入するために実施例８に示すシャトルベクターpVK7に当該ＤＮＡ断片を接続した。pCRORF1を制限酵素EcoRI（宝酒造（株）製）にて切断し、同じく制限酵素EcoRIにて切断したpVK7と接続した。ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用いて行った。構築したプラスミドをpORF1と命名した。pORF1の構築の過程を図１４に示す。
【０１１８】
同様にpCRORF2とpVK7よりpORF2を構築した。
作製したpORF1、pORF2をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム野生株ATCC13869株に実施例９と同様にして導入した。ＡＴＣＣ１３８６９及び取得したプラスミド導入株ＡＴＣＣ１３８６９／pORF1、ＡＴＣＣ１３８６９／pORF2のaspC活性を測定した。活性測定は実施例１と同様にして行った。表２に示される様に、ＡＴＣＣ１３８６９／pORF1においてのみaspC活性の向上が見られたことからＯＲＦ１にaspCがコードされていることが確認できた。
【０１１９】
以上の実験により決定されたブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのaspCの塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるアミノ酸配列を配列番号３０に示す。また、アミノ酸配列のみを配列番号３１に示す。ＧＥＮＥＢＡＮＫによるホモロジーリサーチの結果、他生物のＡＡＴタンパク質を含め既知のアミノ酸配列との相同性は認められなかった。
【０１２０】
【表２】

【０１２１】
【実施例１０】
Ｌ−リジン生合成遺伝子を含むプラスミドのブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌への導入
実施例７で作製された変異型lysC、dapA、dapB及びlysAを有するプラスミドpCABL（Cm^r）をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ Ｂ−１１４７０）に導入した。ＡＪ１１０８２株は、ＡＥＣ耐性の性質を有する。プラスミドの導入の方法は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によった。形質転換体の選択は各々のプラスミドが持つ薬剤耐性マーカーによった。クロラムフェニコール耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合は５μg/mlのクロラムフェニコールを含む完全培地にて、また、カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドを導入した場合には２５μg/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転換体の選択を行なった。
【０１２２】
次に、上記のようにして得られた形質転換体ＡＪ１１０８２／pCABLを、さらにエシェリヒア・コリのaspCを有するプラスミドpOm（Km^r）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのaspCを有するプラスミドpORF1（Km^r）で形質転換した。pCABLがブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞中での複製起点としてpHM1519を利用し、マーカー遺伝子としてCm耐性遺伝子を用いているのに対し、pOmはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞中での複製起点としてpAM330を利用し、マーカーとしてKm耐性遺伝子を用いているため、両プラスミドがブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム細胞中で安定に保持される。この様にしてＬ−リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドとaspCを含むプラスミドが共存した菌株ＡＪ１１０８２／pCABL／pOm 、ＡＪ１１０８２／pCABL／pORF1を取得した。
【０１２３】
同様にして、ＡＪ１１０８２株に、p399AK9B（Cm^r）、pDPSB（Km^r）、pDPRB（Cm^r）、pLYSAB（Cm^r）、pOm、pCRCAB（Km^r）、pAB（Cm^r）、pCB（Cm^r）、pCAB（Cm^r）を導入し、変異型lysC、dapA、dapB、lysA、aspCが単独で、又はこれらの遺伝子が２種類又は３種類の組み合わせで増強された形質転換体を取得した。
【０１２４】
【実施例１１】
形質転換体のaspC活性の測定
ＡＪ１１０８２及び実施例１０にて取得した形質転換体ＡＪ１１０８２／pCABL、ＡＪ１１０８２／pCABL／pOm及びＡＪ１１０８２／pCABL／pORF1のaspC活性を測定した。活性測定は実施例９の＜３＞に示す方法で行った。表３に示される様に、pOmベクター上のlacプロモーターが、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム中でも機能し、ＡＪ１１０８２／pCABL／pOmのaspCの活性が約３倍に上昇していることが確認された。さらに、ＡＪ１１０８２／pCABL／pORF1においてはそれを上回る約９倍の活性上昇が確認された。
【０１２５】
【表３】

【０１２６】
【実施例１２】
Ｌ−リジンの製造
実施例１０で取得した各形質転換体をＬ−リジン生産培地にて培養し、そのＬ−リジン生産能を評価した。Ｌ−リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
【０１２７】
〔Ｌ−リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、ＫＯＨでｐＨ８．０に調製し、１１５℃で１５分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを５０ｇ加える。
【０１２８】
グルコース 100 g
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 55 g
ＫＨ₂ＰＯ₄ 1 g
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1 g
ビオチン 500 μg
チアミン 2000 μg
ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g
ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g
ニコチンアミド 5 mg
蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム 50 g
【０１２９】
上記組成の培地に各種形質転換体及び親株を植菌し、31.5℃にて往復振盪培養を行った。培養４０時間、７２時間後のＬ−リジン生成量、及び７２時間後の生育（OD₅₆₂）を表４に示す。表中、lysC^*は変異型lysCを表す。生育は１０１倍希釈した後、562nmにてＯＤを測定することにより定量した。
【０１３０】
【表４】

【０１３１】
以上に示すように、変異型lysC、dapA、dapB、lysA、及びaspC単独の増強では、培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いか同等であるが、４０時間後では親株よりも生産量が少なく、すなわち短期間培養におけるＬ−リジン生産速度は低下した。同様に、変異型lysC及びdapA、又はdapA及びdapBを組み合わせて増強した場合には、培養７２時間後にはＬ−リジン生産量は親株よりも多いが、４０時間後では親株よりも生産量が少なく、L−リジン生産速度は低下した。
【０１３２】
一方、変異型lysCとともにdapBを増強した株、変異型lysC、dapA及びdapBの３者が増強された株、及び変異型lysC、dapA、dapB及びlysAの４者が増強された株では、短期間培養及び長期間培養のいずれにおいてもＬ−リジン蓄積量が向上した。
【０１３３】
さらに、変異型lysC、dapA、dapB、lysA、及びエシェリヒア・コリのaspCの５者が増強された株、並びに、lysC、dapA、dapB、lysA、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのaspCの５者が増強された株では、いずれの培養時間においてもＬ−リジン生産能が一層向上した。その向上の程度は後者の方が大きかった。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジン生産能を向上させることができる。
【０１３５】
【配列表】

【０１３６】

【０１３７】

【０１３８】

【０１３９】

【０１４０】

【０１４１】

【０１４２】

【０１４３】

【０１４４】

【０１４５】

【０１４６】

【０１４７】

【０１４８】

【０１４９】

【０１５０】

【０１５１】

【０１５２】

【０１５３】

【０１５４】

【０１５５】

【０１５６】

【０１５７】

【０１５８】

【０１５９】

【０１６０】

【０１６１】

【０１６２】

【０１６３】

【０１６４】

【０１６５】

【図面の簡単な説明】
【図１】 変異型lysCを有するプラスミドp399AK9B及びp399AKYB構築の過程を示す図。
【図２】 dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPRBの構築の過程を示す図。
【図３】 dapA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpDPSBの構築の過程を示す図。
【図４】 lysAを有するプラスミドp299LYSAの構築の過程を示す図。
【図５】 lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpLYSABの構築の過程を示す図。
【図６】 lysC、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCRCABの構築の過程を示す図。
【図７】 変異型lysC及びdapBを併せ持つプラスミドpCBの構築の過程を示す図。
【図８】 dapA、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpABの構築の過程を示す図。
【図９】 変異型lysC、dapA、dapB及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCABの構築の過程を示す図。
【図１０】 変異型lysC、dapA、dapB、lysA及びBrevi.-oriを有するプラスミドpCABLの構築の過程を示す図。
【図１１】 新規なコリネ型細菌用クローニングベクターpVK6及びpVK7の構築の過程を示す図。
【図１２】 aspCを有するプラスミドpOmの構築の過程を示す図。
【図１３】 ＡＴＣＣ１３８６９染色体ＤＮＡ断片上の２つのＯＲＦを示す図。
【図１４】 ｐＯＲＦ１の構築過程を示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing L-lysine by modifying a coryneform bacterium used for fermentative production of amino acids and the like using a genetic manipulation technique and culturing the microorganism.
[0002]
[Prior art]
L-lysine used as a feed additive is usually produced by fermentation using an L-lysine-producing mutant strain of coryneform bacteria. Various L-lysine-producing bacteria currently known are produced by artificial mutation of wild strains of coryneform bacteria.
[0003]
On the other hand, in a coryneform bacterium, a vector plasmid (see US Pat. No. 4,451,502) that can autonomously propagate in the microbial cell and has a drug resistance marker gene, and a method for introducing the gene into the microbial cell (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791) Discloses the possibility of growing L-threonine or L-isoleucine-producing bacteria using these techniques (see U.S. Pat. No. 4,542,890 and U.S. Pat. No. 4,442,208). As for the growth of L-lysine-producing bacteria, a technique for incorporating a gene involved in L-lysine biosynthesis into a vector plasmid and amplifying it in the bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 56-160997, etc.) is known.
[0004]
Examples of L-lysine biosynthesis genes include genes involved in L-lysine biosynthesis such as dihydrodipicolinate reductase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 7-75578) and aspartate aminotransferase gene (Japanese Patent Publication No. 6-2002028). Example of cloning, amplification of phosphoenolpyruvate carboxylase gene (JP 60-87788), dihydrodipicolinate synthase gene (JP-B 6-55149), diaminopimelate decarboxylase gene (JP 60-62994) Examples affecting L-lysine productivity are known.
[0005]
In addition, among the enzymes involved in L-lysine biosynthesis, an example in which an enzyme gene having a mutation in which feedback inhibition is canceled is introduced to improve the L-lysine productivity for an enzyme that undergoes feedback inhibition in the wild type. Are known. Specifically, aspartokinase gene (WO94 / 25605 international publication pamphlet) and the like are known as such a gene.
[0006]
As described above, certain results have been obtained by amplification of L-lysine biosynthesis genes or introduction of mutant genes. For example, a coryneform bacterium having a mutant aspartokinase gene in which concerted inhibition by lysine and threonine is released produces a significant amount (about 25 g / L) of L-lysine. However, the growth rate of the bacterium is lower than that of a bacterium that does not have a mutant aspartokinase gene. There is also a report that L-lysine productivity is improved by introducing a dihydrodipicolinate synthase gene in addition to the mutant aspartokinase gene (Applied and Environmental Microbiology 57 (6), 1746-1752 (1991)). is there. However, the growth rate of general bacteria is further reduced.
[0007]
On the other hand, with respect to the dihydrodipicolinate reductase gene, it has been shown that the dihydrodipicolinate reductase activity of the coryneform bacterium into which the dihydrodipicolinate reductase gene has been introduced has been shown, but no influence on L-lysine productivity has been reported (particularly Kaihei 7-75578).
[0008]
In addition, in coryneform bacteria, there are currently no known examples in which a plurality of L-lysine biosynthetic genes are combined to successfully improve the L-lysine yield. In addition, no example has been reported in which growth is improved by enhancing the L-lysine biosynthesis gene.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is aspartokinase (hereinafter also referred to as “AK”, which is an important enzyme for L-lysine biosynthesis in cells of coryneform bacteria. A gene encoding an AK protein is also referred to as “lysC” hereinafter). Dihydrodipicolinate reductase (hereinafter also referred to as “DDPR”; a gene encoding DDPR protein is also referred to as “dapB” hereinafter), dihydrodipicolinate synthase (hereinafter abbreviated as “DDPS”). dapA "), diaminopimelate decarboxylase (hereinafter also referred to as" DDC ". The gene encoding the DDC protein is also referred to as" lysA "hereinafter), and aspartate aminotransferase (hereinafter also referred to as" AAT ". AAT). (The gene encoding the protein is also referred to as “aspC” hereinafter.) Using a DNA sequence encoding each genetic material, it is that attempts to improve L- lysine-producing ability of coryneform bacteria.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The gist of the present invention is that mutant lysC (hereinafter simply referred to as “mutant type”) encoding mutant AK in which concerted inhibition by lysine and threonine is released in coryneform bacteria (hereinafter also simply referred to as “mutant AK”). lysC "), and the ability to improve L-lysine production by combining and enhancing dapA, dapB, lysA, and aspC.
[0011]
That is, the present invention relates to a DNA sequence encoding aspartokinase, a DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase, and a DNA sequence encoding dihydrodipicolinate synthase from which feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is substantially eliminated. A recombinant DNA comprising a DNA sequence encoding diaminopimelate decarboxylase and a DNA sequence encoding aspartate aminotransferase and capable of autonomously growing in coryneform bacterial cells is provided.
[0012]
The present invention also includes an aspartokinase in which feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is substantially eliminated, and a DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase, and a DNA sequence encoding dihydrodipicolinate synthase A coryneform bacterium having an enhanced DNA sequence encoding diaminopimelate decarboxylase and a DNA sequence encoding aspartate aminotransferase is provided.
[0013]
Further, the present invention is characterized in that any one of the above coryneform bacteria is cultured in a suitable medium, L-lysine is produced and accumulated in the culture, and L-lysine is collected from the culture. -To provide a method for producing lysine.
[0014]
Furthermore, the present invention provides a DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31. Specific examples of this DNA include DNA containing at least the base sequence consisting of base numbers 879 to 2174 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.
[0015]
The present invention also provides a vector pVK7 that can autonomously replicate in cells of Escherichia coli and Brevibacterium lactofermentum, and that retains multiple cloning sites and lacZ ′.
[0016]
In the present invention, the coryneform bacterium is a group of microorganisms defined in the 8th edition, page 599 (1974) of the Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Brevibacterium, temperament, Gram-positive, non-acidic, non-spore-forming gonococci, categorized as Corynebacterium, and previously classified as Brevibacterium, but now integrated as Corynebacterium Genus bacteria, and Brevibacterium bacteria that are very closely related to Corynebacterium bacteria.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<1> Acquisition of L-lysine biosynthesis gene used in the present invention
The L-lysine biosynthetic gene used in the present invention is a strain that prepares a chromosomal DNA from a bacterium as a DNA donor, creates a chromosomal DNA library using a plasmid vector or the like, and retains the desired gene from this library And the recombinant DNA having the gene inserted therein is recovered from the selected strain. The L-lysine biosynthetic gene DNA donor used in the present invention is not particularly limited as long as the desired L-lysine biosynthetic gene expresses an enzyme protein that functions in coryneform bacterial cells. Type bacteria are preferred.
[0018]
Since the sequences of lysC, dapA, dapB and lysA genes derived from coryneform bacteria are known, the polymerase chain reaction method (PCR: White, TJ et al; Trends Genet. 5,185 (1989) For example).
[0019]
Below, the method of acquiring each L-lysine biosynthesis gene used for this invention is illustrated.
[0020]
(1) Acquisition of mutant lysC
A DNA fragment containing the mutant lysC can be prepared from a mutant strain in which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine on AK activity is substantially eliminated (WO94 / 25605 international publication pamphlet). Such a mutant strain is obtained by, for example, subjecting a wild coryneform bacterium strain to a usual mutation treatment method, ultraviolet irradiation, or treatment with a mutation agent such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG). It can be obtained from the treated cell group. For the measurement of AK activity, the method described in Miyajima, R et al; The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2), 139-148 can be used. As such a mutant, it was derived from Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 (current name has been changed to Corynebacterium glutamicum) by mutation treatment. L-lysine-producing bacterium AJ3445 (FERM P-1944) is most preferable.
[0021]
Mutant lysC can also be obtained by in vitro mutation treatment of plasmid DNA containing wild-type lysC. Furthermore, a mutation that cancels synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine of AK is specifically known (WO94 / 25605 international publication pamphlet). Can also be prepared from wild-type lysC.
[0022]
To isolate lysC from coryneform bacteria, for example, a chromosomal DNA is prepared by the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta, 72,619, (1963)) and the polymerase chain reaction. It can be performed by amplifying lysC by the method (PCR: polymerase chain reaction; see White, TJ et al; Trends Genet. 5,185 (1989)).
[0023]
As a DNA primer, for example, a sequence known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology (1991), 5 (5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324) Based on this, 23mer and 21mer single-stranded DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are listed to amplify a region of about 1643 bp encoding lysC. DNA can be synthesized according to a conventional method using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems and using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). The PCR reaction can be performed using a DNA thermal cycler type PJ2000 manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., using Taq DNA polymerase according to the method specified by the supplier.
[0024]
The lysC amplified by the PCR method is connected to a vector DNA that can autonomously replicate in cells of E. coli and / or coryneform bacteria to prepare a recombinant DNA, which is introduced into the E. coli cell. This makes it easier to perform later operations. As a vector capable of autonomous replication in E. coli cells, a plasmid vector is preferable, and those capable of autonomous replication in a host cell are preferable, and examples thereof include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, and RSF1010. .
[0025]
In addition, when a DNA fragment having the ability to enable autonomous replication of a plasmid in coryneform bacteria is inserted into these vectors, it can be used as a so-called shuttle vector capable of autonomous replication in both E. coli and coryneform bacteria. .
[0026]
Examples of such shuttle vectors include the following. In addition, the microorganisms holding each vector and the deposit number of the international depository organization are shown in parentheses.
[0027]

[0028]
These vectors are obtained from the deposited microorganism as follows. Cells collected in the logarithmic growth phase are lysed using lysozyme and SDS, centrifuged at 30000 × g, polyethylene glycol is added to the supernatant obtained from the lysate, and cesium chloride-ethidium bromide equilibrium density gradient centrifugation. Separate and purify by separation.
[0029]
In order to transform by introducing plasmid into E. coli, DMMorrison method (Methods in Enzymology, 68, 326, 1979) or by treating recipient cells with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M and Higa, A., J. Mol., Biol., 53, 159 (1970)) and the like.
[0030]
If lysC is isolated from the AK wild strain as described above, wild type lysC is obtained, and if lysC is isolated from the AK mutant strain, mutant lysC is obtained.
An example of the base sequence of a DNA fragment containing wild type lysC is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. The amino acid sequence of the α subunit of the wild type AK protein deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing simultaneously with the DNA sequence, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5. In addition, the amino acid sequence of the β subunit of the wild-type AK protein deduced from the DNA base sequence is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing together with the DNA, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 7. In each subunit, GTG is used as an initiation codon, and the corresponding amino acid is expressed as methionine, which represents methionine, valine, or formylmethionine.
[0031]
The mutant lysC used in the present invention is not particularly limited as long as it encodes AK in which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is released. In the amino acid sequence of wild-type AK, In the unit, the amino acid residue corresponding to the 279th alanine residue from the N-terminal is an amino acid residue other than alanine and other than acidic amino acid, and in the β subunit, the amino acid residue corresponding to the 30th alanine residue from the N-terminal is Examples include mutations that change to amino acid residues other than alanine and other than acidic amino acids. Here, specific examples of the amino acid sequence of wild type AK include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the α subunit and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the β subunit.
[0032]
The preferred amino acid residues other than alanine and acidic amino acids are threonine residue, arginine residue, cysteine residue, phenylalanine residue, proline residue, serine residue, tyrosine residue and valine residue. Is mentioned. The codon corresponding to the amino acid residue to be substituted is not particularly limited as long as it encodes the amino acid residue.
[0033]
In addition, it is expected that there will be slightly different amino acid sequences of wild-type AK retained due to differences in bacterial species and strains. Such an AK having a mutation caused by substitution, deletion or insertion of one or two or more amino acid residues at one or two or more positions not involved in the activity of the enzyme can also be used in the present invention. DNA encoding AK having such a natural mutation hybridizes under stringent conditions with, for example, DNA having at least a part of the base sequence described in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing from a microbial cell retaining AK. Can be obtained by isolating the DNA to be isolated. The “stringent conditions” referred to herein are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to quantify this condition clearly, for example, DNAs with high homology, for example, DNAs having 90% or more homology hybridize and DNA with lower homology than that. Conditions for not hybridizing to each other, or Tm to (Tm-30) ° C., preferably Tm to (Tm-20) ° C. of a hybrid whose temperature is perfectly matched, and 1 × SSC, preferably 0.1 × A condition for hybridizing at a salt concentration corresponding to SSC is mentioned.
[0034]
Furthermore, as long as it does not substantially affect the AK activity and the release of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine, artificial mutation due to substitution, deletion or insertion of other one or more amino acids You can also use AK. LysC encoding AK having such an artificial mutation can be obtained by modifying the nucleotide sequence so that an amino acid at a specific site is substituted, deleted, or inserted, for example, by site-specific mutagenesis. Further, lysC having such a mutation can be obtained by a conventionally known mutation treatment. Mutation treatment includes in vitro treatment of DNA containing lysC with hydroxylamine and the like, and microorganisms holding DNA containing lysC by ultraviolet irradiation or N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) Or the method of processing with the mutation agent normally used for artificial mutations, such as nitrous acid, is mentioned. Mutation is performed by selecting, from the mutated DNA or the mutated microorganism, the AK encoded or produced by the AK that retains AK activity and the AK amino acid sequence is mutated. The position at which can be introduced, or the position at which the mutation has occurred can be determined. The position of the introduced mutation is not particularly limited as long as it does not substantially affect AK activity and release of feedback inhibition. The number of mutations to be introduced varies depending on the position and type of the amino acid to be mutated in the three-dimensional structure of the protein, and is not particularly limited as long as it does not substantially affect the release of AK activity and feedback inhibition. 1 to 20, preferably 1 to 10.
[0035]
A person skilled in the art can easily identify the amino acid residue corresponding to the specific alanine residue in the amino acid sequence of AK having the mutation as described above.
[0036]
The strain AJ12691, in which the mutant lysC plasmid p399AK9B was introduced into the AJ12036 strain (FERM BP-734), a wild-type strain of Brevibacterium lactofermentum, was founded on April 10, 1992 at the Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry Deposited at the research institute (postal code 305, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) under the accession number FERM P-12918, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on February 10, 1995, and FERM BP- Deposited with a deposit number of 4999.
[0037]
(2) Acquisition of dapB
A DNA fragment containing dapB can be prepared by PCR from a coryneform bacterial chromosome. Although it does not restrict | limit especially as a DNA donor microbe, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain | stump | stock is mentioned.
[0038]
The DNA sequence encoding DDPR is known in Brevibacterium lactofermentum (Journal of Bacteriology 175 (9), 2743-2749 (1993)), and DNA primers for PCR can be prepared based on this. it can. Specific examples of such a DNA primer include 23-mer DNAs each having the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 8 and 9 in the sequence listing. DNA synthesis, PCR reaction, preparation of the resulting plasmid containing dapB, etc. can be carried out in the same manner as in the case of lysC.
[0039]
The nucleotide sequence of a DNA fragment containing dapB and the amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 10. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11. In the present invention, in addition to the DNA fragment encoding this amino acid sequence, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, that is, one or more amino acids as long as it does not substantially affect DDPR activity A DNA fragment encoding an amino acid sequence having a mutation due to substitution, deletion or insertion of can also be used. DapB having such a natural mutation or an artificial mutation is a DNA encoding AK having a mutation that does not substantially affect the above-described AK activity and release of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine. It can be obtained in the same way.
[0040]
The transformed strain AJ13107 obtained by introducing the plasmid pCRDAPB containing dapB obtained in the examples below into E. coli JM109 strain was introduced on May 26, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. (Postal code 305, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) The deposit number is FERM BP-5114 and is deposited internationally based on the Budapest Treaty.
[0041]
(3) Acquisition of dapA
A DNA fragment containing dapA can be prepared from a coryneform bacterial chromosome by PCR. Although it does not restrict | limit especially as a DNA donor microbe, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain | stump | stock is mentioned.
[0042]
The DNA sequence encoding DDPS is known in Corynebacterium glutamicum (see Nucleic Acids Research 18 (21), 6421 (1990), EMBL accession No. X53993), and DNA primers for PCR are prepared based on this. can do. Specific examples of such a DNA primer include 23-mer DNAs each having the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 12 and 13 in the Sequence Listing. DNA synthesis, PCR reaction, preparation of the obtained plasmid containing dapA, etc. can be carried out in the same manner as in the case of lysC.
[0043]
An example of the base sequence of a DNA fragment containing dapA and an amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 14. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 15. In the present invention, in addition to the DNA fragment encoding this amino acid sequence, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, that is, one or more amino acids as long as it does not substantially affect DDPS activity A DNA fragment encoding an amino acid sequence having a mutation due to substitution, deletion, insertion, or the like can also be used. DapA having such a natural mutation or artificial mutation is a DNA encoding AK having a mutation that does not substantially affect the above-mentioned AK activity and the release of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine. It can be obtained in the same way.
[0044]
The transformed strain AJ13106 obtained by introducing the plasmid pCRDAPA containing dapA obtained in the Examples below into E. coli JM109 strain was introduced on May 26, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. (Postal code 305, 1-3 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan) The deposit number is FERM BP-5113 and is deposited internationally under the Budapest Treaty.
[0045]
(4) Acquisition of lysA
A DNA fragment containing lysA can be prepared from coryneform bacterial chromosomes by PCR. Although it does not restrict | limit especially as a DNA donor microbe, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain | stump | stock is mentioned.
[0046]
In coryneform bacteria, lysA forms an operon together with argS (arginyl-tRNA synthase gene), and lysA exists downstream of argS. The expression of lysA is regulated by a promoter upstream of argS (see Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362 (1993)). The base sequences of these genes are known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology 4 (11), 1819-1830 (1990), Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)). Thus, a DNA primer for PCR can be prepared. Specifically as such a DNA primer, SEQ ID NO: 16 in the sequence listing (corresponding to base numbers 11 to 33 in the base sequence described in Molecular Microbiology 4 (11), 1819-1830 (1990)) and sequence Examples include DNAs of 23 mer each having a base sequence represented by No. 17 (corresponding to base numbers 1370 to 1392 in the base sequence described in Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)). DNA synthesis, PCR reaction, preparation of the resulting plasmid containing lysA, and the like can be performed in the same manner as in the case of lysC described above.
[0047]
In Examples described later, a DNA fragment containing a promoter, argS and lysA was used to enhance lysA. However, argS is not essential to the present invention, and a DNA fragment in which lysA is linked directly under the promoter may be used. Good.
[0048]
An example of the base sequence of a DNA fragment containing argS and lysA and an amino acid sequence predicted to be encoded by this sequence are shown in SEQ ID NO: 18. An example of the amino acid sequence encoded by argS is shown in SEQ ID NO: 19, and an example of the amino acid sequence encoded by lysA is shown in SEQ ID NO: 20. In the present invention, in addition to the DNA fragment encoding this amino acid sequence, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, ie, one or more amino acids unless the DDC activity is substantially affected A DNA fragment encoding an amino acid sequence having a mutation due to substitution, deletion or insertion of can also be used. LysA having such a natural mutation or an artificial mutation is a DNA encoding AK having a mutation that does not substantially affect the above-described AK activity and release of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine. It can be obtained in the same way.
[0049]
(5) Acquisition of aspC
A DNA fragment containing aspC can be prepared from a gene library prepared from the chromosomes of microorganisms such as coryneform bacteria, Escherichia bacteria and the like by complementing the auxotrophy of AAT-deficient strains as an indicator. Although it does not restrict | limit especially as a DNA donor of a coryneform bacterium, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain is mentioned. Moreover, the DNA donor of Escherichia bacteria is not particularly limited, and examples thereof include E. coli JM109 strain.
[0050]
Specifically, a method of obtaining aspC of coryneform bacteria is already known (see Japanese Patent Publication No. 6-1002028), and can be obtained according to this method.
[0051]
In addition, the DNA sequence encoding AAT is known in E. coli (see Kuramitsu, S. et al; J. Biochem. 97 (4), 1259-1262 (1985)), and based on this is used for PCR. DNA primers can be prepared. Specific examples of such a DNA primer include 20-mer DNAs each having the base sequence set forth in SEQ ID NOs: 21 and 22 in the Sequence Listing. DNA synthesis, PCR reaction, preparation of the obtained plasmid containing aspC, and the like can be performed in the same manner as in the case of lysC.
[0052]
An example of the base sequence of a DNA fragment containing aspC and an amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 23. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24. In addition, SEQ ID NO: 30 shows another example of the base sequence of a DNA fragment containing aspC and the amino acid sequence predicted from this sequence. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 31. In the present invention, in addition to DNA fragments encoding these amino acid sequences, the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 31, that is, 1 or 2 as long as the AAT activity is not substantially affected. A DNA fragment encoding an amino acid sequence having a mutation due to substitution, deletion, insertion or the like of the above amino acids can be used as well. AspC having such a natural mutation or an artificial mutation is a DNA encoding AK having a mutation that does not substantially affect the above-mentioned AK activity and release of synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine. It can be obtained in the same way.
[0053]
AspC having the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 is derived from Corynebacterium lactofermentum and was first obtained by the present invention by the method described in Example 9 below. Accordingly, the present invention provides a DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31. Specific examples of this DNA include DNA containing at least the base sequence consisting of base numbers 879 to 2174 among the base sequence shown in SEQ ID NO: 30.
[0054]
<2> Recombinant DNA and coryneform bacterium of the present invention
The coryneform bacterium of the present invention retains aspartokinase (mutant AK) in which feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is substantially eliminated, and further, a DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase, dihydrodipicoline A coryneform bacterium having an enhanced DNA sequence encoding acid synthase, a DNA sequence encoding diaminopimelate decarboxylase, and a DNA sequence encoding aspartate aminotransferase.
[0055]
Here, “increasing” DNA means increasing the copy number of a gene, using a strong promoter, using a gene encoding an enzyme with a high specific activity, or combining these. This refers to increasing the activity in the cell of an enzyme encoded by DNA.
[0056]
The coryneform bacterium retaining the mutant AK may be one that has produced mutant aspartokinase by mutation, or may have been transformed by introducing mutant lysC.
[0057]
Examples of coryneform bacteria into which the DNA is introduced include, for example, the following L-lysine-producing wild strains.
[0058]
Corynebacterium acetoacid film ATCC13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium carnae ATCC15991
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
(Brevibacterium divaricatam) ATCC14020
(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869
(Corynebacterium lilium) ATCC15990
(Brevibacterium flavum) ATCC14067
Corynebacterium melasecola ATCC17965
Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066
Brevibacterium immario film ATCC14068
Brevibacterium rose ATCC13825
Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240
Microbacterium ammonia film ATCC15354
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
[0059]
In addition to the above strains, mutants having L-lysine production ability derived from these strains can also be used as hosts. Examples of such artificial mutants are as follows. S- (2-aminoethyl) -cysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”) resistant mutants (for example, Brevibacterium lactofermentum AJ11082 (NRRL B-11470), Japanese Patent Publication No. 56-1914, Japanese Patent Publication No. Sho) 56-1915, Shoko 57-14157, Shoko 57-14158, Shoko 57-30474, Shoko 58-10075, Shoko 59-4993, Shoko 61-35840, Shoko 62 -24074, JP-B 62-36673, JP-B 5-11958, JP-B 7-112437, JP-B 7-112438), mutant strains that require amino acids such as L-homoserine for their growth ( JP-B-48-28078, JP-B-56-6499), resistant to AEC, L-leucine, L-homoserine, L-proline, L-serine, L-arginine, L-alanine, L-valine, etc. Mutants requiring amino acids of (US Pat. Nos. 3,708,395 and 3,582,472), DL-α-amino-ε-caprolactam, α-amino-lauryl L-lysine production mutant showing resistance to lactam, aspartate-analog, sulfa drug, quinoid, N-lauroylleucine, oxaloacetate decarboxylase or respiratory enzyme inhibitor Mutants (JP 50-53588, JP 50-31093, JP 52-102498, JP 53-9394, JP 53-86089, JP 55-9783) , JP 55-9759, JP 56-32995, JP 56-39778, JP 53-43591, JP 53-1833), L-lysine production requiring inositol or acetic acid Mutant strains (Japanese Patent Laid-Open Nos. 55-9784 and 56-8692), L-lysine producing mutant strains sensitive to fluoropyruvic acid or a temperature of 34 ° C. or higher (Japanese Patent Laid-Open No. 55-9783, Japanese Patent Laid-Open No. 53-86090), Brevibacterium genus or Coryneva which is resistant to ethylene glycol and produces L-lysine Agrobacterium genus producing mutant strain (US Pat. No. 4,411,997).
[0060]
In order to enhance L-lysine biosynthesis genes in the host as described above, as specific examples, these genes are introduced into the host using a plasmid vector, transposon, phage vector or the like. In this case, although a certain degree of enhancement can be expected even when a low copy type vector is used, it is preferable to use a multicopy type vector. Examples of such vectors include plasmid vectors such as pAJ655, pAJ1844, pAJ611, pAJ3148, and pAJ440. Further, transposon derived from coryneform bacteria is disclosed in WO02 / 02627 international publication pamphlet, WO93 / 18151 international publication pamphlet, European Patent Publication No. 0445385, JP-A-6-46867, Vertes, AA et al., Mol. Microbiol., 11 , 739-746 (1994), Bonamy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, AA et al., Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), JP-A-7-107976, JP-A-7-327680, and the like.
[0061]
In the present invention, the mutant lysC does not necessarily have to be enhanced. As described above, the mutant lysC may have a mutation in lysC on the chromosomal DNA, or the mutant lysC may be incorporated into the chromosomal DNA. It may be introduced using a plasmid vector. On the other hand, dapA, dapB, lysA and aspC are preferably enhanced in order to efficiently produce L-lysine.
[0062]
The lysC, dapA, dapB, lysA, and aspC genes may be introduced into the host sequentially using separate vectors, or two, three, four, or five using a single vector. These genes may be introduced together. When separate vectors are used, the order of gene introduction is not limited, but it is preferable to use vectors that have a stable distribution and retention mechanism in the host and can coexist with each other.
[0063]
In particular, the vector pVK7 is preferably used as a vector for introducing aspC into coryneform bacteria. The vector pVK7 is a cloning vector for coryneform bacteria provided by the present invention, is capable of autonomous replication in cells of E. coli and Brevibacterium lactofermentum, and has a multiple cloning site derived from pHSG299. Holds lacZ '. Vector pVK7 can be constructed by the method described in Example 8 below.
[0064]
Coryneform bacteria that retain mutant AK and have enhanced dapB, dapA, lysA, and aspC include, for example, mutant lysC and dapB, dapA, lysA, and aspC, and can autonomously grow in coryneform bacterial cells Can be obtained by introducing a recombinant DNA into a host coryneform bacterium.
[0065]
The recombinant DNA as described above can be obtained by inserting each of the L-lysine biosynthetic genes into a vector such as a plasmid vector, transposon, or phage vector.
[0066]
In the case of a plasmid, the method for introducing the recombinant DNA into the host can be performed by the electric pulse method (Sugimoto et al., Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791). Amplification of a gene using a transposon can be performed by mounting a transposon on a plasmid and introducing it into a cell to induce transposition of the transposon.
[0067]
The coryneform bacterium of the present invention includes, in addition to the above genes, other genes involved in L-lysine biosynthesis, such as a DNA sequence encoding phosphoenolpyruvate carboxylase, a DNA sequence encoding diaminopimelate dehydrogenase, and the like. It may be enhanced.
[0068]
<3> Method for producing L-lysine
Cultivation of coryneform bacteria having an enhanced L-lysine biosynthesis gene as described above in a suitable medium, producing and accumulating L-lysine in the culture, and collecting L-lysine from the culture Thus, L-lysine can be produced efficiently.
[0069]
Examples of the medium to be used include a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as necessary.
As the carbon source, saccharides such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysate, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid can be used.
[0070]
As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia and the like can be used.
[0071]
As an organic trace nutrient source, it is desirable to contain an appropriate amount of a required substance such as vitamin B1, L-homoserine or a yeast extract. In addition to these, potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added in small amounts as necessary.
[0072]
Cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 30 to 90 hours. The culture temperature is preferably controlled at 25 ° C. to 37 ° C., and the pH during culture is preferably controlled at 5 to 8. In addition, an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment. Collection of L-lysine from the culture can be carried out by a combination of ordinary ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
[0073]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0074]
[Example 1]
Acquisition of Brevibacterium lactofermentum wild type lysC and mutant lysC
<1> Acquisition of wild type and mutant lysC, and preparation of plasmids containing them
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain and L-lysine-producing mutant AJ3445 (FERM P-1944) obtained by mutation treatment from ATCC13869 strain were used as donors for chromosomal DNA. In the AJ3445 strain, lysC is substantially desensitized to concerted inhibition by lysine and threonine due to mutation (Journal of Biochemistry 68, 701-710 (1970)).
[0075]
A DNA fragment containing lysC was amplified from the chromosomal DNA by PCR (polymerase chain reaction; White, TJ et al; see Trends Genet. 5,185 (1989)). DNA primers used for amplification are based on sequences known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324). In order to amplify a region of about 1643 bp encoding lysC, 23-mer and 21-mer single-stranded DNAs having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 were synthesized. The DNA was synthesized using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems, using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) and according to a conventional method.
[0076]
For PCR reaction, DNA thermal cycler PJ2000 type manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used, and Taq DNA polymerase was used for gene amplification according to the method specified by the supplier. After confirming the amplified 1643 kb gene fragment by agarose gel electrophoresis, the fragment cut out from the gel was purified by a conventional method, and the restriction enzyme NruI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) were purified. And cut.
[0077]
PHSG399 (see Takeshita, S et al; Gene (1987), 61, 63-74) was used as a gene fragment cloning vector. pHSG399 was cleaved with restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and restriction enzyme EcoRI and connected to the amplified lysC fragment. DNA was connected by a designated method using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). In this way, a plasmid was prepared in which pHSG399 was connected to the lysC fragment amplified from the Brevibacterium lactofermentum chromosome. The plasmid having lysC derived from the wild strain ATCC13869 was named p399AKY, and the plasmid having lysC derived from AJ3463, an L-lysine-producing bacterium, was named p399AK9.
[0078]
Introduced into p399AKY and p399AK9 are DNA fragments (hereinafter referred to as “Brevi.-ori”) capable of autonomously replicating plasmids in Corynebacterium, allowing autonomous replication in Corynebacterium. A plasmid carrying lysC was prepared. Brevi.-ori was prepared from a plasmid vector pHK4 that can replicate autonomously in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria. pHK4 was constructed by cleaving pHC4 with KpnI (Takara Shuzo) and BamHI (Takara Shuzo), extracting the Brevi.-ori fragment, and connecting it to pHSG298, which was also cleaved with KpnI and BamHI. (See JP-A-5-7491). pHK4 confers kanamycin resistance to the host. In addition, Escherichia coli HB101 holding pHK4 is named Escherichia coli AJ13136. On August 1, 1995, Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry 1-chome 1-3) is deposited with the deposit number FERM BP-5186.
[0079]
pHK4 was cleaved with restriction enzymes KpnI and BamHI, and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated BamHI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with BamHI alone. This plasmid was cleaved with BamHI, and the resulting Brevi.-ori DNA fragment was ligated to p399AKY and p399AK9, which were also cleaved with BamHI, to produce a plasmid capable of autonomous replication in Corynebacterium and containing lysC.
[0080]
The plasmid containing wild type lysC derived from p399AKY was named p399AKYB, and the plasmid containing mutant lysC derived from p399AK9 was named p399AK9B. The construction process of p399AK9B and p399AKYB is shown in FIG. The strain AJ12691 in which the mutant lysC plasmid p399AK9B was introduced into the wild strain Brevibacterium lactofermentum AJ12036 (FERM BP-734) Depository number FERM P-12918, postal code 305 Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan 305, transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on February 10, 1995, FERM BP-4999 The deposit number is.
[0081]
<2> Determination of nucleotide sequences of wild-type lysC and mutant lysC of Brevibacterium lactofermentum
Plasmid p399AKY containing wild type lysC and plasmid p399AK9 containing mutant lysC were prepared from each transformant, and the nucleotide sequences of wild type and mutant lysC were determined. The base sequence was determined by the method of Sanger et al. (F. Sanger et al: Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463 (1977), etc.).
[0082]
The base sequence of wild-type lysC encoded by p399AKY is shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. On the other hand, the base sequence of the mutant lysC encoded by p399AK9 had only a single base mutation in which the 1051st G was changed to A in SEQ ID NO: 3 compared to the wild type lysC. LysC of Corynebacterium glutamicum is known that two subunits α and β are encoded in the same DNA strand in the same reading frame (Kalinowski, J et al; Molecular Microbiology ( (1991) 5 (5), 1197-1204), judging from homology, this gene is also considered to be encoded in the same DNA strand by two subunits α and β in the same reading frame.
[0083]
The amino acid sequence of the α subunit of the wild type AK protein deduced from the DNA base sequence is shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing simultaneously with the DNA sequence, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 5. In addition, the amino acid sequence of the β subunit of the wild-type AK protein deduced from the DNA base sequence is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing together with the DNA, and only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 7. In each subunit, GTG is used as an initiation codon, and the corresponding amino acid is expressed as methionine, which represents methionine, valine, or formylmethionine.
[0084]
On the other hand, the mutation on the mutant lysC sequence is that the 279th alanine residue is changed to the threonine residue in the α subunit and the 30th position in the β subunit in the amino acid sequence of the wild type AK protein (SEQ ID NOs: 5 and 7). It means that an alanine residue has caused an amino acid residue substitution to a threonine residue.
[0085]
[Example 2]
Acquisition of Brevibacterium lactofermentum dapB
<1> Acquisition of dapB and preparation of a plasmid containing it
Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 was used as a donor of chromosomal DNA. Chromosomal DNA was prepared from ATCC13869 strain according to a conventional method. A DNA fragment containing dapB was amplified from the chromosomal DNA by PCR. The DNA primer used for amplification was about 2.0 kb encoding DDPR based on the sequence known in Brevibacterium lactofermentum (see Journal of Bacteriology 175 (9), 2743-2749 (1993)). In order to amplify the region, DNA fragments of 23 mer each having the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 8 and 9 in the sequence listing were synthesized. DNA synthesis and PCR were performed in the same manner as in Example 1. PCR-Script (manufactured by Invitrogen) was used as a cloning vector for the amplified 2001 bp gene fragment and connected to the amplified dapB fragment. In this way, a plasmid in which a 2001 bp bp of dapB fragment amplified from Brevibacterium lactofermentum chromosome was connected to pCR-Script was prepared. The plasmid having dapB derived from ATCC13869 thus obtained was named pCRDAPB. The transformant AJ13107 obtained by introducing pCRDAPB into E. coli JM109 was launched from May 26, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal Code 305, Toichi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). No. 1-3) has been deposited internationally under the Budapest Treaty under the deposit number FERM BP-5114.
[0086]
Furthermore, a 1101 bp fragment containing the DDPR structural gene was extracted by cleaving pCRDAPB with EcoRV and SphI. A plasmid was prepared by ligating this fragment with pHSG399 digested with HincII and SphI. This prepared plasmid was named p399DPR.
[0087]
Brevi.-ori was introduced into the prepared p399DPR, and a plasmid carrying dapB capable of autonomous replication in coryneform bacteria was prepared. pHK4 was cleaved with restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated BamHI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with BamHI alone. This plasmid was cleaved with BamHI, and the resulting Brevi.-ori DNA fragment was connected to p399DPR, which was also cleaved with BamHI, to produce a plasmid capable of autonomous growth in coryneform bacteria and containing dapB. The prepared plasmid was named pDPRB. The process of pDPRB construction is shown in FIG.
[0088]
<2> Determination of base sequence of Brevibacterium lactofermentum dapB
Plasmid DNA was prepared from the AJ13107 strain carrying p399DPR, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 1. The determined base sequence and the amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 10. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
[0089]
[Example 3]
Acquisition of Brevibacterium lactofermentum dapA
<1> Acquisition of dapA and preparation of a plasmid containing it
Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 was used as a donor of chromosomal DNA. Chromosomal DNA was prepared from ATCC13869 strain according to a conventional method. A DNA fragment containing dapA was amplified from the chromosomal DNA by PCR. The DNA primer used for amplification was about 1.5 coding for DDPS based on the sequence known in Corynebacterium glutamicum (see Nucleic Acids Research 18 (21), 6421 (1990), EMBL accession No. X53993). In order to amplify the kb region, 23-mer DNAs each having the base sequences described in SEQ ID NOs: 12 and 13 in the sequence listing were synthesized. DNA synthesis and PCR were performed in the same manner as in Example 1. As a vector for cloning the amplified 1411 bp gene fragment, pCR1000 (manufactured by Invitrogen; see Bio / Technology 9, 657-663 (1991)) was used and connected to the amplified dapA fragment. DNA was connected by a designated method using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). In this manner, a plasmid in which dCRA fragment 1411 bp amplified from Brevibacterium lactofermentum chromosome was connected to pCR1000 was prepared. The plasmid having dapA derived from ATCC13869 thus obtained was named pCRDAPA.
[0090]
The transformed strain AJ13106 obtained by introducing pCRDAPA into E. coli JM109 strain was launched from May 26, 1995 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Postal code 305, Toichi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). No. 1-3) is deposited with an accession number of FERM BP-5113 and has been deposited internationally under the Budapest Treaty.
[0091]
Brevi.-ori was introduced into the prepared pCRDAPA to prepare a plasmid carrying dapA capable of autonomous replication in coryneform bacteria. pHK4 was cleaved with restriction enzymes KpnI and BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated SmaI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with SmaI alone. This plasmid was cleaved with SmaI, and the resulting Brevi.-ori DNA fragment was connected to pCRDAPA that was also cleaved with SmaI to prepare a plasmid capable of autonomous growth in coryneform bacteria and containing dapA. This plasmid was named pDPSB. pDPSB (Km ^r The construction process is shown in FIG.
[0092]
<2> Determination of base sequence of Brevibacterium lactofermentum dapA
Plasmid DNA was prepared from the AJ13106 strain carrying pCRDAPA, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 1. The determined base sequence and the amino acid sequence deduced from this sequence are shown in SEQ ID NO: 14. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 15.
[0093]
[Example 4]
Acquisition of Brevibacterium lactofermentum lysA
<1> Acquisition of lysA and preparation of a plasmid containing it
Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 was used as a donor of chromosomal DNA. Chromosomal DNA was prepared from ATCC13869 strain according to a conventional method. A DNA fragment containing argS, lysA and the operon promoter containing these was amplified from the chromosomal DNA by PCR. As DNA primers used for amplification, sequences known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology 4 (11), 1819-1830 (1990), Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)) In order to amplify an approximately 3.6 kb region encoding arginyl-tRNA synthase and DDC based on the DNA, 23-mer synthetic DNAs each having a base sequence set forth in SEQ ID NOs: 16 and 17 in the sequence listing were used. DNA synthesis and PCR were performed in the same manner as in Example 1. PHSG399 was used as a vector for cloning the amplified 3579 bp gene fragment. pHSG399 was cleaved with restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and connected to the amplified DNA fragment containing lysA. The plasmid containing lysA derived from ATCC13869 thus obtained was named p399LYSA.
[0094]
Furthermore, p399LYSA was cleaved with KpnI (Takara Shuzo) and BamHI (Takara Shuzo) to extract a DNA fragment containing lysA. This DNA fragment was ligated with pHSG299 digested with KpnI and BamHI. The resulting plasmid was named p299LYSA. The process of constructing p299LYSA is shown in FIG.
[0095]
Brevi.-ori was introduced into the obtained p299LYSA to prepare a plasmid carrying lysA capable of autonomous replication in coryneform bacteria. pHK4 was cleaved with restriction enzymes KpnI and BamHI, and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated KpnI linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with KpnI alone. This plasmid was cleaved with KpnI, and the resulting Brevi.-ori DNA fragment was connected to p299LYSA which was also cleaved with KpnI to produce a plasmid capable of autonomous replication in coryneform bacteria and containing lysA. The prepared plasmid was named pLYSAB. The process of pLYSAB construction is shown in FIG.
[0096]
<2> Determination of the base sequence of Brevibacterium lactofermentum lysA
Plasmid DNA of p299LYSA was prepared, and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 1. The determined nucleotide sequence and the amino acid sequence predicted to be encoded by this sequence are shown in SEQ ID NO: 18. Among these base sequences, the amino acid sequence encoded by argS and the amino acid sequence encoded by lysA are shown in SEQ ID NOs: 19 and 20, respectively.
[0097]
[Example 5]
Preparation of Escherichia coli aspC and plasmid containing the same
E. coli strain JM109 was used as a donor of chromosomal DNA. Chromosomal DNA was prepared from E. coli strain JM109 according to a conventional method. A DNA fragment containing aspC was amplified from the chromosomal DNA by PCR. The DNA primers used for amplification are based on sequences known in E. coli (see Kuramitsu, S. et al; J. Biochem. 97 (4), 1259-1262 (1985)). 20-mer synthetic DNAs each having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 21 and 22 in the column table were used. DNA synthesis and PCR were performed in the same manner as in Example 1. The amplified 1331 bp gene fragment was cloned into the TA cloning vector pCR1000. The constructed plasmid was named pCRASPC.
[0098]
SEQ ID NO: 23 shows the nucleotide sequence of the amplified aspC-containing DNA and the amino acid sequence expected to be encoded by this sequence. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
[0099]
[Comparative Example 1]
Construction of a plasmid with mutant lysC and dapA
From the plasmid pCRDAPA having dapA and the plasmid p399AK9B having mutant lysC and Brevi.-ori, a plasmid having the replication origin of mutant lysC, dapA and coryneform bacteria was prepared. p399AK9B was completely digested with SalI, blunt-ended, and an EcoRI linker was connected to prepare a plasmid in which the SalI site was changed to an EcoRI site. The obtained plasmid was designated as p399AK9BSE. Mutant lysC and Brevi.-ori were excised as one fragment by partially decomposing p399AK9BSE with EcoRI. This fragment was ligated with pCRDAPA digested with EcoRI. The resulting plasmid was named pCRCAB. This plasmid is capable of autonomously growing in E. coli and coryneform bacteria, imparts kanamycin resistance to the host, and retains the mutant lysC and dapA together. The process for preparing pCRCAB is shown in FIG.
[0100]
[Comparative Example 2]
Construction of a plasmid with mutant lysC and dapB
A plasmid containing mutant lysC and dapB was prepared from plasmid p399AK9 having mutant lysC and plasmid p399DPR having dapB. By cutting p399DPR with EcoRV and SphI, a 1101 bp fragment containing the DDPR structural gene was extracted. This fragment was digested with p399AK9 with SalI, blunt-ended, and further ligated with SphI cleaved to prepare a plasmid having both mutant lysC and dapB. This plasmid was named p399AKDDPR.
[0101]
Next, Brevi.-ori was introduced into the obtained p399AKDPR. Plasmid pHK4 containing Brevi.-ori was cleaved with restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated BamHI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with BamHI alone. This plasmid was cleaved with BamHI, and the resulting Brevi.-oriDNA fragment was connected to p399AKDDPR, which was also cleaved with BamHI, to produce a plasmid containing mutant lysC and dapB that can autonomously grow in coryneform bacteria. Named. The process of construction of pCB is shown in FIG.
[0102]
[Comparative Example 3]
Preparation of plasmid having both dapA and dapB
Plasmid pCRDAPA having dapA was cleaved with KpnI and EcoRI, a DNA fragment containing dapA was extracted, and ligated with vector plasmid pHSG399 cleaved with KpnI and EcoRI. The resulting plasmid was named p399DPS.
[0103]
On the other hand, plasmid pCRDAPB having dapB is cleaved with SacII and EcoRI, a 2.0 kb DNA fragment containing the region encoding DDPR is extracted, connected to p399DPS cleaved with SacII and EcoRI, and dapA and dapB are combined. A plasmid was prepared. The resulting plasmid was named p399AB.
[0104]
Next, Brevi.-ori was introduced into p399AB. PHK4 containing Brevi.-ori was cleaved with restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated KpnI linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with KpnI alone. This plasmid was cleaved with KpnI, and the resulting Brevi.-oriDNA fragment was connected to p399AB, which was also cleaved with KpnI, to produce a plasmid capable of autonomous growth in coryneform bacteria and containing dapA and dapB, and named pAB did. The process of construction of pAB is shown in FIG.
[0105]
[Example 6]
Construction of a plasmid with mutant lysC, dapA and dapB
p399DPS was digested with EcoRI and SphI and blunt-ended, and then a dapA fragment was extracted. This fragment was ligated with p399AK9 digested with SalI and blunt-ended to construct plasmid p399CA in which mutant lysC and dapA coexisted.
[0106]
The plasmid pCRDAPB having dapB was cleaved with EcoRI and blunt-ended, and then cleaved with SacI to extract a 2.0 kb DNA fragment containing dapB. Plasmid p399CA having dapA and mutant lysC was digested with SpeI, blunt-ended, then digested with SacI, and connected to the extracted dapB fragment to obtain a plasmid containing mutant lysC, dapA and dapB. This plasmid was named p399CAB.
[0107]
Next, Brevi.-ori was introduced into p399CAB. Plasmid pHK4 having Brevi.-ori was cleaved with restriction enzyme BamHI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. The blunt end was performed by a designated method using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). After blunting, a phosphorylated KpnI linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected and modified so that the DNA fragment of Brevi.-ori was excised from pHK4 by cleavage with KpnI alone. This plasmid was cleaved with KpnI, and the resulting Brevi.-oriDNA fragment was connected to p399CAB, which was also cleaved with KpnI, to produce a plasmid that could autonomously grow in coryneform bacteria and had mutant lysC, dapA, and dapB together. , Named pCAB. The process of construction of pCAB is shown in FIG.
[0108]
[Example 7]
Preparation of plasmid having mutant lysC, dapA, dapB and lysA The plasmid p299LYSA having lysA was cleaved with KpnI and BamHI and blunt-ended, and then a fragment of lysA was extracted. This fragment was ligated with pCAB cleaved with HpaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and blunt-ended, so that it can autonomously grow in coryneform bacteria and also has a mutant lysC, dapA, dapB, and lysA Was made and named pCABL. The process of pCABL construction is shown in FIG. In pCABL, the lysA fragment is inserted into the HpaI site in the DNA fragment containing dapB. This HpaI site is located upstream of the dapB promoter (base numbers 611 to 616 in SEQ ID NO: 10). And dapB is not divided.
[0109]
[Example 8]
Preparation of plasmid with aspC
As a vector for introducing aspC into coryneform bacteria, a newly constructed cloning vector pVK7 for coryneform bacteria was used. pVK7 was prepared as follows: pHSG299 (Km ^r ; See Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)) and ligated with pAM330, a cryptic plasmid of Brevibacterium lactofermentum. pAM330 was prepared from Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 strain. pHSG299 was cleaved with AvaII (Takara Shuzo Co., Ltd.), a single cleavage enzyme, blunted with T4 DNA polymerase, then cut with HindIII (Takara Shuzo Co., Ltd.), and blunted with T4 DNA polymerase. And connected to the pAM330. The two types of plasmids generated were named pVK6 and pVK7 depending on the insertion direction of pAM330 into pHSG299, and pVK7 was used in the following experiments. pVK7 is capable of autonomous replication in E. coli and Brevibacterium lactofermentum cells, and retains multiple cloning sites and lacZ ′ derived from pHSG299. The process of construction of pVK6 and pVK7 is shown in FIG.
[0110]
AspC was connected to the constructed shuttle vector pVK7. pCRASPC was cleaved with the restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and connected to pVK7 which was also cleaved with the restriction enzyme EcoRI. DNA was connected using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Among the pVK7 fragments in which the aspC fragment was connected, the one inserted in the transcription direction and forward direction of the lac promoter possessed by pVK7 was named pOm. The process of constructing pOm is shown in FIG.
[0111]
[Example 9]
Acquisition of Brevibacterium lactofermentum aspC
<1> Isolation of Brevibacterium lactofermentum aspC
Aspartate-requiring strain 102-7 (I. Shiio and K. Ujikawa; J. Biochem. 84, 647 (1978) belonging to the genus Corynebacterium that has lost aspC activity (AAT activity) and has become aspartic acid-requiring ) Introduced a gene library (International Publication No. WO 95/23224) in which various chromosomal DNA fragments of Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 were linked to a vector that functions in Corynebacterium bacteria. Transformation. The obtained transformant is recovered, washed twice with distilled water, and minimum medium Medium10 containing no ammonia as a nitrogen source (I. Shiio and K. Ujikawa; J. Biochem. 84, 647 (1978)) Tens of thousands of these were applied to an agar plate, and aspartic acid requirement was recovered, and those showing good growth on the plate were obtained. Plasmid DNA was recovered from the aspartate-requiring strain and named as pAC. When the Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 was transformed with pAC, the transformant had improved aspC activity (Table 1). The activity was measured by a known method (see Sizer, IW and Jenkins, WT; Meth. Enzymol. Vol. 5, 677-679 (1962)).
[0112]
As a result, it was confirmed that Brevibacterium lactofermentum aspC was contained on the chromosomal DNA fragment of about 2.5 kb ATCC13869 strain existing on the plasmid DNA.
[0113]
[Table 1]

[0114]
<2> Analysis of Brevibacterium lactofermentum aspC
The nucleotide sequence of the 2.5 kb DNA fragment was determined according to the dideoxy method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)). The determined base sequence is shown in SEQ ID NO: 25. The obtained base sequence was analyzed using the GENETYX-MAC Vision 7.3 program of Software Development Co., Ltd. As a result of ORF (Open Reading Frame) search, two ORFs overlapping in opposite directions were recognized as shown in FIG. 432 amino acids or 426 amino acids encoded in the forward direction from the 879th to 881st ATG or the 897th to 899th ATG of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 as the start codon and the 2175th to 2177th TAG as the start codon ORF1 is named ORF1 and consists of 393 amino acids encoded in the reverse direction with the complementary chain GTG of CAC 2163 to 2165 as the start codon and the complementary chain TGA of 984th to 986th TCA as the start codon The ORF was named ORF2.
[0115]
<3> Determination of ORF encoding aspC
In order to confirm which of these two ORFs encodes the AAT protein, a DNA fragment encoding the full length of ORF1 was amplified by PCR from pAC. As DNA primers used for the amplification, 23-mer synthetic DNAs each having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 26 and 27 based on the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 were used. DNA synthesis and PCR were performed in the same manner as in Example 1. The amplified 2062 bp gene fragment from 126th to 2187th of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 was cloned into TA cloning vector pCR2.1 (manufactured by Invitrogen). The constructed plasmid was named pCRORF1.
[0116]
Similarly, a 1543 bp gene fragment from the 975th to the 2517th of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 encoding the full length of ORF2 alone was amplified and cloned, and named pCRORF2. As DNA primers used for amplification, 23-mer synthetic DNAs each having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 28 and 29 were used.
[0117]
In order to introduce the cloned DNA fragment into a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, the DNA fragment was connected to the shuttle vector pVK7 shown in Example 8. pCRORF1 was cleaved with the restriction enzyme EcoRI (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) and connected to pVK7 cut with the restriction enzyme EcoRI. DNA was connected using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). The constructed plasmid was named pORF1. The process of construction of pORF1 is shown in FIG.
[0118]
Similarly, pORF2 was constructed from pCRORF2 and pVK7.
The prepared pORF1 and pORF2 were introduced into Brevibacterium lactofermentum wild strain ATCC13869 in the same manner as in Example 9. The aspC activities of ATCC 13869 and the obtained plasmid-introduced strains ATCC 13869 / pORF1 and ATCC 13869 / pORF2 were measured. The activity measurement was performed in the same manner as in Example 1. As shown in Table 2, since aspC activity was improved only in ATCC 13869 / pORF1, it was confirmed that aspC was encoded in ORF1.
[0119]
SEQ ID NO: 30 shows the nucleotide sequence of aspC of Brevibacterium lactofermentum determined by the above experiment and the amino acid sequence expected to be encoded by this sequence. Further, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 31. As a result of homology research by GENEBANK, homology with known amino acid sequences including AAT proteins of other organisms was not recognized.
[0120]
[Table 2]

[0121]
[Example 10]
Introduction of plasmid containing L-lysine biosynthesis gene into Brevibacterium lactofermentum L-lysine producing bacteria
Plasmid pCABL (Cm) having mutant types lysC, dapA, dapB and lysA prepared in Example 7 ^r ) Was introduced into AJ11082 (NRRL B-11470), which is a Brevibacterium lactofermentum L-lysine producing bacterium. The AJ11082 strain has AEC resistance properties. The plasmid was introduced by the electric pulse method (Sugimoto et al., Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791). The selection of transformants was based on the drug resistance marker possessed by each plasmid. When a plasmid having a chloramphenicol resistance gene is introduced, it is contained in a complete medium containing 5 μg / ml chloramphenicol, and when a plasmid having a kanamycin resistance gene is introduced, it contains 25 μg / ml kanamycin. Transformants were selected on a complete medium.
[0122]
Next, the transformant AJ11082 / pCABL obtained as described above was further transformed into a plasmid pOm (Km ^r ) Or plasmid pORF1 (Km) containing Brevibacterium lactofermentum aspC ^r ). pCABL uses pHM1519 as the origin of replication in Brevibacterium lactofermentum cells and uses a Cm resistance gene as a marker gene, whereas pOm is the origin of replication in Brevibacterium lactofermentum cells Since pAM330 is used as a marker and a Km resistance gene is used as a marker, both plasmids are stably maintained in Brevibacterium lactofermentum cells. In this way, strains AJ11082 / pCABL / pOm and AJ11082 / pCABL / pORF1 were obtained in which the plasmid containing the L-lysine biosynthesis gene and the plasmid containing aspC coexisted.
[0123]
Similarly, p399AK9B (Cm ^r ), PDPSB (Km ^r ), PDPRB (Cm ^r ), PLYSAB (Cm ^r ), POm, pCRCAB (Km ^r ), PAB (Cm ^r ), PCB (Cm ^r ), PCAB (Cm ^r ) Was introduced, and transformants in which mutants lysC, dapA, dapB, lysA, and aspC were enhanced alone or in combination of two or three of these genes were obtained.
[0124]
Example 11
Measurement of aspC activity of transformants
The aspC activities of the transformants AJ11082 / pCABL, AJ11082 / pCABL / pOm and AJ11082 / pCABL / pORF1 obtained in AJ11082 and Example 10 were measured. The activity was measured by the method shown in <9> of Example 9. As shown in Table 3, it was confirmed that the lac promoter on the pOm vector also functions in Brevibacterium lactofermentum, and the activity of aspC of AJ11082 / pCABL / pOm was increased about 3-fold. . Furthermore, in AJ11082 / pCABL / pORF1, an activity increase of about 9 times exceeding that was confirmed.
[0125]
[Table 3]

[0126]
Example 12
Production of L-lysine
Each transformant obtained in Example 10 was cultured in an L-lysine production medium, and its L-lysine production ability was evaluated. The composition of the L-lysine production medium is as shown below.
[0127]
[L-lysine production medium]
The following components other than calcium carbonate (in 1 L) are dissolved, adjusted to pH 8.0 with KOH, sterilized at 115 ° C. for 15 minutes, and then added with 50 g of calcium carbonate sterilized by dry heat.
[0128]
Glucose 100 g
(NH _Four ) ₂ SO _Four 55 g
KH ₂ PO _Four 1 g
MgSO _Four ・ 7H ₂ O 1 g
Biotin 500 μg
Thiamine 2000 μg
FeSO _Four ・ 7H ₂ O 0.01 g
MnSO _Four ・ 7H ₂ O 0.01 g
Nicotinamide 5 mg
Protein hydrolyzate (Mameno) 30 ml
Calcium carbonate 50 g
[0129]
Various transformants and the parent strain were inoculated into a medium having the above composition, and reciprocal shaking culture was performed at 31.5 ° C. L-lysine production after 40 hours and 72 hours of culture, and growth after 72 hours (OD ₅₆₂ ) Is shown in Table 4. In the table, lysC ^* Represents mutant lysC. Growth was quantified by measuring OD at 562 nm after 101-fold dilution.
[0130]
[Table 4]

[0131]
As shown above, in the enhancement of mutant lysC, dapA, dapB, lysA, and aspC alone, L-lysine production is greater than or equal to that of the parent strain after 72 hours of culture, but after 40 hours, it is greater than that of the parent strain. However, the production amount was small, that is, the L-lysine production rate in short-term culture decreased. Similarly, when mutant lysC and dapA, or dapA and dapB are combined and enhanced, L-lysine production is higher than that of the parent strain after 72 hours of culture, but is lower than that of the parent strain after 40 hours. , L-lysine production rate decreased.
[0132]
On the other hand, in the strain in which dapB is enhanced together with mutant lysC, the strain in which mutant lysC, dapA and dapB are enhanced, and the strain in which mutant lysC, dapA, dapB and lysA are enhanced are short-term. The L-lysine accumulation amount was improved in both the culture and the long-term culture.
[0133]
In addition, five variants of lysC, dapA, dapB, lysA, and Escherichia coli aspC were enhanced, and five of lysC, dapA, dapB, lysA, and Brevibacterium lactofermentum aspC. In the strain in which L was enhanced, L-lysine production ability was further improved at any culture time. The latter degree of improvement was greater.
[0134]
【The invention's effect】
According to the present invention, L-lysine producing ability of coryneform bacteria can be improved.
[0135]
[Sequence Listing]

[0136]

[0137]

[0138]

[0139]

[0140]

[0141]

[0142]

[0143]

[0144]

[0145]

[0146]

[0147]

[0148]

[0149]

[0150]

[0151]

[0152]

[0153]

[0154]

[0155]

[0156]

[0157]

[0158]

[0159]

[0160]

[0161]

[0162]

[0163]

[0164]

[0165]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the process of constructing plasmids p399AK9B and p399AKYB having mutant lysC.
FIG. 2 shows the process of construction of plasmid pDPRB having dapB and Brevi.-ori.
FIG. 3 shows the process of construction of plasmid pDPSB having dapA and Brevi.-ori.
FIG. 4 is a diagram showing the process of construction of plasmid p299LYSA having lysA.
FIG. 5 is a diagram showing the process of construction of plasmid pLYSAB having lysA and Brevi.-ori.
FIG. 6 shows the process of construction of plasmid pCRCAB having lysC, dapB and Brevi.-ori.
FIG. 7 is a diagram showing a process of constructing a plasmid pCB having both mutant lysC and dapB.
FIG. 8 shows the process of construction of plasmid pAB having dapA, dapB and Brevi.-ori.
FIG. 9 is a diagram showing the process of construction of plasmid pCAB having mutant types lysC, dapA, dapB and Brevi.-ori.
FIG. 10 is a diagram showing the process of construction of plasmid pCABL having mutant types lysC, dapA, dapB, lysA and Brevi.-ori.
FIG. 11 is a diagram showing the process of constructing new cloning vectors pVK6 and pVK7 for coryneform bacteria.
FIG. 12 shows the process of construction of plasmid pOm having aspC.
FIG. 13 shows two ORFs on the ATCC 13869 chromosomal DNA fragment.
FIG. 14 is a diagram showing the construction process of pORF1.

Claims (9)

  DNA sequence encoding aspartokinase substantially desensitized to feedback inhibition by L-lysine and L-threonine, DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase, DNA sequence encoding dihydrodipicolinate synthase, diaminopimelate decarboxylase And a DNA sequence encoding aspartate aminotransferase, and a recombinant DNA capable of autonomous growth in coryneform bacterial cells.   The aspartokinase from which feedback inhibition by L-lysine and L-threonine is substantially released is aspartokinase derived from coryneform bacteria, and the α subunit has 279 from the N-terminal in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. The amino acid residue corresponding to the th alanine residue is an amino acid residue other than alanine and other than an acidic amino acid, and in the β subunit, the amino acid residue corresponding to the 30 th alanine residue from the N-terminus in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 The recombinant DNA according to claim 1, which is a mutant aspartokinase whose group is changed to an amino acid residue other than alanine and other than an acidic amino acid. The recombinant DNA according to claim 1 or 2 , wherein the DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 of the Sequence Listing or an amino acid sequence substantially identical thereto. The recombinant DNA according to any one of claims 1 to 3, wherein the DNA sequence encoding dihydrodipicolinate synthase encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing or an amino acid sequence substantially identical thereto. The recombinant DNA according to any one of claims 1 to 4, wherein the DNA sequence encoding diaminopimelate decarboxylase encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20 of the sequence listing or an amino acid sequence substantially identical thereto. The recombination according to any one of claims 1 to 5, wherein the DNA sequence encoding aspartate aminotransferase encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24 or 31 of the sequence listing or an amino acid sequence substantially identical thereto. DNA. A DNA sequence encoding dihydrodipicolinate reductase, DNA sequence encoding dihydrodipicolinate synthase, A coryneform bacterium having an enhanced DNA sequence encoding and a DNA sequence encoding aspartate aminotransferase. The coryneform bacterium according to claim 7, transformed by introduction of the recombinant DNA according to any one of claims 1 to 6 . A coryneform bacterium according to claim 7 or 8 is cultured in a suitable medium, L-lysine is produced and accumulated in the culture, and L-lysine is collected from the culture. Manufacturing method.

Images