EP3074418A2 - Composition vaccinale pour la prevention et/ou le traitement de leishmanioses, peptides immunogenes et procede d'obtention - Google Patents

Composition vaccinale pour la prevention et/ou le traitement de leishmanioses, peptides immunogenes et procede d'obtention

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EP3074418A2
EP3074418A2 EP14830587.3A EP14830587A EP3074418A2 EP 3074418 A2 EP3074418 A2 EP 3074418A2 EP 14830587 A EP14830587 A EP 14830587A EP 3074418 A2 EP3074418 A2 EP 3074418A2
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EP
European Patent Office
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psar
psa
leu
ser
ala
Prior art date
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Ceased
Application number
EP14830587.3A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Loup Lemesre
Gérard-Marie PAPIEROK
Rachel Elise BRAS GONCALVES
Elodie PETITDIDIER-LESIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Virbac SA
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Virbac SA
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
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Filing date
Publication date
Application filed by Virbac SA, Institut de Recherche pour le Developpement IRD filed Critical Virbac SA
Publication of EP3074418A2 publication Critical patent/EP3074418A2/fr
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/008—Leishmania antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the subject of the invention is a vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniases in mammals. It also relates to immunogenic peptides and their production process.
  • Leishmaniases are among the most serious parasitic infections affecting humans in the world. Three hundred and fifty million people are exposed in eighty - eight countries spread over four of the five continents, and sixteen million of them carry the parasite. They are responsible for a broad spectrum of clinical manifestations: cutaneous, mucocutaneous and visceral.
  • Visceral leishmaniasis is caused by parasites of the Leishmania donovani complex (L. infantum, L. chagasi and L. donovani) which are intracellular parasites of the macrophage.
  • Leishmania donovani complex Unlike other Leishmania species causing the integumentary forms of the disease (L. major, L. brasiliensis, ...) that affect the dermis or mucous membranes, leishmanias of the donovani complex have an ability to spread to all deep organs (liver, spleen, ganglion and bone marrow) where they multiply.
  • Visceral leishmaniasis also affects the canine population, which is a reservoir of parasites supplying the cycle of transmission continuously. It is due to L. infantum / chagasi, a species responsible for a zoonosis of domestic and wild canids widespread throughout the world. It affects millions of dogs in Europe, Asia, North Africa and South America. Symptomatic dogs, but also asymptomatic, constitute a source of parasites for the transmission of LV in humans.
  • first-generation vaccines based on the use of whole attenuated or dead parasites (including autoclaved), combined or not with adjuvants, were intended primarily to protect against cutaneous leishmaniases by trying to reproduce the levels of protection obtained with live parasites.
  • first-generation vaccines based on the use of whole attenuated or dead parasites (including autoclaved), combined or not with adjuvants, were intended primarily to protect against cutaneous leishmaniases by trying to reproduce the levels of protection obtained with live parasites.
  • first-generation vaccine or recombinant (second-generation vaccine) native proteins have been tested. Some vaccine candidates have given a good level of protection against experimental infection. the mouse.
  • third-generation DNA vaccines have been developed with the nucleotide sequences encoding the proteins used in second generation vaccines (References 1, 2 and 3).
  • mice have been successfully explored in mice, such as the antigens based on antigens present in sandfly saliva (References 4 and 5), which have made it possible to obtain relative resistance to experimental infection. at Leishmania major.
  • LEISH-Fl consisting of 3 recombinant fusion proteins (TSA-LmSTI1-LelF) formulated with a monophosphorylated lipid and squalene in a stable emulsion (MPL-SE).
  • TSA-LmSTI1-LelF 3 recombinant fusion proteins
  • MPL-SE monophosphorylated lipid and squalene in a stable emulsion
  • CaniLeish® which is a product composed of secretion excretion antigens (AES) of L. infantum promastigotes (based on WO 9426899 and its extensions, on behalf of IRD). Canine leishmaniasis thus sees its preventive measures profoundly modified and completed.
  • AES secretion excretion antigens
  • Vaccination not only controls the development of the disease, but also significantly decreases the parasite load in the dog and thus contributes to the interruption of the transmission cycle of LV in sandflies, dogs and humans.
  • the solution provided by the invention is based on the work carried out by some of the co-inventors on the major immunogen naturally secreted excreted antigens (AES).
  • the invention therefore aims to use, as a vaccine molecule, a PSA, as obtained by implementing said strategy and / or the use of a part of this molecule, and their applications. prophylactic and / or immunotherapeutic agents in mammals.
  • the invention also aims, as new molecules, major immunogens of AES, and a portion of these immunogens, as produced according to the method of the invention.
  • the invention is further directed to a preventive and / or therapeutic vaccine composition comprising such an immunogenic molecule and / or a part of this molecule and the antibodies directed against this molecule.
  • the invention thus relates to the use, as a vaccine molecule in a mammal, of a PSA such as leishmania, or a part of this PSA, hereinafter referred to as ES PSAR, having immunogenic properties, said PSA is presenting in soluble, native, recombinant form.
  • a PSA such as leishmania
  • ES PSAR a part of this PSA
  • Soluble PSA refers to soluble PSA excreted / secreted into leishmania culture supernatant.
  • “Native PSA” refers to a PSA as produced in a culture supernatant by a leishmania, comprising the co- and post-translational modifications of a PSA such as leishmania, or a part of this PSA having immunogenic properties, said PSA, hereinafter referred to as ES PSAr, being in soluble form, native in conformation, recombinant or a part of such PSA.
  • Recombinant PSA refers to a PSA as expressed by genetic recombination, integrated into the genome of the host cells of the expression system.
  • E PSAr generally means a PSA of leishmania, in soluble, native, recombinant form or a part of such PSA.
  • the PSA sequence comprises a signal peptide involved in the secretory pathways located at the end of the amino-terminal part of the molecule, a variable number of repeat domains rich in leucine (LRR motifs, for "Leucine”). Rich Repeats ”) and a carboxy-terminal portion of the proline-rich molecule, threonine and cysteine (see Figure 1).
  • the end of the carboxy terminal part comprises a hydrophobic anchoring signal GPI or anchor GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol).
  • PSA also has the particularity of being present in all species of leishmania (integumentary and visceral), which represents a real advantage in terms of cross-vaccination vis-à-vis the different clinical expressions of leishmaniasis.
  • the invention relates to the use of the entire ES PSAr molecule.
  • the term "whole PSAr PS” means that the protein possesses the co- and post-translational modifications of the native molecule, as produced by the parasite and is not truncated.
  • the invention aims to use an ES PSAr that does not include all the co- and post-translational modifications.
  • the invention relates to the use of a deglycosylated ES PSAr.
  • the use according to the invention comprises a glycosylated PSAR PS.
  • the invention relates to the use of an ES PSAr devoid of the GPI anchor of the hydrophobic part in the C-terminal end. In another variant embodiment, the invention relates to the use of a PS PS ES devoid of the carboxy terminal part.
  • the invention relates to the use of the C-terminal part of a PSA or ES PSAr molecule (hereinafter referred to as C-ter PSA or Oter ES PSAr) as isolated of a leishmaniasis culture excretion / secretion supernatant.It is a non-native molecule, as encoded by a truncated DNA sequence of PSA or ES PSAr
  • the invention relates to the use as a vacant molecule of an ES PSAr as obtained from the PSA of L. amazonensis or a leishmania donovani complex, especially L. infantum or L. donovani, or the complex braziliensis and tropica.
  • the invention thus aims in particular at using an ES PSAr of sequence SEQ ID No. 1.
  • This ES PSAr is obtained more particularly from the PSA produced by L. amazonensis deleted from its hydrophobic membrane anchoring peptide.
  • the ES PSAr is more particularly obtained from the PSA of L. infantum of sequence SEQ ID No. 2 or L. donovani of sequence SEQ ID No. 3, these sequences also being deleted at the carboxy-terminal end of their hydrophobic membrane anchoring peptide.
  • the vaccine molecule used may correspond to a part of the ES PSAr, in particular at the C-terminal end.
  • Such a molecule has in particular the sequence SEQ ID No. 4.
  • the invention relates to the use, as a vaccine molecule, of an ES PSAr in soluble form, as produced by insertion of a vector comprising the gene encoding ES PSAr into a eukaryotic recombinant leishmanian expression system.
  • the recombinant expression system used is that of a nonpathogenic leishmania in mammals.
  • the invention is particularly directed to the use, as a vaccine molecule, of ES PSAr in soluble form, as produced by insertion of the gene encoding ES PSAr, into a eukaryotic recombinant expression system consisting of Leishmania tarentolae or alternatively of the gene coding for a part of ES PSAr, in particular a part devoid of its hydrophobic part as indicated above.
  • this system allows the integration of the expression vector containing the gene coding for ES PSAr in the 18S rRNA locus of the chromosome of Leishmania tarentolae which has a very high transcription rate and thus the obtaining of an abundant amount of the ⁇ recombinant.
  • the protein can be produced with all or part of the co- and post-translational modifications of Leishmania proteins.
  • the invention also relates to a method for producing ES PSAr in soluble form, comprising the characteristics defined above.
  • this method comprises the integration of an expression vector comprising the gene encoding ES PSAr in a non-pathogenic eukaryotic recombinant system for humans or animals.
  • the transfection by the vector is carried out in the locus of a chromosome of a non-pathogenic leishmania having a high level of transcription.
  • a particularly suitable leishmania is L. tarentolae, at the promastigote stage.
  • the insertion in the 18 s rRNA locus of the chromosome whose transcription rate is high makes it possible to obtain high production yields.
  • the expression vector used is advantageously a plasmid.
  • pF4X1.4 is particularly suitable for the implementation of the invention. Sequences necessary for post-translational modifications in L. tarentolae are introduced on both sides of the cloning cassette.
  • the ES PSAr protein thus produced is a soluble protein in leishmania culture supernatants, possessing the properties of the native protein, in particular one or more of the co- and posttranslational modifications of Leishmania proteins, such as acetylation, hydroxylation, disulfide bridges, glycylation, glycosylation, phosphorylation, lipid anchoring and the like.
  • deglycosylated ES PSAr in one variant of the invention, is produced from the culture of the promastigote forms of L. tarentolae in the presence of tunicamicyne.
  • Tunicamycin is an antibiotic that inhibits the GlcNAc phosphotransferase (GPT) enzyme. It thus inhibits the N-glycosylation necessary for fixing the precursors of N-glycosides on the dolichol diphosphate (see FIG. 3).
  • the culture of L. tarentolae promastigote transgenes is advantageously carried out in the fully defined culture medium as described in the aforementioned international application in the name of IRD and its extensions, which makes it possible to recover PSA produced without serum contaminants. and cell provided by conventionally used culture media,.
  • a purification step can be carried out for example by chromatography of gel affinity.
  • the production of the C-ter portion of PSA is advantageously carried out in a recombinant bacterial system, followed preferably by a purification step.
  • the expression vector used which comprises the cDNA of the gene coding for the carboxy-terminal part of PSA, is in particular a plasmid.
  • a plasmid construct suitable for carrying out the invention comprises the elements for producing a recombinant protein with a 6-Histidine tag in position
  • the colonies producing the desired recombinant proteins are selected and after amplification in culture are advantageously purified.
  • the invention is directed in particular to a glycosylated PSAR PS or alternatively a deglycosylated PSAr ES.
  • ES PSAr a deleted ES PSAr, in particular devoid of the GPI anchor and therefore the hydrophobic peptide in the C-terminal position, which makes it possible to avoid aggregation phenomena and the formation of inclusion bodies during production. from ES PSAr.
  • the invention aims as a new product, the molecule consisting of the C-ter PSA portion of the protein as defined above.
  • ES PSAR protein as well as its carboxy-terminal part (C-ter PSA), in combination with an adjuvant, confer in the dog a very high level of protection against an experimental infection. to L. infantum.
  • the examples also show a protective and induced immuno-reaction on human cells, which confirms the results obtained in dogs and allows to consider the development of a human vaccine.
  • This immunoreactivity is accompanied by the production TH1-type cytokines and a T-cytotoxic response evidenced by the production of granzyme B.
  • the invention therefore also relates to a vaccine composition for the prevention and / or treatment of leishmaniases in humans or animals, characterized in that it comprises:
  • an ES PSAr protein in soluble form, of leishmania and / or a truncated ES PSAr, in particular depicted from the GPI anchor, and / or the C-ter peptide portion of PSA such as leishmania, or ES PSAr and
  • one or more adjuvants and / or one or more immunomodulators are provided.
  • the adjuvant is advantageously chosen from those capable of inducing a cell-mediated response leading to the elimination of the parasite.
  • Suitable adjuvants include those of the TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9 classes, saponins and their derivatives, oil-in-water or water-in-oil emulsions, polysaccharides, cationic liposomes, virosomes or polyelectrolytes.
  • Suitable immunomodulators include phlebotomy saliva proteins, cytokines and heat shock protein (HSP).
  • the vaccine composition of the invention is particularly in a form allowing administration by different routes, such as the subcutaneous, intradermal, intramuscular, parenteral, oral, endonasal or mucosal route.
  • the vaccine composition defined above is especially suitable for the manufacture of a drug or a vaccine, an in vivo or in vitro diagnostic reagent for the induction or diagnosis in mammals of cell-mediated immunity dependent on Th1-type lymphocytes and / or humoral effector immunity.
  • composition is suitable for induction or diagnosis in the mammal of the passage from a Th2 type immune state to a Th1 type immune state, or for the induction or diagnosis in the mammal of isotype specific antibodies.
  • Such antibodies and the antisera containing them also form part of the invention.
  • FIGS. 1 to 18, which represent, respectively,
  • FIG. 1 a schematic representation of the Leishmania PSA protein
  • FIG. 2 the polypeptide analysis of purified ES PSAr in SDS-PAGE gel (reducing and non-reducing conditions
  • FIG. 4 the polypeptide analysis of C-ter PSA (SEQ ID NO: 4) purified in SDS-PAGE gel (reducing and non-reducing conditions,
  • FIG. 5 Electrophoretic analysis of ES PSAr soluble glycoproteins (SEQ ID NO: 1 deglycosylated (1 and 3), native ES PSAR (2 and 4)),
  • FIG. 6 IgG2 versus AES ELISA expressed in optical density (OD)
  • FIG. 7 IgG2 versus ES PSAR ELISA expressed in optical density (OD)
  • FIG. 8 IgG2 versus C-ter PSA ELISA expressed in optical density (OD),
  • FIG. 9 Effect of the sera of vaccinated dogs (CaniLeish®, ES PSAr and C-ter PSA) on the viability and proliferation of the promastigotes of
  • T0 pre-immune sera
  • T5 sera taken two months after the administration of three doses of the vaccine
  • Figure 10 Neutralizing effect of anti-ES PSAr and anti-C-ter PSA monospecific polyclonal rabbit sera (used at different dilutions (1/10, 1/50 and 1/100), - Figure 11: Effect of a serum monospecific polyclonal rabbit directed against the C-ter PSA portion (carboxy-terminal portion of PSA) used at different dilutions (1/25 and 1/50) on the growth of promastigote forms of.
  • FIG. 12 Evaluation, compared to a control, of the number of promastigotes / mL with concentrations of PS PS 17.8 ⁇ and 0.22 ⁇ , at different addition times,
  • FIG. 13 Leishmanicidal activities of the canine macrophages of the placebo group versus the group vaccinated before (T0), one month after the administration of two doses of vaccine (T3) and two months after the injection of three doses (T5),
  • Figure 14 Determination of interferon (IFN) - ⁇ levels present in the co-culture supernatants of cells from placebos and vaccinated dogs (ES PSAr or C-ter PSA).
  • T0 pre-immune sera
  • T5 sera taken two months after the administration of three doses of the vaccine
  • Figure 15 Evaluation of the levels of nitric oxide (NO) produced in the supernatants of co-culture of the cells from placebos and vaccinated dogs (ES PSAr or C-ter PSA).
  • T0 pre-immune sera
  • T5 sera taken two months after the administration of three doses of the vaccine
  • Figure 17 Determination of Percentages of Parasitologically Positive Dogs in Placebos and Groups of Dogs Vaccinated with C-ter PSA,
  • Figure 18 Determination of parasite loads by RT-PCR in dogs of placebo and vaccinated groups.
  • Example 1 Obtaining, producing and purifying recombinant proteins
  • a hyperimmersum generated in the rabbit and directed against the exosproting secretion antigens (AES) of L. amazonensis promastigote and a monoclonal antibody (E2) specifically directed against the major immunogen of parasitic AES were used to screen a bank cDNA of promastigote and amastigote forms (produced in 1ZAPII) of L. amazonensis.
  • sequence SEQ ID No. 1 is derived from the LaPSA38 gene coding for the entire 45 kDa (372 aa) protein which corresponds to WO 2005/051989 in the name of IRD and the sequence SEQ ID No. 4 is derived from the truncated gene.
  • PSA19 which codes for the carboxy- terminal of LaPSA38. This is the C-ter PSA part, 19kDa (119 aa).
  • the sequence SEQ ID No. 2 is derived from the LiJll gene.
  • the LiJll gene was obtained by using the C-ter PSA sequence (radiolabeled probe) to screen a cosmid library of genomic DNA of L. infantum promastigotes, which made it possible to characterize a homologous PSA in Leishmania infantum (PSA IJll). 463 aa (50 kDa).
  • PSAIJll of L. infantum exhibits strong sequence homology with that of LAPSA38s of L. amazonensis in its amino- (73.8%) and carboxy- (77.5%) terminal parts with a number of motifs. higher leucine-rich repeat (9 against 6) (in the aforementioned international application WO 2005/051989, said gene coding for the non-recombinant protein corresponds to SEQ ID No. 11 and the protein encoded in SEQ ID No. 12).
  • This step is carried out with a gene expression system in L. tarentolae marketed by Jena Bioscience: “Leishmania tarentolae Gene Expression Starter Kit”.
  • This expression system uses the parasite itself to produce its own protein. The latter has many advantages for the production of therapeutic proteins:
  • Leishmania tarantolae is a non-pathogenic lizard parasite for humans. Its manipulation does not require any restrictive security measures;
  • L. tarentolae is easily grown in cell suspension in completely defined culture media (no contamination with other foreign proteins), at 26 ° C, with a good yield (of the order of 10 cells per ml, population doubling time of 4 h.);
  • This expression system makes it possible to produce proteins native to Leishmania.
  • the parasite contains the machinery necessary for the expression of native eukaryotic proteins;
  • the protein produced possesses all post-translational modifications of Leishmania proteins such as glycosylation and disulfide bond formation;
  • the vector used in this system makes it possible to clone the gene of interest in a bacterial system and then to express the protein in Leishmania tarentolae;
  • the LaPSA38s gene was amplified and then modified by site-directed mutagenesis to allow the production of a protein with a poly-histidine tag (5 histidines) partially carboxy-terminal, and delete the site of anchoring to the membrane.
  • plasmids were specifically constructed to allow the production of the recombinant protein in the culture medium supernatant from which it can be easily isolated.
  • This construct was transfected into Leishmania tarentolae where it was integrated into the genome of the parasite at the promastigote stage, by homologous recombination, conferring at the same time a resistance to nseothorin (NTC), to select the recombinant individuals.
  • NTC nseothorin
  • Overexpression is done thanks integration of the gene within the 18S rRNA locus, taking advantage of the high level of transcription of host RNA polymerase I.
  • This plasmid also contains around the cloning cassette the sequences necessary for the co- and post-translational modifications in elshmania tarentolae, making it possible to obtain a protein in its native form.
  • the promastigote transgenes of L. tarentolae were adapted in the completely defined medium developed by the IRD (WO application cited above and its extensions) so as to easily purify the parasite protein from the culture supernatants and to produce it in the absence of any foreign protein (molecules of serum and cellular origin).
  • the purification from the culture medium supernatants of the ES PSAr thus produced was carried out by Agarose-Nickel gel affinity chromatography.
  • LAPSA38snr of L. amazonensis was produced with a production yield of 0.2 to 0.3 mg of purified protein per liter of culture, sufficient to allow its use in the development of new analytical methods and its evaluation as a vaccine candidate. It corresponds to an apparent molecular weight of 45 kDa and a theoretical molecular weight of 37 kDa. It has the sequence SEQ ID No. 1 referred to above. This protein has 349 amino acids; his ft is 5.07.
  • the cDNAs of the LaPSA19s gene were inserted into plasmid pQE-31.
  • the plasmids were specifically constructed to allow the production of a recombinant protein having a 6-His-tag in the amino-terminal position and a tag cleavage site.
  • the transformation with pQE-31-6 (His) -C00H LaPSAl9s was carried out in chemically competent E. coli M15 bacterial cells.
  • the recombinant colonies were selected to produce the recombinant proteins.
  • the most productive clone was amplified in culture.
  • the corresponding C-ter PSA protein was purified on Agarose-Nickel gel.
  • a yield of about 1 g of recombinant protein per liter of culture was obtained. It comprises 119 amino acids and has a molecular weight of 18 kDa under reducing conditions and in dimer form, under non-reducing conditions, a molecular weight of 36 kDa (see FIG. 4).
  • This clinical trial reported hereinafter aims to compare in the same vaccination trial in dogs "Beagle" the protective effects of the two recombinant proteins ES PSAr and C-ter PSA on groups of 9 dogs and 5 dogs respectively.
  • a placebo group of 5 dogs constitutes the control group not vaccinated.
  • An experimental challenge infection is performed 2 months after the immunization protocol.
  • Clinical and parasitological follow-up are carried out every 2 months until 8 months after the experimental infection.
  • QA21 is used at 60 ⁇ s per vaccine dose, the equivalent amount of adjuvant used in the CaniLeish vaccine. Used alone and at this concentration, it has no significant effect on the immune system of the dog and mouse.
  • the immunization protocol includes 3 injections by the subcutaneous route performed at one month intervals. Three groups of dogs were selected as follows:
  • Group 1 Placebo (Physiological Injection for Injection);
  • Group 2 Injection of 25 ⁇ g of LaES PSAr adjuvanted with 60 ⁇ g of QA-21;
  • Group 3 Injection of 25 ⁇ g of C-ter PSA (protein of sequence SEQ ID No. 4) adjuvated with 60 of QA-21.
  • T3 one month after administration of two T5 vaccine doses: two months after three doses of the vaccine.
  • 3 - CLINICAL FOLLOW-UP
  • An experimental challenge infection injection of 10 9 metacyclic promastigotes of L. infantum intravenously was performed 2 months after the immunization protocol. Clinical and parasitological follow-ups conducted every 2 months for 8 months after experimental infection.
  • PCR and culture of bone marrow samples at T0, 2 months post-challenge (T6), 4 months post-challenge (T7), and 6 months post-challenge (T8) were performed to highlight the presence of the parasite or its DNA.
  • ELISA techniques were used to analyze the antibody responses in the dogs in the study.
  • the mean titers of IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr and anti-Cter PSA antibodies were compared by ELISA between placebo dogs and vaccinated dogs before immunization (T0) and at different post-immunization times:
  • the determined anti-Leishmania IgG antibody responses were negative in all dogs in the pre-immunization study and in all dogs in the T5 placebo group.
  • IgG2 isotype antibodies specifically against AES (FIG. 6), ES PSAr (FIG. 7) and C-ter PSA (FIG. 8) are demonstrated in all vaccinated dogs from the first month after administration of two vaccine doses (T3) and two months after three doses of the vaccine (T5).
  • Vaccine candidates do not induce anti-Leishmania IgG antibodies (antigen shown) in the dog by the indirect immunofluorescence technique (IFI, standard technique for serological diagnosis) in all vaccinated dogs (T3-negative IFI titre). and T5).
  • IFI indirect immunofluorescence technique
  • IgG2 isotype antibodies strongly demonstrates the induction of Th1 (protective immunity) type cellular immunity.
  • Th1 protective immunity
  • b - Functional biological role of antibodies produced bl- Effect of sera from vaccinated dogs (CaniLeish®, ES PSAr and C-ter PSA) on the viability and proliferation of Leishmania
  • Transgenes promastigotes of L. infantum MONL ⁇ c! NEO 2 r / Luke) transfected with luciferase gene are incubated for 5 days in the absence or presence of serum (decomplementized) of placebos and vaccinated dogs. The number of parasites is determined by luminometry (RLU). The results are expressed as percentage inhibition of the proliferation of promastigotes.
  • Promatigative forms were incubated in the presence of different dilutions (1/10, 1/50 and 1/100) of rabbit sera healthy or previously immunized with PSAR ES (or C-ter PSA and then washed three times by centrifugation for eliminate excess serum
  • PSAR ES or C-ter PSA
  • PI Parasite Index
  • the leishmanicidal activities revealed by the Placébo group versus the Vaccinated group cells were evaluated before (T0) and one month after two doses of vaccine (T3) and two months after the injection of three doses ( T5).
  • PCR gene amplification technique
  • IgG2 isotype which seems to play a significant role in the protection (leishmanicidal and neutralizing effects); the polarization of the cell-mediated response towards a Th1-type pathway revealed by an increase in the production by IFN-gamma T lymphocytes leading to the activation by the classical macrophage pathway characterized by the increased synthesis of NO and therefore the elimination of intracellular leishmanias (leishmanicidal activity of canine macrophages).
  • the immunogenicity of native recombinant PSA was evaluated on human cells by analyzing the profile of the cellular immune response generated ex vivo in humans.
  • ES PSAr ability of ES PSAr to induce, ex-vivo, on human cells, a specific cell-mediated immune response by activating Thl-producing cytokine-producing T lymphocytes and / or Granzyme B from healthy donors as compared to individuals immune or healed exposed to visceral leishmaniasis L. infantum in the south of France, was evaluated. To this end, a set of immunological and parasitological methods, associated with clinical monitoring, has been set up.
  • IFN-gamma ( ⁇ g / ml) in supernatants co-culturing human cells from healthy individuals (B, IND 8 to 15) and asymptomatic or cured immune individuals (A, IND there 7) exposed in southern France to visceral leishmaniasis L. infantum.
  • TSLA Ldd8 total parasite extract of L. donovani promastigotes
  • TSLA Ldi total parasite extract of L. infantum promastigotes.
  • TSLA Ldd8 total parasite extract of L. donovani promastigotes
  • TSLA Ldi total parasite extract of L. infantum promastigotes
  • the analysis of the cell test results shows that the ES PSAr constituting the vaccine candidate is capable of inducing a specific Th1 type immune response, generating significant levels of IFN- gamma (Table 1), and / or a T-cytotoxic response determined by a significant production of Granzyme B (Tabeau 2) in asymptomatic or cured individuals with respect to individuals healthy.
  • the results of the immunogenicity tests of the vaccine candidate ES PSAr confirm the interest of this recombinant protein to be selected to enter the composition of a vaccine against human leishmaniases.

Abstract

L'invention vise l'utilisation, comme molécule vaccinale chez un mammifère, d'une PSA, telle qu'issue de leishmanie, ou une partie de cette PSA possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA désignée ci-après par ES PSAr, se présentant sous forme soluble, native, recombinante. Elle vise également une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement des leishmanioses comprenant une protéine ES PSAr.

Description

COMPOSITION VACCINALE POUR LA PREVENTION ET/OU LE TRAITEMENT DE LEISHMANIOSES, PEPTIDES IMMUNOGENES ET PROCEDE D'OBTENTION
L'invention a pour objet une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement de leishmanioses chez les mammifères. Elle est également relative à des peptides immunogènes et à leur procédé de production.
Les grandes endémies parasitaires sont, de très loin, les causes les plus importantes de morbidité et de mortalité non seulement pour l'espèce humaine, mais pour toutes les autres espèces animales tant domestiques que sauvages.
Les leishmanioses sont parmi les plus graves infections parasitaires affectant l'Homme dans le monde. Trois cents cinquante millions d' individus sont exposés dans quatre- vingt-huit pays répartis sur quatre des cinq continents et seize millions d'entre eux sont porteurs du parasite. Elles sont responsables d'un large spectre de manifestations cliniques : cutanées, muco-cutanées et viscérales.
La leishmaniose viscérale (LV) est causée par les parasites du complexe Leishmania donovani (L. infantum, L. chagasi et L. donovani) qui sont des parasites intracellulaires du macrophage. Contrairement aux autres espèces de Leishmania causant les formes tégumentaires de la maladie (L. major, L. brasiliensis, ...) qui affectent le derme ou les muqueuses, les leishmanies du complexe donovani présentent une capacité à se disséminer à l'ensemble des organes profonds (foie, rate, ganglions et moelle osseuse) où elles se multiplient. Les patients atteints de LV présentent alors un tableau clinique associant une fièvre modérée mais persistante, une hépatosplénomégalie et une pancytopénie conduisant généralement au décès si aucun traitement spécifique n'est initié suffisamment rapidement ou en cas d'échec au traitement. Même si la LV à L. infantum/chagasi est un problème important en Europe du Sud avec l'extension de la pandémie du SIDA et l'apparition d'un nombre croissant de co-infections Leishmania/HIV, elle est loin d'être contrôlée et devient très préoccupante en termes de problème de santé publique dans les pays d'Amérique du Sud. Dans d'autres parties du monde, notamment dans les zones d'endémie à L. donovani , des épidémies meurtrières ont fait des centaines de milliers de victimes ces dernières décennies, particulièrement au Soudan et en Inde. De plus, la situation devient critique en Inde avec l'émergence de souches résistantes aux dérivés pentavalents de l'antimoine (médicaments de première intention) .
L'incidence annuelle des leishmanioses humaines est estimée entre 2 et 2,5 millions de nouveaux cas, parmi lesquels plus de 500 000 sont atteints de leishmaniose viscérale et 1,5 à 2 millions de leishmanioses tégumentaires dont certaines sont très défigurantes et mutilantes comme les leishmanioses muco-cutanées (LMC) . Ceci a pour conséquence une morbidité globale supérieure à deux millions de DALYs (pour Disability Adjusted Life Years) et le décès de près de soixante mille personnes chaque année. Ces maladies constituent encore aujourd'hui un véritable problème de santé publique en Amérique latine, en Asie, en Afrique, au proche et Moyen Orient et dans le sud de l'Europe.
La leishmaniose viscérale touche également la population canine, qui constitue un réservoir de parasites approvisionnant de manière continue le cycle de transmission. Elle est due à L. infantum/chagasi, espèce responsable d'une zoonose des canidés domestiques et sauvages largement répandue dans le monde. Elle affecte des millions de chiens en Europe, Asie, Afrique du Nord et Amérique du Sud. Les chiens symptomatiques , mais aussi asymptomatiques , constituent une source de parasites pour la transmission de la LV chez l'Homme.
Les mesures de prévention contre les leishmanioses sont nombreuses. Pendant longtemps, elles ont été fondées sur la lutte contre l'insecte vecteur et l'objectif principal visait à contrôler leur multiplication par l' utilisation d'insecticides et à éviter le contact entre le vecteur (phlébotome) et leurs hôtes (chien, Homme, ...) . Le contrôle des leishmanioses, une fois diagnostiquées, passe aussi par les traitements chimiothérapeutiques . Ces derniers sont malheureusement mis en péril par un arsenal thérapeutique ancien et très limité, des traitements longs, toxiques et onéreux s 1 accompagnant de nombreux cas de rechute et par l'émergence des phénomènes de chimiorésistance . En l'absence de traitements efficaces et devant l'ampleur du problème, il devient donc nécessaire de mettre à la disposition des populations les plus gravement touchées des moyens de prévention applicables à grande échelle, dont le plus adapté serait la vaccination.
Plusieurs arguments sont en faveur de la faisabilité d'un vaccin chez l'Homme.
Cependant, chez l'Homme, aucun vaccin n'est actuellement disponible contre les leishmanioses.
En fait, seule une approche pragmatique utilisant des parasites entiers tués a été rendue possible à ce jour.
Historiquement, les vaccins de première génération, basés sur l'utilisation de parasites entiers atténués ou morts (notamment autoclavés) combinés ou non à des adjuvants, avaient pour but de protéger principalement contre les leishmanioses cutanées en essayant de reproduire les niveaux de protection obtenus avec les parasites vivants. Cependant, les nombreux essais cliniques menés sur des milliers d'individus en Amérique du sud, mais aussi en Iran, ont donné des résultats plus que mitigés, voire décevants.
De nombreux vaccins à sous-unités constituées de protéines natives purifiées (vaccin de première génération) ou recombinantes (vaccin de seconde génération) ont ainsi été testés Certains candidats vaccins ont conféré un bon niveau de protection à l' encontre d'une infection expérimentale chez la souris.
Plus récemment, les vaccins ADN, dit de troisième génération, ont été développés avec les séquences nucléotidiques codant pour les protéines utilisées dans les vaccins de seconde génération (Références 1, 2 et 3) .
Enfin, d'autres pistes vaccinales ont été explorées avec succès chez la souris comme les vaccins à base d'antigènes présents dans la salive du phlébotome (Références 4 et 5), qui ont permis d'obtenir une relative résistance à l'infection expérimentale à Leishmania major.
Toutefois, à ce jour, peu de candidats vaccins ont dépassé le stade expérimental (souris, hamsters) en raison de la difficulté à développer un modèle animal approprié reproduisant les caractéristiques de la maladie humaine et à mettre en œuvre des essais cliniques chez des hôtes naturels de l'infection qui nécessitent des cohortes importantes, des infrastructures lourdes et qui peuvent prendre des années avant de donner un résultat définitif. De plus, il est difficile d'extrapoler directement des résultats obtenus chez la souris à des hôtes naturels de l'infection, tels que le chien ou l'Homme. Enfin, les réponses immunitaires protectrices contrôlant une infection d'épreuve peuvent ne pas refléter celles requises pour prévenir les leishmanioses en zones endémiques. Deux candidats vaccinaux sont en cours de développement clinique :
• Le Leish 111 f MPL SE du Infections Disease Research
Institute (IRDI) à Seattle est un vaccin chimérique appelé LEISH-Fl constitué de 3 protéines recombinantes en fusion (TSA-LmSTIl-LelF) formulées avec un lipide monophosphorylé et du squalène dans une émulsion stable (MPL-SE) . Toutefois, si la protection contre la leishmaniose cutanée semble en bonne voie, des études ont montré que Leish-lll f MPL-SE ne protège pas des chiens exposés à une infection naturelle à L. infantum.
Le HASPB + KMP-11 de l'Université de York (Grande Bretagne) sur lequel les résultats des essais cliniques ne sont pas connus à ce jour.
Chez le Chien, il existe une solution efficace avec
CaniLeish®, qui est un produit composé d'antigènes d'excrétion sécrétion (AES) de promastigotes de L. infantum (basé sur WO 9426899 et ses extensions, au nom de l' IRD) . La leishmaniose canine voit ainsi ses mesures préventives profondément modifiées et complétées.
La vaccination contrôle non seulement le développement de la maladie, mais diminue aussi significativement la charge parasitaire chez le chien et contribue ainsi à l'interruption du cycle de transmission de la LV chez le phlébotome, le chien et l'Homme.
Toutefois les rendements de production des AES ne permettent pas une production à l'échelle industrielle d'un vaccin humain.
Dans ce contexte, il existe à ce jour un besoin urgent d'investir dans de nouvelles pistes proposant une alternative plus efficace aux vaccins existants, afin de permettre la vaccination prophylactique et/ou thérapeutique de patients contre les leishmanies, notamment les patients résistants aux thérapies existantes, et de fournir une molécule vaccinale reproductible, thermostable et facile à produire à bas prix dans les zones d'endémie.
La solution apportée par l'invention s'appuie sur les travaux réalisés par certains des co-inventeurs sur l'immunogène majeur des antigènes naturellement excrétés sécrétés (AES) .
Ces travaux, concernant la caractérisation biochimique, immunologique et plus récemment moléculaire des AES de L. amazonensis ou L. infantu , ont démontré clairement qu'ils renferment des immunogènes majeurs constitués par des protéines appelées PSA (pour « Promastigote Surface Antigen ») .
Dans le cadre de l'étude de ces protéines comme candidats vaccinaux, une nouvelle stratégie de production a été développée par les inventeurs, permettant de disposer de produits excrétés/sécrétés fortement immunogènes et de les obtenir sous forme native, recombinante, avec des rendements élevés, rendant ainsi possible leur exploitation à échelle industrielle .
De plus, il s'est avéré que des parties de telles molécules présentaient de manière inattendue également un grand intérêt pour les applications prophylactiques et thérapeutiques visées.
L'invention a donc pour but l'utilisation, en tant que molécule vaccinale, d'une PSA, telle qu'obtenue en mettant en œuvre la dite stratégie et/ou l'utilisation d'une partie de cette molécule, et leurs applications prophylactiques et/ou immunothérapeutiques chez les mammifères.
Elle vise également une méthode de production en milieu complètement défini d'une PSA, assurant son obtention de manière reproductible dépourvue de toutes protéines étrangères et à un coût permettant une exploitation à l'échelle industrielle, ainsi que la production d'une partie de cette PSA.
L'invention vise également, en tant que nouvelles molécules, des immunogènes majeurs d'AES, et une partie de ces immunogènes, tels que produits selon le procédé de l' invention .
Selon encore un autre aspect, l'invention vise en outre une composition vaccinale à visée préventive et/ou thérapeutique, renfermant une telle molécule immunogène et/ou une partie de cette molécule et les anticorps dirigés contre cette molécule.
L'invention vise ainsi l'utilisation, comme molécule vaccinale chez un mammifère, d'une PSA telle qu'issue de leishmanie, ou une partie de cette PSA, désignée ci-après par ES PSAr, possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA se présentant sous forme soluble, native, recombinante .
Dans la description et les revendications,
« PSA soluble » désigne une PSA soluble excrétée/sécrétée dans le surnageant de culture de leishmanies .
« PSA native » désigne une PSA telle que produite dans un surnageant de culture par une leishmanie, comportant les modifications co- et post- traductionnelles d'une PSA telle qu'issue de leishmanie, ou une partie de cette PSA possédant des propriétés immunogènes, ladite PSA désignée ci-après par ES PSAr se présentant sous forme soluble, native par sa conformation, recombinante ou une partie d'une telle PSA.
« PSA recombinante » désigne une PSA telle qu'exprimée par recombinaison génétique, intégrée au génome des cellules hôtes du système d'expression. - « ES PSAr » désigne de manière générale une PSA de leishmanie, sous forme soluble, native, recombinante ou une partie d' une telle PSA.
On rappelle que la séquence d'une PSA comporte un peptide signal impliqué dans les voies de sécrétion situé à l'extrémité de la partie amino-terminale de la molécule, un nombre variable de domaines répétés riches en leucine (motifs LRR, pour « Leucine Rich Repeats ») et une partie carboxy- terminale de la molécule riche en proline, thréonine et cystéine (voir Figure 1). L'extrémité de la partie carboxy- terminale comporte un signal hydrophobe d'ancrage GPI ou ancre GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol) .
La PSA possède aussi la particularité d'être présente chez toutes les espèces de leishmanies (tégumentaires et viscérales) , ce qui représente un réel avantage en termes de vaccination croisée vis-à-vis des différentes expressions cliniques de la leishmaniose.
Selon un mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de la molécule de ES PSAr entière,. L'expression « ES PSAr entière » signifie que la protéine possède les modifications co- et post-traductionnelles de la molécule native, telle que produite par le parasite et n'est pas tronquée.
En variante, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr ne comportant pas la totalité des modifications co-et post-traductionnelles. En particulier, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr déglycosylée .
Selon une autre variante, l'utilisation selon l'invention comprend une ES PSAr glycosylée.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation d'une ES PSAr dépourvue de l'ancre GPI de la partie hydrophobe dans l'extrémité C-terminale. Dans une autre variante de réalisation, l' invention vise l'utilisation d'une ES PSAr dépourvue de la partie carboxy- terminale .
Selon encore un autre mode de réalisation, l'invention vise l'utilisation de la partie C-terminale d'une molécule de PSA ou de ES PSAr (désignée ci-après par C-ter PSA ou Oter ES PSAr) telle qu'isolée d'une surnageant d'excrétion/sécrétion de culture de leishmaniose.il s'agit d'une molécule non native, telle que codée par une séquence d'ADN tronquée de PSA ou de ES PSAr
De manière avantageuse, l'invention vise l'utilisation comme molécule vacinale d'une ES PSAr telle qu'obtenue à partir de la PSA de L. amazonensis ou d'une leishmanie du complexe donovani, notamment de L . infantum ou de L. donovani ,ou du complexe braziliensis et tropica.
L'invention vise ainsi notamment l'utilisation d'une ES PSAr de séquence SEQ ID N°l. Cette ES PSAr est obtenue plus particulièrement à partir de la PSA produite par L . amazonensis délétée de son peptide hydrophobe d'ancrage membranaire .
En variante, la ES PSAr est plus particulièrement obtenue à partir de la PSA de L. infantum de séquence SEQ ID N°2 ou L. donovani de séquence SEQ ID N°3, ces séquences étant aussi délétées à l'extrémité carboxy-terminale de leur peptide hydrophobe d'ancrage à la membrane.
La molécule vaccinale utilisée peut correspondre à une partie de la ES PSAr, en particulier à l'extrémité C- terminale. Une telle molécule présente notamment la séquence SEQ ID N°4.
Plus spécifiquement, l'invention vise l'utilisation, comme molécule vaccinale, d'une ES PSAr sous forme soluble, telle que produite par insertion d'un vecteur comprenant le gène codant pour la ES PSAr dans un système d'expression recombinant eucaryote de leishmanie.
De préférence, le système d'expression recombinant utilisé est celui d'une leishmanie non pathogène chez les mammifères .
L'invention vise tout spécialement l'utilisation, comme molécule vaccinale, de la ES PSAr sous forme soluble, telle que produite par insertion du gène codant pour la ES PSAr, dans un système d'expression recombinant eucaryote constitué par Leishmania tarentolae ou en variante du gène codant pour une partie de ES PSAr, en particulier une partie dépourvue de sa partie hydrophobe comme indiqué plus haut.
Avantageusement, ce système permet l'intégration du vecteur d'expression contenant le gène codant pour ES PSAr dans le locus 18S rRNA du chromosome de Leishmania tarentolae qui possède un taux de transcription très élevé et ainsi l'obtention d'une quantité abondante de la ΡΞΑ recombinante.
La protéine peut être produite avec tout ou partie des modifications co- et post-traductionnelles des protéines des leishmanies .
L' invention vise également un procédé de production de ES PSAr sous forme soluble, comportant les caractéristiques définies ci-dessus.
Ainsi, ce procédé comprend l'intégration d'un vecteur d'expression comportant le gène codant pour la ES PSAr dans un système recombinant eucaryote non pathogène pour l'Homme ou l'animal.
De manière avantageuse, la transfection par le vecteur est réalisée dans le locus d'un chromosome d'une leishmanie non pathogène possédant un taux de transcription élevé.
Une leishmanie particulièrement appropriée est constituée par L. tarentolae, au stade promastigote . L' insertion dans le locus 18 s rRNA du chromosome dont le taux de transcription est élevé permet d'obtenir des rendements de production élevés.
Le vecteur d'expression utilisé est avantageusement un plasmide. Comme illustré dans les exemples, pF4Xl.4 est particulièrement approprié pour la mise en œuvre de l'invention. Les séguences nécessaires aux modifications post-traductionnelles chez L. tarentolae sont introduites de part et d'autre de la cassette de clonage.
La protéine de ES PSAr ainsi produite est une protéine soluble dans les surnageants de culture des leishmanies, possédant les propriétés de la protéine native, en particulier une ou plusieurs des modifications co- et post- traductionnelles des protéines des leishmanies, comme l' acétylation, l' hydroxylation, les ponts disulfure, la glycylation, la glycosylation, la phosphorylation, l'ancrage lipidique et autres.
Ainsi, la ES PSAr déglycosylée, dans une variante de l'invention, est produite à partir de la culture des formes promastigotes de L. tarentolae en présence de tunicamicyne . La tunicamycine est un antibiotique qui inhibe l'enzyme GlcNAc phosphotransférase (GPT) . Elle inhibe ainsi la N- glycosylation nécessaire à la fixation des précurseurs des N- hétérosides sur le dolichol diphosphate (voir Figure 3) .
La culture des transgènes de promastigotes de L. tarentolae est réalisée avec avantage dans le milieu de culture totalement défini tel que décrit dans la demande internationale précitée au nom de l' IRD et ses extensions, ce qui permet de récupérer la PSA produite sans contaminants sériques et cellulaires apportés par les milieux de culture classiquement utilisés, .
Une étape de purification peut être réalisée par exemple par chromatograhie d' affinité sur gel . La production de la partie C-ter de la PSA est avantageusement réalisée dans un système bactérien recombinant, suivie de préférence d'une étape de purification .
Le vecteur d'expression utilisé, qui comprend l'ADNc du gène codant pour la partie carboxy-terminale de la PSA est en particulier un plasmide.
Une construction de plasmide convenant pour la mise en œuvre de l'invention comprend les éléments pour produire une protéine recombinante avec un tag 6-Histidine en position
NH2-terminale et un site de clivage du tag.
Les colonies produisant les protéines recombinantes recherchées sont sélectionnées et après amplification en culture sont avantageusement purifiées.
La protéine recombinante, sous forme native, avantageusement avec une ou plusieurs des modifications co- et post-traductionnelles décrites ci-dessus, constitue un produit nouveau et à ce titre entre dans le champ de
1 ' invention .
L'invention vise en particulier une ES PSAr glycosylée ou en variante une ES PSAr déglycosylée .
Elle vise également une ES PSAr délétée, en particulier dépourvue de l'ancre GPI et donc du peptide hydrophobe en position C-terminale , ce qui permet d'éviter les phénomènes d'agrégation et la formation de corps d'inclusion lors de la production de la ES PSAr.
De même, l'invention vise en tant que nouveau produit, la molécule constituée par la partie C-ter PSA de la protéine telle que définie ci-dessus.
Les méthodes de production décrites ci-dessus sont illustrées dans les exemples en partant de la ES PSAr de
L. amazonensis et avec C-ter PSA de . amazonensis. Comme le montrent également les exemples, la protéine ES PSAr ainsi que sa partie carboxy-terminale (C-ter PSA) , en combinaison avec un adjuvant, confèrent chez le chien un très fort niveau de protection à l' encontre d'une infection expérimentale à L. infantum.
Cette protection s'accompagne de :
la production d'anticorps spécifiques principalement d' isotype IgG2 qui apparaissent jouer un rôle non négligeable dans la protection (effets leishmanicide et neutralisant) ;
- la polarisation de la réponse à médiation cellulaire vers une voie de type Thl révélé par une augmentation de la production par les lymphocytes T d' IFN-γ, conduisant à l'activation par la voie classique des macrophages, caractérisée par la synthèse accrue de NO et donc l'élimination des leishmanies intracellulaires (activité leishmanicide des macrophages canins) .
Les propriétés remarquables de la ES PSAr ainsi que de sa partie C-ter sont aussi révélées par :
- l'effet inhibiteur d'un hyperimmunsérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la C-ter PSA sur la croissance des formes promastigotes de . infantum ;
l'effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA (non native) sur la capacité des promastigotes à infecter ex vivo les macrophages ,
- l'effet « facteur de croissance » de la ES PSAr sur la prolifération des formes promastigotes.
Les exemples montrent également une immuno-réaction protectrice et induite sur les cellules humaines, ce qui conforte les résultats obtenus chez le chien et permet d'envisager le développement d'un vaccin à visée humaine . Cette immunoréactivité s'accompagne de la production de cytokines de type TH1 et d'une réponse T-cytotoxique mise en évidence par la production du granzyme B.
L'invention vise donc également une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement des leishmanioses chez l'Homme ou l'animal, caractérisée en ce qu' elle comprend :
une protéine ES PSAr, sous forme soluble, de leishmanie et/ou une ES PSAr tronquée, en particuler dépouvue de l'ancre GPI, et/ou la partie peptidique C-ter de la PSA telle qu'issue de leishmanie, ou de la ES PSAr et
un ou plusieurs adjuvants et/ou un ou plusieurs immunomodulateurs .
L'adjuvant est avantageusement choisi parmi ceux capables d'induire une réponse à médiation cellulaire conduisant à l'élimination du parasite.
Des adjuvants appropriés comprennent ceux des classes TLR3, TLR4, TLR5 , TLR7, TLR8 , TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly électrolytes .
Des immunomodulateurs appropriés comprennent les protéines de salive de phlébotomes, les cytokines et les protéines de choc thermique ou HSP (pour Heat Shock Protein) .
La composition vaccinale de l'invention se présente en particulier sous une forme permettant l'administration par différentes voies, comme la voie sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, parentérale, orale, endonasale ou mucosale.
La composition vaccinale définie ci-dessus est tout spécialement appropriée pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin, d'un réactif de diagnostic in vivo ou in vitro pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'une activation de l'immunité à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes de type Thl et/ou de l'immunité humorale effectrice.
Cette composition convient pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère du passage d'un état immunitaire de type Th2 vers un état immunitaire de type Thl, ou encore pour l' induction ou le diagnostic chez le mammifère d'anticorps spécifiques d' isotype IgG2 neutralisants et/ou lytiques qui reconnaissent les déterminants antigéniques des parasites .
De tels anticorps et les immunsérums les renfermant font également partie de l'invention.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent, avec référence aux Figures 1 à 18, qui représentent, respectivement,
- Figure 1 : une représentation schématique de la protéine PSA de Leishmania ,
- Figure 2 : l'analyse polypeptidique de la ES PSAr purifiée en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices,
Figure 3 : profils électrophorétiques obtenus après coloration des protéines (A) et des sucres (B) des ES PSAr (SEQ ID NO: 1) produites en présence (piste 3) ou en l'absence (piste 2) de tunicamycine,
- Figure 4 : l'analyse polypeptidique de la C-ter PSA (SEQ ID NO: 4) purifiée en gel SDS-PAGE (conditions réductrices et non réductrices,
- Figure 5 : Analyse électrophorétique des glycoprotéines solubles ES PSAr (SEQ ID NO: 1 déglycosylées (1 et 3); ES PSAr native (2 et 4)),
- Figure 6 : ELISA IgG2 versus AES exprimé en densité optique (DO) , - Figure 7 : ELISA IgG2 versus ES PSAr exprimé en densité optique (DO) ,
- Figure 8 : ELISA IgG2 versus C-ter PSA exprimé en densité optique (DO) ,
- Figure 9 : Effet des sérums de chiens vaccinés (CaniLeish®, ES PSAr et C-ter PSA) sur la viabilité et la prolifération des promastigotes de
L. infantum, comparativement à celles des sérums de chiens placébos :
T0 : sérums pré-immuns ; T5 : sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin,
Figure 10 : Effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA (utilisés à différentes dilutions (1/10, 1/50 et 1/100), - Figure 11: Effet d'un sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la partie C-ter PSA (partie carboxy -terminale de la PSA) utilié à différentes dilutions (1/25 et 1/50) sur la croissance des formes promastigotes de . infantum,
- Figure 12 : Evaluation, comparée à un témoin, du nombre de promastigotes/mL avec des concentrations en ES PSAr de 17,8μΜ et de 0,22μΜ, à différents temps d'addition,
- Figure 13 : Activités leishmanicides des macrophages canins du groupe placébo versus le groupe vacciné avant (T0), un mois après l'administration de 2 doses de vaccin (T3) et deux mois après l'injection de 3 doses (T5) ,
Figure 14: Détermination des taux d' interféron (IFN)-y présents dans les surnageants de co-culture des cellules provenant de chiens placébos et de chiens vaccinés (ES PSAr ou C-ter PSA). T0: sérums pré-immuns ; T5: sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin, Figure 15 : Evaluation des taux d'oxyde nitrique (NO) produits dans les surnageants de co-culture des cellules provenant de chiens placébos et de chiens vaccinés (ES PSAr ou C-ter PSA) . T0 : sérums pré-imrauns ; T5 : sérums prélevés deux mois après l'administration de trois doses du vaccin,
- Figure 16 : Détermination des pourcentages de chiens parasitologiquement positifs dans les groupes de chiens placébos et les groupes de chiens vaccinés avec la ES PSAr,
Figure 17 : Détermination des pourcentages de chiens parasitologiquement positifs dans les groupes de chiens placébos et les groupes de chiens vaccinés avec la C-ter PSA,
- Figure 18 : Détermination des charges parasitaires par RT- PCR chez les chiens des groupes placébos et vaccinés.
Exemple 1 : Obtention, production et purification des protéines recombinantes
1. Clonage et séquençage des gènes de PSA
Un hyperimmunsérum généré chez le lapin et dirigé conte les antigènes d'excrétion sécrétion (AES) de promastigote de L. amazonensis ainsi qu'un anticorps monoclonal (E2) dirigé spécifiquement contre l'immunogène majeur des AES parasitaires ont été utilisés pour cribler une banque d'ADNc de formes promastigotes et amastigotes (produite en 1ZAPII) de L. amazonensis.
L'analyse des séquences des inserts contenus dans les plasmides recombinants a permis d' identifier principalement des clones d'ADNc, situés sélectivement sur le chromosome 12 et codant des protéines appartenant à la famille des PSA.
La séquence SEQ ID N°l est issue du gène LaPSA38 codant pour la protéine entière de 45 kDa (372 aa) qui correspond à WO 2005/051989 au nom de l'IRD et la séquence SEQ ID N°4 est issue du gène tronqué LaPSA19 qui code la partie carboxy- terminale de la LaPSA38. Il s'agit de la partie C-ter PSA, de 19kDa (119 aa) .
La séquence SEQ ID N°2 est issue du gène LiJll.
Le gène LiJll a été obtenu en utilisant la séquence C-ter PSA (sonde radiomarquée) pour cribler une banque cosmidique d'ADN génomique de promastigotes de L. infantum , ce qui a permis de caractériser une PSA homologue chez Leishmania infantum (PSA IJll) de 463 aa (50 kDa) . La séquence protéique de la PSAIJll de L. infantum présente une forte homologie de séquence avec celle de LaPSA38s de L. amazonensis dans ses parties amino- (73,8%) et carboxy- (77,5%) terminales avec un nombre de motifs répétés riches en leucine plus élevé (9 contre 6) (dans la demande internationale WO 2005/051989 précitée, ledit gène codant pour la protéine non recombinante correspond à SEQ ID N°ll et la protéine codée à SEQ ID N°12) .
2. Production de LaES PSAr délétée de l'ancre GPI dans un système recombinant eucaryote et purification
Cette étape est réalisée avec un système d'expression de gène chez L. tarentolae commercialisé par Jena Bioscience : « Leishmania tarentolae Gene Expression Starter Kit ».
Ce système d'expression utilise le parasite lui-même pour produire sa propre protéine. Ce dernier présente de nombreux avantages pour la production de protéines à visée thérapeutique :
Leishmania tarentolae est un parasite de lézard non pathogène pour l'Homme. Sa manipulation ne nécessite pas de mesures de sécurité contraignantes ;
L. tarentolae se cultive facilement en suspension cellulaire dans des milieux de culture complètement définis (pas de contamination avec d'autres protéines étrangères), à 26°C, avec un bon rendement (de l'ordre de 10 cellules par ml, temps de doublement de population de 4 h.) ;
Ce système d' expression permet de produire des protéines natives de leishmanie. Le parasite contient en effet la machinerie nécessaire pour l'expression de protéines eucaryotes natives ;
Ainsi, la protéine produite possède toutes les modifications post-traductionnelles des protéines de leishmanies telles que la glycosylation et la formation de ponts disulfures ;
Le vecteur utilisé dans ce système permet de réaliser le clonage du gène d'intérêt en système bactérien, puis de faire l'expression de la protéine chez Leishmania tarentolae ;
Il permet l'intégration de la cassette d'expression dans le locus 18S rRNA du chromosome qui possède un taux de transcription très élevé et ainsi l'obtention stable d'une quantité abondante de protéine recombinante.
Le gène LaPSA38s a été amplifié, puis modifié par mutagenèse dirigée pour permettre la production d'une protéine avec un tag poly-histidine (5 histidines) en partie carboxy- terminale, et supprimer le site d'ancrage à la membrane.
Le clonage directionnel du gène de la ES PSAr a été réalisé dans le vecteur d'expression pF4X1.4sat. Les plasmides ont été spécifiquement construits pour permettre la production de la protéine recombinante dans le surnageant de milieu de culture à partir duquel elle peut être facilement isolée. Cette construction a été transfectée dans Leishmania tarentolae où elle a été intégrée au génome du parasite, au stade promastigote, par recombinaison homologue, lui conférant par la même occasion une résistance à la nourséothricine (NTC) , permettant de sélectionner les individus recombinants. La surexpression est effectuée grâce à l'intégration du gène au sein du locus de l'ARNr 18S, en tirant parti du haut niveau de transcription de l'ARN polymérase I de l'hôte. Ce plasmide contient également autour de la cassette de clonage les séquences nécessaires aux modifications co- et post-traductionnelles chez elshmania tarentolae, permettant d'obtenir une protéine sous sa forme native .
Les transgènes promastigotes de L. tarentolae ont été adaptés dans le milieu complètement défini développé par l'IRD (demande WO précitée et ses extensions) de façon à purifier facilement la protéine parasitaire à partir des surnageants de culture et à la produire en l'absence de toute protéine étrangère (molécules d' origine sérique et cellulaire) .
La purification à partir des surnageants de milieu de culture de la ES PSAr ainsi produite a été réalisée par chromatographie d'affinité sur gel Agarose-Nickel .
Dans ces conditions expérimentales, seule la LaPSA38snr de L. amazonensis a été produite avec un rendement de production de 0,2 à 0,3 mg de protéine purifiée par litre de culture, suffisant pour permettre son utilisation dans le développement de nouvelles méthodes analytiques et son évaluation comme candidat vaccin. Elle correspond à un poids moléculaire apparent de 45 kDa et un poids moléculaire théorique de 37kDa. Elle présente la séquence SEQ ID N°l visée plus haut. Cette protéine comporte 349 acides aminés ; son pi est de 5,07.
L'analyse polypeptidique de la ES PSAr purifiée en gel SDS- PAGE (conditions réductrices et non réductrices) est donnée sur la Figure 2.
Les profils électrophorétiques obtenus après coloration des protéines (A) et des sucres (B) des ES PSAr produites en présence (piste 3) ou en l'absence (piste 2) de tunicamycine, sont donnés sur la figure 3.
3 - Production dans un système bactérien recombinant et purification de la C-ter PSA
Les ADNc du gène LaPSA19s (C-ter PSA) ont été insérés dans le plasrnide pQE-31. Les plasmides ont été spécifiquement construits pour permettre la production d'une protéine recombinante possédant un 6-His-tag en position amino- terminale et un site de clivage du tag. La transformation avec le plamide pQE-31-6 (His) -C00H LaPSAl9s a été effectuée dans des cellules bactériennes E. coli M15 rendues chimiocompétentes . Les colonies recombinantes ont été sélectionnées en vue de produire les protéines recombinantes. Le clone le plus producteur a été amplifié en culture. La protéine correspondante C-ter PSA a été purifiée sur gel Agarose-Nickel . Un rendement d'environ 1 g de protéine recombinante par litre de culture a été obtenu. Elle comporte 119 acides aminés et présente un poids moléculaire de 18 kDa en conditions réductrices et sous forme dimère, en conditions non réductrices, un poids moléculaire de 36 kDa (voir Figure 4) .
Les résultats de l'analyse électrophorétique des glycoprotéines solubles sont rapportées sur la Figure 5 : ES PSAr déglycosylées (1 et 3) et ES PSAr native (2 et 4)
Exemple 2 : Réponses immunoprotectrices induites par la ES PSAr et la C-ter PSA chez le chien
Cet essai clinique rapporté ci-après vise à comparer dans un même essai de vaccination chez des chiens « Beagle » les effets protecteurs des deux protéines recombinantes ES PSAr et C-ter PSA sur des groupes de 9 chiens et de 5 chiens respectivement. Un groupe placébo de 5 chiens constitue le groupe contrôle non vacciné. Une infection d'épreuve expérimentale est réalisée 2 mois après le protocole d'immunisation. Des suivis cliniques et parasitologiques sont menés tous les 2 mois jusqu'à 8 mois après l'infection expérimentale .
Le QA21 est utilisé à 60 μς par dose de vaccin, quantité d'adjuvant équivalente à celle contenue dans le vaccin CaniLeish. Utilisé seul et à cette concentration, il n'a aucun effet significatif sur le système immunitaire du chien et de la souris .
1 - PROTOCOLE D' IMMUNISATION
L'étude a été menée en double aveugle, randomisée et contrôlée. Elle a été approuvée par le comité d'éthique de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.
Le protocole d'immunisation comprend 3 injections par la voie sous-cutanée réalisée à un mois d'intervalle. Trois groupes de chiens ont été sélectionnés comme suit :
^Groupe 1 : Placébo (Injection d'eau physiologique pour préparations injectables) ;
^Groupe 2 : Injection de 25μg de la LaES PSAr adjuvés avec 60 μg de QA-21 ;
*Groupe 3 : Injection de 25μg de C-ter PSA (protéine de séquence SEQ ID N°4) adjuvés avec 60 de QA-21.
RANDOMISATION
Vaccinés Vaccinés Témoins Total
ES PSAr
C-ter
PSA
Nombre de Chiens 9 5 5 19
Nombre de femelles 5 2 3 10 Nombre de mâles 4 3 2 9
Moyenne d'Age (an) 2, 69 2, 93 2,87 2,89
Ecart type d^Age (an) 1,12 1,10 1, 14 1, 08
Moyenne de Poids (Kg) 15,2 15, 4 14, 8 14, 9
Ecart type de Poids (Kg) 2,5 2,2 2,4 2,3
2 - PROTOCOLE DES PRELEVEMENTS
Différents prélèvements avant le challenge infectieux ont été réalisés à :
T0 : avant toute immunisation
T3 : un mois après l'administration de deux doses vaccinales T5 : deux mois après l'administration de trois doses du vaccin. 3 - SUIVIS CLINIQUES :
Ces suivis sont effectués
- à la réception des animaux
- 1 fois/mois pendant toute l'étude
quotidiennement pendant 5 jours après le challenge expérimental
4 -SUIVIS IMMUNOLOGIQUES ET PARASITOLOGIQUES:
Immunologiques :
- sérologie spécifique à T0, T3 et T5
- effet leishmanicide à T0 et T5
- dosage de l'oxyde nitrique (NO) et détermination de la production d' IFN-γ dans les surnageants de co-culture à T0 et à T5.
Parasitologiques :
Une infection d'épreuve expérimentale (injection de 109 promastigotes métacycliques de L. infantum par la voie intraveineuse) a été réalisée 2 mois après le protocole d'immunisation. Des suivis cliniques et parasitologiques ont été menés tous les 2 mois pendant 8 mois après l'infection expérimentale .
Des PCR et une mise en culture d'échantillons de moelles osseuses à T0, 2 mois post-challenge (T6) , 4 mois post- challenge (T7), et 6 mois post-challenge (T8) ont été réalisées pour mettre en évidence la présence du parasite ou de son ADN.
5 - RESULTATS
5.1 - Réponses à médiation humorale a- Analyse de la réponse anticorps spécifique d' isotype IgG2 Des techniques ELISA ont été mises en œuvre pour analyser les réponses anticorps chez les chiens de l'étude. Les titres moyens anticorps IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr et anti-Cter PSA ont été comparés par la technique ELISA entre chiens placébos et chiens vaccinés avant immunisation (T0) et à différents temps post-immunisation :
- un mois après l'administration de deux doses vaccinales (T3) et/ou
- deux mois après trois injections (T5) .
Tous les chiens de l'étude se sont révélés sérologiquement négatifs à T0 (figures 5, 6 et 7). Tous les chiens appartenant au groupe placébo présentent des titres anticorps d' isotype IgG2 anti-AES, anti-ES PSAr et anti-C-ter PSA inférieurs au eut off correspondant et ceci quelle que soit la période de prélèvement (T3 et T5) (Figures 6,7 et 8) .
Les réponses anticorps IgG anti-Leishmania déterminées sont négatives chez tous les chiens de l'étude avant immunisation ainsi que chez tous les chiens du groupe placébo à T5.
Seule une production significativement élevée d'anticorps d' isotype IgG2 spécifiquement dirigés contre les AES (figure 6), la ES PSAr (figure 7) et la C-ter PSA (figure 8) est mise en évidence chez tous les chiens vaccinés dès le premier mois après l'administration de deux doses vaccinales (T3) et deux mois après l'administration de trois doses du vaccin (T5) .
Les moyennes des titres anticorps IgG2 sont significativement plus élevées chez les chiens vaccinés que chez les chiens placebos (P <0/05) aux temps T3 et T5 postimmunisation (Figures 6, 7 f et 8) .
Les candidats vaccins n' induisent pas chez le chien d'anticorps IgG anti-Leishmania (antigène figuré) par la technique d' immunofluorescence indirecte (IFI, technique de référence pour le diagnostic sérologique) chez tous les chiens vaccinés (titre IFI négatifs à T3 et T5) .
La mise en évidence d'anticorps d' isotype IgG2 montre fortement l'induction d'une immunité cellulaire de type Thl (immunité protectrice) . b - Rôle biologique fonctionnel des anticorps produits bl- Effet des sérums de chiens vaccinés (CaniLeish®, ES PSAr et C-ter PSA) sur la viabilité et la prolifération des leishmanies
Les promastigotes transgènes de L. infantum {MONl, c!2r NEO/Luc) transfectés avec le gène de la luciférase sont incubés pendant 5 jours en l'absence ou en présence de sérum (décomplémentés ) de chiens placébos et vaccinés. Le nombre de parasites est déterminé par luminométrie (RLU) . Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la multiplication des promastigotes.
Comme le montre la Figure 9 un effet leishmanicide significatif (p <0,01) est observé sur les formes promastigotes de L. infantum lorsque les parasites sont incubés pendant 30 mn avec du sérum non dilué de chiens vaccinés (ES PSAr et C-ter PSA) , alors que les pourcentages de viabilité restent élevés avec les sérums de chiens placébos (moins de 10% de réduction de la croissance parasitaire) . Des inhibitions de 60%, 70% et 85% de la prolifération parasitaire sont respectivement observées avec les sérums de chiens vaccinés avec CaniLeish®, la ES PSAr et la C-ter PSA (p<0,01). Cet effet leishmanicide est moins prononcé à la dilution de ½ et s'estompe à la dilution de 1/8.
La prolifération des parasites non traités était très semblable à celle des parasites traités avec des sérums de chiens du groupe placebo quelle que soit la dilution du sérum utilisée. Moins de 10% de réduction de la croissance était observée .
En revanche, les sérums de chiens vaccinés n'ont aucun effet sur la différenciation des promastigotes en amastigotes) .
b2- Effet neutralisant de sérums de lapin polyclonaux monospécifiques anti-ES PSAr et anti-Cter PSA
Des formes promatigotes ont été incubées en présence de différentes dilutions (1/10, 1/50 et 1/100) de sérums de lapin sain ou préalablement immunisé avec la ES PSAr (ou la C-ter PSA puis lavées trois fois par centrifugation pour éliminer l'excédent de sérum. Leurs capacités à infecter les macrophages dérivés de monocytes canins ont été étudiées en déterminant le pourcentage de réduction de l'Indexe Parasitaire (IP) après 72 h d' intéraction .
Comme le montre la Figure 10, les promastigotes traités avec du sérum de lapin sain se sont révélés être plus infectieux vis-à-vis des macrophages que ceux non traités. En revanche, l'exposition des parasites aux sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-ES PSAr ou anti-C-ter PSA inhibe leur capacité à infecter ex vivo les macrophages dérivés de monocytes canins. L'effet du sérum anti-C-ter PSA à la dilution 1/100 est plus prononcé que celui du sérum anti-ES PSAr à la même dilution (Figure 10) .
L'effet du sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la partie C-ter PSA a aussi été évalué sur la croissance in vitro des formes promastigotes de L. infantum. Comme le montre la Figure 11, une inhibition quasi-totale de la multiplication des promastigotes est observée lorsque le sérum est additionné à la dilution de 1/25 tous les deux jours à la culture de parasites. Utilisé à la dilution 1/50, cette inhibition est partielle.
En revanche, l'addition tous les deux jours de différentes concentrations de ES PSAr (0,22 μΜ et 17,8 μΜ) à la culture des promastigotes de L. infantum active significativement la prolifération des parasites (Figure 12) .
5.2 Réponses à médiation cellulaire a- Activités leishmanicides des macrophages canins
Les activités leishmanicides révélées par les cellules des chiens du groupe Placébo versus ceux du groupe Vaccinés ont été évaluées avant (T0) et un mois après l'administration de 2 doses de vaccin (T3) et deux mois après l'injection de 3 doses (T5) .
L'incubation des lymphocytes autologues avec les macrophages infectés provenant des chiens pré-immuns (T0) , mais aussi des chiens placébo à différents temps post-immunisation (T3 et T5) induit des activités leishmanicides inférieures à 20% de réduction de l' index parasitaire (Figure 13). De façon remarquable, les effets leishmanicides révélés par la co-culture des cellules isolées des chiens vaccinés avec la ES PSAr ou la C-ter PSA augmentent significativement à T3 (60% et 40% de réduction de l'indexe parasitaire respectivement, P<0,05) et s'élèvent encore à T5 (90% et 60% de réduction respectivement, P<0,01) {Figure 13).
Ces effets leishmanicides s'accompagnent à T5 d'une production sélective et significative d' oxyde nitrique (NO) (Figure 15) et d' ' interféron (IFN) -γ (Figure 14) chez les chiens vaccinés avec la ES PSAr ou la C-ter PSA.
5.3 Suivis parasitologiques des chiens après épreuve infectieuse
Les suivis parasitologiques ont été réalisés chez les chiens en utilisant deux méthodes d'amplification :
- celle visant à détecter la présence des parasites dans la moelle osseuse après mise en culture de prélèvements de moelle osseuse en milieu NNN ;
- celle visant à détecter l'ADN parasitaire par une technique d'amplification de gènes (PCR) qui, couplée à la PCR- quantitative, présente l'avantage d'évaluer quantitativement la charge parasitaire.
Les suivis parasitologiques effectués à T0 permettent de montrer que l'ensemble des chiens de l'étude étaient indemmes de leishmanies avant l'épreuve infectieuse expérimentale (Figures 16 et 17) Selon les Figures 16, 17 et 18 et l'étude statistique, les résultats du suivi parasitologique sont les suivants :
- 2 mois après l' épreuve infectieuse
Aucune différence significative en groupes placebo et vaccinés n'est mis en évidence. Tous les chiens étaient parasitologiquement négatifs.
- 4 mois après l'épreuve infectieuse
Les résultats sont peu significatifs entre le groupe de chiens placébo et le groupe de chiens vaccinés avec la Cter PSA (p = 0.04852). Par contre les placebos ont significativement plus de chiens infectés que les vaccinés avec la ES PSAr (p = 0.0256)
- 6 mois après l'épreuve infectieuse
Tous les chiens du groupe placébo sont infectés alors que seulement 22% et 20% des chiens vaccinés respectivement avec la ES PSAr et la C-ter PSA le sont. Les différences entre groupes placébo et vaccinés sont donc très significatives (p <0, 01) .
5.4 Conclusions :
La protéine PSA recombinante (ES PSAr) ainsi que sa partie carboxy-terminale (C-ter PSA) combinées au QA-21 confèrent chez le chien un excellent niveau de protection à l' encontre d'une infection expérimentale à L. infantum. Cette protection s'accompagne de :
la production d'anticorps spécifique principalement d' isotype IgG2 qui semble jouer un rôle non négligeable dans la protection (effets leishmanicide et neutralisant) ; - la polarisation de la réponse à médiation cellulaire vers une voie de type Thl révélée par une augmentation de la production par les lymphocytes T d' IFN-γ conduisant à l' activation par la voie classique des macrophages caractérisée par la synthèse accrue de NO et donc l'élimination des leishmanies intracellulaires (activité leishmanicide des macrophages canins) .
Les propriétés remarquables de la ES PSAr ainsi que de sa partie C-ter sont aussi révélées par :
l'effet inhibiteur d'un sérum de lapin polyclonal monospécifique dirigé contre la C-ter PSA sur la croissance des formes promastigotes de L. infantum ;
l'effet neutralisant de sérums de lapin polyclonal monospécifique anti-rPSA et anti-C-ter PSA sur la capacité des promastigotes à infecter ex vivo les macrophages ;
- l'effet « facteur de croissance » de la ES PSAr sur la prolifération des formes promastigotes.
Exemple 3 - : essais sur cellules humaines
L' immunogénicité de la PSA recombinante native (ES PSAr) a été évaluée sur des cellules humaines par l'analyse du profil de la réponse immune cellulaire engendrée ex-vivo chez 1' homme .
La capacité de la ES PSAr à induire, ex-vivo, sur des cellules humaines, une réponse immune à médiation cellulaire spécifique en activant des lymphocytes T producteurs de cytokines de type Thl et/ou du Granzyme B provenant de donneurs sains comparativement à des individus immuns ou guéris exposés à la leishmaniose viscérale à L. infantum dans le sud de la France, a été évaluée. A cet effet, un ensemble de méthodes immunologique et parasitologique, associées au suivi clinique, a été mis en place .
Les résultats sont rapportés dans les tableaux 1 et 2 suivants :
Tableau 1
Taux d'IFN-γ (pg/ml) dans les surnageants de co-culture de cellules humaines provenant d'individus sains (B, IND 8 à 15) et d'individus immuns asymptomatiques ou guéris (A, IND là 7) exposés dans le sud de la France à la leishmaniose viscérale à L. infantum .
A
B
TSLA Ldd8 : extrait parasitaire total de promastigotes de L. donovani
TSLA Ldi : extrait parasitaire total de promastigotes de L. infantum .
Tableau 2 Production de Granzyme B (pg/ml) dans les surnageants de co- culture de cellules humaines provenant d'individus sains ( B, IND 8 à 15) et d'individus immuns asymptornatiques ou guéris (A, IND 1, 3, 5 et 6) exposés dans le sud de la France à la leishmaniose viscérale à L. infantinn. A
B
TSLA Ldd8 : extrait parasitaire total de promastigotes de L. donovani
TSLA Ldi : extrait parasitaire total de promastigotes de L. infantum L'analyse des résultats des tests cellulaires montre que la ES PSAr constituant le candidat vaccinal est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique de type Thl, générant des taux significatifs d' IFN-gamma (Tableau 1) , et/ou une réponse T-cytotoxique déterminée par une production significative de Granzyme B (Tabeau 2) chez des individus immuns asymptomatiques ou guéris par rapport à des individus sains. Les résultats des tests d' immunogénicité du candidat vaccinal ES PSAr confirment l'intérêt de cette protéine recombinante à être sélectionnée pour entrer dans la composition d'un vaccin contre les leishmanioses humaines.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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<212> PRT
<213> Leishmania amazonensis
<400> 1
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Gly Cys Glu val Cys Glu Gly Asp ser Ala Ala Arg cys Ala Arg cys
85 90 95
Arg Glu Gly Tyr ser Leu Thr Asp Glu Lys Thr Cys Leu Ala Asn His
100 105 110
Asp Gly Gly Val Ala Ala Ala ser ser Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Val Trp Ala Ala Val Leu Leu ser Val Gly Leu val Ala
130 135 140

Claims

Revendications
1 - Utilisation, comme molécule vaccinale chez un mammifère, d'une protéine PSA ( Promastigote Surface Antigen) , issue de leishmanie, ou une partie de cette PSA possédant des propriétés immunogènes , ladite PSA désignée ci-après par ES PSAr, se présentant sous forme soluble, native, recombinante.
2 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la molécule de ES PSAr est entière.
3 - Utilisation d'une ES PSAr ne comportant pas la totalité des modifications co- et post-traductionnelles .
4 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr glycosylée ou d'une ES PSAr déglycosylée .
5- Utilisation selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la ES PSAr est dépourvue d'ancre GPI.
6- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 3 ou 4, caractérisée en ce qu'elle la ES PSAr est dépourvue de la partie carboxy-terminale .
7 - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la partie de ES PSAr est la partie C-terminale, désignée ci-après par C-ter PSA, ou la partie C-terminale de la PSA telle qu'isolée d'un surnageant d'excrétion/sécrétion de culture de leishmanie.
8- Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la ES PSAr ou la partie de cette PSA est telle qu'obtenue à partir de la PSA de L . amazonensis ou d'une leishmanie du complexe donovani, notamment de
L.infantum ou de L. donovani, ou du complexe braziliensis et tropica .
9- Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite ES PSAr présente la séquence SED ID N°l, SEQ ID N0°2, ou SEQ ID N°3.
10 - Utilisation selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la partie C-terminale de la PSA présente la séquence SEQ ID N°4.
11 - Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, 8 ou 9, caractérisée en ce que la ES PSAr est produite par insertion d' un vecteur comprenant le gène codant pour la ES PSAr ou une partie de ES PSAr, en particulier une partie délétée de l'ancre GPI, dans un système d'expression recombinant eucaryote de leishmanie.
12 - Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le système d' expression recombinant utilisé est celui d'une leishmanie non pathogène chez les mammifères.
13 - Utilisation selon la revendication 11 ou 12, caractérisée en ce que le système d' expression recombinant eucaryote est constitué par celui de promastigotes de Leishmania tarentolae.
14 - Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que le vecteur d' expression contenant le gène codant pour ES PSAr PSA est intégré dans le locus 18S rRNA du chromosome de Leishmania tarentolae. 15 - Procédé de production de ES PSAr sous forme soluble, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes définies dans l'une des quelconque des revendications 11 à 14,
16 - Procédé de production de la partie C-ter PSA selon l'une des revendications 1, 7, 8 ou 10, caractérisé en ce qu'il est réalisé dans un système bactérien recombinant. 17 - Protéine recombinante, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr sous forme soluble, native, recombinante, comportant le cas échéant une ou plusieurs des modifications co- et post-traductionnelles, telle que l' acétylation, 1 ' hydroxylation, les ponts disulfure, la glycylation, la glycosylation, la phosphorylation, l'ancrage lipidique, et/ou dépourvue de l'ancre GPI .
18- Protéine recombinante selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une ES PSAr glycosylée ou d'une ES PSAr déglycosylée .
19 - Protéine recombinante selon la revendication 17 ou 18, caractérisée en ce qu'elle est délétée de l'ancre GPI. 20 - Peptide, caractérisé en ce qu'il s'agit de la partie C- ter de la ES PSAr selon la revendication 7, 8 ou 10.
21 - Composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement des leishmanioses, caractérisée en ce qu'elle comprend :
. une protéine ES PSAr de leishmanie et/ou la partie C-ter de la PSA de leishmanie, telle (s) qu' utilisée { s ) selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, ou telle que définie dans l'une des revendications 17 à 20 et
un ou plusieurs adjuvants et/ou un ou plusieurs immunomodulateurs .
22 - Composition vaccinale selon la revendication 21, caractérisée en ce que l'adjuvant est avantageusement choisi parmi ceux capables d' induire une réponse à médiation cellulaire conduisant à l'élimination du parasite.
23 - Composition vaccinale selon la revendication 22, caractérisée en ce que les adjuvants sont choisis parmi ceux des classes TLR3, TLR4 , TLR5, TLR7, TLR8 , TLR9, les saponines et leurs dérivés, les émulsions huile dans eau ou eau dans huile, les polysaccharides, les liposomes cationiques, les virosomes ou les poly-électrolytes et les immunomodulateurs sont choisis parmi les protéines de salive de phlébotomes, les cytokines et les protéines de chose thermique HSP20.
24 - Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisée en ce qu'elle se présente sous une forme permettant l'administration par différentes voies, comme la voie sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, parentérale, endonasale, mucosale, ou orale.
25 - Composition vaccinale selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, pour la fabrication d'un médicament ou d'un vaccin, d'un réactif de diagnostic in vivo ou in vitro pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'une activation de l'immunité à médiation cellulaire dépendante de lymphocytes de type Thl et/ou de l'immunité humorale effectrice. 26 - Composition selon la revendication 24, pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère du passage d'un état immunitaire de type Th2 vers un état immunitaire de type Thl, ou encore pour l'induction ou le diagnostic chez le mammifère d'anticorps spécifiques d' isotype IgG2 neutralisants et/ou lytiques qui reconnaissent les déterminants antigéniques des parasites .
27 - Les anticorps spécifiques d' IgG2 et immunsérums les renfermant dirigés contre une ES PSAr ou une partie de ES PSAr selon l'une quelconque des revendications 17 à 20.
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