EP3055675A1 - Dispositif et procede de mesure de fluorescence resolue en temps pour le criblage a haut debit d'echantillons - Google Patents

Dispositif et procede de mesure de fluorescence resolue en temps pour le criblage a haut debit d'echantillons

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EP3055675A1
EP3055675A1 EP14783629.0A EP14783629A EP3055675A1 EP 3055675 A1 EP3055675 A1 EP 3055675A1 EP 14783629 A EP14783629 A EP 14783629A EP 3055675 A1 EP3055675 A1 EP 3055675A1
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EP
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fluorescence
sample
time
unit
measurement
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14783629.0A
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Inventor
Jérémie LEONARD
Wilfried UHRING
Norbert DUMAS
Stefan HAACKE
Sacha MAILLOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Strasbourg filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the technical field of the invention is that of high throughput screening of samples, in particular for the research and development of new drugs by the pharmaceutical industry.
  • the present invention relates to a high throughput time resolved fluorescence measurement device and method for high throughput screening of samples. Also provided is a high throughput sample screening device and method based on a time resolved fluorescence measurement, and a high throughput sample sorting device and method based on a fluorescence measurement resolved in time.
  • HTS High Throughput Screening
  • time-resolved fluorescence (TRF) time-resolved fluorescence detection is of particular interest because it makes it possible to reveal information intrinsically linked to the marking.
  • Time-integrated fluorescence detection i.e., fluorescence intensity detection
  • background signals such as autofluorescence or diffusion.
  • TRF detection is a more complex technique than fluorescence intensity detection and whose implementation remains difficult in high throughput HTS screening applications.
  • the TRF-resolved fluorescence detection is a measure of the decay kinetics of a fluorescence signal of a chromophore in solution, after said chromophore has been excited by an ultrashort light pulse.
  • this decay kinetics represents the probability of emitting a single photon by spontaneous emission, that is to say by fluorescence, as a function of time after the excitation. Because of the interaction of the chromophore with its environment, the kinetics of fluorescence decay is likely to be greatly accelerated.
  • FIG. 1a shows schematically:
  • each kinetic curve is proportional to the total number of photons emitted. It is this total number of emitted photons that is measured during a time-integrated fluorescence measurement, that is to say during a measurement of fluorescence intensity, for example in conventional HTS screening devices. using fluorescence detection.
  • FIG. 1a shows the area 11 under the kinetic curve 1 and the area 12 under the kinetic curve 2. The area 11 is greater than the area 12.
  • a fluorescence intensity measurement gives however no information on the temporal distribution of the emitted photons and therefore does not allow access to the gait of kinetic curves 1 and 2 themselves.
  • the molecular interactions and in particular the molecular bonds are tested by detecting a change in the fluorescence quantum yield of a chromophore linked to a first molecule, when this first molecule interacts with another molecule, by example by forming a complex.
  • this change in the fluorescence quantum yield results in faster fluorescence decay kinetics and consequently a decrease in fluorescence intensity.
  • a change in fluorescence intensity is not necessarily caused by a change in quantum fluorescence efficiency.
  • a change in fluorescence intensity may also be caused by fluctuations in other external parameters, such as the concentration of the chromophore in solution or the intensity of the excitation light source.
  • the amplitude of the signal can certainly be affected by a change in the chromophore concentration or the intensity of the excitation laser, but not the constant. decay time, called "fluorescence lifetime".
  • fluorescence lifetime does not depend on external parameters: the fluorescence lifetime depends solely on the molecular interactions. It is notably the reason why the Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) technique has been massively developed, for example in cell biology, in addition to conventional fluorescence microscopy.
  • FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
  • Time-Correlated Single Photon Counting is a digital acquisition technique in which the acquisition of the fluorescence signal is performed by counting the photons one by one and by simultaneously recording the arrival time of each of these photons after the excitation pulse.
  • the TRF signal is constructed as a histogram of the number of photons detected in successive time intervals.
  • Figure 1b shows time-resolved fluorescence decay kinetics data typically obtained by a TCSPC counting technique, forming a histogram 3. The signal is progressively constructed, counting the photons one by one. The statistical noise inherent in the light-emitting process is less and less pronounced as the number of photons detected increases.
  • the histogram 3 thus converges asymptotically, for a large number of detected photons, towards the theoretical curve 4 of fluorescence decay kinetics.
  • the histogram 3 and the theoretical curve 4 are simulated for the case where approximately 1000 photons have been detected in all.
  • up to one photon per sensing channel must be detected to prevent a stack-up phenomenon from occurring. Indeed, if two photons are detected at the same time on the same detection channel, one will be hidden by the other.
  • a laser with a repetition rate high, typically greater than 10 MHz, is required to allow the acquisition of a fluorescence decay curve with a good signal-to-noise ratio in a short acquisition time.
  • TRF detection should significantly reduce "false positive” or "false negative” cases by reducing the influence of background signals or concentration fluctuations. .
  • the TRF detection was initially implemented with analog detection, in frequency domain, and for long-lived chromophores, that is to say having fluorescence lifetimes of the order of a few hundred ns, such as ruthenium complexes - as explained in the document "Fluorescence-lifetime technologies for high-throughput screening", French, TE et al., p. 209-218 (1998), or of the order of the microsecond, as the lanthanides.
  • Such an analog implementation is not compatible with a TRF-resolved fluorescence detection for most chromophores of interest - for example for FRET-based assays.
  • These chromophores of interest such as fluorescent proteins and in particular the GFP (Green Fluorescent Protein) protein, have in fact fluorescence lifetimes of the order of a few nanoseconds.
  • TRF time resolved fluorescence measuring devices
  • a device with an analog implementation of fluorescence measurement TRF suitable only for the screening of samples containing chromophores of great longevity, that is to say having fluorescence lifetimes of the order of a few hundreds of ns or the order of the microsecond.
  • fluorescence lifetimes of the order of a few hundreds of ns or the order of the microsecond.
  • the majority of chromophores of interest have much shorter fluorescence lifetimes, of the order of a few nanoseconds;
  • a device with an analog implementation of fluorescence measurement TRF adapted for the screening of samples containing chromophores with fluorescence lifetimes of the order of a few ns, and offering a screening rate of the order a few hundred samples per minute.
  • This device does not implement a TCSPC counting method and therefore does not allow detection sensitivity to single photon;
  • a TRF fluorescence measuring device by a counting method TCSPC providing a single photon detection sensitivity, but with a screening rate of the order of a few tens of samples per minute only.
  • Microfluidic systems make it possible to improve this last point, by authorizing the production and the manipulation of samples in the form of drops at a very high speed, at a frequency of the order of KHz, three orders of magnitude faster than micro-well type samples on micro-plates.
  • Such microfluidic systems also make it possible to form samples whose volume is less than the nanoliter, which represents a reduction of more than four orders of magnitude compared with micro-well type samples on microplates.
  • the present invention aims to provide a solution to the problems mentioned above, by proposing a device that is both accurate, reliable and high throughput time resolved fluorescence measurement (TRF), for high-throughput screening. sample flow.
  • TRF time resolved fluorescence measurement
  • the term "broadband" a rate of up to a frequency of the order of 1 KHz, therefore much higher than the rates found in the prior art.
  • the invention therefore relates firstly to a time-resolved fluorescence measuring device for high-throughput screening of at least one sample, the device operating with a light source capable of producing a succession of pulses of light. excitation for exciting the sample so that the sample emits a plurality of fluorescence photons forming a fluorescence emission, the device comprising:
  • a single photon detection unit capable of detecting at least a portion of said fluorescence photons, the single photon detection unit generating a detection signal for each single photon detected, the detected portion of the fluorescence photons forming a fluorescence signal; fluorescence;
  • a measurement unit for measuring, for each detection signal, the time elapsed between the excitation pulse and the detection signal, called "arrival time", and generating a digital data characteristic of this time of arrival;
  • a unit for real-time analysis of the digital data originating from said measurement unit comprising means for detecting the passage of the sample ( ⁇ , ⁇ 1, ⁇ 2) and for calculating at least one numerical quantity characteristic of the temporal distribution the fluorescence emission of the sample.
  • a fluorescence measuring device resolved in TRF time with a digital implementation is proposed.
  • the unique photon detection unit implemented by the device of the invention provides ultimate detection sensitivity, each photon being individually sensed. This sensitivity to the single photon contributes in the first place to the accuracy and reliability of the device of the invention.
  • the measurement unit generates, for each photon detected by the detection unit, a digital datum characteristic of the arrival time of said photon.
  • narrowband means a bit rate that can reach a frequency of the order of 1 KHz.
  • the term "real-time analysis of the digital data” means that the digital fluorescence photon detection data from the first sample are processed in a time interval that is less than or equal to the time interval between the first and second samples. In other words, the digital fluorescence photon detection data from the first sample are processed by the analysis unit before it reaches them. digital fluorescence photon detection data from the second sample.
  • the terms “in real time” and “on the fly” will be used interchangeably in the present description.
  • fluorescence emission refers to all the fluorescence photons emitted, before the collection and detection phases.
  • fluorescence signal refers to the fluorescence photons which, after their emission, have actually been collected and then detected.
  • the fluorescence measuring device may have one or more additional characteristics among the following, considered individually or in any technically possible combination:
  • At least one characteristic quantity of the fluorescence intensity of the sample can also be calculated.
  • a first trigger signal to the light source for order the emission of a light pulse
  • the repetition rate of the light source is fixed by the tripping unit.
  • the repetition rate of the pulses emitted by the light source is determined by the light source itself, as a function of its intrinsic characteristics, and a part of the light beam is directed towards the unit of light. tripping which generates, for each transmitted light pulse, the second trigger signal to the measurement unit.
  • the trip unit may be a constant fraction discriminator having a photodiode.
  • Such means for measuring the unit of measurement advantageously allow, in particular with respect to an analog measurement unit, a very large reduction and optimization of the amount of data generated for each detection event, which must then be stored and / or sent to the analysis unit and processed by said analysis unit.
  • Such measuring means indeed make it possible to measure the time interval between each detection signal and its excitation pulse: it is therefore a measure of relative time between two events, rather than a measurement of an absolute time. .
  • a silicon photomultiplier a photomultiplier tube or a matrix of photomultiplier tubes;
  • an avalanche diode and a single-photon avalanche diode are distinguished in particular by their mode of operation, which is given by the polarization of the diode: slightly above the avalanche voltage for an avalanche diode and far beyond for a single-photon avalanche diode.
  • the single photon detection unit may comprise one or more single photon detectors, according to different embodiments of the invention.
  • the single photon detection unit advantageously comprises a plurality of single photon detectors and the unit of measure advantageously comprises several measuring means, each single photon detector of the single photon detection unit operating with a measurement means of the photon. unit of measurement.
  • a measurement of the TRF fluorescence can advantageously be carried out:
  • the fluorescence photons from a sample can be diffracted, for example by means of a spectrometer, to a plurality of detectors, each detector of the plurality of detectors then being associated with a certain range of wave length ;
  • the measurement unit may comprise a single measuring means, or preferably several measuring means and for example as many measuring means as detectors of unique photons.
  • the analysis unit is then able to process the digital data in parallel generated simultaneously by the different measuring means of the unit of measure. It is interesting to have several means of measurement to implement a multiparameter measurement of fluorescence, or simply to be able to count faster while avoiding the phenomenon of "pile-up".
  • a single trigger unit is a priori sufficient to trigger all the measurement means of the unit of measurement. However, it is conceivable to use several independent laser sources, and advantageously use in this case an independent laser source trigger unit. In the case of several laser sources synchronized with each other, that is to say for example laser diodes, a single trigger unit may be sufficient to trigger the synchronized laser sources and the measuring means.
  • the analysis unit advantageously comprises means for calculating at least one digital quantity characteristic of the temporal evolution of signals resulting from a multiparameter fluorescence measurement of the sample, such that:
  • Another aspect of the invention relates to a high-throughput screening device using a time-resolved fluorescence measurement, the device comprising:
  • a time-resolved fluorescence measuring device comprising means for calculating at least one numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence emission of each sample of a plurality of samples;
  • a unit for producing and manipulating the plurality of samples capable of successively supplying each sample in one or more fluorescence excitation zones
  • screening is understood to mean the fact of determining, for each sample, a class of result from a predetermined plurality of classes of result, as a function of the numerical quantity calculated for said sample by the unit of analysis of the fluorescence measuring device.
  • the high throughput screening device advantageously employs a microfluidic sample handling unit, the samples being droplets or biological cells.
  • a microfluidic unit indeed allows the formation of samples in the form of microdroplets of very small volume, and the precise handling of these samples at a very high rate.
  • a microfluidic unit for the formation and manipulation of samples within a screening device according to the invention advantageously makes it possible to exploit the high-throughput capacities of the screening device according to the invention in a satisfactory manner.
  • the real-time analysis unit advantageously has the means of:
  • the fluorescence signal detected between sample passes is typically due to the fluorescence background of the sample handling unit and / or the excitation light scatter.
  • the optical coupling and focusing unit advantageously comprises one or more diffractive or refractive optics, conventional or integrated.
  • the optical coupling and focusing unit of the screening device of the invention notably ensures the shaping of the excitation light pulses from the light source, for the efficient excitation of the samples in at least one spatially defined zone of the microfluidic handling unit.
  • the excitation light pulses may be focused using conventional optical elements, such as microscope objectives, or coupled to the microfluidic unit by chip-guided propagation or integrated optics. Spatial shaping of the excitation light pulses in one or more spots can be achieved by diffractive or refractive optics.
  • the collection, filtering and optical coupling unit of the screening device of the invention allows the efficient collection of the fluorescence photons emitted by the samples in one or more excitation zones and the coupling to the fluorescence measuring device. .
  • the collection, filtering and optical coupling unit of the screening device of the invention also allows filtering of the fluorescence photons with respect to other photons originating from the luminous background, in order to discriminate the fluorescence photons of the molecule.
  • of interest of the other photons coming from the luminous background and thus of limiting the number of these photons coming from the luminous background: photons of excitation, luminescence of the microfluidic device itself, or of any other compound other than the molecule of interest in the sample.
  • the collection, filtering and optical coupling unit can advantageously have one or more elements selected from the following list:
  • the collection, filtering and optical coupling unit advantageously makes it possible to solve in polarization and / or spectrally the fluorescence signal collected, and comprises one or more elements chosen from the following list:
  • the screening device will advantageously comprise a fluorescence measuring device in which the single photon detection unit comprises several single photon detectors and the measurement unit comprises several measuring means.
  • the single photon detection unit comprises a plurality of single photon detectors and the measurement unit comprises a plurality of measuring means, each single photon detector of the single photon detection unit. operating with a measuring means of the unit of measurement;
  • the microfluidic unit comprises a plurality of microfluidic channels for the parallel manipulation of samples
  • the optical coupling and focusing unit focuses the excitation pulses on at least one spatially defined zone of each microfluidic channel; the collection, filtering and optical coupling unit makes it possible to collect, filter and optically couple with the fluorescence measuring device the fluorescence photons originating from the samples flowing in each microfluidic channel.
  • the screening device of the invention makes it possible to simultaneously process several samples in parallel in order to increase the screening rate.
  • several time-resolved fluorescence data may also be simultaneously processed, for example to provide a spectral resolution and / or polarization of the fluorescence signal of each sample.
  • simultaneous processing of several samples in parallel can also be implemented by performing measurements in several spatially defined areas of a single channel.
  • the three preceding solutions may be combined, in an implementation with several microfluidic channels in parallel, measurements being made in several spatially defined zones of each microfluidic channel.
  • Another aspect of the invention relates to a device for high-throughput sorting of a plurality of samples, using a time-resolved fluorescence measurement, and comprising:
  • a screening device using a time-resolved fluorescence measurement comprising means for assigning in real time to each sample of the plurality of samples a result class from among a plurality of result classes;
  • a sample may be specifically oriented within the microfluidic manipulation device. For example, in the case of a binary screening, samples circulating initially in a main channel, will be oriented in a first subchannel of the main channel if their screening result is "positive", and in a second subchannel of the main channel if their screening result is "negative".
  • conditional fusion according to their screening results, two samples can be fused in order to mix their contents. From two initial samples, a single merged sample is obtained.
  • Another aspect of the invention relates to a time resolved single photon count fluorescence measuring method for high throughput screening of at least one sample, the method comprising:
  • a light source emits a succession of excitation pulses for excitation of the sample so that the sample emits a plurality of fluorescence photons forming a fluorescence emission;
  • a single photon detection unit detects at least a portion of said fluorescence photons and generates a detection signal for each detected single fluorescence photon, the detected portion of the fluorescence photons forming a fluorescence signal;
  • a measurement unit determines, for each detection signal, the time elapsed between the excitation pulse and the detection signal, called "arrival time", and generates a digital data characteristic of this arrival time;
  • the fourth step of the fluorescence measurement method of the invention may comprise the following substeps:
  • the analysis unit counts the number of fluorescence photons detected as a function of the arrival time of said detected fluorescence photons and thus builds a histogram of the number of fluorescence photons detected as a function of their arrival time;
  • the analysis unit calculates, from the histogram constructed during the first substep, at least one numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence emission of the sample and / or at least one digital quantity characteristic of a temporal evolution of signals resulting from a multiparameter fluorescence measurement of the sample.
  • Another aspect of the invention relates to a multi-parameter resolved fluorescence metering method by single photon counting for high throughput screening of at least one sample, the method comprising:
  • a light source emits a succession of excitation pulses for excitation of the sample so that the sample emits a plurality of fluorescence photons forming a fluorescence emission;
  • a second step according to which the fluorescence emission is resolved into a plurality of beams according to a first parameter such as the wavelength, the polarization or the direction of propagation of each fluorescence photon;
  • a single photon detector of the single photon detection unit detects at least a part of the fluorescence photons and generates a detection signal for each single fluorescence photon detected, the detected portion of the fluorescence photons forming a fluorescence signal;
  • a means of measuring the unit of measurement determines, for each beam, the time elapsed between the excitation pulse and each detection signal from a florescence photon said beam, called "arrival time", and generates a digital data characteristic of this time of arrival;
  • Another aspect of the invention relates to a method for high-throughput screening of a plurality of samples with photon-counted time-resolved fluorescence measurement, the method comprising:
  • a step of high-throughput screening of the plurality of samples according to which the passage of each sample in the fluorescence excitation zone is detected and, from the numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence emission for each sample, a result class from among a plurality of result classes is determined and archived for each sample.
  • the implemented fluorescence measurement method will advantageously implement a fluorescence measuring device comprising a real-time analysis unit allowing: the detection of the passage of each sample,
  • Another aspect of the invention relates to a method of high throughput sorting of a plurality of samples comprising:
  • FIG. 1a shows schematically a first time-resolved fluorescence decay kinetics of a chromophore in solution, the chromophore having no interaction with another molecule, and a second kinetics of fluorescence decay resolved in time of same chromophore in solution, the chromophore interacting with another molecule.
  • FIG. 1b shows time-resolved fluorescence decay kinetics data typically obtained by a TCSPC counting technique and forming a histogram.
  • FIG. 2a schematically shows a time-resolved fluorescence measuring device according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2b shows schematically a time-resolved fluorescence measuring device according to a second embodiment of the invention.
  • FIG. 3a schematically shows a high-throughput screening device according to a mode of operation.
  • FIG. 3b schematically shows a high-speed screening device according to a second mode of operation.
  • FIG. 3c schematically shows a high-throughput screening device according to a third mode of operation.
  • FIG. 4 schematically shows a high sample rate sorting device.
  • FIG. 5a schematically shows the organization of the steps of a time-resolved fluorescence measurement method according to the invention.
  • FIG. 5b schematically shows the organization of the steps of a multi-parameter time-resolved fluorescence measurement method according to the invention.
  • FIG. 6 schematically shows the organization of the steps of a high throughput screening method according to the invention.
  • FIG. 7 schematically shows the organization of the steps of a high throughput sorting method according to the invention.
  • the invention relates to a time-resolved fluorescence measuring device for single-photon counting for high-throughput screening or sorting of samples.
  • screening means determining and then archiving, for each sample among a plurality of samples, a result class from a predetermined plurality of result classes.
  • a screening can in particular be carried out by a flow cytometry technique, which makes it possible to scroll a plurality of samples in the beam of a laser, counting and characterizing each sample.
  • sorting it is meant to use the result of a screening operation, i.e. the result class determined for each of a plurality of samples, to perform a conditional manipulation operation of each sample.
  • each sample typically comprises at least one fluorophore in solution or a biological cell labeled with at least one chromophore.
  • FACS cell sorting technique Fluorescence Activated Cell Sorting
  • Each sample typically comprises at least one fluorophore in solution or a biological cell labeled with at least one chromophore.
  • the term "broadband" a rate up to a frequency of the order of 1 KHz.
  • the device of the invention thus typically makes it possible to screen up to 1000 samples per second.
  • the first sample is successively excited by a plurality of excitation pulses and the first sample thus emits several fluorescence photons by de-energizing. At least a part of these fluorescence photons is detected, each fluorescence photon detected having a detection signal and a digital data characteristic of this detection signal.
  • the term "real-time analysis of the digital data” means that the digital fluorescence photon detection data from the first sample are processed in a time interval that is less than or equal to the time interval between the first and second samples. In other words, the digital fluorescence photon detection data from the first sample are processed by the analysis unit before receiving the digital fluorescence photon detection data from the second sample.
  • the counting rate associated with the Darkness Rate DCR (Dark Count Rate) is generally of the order of kHz but can be reduced to a few Hz per ⁇ 2 by cooling the system.
  • Darkness noise DCR is the number of unique events "detected" by a photodetector, although the photodetector is in total darkness. Thanks to these performances, Time-resolved fluorescence microscopy devices with 2D arrays of SPAD diodes have already been successfully implemented.
  • 2D systems are limited by their architecture and their mode of action, because of spatial constraints.
  • the use of a shutter technique reduces the sensitivity.
  • the invention therefore proposes to advantageously use a system with a single spot, or a "multi-spot" system with a reduced number of spots such as an ITCSPC system with a one-dimensional matrix, which makes it possible to reach the limits. of technology by overcoming the constraints of a two-dimensional matrix.
  • a 1D matrix is thus the most suitable design for this application to obtain the best possible sensitivity.
  • FIG. 2a shows a time-resolved fluorescence measuring device 100 according to one embodiment of the invention.
  • the device 100 implements:
  • a SPDet unit for detecting single photons
  • a measuring unit M comprising a TDC measuring means and a trigger Trig unit
  • the device 100 advantageously operates with the following elements, which will be detailed later:
  • an excitation light source LS which emits excitation pulses LP;
  • a Foc unit for spatially shaping, optically coupling and focusing the excitation pulses LP towards a sample ⁇ , for the excitation of said sample ⁇ so that said sample ⁇ emits a plurality of fluorescence photons F;
  • the single photon detection SPDet unit is a system for detect a single photon, as a single event. Each detected photon is thus detected individually.
  • the single photon detection unit SPDet generates a detection signal as soon as it detects a photon. There are thus as many distinct detection signals as single photons detected.
  • the unit SPDet unique photon detection includes a photosensitive part, which is the actual detector. This detector can for example be chosen from the following list:
  • a photomultiplier tube with a microchannel wafer or a matrix of photomultiplier tubes with a microchannel wafer is a photomultiplier tube with a microchannel wafer or a matrix of photomultiplier tubes with a microchannel wafer.
  • the single photon detection SPDet unit also includes an electronic module for biasing the photosensitive detector, shaping the analog signal output from the photosensitive detector, and outputting the detection signal.
  • the SPDet unit comprises a single single photon detector. Nevertheless, according to another embodiment which will be described later, the SPDet unit may comprise several single photon detectors, possibly integrated on the same electronic chip.
  • the measurement unit M is a system that measures the elapsed time between the excitation pulse LP and the detection signal.
  • the measurement unit M typically comprises a measuring means TDC and a tripping unit Trig.
  • the measuring means TDC is advantageously a time-to-digital converter. After measuring the elapsed time between the excitation LP pulse and the detection signal, the time-to-digital converter generates as output a numerical value characteristic of this elapsed time. The order of magnitude of this numerical value is typically between a few picoseconds and a few nanoseconds. Compared to an analog measurement unit, or to a digital measurement unit with a very high sampling rate, the measurement unit M with the measuring means TDC allows a very large reduction and optimization of the amount of data generated. for each detection event, and which must then be stored and / or sent to the analysis RTA unit and processed by said analysis RTA unit.
  • the measurement unit M implemented in a screening device according to the invention makes it possible to measure the time interval between each detection signal and its excitation pulse LP: it is therefore a relative time measurement. between two events, rather than a measure of "absolute" time. In doing so, the measurement unit M implemented in a screening device according to the invention makes it possible to avoid a huge generation, storage and processing of unnecessary data.
  • the dynamics of the time-to-digital converter can be reduced to a few bits, up to less than 4 or 5 bits for example. Nevertheless a time-to-digital converter with significant dynamics, up to more than 32 bits, can also be used.
  • the conversion time of the time-to-digital converter must be kept as low as possible, of the order of a few nanoseconds, in order to reduce the dead time for the entire detection system.
  • the TDC measuring means implemented by the measurement unit M may for example be:
  • the unit of measurement M can be integrated with the SPDet unit on the same electronic chip.
  • Trig Trigger unit ensures a mode of operation synchronously between the measuring means TDC of the measuring unit M and the excitation light source LS. Two modes of operation are possible for the trigger Trig unit. According to a first mode of operation, the trigger Trig unit generates simultaneously:
  • the repetition rate of the light source LS is set by the triggering unit Trig.
  • the repetition rate of the pulses LP emitted by the light source LS is determined by the light source LS itself, according to its intrinsic characteristics, and a part of the light beam is directed towards the unit Trig trigger.
  • the trigger Trig unit therefore detects a portion of said light pulse LP and generates the second trigger signal to the measuring means TDC.
  • the Trig Trigger Unit may be a constant fraction discriminator having a photodiode.
  • the RTA analysis unit allows the on-the-fly processing of the data from the TDC measuring means to calculate at least one numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence emission of the sample ⁇ considered.
  • This numerical quantity can for example be:
  • At least one constant of fluorescence decay time of the sample In the case of an analysis assuming an exponential decay of fluorescence, a single fluorescence decay time constant will be calculated. In the case of an analysis assuming a multi-exponential or non-exponential fluorescence kinetics, several characteristic time constants can be calculated;
  • the moment of order 1, that is to say the mean value of the arrival times of the fluorescence photons of the sample, and / or the moment of order 2, that is to say the mean square deviation of the arrival times of the fluorescence photons of the sample, may in particular be calculated.
  • At least one characteristic quantity of the fluorescence intensity of the sample may also be calculated by the RTA analysis unit.
  • the RTA analysis unit may, for example, perform a preliminary step of counting the number of fluorescence photons F detected as a function of the arrival time of said detected fluorescence photons F, and thus construct a histogram of the number of photons detected according to the arrival time of the photons detected.
  • the RTA analysis unit calculates, from the histogram previously constructed, a numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence signal of the ⁇ sample considered.
  • This preliminary counting step is optional: it can be performed or not, depending on the analysis algorithm chosen for the calculation of said digital quantity.
  • the analysis algorithm can notably be implemented:
  • the analysis RTA unit which includes logic and processing intelligence, is integrated on the same electronic circuit as the SPDet detection unit and / or the unit of measurement M;
  • programmable digital components such as a processor or a reconfigurable device, for example an FPGA.
  • the RTA analysis unit can therefore have one or the following two types of results:
  • the excitation light source LS is a laser source emitting ultra-short LP light pulses at a high repetition rate.
  • the term "ultra-short pulses” pulses whose duration belongs to the interval between a few femtoseconds and several hundred picoseconds, and "high repetition rate” means a repetition rate greater than a few hundred kHz.
  • the emission wavelength of the light source LS is chosen or tuned according to the type of fluorophore contained in each ⁇ sample.
  • the emission wavelength of the light source LS is typically between 200 nm and 1500 nm.
  • the source can be used to excite the fluorescence of the samples by a linear or multiphoton absorption process.
  • the light source LS may in particular be chosen from the following list:
  • a femtosecond laser or a picosecond laser for example a titanium-sapphire laser, a dye laser or a fiber laser, generating light pulses with a half-height width FWHM typically less than or equal to 2 ps at a rate of typically adjustable repetition, up to a few hundred MHz, and with an average power typically greater than a few hundred mW;
  • a non-linear optical source such as a parametric oscillator optical (OPO) or any other source using for example the generation of second, third or fourth harmonic to provide, for example from the laser sources mentioned in the previous point, a wavelength tunability ranging from ultraviolet to infrared;
  • OPO parametric oscillator optical
  • a laser diode operating in triggered pulse mode also called a "Q-switch"
  • Q-switch generating light pulses with a half-height width FWHM typically between 10 ps and 200 ps, at an adjustable repetition rate ranging from a few Hz to more than 100 MHz, and with an average power typically of the order of 1 mW.
  • FWHM half-height width
  • the average power of such a system is typically of the order of a few mW;
  • an extended light source also called a supercontinuum light source
  • a supercontinuum light source can be used to help obtain a wavelength tunable laser source in a wide range of wavelengths.
  • the LP light pulses are directed to the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing.
  • the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing contributes to ensuring efficient excitation of each ⁇ sample by a light pulse LP, emitted by the light source LS.
  • the light pulses LP can propagate freely in space or be coupled in one or more fibers, as in the case of multiple laser diodes, or multiple excitation spots.
  • the excitation pulses LP can be implemented in multiple lines or excitation spots. It is thus possible to advantageously use diffractive optics, as detailed later.
  • the excitation light pulses LP can be focused using conventional optical elements, such as microscope objectives, or cylindrical symmetry optical elements for the generation of excitation lines, or coupled by guided propagation. or through integrated optics.
  • Each light pulse LP is thus focused, at the output of the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing, on a ⁇ sample for the excitation of said ⁇ sample.
  • the sample ⁇ de-excited by emitting one or more fluorescence photons F by exciter LP light pulse.
  • Each ⁇ sample is excited N times, N being typically between several thousand and several hundreds of thousands.
  • Each sample ⁇ will then de-energize N times and emit, during these N de-excitation, one or more fluorescence photons of which at most N will be detected by the detection unit.
  • the collection, filtering and optical coupling unit contributes to ensuring an efficient collection of fluorescence photons F emitted during successive de-excitation of the ⁇ sample.
  • efficient collection it is meant that at best a few percent of the emitted photons are collected and coupled to the SPDet detection unit.
  • This collection can be performed using integrated optical elements, or by guided propagation, or using conventional optical elements, such as microscope objectives.
  • the microscope objective may be identical to that potentially used in the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing, since a dichroic mirror is used to reflect the light of the light. excitation, ie the light pulses LP, and to transmit the fluorescence light, that is to say the fluorescence photons F.
  • the fluorescence light can then be filtered through pass filters. bands or a polarizer.
  • a filtering advantageously makes it possible to collect only fluorescence photons F by rejecting other photons originating from the luminous background: excitation photons, luminescence photons of a ⁇ de sample handling unit, or any other compound other than a fluorophore of interest of a ⁇ sample.
  • the collected and filtered fluorescence signal propagates freely in space, or in a fiber. It is then coupled to a single photon detector of the SPDet detection unit.
  • FIG. 2b shows a time-resolved fluorescence measuring device 101 according to a second embodiment of the invention.
  • the single photon detection unit SPDet comprises several single photon detectors, for example arranged in a one-dimensional array.
  • the device 101 according to the second embodiment of the invention therefore comprises several single photon detection channels.
  • multiparameter resolution allows, for a fluorescence signal coming from a single sample, a so-called “multiparameter” resolution, that is to say a resolution that is both temporal and following at least one other parameter.
  • the fluorescence signal can in particular be solved:
  • spectrally by means of a spectrometer employing, for example, a diffraction grating or a prism, or alternatively by means of pass-band filters or dichroic mirrors;
  • the fluorescence signal resolved according to several parameters is then divided into a plurality of beams:
  • Each beam propagates freely in space, or is coupled in a fiber. Each beam is ultimately coupled to one or more single photon detectors of the detection SPDet unit.
  • the RTA analysis unit can produce a so-called “multiparameter” analysis based on a measurement of at least two fluorescence signals, such that:
  • the RTA analysis unit will be able to provide in real time one or more numerical constants characterizing the kinetics of temporal evolution of any signal resulting from a multiparameter analysis of the fluorescence.
  • the measurement unit M may comprise a single measuring means TDC, or alternatively several measuring means TDC and for example as many means measuring TDC than single photon detectors.
  • the RTA analysis unit can analyze in parallel multiple fluorescence signals.
  • the single photon detectors, the one or more TDC measuring means and the analysis unit may be integrated on one or more electronic chips.
  • Figure 3a shows a high-throughput screening device 200 in one mode of operation.
  • the screening device 200 comprises:
  • the excitation light source LS emitting the excitation pulses LP;
  • microfluidic unit comprising a microfluidic channel Ch for the high-speed circulation of a plurality of ⁇ samples
  • the unit Foc described above, of spatial shaping, of optical coupling and of focusing of the LP excitation pulses towards a spatially defined zone, called the "excitation zone", of the microfluidic channel Ch, for the excitation of each ⁇ sample during its passage in said excitation zone, so that said sample ⁇ emits a plurality of fluorescence photons F;
  • the unit Fil described above, for collecting, filtering and optically coupling fluorescence photons F to the time-resolved fluorescence measuring device 100.
  • Said allocation means are for example implemented in the analysis RTA unit.
  • the result of the entire screening operation is to construct a database archiving the result of analysis obtained for each sample.
  • the RTA analysis unit of the fluorescence measuring device 100 allows the calculation, for each ⁇ treated sample, of one or more digital quantities characteristic of the temporal distribution of the fluorescence emission of said ⁇ sample.
  • the RTA analysis unit shall include real-time detection of the passage of each ⁇ sample in the excitation zone of the microfluidic Ch channel.
  • sample detection ⁇ is set in advance or may change depending on the accumulated data. This criterion may for example relate to the number of single photons detected over a short time window, for example 10 microseconds, in front of the total transit time of the ⁇ sample in the excitation zone, which is typically of the order of 1 ms or more.
  • the analysis algorithm of the RTA analysis unit can:
  • screening means determining, for each sample or group of identical samples ⁇ , a class of result from a predetermined plurality of classes of result, as a function of the numerical quantity calculated for said sample. or group of identical samples ⁇ by the RTA analysis unit of the fluorescence measuring device 100.
  • the screening may notably be binary: in this case, two classes of results will be possible:
  • the high-throughput screening device 200 advantageously employs one unit microfluidic ⁇ ⁇ manipulation sample manipulation.
  • a microfluidic unit ⁇ makes it possible to form ⁇ samples in the form of microdroplets of very small volume, and the precise handling of these samples at a very high rate.
  • microfluidic units ⁇ can be used to form samples whose volume is less than the nanolitre, which represents a reduction of more than four orders of magnitude compared to micro-well type samples on microplates.
  • Such ⁇ lu microfluidic samples can also be produced and manipulated at a frequency of the order of KHz or more, three orders of magnitude faster than micro-well type samples on microplates.
  • ⁇ samples may be droplets or biological cells possibly contained in droplets at the rate of one or more biological cells per droplet.
  • biological cells and “living cells” are used interchangeably.
  • the advantages of the ⁇ microf microfluidic unit for handling ⁇ samples have been previously described. However, in general, any microfluidic or non-microfluidic sample handling unit can be used. In other words, any sample handling unit that effectively scrolls a plurality of samples in a measurement area can be used. As examples, “treadmill” type or “micro-well on micro-plate” type solutions can therefore be used.
  • FIG. 3b shows a high-throughput screening device 201 according to a second mode of operation, called "multichannel", in which simultaneous parallel screening of samples circulating in a plurality of microfluidic channels is carried out.
  • the device 201 comprises in the example shown in FIG. 3b:
  • a ⁇ microf microfluidic system comprising a first microfluidic channel Ch1 for the high-throughput flow of first ⁇ 1 samples and a second microfluidic channel Ch2 for high flow rate second samples ⁇ 2;
  • the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing of LP excitation pulses to:
  • the two spatially defined zones of the first and second microfluidic channels Ch1 and Ch2, also called “excitation zones” or “excitation spots”, are for example obtained, from the optical coupling and focusing Foc unit, thanks to optical means described above of conventional optics, refractive, reflective, integrated or not.
  • the exciting light may be shaped spatially along a continuous line of excitatory light, or a collection of focusing points, the intersection of which with the various microfluidic channels constitutes the excitation zones.
  • each fluorescence emission is then detected by one or more single photon detectors, each single photon detector being equipped with its own means. in the measurement unit M, and its own means of analysis within the the RTA analysis unit.
  • the device 201 may more generally, and on the same principle, include a plurality of microfluidic channels for the circulation, detection and parallel analysis of a plurality of samples.
  • the device 201 therefore advantageously makes it possible to increase the flow rate for handling and screening the samples.
  • the second mode of operation of the screening device 201 has already been described, having several points of focus in parallel.
  • Another possible configuration is that of a screening device, not shown, having several excitation zones in series along the same microfluidic channel.
  • This configuration involves several serial wire units, collecting, filtering and coupling the various fluorescence signals to a fluorescence measuring device 101 capable of detecting and analyzing in parallel these different fluorescence signals.
  • This configuration advantageously allows a follow-up of the evolution of each ⁇ sample during its movement in the microfluidic system ⁇ , and therefore over time. It will thus be possible to study the biochemical reaction kinetics within the samples, or to carry out, according to a variant described later, several successive sorting steps on the samples.
  • FIG. 3c shows a device 202 for high-throughput screening according to a third mode of operation allowing the screening of a ⁇ sample from a measurement of fluorescence resolved at a time, and according to another parameter, as for example the wavelength (spectral resolution), the polarization or the direction of propagation.
  • the device 202 comprises:
  • the ⁇ microf microfluidic system comprising a microfluidic channel Ch for the high-throughput flow of the plurality of ⁇ samples;
  • the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing of the excitation pulses LP towards a spatially defined zone of the microfluidic channel Ch;
  • the second and third modes of operation may be combined in order to implement a screening device allowing parallel screening of several samples and, for each screened sample, obtaining a temporal resolution and a resolution according to another parameter such as the wavelength, the polarization or the direction of propagation of the fluorescence photons of said sample.
  • the transit time of each sample ⁇ in the spatially defined excitation and detection zone of the microfluidic channel Ch will be approximately 1 ms.
  • each sample ⁇ will be excited 50000 times during its passage of 1 ms in the laser focusing spot. With such a repetition rate, there are 20 ns between two consecutive LP light pulses.
  • the fluorescence measuring device therefore has, in the particular case where the repetition frequency is 50 MHz, a maximum of 20 ns for:
  • the detection unit SPDet detects a fluorescence photon F
  • the measurement unit M measures the arrival time of the fluorescence photon F and generates a digital datum characteristic of this arrival time
  • the RTA analysis unit receives the numerical data and, if necessary, updates the histogram of the number of photons detected as a function of the arrival time of the detected photons.
  • the fluorescence measuring device then has approximately 1 ms so that the RTA analysis unit calculates at least one numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence signal of the ⁇ sample considered.
  • the screening device has about 1 ms to effectively perform the screening, that is to say:
  • FIG. 4 shows a 300 high sample rate sorting device.
  • the sorting device 300 comprises:
  • the device 100 for measuring fluorescence illustrated in FIG. 2a the device 100 for measuring fluorescence illustrated in FIG. 2a.
  • the sorting device 300 may also include the fluorescence measurement device 1 01 illustrated in FIG. 2b;
  • a ⁇ microf microfluidic system comprising a microfluidic channel Ch for the high-throughput flow of the plurality of ⁇ samples, the microfluidic channel Ch dividing into a first subchannel sCh1 and into a second subchannel sCh2;
  • the Foc unit for spatial shaping, optical coupling and focusing the LP excitation pulses to a spatially defined area of the microfluidic channel Ch;
  • the high throughput manipulation performed by Manip means can be:
  • Each sample ⁇ is then oriented either in the first subchannel sCh1, or in the second subchannel sCh2, according to its screening result;
  • a first sample ⁇ may be fused with a second sample ⁇ , in order to generate the mixture of the two samples and the start of a new biomolecular reaction, conditioned by the result of the measurement of fluorescence TRF.
  • the first subchannel sCh1 may comprise a subdivision and / or the second subchannel sCh2 may comprise a subdivision, in order to allow a second level of sorting.
  • FIG. 5 shows the organization of the steps of a method 500 according to the invention for photon counting time-resolved fluorescence measurement for the high-throughput screening of at least one ⁇ sample.
  • the method 500 comprises:
  • a first step 501 according to which the light source LS emits a succession of excitation pulses LP for the excitation of the sample ⁇ so that the sample ⁇ emits a plurality of fluorescence photons F; a second step 502 in which the single photon detection unit SPDet detects at least a portion of said fluorescence photons F and generates a detection signal for each single fluorescence photon F detected;
  • a third step 503 according to which the measurement unit M determines, for each detection signal, the time elapsed between the excitation pulse LP and the detection signal, called "arrival time", and generates a numerical data item characteristic of this arrival time;
  • a fourth step 504 in which the RTA analysis unit processes in real time the digital data from the measurement unit M and calculates a numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence signal of the sample ⁇ , the fourth step 504 advantageously comprising the following substeps:
  • a first substep 504-1 according to which the RTA analysis unit counts the number of fluorescence photons F detected as a function of the arrival time of said detected fluorescence photons and thus builds the histogram of the number of photons of fluorescence F detected according to their arrival time;
  • a second substep 504-2 according to which the analysis unit RTA calculates, from the histogram constructed during the first substep 504-1, the numerical quantity characteristic of the temporal distribution of the fluorescence signal of the ⁇ sample.
  • FIG. 5b shows the organization of the steps of a method 51 0 according to the invention for resolving fluorescence measurement in multiparameter time by single photon counting for the high-throughput screening of at least one ⁇ sample.
  • the method 51 0 comprises:
  • a first step 51 1 according to which the light source LS emits a succession of excitation pulses LP for the excitation of the sample ⁇ so that the sample ⁇ emits a plurality of fluorescence photons F forming an emission of fluorescence;
  • a second step 51 2 according to which the emission of fluorescence is resolved into a plurality of beams according to a first parameter such as wavelength, polarization or propagation direction of each fluorescence photon F;
  • a single photon detector of the single photon detection unit SPDet detects at least a part of the fluorescence photons F and generates a detection signal for each single photon of fluorescence F detected;
  • a measurement means TDC of the measurement unit M determines, for each beam, the time elapsed between the excitation pulse LP and each detection signal coming from a florescence photon F of said beam , called "arrival time", and generates a numerical data characteristic of this arrival time;
  • a fifth step 51 5 according to which the RTA analysis unit processes in real time the digital data coming from each measurement means TDC of the measurement unit M and calculates at least one digital quantity characteristic of the temporal distribution of the signal of fluorescence of the ⁇ sample, and / or at least one digital quantity characteristic of a temporal evolution of the calculated signals, resulting from the combination of various fluorescence signals from the multiparameter measurement.
  • FIG. 6 shows the organization of the steps of a method 600 of high-throughput screening of a plurality of ⁇ samples with a photon-counted time-resolved fluorescence measurement.
  • the method 600 comprises:
  • a step 400 for producing and manipulating a plurality of samples which successively supplies each sample in one or more zones of fluorescence excitation
  • a fifth step 505 of high throughput screening of the ⁇ samples according to which, the passage of each sample in the fluorescence excitation zone is detected and at least one numerical variable characteristic of the temporal distribution of the fluorescence signal of each ⁇ sample, is determined and stored for each ⁇ sample a class of result from a plurality of result classes.
  • FIG. 7 shows the organization of the steps of a method 700 of high throughput sorting of a plurality of ⁇ samples.
  • the method 700 comprises:

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Abstract

L'invention concerne un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le dispositif fonctionnant avec une source lumineuse apte à produire une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence, le dispositif étant caractérisé en ce qu'il comporte : - une unité de détection de photons uniques apte à détecter au moins une partie desdits photons de fluorescence, l'unité de détection de photon unique générant un signal de détection pour chaque photon unique détecté; - une unité de mesure permettant de mesurer, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et générant une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée; - une unité d'analyse en temps réel des données numériques issues de ladite unité de mesure, comportant des moyens pour détecter le passage de l'échantillon et pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon.

Description

DISPOSITIF ET PROCEDE DE MESURE DE FLUORESCENCE RESOLUE EN TEMPS POUR LE CRIBLAGE A HAUT DEBIT D'ECHANTILLONS
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
Le domaine technique de l'invention est celui du criblage à haut débit d'échantillons, notamment pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments par l'industrie pharmaceutique. La présente invention concerne un dispositif et un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps à haut débit pour le criblage à haut débit d'échantillons. L'invention concerne également un dispositif et un procédé de criblage à haut débit d'échantillons s'appuyant sur une mesure de fluorescence résolue en temps, ainsi qu'un dispositif et un procédé de tri à haut débit d'échantillons s'appuyant sur une mesure de fluorescence résolue en temps.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
L'implémentation et la mise en œuvre de procédés de criblage à haut débit HTS (de l'anglais « High-Throughput Screening ») présentent un très grand intérêt pour l'industrie pharmaceutique et plus généralement pour la recherche académique, notamment dans les domaines de la biologie, de la biochimie ou de la biophysique. En effet, dès qu'une biomolécule est identifiée en tant que nouvelle cible thérapeutique potentielle, son interaction avec un très grand nombre de composés chimiques, typiquement plusieurs dizaines de milliers, est systématiquement étudiée afin de déterminer, parmi ces composés chimiques, ceux qui se lient à la biomolécule cible et pourraient donc être utilisés dans la conception de nouveaux médicaments. La plupart des méthodes HTS sont basées sur une détection de fluorescence de biomolécules marquées, dans des dispositifs automatisés capables de manipuler rapidement un grand nombre d'échantillons. Parmi les différentes mises en œuvre possibles de détection de fluorescence, la détection de fluorescence résolue en temps TRF (de l'anglais « Time-Resolved Fluorescence ») présente un intérêt particulier car elle permet de révéler des informations intrinsèquement liées au marquage. La détection de fluorescence intégrée en temps, c'est-à-dire la détection d'intensité de fluorescence, est au contraire sensible aux fluctuations de concentration et sujette aux interférences avec des signaux de fond, tels que des signaux d'autofluorescence ou de diffusion. La détection TRF est cependant une technique plus complexe que la détection d'intensité de fluorescence et dont la mise en œuvre demeure difficile dans des applications de criblage à haut débit HTS.
La détection de fluorescence résolue en temps TRF est une mesure de la cinétique de décroissance d'un signal de fluorescence d'un chromophore en solution, après que ledit chromophore a été excité par une impulsion lumineuse ultra-courte. A l'échelle d'une molécule unique, cette cinétique de décroissance représente la probabilité d'émettre un photon unique par émission spontanée, c'est-à-dire par fluorescence, en fonction du temps après l'excitation. A cause de l'interaction du chromophore avec son environnement, la cinétique de décroissance de fluorescence est susceptible d'être fortement accélérée. C'est par exemple le cas du mécanisme de transfert résonant d'énergie de type Fôrster FRET (de l'anglais « Fôrster Résonance Energy Transfer »), qui est utilisé pour tester les interactions biomoléculaires. Le nombre total de photons détectés durant une fenêtre temporelle donnée est simplement l'intégrale de la cinétique de décroissance sur cette fenêtre temporelle. C'est ce nombre total de photons qui est mesuré lors d'une mesure d'intensité de fluorescence, réalisée en excitant une même solution avec une source lumineuse continue. Ainsi, plus la cinétique de décroissance de fluorescence est rapide, plus la quantité totale de photons détectés, c'est-à-dire l'intensité de fluorescence, diminue, ce qui signifie que le rendement quantique de fluorescence est réduit.
La figure 1 a représente schématiquement :
- une cinétique 1 de décroissance de fluorescence résolue en temps d'un chromophore en solution, le chromophore n'ayant pas d'interaction avec une autre molécule ; - une cinétique 2 de décroissance de fluorescence résolue en temps du même chromophore en solution, le chromophore ayant une interaction avec une autre molécule.
L'aire en-dessous de chaque courbe de cinétique est proportionnelle au nombre total de photons émis. C'est ce nombre total de photons émis qui est mesuré lors d'une mesure de fluorescence intégrée en temps, c'est-à-dire lors d'une mesure d'intensité de fluorescence, par exemple dans les dispositifs classiques de criblage HTS utilisant la détection de fluorescence. La figure 1 a montre l'aire 11 sous la courbe de cinétique 1 et l'aire 12 sous la courbe de cinétique 2. L'aire 11 est supérieure à l'aire 12. Une mesure d'intensité de fluorescence ne donne en revanche aucune information sur la répartition temporelle des photons émis et ne permet donc pas d'accéder aux allures des courbes de cinétique 1 et 2 proprement dites.
Dans la plupart des procédés de criblage HTS, les interactions moléculaires et notamment les liaisons moléculaires sont testées en détectant un changement dans le rendement quantique de fluorescence d'un chromophore lié à une première molécule, lorsque cette première molécule interagit avec une autre molécule, par exemple en formant un complexe. Comme expliqué précédemment, ce changement dans le rendement quantique de fluorescence entraîne une cinétique de décroissance de fluorescence plus rapide et conséquemment une diminution de l'intensité de fluorescence. Cependant, un tel changement d'intensité de fluorescence n'est pas nécessairement causé par une variation du rendement de fluorescence quantique. Ainsi, une modification de l'intensité de fluorescence peut également être causée par des fluctuations d'autres paramètres extérieurs, tels que la concentration du chromophore en solution ou l'intensité de la source lumineuse d'excitation. En revanche, lorsqu'on réalise une mesure de fluorescence résolue en temps TRF, l'amplitude du signal peut certes être affectée par un changement de la concentration du chromophore ou de l'intensité lumineuse du laser d'excitation, mais pas la constante de temps de décroissance, appelée « durée de vie de fluorescence ». En effet, la durée de vie de fluorescence ne dépend pas de paramètres extérieurs : la durée de vie de fluorescence dépend uniquement des interactions moléculaires. C'est notamment la raison pour laquelle la technique d'imagerie par durée de vie de fluorescence FLIM (de l'anglais « Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy ») a été massivement développée, par exemple en biologie cellulaire, en plus de la microscopie en fluorescence classique. En effet, seule la technique FLIM permet de repérer les emplacements où les biomolécules interagissent - ou n'interagissent pas - les unes avec les autres, par opposition aux emplacements où les biomolécules se trouvent en faible ou en forte concentration au sein d'une cellule. Dans le présent contexte de criblage à haut débit HTS et pour les raisons qui viennent d'être exposées, la détection de fluorescence résolue en temps TRF est susceptible de réduire significativement le nombre de détections de « faux positifs » ou de « faux négatifs ».
Le comptage de photons uniques avec corrélation temporelle TCSPC (de l'anglais « Time-Correlated Single Photon Counting ») est une technique d'acquisition numérique, selon laquelle l'acquisition du signal de fluorescence est réalisée en comptant les photons un par un et en enregistrant simultanément le temps d'arrivée de chacun de ces photons après l'impulsion d'excitation. Ainsi, le signal TRF est construit comme un histogramme du nombre de photons détectés dans des intervalles de temps successifs. La figure 1 b montre des données de cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps typiquement obtenues par une technique de comptage TCSPC, formant un histogramme 3. Le signal se construit progressivement, en comptant les photons un par un. Le bruit statistique, inhérent au processus d'émission de lumière, est de moins en moins prononcé à mesure que le nombre de photons détectés augmente. L'histogramme 3 converge ainsi asymptotiquement, pour un grand nombre de photons détectés, vers la courbe théorique 4 de cinétique de décroissance de fluorescence. Dans l'exemple représenté à la figure 1 b, l'histogramme 3 et la courbe théorique 4 sont simulés pour le cas où environ 1000 photons ont été détectés en tout. Après chaque impulsion d'excitation, un photon au maximum doit être détecté par canal de détection, afin d'éviter qu'un phénomène d'empilement (« pile-up ») ne se produise. En effet, si deux photons sont détectés en même temps sur un même canal de détection, l'un sera caché par l'autre. Un laser avec un taux de répétition élevé, typiquement supérieur à 10 MHz, est donc requis afin de permettre l'acquisition d'une courbe de décroissance de fluorescence avec un bon rapport signal à bruit dans un bref temps d'acquisition. Lorsque le nombre de photons détectés augmente, la forme de l'histogramme 3 évolue vers la forme des courbes de cinétique 1 et 2 représentées à la figure 1 a. La précision de la cinétique de décroissance de fluorescence est limitée par le bruit de détection des photons, qui diminue lorsque le nombre total de photons détectés augmente, donc lorsque le temps d'acquisition augmente. Nous abordons dans ce paragraphe la problématique de la mise en œuvre d'une détection TRF pour des analyses automatisées de fluorescence. Par opposition à la détection de fluorescence intégrée en temps, la détection TRF doit permettre de réduire significativement les cas de « faux positifs » ou de « faux négatifs », grâce à la diminution de l'influence des signaux de fond ou des fluctuations de concentration. Dans le cadre d'applications de criblage HTS, la détection TRF a initialement été mise en œuvre avec une détection analogique, en domaine fréquentiel, et pour des chromophores de grande longévité, c'est-à-dire présentant des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques centaines de ns, comme les complexes de ruthénium - ainsi qu'exposé dans le document « Fluorescence- lifetime technologies for high-throughput screening », French, T.E. et al., p. 209- 218 (1998), ou de l'ordre de la microseconde, comme les lanthanides. Une telle mise en œuvre analogique n'est cependant pas compatible avec une détection de fluorescence résolue en temps TRF pour la plupart des chromophores d'intérêt - par exemple pour les analyses basées sur des mesures de FRET. Ces chromophores d'intérêt, comme les protéines fluorescentes et notamment la protéine GFP (de l'anglais « Green Fluorescent Protein »), ont en effet des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques nanosecondes.
Récemment, une équipe de l'université du Minnesota a décrit, dans le document « High-Throughput FRET Assay Yields Allosteric SERCA Activators », Cornea, R.L., S.J. Gruber, E.L. Lockamy, J.M. Muretta, D. Jin, J. Chen, R. Dahl, T. Bartfai, K.M. Zsebo, G.D. Gillispie, and D.D. Thomas, Journal of Biomolecular Screening. 18(1 ): p. 97-107 (2013), un procédé prometteur de criblage HTS efficace, basé sur des mesures de FRET dans des micro-puits. Dans ces travaux, la détection TRF est mise en œuvre avec un procédé analogique nommé « Direct Waveform Recording » (DWR), c'est-à-dire « enregistrement direct de forme d'onde ». Ce procédé analogique DWR, qui utilise une source laser intense avec un faible taux de répétition - de l'ordre de 10 kHz - a été spécialement développé pour la détection TRF, dans des applications de criblage HTS. Les auteurs affirment en effet, dans le document « High-performance time-resolved fluorescence by direct waveform recording », Muretta, J.M., A. Kyrychenko, A.S. Ladokhin, D.J. Kast, G.D. Gillispie, and D.D. Thomas, Review of Scientific Instruments. 81 (10): p. 103101 -8 (2010), que le comptage de photons uniques avec corrélation temporelle TCSPC, qui est la forme la plus répandue de détection TRF, n'est pas compatible avec un criblage HTS. Avec l'approche analogique DWR, les auteurs parviennent à mettre en œuvre des tests TRF avec un débit élevé : 384 micropuits, contenant des solutions de 90 nl_ d'un marqueur fluorescent, ont ainsi été analysés en deux minutes. Toutefois, les auteurs abandonnent délibérément la sensibilité ultime, c'est-à-dire le photon unique, permise par le comptage TCSPC. Bien qu'un comptage TCSPC ait déjà été mis en œuvre pour une détection TRF avec des microplaques - voir par exemple le document « A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Abelson Kinase », Pritz, S. et al., Journal of Biomolecular Screening. 16(1 ): p. 65-72 (201 1 ), une telle technique demeure bien moins performante en termes de débit et d'applications industrielles, puisqu'elle nécessite typiquement de 5 à 20 minutes pour une plaque comportant 384 micropuits, avec 3000 à 10000 photons détectés par puits.
L'état de la technique propose donc plusieurs types de dispositifs de mesure de fluorescence résolue en temps TRF pour le criblage d'échantillons sur microplaques, les échantillons comportant des chromophores d'intérêt :
- un dispositif avec une mise en œuvre analogique de mesure de fluorescence TRF, adapté uniquement pour le criblage d'échantillons contenant des chromophores de grande longévité, c'est-à-dire présentant des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques centaines de ns ou de l'ordre de la microseconde. Cependant la majorité des chromophores d'intérêt ont des durées de vie de fluorescence beaucoup plus courtes, de l'ordre de quelques nanosecondes ;
- un dispositif avec une mise en œuvre analogique de mesure de fluorescence TRF, adapté pour le criblage d'échantillons contenant des chromophores avec des durées de vie de fluorescence de l'ordre de quelques ns, et offrant un débit de criblage de l'ordre de quelques centaines d'échantillons par minute. Ce dispositif n'implémente pas de méthode de comptage TCSPC et ne permet donc pas une sensibilité de détection au photon unique ;
- un dispositif de mesure de fluorescence TRF par une méthode de comptage TCSPC, offrant une sensibilité de détection au photon unique, mais avec un débit de criblage de l'ordre de quelques dizaines d'échantillons par minute seulement.
Ces dispositifs sont principalement limités par la vitesse à laquelle ils sont capables de traiter et d'analyser les données de criblage, mais également par la vitesse à laquelle ils parviennent à manipuler les échantillons. Des systèmes microfluidiques permettent d'améliorer ce dernier point, en autorisant la production et la manipulation d'échantillons sous forme de gouttes à une vitesse très élevée, à une fréquence de l'ordre du KHz, soit trois ordres de grandeur plus vite que des échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. De tels systèmes microfluidiques permettent en outre de former des échantillons dont le volume est inférieur au nanolitre, ce qui représente une diminution de plus de quatre ordres de grandeur par rapport aux échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. Deux dispositifs de criblage par comptage TCSPC utilisant un système microfluidique pour la production et la manipulation d'échantillons ont jusqu'à présent été décrits dans la littérature, notamment dans les documents « High- speed FRET screening for optical proteomics in a microfluidic format », Visitkul, V. et al., p. 79020P-79020P (201 1 ) et « Protein-protein interaction analysis in single microfluidic droplets using FRET and fluorescence lifetime détection », Benz, C. et al., Lab on a Chip. 13(14): p. 2808-2814 (2013). Cependant, ces deux dispositifs demeurent cette fois limités par la vitesse à laquelle ils parviennent à traiter et analyser les données de criblage. Ainsi, ils n'atteignent, au mieux, qu'un débit de criblage de quelques dizaines d'échantillons par seconde.
RESUME DE L'INVENTION
Dans ce contexte, la présente invention a pour but d'offrir une solution aux problèmes évoqués précédemment, en proposant un dispositif à la fois précis, fiable et à haut débit de mesure de fluorescence résolue en temps (TRF), pour le criblage à haut débit d'échantillons. Dans la présente description, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz, donc très supérieur aux débits constatés dans l'art antérieur.
A cette fin, l'invention concerne donc en premier lieu un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le dispositif fonctionnant avec une source lumineuse apte à produire une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence, le dispositif comportant :
- une unité de détection de photons uniques apte à détecter au moins une partie desdits photons de fluorescence, l'unité de détection de photons uniques générant un signal de détection pour chaque photon unique détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une unité de mesure permettant de mesurer, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et générant une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- une unité d'analyse en temps réel des données numériques issues de ladite unité de mesure, comportant des moyens pour détecter le passage de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) et pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon. Grâce à l'invention, un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps TRF avec une mise en œuvre numérique est donc proposé. L'unité de détection de photons uniques implémentée par le dispositif de l'invention garantit une sensibilité de détection ultime, chaque photon étant détecté de manière individuelle. Cette sensibilité au photon unique contribue en premier lieu à la précision et à la fiabilité du dispositif de l'invention. L'unité de mesure génère, pour chaque photon détecté par l'unité de détection, une donnée numérique caractéristique du temps d'arrivée dudit photon. On comprend que, pour un échantillon donné, une pluralité de photons de fluorescence est détectée par l'unité de détection, et donc une pluralité de données numériques est produite par l'unité de mesure, à destination de l'unité d'analyse. L'unité d'analyse permet un traitement numérique en temps réel et à haut débit de cette pluralité de données numériques.
Comme mentionné plus haut, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz.
L'expression « analyse en temps réel des données numériques » est explicitée ci- après. On considère l'exemple de deux échantillons consécutifs, passant et résidant successivement dans une zone de mesure de fluorescence TRF sans qu'aucun autre échantillon ne se trouve entre eux. Les deux échantillons sont séparés par un intervalle de temps qui définit la fréquence de mesure de fluorescence TRF. Pendant son passage dans la zone de mesure, le premier échantillon est successivement excité par une pluralité d'impulsions d'excitation et le premier échantillon émet ainsi plusieurs photons de fluorescence en se désexcitant. Au moins une partie de ces photons de fluorescence est détectée, chaque photon de fluorescence détecté ayant un signal de détection et une donnée numérique caractéristique de ce signal de détection. Dans la présente description, on entend par « analyse en temps réel des données numériques » le fait que les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées dans un intervalle de temps inférieur ou égal à l'intervalle de temps entre les premier et deuxième échantillons. Autrement dit, les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées par l'unité d'analyse avant que ne lui parviennent les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du deuxième échantillon. On emploiera indifféremment dans la présente description les termes « en temps réel » et « à la volée ». Dans la présente description, le terme « émission de fluorescence » désigne l'ensemble des photons de fluorescence émis, avant les phases de collection et de détection. Le terme « signal de fluorescence » désigne quant à lui les photons de fluorescence qui, après leur émission, ont effectivement été collectés puis détectés.
Outre les caractéristiques évoquées précédemment, le dispositif de mesure de fluorescence selon l'invention peut présenter une ou plusieurs caractéristiques complémentaires parmi les suivantes, considérées individuellement ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles :
La grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon est avantageusement choisie parmi la liste suivante :
- au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon ;
- au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon.
Parallèlement à une ou plusieurs grandeurs, préférentiellement choisies dans la liste ci-dessus, caractérisant la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon, au moins une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon, comme le nombre total de photons détectés, pourra également être calculée.
L'unité de mesure comporte avantageusement :
- un moyen de mesure, et
- une unité de déclenchement permettant d'assurer un fonctionnement synchrone entre la source lumineuse d'excitation et le moyen de mesure. Selon un premier mode de fonctionnement, l'unité de déclenchement génère simultanément :
- un premier signal de déclenchement vers la source lumineuse pour ordonner l'émission d'une impulsion lumineuse, et
- un deuxième signal de déclenchement vers l'unité de mesure.
Selon ce premier mode de fonctionnement, le taux de répétition de la source lumineuse est fixé par l'unité de déclenchement.
Alternativement, selon un deuxième mode de fonctionnement, le taux de répétition des impulsions émises par la source lumineuse est déterminé par la source lumineuse elle-même, en fonction de ses caractéristiques intrinsèques, et une partie du faisceau lumineux est dirigée vers l'unité de déclenchement qui génère, pour chaque impulsion lumineuse émise, le deuxième signal de déclenchement vers l'unité de mesure. L'unité de déclenchement peut être un discriminateur à fraction constante comportant une photodiode.
Le moyen de mesure de l'unité de mesure est avantageusement choisi parmi la liste suivante :
- un convertisseur temps-amplitude ;
- un compteur numérique rapide ;
- un convertisseur temps-numérique.
De tels moyens de mesure de l'unité de mesure autorisent avantageusement, en particulier par rapport à une unité de mesure analogique, une très grande diminution et optimisation de la quantité de données générées pour chaque événement de détection, et qui doivent ensuite être stockées et/ou envoyées à l'unité d'analyse et traitées par ladite unité d'analyse. De tels moyens de mesure permettent en effet de mesurer l'intervalle de temps entre chaque signal de détection et son impulsion d'excitation : c'est donc une mesure de temps relative entre deux événements, plutôt qu'une mesure d'un temps absolu.
L'unité de détection de photons uniques comprend avantageusement au moins un détecteur de photons uniques choisi parmi la liste suivante :
- une diode à avalanche ou une matrice de diodes à avalanche ;
- une diode à avalanche à photon unique ou une matrice de diodes à avalanche à photon unique ;
- un photomultiplicateur silicium ; - un tube photomultiplicateur ou une matrice de tubes photomultiplicateurs ;
- un tube photomultiplicateur hybride ou une matrice de tubes photomultiplicateurs hybrides ;
- un nanofil supraconducteur ;
- un tube photomultiplicateur à galette de micro-canaux ou une matrice de tubes photomultiplicateurs à galette de micro-canaux
On notera qu'une diode à avalanche et une diode à avalanche à photon unique se distinguent notamment par leur mode de fonctionnement, qui est donné par la polarisation de la diode : légèrement au-delà de la tension d'avalanche pour une diode à avalanche et bien au-delà pour une diode à avalanche à photon unique. L'unité de détection de photons uniques pourra comprendre un ou plusieurs détecteurs de photons uniques, selon différentes réalisations de l'invention.
L'unité de détection de photons uniques comprend avantageusement plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend avantageusement plusieurs moyens de mesure, chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques fonctionnant avec un moyen de mesure de l'unité de mesure. Ainsi, une mesure de fluorescence TRF pourra avantageusement être réalisée :
simultanément sur plusieurs échantillons, selon une configuration « multichannel » de l'invention, afin d'accroître le débit de traitement ;
- avec une résolution spectrale. Dans ce dernier cas, les photons de fluorescence issus d'un échantillon peuvent être diffractés, par exemple à l'aide d'un spectromètre, vers une pluralité de détecteurs, chaque détecteur de la pluralité de détecteurs étant alors associé à une certaine gamme de longueur d'onde ;
- avec une résolution en polarisation ;
- avec une résolution en direction de propagation.
Dans le cas où l'unité de détection de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, l'unité de mesure pourra comporter un seul moyen de mesure, ou préférentiellement plusieurs moyens de mesure et par exemple autant de moyens de mesure que de détecteurs de photons uniques. L'unité d'analyse est alors capable de traiter en parallèle les données numériques générées simultanément par les différents moyens de mesure de l'unité de mesure. Il est intéressant d'avoir plusieurs moyens de mesure pour mettre en œuvre une mesure multiparamètre de fluorescence, ou simplement pour pouvoir compter plus vite tout en évitant le phénomène de « pile-up ». Une seule unité de déclenchement suffit a priori pour déclencher l'ensemble des moyens de mesure de l'unité de mesure. Il est cependant envisageable d'utiliser plusieurs sources lasers indépendantes, et on utilisera avantageusement dans ce cas une unité de déclenchement par source laser indépendante. Dans le cas de plusieurs sources lasers synchronisées entre elles, c'est-à-dire par exemple des diodes laser, une seule unité de déclenchement pourra suffire pour déclencher les sources laser synchronisées et les moyens de mesure.
L'unité d'analyse comporte avantageusement des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de l'évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon, telle que :
- l'anisotropie de fluorescence résolue en temps de l'échantillon ;
- la corrélation de plusieurs signaux de fluorescence de l'échantillon détectés à différentes longueurs d'ondes ou l'évolution spectrale de la fluorescence de l'échantillon.
Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de criblage à haut débit utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps, le dispositif comportant :
- un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon d'une pluralité d'échantillons ;
- une unité de production et de manipulation de la pluralité d'échantillons capable d'apporter successivement chaque d'échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de fluorescence ;
- une unité de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation émises par la source lumineuse sur au moins une zone d'excitation de fluorescence de l'unité de production et de manipulation dans laquelle circule chaque échantillon ;
- une unité de collection et de filtrage des photons de fluorescence, et de couplage optique desdits photons de fluorescence avec le dispositif de mesure de fluorescence ;
- des moyens pour, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon, attribuer audit échantillon une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat.
Dans la présente description, on entend donc par « criblage » le fait de déterminer, pour chaque échantillon, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat, en fonction de la grandeur numérique calculée pour ledit échantillon par l'unité d'analyse du dispositif de mesure de fluorescence.
Le dispositif de criblage à haut débit emploie avantageusement une unité microfluidique de manipulation d'échantillons, les échantillons étant des gouttelettes ou des cellules biologiques. Une telle unité microfluidique permet en effet la formation d'échantillons sous la forme de microgouttelettes de très faible volume, et la manipulation précise de ces échantillons à une cadence très élevée.
Ainsi, une unité microfluidique pour la formation et la manipulation d'échantillons au sein d'un dispositif de criblage selon l'invention permet avantageusement d'exploiter les capacités de haut débit du dispositif de criblage selon l'invention de manière satisfaisante.
Dans le dispositif de criblage de l'invention, l'unité d'analyse en temps réel a avantageusement les moyens de :
- détecter le passage de chaque échantillon ;
- générer une distribution temporelle moyenne du signal de fluorescence d'une succession d'échantillons, et les grandeurs numériques caractéristiques de cette distribution ;
- générer une distribution temporelle du signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons et la moyenne glissante de ladite distribution temporelle. Le signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons est typiquement dû au fond de fluorescence de l'unité de manipulation des échantillons et/ou à la diffusion de la lumière d'excitation. En générant une distribution temporelle de ce signal de fluorescence « parasite » et la moyenne glissante de ladite distribution temporelle, on peut avantageusement corriger le résultat de la mesure de fluorescence de chaque échantillon.
L'unité de couplage optique et de focalisation comporte avantageusement une ou plusieurs optiques diffractives ou réfractives, conventionnelles ou intégrées.
L'unité de couplage optique et de focalisation du dispositif de criblage de l'invention assure notamment la mise en forme des impulsions lumineuses d'excitation issue de la source lumineuse, pour l'excitation efficace des échantillons dans au moins une zone spatialement définie de l'unité microfluidique de manipulation. Les impulsions lumineuses d'excitation peuvent être focalisées à l'aide d'éléments optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope, ou bien couplées à l'unité microfluidique par propagation guidée sur puce ou grâce à des optiques intégrées. La mise en forme spatiale des impulsions lumineuses d'excitation en une ligne ou plusieurs spots peut être réalisée par des optiques diffractives ou réfractives.
L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique du dispositif de criblage de l'invention permet la collection efficace des photons de fluorescence émis par les échantillons en une ou plusieurs zones d'excitation et le couplage vers le dispositif de mesure de fluorescence.
L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique du dispositif de criblage de l'invention permet également un filtrage des photons de fluorescence par rapport à d'autres photons issus du fond lumineux, afin de discriminer les photons de fluorescence de la molécule d'intérêt des autres photons issus du fond lumineux, et donc de limiter le nombre de ces photons issus du fond lumineux : photons d'excitation, luminescence du dispositif microfluidique lui-même, ou de tout composé autre que la molécule d'intérêt dans l'échantillon.
L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique pourra avantageusement comporter un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante :
- une ou plusieurs optiques conventionnelles ;
- une ou plusieurs optiques intégrées ;
- un ou plusieurs guides d'ondes intégrés ou non intégrés ;
- un moyen de filtrage des photons de fluorescence par rapport aux autres photons issus du fond lumineux.
L'unité de collection, de filtrage et de couplage optique permet avantageusement de résoudre en polarisation et/ou spectralement le signal de fluorescence collecté, et comporte un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante :
- un moyen de filtrage ou de résolution spectrale en longueur d'onde des photons de fluorescence ;
- un moyen de filtrage ou de résolution en polarisation des photons de fluorescence.
Ainsi, on peut avantageusement fournir une résolution spectrale et/ou en polarisation du signal de fluorescence de chaque échantillon. Avec une telle unité de collection, de filtrage et de couplage optique, le dispositif de criblage comportera avantageusement un dispositif de mesure de fluorescence au sein duquel l'unité de détection de photons uniques comprend plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend plusieurs moyens de mesure.
Selon une mise en œuvre avantageuse du dispositif de criblage de l'invention :
- au sein du dispositif de mesure de fluorescence, l'unité de détection de photons uniques comprend plusieurs détecteurs de photons uniques et l'unité de mesure comprend plusieurs moyens de mesure, chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques fonctionnant avec un moyen de mesure de l'unité de mesure ;
- l'unité microfluidique comporte une pluralité de canaux microfluidiques pour la manipulation en parallèle d'échantillons ;
- l'unité de couplage optique et de focalisation focalise les impulsions d'excitation sur au moins une zone spatialement définie de chaque canal microfluidique ; - l'unité de collection, de filtrage et de couplage optique permet de collecter, filtrer et coupler optiquement avec le dispositif de mesure de fluorescence les photons de fluorescence issus des échantillons circulant dans chaque canal microfluidique.
Ainsi, selon cette mise en œuvre « multicanal », le dispositif de criblage de l'invention permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en parallèle afin d'accroître le débit de criblage. De plus, pour un échantillon donné, plusieurs données de fluorescence résolue en temps pourront également être simultanément traitées, par exemple afin de fournir une résolution spectrale et/ou en polarisation du signal de fluorescence de chaque échantillon. Alternativement, un tel traitement simultané de plusieurs échantillons en parallèle pourra également être mis en œuvre en effectuant des mesures en plusieurs zones spatialement définies d'un unique canal. Selon une autre alternative, les trois solutions précédentes pourront être combinées, dans une mise en œuvre avec plusieurs canaux microfluidiques en parallèle, des mesures étant effectuées en plusieurs zones spatialement définies de chaque canal microfluidique.
Un autre aspect de l'invention concerne un dispositif de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons, utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps, et comportant :
- un dispositif de criblage utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps et comportant des moyens pour attribuer en temps réel à chaque échantillon de la pluralité d'échantillons une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat ;
des moyens pour réaliser une manipulation conditionnelle à haut débit desdits échantillons consécutive au résultat du criblage, en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon.
Il pourra s'agir de mettre en œuvre un traitement spécifique pour chaque échantillon, conditionné au résultat du criblage, comme par exemple :
- un tri : en fonction de son résultat de criblage, un échantillon peut être spécifiquement orienté au sein du dispositif microfluidique de manipulation. Par exemple, dans le cas d'un criblage binaire, des échantillons, circulant initialement dans un canal principal, seront orientés dans un premier sous- canal du canal principal si leur résultat de criblage est « positif », et dans un deuxième sous-canal du canal principal si leur résultat de criblage est « négatif ».
- une fusion conditionnelle : en fonction de leurs résultats de criblage, deux échantillons peuvent être fusionnés afin de mélanger leurs contenus. On obtient alors, à partir de deux échantillons initiaux, un unique échantillon fusionné.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le procédé comportant :
- une première étape, selon laquelle une source lumineuse émet une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence ;
- une deuxième étape, selon laquelle une unité de détection de photons uniques détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une troisième étape, selon laquelle une unité de mesure détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- une quatrième étape, selon laquelle une unité d'analyse traite en temps réel les données numériques issues de ladite unité de mesure et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon. La quatrième étape du procédé de mesure de fluorescence de l'invention pourra comprendre les sous-étapes suivantes :
- selon une première sous-étape, l'unité d'analyse compte le nombre de photons de fluorescence détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence détectés et construit ainsi un histogramme du nombre de photons de fluorescence détectés en fonction de leur temps d'arrivée ;
- selon une deuxième sous-étape, l'unité d'analyse calcule, à partir de l'histogramme construit lors de la première sous-étape, au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon, le procédé comportant :
- une première étape selon laquelle une source lumineuse émet une succession d'impulsions d'excitation pour l'excitation de l'échantillon de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence formant une émission de fluorescence ;
- une deuxième étape selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence ;
- une troisième étape selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques détecte au moins une partie des photons de fluorescence et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une quatrième étape selon laquelle un moyen de mesure de l'unité de mesure détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
une cinquième étape selon laquelle l'unité d'analyse traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure de l'unité de mesure et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon, et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre.
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons, le procédé comportant :
- une étape de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons afin d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation ;
- un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps, éventuellement multiparamètre, sur chaque échantillon par comptage de photons selon l'invention ;
- une étape de criblage à haut débit de la pluralité d'échantillons selon laquelle le passage de chaque échantillon dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon, on détermine et on archive pour chaque échantillon une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat.
Dans le procédé de criblage à haut débit du paragraphe précédent, le procédé de mesure de fluorescence implémenté mettra avantageusement en œuvre un dispositif de mesure de fluorescence comportant une unité d'analyse en temps réel permettant : - la détection du passage de chaque échantillon,
- l'accumulation et l'analyse des photons de fluorescence émis par plusieurs échantillons successifs,
- l'accumulation et l'analyse des photons de « fond » émis par l'ensemble du dispositif entre les échantillons successifs,
- la correction de la mesure de fluorescence TRF des échantillons par soustraction de la mesure de fluorescence TRF du « fond ».
Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons comportant :
- un procédé selon l'invention de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons avec une mesure de fluorescence, éventuellement multiparamètre, résolue en temps par comptage de photon ;
- une étape de tri à haut débit de la pluralité d'échantillons selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle de chaque échantillon en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon à l'issue du procédé de criblage selon l'invention.
L'invention et ses différentes applications seront mieux comprises à la lecture de la description qui suit et à l'examen des figures qui l'accompagnent.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Les figures sont présentées à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention.
- La figure 1 a montre schématiquement une première cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps d'un chromophore en solution, le chromophore n'ayant pas d'interaction avec une autre molécule, et une deuxième cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps du même chromophore en solution, le chromophore ayant une interaction avec une autre molécule.
- La figure 1 b montre des données de cinétique de décroissance de fluorescence résolue en temps typiquement obtenues par une technique de comptage TCSPC et formant un histogramme. - La figure 2a montre schématiquement un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps selon un mode de réalisation de l'invention.
- La figure 2b montre schématiquement un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.
- La figure 3a montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un mode de fonctionnement.
- La figure 3b montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un deuxième mode de fonctionnement.
- La figure 3c montre schématiquement un dispositif de criblage à haut débit selon un troisième mode de fonctionnement.
- La figure 4 montre schématiquement un dispositif de tri à haut débit d'échantillons.
- La figure 5a montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de mesure de fluorescence résolue en temps selon l'invention.
- La figure 5b montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de mesure de fluorescence multiparamètre résolue en temps selon l'invention.
- La figure 6 montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de criblage à haut débit selon l'invention.
- La figure 7 montre schématiquement l'organisation des étapes d'un procédé de tri à haut débit selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE D'AU MOINS UN MODE DE REALISATION DE L'INVENTION
Sauf précision contraire, un même élément apparaissant sur des figures différentes présente une référence unique.
L'invention concerne un dispositif de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques pour le criblage ou le tri à haut débit d'échantillons. Dans la présente description, on entend par « criblage » le fait de déterminer puis archiver, pour chaque échantillon parmi une pluralité d'échantillons, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat. A titre d'exemple, un tel criblage peut notamment être réalisé par une technique de cytométrie en flux, qui permet de faire défiler une pluralité d'échantillons dans le faisceau d'un laser, en comptant et en caractérisant chaque échantillon. On entend par « tri » le fait d'utiliser le résultat d'une opération de criblage, c'est-à-dire la classe de résultat déterminée pour chaque échantillon parmi une pluralité d'échantillons, pour réaliser une opération de manipulation conditionnelle de chaque échantillon. A titre d'exemple, un tel tri peut notamment être réalisé par une technique de tri cellulaire FACS (de l'anglais « Fluorescence Activated Cell Sorting »). Chaque échantillon comprend typiquement au moins un fluorophore en solution ou une cellule biologique marquée d'au moins un chromophore. Dans la présente description, on entend par « haut débit » un débit pouvant atteindre une fréquence de l'ordre de 1 KHz. Le dispositif de l'invention permet donc typiquement de cribler jusqu'à 1000 échantillons par seconde.
Avec une méthode de comptage de photons uniques corrélés dans le temps TCSPC, les photons sont détectés un par un : de nombreux événements de détection sont donc nécessaires pour construire un signal de détection de fluorescence résolue en temps TRF d' un échantillon donné. Le débit de détection, donc de criblage, est ainsi limité par le taux d'acquisition des événements de détection. Le dispositif de l'invention doit donc permettre un taux d'acquisition des événements de détection le plus grand possible, tout en assurant le traitement « à la volée », en temps réel, des données de détection desdits événements de détection. L'expression « traitement en temps réel des données numériques » est explicitée ci-après. On considère l'exemple de deux échantillons consécutifs, passant et résidant successivement dans une zone de mesure de fluorescence TRF sans qu'aucun autre échantillon ne se trouve entre eux. Les deux échantillons sont séparés par un intervalle de temps qui définit la fréquence de mesure de fluorescence TRF. Pendant son passage dans la zone de mesure, le premier échantillon est successivement excité par une pluralité d'impulsions d'excitation et le premier échantillon émet ainsi plusieurs photons de fluorescence en se désexcitant. Au moins une partie de ces photons de fluorescence est détectée, chaque photon de fluorescence détecté ayant un signal de détection et une donnée numérique caractéristique de ce signal de détection. Dans la présente description, on entend par « analyse en temps réel des données numériques » le fait que les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées dans un intervalle de temps inférieur ou égal à l'intervalle de temps entre les premier et deuxième échantillons. Autrement dit, les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du premier échantillon sont traitées par l'unité d'analyse avant que ne lui parviennent les données numériques de détection des photons de fluorescence issus du deuxième échantillon. On emploiera indifféremment dans la présente description les termes « en temps réel » et « à la volée ». Une telle analyse à la volée des données numériques de chaque échantillon est permise par une détection à la volée du passage de chaque échantillon dans la zone de mesure. Les diodes à avalanche à photon unique SPAD (de l'anglais « Single Photon Avalanche Diodes »), ou photodiodes à avalanche polarisées en mode Geiger, sont des photodétecteurs ultra-sensibles, capables de détecter un photon unique. Bien que cette technique soit connue depuis les années 1970, les premiers travaux décrivant l'intégration réussie d'une photodiode à avalanche polarisée en mode Geiger dans un procédé CMOS standard datent seulement de la dernière décennie. La première matrice de système de comptage TCSPC complètement intégrée, notée ITCSPC pour « Integrated Time-Correlated Single Photon Counting », a été réalisée en 2008. La plupart des systèmes ITCSPC sont des matrices à deux dimensions et présentent une résolution temporelle de l'ordre de 100 ps FWHM (de l'anglais « Full Width at Half Maximum », largeur à mi-hauteur) et une efficacité quantique de détection de photon de plus de 25% pour les longueurs d'onde comprises entre 500 nm et 600 nm. Dans ces dispositifs, le taux de comptage associé au bruit d'obscurité DCR (de l'anglais « Dark Count Rate ») est généralement de l'ordre du kHz mais peut être réduit à quelques Hz par μιη2 en refroidissant le système. Le bruit d'obscurité DCR correspond au nombre d'événements uniques « détectés » par un photodétecteur, bien que le photodétecteur se trouve dans l'obscurité totale. Grâce à ces performances, des dispositifs de microscopie de fluorescence résolue en temps avec des matrices 2D de diodes SPAD ont d'ores et déjà été mis en œuvre avec succès. Néanmoins, les systèmes 2D sont limités par leur architecture et leur mode d'action, en raison de contraintes spatiales. Par exemple, l'utilisation d'une technique d'obturation réduit la sensibilité. L'invention propose donc d'utiliser avantageusement un système avec un spot unique, ou un système « multi-spot » avec un nombre de spots réduit comme un système ITCSPC avec une matrice à une seule dimension, ce qui permet d'atteindre les limites physiques de la technologie en s'affranchissant des contraintes liées à une matrice à deux dimensions. Une matrice 1 D constitue ainsi le design le plus adapté pour la présente application afin d'obtenir la meilleure sensibilité possible.
La figure 2a montre un dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps selon un mode de réalisation de l'invention.
Le dispositif 100 met en œuvre :
- une unité SPDet de détection de photons uniques ;
- une unité M de mesure comportant un moyen de mesure TDC et une unité Trig de déclenchement ;
- une unité RTA d'analyse en temps réel.
Le dispositif 100 fonctionne avantageusement avec les éléments suivants, qui seront détaillés ultérieurement :
- une source lumineuse LS d'excitation qui émet des impulsions d'excitation LP ;
- une unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers un échantillon μϋ, pour l'excitation dudit échantillon μϋ de manière que ledit échantillon μϋ émette une pluralité de photons de fluorescence F ;
- une unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique des photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps.
L'unité SPDet de détection de photons uniques est un système permettant de détecter un photon unique, en tant qu'événement unique. Chaque photon détecté est donc détecté de manière individuelle. L'unité SPDet de détection de photons uniques génère un signal de détection dès qu'elle détecte un photon. Il y a ainsi autant de signaux de détection distincts que de photons uniques détectés. L'unité SPDet de détection de photons uniques comprend notamment une partie photosensible, qui est le détecteur proprement dit. Ce détecteur peut par exemple être choisi parmi la liste suivante :
- une diode à avalanche ou une matrice de diodes à avalanche ;
- une diode à avalanche à photon unique SPAD (de l'anglais « single-photon avalanche diode ») ou une matrice de diodes à avalanche à photon unique ;
- un photomultiplicateur silicium ;
- un tube photomultiplicateur ou une matrice de tubes photomultiplicateurs ;
- un tube photomultiplicateur hybride ou une matrice de tubes photomultiplicateurs hybrides ;
- un nanofil supraconducteur ;
- un tube photomultiplicateur à galette de micro-canaux ou une matrice de tubes photomultiplicateurs à galette de micro-canaux.
L'unité SPDet de détection de photons uniques comprend également un module électronique afin de polariser le détecteur photosensible, mettre en forme le signal analogique délivré par le détecteur photosensible et générer en sortie le signal de détection.
Dans le mode de réalisation illustré à la figure 2a, l'unité SPDet comporte un seul détecteur de photons uniques. Néanmoins, selon un autre mode de réalisation qui sera décrit ultérieurement, l'unité SPDet peut comporter plusieurs détecteurs de photons uniques, éventuellement intégrés sur une même puce électronique.
L'unité de mesure M est un système qui mesure le temps écoulé entre l'impulsion LP d'excitation et le signal de détection. L'unité de mesure M comporte typiquement un moyen de mesure TDC et une unité de déclenchement Trig.
Le moyen de mesure TDC est avantageusement un convertisseur temps- numérique. Après avoir mesuré le temps écoulé entre l'impulsion LP d'excitation et le signal de détection, le convertisseur temps-numérique génère en sortie une valeur numérique caractéristique de ce temps écoulé. L'ordre de grandeur de cette valeur numérique est typiquement compris entre quelques picosecondes et quelques nanosecondes. Par rapport à une unité de mesure analogique, ou à une unité de mesure numérique avec un très fort taux d'échantillonnage, l'unité de mesure M avec le moyen de mesure TDC autorise une très grande diminution et optimisation de la quantité de données générées pour chaque événement de détection, et qui doivent ensuite être stockées et/ou envoyées à l'unité RTA d'analyse et traitées par ladite unité RTA d'analyse. L'unité de mesure M mise en œuvre dans un dispositif de criblage selon l'invention permet en effet de mesurer l'intervalle de temps entre chaque signal de détection et son impulsion LP d'excitation : c'est donc une mesure de temps relative entre deux événements, plutôt qu'une mesure d'un temps « absolu ». Ce faisant, l'unité de mesure M mise en œuvre dans un dispositif de criblage selon l'invention permet d'éviter une génération, un stockage et un traitement énormes de données inutiles. La dynamique du convertisseur temps-numérique peut être réduite à quelques bits, jusqu'à moins de 4 ou 5 bits par exemple. Néanmoins un convertisseur temps- numérique avec une dynamique importante, jusqu'à plus de 32 bits, peut également être utilisé. Le temps de conversion du convertisseur temps-numérique doit être maintenu aussi faible que possible, de l'ordre de quelques nanosecondes, afin de réduire le temps mort pour l'ensemble du système de détection. Le moyen de mesure TDC mis en œuvre par l'unité de mesure M peut par exemple être :
- un ou plusieurs convertisseurs temps-amplitude ;
- un ou plusieurs compteurs numériques rapides ;
- un ou plusieurs convertisseurs temps-numérique utilisant une ligne à retard ;
- un ou plusieurs des éléments listés ci-dessus.
L'unité de mesure M pourra être intégrée avec l'unité SPDet sur une même puce électronique.
L'unité Trig de déclenchement permet d'assurer un mode de fonctionnement synchrone entre le moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M et la source lumineuse LS d'excitation. Deux modes de fonctionnement sont possibles pour l'unité Trig de déclenchement. Selon un premier mode de fonctionnement, l'unité Trig de déclenchement génère simultanément :
- un premier signal de déclenchement vers la source lumineuse LS pour ordonner l'émission d'une impulsion lumineuse, et
- un deuxième signal de déclenchement vers le moyen de mesure TDC. Selon ce premier mode de fonctionnement, le taux de répétition de la source lumineuse LS est fixé par l'unité Trig de déclenchement.
Selon un deuxième mode de fonctionnement, le taux de répétition des impulsions LP émises par la source lumineuse LS est déterminé par la source lumineuse LS elle-même, en fonction de ses caractéristiques intrinsèques, et une partie du faisceau lumineux est dirigée vers l'unité Trig de déclenchement. Pour chaque impulsion lumineuse LP émise, l'unité Trig de déclenchement détecte donc une partie de ladite impulsion lumineuse LP et génère le deuxième signal de déclenchement vers le moyen de mesure TDC. L'unité Trig de déclenchement peut être un discriminateur à fraction constante comportant une photodiode.
L'unité RTA d'analyse permet le traitement à la volée des données issues du moyen de mesure TDC afin de calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré. Cette grandeur numérique peut par exemple être :
- au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon. Dans le cas d'une analyse supposant une décroissance exponentielle de fluorescence, une seule constante de temps de décroissance de fluorescence sera calculée. Dans le cas d'une analyse supposant une cinétique multi-exponentielle ou non-exponentielle de fluorescence, plusieurs constantes de temps caractéristiques pourront être calculées ;
- au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon. Le moment d'ordre 1 , c'est-à-dire la valeur moyenne des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon, et/ou le moment d'ordre 2, c'est-à-dire l'écart quadratique moyen des temps d'arrivée des photons de fluorescence de l'échantillon, pourront notamment être calculés.
Parallèlement à une ou plusieurs grandeurs, préférentiellement choisies dans la liste ci-dessus, caractérisant la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon, au moins une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon, comme le nombre total de photons détectés, pourra également être calculée par l'unité RTA d'analyse.
L'unité RTA d'analyse peut par exemple réaliser une étape préliminaire de comptage du nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence F détectés, et construire ainsi un histogramme du nombre de photons détectés en fonction du temps d'arrivée des photons détectés. L'unité RTA d'analyse calcule alors, à partir de l'histogramme précédemment construit, une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré. Cette étape de comptage préliminaire est facultative : elle peut être réalisée ou non, en fonction de l'algorithme d'analyse choisi pour le calcul de ladite grandeur numérique. L'algorithme d'analyse peut notamment être implémenté :
sur puce (« on chip »), de manière intégrée : dans ce cas, l'unité RTA d'analyse, qui comprend la logique et l'intelligence de traitement, est intégrée sur le même circuit électronique que l'unité SPDet de détection et/ou l'unité de mesure M ;
- de manière externe, sur des circuits intégrés spécifiques ;
- à l'aide de composants numériques programmables, tel qu'un processeur ou un dispositif reconfigurable, par exemple un FPGA.
L'algorithme d'analyse de l'unité RTA d'analyse est avantageusement choisi parmi la liste suivante :
- un algorithme régressif de minimisation de l'erreur résiduelle ;
- un calcul direct ;
- un algorithme d'ajustement ;
- un algorithme de reconnaissance utilisant un réseau de neurones ;
- un algorithme basé sur une table de conversion. En résumé, l'unité RTA d'analyse pourra donc présenter l'un, l'autre ou les deux types de résultat suivants :
- l'histogramme de mesure d'un échantillon μϋ non traité ou éventuellement filtré numériquement ;
- l'évaluation d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré, et éventuellement d'une grandeur caractéristique de l'intensité de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré. On revient à présent sur la description de la source lumineuse LS d'excitation, de l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, et de l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique, fonctionnant avec le dispositif 1 00 de mesure de fluorescence résolue en temps.
La source lumineuse LS d'excitation est une source laser émettant des impulsions lumineuses LP ultra-courtes à un taux élevé de répétition. Dans la présente description, on entend par « impulsions ultra-courtes » des impulsions dont la durée appartient à l'intervalle compris entre quelques femtosecondes et plusieurs centaines de picosecondes, et on entend par « taux élevé de répétition » un taux de répétition supérieur à quelques centaines de kHz. La longueur d'onde d'émission de la source lumineuse LS est choisie ou accordée en fonction du type de fluorophore contenu dans chaque échantillon μϋ. La longueur d'onde d'émission de la source lumineuse LS est typiquement comprise entre 200 nm et 1 500 nm. La source peut être utilisée pour exciter la fluorescence des échantillons par un processus d'absorption linéaire ou multiphotonique. La source lumineuse LS peut en particulier être choisie parmi la liste suivante :
- un laser femtoseconde ou un laser picoseconde - par exemple un laser titane-saphire, un laser à colorant ou un laser à fibre - générant des impulsions lumineuses avec une largeur à mi-hauteur FWHM typiquement inférieure ou égale à 2 ps, à un taux de répétition typiquement ajustable, pouvant aller jusqu'à quelques centaines de MHz, et avec une puissance moyenne typiquement supérieure à quelques centaines de mW ;
- une source optique non-linéaire telle qu'un oscillateur paramétrique optique (OPO) ou toute autre source utilisant par exemple la génération de seconde, troisième ou quatrième harmonique afin de fournir, par exemple à partir des sources lasers mentionnées au point précédent, une accordabilité en longueur d'onde allant de l'ultraviolet à l'infrarouge ;
- une diode laser fonctionnant en mode impulsionnel déclenché, également appelé « Q-switch », générant des impulsions lumineuses avec une largeur à mi-hauteur FWHM typiquement comprises entre 10 ps et 200 ps, à un taux de répétition réglable allant de quelques Hz à plus de 100 MHz, et avec une puissance moyenne typiquement de l'ordre de 1 mW. Il est également envisageable de mettre en œuvre une pluralité de diodes laser présentant des longueurs d'ondes d'émission variées afin de permettre une accordabilité en longueur d'onde. La puissance moyenne d'un tel système est typiquement de l'ordre de quelques mW ;
- une source lumineuse étendue, également appelée source lumineuse à supercontinuum, peut être utilisée afin de contribuer à obtenir une source laser puisée et accordable en longueur d'onde dans un large domaine de longueurs d'onde.
Les impulsions lumineuses LP sont dirigées vers l'unité Foc de mise en forme spatiale, couplage optique et de focalisation.
L'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation contribue à assurer une excitation efficace de chaque échantillon μϋ par une impulsion lumineuse LP, émise par la source lumineuse LS. Les impulsions lumineuses LP peuvent se propager librement dans l'espace ou être couplées dans une ou plusieurs fibres, comme dans le cas de diodes laser multiples, ou de multiples spots d'excitation. Les impulsions lumineuses LP d'excitation peuvent être mises en œuvre dans de multiples lignes ou spots d'excitation. Il est ainsi possible d'employer avantageusement de l'optique diffractive, comme détaillé ultérieurement. Les impulsions lumineuses LP d'excitation peuvent être focalisées à l'aide d'éléments optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope, ou bien des éléments d'optique à symétrie cylindrique pour la génération de lignes d'excitation, ou couplées par propagation guidée ou grâce à une optique intégrée. Chaque impulsion lumineuse LP est donc focalisée, en sortie de l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, sur un échantillon μϋ pour l'excitation dudit échantillon μϋ. Lorsqu'il est excité par une impulsion lumineuse LP, l'échantillon μϋ se désexcite en émettant un ou plusieurs photons de fluorescence F par impulsion lumineuse LP excitatrice. Chaque échantillon μϋ est excité N fois, N étant typiquement compris entre plusieurs milliers et plusieurs centaines de milliers. Chaque échantillon μϋ se désexcitera alors N fois et émettra, au cours de ces N désexcitations, un ou plusieurs photons de fluorescence dont au maximum N seront détectés par l'unité de détection.
L'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique contribue à assurer une collection efficace des photons de fluorescence F émis lors des désexcitations successives de l'échantillon μϋ. Par « collection efficace », on entend qu'au mieux quelques pourcents des photons émis sont collectés et couplés vers l'unité SPDet de détection. Cette collection peut être réalisée à l'aide d'éléments optiques intégrés, ou par propagation guidée, ou à l'aide d'éléments d'optiques conventionnels, comme des objectifs de microscope. Dans ce dernier cas, l'objectif de microscope peut être identique à celui potentiellement utilisé dans l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation, dans la mesure où on utilise un miroir dichroïque afin de réfléchir la lumière d'excitation, c'est-à-dire les impulsions lumineuses LP, et de transmettre la lumière de fluorescence, c'est-à-dire les photons de fluorescence F. La lumière de fluorescence peut être ensuite filtrée grâce à des filtres passe-bandes ou à un polariseur. Un tel filtrage permet avantageusement de ne collecter que des photons de fluorescence F en rejetant d'autres photons issus du fond lumineux : photons d'excitation, photons de luminescence d'une unité de manipulation des échantillons μϋ, ou de tout composé autre qu'un fluorophore d'intérêt d'un échantillon μϋ. Le signal de fluorescence collecté et filtré se propage librement dans l'espace, ou bien dans une fibre. Il est ensuite couplé à un détecteur de photons uniques de l'unité SPDet de détection.
La figure 2b montre un dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps selon un deuxième mode de réalisation de l'invention.
Selon ce deuxième mode de réalisation de l'invention, l'unité SPDet de détection de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, par exemple disposés selon une matrice à une dimension. Le dispositif 101 selon le deuxième mode de réalisation de l'invention comporte donc plusieurs canaux de détection de photons uniques.
Ce deuxième mode de réalisation permet avantageusement de réaliser une ou plusieurs des opérations suivantes :
- augmenter le taux de comptage pour la mesure d'un signal de fluorescence. En augmentant le nombre de canaux de détection, on peut en effet compter plusieurs photons de fluorescence par impulsion d'excitation, si lesdits photons de fluorescence tombent sur des canaux de détection différents ;
- optimiser, dans la mesure d'un signal de fluorescence, la sensibilité de détection par rapport au bruit d'obscurité DCR ;
- recueillir simultanément plusieurs signaux de fluorescence issus de plusieurs échantillons. Ce cas sera détaillé ultérieurement ;
- permettre, pour un signal de fluorescence issu d'un seul échantillon, une résolution dite « multiparamètre », c'est-à-dire une résolution à la fois temporelle et suivant au moins un autre paramètre.
Dans ce dernier cas de résolution multiparamètre, le signal de fluorescence peut notamment être résolu :
- spectralement, grâce à un spectromètre employant par exemple un réseau de diffraction ou un prisme, ou alternativement grâce à des filtres passe- bandes ou des miroirs dichroïques ;
- en polarisation, grâce à un élément optique séparateur de polarisation ;
- en direction de propagation.
Le signal de fluorescence résolu selon plusieurs paramètres est alors divisé en une pluralité de faisceaux :
- de longueurs d'onde différentes dans le cas d'une résolution spectrale ;
- de polarisations différentes dans le cas d'une résolution en polarisation ;
- de directions de propagation différentes dans le cas d'une résolution en direction de propagation.
Chaque faisceau se propage librement dans l'espace, ou bien est couplé dans une fibre. Chaque faisceau est finalement couplé à un ou plusieurs détecteurs de photons uniques de l'unité SPDet de détection.
Dans ce cas de résolution multiparamètre, l'unité d'analyse RTA pourra produire une analyse dite « multiparamètre » reposant sur une mesure d'au moins deux signaux de fluorescence, telle que :
- une mesure résolue en temps d'anisotropie de fluorescence qui repose sur la résolution en polarisation ;
- une mesure résolue en temps de décalages spectraux d'émission, qui repose sur la résolution spectrale ;
- une mesure de corrélation d'au moins deux signaux de fluorescence détectés à des longueurs d'onde différentes.
L'unité d'analyse RTA pourra fournir en temps réel une ou plusieurs constantes numériques caractérisant la cinétique d'évolution temporelle de tout signal résultant d'une analyse multiparamètre de la fluorescence.
Selon le deuxième mode de réalisation où l'unité de détection de photons uniques comporte plusieurs détecteurs de photons uniques, l'unité M de mesure pourra comporter un seul moyen de mesure TDC, ou alternativement plusieurs moyens de mesure TDC et par exemple autant de moyens de mesure TDC que de détecteurs de photons uniques. L'unité d'analyse RTA pourra analyser en parallèle de multiples signaux de fluorescence. Les détecteurs de photons uniques, le ou les moyens de mesure TDC et l'unité d'analyse pourront être intégrés sur une ou plusieurs puces électroniques.
La figure 3a montre un dispositif 200 de criblage à haut débit selon un mode de fonctionnement.
Le dispositif 200 de criblage comporte :
- le dispositif 1 00 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2a ;
- la source lumineuse LS d'excitation émettant les impulsions d'excitation LP ;
- une unité microfluidique comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit d'une pluralité d'échantillons μϋ ;
- l'unité Foc, décrite ci-dessus, de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie, dite « zone d'excitation », du canal microfluidique Ch, pour l'excitation de chaque échantillon μϋ lors de son passage dans ladite zone d'excitation, de manière que ledit échantillon μϋ émette une pluralité de photons de fluorescence F ;
- l'unité Fil, décrite ci-dessus, de collection, de filtrage et de couplage optique des photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps.
- des moyens pour attribuer à chaque échantillon μϋ une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat, c'est-à-dire pour déterminer une appartenance de l'échantillon μϋ considéré à un groupe spécifique. Lesdits moyens d'attribution sont par exemple implémentés dans l'unité RTA d'analyse. Le résultat de l'ensemble de l'opération de criblage est de construire une base de données archivant le résultat d'analyse obtenu pour chaque échantillon.
L'unité RTA d'analyse du dispositif 100 de mesure de fluorescence permet le calcul, pour chaque échantillon μϋ traité, d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence dudit échantillon μϋ.
Pour être capable de réaliser une analyse échantillon par échantillon « à la volée », l'unité RTA d'analyse devra inclure une détection en temps réel du passage de chaque échantillon μϋ dans la zone d'excitation du canal microfluidique Ch. Le critère de détection des échantillons μϋ est fixé à l'avance ou peut évoluer en fonction des données accumulées. Ce critère peut par exemple porter sur le nombre de photons uniques détectés sur une fenêtre temporelle courte, par exemple 10 microsecondes, devant le temps de passage total de l'échantillon μϋ dans la zone d'excitation, qui est typiquement de l'ordre de 1 ms ou plus. De plus, l'algorithme d'analyse de l'unité RTA d'analyse pourra :
- calculer et renvoyer des données complémentaires sur la dimension des échantillons μϋ, sur l'espacement entre deux échantillons μϋ consécutifs ou sur la vitesse des échantillons μϋ, avec des informations statistiques, ceci par exemple afin de permettre un contrôle de la qualité des échantillons μϋ, ou de détecter une éventuelle fuite ou défaillance de l'unité microfluidique μΡΟ ;
- accumuler les signaux de fluorescence de plusieurs échantillons μϋ successifs identiques et générer l'évaluation d'une ou plusieurs grandeurs numériques caractéristiques de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'ensemble de ces échantillons μϋ identiques, de manière à réduire l'incertitude statistique sur ladite évaluation ;
- accumuler le signal de fluorescence résolue en temps détecté entre les échantillons μϋ, et qui constitue le « fond » lumineux émis par l'ensemble du dispositif en présence d'impulsions lumineuses d'excitation LP, puis retrancher ce signal de fluorescence de fond au signal de fluorescence détecté dans les échantillons μϋ.
Dans la présente description, on entend par « criblage » le fait de déterminer, pour chaque échantillon ou groupe d'échantillons identiques μϋ, une classe de résultat parmi une pluralité prédéterminée de classes de résultat, en fonction de la grandeur numérique calculée pour ledit échantillon ou groupe d'échantillons identiques μϋ par l'unité d'analyse RTA du dispositif 100 de mesure de fluorescence.
Le criblage pourra notamment être binaire : dans ce cas, deux classes de résultat seront possibles :
- une classe de résultat « haute », « positive », par exemple « 1 » ;
- ou une classe de résultat « basse », « négative », par exemple « 0 ».
Néanmoins, d'autres types de criblage sont tout à fait envisageables, par exemple avec trois classes de résultat ou plus.
Le dispositif 200 de criblage à haut débit emploie avantageusement une unité microfluidique μΡΟ de manipulation d'échantillons μϋ. Une telle unité microfluidique μΡΟ permet en effet la formation d'échantillons μϋ sous la forme de microgouttelettes de très faible volume, et la manipulation précise de ces échantillons à une cadence très élevée. On parvient notamment grâce à de telles unités microfluidiques μΡΟ à former des échantillons dont le volume est inférieur au nanolitre, ce qui représente une diminution de plus de quatre ordres de grandeur par rapport aux échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. De tels échantillons microfluidiques μϋ peuvent en outre être produits et manipulés à une fréquence de l'ordre du KHz ou plus, soit trois ordres de grandeur plus vite que des échantillons de type micro-puits sur micro-plaques. Les échantillons μϋ pourront être des gouttelettes ou des cellules biologiques éventuellement contenues dans des gouttelettes à raison d'une ou plusieurs cellules biologiques par gouttelette. Dans la présente description, on emploie indifféremment les termes « cellules biologiques » et « cellules vivantes ». Les avantages de l'unité microfluidique μΡΟ de manipulation d'échantillons μϋ ont été précédemment décrits. Toutefois, d'une manière générale, toute unité de manipulation d'échantillons, microfluidique ou non microfluidique, peut être utilisée. Autrement dit, toute unité de manipulation d'échantillons permettant effectivement de faire défiler une pluralité d'échantillons dans une zone de mesure peut être utilisée. A titre d'exemples, des solutions de type « tapis roulant » ou de type « micro-puits sur micro-plaques » peuvent donc être utilisées.
La figure 3b montre un dispositif 201 de criblage à haut débit selon un deuxième mode de fonctionnement, dit « multicanal », dans lequel on effectue le criblage simultané en parallèle d'échantillons circulant dans une pluralité de canaux microfluidiques.
Le dispositif 201 comporte dans l'exemple représenté à la figure 3b :
- le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2b ;
- la source lumineuse LS ;
- un système microfluidique μΡΟ comportant un premier canal microfluidique Ch1 pour la circulation à haut débit de premiers échantillons μϋ1 et un deuxième canal microfluidique Ch2 pour la circulation à haut débit de deuxièmes échantillons μϋ2 ;
- l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers :
o une zone spatialement définie du premier canal microfluidique Ch1 pour l'excitation de chaque premier échantillon μϋ1 lors de son passage dans ladite zone spatialement définie du premier canal microfluidique Ch1 , de manière que ledit premier échantillon μϋ1 émette une pluralité de premiers photons de fluorescence F1 , o et vers une zone spatialement définie du deuxième canal microfluidique Ch2 pour l'excitation de chaque deuxième échantillon μϋ2 lors de son passage dans ladite zone spatialement définie du deuxième canal microfluidique Ch2, de manière que ledit deuxième échantillon μϋ2 émette une pluralité de deuxièmes photons de fluorescence F2 ;
- l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique des premiers photons de fluorescence F1 et des deuxièmes photons de fluorescence F2 vers le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps.
Les deux zones spatialement définies des premier et deuxième canaux microfluidiques Ch1 et Ch2, également appelées « zones d'excitations » ou « spots d'excitation », sont par exemple obtenues, à partir de l'unité Foc de couplage optique et de focalisation, grâce à des moyens optiques décrits ci- dessus d'optique conventionnelle, réfractive, réflective, intégrée ou non. En particulier, la lumière excitatrice pourra être mise en forme spatialement selon une ligne continue de lumière excitatrice, ou une collection de points de focalisation, dont l'intersection avec les différents canaux microfluidiques constitue les zones d'excitation.
Au sein de l'unité SPDet de détection de photons uniques du dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps, chaque émission de fluorescence est alors détectée par un ou plusieurs détecteurs de photons uniques, chaque détecteur de photons uniques étant équipé de son propre moyen de mesure TDC au sein de l'unité de mesure M, et de son propre moyen d'analyse au sein de l'unité RTA d'analyse.
On a décrit à titre d'exemple le cas particulier où le dispositif 201 met en œuvre deux canaux microfluidiques. Le dispositif 201 pourra plus généralement, et sur le même principe, comporter une pluralité de canaux microfluidiques pour la circulation, la détection et l'analyse en parallèle d'une pluralité d'échantillons.
Le dispositif 201 permet donc avantageusement d'accroître le débit de manipulation et de criblage des échantillons.
On a décrit précédemment le deuxième mode de fonctionnement du dispositif de criblage 201 , présentant plusieurs points de focalisation en parallèle. Une autre configuration possible est celle d'un dispositif de criblage, non illustré, présentant plusieurs zones d'excitation en série le long d'un même canal microfluidique. Cette configuration implique plusieurs unités Fil en série, collectant, filtrant et couplant les divers signaux de fluorescence vers un dispositif de mesure de fluorescence 101 capable de détecter et analyser en parallèle ces différents signaux de fluorescence. Cette configuration autorise avantageusement un suivi de l'évolution de chaque échantillon μϋ au cours de son déplacement dans le système microfluidique μΡΰ, et donc au cours du temps. On pourra ainsi étudier une cinétique de réaction biochimique au sein des échantillons, ou réaliser, selon une variante décrite ultérieurement, plusieurs étapes de tri successives sur les échantillons.
On note également que les deux configurations précédemment décrites peuvent tout à fait être combinées dans une troisième configuration avec plusieurs points de focalisation/collection/détection/analyse en série et plusieurs points de focalisation/collection/détection/analyse en parallèle. Ce dernier type de fonctionnement pourrait nécessiter la conception de matrices bidimensionnelles de détecteurs de photons uniques/moyens de mesure TDC/unités d'analyse RTA afin de satisfaire des contraintes d'espace accrues. La figure 3c montre un dispositif 202 de criblage à haut débit selon un troisième mode de fonctionnement permettant le criblage d'un échantillon μϋ à partir d'une mesure de fluorescence résolue à la fois en temps, et selon un autre paramètre, comme par exemple la longueur d'onde (résolution spectrale), la polarisation ou la direction de propagation.
Pour ce faire, le dispositif 202 comporte :
- le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps illustré à la figure 2b ;
- la source lumineuse LS ;
- le système microfluidique μΡΟ comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit de la pluralité d'échantillons μϋ ;
- l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie du canal microfluidique Ch ;
- une unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique de la pluralité de photons de fluorescence F vers le dispositif 101 de mesure de fluorescence résolue en temps, ladite unité permettant spécifiquement de résoudre spectralement, en polarisation ou en direction de propagation, la fluorescence collectée, selon la description ci-dessus.
Selon une variante, les deuxième et troisième modes de fonctionnement, respectivement illustrées aux figures 3b et 3c, pourront être combinés afin de mettre en œuvre un dispositif de criblage permettant un criblage en parallèle de plusieurs échantillons et, pour chaque échantillon criblé, l'obtention d'une résolution temporelle et d'une résolution selon un autre paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation des photons de fluorescence dudit échantillon.
On notera que pour des échantillons μϋ circulant dans l'unité microfluidique μΡΰ à une fréquence de 1 KHz, le temps de passage de chaque échantillon μϋ dans la zone d'excitation et de détection spatialement définie du canal microfluidique Ch, sera d'environ 1 ms. Pour une source lumineuse LS émettant des impulsions lumineuses LP avec une fréquence de répétition de 50 MHz, chaque échantillon μϋ sera excité 50000 fois au cours de son passage de 1 ms dans le spot de focalisation laser. Avec une telle fréquence de répétition, il y a 20 ns entre deux impulsions lumineuses LP consécutives. Le dispositif de mesure de fluorescence dispose donc, dans le cas particulier où la fréquence de répétition est de 50 MHz, de 20 ns au maximum pour que :
- l'unité de détection SPDet détecte un photon de fluorescence F,
- l'unité de mesure M mesure le temps d'arrivée du photon de fluorescence F et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- l'unité d'analyse RTA reçoive la donnée numérique et mette à jour, le cas échéant, l'histogramme du nombre de photons détectés en fonction du temps d'arrivée des photons détectés.
Le dispositif de mesure de fluorescence dispose ensuite d'environ 1 ms pour que l'unité d'analyse RTA effectue le calcul d'au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré.
De même, le dispositif de criblage dispose d'environ 1 ms pour réaliser effectivement le criblage, c'est-à-dire :
- effectuer le calcul d'au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ considéré, et
- prendre une décision sur la nature de l'échantillon μϋ en lui attribuant une classe de résultat, parmi une pluralité de classes de résultat possibles.
La figure 4 montre un dispositif 300 de tri à haut débit d'échantillons. Le dispositif 300 de tri comporte :
- le dispositif 100 de mesure de fluorescence illustré à la figure 2a.
Alternativement, le dispositif 300 de tri peut également comporter le dispositif 1 01 de mesure de fluorescence illustré à la figure 2b ;
- la source lumineuse LS ;
- un système microfluidique μΡΟ comportant un canal microfluidique Ch pour la circulation à haut débit de la pluralité d'échantillons μϋ, le canal microfluidique Ch se divisant en un premier sous-canal sCh1 et en un deuxième sous-canal sCh2 ;
- l'unité Foc de mise en forme spatiale, de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation LP vers une zone spatialement définie du canal microfluidique Ch ;
- l'unité Fil de collection, de filtrage et de couplage optique de la pluralité de photons de fluorescence F vers le dispositif 100 de mesure de fluorescence résolue en temps ;
- des moyens Manip pour réaliser une manipulation à haut débit des échantillons μϋ en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon μϋ.
La manipulation à haut débit réalisée par les moyens Manip peut être :
- un tri physique mettant en œuvre un champ électrique ou des tirs lasers.
Chaque échantillon μϋ est alors orienté soit dans le premier sous-canal sCh1 , soit dans le deuxième sous-canal sCh2, en fonction de son résultat de criblage ;
- toute autre manipulation de l'échantillon μϋ conditionnée au résultat de la mesure de fluorescence TRF fourni par les dispositifs 100 ou 101 de mesure de fluorescence TRF, respectivement illustrés aux figure 2a et 2b. Par exemple, un premier échantillon μϋ peut être fusionné avec un deuxième échantillon μϋ, afin de générer le mélange des deux échantillons et le démarrage d'une réaction biomoléculaire nouvelle, conditionnée au résultat de la mesure de fluorescence TRF.
Selon une alternative (non illustrée à la figure 4), le premier sous-canal sCh1 peut comporter une subdivision et/ou le deuxième sous-canal sCh2 peut comporter une subdivision, afin de permettre un deuxième niveau de tri.
La figure 5 montre l'organisation des étapes d'un procédé 500 selon l'invention de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon μϋ. Le procédé 500 comporte :
- une première étape 501 selon laquelle la source lumineuse LS émet une succession d'impulsions d'excitation LP pour l'excitation de l'échantillon μϋ de manière que l'échantillon μϋ émette une pluralité de photons de fluorescence F ; une deuxième étape 502 selon laquelle l'unité de détection de photons uniques SPDet détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence F et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence F détecté ;
une troisième étape 503 selon laquelle l'unité de mesure M détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation LP et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
une quatrième étape 504 selon laquelle l'unité d'analyse RTA traite en temps réel les données numériques issues de l'unité de mesure M et calcule une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ, la quatrième étape 504 comportant avantageusement les sous-étapes suivantes :
o une première sous-étape 504-1 selon laquelle l'unité d'analyse RTA compte le nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction du temps d'arrivée desdits photons de fluorescence détectés et construit ainsi l'histogramme du nombre de photons de fluorescence F détectés en fonction de leur temps d'arrivée ;
o une deuxième sous-étape 504-2 selon laquelle l'unité d'analyse RTA calcule, à partir de l'histogramme construit lors de la première sous- étape 504-1 , la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ.
La figure 5b montre l'organisation des étapes d'un procédé 51 0 selon l'invention de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon μϋ. Le procédé 51 0 comporte :
- une première étape 51 1 selon laquelle la source lumineuse LS émet une succession d'impulsions d'excitation LP pour l'excitation de l'échantillon μϋ de manière que l'échantillon μϋ émette une pluralité de photons de fluorescence F formant une émission de fluorescence ;
- une deuxième étape 51 2 selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence F ;
une troisième étape 51 3 selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques SPDet détecte au moins une partie des photons de fluorescence F et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence F détecté ;
une quatrième étape 514 selon laquelle un moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation LP et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence F dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
une cinquième étape 51 5 selon laquelle l'unité d'analyse RTA traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure TDC de l'unité de mesure M et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de l'échantillon μϋ, et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre.
La figure 6 montre l'organisation des étapes d'un procédé 600 de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons μϋ avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons. Le procédé 600 comporte :
- une étape 400 de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons qui apporte successivement chaque d'échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de la fluorescence ;
- le procédé 500 de mesure de fluorescence de la figure 5a ou, alternativement, le procédé 51 0 de mesure de fluorescence multiparamètre de la figure 5b ;
- une cinquième étape 505 de criblage à haut débit des échantillons μϋ selon laquelle, le passage de chaque échantillon dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle du signal de fluorescence de chaque échantillon μϋ, on détermine et on archive pour chaque échantillon μϋ une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat.
La figure 7 montre l'organisation des étapes d'un procédé 700 de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons μϋ. Le procédé 700 comporte :
- le procédé 600 de criblage de la figure 6 ;
- une sixième étape 506 de tri à haut débit des échantillons μϋ selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle des échantillons μϋ en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon μϋ à l'issue du procédé 600 de criblage.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Dispositif (100, 101 ) de mesure de fluorescence résolue en temps pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2), le dispositif fonctionnant avec une source lumineuse (LS) apte à produire une succession d'impulsions d'excitation (LP, LP1 , LP2) pour l'excitation de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence (F, F1 , F2) formant une émission de fluorescence, le dispositif (100, 101 ) étant caractérisé en ce qu'il comporte :
- une unité de détection de photons uniques (SPDet) apte à détecter au moins une partie desdits photons de fluorescence (F, F1 , F2), l'unité de détection de photons uniques générant un signal de détection pour chaque photon unique détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une unité de mesure (M) permettant de mesurer, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP, LP1 , LP2) et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et générant une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- une unité d'analyse (RTA) en temps réel des données numériques issues de ladite unité de mesure (M), comportant des moyens pour détecter le passage de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) et pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2).
2. Dispositif (100, 101 ) selon la revendication précédente caractérisé en ce que la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) est choisie parmi la liste suivante :
- au moins une constante de temps de décroissance de fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ;
- au moins un moment de la distribution temporelle des temps d'arrivée des photons de fluorescence (F, F1 , F2) de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2).
3. Dispositif (1 00, 1 01 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'unité de mesure (M) comporte :
- un moyen de mesure (TDC), et
- une unité de déclenchement (Trig) permettant d'assurer un fonctionnement synchrone entre la source lumineuse d'excitation (LS) et le moyen de mesure (TDC).
4. Dispositif (1 00, 1 01 ) selon la revendication précédente caractérisé en ce que le moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) est choisi parmi la liste suivante :
- un convertisseur temps-amplitude ;
- un compteur numérique rapide ;
- un convertisseur temps-numérique.
5. Dispositif (101 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que :
- l'unité de détection de photons uniques (SPDet) comprend plusieurs détecteurs de photons uniques, et
- l'unité de mesure (M) comprend plusieurs moyens de mesure (TDC), chaque détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques (SPDet) fonctionnant avec un moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M).
6. Dispositif (1 01 ) selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'unité d'analyse (RTA) comporte des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de l'évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2), telle que :
- l'anisotropie de fluorescence résolue en temps de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ;
- la corrélation de plusieurs signaux de fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) détectés à différentes longueurs d'ondes ou l'évolution spectrale de la fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2).
7. Dispositif (200, 201 , 202) de criblage à haut débit utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps caractérisé en ce qu'il comporte :
- un dispositif (100, 101 ) de mesure de fluorescence résolue en temps selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit dispositif (100, 101 ) comportant des moyens pour calculer au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon d'une pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ;
- une unité (μΡΟ) de production et de manipulation de la pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) capable d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation de fluorescence ;
- une unité (Foc) de couplage optique et de focalisation des impulsions d'excitation (LP, LP1 , LP2) émises par la source lumineuse (LS) sur au moins une zone d'excitation de fluorescence de l'unité (μΡΟ) de production et de manipulation dans laquelle circule chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ;
- une unité (Fil) de collection et de filtrage des photons de fluorescence (F, F1 , F2), et de couplage optique desdits photons de fluorescence (F, F1 , F2) avec le dispositif (100, 101 ) de mesure de fluorescence ;
- des moyens pour, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2), attribuer audit échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat.
8. Dispositif (200, 201 , 202) de criblage selon la revendication précédente caractérisé en ce que l'unité d'analyse en temps réel a les moyens de :
- détecter le passage de chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ;
- générer une distribution temporelle moyenne du signal de fluorescence d'une succession d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2), et les grandeurs numériques caractéristiques de cette distribution ;
- générer une distribution temporelle du signal de fluorescence détecté entre les passages des échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) et la moyenne glissante de ladite distribution temporelle.
9. Dispositif (201 ) de criblage selon l'une quelconque des revendications 7 ou
8 caractérisé en ce que :
- l'unité (μΡΟ) est une unité microfluidique qui comporte une pluralité de canaux microfluidiques (Ch1 , Ch2) pour la manipulation en parallèle d'échantillons (μϋ1 , μϋ2) ;
- l'unité de couplage optique et de focalisation (Foc) focalise les impulsions d'excitation (LP, LP1 , LP2) sur au moins une zone spatialement définie de chaque canal microfluidique (Ch1 , Ch2) ;
- l'unité de collection, de filtrage et de couplage optique (Fil) permet de collecter, filtrer et coupler optiquement avec le dispositif (101 ) de mesure de fluorescence les photons de fluorescence (F1 , F2) issus des échantillons (μϋ1 , μϋ2) circulant dans chaque canal microfluidique (Ch1 , Ch2).
10. Dispositif (202) de criblage selon l'une quelconque des revendications 7 à
9 caractérisé en ce que l'unité (Fil) de collection, de filtrage et de couplage optique permet de résoudre en polarisation et/ou spectralement le signal de fluorescence collecté, et comporte un ou plusieurs éléments choisis parmi la liste suivante :
- un moyen de filtrage ou de résolution spectrale en longueur d'onde des photons de fluorescence (F, F1 , F2) ;
- un moyen de filtrage ou de résolution en polarisation des photons de fluorescence (F, F1 , F2).
1 1 . Dispositif (300) de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps caractérisé en ce qu'il comporte :
- un dispositif de criblage (200, 201 , 202) utilisant une mesure de fluorescence résolue en temps selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, le dispositif de criblage (200, 201 , 202) comportant des moyens pour attribuer en temps réel à chaque échantillon de la pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat ;
des moyens (Manip) pour réaliser une manipulation conditionnelle à haut débit desdits échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) consécutive au résultat du criblage, en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon (μϋ, μ01 , μϋ2).
12. Procédé (500) de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2), le procédé comportant :
- une première étape (501 ), selon laquelle une source lumineuse (LS) émet une succession d'impulsions d'excitation (LP, LP1 , LP2) pour l'excitation de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) de manière que l'échantillon émette une pluralité de photons de fluorescence (F, F1 , F2) formant une émission de fluorescence ;
- une deuxième étape (502), selon laquelle une unité de détection de photons uniques (SPDet) détecte au moins une partie desdits photons de fluorescence (F, F1 , F2) et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence (F, F1 , F2) détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une troisième étape (503), selon laquelle une unité de mesure (M) détermine, pour chaque signal de détection, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP, LP1 , LP2) et le signal de détection, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- une quatrième étape (504), selon laquelle une unité d'analyse (RTA) traite en temps réel les données numériques issues de ladite unité de mesure (M) et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle de signaux résultant d'une mesure de fluorescence multiparamètre de l'échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2).
13. Procédé (510) de mesure de fluorescence résolue en temps multiparamètre par comptage de photons uniques pour le criblage à haut débit d'au moins un échantillon (μϋ), le procédé (510) comportant :
- une première étape (51 1 ) selon laquelle la source lumineuse (LS) émet une succession d'impulsions d'excitation (LP) pour l'excitation de l'échantillon (μϋ) de manière que l'échantillon (μϋ) émette une pluralité de photons de fluorescence (F) formant une émission de fluorescence ;
- une deuxième étape (512) selon laquelle l'émission de fluorescence est résolue en une pluralité de faisceaux selon un premier paramètre tel que la longueur d'onde, la polarisation ou la direction de propagation de chaque photon de fluorescence (F) ;
- une troisième étape (513) selon laquelle, pour chacun de ces faisceaux, un détecteur de photons uniques de l'unité de détection de photons uniques (SPDet) détecte au moins une partie des photons de fluorescence (F) et génère un signal de détection pour chaque photon unique de fluorescence
(F) détecté, la partie détectée des photons de fluorescence formant un signal de fluorescence ;
- une quatrième étape (514) selon laquelle un moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) détermine, pour chaque faisceau, le temps écoulé entre l'impulsion d'excitation (LP) et chaque signal de détection issu d'un photon de florescence (F) dudit faisceau, dit « temps d'arrivée », et génère une donnée numérique caractéristique de ce temps d'arrivée ;
- une cinquième étape (515) selon laquelle l'unité d'analyse (RTA) traite en temps réel les données numériques issues de chaque moyen de mesure (TDC) de l'unité de mesure (M) et calcule au moins une grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de l'échantillon (μϋ), et/ou au moins une grandeur numérique caractéristique d'une évolution temporelle des signaux calculés, résultant de la combinaison de divers signaux de fluorescence provenant de la mesure multiparamètre.
14. Procédé (600) de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons, le procédé (600) comportant :
- une étape (400) de production et de manipulation d'une pluralité d'échantillons afin d'apporter successivement chaque échantillon dans une ou plusieurs zones d'excitation ;
- un procédé (500, 510) de mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons sur chaque échantillon selon l'une quelconque des revendications 12 ou 13 ;
- une étape (505) de criblage à haut débit de la pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) selon laquelle le passage de chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) dans la zone d'excitation de fluorescence est détecté et, à partir de la grandeur numérique caractéristique de la distribution temporelle de l'émission de fluorescence de chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2), on détermine et on archive pour chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) une classe de résultat parmi une pluralité de classes de résultat.
15. Procédé (700) de tri à haut débit d'une pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) comportant :
- le procédé (600) selon la revendication précédente de criblage à haut débit d'une pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) avec une mesure de fluorescence résolue en temps par comptage de photons ;
- une étape (506) de tri à haut débit de la pluralité d'échantillons (μϋ, μϋ1 , μϋ2) selon laquelle on réalise une manipulation conditionnelle de chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) en fonction de la classe de résultat attribuée à chaque échantillon (μϋ, μϋ1 , μϋ2) à l'issue du procédé (600) de criblage.
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