EP2838997A1 - Nadp-abhängige alanindehydrogenase - Google Patents

Nadp-abhängige alanindehydrogenase

Info

Publication number
EP2838997A1
EP2838997A1 EP13721283.3A EP13721283A EP2838997A1 EP 2838997 A1 EP2838997 A1 EP 2838997A1 EP 13721283 A EP13721283 A EP 13721283A EP 2838997 A1 EP2838997 A1 EP 2838997A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
amino acid
cell
alanine
polypeptide
nadp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP13721283.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Haas
Jan Christoph Pfeffer
Arne Skerra
Alexandra Lerchner
Alexander Jarasch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Evonik Industries AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Industries AG filed Critical Evonik Industries AG
Priority to EP13721283.3A priority Critical patent/EP2838997A1/de
Publication of EP2838997A1 publication Critical patent/EP2838997A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01001—Alanine dehydrogenase (1.4.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of alanine dehydrogenase (AlaDH) from Bacillus subtilis or a variant thereof, wherein Leu197 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence is replaced by a positively charged amino acid, encoding a nucleic acid molecule
  • a polypeptide and a process for the production of alanine or a compound resulting in the consumption of alanine comprising the step of reacting pyruvate with ammonium and NADPH to alanine by contacting with the polypeptide or the cell according to the invention.
  • Amines are used as synthesis building blocks for a large number of products of the chemical industry, such as epoxy resins, polyurethane foams, isocyanates and, in particular, polyamides.
  • the latter represent a class of polymers characterized by repeating amide groups.
  • polyamides unlike the chemically related proteins, usually refers to synthetic, commercially available, thermoplastics derived from primary amines or secondary amines that can be obtained from alkanes derived from the cracking of fossil hydrocarbons
  • derivatives of amines more particularly aminocarboxylic acid, lactams and diamines, can also be used for the preparation of amide-based polymers of interest are also short-chain, gaseous alkanes as starting materials, which can be obtained from renewable raw materials by means of biotechnological processes and then aminated.
  • polyamide 6 can be obtained by polymerizing ⁇ -caprolactam and "polyamide 12" by polymerizing laurolactam.
  • Other commercially interesting products include copolymers of lactam, e.g. B. Copolymers of ⁇ -caprolactam and laurolactam.
  • the conventional chemical-technical production of amines is dependent on the supply of fossil fuels, inefficient, and there are large amounts of unwanted by-products, in some steps of synthesis up to 80%.
  • An example of such a process is the production of laurolactam, which is conventionally obtained by trimerization of butadiene.
  • trimerization product cyclododecatriene is hydrogenated and the resulting cyclododecane is oxidized to cyclodecanone, which is then reacted with hydroxylamine to cyclododecanoxine, which is finally converted via a Beckmann rearrangement to laurolactam.
  • International Patent Application PCT / EP 2008/067447 describes a biological system for producing ⁇ -aminocarboxylic acids using a cell which has a number of suitable enzymatic activities and is capable of converting carboxylic acids to corresponding ⁇ -aminocarboxylic acid.
  • the cell has the AlkBGT oxidase system from Pseudomonas putida GP01, which oxidizes the ⁇ -aminocarboxylic acid first to ⁇ -hydroxycarboxylic acid and then to the aldehyde. This is followed by amination of the oxidation product by a likewise expressed transaminase.
  • EP 1 1 174729.1 and EP 1 1006458.1 describe processes for the preparation of amines starting from alkanes or alcohols, which are characterized in that the alcohol or the alkane hydroxylated to the alcohol in a first process step is oxidized by an alcohol dehydrogenase and NAD + is consumed Aldehyde or ketone and then under by a transaminase with consumption of alanine as amine donor to the amine.
  • the spent alanine can be replaced by a present Alanine dehydrogenase can be regenerated with consumption of pyruvate and ammonium, so that no total supply of alanine is required.
  • alanine dehydrogenases described in the literature, alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis and variants thereof are suitable for such a process.
  • a particular disadvantage of this group of alanine dehydrogenases is that they are NADH-dependent, that is to say they consume a different reduced redox factor than that which the numerous biotechnologically proven NAD-dependent alcohol dehydrogenases generate in the oxidation of the alcohol.
  • the object underlying the invention is to provide a redox-neutral enzyme system for the amination of alcohols, ie a system comprising enzymes which do not supply externally produced NAD + or NADPH to catalyze the conversion from alcohol to amine while regenerating the alanine or other redox factors.
  • Another object of the invention is to provide an alanine dehydrogenase which is suitable for the enzymatically catalyzed conversion of the alcohol to the amine in the presence of NADPH and the reaction with the highest possible turnover number, d. H. the number of substrate molecules reacted per second, catalyzed.
  • a further object underlying the invention is to modify the alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis such that the enzyme catalyzes the conversion of pyruvate to alanine with higher affinity for NADPH as substrate and the affinity of the enzyme to NADPH is preferably higher than that NADH, more preferably without there being a significant reduction in the turnover number relative to the turnover number of the wild-type enzyme.
  • Another object underlying the invention is to provide a redox-neutral, for a one-pot reaction under mild reaction conditions, d. H. especially those without extreme temperatures or pH values and in the absence of heavy metals containing catalysts or other toxic compounds to provide a suitable system for the amination of alcohols.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis or a variant thereof, wherein Leu197 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence is replaced by an amino acid with a positively charged side chain ,
  • the problem is solved in a first embodiment of the first aspect by a polypeptide, wherein the amino acid with positively charged side chain is arginine.
  • the problem is solved in a second embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first aspect, by a polypeptide wherein in addition Asp196 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence is replaced by an amino acid with a neutral or positively charged side chain.
  • the problem is solved in a third embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to second aspects, by a polypeptide, wherein the amino acid with neutral or positively charged side chain is an amino acid from the group consisting of alanine, Glycine, serine and cysteine, preferably alanine.
  • the problem is solved in a fourth embodiment of the first aspect, which is also an embodiment of the first to second aspects, by a polypeptide which is the polypeptide shown in SEQ ID NO 1.
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence coding for the polypeptide according to the first aspect and its embodiments.
  • nucleic acid molecule which is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO 2.
  • the problem underlying the invention is solved in a third aspect by a vector comprising the nucleic acid molecule according to the second aspect and its embodiments.
  • the problem underlying the invention is solved in a fourth aspect by a cell comprising the polypeptide according to the first aspect, the nucleic acid molecule according to the second aspect or the vector according to the third aspect and the respective embodiments.
  • the problem is solved in a first embodiment of the fourth aspect by a cell further expressing an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase.
  • the problem is solved in a second embodiment of the fourth aspect, which is also an embodiment of the first aspect, by a cell according to the fourth aspect or the first embodiment of the fourth aspect, further expressing a transaminase.
  • the problem underlying the invention is solved in a fourth aspect by a process for producing alanine or a compound resulting from the consumption of alanine, comprising the step c) reacting pyruvate with ammonium and NADPH to alanine by contacting with the polypeptide according to the first aspect or with the cell according to the second aspect or one of the respective embodiments.
  • the problem is solved in a first embodiment of the fourth aspect by methods further comprising a) reacting a primary or secondary alcohol to the aldehyde or ketone by contacting with an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase in the presence of NADP + .
  • a second embodiment of the fourth aspect which is also an embodiment of the first aspect, by a method further comprising b) reacting the aldehyde or ketone produced in step a) to the amine by contacting with a transaminase in the presence of alanine.
  • a third embodiment of the fourth aspect which is also an embodiment of the first to second aspects, by a method wherein steps a), b) and c) occur in the same reaction mixture, preferably simultaneously.
  • the problem is solved in a further embodiment of the third or fourth aspect or an embodiment of the third or fourth aspect by a cell or a method, wherein the cell comprises all enzymes from the group comprising the polypeptide according to one of claims 1 to 5, the NADP + dependent alcohol dehydrogenase and the transaminase expressed intracellularly localized.
  • NADP + -dependent alcohol dehydrogenase is an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase from the group comprising Alcohol dehydrogenases from E. coli (YjgB, database code ZP_071 17674, and a YahK, database code BAE76108.1) and the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 3), preferably the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) or variants thereof.
  • the NADP + -dependent alcohol dehydrogenase is an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase from the group comprising Alcohol dehydrogenases from E. coli (YjgB, database code ZP_071 17674, and a YahK, database code BAE76108.1) and the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 3), preferably the alcohol dehydrogenase from Ralstonia
  • the transaminase is a transaminase from the group comprising the transaminases from Chromobacterium violaceum (database code NP_901695) , Pseudomonas putida (database code YP_001668026.1 or YP_001671460) and Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023, database code YP_353455) and variants thereof, preferably the transaminase from Chromobacterium violaceum (database code NP_901695).
  • the transaminase is a transaminase from the group comprising the transaminases from Chromobacterium violaceum (database code NP_901695) , Pseudomonas putida (database code YP_001668026.1 or YP_001671460) and Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 1702
  • the present invention is based on the surprising discovery of the inventors that an enzyme system comprising an alcohol dehydrogenase, preferably an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase, a transaminase and a polypeptide comprising the amino acid sequence of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis or a variant thereof, wherein Leu197 or homologous Position in the amino acid sequence located amino acid is replaced by an amino acid with a positively charged side chain, can be used to redoxneutral catalyze the amination of an alcohol.
  • an enzyme system comprising an alcohol dehydrogenase, preferably an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase, a transaminase and a polypeptide comprising the amino acid sequence of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis or a variant thereof, wherein Leu197 or homologous Position in the amino acid sequence located amino acid is replaced by an amino acid with a positively charged side chain
  • the present invention is based on the surprising finding of the inventors that the affinity of a polypeptide comprising the amino acid sequence of Bacillus subtilis alanine dehydrogenase can be increased to NADPH by Leu197 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence against a positively charged amino acid Although the side chain is replaced and the enzyme still remains catalytically active and capable of catalyzing the reaction with high turnover number.
  • the invention relates to a polypeptide comprising the amino acid sequence of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis or a variant thereof, wherein Leu197 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence is replaced by an amino acid having a positively charged side chain.
  • This polypeptide is listed in the sequence listing under SEQ ID NO 1.
  • the term "alanine dehydrogenase” as used herein means an enzymatically-active polypeptide which inhibits the conversion of pyruvate while consuming ammonium and NADH or NADPH, preferably NADPH, to alanine and NAD + or NADP + , preferably NADP + , catalyzed.
  • the teaching of the invention can be carried out not only using the exact amino acid or nucleic acid sequences or to the exact amino acid or nucleic acid sequences of the biological macromolecules described herein, for example the alanine dehydrogenase described under database code L20916, but also using or to variants of such macromolecules that can be obtained by deletion, addition or substitution of one or more amino acids or nucleic acids.
  • the term "variant" of a nucleic acid sequence or amino acid sequence hereinafter synonymous and interchangeable with the term “homologue” as used herein, means another nucleic acid or amino acid sequence that is unique with respect to the corresponding original wild-type nucleic acid sequence.
  • homology here used as identity, of 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99% or more percent, preferably other than the catalytically active center forming amino acids or for the structure or folding of essential amino acids are deleted or substituted or the latter are only conservatively substituted, for example, a glutamate by an aspartate or a leucine by a valine.
  • the prior art describes algorithms that can be used to calculate the extent of homology of two sequences, e.g. B. Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3 rd edition.
  • the variant of an amino acid or nucleic acid sequence preferably in addition to the sequence homology mentioned above, has essentially the same enzymatic activity of the wild-type molecule or the original molecule.
  • a variant of a polypeptide enzymatically active as an alanine dehydrogenase has the same or substantially the same proteolytic activity, ie, the ability to catalyze the conversion of pyruvate, ammonium, and NAD (P) H, preferably NADPH, to alanine.
  • the term "substantially the same enzymatic activity” means an activity with respect to the substrates of the wild-type polypeptide that is significantly above the background activity and / or around less than 3, more preferably 2, more preferably an order of magnitude different from the K M and / or k cat values exhibited by the wild-type polypeptide with respect to the same substrates.
  • the term “variant" of a nucleic acid or amino acid sequence comprises at least one active part or fragment of the nucleic acid or amino acid sequence
  • the term “active part” as used herein means an amino acid sequence or a nucleic acid sequence that is less than the full length of the amino acid sequence or encodes less than full length of the amino acid sequence, wherein the amino acid sequence or the encoded amino acid sequence of lesser length than the wild-type amino acid sequence has substantially the same enzymatic activity as the wild-type polypeptide or a variant thereof.
  • the term "variant" of a nucleic acid comprises a nucleic acid whose complementary strand binds to the wild-type nucleic acid, preferably under stringent conditions
  • the stringency of the hybridization reaction is readily determinable by a person skilled in the art and generally depends on the length of the probe In general, longer probes require higher temperatures for hybridization, whereas shorter probes can cope with low temperatures. Whether hybridization takes place generally depends on the ability of denatured DNA to anneal to complementary strands The stringency of the hybridization reaction and corresponding conditions are described in more detail in Ausubel et al., 1995.
  • Hybridization takes place in a preferred embodiment under stringent conditions, that is, only hybrids are formed in which the probe and target sequence, ie the polynucleotides treated with the probe, are at least 70% identical. It is known that the stringency of the hybridization including the washing steps is influenced or determined by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration.
  • the hybridization reaction is generally performed at relatively low stringency compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
  • a buffer corresponding to 5 ⁇ SSC buffer at a temperature of about 50 ° C.-68 ° C. can be used for the hybridization reaction.
  • This can be probes also hybridize to polynucleotides having less than 70% identity to the sequence of the probe. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions.
  • Temperature ranges of about 64 ° C - 68 ° C or about 66 ° C - 68 ° C are preferred. It may be possible to lower the salt concentration to a concentration corresponding to 0.2 ⁇ SSC or 0.1 ⁇ SSC.
  • polynucleotide fragments can be isolated, for example, in order of increasing preference at least 70% or at least 80% or at least 90%, at least 91% , at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least 99% identity to the sequence of the nucleic acid molecule used.
  • kits eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558.
  • variant of a nucleic acid as used herein includes any nucleic acid sequence encoding the same amino acid sequence as the original nucleic acid or a variant of that amino acid sequence in the context of degeneracy of the genetic code.
  • alanine dehydrogenase used by Bacillus subtilis does not comprise the wild-type sequence of the enzyme, but a sequence in which Leu197 or an amino acid located at a homologous position in the amino acid sequence is replaced by an amino acid with a positively charged side chain.
  • the term "homologous position" as used herein means that the corresponding position appears homologous to the X-position amino acid sequence of the alanine dehydrogenase of Bacillus subtilis in an alignment of the molecule under study. Numerous software packages and algorithms are known to those skilled in the art.
  • amino acid or "alanine” is understood to mean a proteinogenic L-amino acid or L-alanine, ie an amino acid which is universally used in the nature of organisms for the production of polypeptides.
  • amino acid like all the compounds mentioned in this application, also encompasses all crystal, salt or similar forms of the corresponding compound
  • histidine also comprises the salt of protonated histidine and a chloride ion.
  • the term "inorganic nitrogen source” as used herein means an inorganic nitrogen-containing salt which comprises ammonium or can be converted to ammonium in the metabolism of the cell Examples include ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium hydroxide, ammonium phosphate, In a preferred embodiment, the concentration of ammonium in the medium is 0.05 to 5, more preferably 0.1 to 3, most preferably 0.5 to 3 g / L.
  • the inorganic nitrogen source of the cell is provided in accordance with the invention, that the appropriate compound is added in sufficient quantity to the aqueous phase in which the reaction proceeds.
  • Amino acids with a positively charged side chain include the amino acids arginine, lysine and histidine, preferably arginine and lysine, most preferably arginine.
  • Possible polypeptides according to the invention have, for example, the mutations Leu197Arg, Leu197Lys and Leu197His.
  • the teaching according to the invention expressly also comprises alanine dehydrogenases from organisms other than Bacillus subtilis, provided that they belong to the group of the variants of the alanine dehydrogenase of Bacillus subtilis.
  • the teaching according to the invention also comprises a polypeptide which, in addition to the above-mentioned replacement at the position of the Leu197, has another exchange at the position Asp196 or at a homologous position, namely against an amino acid with a neutral or positive charged side chain.
  • neutral side chain amino acids include the group comprising glycine, alanine, valine, leucine, tryptophan, tyrosine, isoleucine, serine, cysteine, threonine, glutamine, methionine, phenylalanine, proline and asparagine.
  • amino acids having a positively charged side chain include the group comprising arginine, lysine and histidine, preferably arginine and lysine.
  • Nucleic acid molecules according to the invention comprise all unmodified or modified DNA and RNA molecules comprising a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • the person skilled in the art is familiar with standard methods of molecular biology or synthetic chemistry by means of which such nucleic acid molecules can be prepared, for example the polymerase chain reaction or solid-phase synthesis.
  • the nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule which comprises or represents the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO 2.
  • the teaching according to the invention can be carried out both using an isolated polypeptide, nucleic acid molecule or vector according to the invention and using a cell according to the invention as a whole-cell catalyst.
  • the term "whole cell catalyst" as used herein means an intact, viable, and metabolically active cell that provides a desired enzymatic activity
  • the whole cell catalyst can be the substrate to be metabolized, in the case of the present invention, the alcohol or the
  • the resulting oxidation product may either be transported inside the cell where it is metabolized by cytosolic enzymes, or it may present the enzyme of interest on its surface where it is directly exposed to substrates in the medium. for example from DE 60216245.
  • the cell expresses the polypeptide according to the invention with NADPH-dependent alanine dehydrogenase activity, the transaminase and / or the NADP + -dependent alcohol dehydrogenase intracellularly, ie the jewe
  • the active enzyme is permanently localized inside the cell, in particular in the cytosol of the cell or as a membrane or membrane-anchored protein which protrudes into the cytosol of the cell.
  • the cell used as the whole-cell catalyst or in the cell used as the expression system is a prokaryotic cell, preferably a bacterial cell. In a further preferred embodiment, it is a mammalian cell. In a further preferred embodiment, it is a lower one eukaryotic cell, preferably a yeast cell.
  • Exemplary prokaryotic cells include Escherichia, especially Escherichia coli, and strains of the genus Pseudomonas and Corynebacterium.
  • Exemplary lower eukaryotic cells include the genera Saccharomyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Schizosaccharomyces, especially the strains Candida tropicalis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica and Saccharomyces cerivisiae.
  • the whole-cell catalyst in some substrates, especially those with long alkyl chains, the entry of the molecule into the interior of the whole-cell catalyst for the production of the desired substance may be limiting.
  • the whole-cell catalyst in the case of long-chain alkanes and alcohols, it is preferable that the whole-cell catalyst has an AlkL polypeptide.
  • an "AlkL polypeptide” as used herein is a polypeptide having a length of 230 consecutive amino acids of at least 80, preferably 90, more preferably 90% sequence identity to Pseudomonas putida AlkL (Database code CAB69081), and preferably has the ability to assist in the import of long-chain alkanes into the interior of a cell.
  • an "AlkL family polypeptide” as used herein is an outer membrane of a Gram-negative bacterium localized polypeptide having the sequence motif DXWAPAXQ (V / A) GXR, wherein X represents a proteinogenic amino acid, and preferably additionally Pseudomonas putida AlkL (database code CAB69081) or a variant thereof.
  • Exemplary members of the AlkL family include Pseudomonas putida AlkL (database code CAB69081), Marinobacter aquaeolei VT8 (database code YP_957722), Oceanicaulis alexandrii HTCC2633 (database code ZP_00953584), Marinobacter manganoxydans Mnl7-9 (database code ZP_09158756), Caulobacter sp. K31 (database code YP_001672217), Pseudomonas oleovorans (database code Q00595) and variants thereof.
  • the enzymatically active polypeptides used according to the invention may each also be a preparation of the polypeptide according to the invention in all purification stages, from the crude lysate to the isolated polypeptide.
  • the cell may contain one or more than one nucleic acid sequence coding for an enzyme used according to the invention on a plasmid or integrated into its genome.
  • polypeptides for the expression of the polypeptides all expression systems available to the person skilled in the art can be used, for example vectors of the type pET or pGEX. Purification can be carried out by chromatographic methods, for example the affinity chromatographic purification of a tagged recombinant protein using immobilized ligands, for example a nickel ion in the case of a histidine tag, of immobilized glutathione in the case of glutathione S-transferase fused to the target protein or immobilized maltose in the case of a tag comprising maltose-binding protein.
  • immobilized ligands for example a nickel ion in the case of a histidine tag
  • the term "isolated" means that the enzyme is in a purer and / or more concentrated form than in its natural source
  • the enzyme is considered isolated if it is a polypeptide enzyme and more than 60, 70, 80, 90 or preferably 95% of the mass protein content of the corresponding preparation
  • numerous methods for measuring the mass of a protein in a solution for example the visual estimation based on the thickness of corresponding protein bands on SDS-polyacrylamide gels, NMR Spectroscopy or mass spectrometry based methods.
  • the purified enzymatically active polypeptides can be used either in soluble form or immobilized.
  • the person skilled in the art is familiar with suitable methods by which polypeptides can be immobilized covalently or noncovalently on organic or inorganic solid phases, for example by sulfhydryl coupling chemistry (for example Pierce kits).
  • the enzymes used according to the invention are preferably recombinant enzymes.
  • the term "recombinant" as used herein means that the corresponding nucleic acid molecule is not naturally occurring and / or produced using genetic engineering methods A protein, when the corresponding polypeptide is encoded by a recombinant nucleic acid
  • a recombinant cell as used herein is a Understood cell having at least one recombinant nucleic acid or a recombinant polypeptide.
  • suitable methods for producing recombinant molecules or cells for example, in Sambrook / Fritsch / Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 nd edition described.
  • an aqueous phase d. H. an aqueous culture or reaction medium suitable for at least temporarily maintaining or culturing the cell or the activity of the polypeptide of the invention.
  • aqueous culture media which are suitable for the maintenance or cultivation of cells, in particular biotechnologically significant cells. These include both full media such as LB medium, minimal media such as M9 media and selective media, for example those which contain a high salt concentration and therefore only allow the growth of halophilic or at least halotolerant organisms.
  • aqueous phase as used herein is understood to mean a water-based reaction or culture medium substantially immiscible with hydrophobic solvents, with respect to all relevant factors, in particular pH, salinity and temperature
  • the pH is of the aqueous culture medium at the time of contacting between 4 to 9, more preferably between 4.5 to 8.5, most preferably between 6.5 and 7.5
  • the temperature is between 5 and 42 ° C, more preferably between 15 and 40 ° C, on b preferably between 20 and 37 ° C.
  • enzymes require the presence of all necessary substrates.
  • the activity of alanine dehydrogenase requires the presence of the substrates ammonium, a suitable reduced redox factor, and pyruvate.
  • a suitable aqueous solution is required for the activity of enzymes, ie a solution which, with regard to the necessary buffer present, pH, temperature, salt concentration, the presence of necessary cofactors or activity-promoting or -supporting further Polypeptides and other relevant factors is suitable for at least temporarily maintaining the activity of the enzyme.
  • the cell according to the invention expresses an NADP + -dependent alcohol dehydrogenase.
  • the term "alcohol dehydrogenase” as used herein means an enzyme that oxidizes an aldehyde or ketone to the corresponding primary, secondary or other alcohol, examples of which include the NADP + -dependent alcohol dehydrogenases from E. coli (YjgB, database code ZP_071 17674, and a YahK, database code BAE76108.1) and the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) as well as the respective variants thereof In a particularly preferred embodiment it is the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5).
  • the cell according to the invention expresses a transaminase.
  • transaminase refers to an enzyme that catalyzes the transfer of amino groups from a donor, preferably an amino acid, to an acceptor molecule, preferably a ketocarboxylic acid.
  • the transaminase is selected from the group comprising the Chromobacterium violaceum ⁇ -transaminase (database code NP_901695), Pseudomonas putida (database code YP_001668026), Pseudomonas putida (database code YP_001668026.1 or YP_001671460), Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023, database code YP_353455) and variants and preferably the transaminase from Chromobacterium violaceum (database code NP_901695).
  • the Chromobacterium violaceum ⁇ -transaminase database code NP_901695
  • Pseudomonas putida database code YP_001668026
  • Pseudomonas putida database code YP_001668026.1 or YP_00
  • the conditions are compatible with the viability of the at least one cell used as a whole-cell catalyst for a longer reaction time.
  • the skilled person can standard works, For example, Fuchs / Schlegel (2007) General Microbiology, 2008, Georg Thieme Verlag, conditions and solutions that allow the preservation of such cells in a viable state.
  • the process according to the invention can be applied to a large number of industrially relevant alcohols.
  • this is an ⁇ -hydroxycarboxylic acid or an ester, preferably methyl ester, thereof, which is or are oxidized to an ⁇ -aminocarboxylic acid and aminated.
  • it is a diol which is oxidized to a diamine and aminated.
  • the primary alcohol is a hydroxyalkylamine.
  • the length of the carbon chain is variable and x is at least 3.
  • Exemplary compounds include ⁇ -hydroxy lauric acid, ⁇ -hydroxy lauric acid methyl ester, and alkane diols, especially 1,8-octane diol and 1,10-decane diol.
  • ⁇ -hydroxycarboxylic acids preferably those which can be oxidized to the ⁇ -ketocarboxylic acids, ie those of the formula R s -C (OH) H-COOH, which in turn can be converted by amination to the proteinogenic amino acids, including in particular essential amino acids such as methionine and lysine.
  • R s is a substituent selected from the group consisting of H, methyl, - (CH 2 ) 4 -NH 2 , - (CH 2 ) 3 -NH-NH-NH 2 , -CH 2 -CH 2 -S-CH 3 , -CH (CH 3 ) 2 , -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 , -CH 2 - (1H-indol-3-yl), -CH (OH) -CH 3 , Is -CH 2 -phenyl, -CH (CH 3 ) -CH 2 -CH 3 .
  • Other secondary alcohols include 2-alkanols, e.g. B.
  • secondary polyhydric alcohols for example alkanediols such as ethanediol, alkanetriols such as glycerol and pentaerythritol into consideration.
  • cycloalkanols preferably cyclohexanol and bis (p-hydroxycyclohexyl) methane, the alcohols of the group H 3 C - C (OH) H - (CH 2 ) X - R 4 , where R 4 is selected from the group consisting of OH, -SH, - NH 2 and -COOR 5 , x is at least 3 and R 5 is selected from the group comprising H, alkyl and aryl.
  • the length of the carbon chain is variable in the case of alcohols of the formula alcohols of H 3 C - C (OH) H - (CH 2 ) X - R 4 and x is at least 3.
  • Numerous secondary alcohols are commercially available and can be used directly in commercial form.
  • the secondary alcohol can be biotechnologically generated beforehand or in situ, for example by hydroxylation of an alkane by suitable alkane oxidases, preferably monooxygenases.
  • R 4 is in the case of secondary alcohols of the formula H 3 C - C (OH) H - (CH 2)
  • X - R 4 is selected from the group -OH, and -COOR comprises 5, x is at least 1 1 and R 5 is selected from the group comprising H, methyl, ethyl and propyl.
  • the primary or secondary alcohol is a sugar alcohol, which in a preferred embodiment, as used herein, is understood to mean a carbohydrate having at least one hydroxy group. In a particularly preferred embodiment, it is a dicyclic sugar alcohol. In a preferred embodiment, as used herein, a "dicyclic sugar alcohol” is understood to mean a sugar alcohol which can form at least transiently two ring systems.
  • a sugar alcohol is a dianhydrohexitol or a compound from the group comprising 1 , 4: 3,6-Dianhydro-D-mannitol, 1, 4: 3, 6-dianhydro-D-glucitol (isosorbide) and 1, 4: 3, 6-dianhydro-L-iditol.
  • the cell according to the invention additionally expresses a monooxygenase or if the method according to the invention is extended by one step in which a monooxygenase hydroxylates an alkane.
  • the monooxygenase is a monooxygenase from the AlkB family.
  • AlkB represents an oxidoreductase from the alkBGT system from Pseudomonas putida, which is known for its hydroxylase activity. This is dependent on two other polypeptides, AlkG and AlkT.
  • AlkT is characterized as a FAD-dependent rubredoxin reductase that transfers electrons from NADH to AlkG.
  • AlkG is a rubredoxin, an iron-containing redox protein that acts as a direct electron donor for AlkB.
  • alkoxy-based monooxygenase as used herein means a membrane-terminated alkane hydroxylase
  • the term is used under the same term "Alkanhydroxylase of the alkB type" a polypeptide having a sequence homology of increasingly preferably at least 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 or 99% to the sequence of the AlkB of Pseudomonas putida Gpo1 (database code: CAB54050.1, this Database code and all other database codes used in this document are understood from NCBI's Genebank Protein Database in the release available on November 9, 201 1.
  • sequence as used herein may refer to the amino acid sequence of a polypeptide and / or or the nucleic acid sequence coding therefor.
  • the monooxygenase is cytochrome P450 monooxygenase of the CYP153 family.
  • cytochrome P450 monooxygenase of the CYP153 family means a cytosolic oxidase which is part of a 3-component system which further comprises a ferredoxin and a ferredoxin reductase, with an alkane binding site and the In a particularly preferred embodiment, it is an enzyme having at least 80, preferably 90, most preferably 95 or 99 percent sequence identity to the CYP153 family cytochrome P450 monooxygenase from Alcanivorax borkumensis SK2 (database code YP_691921).
  • alkane hydroxylase activity means the ability to catalyze the hydroxylation of alkanes or unsubstituted linear alkyl radicals comprising at least five, preferably twelve, carbon radical groups.
  • cytochrome P450 monooxygenase of the CYP153 family is understood to mean a non-membrane-bound oxidase which has a binding site for alkanes, unsubstituted linear alkyl radicals comprising at least five, preferably twelve carbon radical or monohydric alkanes and their polypeptide chain LL (I / L) (V / I) GGNDTTRN
  • a "cytochrome P450 monooxygenase of the CYP153 family” as used herein is a CYP153 family cytochrome P450 monooxygenase from Alcanivorax borkumensis SK2 (database code YP_691921) or a variant thereof, which preferably has alkane hydroxylase activity.
  • the present application comprises a sequence listing with the following polypeptide (polyp) and nucleotide (DNA) sequences:
  • the represented amino acid Asp196 of BasAlaDH corresponds to the amino acid Asp198 in the SheAlaDH or amino acid Asp198 in the MtAlaDH.
  • the amino acid Leu197 of BasAlaDH corresponds to the amino acid Arg199 in the SheAlaDH or amino acid Ile199 in the MtAlaDH.
  • the amino acid Asn198 of BasAlaDH corresponds to the amino acid Ser200 in the SheAlaDH or amino acid Asn200 of MtAlaDH.
  • FIG. 2 shows the FMOC / HPLC analysis of the conversion of isosorbitol and ammonium salt catalysed by the three enzymes RasADH, pCR6 (L417M) and AlaDH (D196A / L197R) after 96 h. Shown are (a) the standards (1 mM each of the amino alcohols I, II, II and IV of FIG. 3 + 1 mM each of the diamines DAI, DAS and DAM), (b) those represented by RasADH, pCR6 (L417M) and AlaDH (D196A / L197R) catalyzed reaction after 96 h, (c) the control reaction as in (b) but without RasADH after 96 h.
  • Fig. 3 shows the chemical formulas of the starting substrate isosorbitol (1, 4: 3,6-dianhydro-D-sorbitol (ol)), the stereoisomers of the aminoalcohol (I to IV) and the stereoisomeric forms of the final diamine product (DAI: 2 , 5-diamino-1,4: 3,6-dianhydro-2,5-dideoxy-L-ldit (ol), DAS: 2,5-diamino-1,4: 3,6-dianhydro-2,5- Dideoxy-D-sorbitol (ol) and DAM: 2,5-diamino-1,4: 3,6-dianhydro-2,5-dideoxy-D-mannitol (ol).
  • DAI 2- , 5-diamino-1,4: 3,6-dianhydro-2,5-dideoxy-L-ldit (ol)
  • DAS 2,5-diamino-1,4: 3,6-dianhydro-2,5
  • Figure 4 shows the yields of mono- and diamine from FMOC / HPLC analysis of RasADH, pCR6 (L417M) and AlaDH (D196A / L197R) catalyzed reaction of isosorbitol and ammonium acetate at different ammonium concentrations.
  • Reaction conditions 300 mM isosorbitol, 2 mM NADP +, 100-300 mM NH 4 OAc, 5 mM L-alanine, 0.3 mM PLP, 132 ⁇ RasADH, 40 ⁇ PCR6 (L417M), 24 ⁇ AlaDH (D196A / L197R) in 25 mM Hepes / NaOH, pH 8.3; Incubation at 30 ° C.
  • Example 1 Change in cosubstrate specificity of an alanine dehydrogenase by bioinformatic analysis and protein engineering
  • AlDH L-alanine dehydrogenase
  • BasAlaDH Bacillus subtilis
  • MtAlaDH Like the enzyme from Bacillus subtilis, MtAlaDH has a redox factor specificity for NADH, whereas SheAlaDH, as the only known AlaDH, is capable of enzymatically converting both NADH and NADPH (Ashida et al. (2004) J. Mol. Catal. B: Enzyme. 30, 173-176).
  • a structural superposition of the homology models of BasAlaDH and SheAlaDH with the Reference structure of MtAlaDH has been created with the program Chimera (version 1.5.3; URL: http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ with the function "Matchmaker"; URL http: //www.cgl.ucsf.
  • the Bacillus subtilis AlaDH gene (SEQ ID NO: 4) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using the oligodeoxynucleotides AlaDHfw (SEQ ID NO: 11) and AlaDHrv (SEQ ID NO: 12) from the plasmid pUC18-AlaDH amplified, cut with the restriction enzyme Kpnl at the 3 'end and ligated with the expression vector pASK IBA35 (+) (IBA GmbH, Göttingen), which was cut with the restriction enzymes Ehel and Kpnl.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the resulting expression pASK-IBA35 (+) - AlaDH on which the BasAlaDH 6 tag is encoded with a N-terminal His was verified by analytical restriction enzyme digestion and DNA sequencing.
  • the plasmid coding for the enzyme variant D196A / L197R was generated by site-directed mutagenesis according to the QuikChange method using the oligodeoxynucleotides AlaDH_D196A / L197Rfw (SEQ ID NO: 13) and AlaDH_D196A / L197Rrv (SEQ ID NO: 14).
  • the resulting Expression plasmid pASK-IBA35 (+) - AlaDH (D196A L197R) was verified by DNA sequencing.
  • the culture was harvested and the cells were taken up in 40 mM Hepes / NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl and mechanically digested in a French-Press homogenizer (G. Heinemann, Schissebisch Gmünd).
  • the clear supernatant was applied to a Zn 2+ loaded Chelating Sepharose TM Fast Flow column (2.8 ml bed volume, GE Healthcare, Kunststoff) and the His 6 -tag fused enzymes to a linear imidazole / HCl concentration gradient from 0 to 500 in 40 mM Hepes / NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl eluted.
  • the elution fractions were concentrated by ultrafiltration and purified by gel filtration on Superdex200 (GE Healthcare) in the presence of 25 mM Hepes / NaOH pH 8.3.
  • the Michaelis constant (K M ) and the turnover number (k cat ) of the two purified enzymes were determined for the cosubstrates NADH and NADPH by the reductive amination of pyruvate and the catalytic efficiency was calculated (k ca t / K M ) (Table 1) ,
  • the enzyme assays were composed as follows:
  • BasAlaDH wild type or double mutant D196A / L197R
  • Table 1 K M and k cat values for the BasAlaDH-catalyzed reductive amination of pyruvate with NADH and NADPH, respectively.
  • Example 2 Synthesis of mono- and diamines from isosorbitol and ammonium salts by coupled enzymatic reaction of an alcohol dehydrogenase, an aminotransferase and an alanine dehydrogenase
  • the structural gene of the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) was amplified by PCR using the oligodeoxynucleotides ADHfw (SEQ ID NO: 15) and ADHrv (SEQ ID NO: 16) from the plasmid pEam-RasADH (Lavandera et al., (2008) J. Org. Chem 73, 6003-6005), cleaved with the restriction enzyme Kpn ⁇ at the 3 'end and finally ligated with the expression vector pASK-IBA35 (+) cut with the restriction enzymes Ehe1 and Kpn1.
  • the gene of aminotransferase from Paracoccus denitrificans (SEQ ID NO: 17) was amplified by PCR using the oligodeoxynucleotides pCR6fw (SEQ ID NO: 18) and pCR6rv (SEQ ID NO: 19) from the plasmid pET21 a (+) - pCR6, with the restriction enzyme Hind ⁇ 'at the 3' end and finally ligated with the expression vector pASK-IBA35 (+), which was cut with the restriction enzymes Ehe ⁇ and Hind ⁇ .
  • the plasmid coding for the enzyme variant L417M of aminotransferase was detected by means of site-directed mutagenesis of the plasmid pASK-IBA35 (+) - pCR6 the QuikChange method (Agilent, Waldbronn) using the oligodeoxynucleotides pCR6_L417Mfw (SEQ ID NO: 20) and pCR6_L417Mrv (SEQ ID NO: 21).
  • the resulting expression plasmid pASK-IBA35 (+) - pCR6 (L417M) was verified by DNA sequencing.
  • the culture was harvested and the cells were taken up in 40 mM Hepes / NaOH pH 7.5, 0.5 M NaCl and mechanically disrupted in a French-Press homogenizer.
  • the clear supernatant was applied to a Zn 2+ -charged Chelating Sepharose TM Fast Flow column and the His 6 -tag fused enzymes to a linear imidazole / HCl concentration gradient from 0 to 500 mM in 40 mM Hepes / NaOH pH 7, 5, 0.5 M NaCl eluted.
  • the elution fractions were concentrated by ultrafiltration and purified by gel filtration on Superdex200 in the presence of 25 mM Hepes / NaOH pH 8.3.
  • the three purified enzymes were used directly for the amination of isosorbitol (1, 4: 3,6-dianhydro-D-sorbitol (ol)) with recycling of the redox factors NADP + and L-alanine.
  • the enzyme test was composed as follows:
  • Fig. 2 shows the chromatogram of the separation of the reaction mixture.
  • product peaks were observed which, on the basis of the accompanying standards, correspond to the 6-amino-3-alcohol in the 4 possible stereoisomeric forms according to FIG. 3 (IV: 3S , 6S, III: 3R, 6R, I: 3S, 6R, II: 3R, 6S).
  • 3S , 6S, III 3R, 6R, I: 3S, 6R, II: 3R, 6S.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist, ein Nukleinsäuremolekül kodierend für eine derartiges Polypeptid sowie ein Verfahren zur Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung umfassend den Schritt Umsetzen von Pyruvat mit Ammonium und NADPH zu Alanin durch Kontaktieren mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder der erfindungsgemäßen Zelle.

Description

NADP-abhängige Alanindehydrogenase
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase (AlaDH) aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist, ein Nukleinsäuremolekül kodierend für eine derartiges Polypeptid sowie ein Verfahren zur Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung umfassend den Schritt Umsetzen von Pyruvat mit Ammonium und NADPH zu Alanin durch Kontaktieren mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder der erfindungsgemäßen Zelle.
Amine finden als Synthesebausteine für eine Vielzahl von Produkten der chemischen Industrie wie Epoxidharze, Polyurethanschäume, Isocyanate und insbesondere Polyamide Verwendung. Letztere stellen eine Klasse von Polymeren dar, die durch sich wiederholende Amidgruppen gekennzeichnet sind. Der Begriff „Polyamide" bezeichnet im Unterschied zu den chemisch verwandten Proteinen gewöhnlich synthetische, im Handel erhältliche, thermoplastische Kunststoffe. Polyamide werden von primären Aminen oder von sekundären Aminen abgeleitet, die ausgehend von beim Cracken von fossilen Kohlenwasserstoffen anfallenden Alkanen gewonnen werden können. Es können jedoch auch Derivate von Aminen, genauer Aminocarbonsäure, Lactame und Diamine, zur Herstellung von Polymeren auf Amidbasis verwendet werden. Von Interesse sind weiterhin kurzkettige, gasförmige Alkane als Edukte, die ausgehend von nachwachsenden Rohstoffen mittels biotechnologischer Verfahren gewonnen und anschließend aminiert werden können.
Viele kommerziell stark nachgefragte Polyamide werden ausgehend von Lactamen hergestellt. Zum Beispiel kann man„Polyamid 6" durch Polymerisation von ε-Caprolactam und„Polyamid 12" durch Polymerisierung von Laurinlactam erhalten. Weitere kommerziell interessante Produkte umfassen Copolymere von Lactam, z. B. Copolymere von ε-Caprolactam und Laurinlactam. Die konventionelle chemisch-technische Erzeugung von Aminen ist von der Versorgung mit fossilen Rohstoffen abhängig, ineffizient, und es fallen dabei große Mengen unerwünschter Nebenprodukte an, in manchen Schritten der Synthese bis zu 80 %. Ein Beispiel für einen solchen Prozess stellt die Herstellung von Laurinlactam dar, das konventionell durch Trimerisierung von Butadien gewonnen wird. Das Trimerisierungsprodukt Cyclododekatrien wird hydriert und das daraus resultierende Cyclododekan wird zu Cyclodekanon oxidiert, das anschließend mit Hydroxylamin zu Cyclododekanoxin umgesetzt wird, welche schließlich über eine Beckmann-Umlagerung zu Laurinlactam umgewandelt wird.
Eingedenk dieser Nachteile wurden Verfahren entwickelt, um Amine unter Verwendung von Biokatalysatoren ausgehend von nachwachsenden Rohstoffen zu gewinnen. Dabei werden landwirtschaftlich erzeugte Produkte wie Zucker oder Fettsäuren, die bereits Alkoholfunktionen enthalten können, zum Aldehyd oder Keton oxidiert. In einem nachgeschalteten Schritt wird der Aldehyd oder das Keton anschließend durch eine Transaminase unter Verbrauch einer Aminosäure zum Amin umgesetzt. Die Aminosäure wird vorteilhafterweise durch eine während der Transaminasereaktion anwesende Aminosäuredehydrogenase unter Verbrauch von eines anorganischen Stickstoffsalzes regeneriert.
Beispielsweise beschreibt die Internationale Patentanmeldung PCT/EP 2008/067447 ein biologisches System zur Herstellung von ω-Aminocarbonsäuren unter Verwendung einer Zelle, die eine Reihe von geeigneten enzymatischen Aktivitäten aufweist und in der Lage ist, Carbonsäuren zu entsprechender ω-Aminocarbonsäure umzuwandeln. Insbesondere weist die Zelle das AlkBGT-Oxidasesystem aus Pseudomonas putida GP01 auf, die die ω- Aminocarbonsäure zunächst zur ω-Hydroxycarbonsäure und dann zum Aldehyd oxidiert. Anschließend folgt eine Aminierung des Oxidationsproduktes durch eine ebenfalls exprimierte Transaminase.
Die EP1 1 174729.1 und die EP1 1006458.1 beschreiben Verfahren zur Herstellung von Aminen ausgehend von Alkanen oder von Alkoholen, die sich dadurch auszeichnen, dass der Alkohol oder das in einem ersten Verfahrensschritt zum Alkohol hydroxylierte Alkan unter durch eine Alkoholdehydrogenase und unter Verbrauch von NAD+ zum Aldehyd oder Keton und anschließend unter durch eine Transaminase unter Verbrauch von Alanin als Amindonor zum Amin umgesetzt wird. Das verbrauchte Alanin kann durch eine anwesende Alanindehydrogenase unter Verbrauch von Pyruvat und Ammonium regeneriert werden, so dass insgesamt keine Zufuhr von Alanin erforderlich ist.
Unter den in der Literatur beschriebenen Alanindehydrogenasen sind die Alanindehydrogenase von Bacillus subtilis und Varianten davon für ein solches Verfahren geeignet. Nachteilig ist speziell an dieser Gruppe von Alanindehydrogenasen, dass sie NADH-abhängig sind, also einen anderen reduzierten Redoxfaktor verbrauchen als den, den die zahlreiche biotechnologisch besonders bewährte NAD-abhängige Alkoholdehydrogenasen bei der Oxidation des Alkohols generieren.
Dies bedeutet im Falle einer in v/'iro-Reaktion, dass der Reaktion pro umgesetztes Alkoholmolekül ein NAD+- und ein NADPH-Molekül zugeführt werden muss. Wird die Reaktion hingegen in vivo unter Verwendung eines Ganzzellkatalysators durchgeführt, so kann die Zelle die jeweiligen Redoxfaktoren zwar grundsätzlich über den Primärstoffwechsel bereitstellen; dies stellt jedoch eine erhebliche Belastung des Metabolismus dar, die eine Verringerung der Ausbeute an Produkt und/oder eine kürzere Verwendbarkeit der Zelle mit sich bringt.
Vor diesem Hintergrund besteht die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe darin, ein redoxneutrales Enzymsystem zur Aminierung von Alkoholen bereitzustellen, d. h. ein System umfassend Enzyme, die zur Katalyse der Umwandlung vom Alkohol zum Amin unter Regenerierung des Alanins keine Zufuhr von extern hergestelltem NAD+ oder NADPH oder sonstigen Redoxfaktoren benötigen.
Eine weitere der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe besteht darin, eine Alanindehydrogenase bereitzustellen, die für die enzymatisch katalysierte Umwandlung vom Alkohol zum Amin in Anwesenheit von NADPH geeignet ist und die Reaktion mit möglichst hoher Wechselzahl, d. h. der Zahl der pro Sekunde umgesetzten Substratmoleküle, katalysiert.
Eine weitere der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe besteht darin, die Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis derart zu verändern, dass das Enzym die Umwandlung von Pyruvat zu Alanin mit höherer Affinität zu NADPH als Substrat katalysiert und die Affinität des Enzyms zu NADPH bevorzugt höher ist als die zu NADH, noch bevorzugter ohne dass es zu einer signifikanten Verringerung der Wechselzahl relativ zur Wechselzahl des Wildtypenzyms kommt.
Eine weitere der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe besteht darin, ein redoxneutrales, für eine Eintopfreaktion unter milden Reaktionsbedingungen, d. h. insbesondere solchen ohne extreme Temperaturen oder pH-Werte und in Abwesenheit von Schwermetalle enthaltenden Katalysatoren oder sonstigen toxischen Verbindungen, geeignetes System zur Aminierung von Alkoholen bereitzustellen.
Diese und weitere Aufgaben werden durch den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung und insbesondere auch durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche gelöst, wobei sich Ausführungsformen aus den Unteransprüchen ergeben.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem ersten Aspekt gelöst durch ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist.
Das Problem wird in einer ersten Ausführungsform des ersten Aspekts durch ein Polypeptid gelöst, wobei es sich bei der Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette um Arginin handelt.
Das Problem wird in einer zweiten Ausführungsform des ersten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten Aspekts darstellt, gelöst durch ein Polypeptid, wobei zusätzlich Asp196 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit neutraler oder positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist.
Das Problem wird in einer dritten Ausführungsform des ersten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zweiten Aspekts darstellt, durch ein Polypeptid gelöst, wobei es sich bei der Aminosäure mit neutraler oder positiv geladener Seitenkette um eine Aminosäure aus der Gruppe handelt, die Alanin, Glycin, Serin und Cystein umfasst, bevorzugt um Alanin. Das Problem wird in einer vierten Ausführungsform des ersten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zweiten Aspekts darstellt, durch ein Polypeptid gelöst, wobei es sich um das in SEQ ID NO 1 dargestellte Polypeptid handelt.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem zweiten Aspekt gelöst durch ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine für das Polypeptid nach dem ersten Aspekt und seiner Ausführungsformen kodierende Nukleotidsequenz.
Das Problem wird in einer ersten Ausführungsform des zweiten Aspekts gelöst durch ein Nukleinsäuremolekül, wobei es sich um die in SEQ ID NO 2 dargestellte Nukleotidsequenz handelt.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem dritten Aspekt gelöst durch einen Vektor umfassend das Nukleinsäuremolekül nach dem zweiten Aspekt und seiner Ausführungsformen.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem vierten Aspekt gelöst durch eine Zelle umfassend das Polypeptid nach dem ersten Aspekt, das Nukleinsäuremolekül nach dem zweiten Aspekt oder den Vektor nach dem dritten Aspekt und der jeweiligen Ausführungsformen.
Das Problem wird in einer ersten Ausführungsform des vierten Aspekts gelöst durch eine Zelle, weiter exprimierend eine NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase.
Das Problem wird in einer zweiten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten Aspekts darstellt, gelöst durch eine Zelle nach dem vierten Aspekt oder der ersten Ausführungsform des vierten Aspekts, weiter exprimierend eine Transaminase.
Das der Erfindung zu Grunde liegende Problem wird in einem vierten Aspekt gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung, umfassend den Schritt c) Umsetzen von Pyruvat mit Ammonium und NADPH zu Alanin durch Kontaktieren mit dem Polypeptid nach dem ersten Aspekt oder mit der Zelle nach dem zweiten Aspekt oder einer der jeweiligen Ausführungsformen.
Das Problem wird in einer ersten Ausführungsform des vierten Aspekts gelöst durch Verfahren, weiter umfassend a) Umsetzen eines primären bzw. sekundären Alkohols zum Aldehyd bzw. Keton durch Kontaktieren mit einer NADP+-abhängigen Alkoholdehydrogenase in Anwesenheit von NADP+.
Das Problem wird in einer zweiten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten Aspekts darstellt, gelöst durch ein Verfahren, weiter umfassend b) Umsetzen des in Schritt a) hergestellten Aldehydes bzw. Ketons zum Amin durch Kontaktieren mit einer Transaminase in Anwesenheit von Alanin.
Das Problem wird in einer dritten Ausführungsform des vierten Aspekts, die auch eine Ausführungsform des ersten bis zweiten Aspekts darstellt, gelöst durch ein Verfahren, wobei die Schritte a), b) und c) in der gleichen Reaktionsmischung ablaufen, bevorzugt gleichzeitig.
Das Problem wird in einer weiteren Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts oder einer Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts gelöst durch eine Zelle oder ein Verfahren, wobei die Zelle sämtliche Enzyme aus der Gruppe umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase und die Transaminase intrazellulär lokalisiert exprimiert.
Das Problem wird in einer weiteren Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts oder einer Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts gelöst durch eine Zelle oder ein Verfahren, wobei es sich bei der NADP+-abhängigen Alkoholdehydrogenase um eine NADP+- abhängige Alkoholdehydrogenase aus der Gruppe umfassend die Alkoholdehydrogenasen aus E. coli (YjgB, Datenbankcode ZP_071 17674, und ein YahK, Datenbankcode BAE76108.1 ) und die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 3), bevorzugt um die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) oder Varianten davon handelt. Das Problem wird in einer weiteren Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts oder einer Ausführungsform des dritten oder vierten Aspekts gelöst durch eine Zelle oder ein Verfahren, wobei es sich bei der Transaminase um eine Transaminase aus der Gruppe umfassend die Transaminasen aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695), Pseudomonas putida (Datenbankencode YP_001668026.1 or YP_001671460) und Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023; Datenbankcode YP_353455) sowie Varianten davon handelt, bevorzugt um die Transaminase aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass ein Enzymsystem umfassend eine Alkoholdehydrogenase, bevorzugt eine NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase, eine Transaminase und ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist, verwendet werden kann, um die Aminierung eines Alkohols redoxneutral zu katalysieren.
Weiterhin basiert die vorliegende Erfindung auf der überraschenden Erkenntnis der Erfinder, dass die Affinität eines Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis zu NADPH dadurch erhöht werden kann, dass Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist und das Enzym dennoch katalytisch aktiv bleibt und die Reaktion mit hoher Wechselzahl zu katalysieren vermag.
Die Erfindung betrifft ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist. Dieses Polypeptid ist im Sequenzprotokoll unter der SEQ ID NO 1 verzeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Alanindehydrogenase", wie hierein verwendet, ein enzymatisch aktives Polypeptid verstanden, das die Umwandlung von Pyruvat unter Verbrauch von Ammonium und NADH bzw. NADPH, bevorzugt NADPH, zu Alanin und NAD+ bzw. NADP+, bevorzugt NADP+, katalysiert. Die Aminosäuresequenz der Alaninde-hydrogenase von Bacillus subtilis ist wie die Sequenzen der anderen in dieser Anmeldung durch Angabe eines Datenbankcodes bezeichneten Moleküle oder Sequenzen in der Datenbank des NCBI in der am 1 . April 2012 online zugänglichen Version unter dem Datenbankcode L20916 zu finden.
Die erfindungsgemäße Lehre kann jedoch nicht nur unter Verwendung der exakten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen bzw. auf die exakten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen der hierin beschriebenen biologischen Makromoleküle ausgeführt bzw. angewendet werden, beispielsweise der unter Datenbankcode L20916 beschriebenen Alanindehydrogenase, sondern auch unter Verwendung von bzw. auf Varianten derartiger Makromoleküle, die durch Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehr als einer Aminosäuren oder Nukleinsäuren erhalten werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „Variante" einer Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz, im Folgenden gleichbedeutend und austauschbar mit dem Begriff „Homologon" gebraucht, wie hierin verwendet, eine andere Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, die mit Hinblick auf die entsprechende ursprüngliche Wildtyp- Nukleinsäure- oder -aminosäuresequenz eine Homologie, hier gleichbedeutend mit Identität verwendet, von 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98, 99 % oder mehr Prozent aufweist, wobei bevorzugt andere als die das katalytisch aktive Zentrum ausbildende Aminosäuren oder für die Struktur oder Faltung essentielle Aminosäuren deletiert oder substituiert sind oder letztere lediglich konservativ substituiert sind, beispielsweise ein Glutamat durch ein Aspartat oder ein Leucin durch ein Valin. Der Stand der Technik beschreibt Algorithmen, die verwendet werden können, um das Ausmaß von Homologie von zwei Sequenzen zu berechnen, z. B. Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3rd edition. In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Variante einer Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz, bevorzugt zusätzlich zur oben genannten Sequenzhomologie, im Wesentlichen die gleiche enzymatisch Aktivität des Wildtypmoleküls bzw. des ursprünglichen Moleküls auf. Zum Beispiel weist eine Variante eines als Alanindehydrogenase enzymatisch aktiven Polypeptids die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche proteolytische Aktivität auf, d. h. die Fähigkeit, die Umsetzung von Pyruvat, Ammonium und NAD(P)H, bevorzugt NADPH, zu Alanin zu katalysieren. In einer besonderen Ausführungsform bedeutet der Begriff „im Wesentlichen die gleiche enzymatische Aktivität" eine Aktivität mit Hinblick auf die Substrate des Wildtyp-Polypeptids, die deutlich über der Hintergrundaktivität liegt oder/und sich um weniger als 3, bevorzugter 2, noch bevorzugter eine Größenordnung von den KM- und/oder kcat- Werten unterscheidet, die das Wildtyppolypeptid mit Hinblick auf die gleichen Substrate aufweist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante" einer Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz wenigstens einen aktiven Teil/oder Fragment der Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „aktiver Teil", wie hierin verwendet, eine Aminosäuresequenz oder eine Nukleinsäuresequenz, die eine geringere als die volle Länge der Aminosäuresequenz aufweist bzw. für eine geringere als die volle Länge der Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuresequenz oder die kodierte Aminosäuresequenz mit geringerer Länge als der Wildtyp-Aminosäuresequenz im Wesentlichen die gleiche enzymatische Aktivität wie das Wildtyppolypeptid oder eine Variante davon aufweist. In einer besonderen Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante" einer Nukleinsäure eine Nukleinsäure, deren komplementärer Strang, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, an die Wildtyp-Nukleinsäure bindet. Die Stringenz der Hybridisierungsreaktion ist für den Fachmann leicht bestimmbar und hängt im Allgemeinen von der Länge der Sonde, den Temperaturen beim Waschen und der Salzkonzentration ab. Im Allgemeinen benötigen längere Sonden höhere Temperaturen zum Hybridisieren, wohingegen kürzere Proben mit geringen Temperaturen auskommen. Ob Hybridisierung stattfindet, hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit der denaturierten DNA ab, an komplementäre Stränge zu annellieren, die in ihrer Umgebung vorhanden sind, und zwar unterhalb der Schmelztemperatur. Die Stringenz von Hybridisierungsreaktion und entsprechende Bedingungen sind ausführlicher in Ausubel et al. 1995 beschrieben. Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255-260 (1991 )). Die Hybridisierung findet in einer bevorzugten Ausführungsform unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5 x SSC- Puffer bei einer Temperatur von ca. 50 °C - 68 °C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von in der Reihenfolge zunehmender Bevorzugung ca. 50 °C - 68 °C, ca. 52 °C - 68 °C, ca. 54 °C - 68 °C, ca. 56 °C - 68 °C, ca. 58 °C - 68 °C, ca. 60 °C - 68 °C, ca. 62 °C - 68 °C, ca. 64 °C - 68 °C, ca. 66 °C - 68 °C eingestellt wird. Temperaturbereiche von ca. 64 °C - 68 °C oder ca. 66 °C - 68 °C werden bevorzugt. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2 x SSC oder 0,1 x SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2 °C von 50 °C auf 68 °C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise in der Reihenfolge zunehmender Bevorzugung mindestens 70 % oder mindestens 80 % oder mindestens 90 %, mindestens 91 %, mindestens 92 %, mindestens 93 %, mindestens 94 %, mindestens 95 %, mindestens 96 %, mindestens 97 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 % Identität zur Sequenz des eingesetzten Nukleinsäuremoleküls. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558). In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Begriff „Variante" einer Nukleinsäure, wie hierin verwendet, eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die für die gleiche Aminosäuresequenz wie die ursprüngliche Nukleinsäure oder eine Variante dieser Aminosäuresequenz im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Codes kodiert.
Für die Durchführung der erfindungsgemäßen Lehre ist essentiell, dass die verwendete Alanindehydrogenase von Bacillus subtilis nicht die Wildtypsequenz des Enzyms umfasst, sondern eine Sequenz, bei der Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet die Bezeichnung „homologe Position", wie hierin verwendet, dass die entsprechende Position bei einem Alignment des untersuchten Moleküls als zur Position X der Aminosäuresequenz aus der Alanindehydrogenase von Bacillus subtilis homolog erscheint. Dem Fachmann sind zahlreiche Softwarepakete und Algorithmen bekannt, mit denen ein Alignment von Aminosäuresequenzen angefertigt werden kann. Beispielhafte Softwarepakete Verfahren umfassen das vom EMBL bereitgestellte Paket ClustalW (Larkin et ai, 2007; Goujon et al. 2010) oder sind in Arthur M. Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics, 3rd edition, aufgeführt und beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Aminosäure" bzw. „Alanin", eine proteinogene L-Aminosäure bzw. L-Alanin verstanden, d.h. eine in der Natur von Organismen universell zum Aufbau von Polypeptiden verwendete Aminosäure. Der Begriff „Aminosäure" umfasst, wie sämtliche in dieser Anmeldung genannten Verbindungen, auch sämtliche Kristall-, Salz- oder ähnliche Formen der entsprechenden Verbindung. Beispielsweise umfasst Histidin auch das Salz aus protoniertem Histidin und einem Chloridion.
Für die Aktivität der Alanindehydrogenase ist essentiell, dass die Edukte der katalysierten Reaktion in ausreichender Menge vorliegen, insbesondere eine anorganische Stickstoffquelle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist unter dem Begriff„anorganische Stickstoffquelle", wie hierin verwendet, ein anorganisches stickstoffhaltiges Salz zu verstehen, das Ammonium umfasst oder im Stoffwechsel der Zelle zu Ammonium umgewandelt werden kann. Beispiele umfassen Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumhydroxid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration von Ammonium im Medium 0,05 bis 5, bevorzugter 0,1 bis 3, am bevorzugtesten 0,5 bis 3 g/L. Bevorzugt wird die anorganische Stickstoffquelle der Zelle erfindungsgemäß dadurch bereitgestellt, dass die entsprechende Verbindung in ausreichender Menge zur wässrigen Phase gegeben wird, in der die Reaktion abläuft.
Aminosäuren mit einer positiv geladenen Seitenketten umfassen die Aminosäuren Arginin, Lysin und Histidin, bevorzugt Arginin und Lysin, am bevorzugtesten Arginin. Mögliche erfindungsgemäße Polypeptide weisen beispielsweise die Mutationen Leu197Arg, Leu197Lys und Leu197His auf. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Lehre ausdrücklich auch Alanindehydrogenasen aus anderen Organismen als Bacillus subtilis, sofern diese zur Gruppe der Varianten der Alanindehydrogenase von Bacillus subtilis zählen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Lehre auch ein Polypeptid, das neben dem erwähnten Austausch an der Position des Leu197 einen weiteren Austausch an der Position Asp196 oder an dazu homologer Position aufweist, nämlich gegen eine Aminosäure mit neutraler oder positiver geladener Seitenkette. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Aminosäuren mit neutraler Seitenkette die Gruppe umfassend Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Tryptophan, Tyrosin, Isoleucin, Serin, Cystein, Threonin, Glutamin, Methionin, Phenylalanin, Prolin und Asparagin. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Aminosäuren mit positiv geladener Seitenkette die Gruppe umfassend Arginin, Lysin und Histidin, bevorzugt Arginin und Lysin.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle umfassen sämtliche unmodifizierte oder modifizierte DNA- und RNA-Moleküle umfassend eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz. Der Fachmann ist mit Standardverfahren der Molekularbiologie oder der synthetischen Chemie vertraut, mittels derer derartige Nukleinsäuremoleküle hergestellt werden können, beispielsweise der Polymerase-Kettenreaktion oder Festphasensynsthese. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um ein Nukleinsäuremolekül, das die in SEQ ID NO 2 dargestellte Nukleotidsequenz umfasst oder sie darstellt.
Die erfindungsgemäße Lehre kann sowohl unter Verwendung eines erfindungsgemäßen isolierten Polypeptids, Nukleinsäuremoleküls oder Vektors als auch unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle als Ganzzellkatalysator ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform versteht man unter dem Begriff „Ganzzellkatalysator", wie hierin verwendet, eine intakte, lebensfähige und metabolisch aktive Zelle, die eine erwünschte enzymatische Aktivität bereitstellt. Der Ganzzellkatalysator kann das zu verstoffwechselnde Substrat, im Falle der vorliegenden Erfindung den Alkohol oder das daraus entstehende Oxidationsprodukt, entweder ins Zellinnere transportieren, wo es von cytosolischen Enzymen verstoffwechselt wird, oder er kann das Enzym von Interesse auf seiner Oberfläche präsentieren, wo es gegenüber Substraten im Medium direkt exponiert ist. Dem Fachmann sind zahlreiche Systeme zur Herstellung von Ganzzellkatalysatoren bekannt, beispielsweise aus der DE 60216245. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform exprimiert die Zelle das erfindungsgemäße Polypeptid mit NADPH-abhängiger Alanindehydrogenaseaktivität, die Transaminase und/oder die NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase intrazellulär, d. h. das jeweilige Enzym ist nach der Expression dauerhaft im Inneren der Zelle lokalisiert, insbesondere im Cytosol der Zelle oder als Membran- oder in der Membran verankertes Protein, das ins Cytosol der Zelle hineinragt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der als Ganzzellkatalysator oder bei der als Expressionssystem verwendeten Zelle um eine prokaryotische, bevorzugt um eine bakterielle Zelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine Säugetierzelle. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um eine niedere eukaryotische Zelle, bevorzugt um eine Hefezelle. Beispielhafte prokaryotische Zellen umfassen Escherichia, besonders Escherichia coli, und Stämme der Gattung Pseudomonas und Corynebacterium. Beispielhafte niedere eukaryotische Zellen umfassen die Gattungen Saccharomyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Schizosaccharomyces, besonders die Stämme Candida tropicalis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica und Saccharomyces cerivisiae.
Im Falle der Verwendung eines erfindungsgemäßen Ganzzellkatalysators kann bei einigen Substraten, insbesondere solchen mit langen Alkylketten, der Eintritt des Moleküls ins Innere des Ganzzellkatalysators für die Herstellung der erwünschten Substanz limitierend sein. Im Falle langkettiger Alkane und Alkohole ist bevorzugt, dass der Ganzzellkatalysator ein AlkL- Polypeptid aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einem „AlkL- Polypeptid", wie hierin verwendet, um ein Polypeptid, das über eine Länge von 230 aufeinander abfolgenden Aminosäuren eine wenigstens 80, bevorzugt 90, noch bevorzugter 90%ige Sequenzidentität zu AlkL aus Pseudomonas putida (Datenbankcode CAB69081 ) und bevorzugt die Fähigkeit aufweist, den Import von langkettigen Alkanen ins Innere einer Zelle zu unterstützen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei einem„Polypeptid der AlkL- Familie", wie hierin verwendet, um ein in der äußeren Membran eines Gram-negativen Bakteriums lokalisiertes Polypeptid, welches das Sequenzmotiv DXWAPAXQ(V/A)GXR, aufweist, wobei X eine proteinogene Aminosäure darstellt, und bevorzugt zusätzlich AlkL aus Pseudomonas putida (Datenbankcode CAB69081 ) oder eine Variante davon ist. Beispielhafte Mitglieder der AlkL-Familie umfassen AlkL aus Pseudomonas putida (Datenbankcode CAB69081 ), Marinobacter aquaeolei VT8 (Datenbankcode YP_957722), Oceanicaulis alexandrii HTCC2633 (Datenbankcode ZP_00953584), Marinobacter manganoxydans Mnl7-9 (Datenbankcode ZP_09158756), Caulobacter sp. K31 (Datenbankcode YP_001672217), Pseudomonas oleovorans (Datenbankcode Q00595) und Varianten davon.
Bei den erfindungsgemäß eingesetzten enzymatisch aktiven Polypeptiden, insbesondere Alkoholdehydrogenase, Transaminase und Alanindehydrogenase, kann es sich aber jeweils auch um eine Präparation des erfindungsgemäßen Polypeptides in sämtlichen Aufreinigungsstufen, vom kruden Lysat bis zum isolierten Polypeptid, handeln. Die Zelle kann eine oder mehr als eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Enzym kodierende Nukleinsäuresequenz auf einem Plasmid oder integriert in ihr Genom enthalten. Dem Fachmann auf dem Gebiet sind zahlreiche Verfahren bekannt, mit denen enzymatisch aktive Polypeptide in geeigneten Zellen überexprimiert und aufgereinigt bzw. isoliert werden können. So können zur Expression der Polypeptide sämtliche dem Fachmann zur Verfügung stehende Expressionssysteme verwendet werden, beispielsweise Vektoren vom Typ pET oder pGEX. Zur Aufreinigung kommen chromatographische Verfahren in Frage, beispielsweise die affinitätschromatographische Aufreinigung eines mit einem Tag versehenen rekombinanten Proteins unter Verwendungen eines immobilisierten Liganden, beispielsweise eines Nickelions im Falle eines Histidin-Tags, von immobilisiertem Glutathion im Falle einer an das Zielprotein fusionierten Glutathion-S-Transferase oder von immobilisierter Maltose im Falle eines Tags umfassend Maltose-bindendes Protein.
Für eine Reihe von Anwendungen empfiehlt sich ausdrücklich die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptides in isolierter Form. In einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet der Begriff „isoliert", wie hierin verwendet, dass das Enzym in reinerer und/oder aufkonzentrierter Form vorliegt als in seiner natürlichen Quelle. In einer bevorzugten Ausführungsform gilt das Enzym als isoliert, wenn es ein Polypeptidenzym ist und mehr als 60, 70, 80, 90 oder bevorzugt 95 % des Massenproteinanteils der entsprechenden Präparation ausmacht. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren zur Messung der Masse eines Proteins in einer Lösung bekannt, beispielsweise die visuelle Abschätzung anhand der Dicke von entsprechenden Proteinbanden auf SDS-Polyacrylamidgelen, NMR-Spektroskopie oder massenspektrometriebasierte Verfahren.
Die aufgereinigten enzymatisch aktiven Polypeptide können entweder in löslicher Form oder immobilisiert eingesetzt werden. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren bekannt, mit denen Polypeptide an organischen oder anorganischen Festphasen kovalent oder nichtkovalent immobilisiert werden können, beispielsweise durch Sulfhydryl-Kopplungs-Chemie (z.B. Kits der Firma Pierce).
Bei den erfindungsgemäß verwendeten Enzymen handelt es sich bevorzugt um rekombinante Enzyme. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff„rekombinant", wie hierin verwendet, verstanden, dass das entsprechende Nukleinsäure-Molekül in der Natur nicht vorkommt und/oder es unter Verwendung von gentechnischen Methoden hergestellt wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform spricht man von einem rekombinanten Protein, wenn das entsprechende Polypeptid von einer rekombinanten Nukleinsäure kodiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter einer rekombinanten Zelle, wie hierin verwendet, eine Zelle verstanden, die wenigstens eine rekombinante Nukleinsäure oder ein rekombinantes Polypeptid aufweist. Dem Fachmann sind zum Herstellen rekombinanter Moleküle oder Zellen geeignete Verfahren bekannt, beispielsweise die in Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition, beschriebenen.
Voraussetzung für die Benutzung der erfindungsgemäßen Lehre ist das Vorliegen einer wässrigen Phase, d. h. einem wässrigen Kultur- oder Reaktionsmedium, das zur wenigstens zeitweiligen Erhaltung oder Kultivierung der Zelle oder der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptides geeignet ist. Dem Fachmann sind zahlreiche wässrige Kulturmedien bekannt, die für die Erhaltung oder Kultivierung von Zellen, insbesondere biotechnologisch bedeutsamer Zellen, geeignet sind. Darunter fallen gleichermaßen Vollmedien wie LB-Medium, Minimalmedien wie M9-Medien sowie Selektivmedien, beispielsweise solche, die eine hohe Salzkonzentration enthalten und daher nur das Wachstum halophiler oder zumindest halotoleranter Organismen ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „wässrige Phase", wie hierin verwendet, ein mit hydrophoben Lösungsmitteln im Wesentlichen unmischbares Reaktions- oder Kulturmedium auf Wasserbasis verstanden, das mit Hinblick auf sämtliche relevante Faktoren, insbesondere pH-Wert, Salzgehalt und Temperatur, derart beschaffen ist, das es die Lebensfähigkeit darin enthaltener Zellen, bevorzugt Mikroorganismen, wenigstens zeitweilig erhält oder fördert. Die Temperaturansprüche verschiedener biotechnologisch bedeutsamer Zellen können mikrobiologischen und molekularbiologischen Lehrbüchern entnommen werden, z.B. Fuchs/Schlegl, 2008. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert des wässrigen Kulturmediums zum Zeitpunkt des Kontaktierens zwischen 4 bis 9, bevorzugter zwischen 4,5 bis 8,5, am bevorzugtesten zwischen 6,5 und 7,5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Temperatur zwischen 5 und 42 °C, bevorzugter zwischen 15 und 40 °C, am bevorzugtesten zwischen 20 und 37 °C.
Die Verwendung von Enzymen erfordert die Anwesenheit aller notwendigen Substrate. Beispielsweise erfordert die Aktivität der Alanindehydrogenase die Anwesenheit der Substrate Ammonium, eines geeigneten reduzierten Redoxfaktors und Pyruvat. Weiterhin ist für die Aktivität von Enzymen eine geeignete wässrige Lösung erforderlich, d. h. eine Lösung, die mit Hinblick auf den anwesenden erforderlichen Puffer, pH, Temperatur, Salzkonzentration, die Anwesenheit notwendiger Cofaktoren oder aktivitätsfördernder oder -erhaltender weiterer Polypeptide und sonstige relevante Faktoren geeignet ist, um die Aktivität des Enzyms zumindest zeitweilig zu erhalten. Verfahren zur Auswahl geeigneter Lösungen und enzymatische Tests, mittels derer die Aktivität von Enzymen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und im Stand der Technik, beispielsweise in Cornish-Bowden (1995), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, beschrieben.
Erfindungsgemäß exprimiert die erfindungsgemäße Zelle neben der modifizierten Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis in einer bevorzugten Ausführungsform eine NADP+- abhängige Alkoholdehydrogenase. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Alkoholdehydrogenase", wie hierin verwendet, wird ein Enzym verstanden, das einen Aldehyd bzw. Keton zu dem entsprechenden primären bzw. sekundären oder sonstigem Alkohol oxidiert. Beispiele umfassend die NADP+-abhängigen Alkoholdehydrogenasen aus £. coli (YjgB, Datenbankcode ZP_071 17674, und ein YahK, Datenbankcode BAE76108.1 ) und die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) sowie die jeweiligen Varianten davon. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5).
Erfindungsgemäß exprimiert die erfindungsgemäße Zelle neben der modifizierten Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis und/oder neben der NADP+-abhängigen Alkoholdehydrogenase in einer bevorzugten Ausführungsform eine Transaminase. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff„Transaminase", wie hierin verwendet, ein Enzym verstanden, das die Übertragung von Aminogruppen von einem Donor-, bevorzugt eine Aminosäure, auf ein Akzeptormolekül, bevorzugt eine Ketocarbonsäure, katalysiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Transaminase aus der Gruppe ausgewählt, die die ω-Transaminase aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695), Pseudomonas putida (Datenbankcode YP_001668026), Pseudomonas putida (Datenbankencode YP_001668026.1 or YP_001671460); Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023; Datenbankcode YP_353455) sowie Varianten davon umfasst, und es handelt sich bevorzugt um die Transaminase aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695).
Im Falle der Verwendung wenigstens eines Ganzzellkatalysators ist bei längerer Reaktionszeit zu beachten, dass die Bedingungen mit der Lebensfähigkeit der wenigstens einen als Ganzzellkatalysator eingesetzten Zelle kompatibel sind. Der Fachmann kann Standardwerken, beispielsweise Fuchs/Schlegel (2007) Allgemeine Mikrobiologie, 2008, Georg Thieme Verlag, Bedingungen und Lösungen entnehmen, die die Erhaltung solcher Zellen in einem lebensfähigen Zustand ermöglichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf eine große Anzahl von industriell relevanten Alkoholen angewandt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um eine ω-Hydroxycarbonsäure oder einen Ester, bevorzugt Methylester, davon, die oder der zu einer ω-Aminocarbonsäure oxidiert und aminiert wird. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich um ein Diol, das zu einem Diamin oxidiert und aminiert wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem primären Alkohol um ein Hydroxyalkylamin. Die Länge der Kohlenstoffkette ist dabei variabel und x beträgt wenigstens 3. Bevorzugt weist die Kohlenstoffkette mehr als drei C-Atome auf, d. h. x = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr. Beispielhafte Verbindungen umfassen ω-Hydroxy- Laurinsäure, ω-Hydroxy-Laurinsäure-Methylester, und Alkan-Diole, insbesondere 1 ,8-Octan- Diol und 1 ,10-Dekan-Diol.
In Frage kommen weiterhin α-Hydroxycarbonsäuren, bevorzugt diejenigen, die zu den a- Ketocarbonsäuren oxidiert werden können, d. h. solchen der Formel Rs-C(OH)H-COOH, die wiederum durch Aminierung zu den proteinogenen Aminosäuren umgewandelt werden können, darunter insbesondere essentielle Aminosäuren wie Methionin und Lysin. Konkrete Beispiele umfassend die Säuren, bei denen Rs ein Substituent aus der Gruppe umfassend, H, Methyl, - (CH2)4-NH2, -(CH2)3-NH-NH-NH2, -CH2-CH2-S-CH3, -CH(CH3)2, -CH2-CH(CH3)2, -CH2-(1 H-indol- 3-yl), -CH(OH)-CH3, -CH2-Phenyl, -CH(CH3)-CH2-CH3 ist. Weitere sekundäre Alkohole umfassen 2-Alkanole, z. B. 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 2-Hexanol usw. Weiter kommen sekundäre mehrwertige Alkohole in Betracht, beispielsweise Alkandiole wie Ethandiol, Alkantriole wie Glycerin und Pentaerythrit in Betracht. Weitere Beispiele umfassen Cycloalkanole, bevorzugt Cyclohexanol und Bis(p-hydroxycyclohexyl)methan, die Alkohole der Gruppe H3C - C(OH)H - (CH2)X - R4, wobei R4 aus der Gruppe ausgewählt ist, die -OH, -SH, - NH2 und -COOR5 umfasst, x wenigstens 3 ist und R5 aus der Gruppe ausgewählt ist, die H, Alkyl und Aryl umfasst.
Die Länge der Kohlenstoff kette ist im Falle von Alkoholen der Formel Alkohole der H3C - C(OH)H - (CH2)X - R4 variabel und x beträgt wenigstens 3. Bevorzugt weist die Kohlenstoffkette mehr als drei C-Atome auf, d. h. x = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 oder mehr. Zahlreiche sekundäre Alkohole sind kommerziell erhältlich und können in käuflicher Form direkt eingesetzt werden. Alternativ kann der sekundäre Alkohol zuvor oder in situ biotechnologisch erzeugt werden, beispielsweise durch Hydroxylierung eines Alkans durch geeignete Alkanoxidasen, bevorzugt Monooxygenasen, erzeugt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist R4 im Falle von sekundären Alkoholen der Formel H3C - C(OH)H - (CH2)X - R4 aus der Gruppe ausgewählt, die -OH und -COOR5 umfasst, x ist wenigstens 1 1 und R5 ist aus der Gruppe ausgewählt, die H, Methyl, Ethyl und Propyl umfasst.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem primären oder sekundären Alkohol um einen Zuckeralkohol, worunter in einer bevorzugten Ausführungsform, wie hierin, verwendet, ein Kohlenhydrat mit wenigstens einer Hydroxygruppe verstanden wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um einen dizyklischen Zuckeralkohol. Unter einem „dizyklischen Zuckeralkohol" wird in einer bevorzugten Ausführungsform, wie hierin verstanden, ein Zuckeralkohol verstanden, der wenigstens transient, zwei Ringsysteme ausbilden kann. In einer bevorzugtesten Ausführungsform handelt es sich bei einem Zuckeralkohol um ein Dianhydrohexitol oder eine Verbindung aus der Gruppe umfassend 1 ,4:3,6-Dianhydro-D-Mannitol, 1 ,4:3,6-Dianhydro-D-Glucitol (Isosorbid) und 1 ,4:3,6-Dianhydro- L-Iditol.
Stehen die erfindungsgemäß umzusetzenden Alkohole nicht also solche, sondern nur in Form von Alkanvorläufern zur Verfügung, so besteht die Möglichkeit, dass die erfindungsgemäße Zelle zusätzlich eine Monooxygenase exprimiert oder das erfindungsgemäße Verfahren um einen Schritt erweitert wird, in dem eine Monooxygenase ein Alkan hydroxyliert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Monooxygenase um eine Monooxygenase aus der AlkB-Familie. AlkB stellt eine Oxidoreduktase aus dem AlkBGT- System aus Pseudomonas putida dar, die für ihre Hydroxylase-Aktivität bekannt ist. Diese ist von zwei weiteren Polypeptiden, AlkG und AlkT abhängig. AlkT wird als FAD-abhängige Rubredoxin-Reduktase charakterisiert, die Elektronen von NADH auf AlkG überträgt. AlkG ist ein Rubredoxin, ein eisenhaltiges Redoxprotein, das als direkter Elektronendonor für AlkB fungiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Monooxygenase aus der alkB-Familie", wie hierein verwendet, eine membranständige Alkanhydroxylase verstanden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird unter dem selben Begriff „Alkanhydroxylase des alkB-Typs" ein Polypeptid mit einer Sequenzhomologie von zunehmend bevorzugt wenigstens 75, 80, 85, 90, 92, 94, 96, 98 oder 99 % zur Sequenz des AlkB von Pseudomonas putida Gpo1 (Datenbankcode: CAB54050.1 , dieser Datenbankcode und sämtliche weitere in diesem Dokument verwendete Datenbankcodes stammen aus der Genbank Protein-Datenbank des NCBI in dem am 9. November 201 1 verfügbaren Release) verstanden. Der Begriff„Sequenz", wie hierin verwendet, kann sich auf die Aminosäuresequenz eines Polypeptides und/oder die dafür codierende Nukleinsäuresequenz beziehen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Monooxygenase um Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie. In einer bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie" eine cytosolische Oxidase verstanden, die Teil eines 3 Komponenten-Systems ist, das weiterhin ein Ferredoxin und eine Ferredoxin-Reduktase umfasst, mit einer Alkan-Bindestelle und der Fähigkeit, Alkane zu hydroxylieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Enzym, das zu wenigstens 80, bevorzugt 90, am bevorzugtesten 95 oder 99 Prozent Sequenzidentität zur Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie aus Alcanivorax borkumensis SK2 (Datenbankcode YP_691921 ) aufweist oder um ein Enzym, das eine Polypeptidsequenz umfasst, die wenigstens 80, bevorzugt 90, am bevorzugtesten 95 oder 99 Prozent Sequenzidentität zur Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie aus Alcanivorax borkumensis SK2 (Datenbankcode YP_691921 ) aufweist und darüber hinaus Alkanhydroxylase-Aktivität aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist unter dem Begriff „Alkanhydroxylase-Aktivität", wie hierin verwendet, die Fähigkeit zu verstehen, die Hydroxylierung von Alkanen oder unsubstituierten linearen Alkylresten umfassend wenigstens fünf, bevorzugt zwölf Kohlenstoffstoffreste zu katalysieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird unter dem Begriff „Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153- Familie" eine nicht membrangebundene Oxidase verstanden, die eine Bindestelle für Alkane, unsubstituierte lineare Alkylreste umfassend wenigstens fünf, bevorzugt zwölf Kohlenstoffstoffreste oder einfach hydroxylierte Alkane und deren Polypeptidkette das Motiv LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei einer„Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie", wie hierin verwendet, um eine Cytochrom P450-Monooxygenase der CYP153-Familie aus Alcanivorax borkumensis SK2 (Datenbankcode YP_691921 ) oder eine Variante davon, die bevorzugt Alkanhydroxylaseaktivität aufweist. Die vorliegenden Anmeldung umfasst ein Sequenzprotokoll mit den folgenden Polypeptid (Polyp)- und Nukleotid (DNA)-Sequenzen:
SEQ ID NO Typ Beschreibung
1 Polyp Alanin-Dehydrogenase von Bacillus subtilis mit Leu197Arg
und Asp196Ala
2 DNA Nukleotidsequenz kodierend für Alanin-Dehydrogenase von
Bacillus subtilis mit Leu197Arg und Asp196Ala
3 Polyp Alkoholdehydrogenasen aus E. coli (YjgB, Datenbankcode
ZP_071 17674,)
4 Polyp Alkoholdehydrogenasen aus E. coli (YahK, Datenbankcode
BAE76108.1 )
5 Polyp Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (zuvor SEQ ID 10)
6 Polyp Transaminase aus Chromobacterium violaceum
(Datenbankcode NP_901695)
7 Polyp Aminotransferase aus Pseudomonas putida (Datenbankcode
YP_001668026)
8 Polyp Aminotransferase aus Pseudomonas putida
(Datenbankencode YP_001668026.1 )
9 Polyp Aminotransferase aus Pseudomonas putida
(Datenbankencode YP_001671460)
10 Polyp Aminotransferase aus Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC
17023; Datenbankcode YP_353455)
1 1 DNA Oligodesoxynukleotid AlaDHfw (zuvor Seq ID 5)
12 DNA Oligodesoxynukleotid AlaDHrv (zuvor 6)
13 DNA Oligodesoxynukleotid AlaDH_D196A/L197Rfw (zuvor 8)
14 DNA Oligodesoxynukleotid AlaDH_D196A/L197Rrv (zuvor 9)
15 DNA Oligodesoxynukleotid ADHfw (zuvor 1 1 )
16 DNA Oligodesoxynukleotid ADHrv (zuvor 12)
17 Polyp Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans (zuvor 14)
18 DNA Oligodesoxynukleotid pCR6fw (zuvor 15)
19 DNA Oligodesoxynukleotid pCR6rv (zuvor 16) 20 DNA Oligodesoxynukleotid pCR6_L417Mfw (zuvor 18)
21 DNA Oligodesoxynukleotid pCR6_L417Mrv (zuvor 19)
22 Polyp Alanin-Dehydrogenase von Bacillus subtilis mit Leu197Arg
und Asp196Ala mit His-Tag
23 DNA Nukleotidsequenz kodierend für Alanin-Dehydrogenase von
Bacillus subtilis mit Leu197Arg und Asp196Ala mit His-Tag
Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.
Fig. 1 zeigt die strukturelle Überlagerung des Homologiemodells der AlaDH aus Bacillus subtilis (weiss; SEQ ID NO: 1 ), des Homologiemodells der AlaDH aus Shewanella sp. (grau) und der Kristallstruktur der AlaDH aus Mycobacterium tuberculosis (schwarz; PDB Code: 2VHW). Die dargestellte Aminosäure Asp196 der BasAlaDH entspricht der Aminosäure Asp198 in der SheAlaDH bzw. Aminosäure Asp198 in der MtAlaDH. Die Aminosäure Leu197 der BasAlaDH entspricht der Aminosäure Arg199 in der SheAlaDH bzw. Aminosäure Ile199 in der MtAlaDH. Die Aminosäure Asn198 der BasAlaDH entspricht der Aminosäure Ser200 in der SheAlaDH bzw. Aminosäure Asn200 der MtAlaDH.
Fig. 2 zeigt die FMOC/HPLC-Analyse der durch die drei Enzyme RasADH, pCR6(L417M) und AlaDH(D196A/L197R) katalysierten Umsetzung von Isosorbit und Ammoniumsalz nach 96 h. Gezeigt sind (a) die Standards (je 1 mM der Aminoalkohole I, I I, I II und IV gemäß Fig. 3 + je 1 mM der Diamine DAI, DAS und DAM), (b) die durch RasADH, pCR6(L417M) und AlaDH(D196A/L197R) katalysierte Reaktion nach 96 h, (c) die Kontrollreaktion wie bei (b) aber ohne RasADH nach 96 h. Zur Derivatisierung wurden 20 μΙ der jeweiligen Reaktionsprobe in ein HPLC-Vial mit 60 μΙ 0,5 M Natriumborat pH 9,0 überführt, gut gemischt und 80 μΙ FMOC- Reagenz (Alltech Grom) hinzugegeben. Überschüssiges FMOC-Reagenz wurde durch Zugabe von 100 μΙ EVA-Reagenz (Alltech Grom) abgefangen. Durch Zufügen von 440 μΙ 50 mM Natriumacetat, pH 4,2 + 70 % Acetonitril (v/v) wurden die Bedingungen für die HPLC-Analyse eingestellt. Chromatographische Bedingungen: Agilent SB-C8 Säule (4,6 χ 150 mm); Flussrate: 1 ml/min; Injektionsvolumen: 20 μΙ; Puffer A. 50 mM NaAcetat pH 4,2 + 20 % Acetonitril (v/v); Puffer B: 50 mM NaAcetat pH 4,2 + 95 % Acetonitril (v/v); Gradient: 0 min 16 % B, 5 min 16 % B, 25 min 18 % B, 28 min 52 % B, 40 min 25 % B.
Fig. 3 zeigt die chemischen Formeln des Ausgangssubstrats Isosorbit (1 ,4:3,6-Dianhydro-D- Sorbit(ol)), der Stereoisomere des Aminoalkohols (I bis IV) sowie der stereoisomeren Formen des Diamin-Endproduktes (DAI: 2,5-Diamino-1 ,4:3,6-Dianhydro-2,5-Didesoxy-L-ldit(ol), DAS: 2,5-Diamino-1 ,4:3,6-Dianhydro-2,5-Didesoxy-D-Sorbit(ol) und DAM: 2,5-Diamino-1 ,4:3,6- Dianhydro-2,5-Didesoxy-D-Mannit(ol).
Fig. 4 zeigt die Ausbeuten an Mono- und Diamin aus der FMOC/HPLC-Analyse der durch RasADH, pCR6(L417M) und AlaDH(D196A/L197R) katalysierten Umsetzung von Isosorbit und Ammoniumacetat bei unterschiedlichen Ammoniumkonzentrationen. Reaktionsbedingungen: 300 mM Isosorbit, 2 mM NADP+, 100 - 300 mM NH4OAc, 5 mM L-Alanin, 0,3 mM PLP, 132 μΜ RasADH, 40 μΜ pCR6(L417M), 24 μΜ AlaDH(D196A/L197R) in 25 mM Hepes/NaOH, pH 8,3; Inkubation bei 30 °C.
Beispiel 1 : Änderung der Cosubstratspezifität einer Alanin-Dehydrogenase durch bioinformatische Analyse und Protein-Engineering
Strukturhomologa der L-Alanin-Dehydrogenase (AlaDH) aus Bacillus subtilis (BasAlaDH; SEQ ID NO: 1 ) wurden mit Hilfe des Servers HHpred (Bioinformatics Toolkit; MPI Tübingen) identifiziert. Dabei wurde ein globales multiples Sequenzalignment (MSA) mit HHblits (Bioinformatics Toolkit; MPI Tübingen; URL: http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred) in drei Iterationen und mit aktiviertem„Secondary Structure Score" generiert. Als ähnlichstes Protein (51 % Sequenzidentität) erwies sich die AlaDH aus Mycobacterium tuberculosis (MtAlaDH). Die Kristallstrukturen dieser AlaDH (PDB Codes: 2VHW, 2VHX, 2VHY und 2VHZ) wurden als Strukturvorlage zur Generierung von Homologiemodellen der BasAlaDH und der AlaDH aus Shewanella sp. (SheAlaDH) mittels des HHpred Servers verwendet (Fig. 1 ).
Die MtAlaDH besitzt wie das Enzym aus Bacillus subtilis eine Redoxfaktorspezifität für NADH, wohingegen die SheAlaDH als einzige bekannte AlaDH in der Lage ist, sowohl NADH als NADPH enzymatisch umzusetzen (Ashida et al. (2004) J. Mol. Catal. B: Enzym. 30, 173-176). Eine strukturelle Überlagerung der Homologiemodelle von BasAlaDH und SheAlaDH mit der Referenz-Struktur der MtAlaDH wurde mit dem Programm Chimera (Version 1.5.3; URL: http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ mit der Funktion „Matchmaker"; URL http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/docs/ContributedSoftware/matchmaker/matchmaker.html) berechnet (Fig. 1 ). Dazu wurde der Needleman-Wunsch Algorithmus unter Verwendung der Matrize Blossum-62 benutzt und der „Secondary Structure Score" auf 30 % gesetzt. Als Iterationsabbruch diente eine Distanz von 1.0 Ä zwischen paarweisen Atomen.
Die strukturelle Überlagerung der genannten drei AlaDHs zeigt in der Nähe des„Rossmann Fold"-Motivs einen für die NADH-Spezifität offenbar verantwortlichen konservierten Aspartat- Rest (Asp196 in SEQ ID NO: 1 ; siehe Fig. 1 )
Der konservierte Aspartat-Rest war Ausgangspunkt für die Konstruktion der BasAlaDH Enzymvarianten D196A/L197R, wobei die Struktur der SheAlaDH als Template verwendet wurde. Wie die strukturelle Überlagerung zeigt (Fig. 1 ), wird durch den Austausch D196A eine Ausbildung von Wasserstoffbrücken von Asp196 zum 2'- und 3'-OH der Ribose des NADH verhindert, aber die Bindung des am 2'-OH der Ribose befindlichen Phosphats des NADPH an das Enzym ermöglicht. Durch die Substitution L197R wird die neue Cosubstratspezifität in Folge der Ausbildung von Salzbrücken zwischen dem eingeführten Arginin-Rest und der Phosphat-Gruppe des NADPH weiter begünstigt.
Das Gen der AlaDH aus Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 4) wurde durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide AlaDHfw (SEQ ID NO: 1 1 ) und AlaDHrv (SEQ ID NO: 12) von dem Plasmid pUC18-AlaDH amplifiziert, mit dem Restriktionsenzym Kpnl am 3'-Ende geschnitten und mit dem Expressionsvektor pASK- IBA35(+) (IBA GmbH, Göttingen), der mit den Restriktionsenzymen Ehel und Kpnl geschnitten wurde, ligiert. Das resultierende Expressionsplasmid pASK-IBA35(+)-AlaDH, auf dem die BasAlaDH mit einem N-terminalem His6-tag kodiert ist, wurde mittels analytischem Restriktionsverdau sowie DNA-Sequenzierung verifiziert. Das für die Enzymvariante D196A/L197R kodierende Plasmid wurde durch ortsgerichtete Mutagenese nach der QuikChange-Methode unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide AlaDH_D196A/L197Rfw (SEQ ID NO: 13) und AlaDH_D196A/L197Rrv (SEQ ID NO: 14) erzeugt. Das resultierende Expressionsplasmid pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A L197R) wurde mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
Die Expressionsplasmide für die BasAlaDH sowie deren Variante D196A/L197R wurden anschließend zur Transformation von E. coli BL21 verwendet (Sambrook et al. (2001 ) Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die Genexpression wurde jeweils in LB-Medium (Sambrook et al. 2001 ) mit 100 μg ml Ampicillin (2 L Kulturvolumen im 5 L-Schüttelkolben) bei 30 °C in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD550 = 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg ml Anhydrotetracyclin (aTc; Acros, Geel, Belgien) induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und die Zellen in 40 mM Hepes/NaOH pH 7,5, 0,5 M NaCI aufgenommen und in einem French-Press Homogenisator (G. Heinemann, Schwäbisch Gmünd) mechanisch aufgeschlossen. Der klare Überstand wurde auf eine mit Zn2+ beladene Chelating Sepharose™ Fast Flow Säule (2.8 ml_ Bettvolumen; GE Healthcare, München) aufgetragen und die mit dem His6-tag fusionierten Enzyme mit einem linearen Imidazol/HCI-Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM in 40 mM Hepes/NaOH pH 7,5, 0,5 M NaCI eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mittels Gelfiltration an Superdex200 (GE Healthcare) in Gegenwart von 25 mM Hepes/NaOH pH 8,3 chromatographisch gereinigt.
Die Michaelis-Konstante (KM) und die Wechselzahl (kcat) der beiden gereinigten Enzyme wurden für die Cosubstrate NADH sowie NADPH anhand der reduktiven Aminierung von Pyruvat bestimmt und die katalytische Effizienz berechnet (kcat/KM) (Tabelle 1 ). Die Enzymtests setzten sich wie folgt zusammen:
Reagenz bzw. Enzym Endkonzentration im Ansatz
Pyruvat 5 mM
Ammoniumacetat 200 mM
NADH/H+ bzw. NADPH/H+ 10 - 500 μΜ
BasAlaDH (Wildtyp bzw. Doppelmutante D196A/L197R) 0.5 nM
Hepes/NaOH-Puffer pH 8,3 25 mM
Gesamtvolumen 250 μΙ Dabei wurde gefunden, dass durch die Substitutionen D196A und L197R die Cosubstratspezifitat der BasAlaDH erfolgreich von NADH auf NADPH geändert wurde, wobei die katalytische Effizienz hinsichtlich der reduktiven Aminierung von Pyruvat nahezu erhalten blieb.
Tabelle 1 : KM- und kcat-Werte für die durch BasAlaDH katalysierte reduktive Aminierung von Pyruvat mit NADH bzw. NADPH.
Beispiel 2: Synthese von Mono- und Diaminen aus Isosorbit und Ammoniumsalzen durch gekoppelte enzymatische Reaktion einer Alkoholdehydrogenase, einer Aminotransferase und einer Alanin-Dehydrogenase
Das Strukturgen der Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 5) wurde durch PCR unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide ADHfw (SEQ ID NO: 15) und ADHrv (SEQ ID NO: 16) von dem Plasmid pEam-RasADH (Lavandera et al. (2008) J. Org. Chem. 73, 6003- 6005) amplifiziert, mit dem Restriktionsenzym Kpn\ am 3'-Ende geschnitten und schließlich mit dem Expressionsvektor pASK-IBA35(+), der mit den Restriktionsenzymen Ehe\ und Kpn\ geschnitten wurde, ligiert. Das resultierende Expressionsplasmid pASK-IBA35(+)-RasADH, auf dem die Alkoholdehydrogenase mit einem N-terminalem His6-tag kodiert ist, wurde durch analytischen Restriktionsverdau sowie DNA-Sequenzierung verifiziert.
Das Gen der Aminotransferase aus Paracoccus denitrificans (SEQ ID NO: 17) wurde durch PCR unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide pCR6fw (SEQ ID NO: 18) und pCR6rv (SEQ ID NO: 19) von dem Plasmid pET21 a(+)-pCR6 amplifiziert, mit dem Restriktionsenzym Hind\\\ am 3'-Ende geschnitten und schließlich mit dem Expressionsvektor pASK-IBA35(+), der mit den Restriktionsenzymen Ehe\ und Hind\\\ geschnitten wurde, ligiert. Das resultierende Expressionsplasmid pASK-IBA35(+)-pCR6, auf dem die Aminotransferase mit einem N- terminalem His6-tag kodiert ist, wurde durch analytischen Restriktionsverdau sowie DNA- Sequenzierung verifiziert. Das für die Enzymvariante L417M der Aminotransferase codierende Plasmid wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese des Plasmids pASK-IBA35(+)-pCR6 nach der QuikChange-Methode (Agilent, Waldbronn) unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide pCR6_L417Mfw (SEQ ID NO: 20) und pCR6_L417Mrv (SEQ ID NO: 21 ) erzeugt. Das resultierende Expressionsplasmid pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M) wurde mittels DNA- Sequenzierung verifiziert.
Als Expressionsplasmid für die D196A L197R-Mutante der AlaDH aus Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 1 ) wurde pASK-IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R) aus Beispiel 1 verwendet.
Die Expressionsplasmide pASK-IBA35(+)-RasADH, pASK-IBA35(+)-pCR6(L417M) und pASK- IBA35(+)-AlaDH(D196A/L197R) für die drei Enzyme wurden anschließend jeweils zur Transformation von E. coli BL21 verwendet. Die Genexpression in den drei resultierenden Stämmen wurde jeweils in LB-Medium mit 100 Dg/ml Ampicillin (2 L Kulturvolumen im 5 L- Schüttelkolben) bei 30 °C in der exponentiellen Wachstumsphase bei OD550 = 0,5 durch Zugabe von 0,2 μg ml aTc induziert. Nach einer Induktionszeit von 3 h wurde die Kultur geerntet und die Zellen in 40 mM Hepes/NaOH pH 7,5, 0,5 M NaCI aufgenommen und in einem French-Press Homogenisator mechanisch aufgeschlossen. Der klare Überstand wurde auf eine mit Zn2+ beladene Chelating Sepharose™ Fast Flow Säule aufgetragen und die mit dem His6-tag fusionierten Enzyme mit einem linearen Imidazol/HCI-Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM in 40 mM Hepes/NaOH pH 7,5, 0,5 M NaCI eluiert. Die Elutionsfraktionen wurden durch Ultrafiltration konzentriert und mittels Gelfiltration an Superdex200 in Gegenwart von 25 mM Hepes/NaOH pH 8,3 chromatographisch gereinigt.
Die drei gereinigten Enzyme wurden direkt für die Aminierung des Isosorbits (1 ,4:3,6- Dianhydro-D-Sorbit(ol)) unter Recycling der Redoxfaktoren NADP+ und L-Alanin eingesetzt. Der Enzymtest setzte sich wie folgt zusammen:
Reagenz bzw. Enzym Endkonzentration im Ansatz
Hepes/NaOH-Puffer pH 8,3 25 mM
Isosorbit 300 mM
NADP+ 2 mM
L-Alanin 5 mM
Pyridoxalphosphat (PLP) 0,3 mM Ammoniumacetat (NH4OAc) 100 - 300 mM
Alkoholdehydrogenase 132 μΜ
Aminotransferase (L417M) 40 μΜ
Alanin-Dehydrogenase (D196A/L197R) 24 μΜ
Gesamtvolumen 250 μΙ
Nach Inkubation für einen Zeitraum von 0 bis 96 h bei 30 °C wurde die Bildung von Mono- und Diaminen als Reaktionsprodukte unter Zugabe eines Überschusses an FMOC-Reagenz (Alltech Grom, Rottenburg-Hailfingen; siehe Fig. 1 ) durch HPLC (Agilent 1200 Serie; siehe Fig. 2) mit einem Fluoreszenz-Detektors nachgewiesen und quantifiziert.
Fig. 2 (Mitte) zeigt das Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches. Bei den Retentionszeiten von 15,1 13 min, 15,720 min, 16,580 und 14,472 min wurden Produkt-Peaks beobachtet, die anhand der mitgeführten Standards dem 6-Amino-3-alkohol in den 4 möglichen stereoisomeren Formen gemäß Fig. 3 (IV: 3S,6S; III: 3R,6R; I: 3S,6R; II: 3R,6S) zugeordnet werden konnten. Diese Peaks traten bei der FMOC/HPLC-Analyse in der Negativkontrolle (analog angesetzter und inkubierter Reaktionsansatz, aber ohne Alkoholdehydrogenase) nicht auf. Darüber hinaus wurden nach einer Reaktionszeit von 96 h weitere Produkt-Peaks bei Retentionszeiten von 37,479 min und 38,135 min erhalten. Diese lassen sich anhand der Standards den Diaminen 2,5-Diamino-1 ,4:3,6-Dianhydro-2,5-Didesoxy-L-ldit(ol) (DAI) und 2,5- Diamino-1 ,4:3,6-Dianhydro-2,5-Didesoxy-D-Sorbit(ol) (DAS) zuordnen.
Die Kopplung der drei enzymatischen Reaktionen ermöglicht also einen Nettoumsatz von Isosorbit zum (3S,6S)-6-Amino-3-alkohol als Hauptprodukt mit Recycling-Faktoren von 30 für NADP+ und 12 für L-Alanin (Fig. 4).

Claims

Ansprüche
1 . Zelle umfassend ein Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu 197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist, oder ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine für das Polypeptid kodierende Nukleotidsequenz.
2. Verfahren zur Herstellung von Alanin oder einer unter Verbrauch von Alanin entstehenden Verbindung, umfassend den Schritt c) Umsetzen von Pyruvat mit Ammonium und NADPH zu Alanin durch Kontaktieren mit der Zelle nach Anspruch 1 oder mit einem Polypeptid umfassend die Aminosäuresequenz der Alanindehydrogenase aus Bacillus subtilis oder eine Variante davon, wobei Leu197 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist
3. Verfahren nach Anspruch 2, weiter umfassend a) Umsetzen eines primären bzw. sekundären Alkohols zum Aldehyd bzw. Keton durch Kontaktieren mit einer NADP+-abhängigen Alkoholdehydrogenase in Anwesenheit von NADP+.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiter umfassend b) Umsetzen des in Schritt a) hergestellten Aldehydes bzw. Ketons zum Amin durch Kontaktieren mit einer Transaminase in Anwesenheit von Alanin.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Schritte a), b) und c) in der gleichen Reaktionsmischung ablaufen, bevorzugt gleichzeitig.
6. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zelle weiterhin eine NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase exprimiert.
7. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Zelle weiterhin eine Transaminase exprimiert.
8. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei in dem Polypeptid Zelle sämtliche Enzyme aus der Gruppe umfassend das Polypeptid, die NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase und die Transaminase intrazellulär lokalisiert exprimiert.
9. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei der NADP+- abhängigen Alkoholdehydrogenase um eine NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase aus der Gruppe umfassend die Alkoholdehydrogenasen aus E. coli (YjgB, Datenbankcode ZP_071 17674, und ein YahK, Datenbankcode BAE76108.1 ) und die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 10), bevorzugt um die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (SEQ ID NO: 10) oder Varianten davon handelt.
10. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei es sich bei der Transaminase um eine Transaminase aus der Gruppe umfassend die Transaminasen aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695), Pseudomonas putida (Datenbankcode YP_001668026), Pseudomonas putida (Datenbankencode YP_001668026.1 or YP_001671460); Rhodobacter sphaeroides (strain ATCC 17023; Datenbankcode YP_353455) sowie Varianten davon handelt, bevorzugt um die Transaminase aus Chromobacterium violaceum (Datenbankcode NP_901695).
1 1 . Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei es sich bei der Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette um Arginin handelt.
12. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , wobei zusätzlich Asp196 oder eine an homologer Position in der Aminosäuresequenz befindliche Aminosäure gegen eine Aminosäure mit neutraler oder positiv geladener Seitenkette ausgetauscht ist.
13. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei es sich bei der Aminosäure mit neutraler oder positiv geladener Seitenkette um eine Aminosäure aus der Gruppe handelt, die Alanin, Glycin, Serin und Cystein umfasst, bevorzugt um Alanin.
14. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei es sich um das in SEQ ID NO 1 dargestellte Polypeptid handelt.
15. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei es sich bei der Nukleotidsequenz um die in SEQ ID NO 2 dargestellte Nukleotidsequenz handelt.
16. Zelle oder Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei es sich bei dem Nukleinsäuremolekül um einen Vektor umfassend das Nukleinsäuremolekül handelt.
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