EP2729186A1 - Verfahren zur sterilisation von funktionalisierten, nukleotide und/oder nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten oberflächen - Google Patents

Verfahren zur sterilisation von funktionalisierten, nukleotide und/oder nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten oberflächen

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EP2729186A1
EP2729186A1 EP12735115.3A EP12735115A EP2729186A1 EP 2729186 A1 EP2729186 A1 EP 2729186A1 EP 12735115 A EP12735115 A EP 12735115A EP 2729186 A1 EP2729186 A1 EP 2729186A1
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EP
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coating
nucleotide derivatives
nucleotides
coated
irradiation
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Withdrawn
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EP12735115.3A
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Matthias Müller
Judith REICHERT
Anne FÖRSTER
Bernd Schwenzer
Dieter Scharnweber
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Technische Universitaet Dresden
Peter Brehm Holding GmbH and Co KG
Original Assignee
Brehm Chirurgie Mechanik EK Peter
Technische Universitaet Dresden
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    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/258—Genetic materials, DNA, RNA, genes, vectors, e.g. plasmids

Definitions

  • the invention relates to a method for the sterilization of functionalized, coated with nucleotides and / or nucleotide derivatives, coated surfaces.
  • the immobilization of nucleotides or nucleotide derivatives on solid support materials is of great importance for implantology and many areas of biotechnology.
  • WO 2004/005302 A2 discloses a metallic object coated with nucleic acids and nucleic acid derivatives and a method for its production and its use, in which nucleic acids and nucleic acid derivatives are immobilized for the production of sensors for biotechnology.
  • DE 10 2006 024 058 A1 discloses a modular system with immobilized nucleic acids or nucleic acid derivatives on metallic surfaces and a method for its production.
  • the production of generic functionalized coatings of surfaces and in particular of metal surfaces or wafer surfaces is thus a known technology in the prior art.
  • a treatment method known for these applications is irradiation with gamma rays in defined doses.
  • Such effects are mainly caused by the formation of reactive species due to the interaction of the ionizing radiation with components in the environment of the DNA.
  • nucleotides or nucleotide derivatives are understood as meaning compounds of these from oligonucleotides to high-molecular-weight DNA structures.
  • nucleotide derivatives for example, phosphotioates for increasing the nuclease stability and similar substances are understood.
  • the object is achieved, in particular, by a method for sterilizing functionalized, coated surfaces containing nucleotides or nucleotide derivatives, in which a) a functionalizing coating of the surface takes place in excess with nucleotides and / or nucleotide derivatives, wherein the excess nucleotides and / or Nucleotide derivatives as sacrificial strands are not washed out of the coating.
  • nucleotides and / or nucleotide derivatives are to be understood as meaning those which are not stably immobilized on the surface to be functionalized.
  • the atmosphere is enriched over the coated surface with ethanol, and in particular with anhydrous ethanol.
  • step c which consists in irradiation of the coated surface with ionizing radiation.
  • the method is formed by irradiation with gamma rays at a dose of 25-30 kGray.
  • An improvement of the method results can be achieved according to a development of the invention in that before the irradiation of the coated surface, a removal of water and oxygen from the coating and the surrounding atmosphere takes place.
  • P2O 5 phosphorus pentoxide
  • the enrichment of an argon protective gas atmosphere with anhydrous ethanol in the concentration of 1, 500 ⁇ to 100 ml volume is advantageous.
  • the method is further developed by the fact that the functionalizing coating of a layer of oligonucleotide single strands on a Titanium surface, or a titanium-containing surface is executed, or that a part of the strands is partially incorporated in anodically formed oxide. This embodiment is advantageously feasible, in particular for implants.
  • the functionalizing coating is made of a layer of oligonucleotide single strands on a monocrystalline silicon surface, also referred to as a wafer.
  • sterilized chips for the production of sensors can be produced by the method according to the invention.
  • the method according to the invention for the treatment of a coating also leads to advantageous effects when the functionalizing coating is in the form of a layer of oligonucleotide single strands on a surface of calcium phosphate phases.
  • the method according to the invention for treating a coating is also advantageously applicable if the functionalizing coating is designed in the form of a layer of oligonucleotide single strands on a polymer surface suitable for biomaterial applications.
  • the concept of the invention is that the combination of two parameters significantly improves the functionality of the treated nucleotide and / or nucleotide derivative structures.
  • the coating is formed with an excess of the nucleotide or nucleotide derivative strands.
  • an enrichment of the atmosphere with ethanol takes place before irradiation by means of ionizing radiation.
  • the method is further developed by combining the known strategies for avoiding oxygen and water with the measures according to the invention.
  • the stated measures lead to maintenance of the functionality, in particular the hybridization ability of the single strands of an oligonucleotide coating of up to 80% of the immobilized anchor strands after gamma sterilization.
  • the treatment according to the invention of functionally coated surfaces provides the prerequisite for effectively using developed immobilization methods according to the prior art for the functionalization of implant surfaces or for sensor production.
  • the samples were then dried in a desiccator over phosphorus pentoxide (P2O 5) and in a glove box under an argon protective gas atmosphere in airtight glass vessels, such as Duran bottles, packed with a volume of 100 ml.
  • P2O 5 phosphorus pentoxide
  • a volume of 1, 500 ⁇ anhydrous ethanol was added during the process of packaging.
  • the sealed samples were sterilized with gamma radiation at a dose of 25-30 kGray prescribed for medical devices.
  • the reference samples were each not sterilized.
  • the optimum combination under the conditions compared lies in the combination of dispensing with the rinsing and the associated desorption of the sacrificial strands with the accumulation of ethanol in the atmosphere before irradiation, which is indicated by the indication EtOH Atm in the figure.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltende, beschichteten Oberflächen, bei dem a) eine funktionalisierende Beschichtung der Oberfläche im Überschuss mit Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten erfolgt, wobei die überschüssigen Nukleotide und/oder Nukleotidderivate als Opferstränge nicht aus der Beschichtung ausgewaschen werden, b) die Atmosphäre über der beschichteten Oberfläche mit Ethanol angereichert wird und c) eine Bestrahlung der beschichteten Oberfläche mit ionisierender Strahlung erfolgt.

Description

Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten
Oberflächen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen. Die Immobilisierung von Nukleotiden oder Nukleotidderivate auf festen Trägermaterialien ist von großer Bedeutung für die Implantologie und viele Bereiche der Biotechnologie.
Derartig behandelte Oberflächen werden insbesondere in der Implantologie als biologisch funktionalisierte Implantate sowie in der Analytik bei der Herstellung von DNA-Chips und zur Herstellung von Sensoren eingesetzt. Weiterhin sind Anwendungsfälle von mit biologisch aktiven Komponenten beschichteten Oberflächen umfasst, deren Verwendung eine Inaktivierung mikrobieller Kontaminationen durch Sterilisation der Oberfläche erfordert.
Aus der WO 2004/005302 A2 geht ein mit Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivaten beschichteter metallischer Gegenstand sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung hervor, bei dem Nukleinsäuren und Nukleinsäurederivate zur Herstellung von Sensoren für die Biotechnologie immobilisiert werden.
Weiterhin geht aus der DE 10 2006 024 058 A1 ein modulares System mit immobilisierten Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivaten an metallischen Oberflächen und ein Verfahren zu dessen Herstellung hervor. Die Herstellung von gattungsgemäß funktionalisierten Beschichtungen von Oberflächen und insbesondere von Metalloberflächen oder Waferoberflächen ist somit im Stand der Technik eine bekannte Technologie. Um die erhaltenen Beschichtungen jedoch in biologischen Systemen einsetzen zu können, ist es erforderlich, durch geeignete Verfahren mögliche mikrobielle Kontaminationen zu beseitigen und somit Sterilität der beschichteten Oberflächen zu erreichen. Aus dem Stand der Technik ist auch bekannt, Produkte, beziehungsweise Oberflächen mit funktionalisierenden Beschichtungen, mittels ionisierender Strahlung zu sterilisieren.
Eine für diese Anwendungsfälle bekannte Behandlungsform ist die Bestrahlung mit Gammastrahlen in festgelegten Dosen.
Weiterhin ist als damit verbundenes Problem bekannt, dass die Behandlung mit ionisierender Strahlung, dabei beispielsweise Schädigungen an DNA- Molekülen (Desoxyribonukleinsäure) verursacht, die auf direkte Wechselwirkungen und indirekte Effekte zurückzuführen sind.
Derartige Effekte werden hauptsächlich verursacht durch die Bildung reaktiver Spezies auf Grund der Wechselwirkung der ionisierenden Strahlung mit Komponenten in der Umgebung der DNA.
Im Stand der Technik wird dieses Problem dadurch zu lösen versucht, dass eine geeignete Zusammensetzung der Gasatmosphäre bei der Bestrahlung gezielt eingestellt wird. Zielstellung ist es dabei, das Vorhandensein von Sauerstoff zu minimieren, da dieser bei der Bestrahlung zu reaktivem Ozon umgesetzt würde, was nachfolgend zu Schädigungen der funktionellen Beschichtung führt. Eine weitere Strategie der Minimierung der Probleme durch die Bestrahlung von DNA enthaltenden Beschichtungen besteht in einer starken Trocknung der Beschichtung vor der Bestrahlung. Unter Trocknung im Sinne der Erfindung ist im weitesten Sinne der Entzug von Wasser zu verstehen.
Allerdings ist auch bekannt, dass die im Stand der Technik ergriffenen Maßnahmen zur Erhaltung der Biofunktionalität der bestrahlten Beschichtung häufig nicht in ausreichendem Maße wirken.
Insbesondere ist bekannt, dass das Ausmaß der Schädigungen von Nukleotiden oder Nukleotidderivaten über Oligonukleotide bis hin zu hochmolekularen DNA-Strukturen im Fall von partiell in anodische Oxidschichten eingebauten Einzelsträngen durch ionisierende Strahlung bei einer typischen Dosis mittels Gamma-Sterilisation zu hoch ist. Nachfolgend sollen unter Nukleotiden oder Nukleotidderivaten Verbindungen aus diesen von Oligonukleotiden bis hin zu hochmolekularen DNA-Strukturen verstanden werden.
Unter Nukleotidderivaten werden beispielsweise auch Phosphotioate zur Erhöhung der Nukleasestabilität und ähnliche Substanzen verstanden.
Es ist Aufgabe der Erfindung, das Ausmaß der Schädigung von Nukleotide oder Nukleotidderivate enthaltenden Beschichtungen von Oberflächen durch eine Bestrahlung mit ionisierender Strahlung zu reduzieren und eine höhere Funktionalität der sterilisierten Oberfläche zu erreichen.
Die Aufgabe wird durch die Merkmale der selbstständigen Patentansprüche gelöst. Weiterbildungen sind in den abhängigen Patentansprüchen angegeben.
Die Aufgabe wird insbesondere durch ein Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen gelöst, bei dem a) eine funktionalisierende Beschichtung der Oberfläche im Überschuss mit Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten erfolgt, wobei die überschüssigen Nukleotide und/oder Nukleotidderivate als Opferstränge nicht aus der Beschichtung ausgewaschen werden.
Unter überschüssigen Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten sind solche zu verstehen, die nicht stabil auf der zu funktionalisierenden Oberfläche immobilisiert sind.
In einem nächsten Verfahrensschritt b) wird die Atmosphäre über der beschichteten Oberfläche mit Ethanol, und insbesondere mit wasserfreiem Ethanol angereichert.
Es schließt sich ein Verfahrensschritt c) an, der in einer Bestrahlung der beschichteten Oberfläche mit ionisierender Strahlung besteht.
Bevorzugt wird das Verfahren dadurch ausgebildet, dass die Bestrahlung mit Gammastrahlen mit einer Dosis von 25 - 30 kGray erfolgt.
Eine Verbesserung der Verfahrensergebnisse kann nach einer Weiterbildung der Erfindung dadurch erreicht werden, dass vor der Bestrahlung der beschichteten Oberfläche eine Entfernung von Wasser und Sauerstoff aus der Beschichtung und der diese umgebenden Atmosphäre erfolgt.
Vorteilhaft zu diesem Zweck ist die Entfernung von Wasser mittels Phosphorpentoxid (P2O5) sowie die Sauerstoffentfernung durch den Austausch von Luft gegen eine Schutzgasatmosphäre. Nach einer konkreten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist gemäß Verfahrensschritt b) die Anreicherung einer Argon- Schutzgasatmosphäre mit wasserfreiem Ethanol in der Konzentration von 1 .500 μΙ auf 100 ml Volumen vorteilhaft. Das Verfahren wird ferner dadurch weitergebildet, dass die funktionalisierende Beschichtung aus einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Titanoberfläche, beziehungsweise einer Titan enthaltenden Oberfläche ausgeführt ist, beziehungsweise dass ein Teil der Stränge partiell in anodisch gebildetes Oxid eingebaut ist. Diese Ausgestaltung ist insbesondere für Implantate vorteilhaft ausführbar. Alternativ zu einer Beschichtung einer metallischen Oberfläche wird die funktionalisierende Beschichtung aus einer Schicht von Oligonukleotid- Einzelsträngen auf einer monokristallinen Siliziumoberfläche, auch als Wafer bezeichnet, ausgeführt. Nach dieser Ausgestaltung können sterilisierte Chips zur Herstellung von Sensoren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzeugt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Beschichtung führt auch zur vorteilhaften Effekten, wenn die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Oberfläche von Calciumphosphatphasen ausgeführt ist.
Ebenso vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung einer Beschichtung anwendbar, wenn die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer für Biomaterialanwendungen geeigneten Polymeroberfläche ausgeführt ist.
Die Konzeption der Erfindung besteht darin, dass durch die Kombination zweier Parameter eine erhebliche Verbesserung der Funktionalität der behandelten Nukleotid- und/oder Nukleotidderivatstrukturen gegeben ist.
Nach einem ersten Aspekt der Erfindung erfolgt eine Erzeugung der Beschichtung mit einem Überschuss der Nukleotid- oder Nukleotidderivatstränge.
Eine Abkehr von konventionellen Verfahren zur Herstellung von funktionalisierenden Beschichtungen auf Titan oder einer Titanlegierung besteht nun in der Vernneidung von Spülprozessen zur Entfernung überschüssiger, nicht in die anodische Oxidschicht partiell eingebauter Einzelstränge, die im Weiteren auch Opferstränge genannt werden. Die Vermeidung von Spülprozessen ist neben der angeführten Beschichtungsart auch auf andere Beschichtungen, beziehungsweise Bindungsmechanismen von Beschichtungen, übertragbar.
Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung erfolgt eine Anreicherung der Atmosphäre mit Ethanol vor der Bestrahlung mittels ionisierender Strahlung.
Diese Maßnahmen führen einzeln angewendet bereits jeweils zu einer Verminderung des Verlustes der Funktionalität der Beschichtung durch die Bestrahlung. Die Kombination dieser Maßnahmen führt überraschenderweise zu einer weiteren Verbesserung des Ergebnisses.
Besonders vorteilhaft wird das Verfahren dadurch weitergebildet, wenn die bekannten Strategien zur Vermeidung von Sauerstoff und Wasser mit den erfindungsgemäßen Maßnahmen kombiniert werden. Die angegebenen Maßnahmen führen zu einem Erhalt der Funktionalität, insbesondere der Hybridisierungsfähigkeit der Einzelstränge einer Oligonukleotidbeschichtung von bis zu 80% der immobilisierten Ankerstränge nach einer Gamma-Sterilisation.
Damit schafft die erfindungsgemäße Behandlung von funktional beschichteten Oberflächen die Voraussetzung, um entwickelte Immobilisierungsverfahren nach dem Stand der Technik effektiv zur Funktionalisierung von Implantatoberflächen oder zur Sensorfertigung einsetzen zu können.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile von Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispieles. Zum Nachweis der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise wurden Oligonukleotideinzelstränge zur Überprüfung der Effektivität der vorgeschlagenen Maßnahmen unter identischen Bedingungen an Titansubstrate adsorbiert und durch elektrochemische Polarisation regioselektiv partiell in anodische Titanoxidschichten eingebaut und dadurch immobilisiert. Ein Teil der Proben mit der funktionalisierenden Beschichtung wurde nachfolgend mit Acetatpuffer gespült, um gemäß der herkömmlichen Verfahrensweise nicht in die Oxidschicht eingebaute Oligonukleotide zu desorbieren und damit von der beschichteten Oberfläche zu entfernen. Die Ergebnisse der gespülten Proben sind auf der linken Seite des Diagramms in der Figur unter der Bezeichnung mit Desorption dargestellt.
Dieser Schritt der Spülung und Entfernung nicht immobilisierter Opferstränge wurde bei den mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben nicht vorgenommen. Auf der rechten Seite sind die Ergebnisse der Proben unter der Bezeichnung ohne Desorption dargestellt.
Anschließend wurden die Proben in einem Exsikkator über Phosphorpentoxid (P2O5) getrocknet und in einer Glovebox unter Argon-Schutzgasatmosphäre in luftdicht schließende Glasgefäße, wie Duranflaschen mit einem Volumen von 100 ml, verpackt.
Bei einem Teil der Proben wurde im Prozess der Verpackung ein Volumen von 1 .500 μΙ wasserfreies Ethanol zugesetzt. Die dichtverschlossenen Proben wurden mit einer für Medizinprodukte vorgeschriebenen Dosis von 25 - 30 kGray mit Gamma-Strahlung sterilisiert.
Eine Überprüfung der Wirksamkeit der Verfahrensweise wurde dadurch vorgenommen, dass die beschichteten Proben mit einem radioaktiv markierten Komplementärstrang (CS) beziehungsweise einem Nicht-Komplementärstrang (NS) unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert und die in der Folge dieses Prozesses auf den Proben vorliegenden Mengen an CS beziehungsweise NS durch Erfassung der Radioaktivität der Proben detektiert wurden.
Die Ergebnisse in der Figur zeigen, dass in keinem Fall eine wesentliche Bindung von NS erfolgte, woraus zu schlussfolgern ist, dass die detektierte Bindung von CS durch Hybridisierung und nicht durch unspezifische Wechselwirkung erfolgt.
Weiterhin führt die Vorgehensweise ohne Desorption und Spülung zu einer nachweisbar deutlich größeren Menge an durch Hybridisierung immobilisiertem CS.
Innerhalb der Gruppe der ungespülten Proben führt die Vorgehensweise in der Kopplung mit Zugabe von Ethanol zur Detektion der größten Mengen an CS. Dabei ist der Fehlerbalken vergleichsweise klein, sodass ein sehr gut reproduzierbarer Oberflächenzustand vorliegen muss.
Auch bei der Vorgehensweise mit Desorption führt die Gegenwart von Ethanol zu einer Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Messwerte, wenn auch auf relativ niedrigem Niveau.
Die Referenzproben wurden jeweils nicht sterilisiert. Die unter den verglichenen Bedingungen optimale Kombination liegt in der Kombination von Verzicht auf die Spülung und die damit verbundene Desorption der Opferstränge mit der Anreicherung von Ethanol in der Atmosphäre vor der Bestrahlung, was mit der Angabe mit EtOH Atm in der Figur dargestellt ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zur Sterilisation von funktionalisierten, Nukleotide und/oder Nukleotidderivate enthaltenden, beschichteten Oberflächen, bei dem a) eine funktionalisierende Beschichtung der Oberfläche im Überschuss mit Nukleotiden und/oder Nukleotidderivaten erfolgt, wobei die überschüssigen Nukleotide und/oder Nukleotidderivate als Opferstränge nicht aus der Beschichtung ausgewaschen werden,
b) die Atmosphäre über der beschichteten Oberfläche mit Ethanol angereichert wird und
c) eine Bestrahlung der beschichteten Oberfläche mit ionisierender Strahlung erfolgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die
Bestrahlung mit Gamma-Strahlen mit einer Dosis von 25 bis 30 kGray erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Bestrahlung der beschichteten Oberfläche eine Entfernung von Wasser und Sauerstoff aus der Beschichtung und der diese umgebenden Atmosphäre erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
Entfernung von Wasser mit Phosphorpentoxid sowie die und Sauerstoffentfernung durch den Austausch von Luft gegen eine Schutzgasatmosphäre erfolgt.
5. Anreicherung gemäß Verfahrensschritt b) einer Argon-Schutzgas- Atmosphäre mit wasserfreiem Ethanol in einer Konzentration von 1 .500 μΙ auf 100 ml Volumen erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Titan enthaltenden Oberfläche ausgeführt ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer monokristallinen Siliziumoberfläche ausgeführt ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer Oberfläche von Calciumphosphatphasen ausgeführt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierende Beschichtung in Form einer Schicht von Oligonukleotid-Einzelsträngen auf einer für Biomaterialanwendungen geeigneten Polymeroberfläche ausgeführt ist.
10. Implantat mit einer Oberfläche behandelt mit einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.
1 1 . Chip zur Herstellung von Sensoren behandelt mit einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.
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