EP2688960A1 - Composes à groupements chromophore et photoreactif - Google Patents

Composes à groupements chromophore et photoreactif

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Publication number
EP2688960A1
EP2688960A1 EP12710091.5A EP12710091A EP2688960A1 EP 2688960 A1 EP2688960 A1 EP 2688960A1 EP 12710091 A EP12710091 A EP 12710091A EP 2688960 A1 EP2688960 A1 EP 2688960A1
Authority
EP
European Patent Office
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group
compound
protein
fluorescent
compound according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12710091.5A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Eve-Isabelle PECHEUR
Line BOUREL-BONNET
Benoit HILBOLD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Universite Claude Bernard Lyon 1
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Strasbourg
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Strasbourg, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2688960A1 publication Critical patent/EP2688960A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B11/00—Diaryl- or thriarylmethane dyes
    • C09B11/04—Diaryl- or thriarylmethane dyes derived from triarylmethanes, i.e. central C-atom is substituted by amino, cyano, alkyl
    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
    • C09B11/24—Phthaleins containing amino groups ; Phthalanes; Fluoranes; Phthalides; Rhodamine dyes; Phthaleins having heterocyclic aryl rings; Lactone or lactame forms of triarylmethane dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/22—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton having nitrogen atoms of amino groups bound to the carbon skeleton of the acid part, further acylated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/76—Unsaturated compounds containing keto groups
    • C07C59/84—Unsaturated compounds containing keto groups containing six membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/10—Spiro-condensed systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • These compounds can be used for the study and the identification of zones or hydrophobic domains within proteins, in particular within viruses.
  • the invention provides compounds that meet at least two distinct criteria: they are photoreactive and they are detectable, for example by fluorescence. Even more advantageously, these compounds according to the invention have at least three functionalities. They have a lipid structure, they are photoactivatable and they are detectable. These three features are connected together by a common platform.
  • a second hydrocarbon-based chain comprising a photoreactive group and functionalized at one end linked to the platform.
  • the compound according to the invention is of formula (I) and comprises
  • At least one chromophore group Q 1 chosen from an absorbing group, a fluorescent group or a luminescent group
  • Q represents an at least trifunctional link platform
  • p 1, 2 or 3;
  • Q 1 identical or different, independently represents a chromophoric group chosen from an absorbing group, a fluorescent group or a luminescent group;
  • L 1 and L 2 identical or different, independently represent a group selected from NH, C (O), S, O;
  • Q 2 represents a photoreactive group
  • n an integer from 0 to 24;
  • n an integer ranging from 1 to 24; • the sum of m and n is between 1 and 30;
  • Q represents an integer ranging from 1 to 30.
  • the compound according to the invention is a compound of formula (I) in which
  • P represents 1 and Q 1 represents a fluorescent group
  • P represents 3 and Q 1 independently represents a luminescent group and two fluorescent groups, which are identical or different.
  • the at least trifunctional binding platform or Q represents a group chosen from amino acid derivatives, glycerol derivatives, triacidic carboxylic derivatives, triamine derivatives; in particular a group derived from an alpha-amino acid and comprising two amino functions and a carbonyl function.
  • the invention relates to a compound of formulas (I), (II) or (III) for which M represents an integer ranging from 1 to 12; or
  • Q represents an integer ranging from 6 to 26;
  • M represents an integer ranging from 1 to 12;
  • N represents an integer ranging from 1 to 12;
  • Q represents an integer ranging from 8 to 24;
  • the chromophore group or Q 1 is independently selected from rhodamine, fluorescein, rhodamine derivatives, substituted rhodamine and fluorescein derivatives, substituted fluorescein, such as in particular fluorophores commercially available in the Molecular Probes series (Invitrogen) and covering a wide range of fluorescence, dyes, colored substances absorbing in the visible (400 to 800 nm), luciferin, luminol, luminol derivatives.
  • the chromophore group or Q 1 is chosen from rhodamine and its analogues, for example carboxytetramethylrhodamine.
  • the photoreactive group or Q 2 is independently selected from a group comprising a diazo or diazoester function, a group derived from diazirine, in particular 3-trifluoromethyl-3-phenyl-diazirine (TID) or pentafluorophenylazide, a grouping comprising an arylazide, acylazide, alkylazide, diazo ester function, a group derived from benzophenone and a group of formula (IV)
  • the invention also relates to a process for preparing such a compound.
  • This preparation process according to the invention comprises the reaction
  • a compound comprising a first hydrocarbon-based chain and functionalized at one end;
  • a compound comprising a second hydrocarbon chain functionalized at one end and comprising a photoreactive group.
  • the order of the steps is not essential.
  • the order of implementation of the different reagents is indifferent, this order can easily be adapted according to the reagents used or according to the reaction conditions.
  • the preparation process according to the invention makes it possible to prepare all the compounds according to the invention, in particular the compounds of formulas (I), (II) or (III), as well as their preferred analogs.
  • the method according to the invention implements an at least trifunctional binding platform which comprises a free primary amine function, a protected primary amine function and a carboxylic acid function.
  • the method according to the invention then comprises the steps:
  • the process according to the invention can be implemented for the preparation of a compound according to the invention, in particular for the preparation of a compound of formula (I), of formula (II) or of formula (III).
  • the preparation process according to the invention uses, as a platform, a commercially available ⁇ -amino acid backbone: Na-Boc-L-2,3-diaminopropionic acid (Boc-Dpr-OH) . It has the advantage of having three different functionalities: a free primary amine, a protected primary amine and a free carboxylic acid and is capable of reacting selectively and successively, by forming a peptide bond with three different molecules.
  • Benzophenone is chosen as a photoreactive group and is integrated within a fatty acid.
  • the preparation method according to the invention can be implemented according to the sequence of diagrams 1, 2 and 3.
  • lipid precursors 1 ac are prepared according to a known procedure or according to the method of preparation according to the invention.
  • compounds 1a and 1b can be prepared according to the method described by Lala et al. (J. Am Chem Soc 1993, 115, 3982-3988) and by Gan et al. (J. Org Chem., 2006, 71, 9487-9490).
  • lipid precursor 1c can be prepared from the method described by Gan et al. (J. Org Chem., 2006, 71, 9487-9490) modified according to the conditions of Scheme 2.
  • the 4-n-decylbenzaldehyde precursor can be prepared in three stages with a good yield (77%) from commercially available 4-decylbenzoyl chloride.
  • the acyl chloride is converted into its methyl ester and then completely reduced to its corresponding alcohol.
  • the primary alcohol is oxidized to 5 using the method described by Omura and Swern (Tetrahedron 1978, 34, 1651-1660).
  • precursor 5 can also be synthesized in a single step by Rosemund reduction from 4-decylbenzoyl chloride in 64% yield.
  • This improvement opens a new, more efficient route for the synthesis of other analogues according to the method of preparation according to the invention.
  • the lipid precursors 1a-c may be used for the preparation of compounds 12a-c according to the invention according to Scheme 3.
  • FIG. 3 Three lipid precursors or fatty acid analogues comprising a benzophenone group (FABP) 1 ac are thus available and used in the synthesis of compounds according to the invention, especially useful as novel lipid probes.
  • FBP benzophenone group
  • the fatty acid containing benzophenone (FABP) is introduced onto the skeleton or platform during the first step of synthesis of the compounds according to the invention.
  • the carboxylic acid function of this synthon is activated thanks to PyBOP in basic medium (DIEA).
  • DIEA basic medium
  • Boc-Dpr-OH is added to the solution.
  • Boc-Dpr (FABP) -OH 9a-c are isolated, characterized and then the free carboxylic acid function of Boc-Dpr (FABP) -OH is activated with PyBOP in the presence of DIEA before adding the hexadecamine.
  • Boc-Dpr (FABP) -NH-C 16 H 33 10 ac are isolated, characterized and then the amino function is deprotected in acidic medium: mixture of TFA and dichloromethane (1/1 v / v). After H-Dpr (FABP) -NH-C 16 H 33 1 1 ac treatment are isolated and characterized. Finally and very advantageously, CTMR is the last synthon to be introduced on the skeleton. After activation of the carboxylic acid function of CTMR by PyBOP in the presence of DIEA, H-Dpr (FABP) -NH-C 16 H 33 is added. The progress of the reaction is monitored by TLC.
  • Rhod-Dpr (FABP) -NH-C 16 H 33 12 ac are isolated in the form of a violet powder. All final or intermediate compounds are characterized by TLC, MS or NMR. It should be noted that carboxytetramethylrhodamine is commercially available, in particular in the form of a mixture of two regioisomers. These two regioisomers are detectable in HPLC but generally difficult to separate. This separation is not necessary for the use of the compounds according to the invention, in particular as probes in a biological medium.
  • the invention relates to the use of a compound according to the invention for the identification of a protein.
  • the invention relates to a method for identifying a protein comprising the use of a compound according to the invention, preferably the use of a hydrophobic compound according to the invention.
  • the identification method according to the invention is implemented for the identification of a hydrophobic fragment within a protein.
  • the identification method according to the invention is implemented for the identification of one or more transmembrane domains within a membrane protein.
  • the identification method according to the invention is implemented for the identification of a fusion protein or a viral fusion peptide.
  • the fusion protein to be identified may be a fusion protein of a hepatitis virus, for example hepatitis B or hepatitis C, or even HIV, an influenza virus or a veterinary virus.
  • the identification method according to the invention comprises
  • the contacting of the compound according to the invention with the protein is carried out by means of micelles or lipid bilayer systems, for example liposomes.
  • the activation power is between 0.1 and 1000 W; or
  • the identification method according to the invention allows a very broad identification range by hydrophobic photolabeling of many domains or protein areas.
  • this compound will be able to bind in a particular way and in a specific position within the protein to be identified.
  • the other lipid chain especially because of its length, can be adapted according to the lipid or membrane environment encountered during the implementation of the identification method according to the invention.
  • the compound according to the invention used for the identification method according to the invention thus allows a suitable anchoring within the protein to be identified.
  • the radical generated during the photoactivation of the benzophenone will react in a hydrophobic medium on a C-H bond covalently with a good yield and thus allows a precise identification of the chemical environment of the adduct formed.
  • benzophenone is chemically stable in ambient light and to most synthetic conditions used in chemistry.
  • the amino acid Boc-L-Dpr-OH is purchased from Iris Biotech GmbH. Ninhydrin, phosphomolybdic acid and trifluoroacetic acid are from Sigma-Aldrich. Carboxytetramethylrhodamine and PyBOP are purchased from Novabiochem. Hexadecylamine comes from Aldrich and DIEA from Alfa Aesar. 6- (4- (4-n-hexylbenzoyl) phenyl) hexanoic acid is synthesized according to the protocol mentioned above. Chemical reagents are used without further purification. The CH 2 Cl 2 and THF are distilled under an inert atmosphere (argon stream) and dried on CaH 2 and sodium (in the presence of benzophenone) respectively.
  • the chromatography is carried out on silica gel 60 (40-63 ⁇ ): the powder and the aluminum plates for the TLCs are purchased from Merck.
  • the 1 H and 13 C NMR spectra are recorded on Brucker 300 MHz or 400 MHz devices.
  • the chemical shifts of the proton (3) are reported in ppm and the spectrum is calibrated with respect to the peak of the deuterated residual solvent.
  • the coupling constants (J) are reported in Hz.
  • the mass spectra (ES-MS) are recorded on an ESI / TOF Mariner mass spectrometer. For the compounds described for the first time, a high resolution mass (HR-MS) is measured on an Agilent GC / TOF mass spectrometer.
  • the melting points are measured on a Buchi B-540.
  • the HPLC analyzes are carried out with a Jupiter 5u C 4 300A column (150 x 4.6 mm, C4) Phenomenex with a flow rate of 1 mL / min using a linear gradient of 10 min from 0 to 100% of CH 3 CN in water (0.1% of TFA), followed by 5 min at 100% CH 3 CN (0.1% TFA).
  • the retention times (Tr) of the HPLC analyzes are presented in minutes.
  • Hybrid lithium aluminum (40 mg-1.03 mmol) is dissolved in 15 mL of diethyl ether with stirring, under argon and at room temperature in a dry flask equipped with a condenser. Then methyl 4-decylbenzoate (950 mg - 3.43 mmol) is added dropwise to the solution and the reaction mixture is stirred for 1 h. 20 ml of water are then cautiously added to the solution and poured into the ice water and a 10% aqueous solution H 2 S0 4 (v / v) is then added. The aqueous phase is extracted with diethyl ether and the recovered organic phases are dried over MgSO 4 , filtered and the solvent is evaporated off under reduced pressure.
  • the residue obtained is purified on a silica column (Cyclohexane elution gradient / AcOEt 95/5 to 80/20 v / v) to yield the desired product obtained in the form of a white solid (768 mg - yield: 90% ).
  • the residue obtained is purified on a silica column (cyclohexane elution gradient / AcOEt 100/0 to 100/10 v / v) to yield the product 6b obtained in the form of a colorless oil (880 mg - yield: 99% ).
  • Boc-L-Dpr (FABP) -NH-C 16 H 33 is dissolved in a solution of CH 2 Cl 2 / TFA 1/1 v / v. This solution is stirred for 1 h at room temperature protected from light and then diluted with CH 2 Cl 2 . The organic phase is washed with a saturated solution of NaHCO 3 and the aqueous phase is extracted with CH 2 Cl 2 . The recovered organic phases are dried over MgSO 4 , filtered and the solvent is evaporated off under reduced pressure.
  • Dodecylphosphocholine (DPC) and bacteriorhodopsin of Halobacterium salinarum are from SIGMA.
  • Egg yolk phosphatidylcholine (PC) and cholesterol (chol, 99% pure) come from Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA).
  • PC, chol and the lipid-tool (12a-c) (65: 30: 5 mole ratio) dissolved in chloroform are mixed in a test tube. After evaporation of the solvent with heat (45 min at 37 ° C.), the dry film is hydrated by addition of 300 ⁇ l of PBS pH 7.4 to obtain a final concentration of 5 mM in lipids. The mixture is stirred and the resulting slurry is heated to 37 ° C, then cooled in liquid nitrogen 5 times, then passed through an extruder equipped with 2 filters of 100 nm (35 passes).
  • the excitation and emission spectra of the probe compounds according to the invention in liposomes are recorded at 32 ° C. on a TECAN Infinité M1000 spectrofluorometer.
  • the lipid composition of liposomes is PC: chol: tool lipid 65: 30: 5 (molar ratio).
  • the "white" control liposomes are composed of PC: chol, and their residual fluorescence is subtracted from the measured fluorescence spectra. Photomarking of bacteriorhodopsin:
  • DPC is added to a compound solution in chloroform-methanol (2/1, v / v), in the ratio compound / detergent 1: 50 molar. After evaporation under high vacuum for 2 hours, the dry lipid film is hydrated by addition of 50 ⁇ l of distilled water and 50 ⁇ l of Tris-HCl pH 8.0. The bacteriorhodopsin resuspended in distilled water is incubated with the compounds according to the invention in detergent micelles, in a protein-compound molar ratio of 1: 5. The mixture is then left for 1 hour in the dark at 4 ° C.
  • UV irradiation with a Dymax UV Flood device, equipped with a 400W high-pressure mercury lamp placed at a distance of 10 cm. of the sample in a quartz bowl.
  • the La ⁇ mmli buffer is then added to the irradiated mixture and incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the analysis is done on electrophoresis gel (15% acrylamide / 20% glycerol). After migration, the gel is first analyzed on a Fluorimager Typhoon 8600 equipped with a rhodamine filter, to detect the fluorescence; the gel is then stained with Coomassie blue to visualize all the protein bands.

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Abstract

L'invention concerne le domaine du marquage de photoaffinité hydrophobe grâce à des sondes qui sont des composés multifonctionnels lipidiques. Ces composés comprennent au moins un groupement chromophore et deux chaînes lipidiques dont une comprend un groupement photoréactif. Ces composés peuvent être utilisés pour l'étude et l'identification de zones ou domaines hydrophobes au sein de protéines, notamment au sein de virus.

Description

COMPOSES A GROUPEMENTS CHROMOPHORE ET PHOTOREACTIF
DESCRIPTION
L'invention concerne le domaine du marquage de photoaffinité hydrophobe grâce à des sondes qui sont des composés multifonctionnels lipidiques. Ces composés comprennent au moins un groupement chromophore et deux chaînes lipidiques dont une comprend un groupement photoréactif.
Ces composés peuvent être utilisés pour l'étude et l'identification de zones ou domaines hydrophobes au sein de protéines, notamment au sein de virus.
On connaît des sondes qui permettent de marquer ou d'identifier des domaines hydrophobes au sein de protéines. Toutefois, les sondes de l'état de la technique utilisent la détection au moyen d'un élément radioactif tel 125l qui émet des rayonnements gamma. Outre les difficultés rencontrées lors de leur préparation, de telles sondes présentent également des risques lors de leur utilisation. Ainsi, l'utilisation de telles sondes est limitée voire empêchée pour certaines applications.
Comme exemple de sondes d'identification de domaines hydrophobes de protéine, on connaît celles décrites par Brunner qui mettent en œuvre 125l avec les inconvénients et problèmes qui en découlent (Annu. Rev. Biochim. 1993. 62. 483-514).
Par ailleurs, on connaît l'utilisation de sondes trifonctionnelles pour l'identification d'enzymes (Speers et al., "Prof iling enzyme activities in vivo using click chemistry method" publié le 1 er avril 2004). Toutefois, les sondes utilisées de possèdent aucune propriété photoréactive. On connaît également par US-2009/305410 l'identification de polypeptides ou de protéines au moyen des différents composés fluorescents comprenant des fragments polymériques hydrosolubles.
Il existe donc un besoin de disposer de sondes de marquage ou d'identification de protéines qui apportent une solution à ces problèmes et qui permettent d'éviter les inconvénients liés à l'utilisation des sondes connues.
La présente invention permet d'apporter une solution à tout ou partie des problèmes liés aux sondes de l'état de la technique.
Ainsi et de manière particulièrement avantageuse, l'invention fournit des composés qui répondent à au moins à deux critères distincts : ils sont photoréactifs et ils sont détectables, par exemple par fluorescence. De manière encore plus avantageuse, ces composés selon l'invention possèdent au moins trois fonctionnalités. Ils sont de structure lipidique, ils sont photoactivables et ils sont détectables. Ces trois fonctionnalités sont connectées ensemble par une plateforme commune.
Ainsi, la présente invention fournit une sonde sous la forme d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle, substituée par
• au moins un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
• une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité liée à la plateforme ;
• une deuxième chaîne hydrocarbonée, comprenant un groupement photoréactif et fonctionnalisée en une extrémité liée à la plateforme.
De manière avantageuse, le composé selon l'invention est de formule (I) et comprend
• une plateforme de liaison Q au moins trifonctionnelle, substituée par
• au moins un groupement chromophore Q1 choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
• une première chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L1 ;
• une deuxième chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L2 et comprenant un groupement photoréactif Q2 ;
(I)
dans laquelle
Q représente une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ;
p représente 1 , 2 ou 3 ;
Q1, identique ou différent, représente indépendamment un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
L1 et L2, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupement choisi parmi NH, C(O), S, O ;
Q2 représente un groupement photoréactif ;
m représente un nombre entier allant de 0 à 24 ;
n représente un nombre entier allant de 1 à 24 ; • la somme de m et de n est comprise entre 1 et 30 ;
• q représente un nombre entier allant de 1 à 30.
De manière préférée, le composé selon l'invention est un composé de formule (I) dans laquelle
• p représente 1 et Q1 représente un groupement fluorescent ; ou
• p représente 2 et Q1 représente indépendamment deux groupements fluorescents, identiques ou différents ; un groupement fluorescent et un groupement absorbant ; un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; ou
• p représente 3 et Q1 représente indépendamment un groupement luminescent et deux groupements fluorescents, identiques ou différents.
De manière préférée pour le composé selon l'invention, la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement choisi parmi les dérivés acides aminés, les dérivés du glycérol, les dérivés triacides carboxyliques, les dérivés triamines ; en particulier un groupement dérivé d'un alpha-aminoacide et comprenant deux fonctions aminés et une fonction carbonyle.
Ainsi, l'invention concern
(il)
dans laquelle Q1 , L1, L2, Q2, m, n et q sont tels que définis pour le composé de formule (I). De manière avantageuse, l'invention concerne également un composé de formule (III)
dans laquelle Q1 , Q2, m, n et q sont tels que définis pour les composés de formule (I) ou de formule (II).
De manière préférée, l'invention concerne un composé de formules (I), (II) ou (III) pour lesquelles • m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou
• n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou
• q représente un nombre entier allant de 6 à 26 ; ou
• la somme de m et de n est comprise entre 4 et 24 ;
ou encore un composé de formules (I), (II) ou (III) pour lesquelles
• m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et
• n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et
• q représente un nombre entier allant de 8 à 24 ; et
• la somme de m et de n est comprise entre 6 et 18.
De manière avantageuse pour le composé selon l'invention, le groupement chromophore ou Q1 est indépendamment choisi parmi la rhodamine, la fluorescéine, les dérivés de la rhodamine, la rhodamine substituée et les dérivés de la fluorescéine, la fluorescéine substituée, tels que notamment les fluorophores disponibles commercialement dans la série Molecular Probes (Invitrogen) et couvrant une large gamme de fluorescence, les colorants, les substances colorées absorbant dans le visible (400 à 800 nm), la luciférine, le luminol, les dérivés du luminol.
De manière préférée le groupement chromophore ou Q1 est choisi parmi la rhodamine et ses analogues, par exemple la carboxytétraméthylrhodamine.
De manière également avantageuse, le composé selon l'invention peut comprendre deux groupements chromophores, par exemple un dérivé de la rhodamine et un dérivé de la fluorescéine. La présence de deux groupements chromophores au sein du composé selon l'invention est particulièrement avantageuse lors de sa mise en oeuvre pour des utilisations selon le principe de transfert de fluorescence par énergie de résonance (FRET).
De manière avantageuse pour le composé selon l'invention, le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi les groupements générateurs de carbène, les groupements générateurs de nitrène, les dérivés d'arylcétone.
De manière préférée, le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi un groupement comprenant une fonction diazo ou diazoester, un groupement dérivé de la diazirine, notamment le 3-trifluorométhyl-3-phényl-diazirine (TID) ou la pentafluorophenylazide, un groupement comprenant une fonction arylazide, acylazide, alkylazide, diazoester, un groupement dérivé de la benzophénone et un groupement de formule (IV)
(IV)
De manière particulièrement avantageuse, le composé selon l'invention est hydrophobe de sorte qu'il présente une affinité particulière pour les zones hydrophobes de substrats avec lesquels il peut être mis en contact.
Outre un composé utile comme sonde, l'invention concerne également un procédé de préparation d'un tel composé. Ce procédé de préparation selon l'invention comprend la réaction
• d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ;
• d'au moins un composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent et un groupement luminescent ;
• d'un composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ;
• d'un composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif.
De manière générale, pour le procédé de préparation selon l'invention, l'ordre des étapes n'a pas un caractère essentiel. Ainsi, l'ordre de mise en œuvre des différents réactifs est indifférent, cet ordre peut aisément être adapté selon les réactifs utilisés ou encore selon les conditions réactionnelles.
Le procédé de préparation selon l'invention permet de préparer l'ensemble des composés selon l'invention, en particulier les composés de formules (I), (II) ou (III) ainsi que leurs analogues préférés.
De manière avantageuse, le procédé selon l'invention met en œuvre une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle qui comprend une fonction aminé primaire libre, une fonction aminé primaire protégée et une fonction acide carboxylique. De manière avantageuse, le procédé selon l'invention comprend alors les étapes :
• de réaction de la fonction aminé primaire avec le composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ;
• de réaction de la fonction acide carboxylique avec le composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif ;
• de déprotection de la fonction aminé primaire protégée ;
• de réaction de la fonction aminé primaire déprotégée avec le composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, groupement fluorescent ou un groupement luminescent.
Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre pour la préparation d'un composé selon l'invention, en particulier pour la préparation d'un composé de formule (I), de formule (II) ou de formule (III).
De manière particulière, le procédé de préparation selon l'invention met en œuvre, comme plateforme, un squelette d'a-aminoacide disponible commercialement : l'acide Na-Boc-L-2,3- diaminopropionique (Boc-Dpr-OH). Il a l'avantage de présenter trois fonctionnalités différentes : une aminé primaire libre, une aminé primaire protégée et un acide carboxylique libre et est capable de réagir de manière sélective et successivement, par formation d'une liaison peptidique avec trois molécules différentes.
La benzophénone est choisie comme groupement photoréactif et est intégrée au sein d'un acide gras.
Enfin, un dérivé de la rhodamine est utilisé comme groupement chromophore : la carboxytétraméthylrhodamine (CTMR). Ce dérivé présente des propriétés avantageuses telles que sa fluorescence ainsi que sa stabilité dans les conditions de synthèse et sa relative insensibilité aux changements de pH.
Le procédé de préparation selon l'invention peut être mis en œuvre selon l'enchaînement des schémas 1 , 2 et 3.
Schéma 1
Ainsi, trois précurseurs lipidiques 1 a-c sont préparés selon une procédure connue ou bien selon la méthode de préparation selon l'invention. Ainsi, les composés 1 a et 1 b peuvent être préparés selon la méthode décrite par Lala et al. (J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 3982-3988) et par Gan et al. (J. Org. Chem., 2006, 71, 9487-9490). Tandis que le précurseur lipidique 1c peut être préparé à partir de la méthode décrite par Gan et al. (J. Org. Chem., 2006, 71, 9487-9490) modifiée selon les conditions du schéma 2.
1c
Schéma 2
Le précurseur 4-n-décylbenzaldéhyde 5 peut être préparé en trois étapes avec un bon rendement (77 %) à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle commercialement disponible. Tout d'abord le chlorure d'acyle est transformé en son ester méthylique puis complètement réduit en son alcool correspondant. L'alcool primaire est oxydé en 5 en utilisant la méthode décrite par Omura et Swern ( Tetrahedron 1978, 34, 1651 -1660). De manière alternative, le précurseur 5 peut également être synthétisé en une seule étape par une réduction de Rosemund à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle avec un rendement de 64 %.
Parallèlement, deux stratégies sont disponibles pour protéger l'alcool 2-(4- bromophenyl)éthanol commercialement disponible. Tout d'abord, le dihydropyrane (DHP) est utilisé et après 6h de réaction, l'acétal correspondant 6a est obtenu avec un rendement de 92% puis couplé avec l'aldéhyde 5 avec un rendement de 19 %. Une stratégie alternative consiste à utiliser du chlorure de triisopropylsilyle (TIPSCI) en présence d'imidazole pour permettre la conversion du 2-(4-bromophenyl)éthanol en son éther de silyle correspondant 6b avec un très bon rendement (99%) et en 2h. Le composé 6b est traité avec du n-butyl- lithium à -78 °C puis couplé avec 5 pour donner l'alcool secondaire 7b sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 70 %. Ensuite, du tétra-n-butylammonium fluoride (TBAF) est utilisé pour déprotéger 7b et l'alcool primaire 8 est obtenu avec un rendement de 73 %. Enfin, 8 est doublement oxydé suivant la méthode de Jones pour obtenir 1 c sous la forme d'un solide blanc avec un rendement de 91 %.
En partant du 4-n-décylbenzaldéhyde, le rendement global de la synthèse est de 46 % alors qu'il n'est que de 22 % avec des synthèses déjà décrites dans la littérature. Finalement, le rendement global de cette synthèse est de 35 %, 7 étapes peuvent être nécessaires pour obtenir le produit final 1 c à partir du chlorure de 4-décylbenzoyle commercialement disponible suivant une stratégie de synthèse convergente. Ainsi, il est possible d'obtenir l'acide (4-(4-décylbenzoyl)phényl)éthanoique (Cio-BP-d-COOH, 1 c) avec un bon rendement et un nombre d'étapes réduit, à partir de l'aldéhyde.
Cette amélioration ouvre une nouvelle voie plus efficace pour la synthèse d'autres analogues selon la méthode de préparation selon l'invention.
Les précurseurs lipidiques 1 a-c peuvent être utilisés pour la préparation de composés 12a-c selon l'invention selon le schéma 3.
12a-c
Schéma 3 Trois précurseurs lipidiques ou analogues d'acide gras comprenant un groupement benzophénone (FABP) 1 a-c sont ainsi disponibles et utilisés dans la synthèse de composés selon l'invention, notamment utiles comme nouvelles sondes lipidiques.
Toutes les expériences sont réalisées à l'abri de la lumière. Afin de contrôler l'état d'avancement de chaque étape de la synthèse par UV, l'acide gras contenant la benzophénone (FABP) est introduit sur le squelette ou plateforme lors de la première étape de synthèse des composés selon l'invention. Pour ce faire la fonction acide carboxylique de ce synthon est activée grâce à du PyBOP en milieu basique (DIEA). Ensuite le Boc-Dpr-OH est ajouté à la solution. Après traitement, Boc-Dpr(FABP)-OH 9a-c sont isolés, caractérisés et ensuite la fonction acide carboxylique libre de Boc-Dpr(FABP)-OH est activée avec du PyBOP en présence de DIEA avant l'ajout de l'hexadéc lamine. Boc-Dpr(FABP)-NH-C16H33 10 a-c sont isolés, caractérisés et ensuite la fonction aminé est déprotégée en milieu acide : mélange de TFA et dichlorométhane (1/1 v/v). Après traitement H-Dpr(FABP)-NH-C16H33 1 1 a-c sont isolés et caractérisés. Pour finir et de manière très avantageuse, CTMR est le dernier synthon à être introduit sur le squelette. Après l'activation de la fonction acide carboxylique de CTMR par du PyBOP en présence de DIEA, H-Dpr(FABP)-NH-C16H33 est ajouté. La progression de la réaction est suivie par CCM. Après traitement, Rhod- Dpr(FABP)-NH-C16H33 12 a-c sont isolés sous la forme d'une poudre violette. Tous les composés finaux ou intermédiaires sont caractérisés par CCM, MS ou RMN. Il est à noter que la carboxytétraméthylrhodamine est disponible commercialement, en particulier sous la forme d'un mélange de deux régio-isomères. Ces deux régio-isomères sont détectables en HPLC mais généralement difficilement séparables. Cette séparation n'est pas nécessaire pour l'utilisation des composés selon l'invention, en particulier comme sondes en milieu biologique.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un composé selon l'invention pour l'identification d'une protéine.
Ainsi, l'invention concerne une méthode d'identification d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon l'invention, préférentiellement l'utilisation d'un composé hydrophobe selon l'invention.
Ainsi et de manière avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention est mise en œuvre pour l'identification d'un fragment hydrophobe au sein d'une protéine.
De manière également avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention est mise en œuvre pour l'identification d'un ou plusieurs domaines transmembranaires au sein d'une protéine membranaire. De manière préférée, la méthode d'identification selon l'invention est mise en œuvre pour l'identification d'une protéine de fusion ou d'un peptide de fusion virale. La protéine de fusion à identifier peut être une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite, par exemple de l'hépatite B ou de l'hépatite C, ou encore du VIH, d'un virus de la grippe ou d'un virus vétérinaire.
De manière également préférée, la méthode d'identification selon l'invention comprend
a- la mise en contact du composé avec la protéine ;
b- la photoactivation du composé ou du groupement photoréactif du composé ;
c- la réaction du groupement photoactivé du composé avec la protéine ;
d- l'activation et la détection ou la détection de la fluorescence ou de l'absorbance du groupement chromophore au sein du produit de réaction.
De manière avantageuse, la mise en contact du composé selon l'invention avec la protéine est effectuée au moyen de micelles ou de systèmes à bicouches lipidiques, par exemple des liposomes.
La méthode d'identification selon l'invention comprend la photoactivation d'un composé selon l'invention qui est avantageusement réalisée
• avec une source choisie parmi une lampe ou un laser ; ou
· la puissance d'activation est comprise entre 0,1 et 1000 W ; ou
• la longueur d'onde est comprise entre 250 et 500 nm ; ou
• la durée d'activation est comprise entre 1 seconde et 2 heures, qu'elle soit effectuée de manière continue ou de manière séquencée ou puise. De manière particulièrement avantageuse, la méthode d'identification selon l'invention permet une très large gamme d'identification grâce au photomarquage hydrophobe de nombreux domaines ou zones protéiques. En effet, selon la position du groupement photoactivable sur la chaîne lipidique au sein du composé selon l'invention qui est utilisé, ce composé va pouvoir se lier de manière particulière et en une positon spécifique au sein de la protéine à identifier. De la même manière, l'autre chaîne lipidique, notamment du fait de sa longueur, peut être adaptée en fonction de l'environnement lipidique ou membranaire rencontré lors de la mise en œuvre de la méthode d'identification selon l'invention. Ainsi, l'adaptation de la longueur des chaînes lipidiques permet au composé selon l'invention de se positionner convenablement au sein du domaine hydrophobe de la protéine, notamment en évitant ou en limitant ses mouvements ou bien en limitant ou en évitant que ses chaînes lipidiques ne se replient sur elles-mêmes empêchant ainsi leur positionnement correct vis-à- vis du domaine hydrophobe étudié ou à identifier.
Le composé selon l'invention mis en œuvre pour la méthode d'identification selon l'invention permet donc un ancrage convenable au sein de la protéine à identifier.
Par ailleurs, parmi tous les groupements chimiques photoréactifs ou photoactivables qui peuvent être présents au sein du composé selon l'invention, la benzophénone est particulièrement avantageuse pour l'étude des interactions protéine-protéine et protéine- lipide. En effet, la longueur d'onde d'activation de la benzophénone se situant aux alentours de 365 nm, la dégradation des protéines est limitée voire nulle, permettant donc de réaliser des études en milieu cellulaire ou au sein d'autres systèmes vivants.
De plus, le radical généré lors de la photoactivation de la benzophénone va réagir en milieu hydrophobe sur une liaison C-H de manière covalente avec un bon rendement et permet donc une identification précise de l'environnement chimique de l'adduit formé.
Enfin, la benzophénone est chimiquement stable à la lumière ambiante et vis-à-vis de la plupart des conditions de synthèse utilisées en chimie.
Les différents aspects de l'invention peuvent être illustrés par les exemples qui suivent. Exemples de méthode de préparation et de composés :
L'acide aminé Boc-L-Dpr-OH est acheté chez Iris Biotech GmbH. La ninhydrine, l'acide phosphomolybdique et l'acide trifluoroacétique proviennent de chez Sigma-AIdrich. La carboxytétraméthylrhodamine et le PyBOP sont achetés chez Novabiochem. L'hexadécylamine provient de chez Aldrich et la DIEA de chez Alfa Aesar. L'acide 6-(4-(4-n- hexylbenzoyl)phényl)hexanoïque est synthétisé suivant le protocole mentionné ci-dessus. Les réactifs chimiques sont utilisés sans purification supplémentaire. Le CH2CI2 et le THF sont distillés sous atmosphère inerte (flux d'argon) et séché sur CaH2 et sodium (en présence de benzophénone) respectivement. La chromatographie est réalisée sur gel de silice 60 (40-63 μηι): la poudre et les plaques d'aluminium pour les CCM sont achetées chez Merck. Les spectres RMN 1H et 13C sont enregistrés sur des appareils Brucker 300 MHz ou 400 MHz. Les déplacements chimiques du proton (3) sont rapportés en ppm et le spectre est calibré par rapport au pic du solvant résiduel deutérée. Les constantes de couplage (J) sont rapportées dans Hz. Les spectres de masse (ES-MS) sont enregistrés sur un spectromètre de masse ESI / TOF Mariner. Pour les composés décrit pour la première fois, une masse à haute résolution (HR-MS) est mesurée sur spectromètre de masse GC / TOF Agilent. Les points de fusion sont mesurés sur un Buchi B-540. Les analyses HPLC sont effectuées avec une colonne Jupiter 5u C4 300A (150 x 4,6 mm, C4) Phenomenex avec un débit de 1 mL / min en utilisant un gradient linéaire de 10 min de 0 à 100 % de CH3CN dans l'eau (0,1% de TFA), suivies de 5 min à 100% CH3CN (0,1 % de TFA). Les temps de rétention (Tr) des analyses HPLC sont présentés en minutes.
Acide (4-(4-décylbenzoyl)phényl)éthanoique
Méthyl 4-décylbenzoate
- PM : 276,4 g. mol"1
Du chlorure de 4-décylbenzyole (1 ,00 g - 3,56 mmol) est dissous dans 10 mL de méthanol sous agitation et à température ambiante. Puis du diméthylaminopyridine (43 mg - 0,36 mmol) est ajouté à la solution et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 1 h. Le méthanol est ensuite évaporé sous pression réduite puis la solution est redissous dans 20 mL de CH2CI2. Le mélange obtenu est lavé avec de l'eau (2 fois 20 mL). La phase aqueuse est extraite avec CH2CI2 et les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le produit formé est séché sous la pompe à palettes pendant une nuit pour conduire au produit désiré sous la forme d'une huile incolore (973 mg - Rdt : 99%).
CCM : Rf = 0,7 (cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v)
RMN 1 H (400 MHz ; CDCI3) δ = 7,96 (d, 2H8+12, J = 8,2), 7,24 (d, 2H9+11 , J = 8,2), 3,90 (s, 3Hh), 2,66 (t, 2Hj, J = 7,8), 1 ,63 (m, 2Hk), 1 ,32-1 ,27 (m, 14Hl+m), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,7) RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) δ = 167,8 (Q), 149,1 (C10), 130,3 (C8+12), 129,0 (C9+11), 128,3 (C7), 52,5 (Ch), 36,7 (C ), 32,6, 31 ,8, 30,2, 30,2, 30,1 , 30,0, 29,9 (C,+k pour les sept pics), 23,3 (Cm), 14,7 (Cn)
Masse : m/z = 277,2 [M+H]+, masse calculée = 276,2
4-décylphénylméthanol
- PM : 248,4 g. mol"1
De l'aluminium lithium hybride (40 mg - 1 ,03 mmol) est dissous dans 15 mL d'éther diéthylique sous agitation, sous argon et à température ambiante dans un ballon sec muni d'un condenseur. Puis du méthyl 4-décylbenzoate (950 mg - 3,43 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution et le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant 1 h. 20 mL d'eau sont ensuite ajoutées avec précaution à la solution puis celle-ci est versée dans de l'eau glacée et une solution aqueuse à 10 % H2S04 (v/v) est ensuite ajoutée. La phase aqueuse est extraite avec de l'éther diéthylique et les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à 80/20 v/v) pour conduire au produit désiré obtenu sous la forme d'un solide blanc (768 mg - Rdt : 90%).
CCM : Rf = 0,6 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v)
RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,29 (d, 2H8+12, J = 7,9), 7,19 (d, 2H9+11 , J = 7,9), 4,65 (s, 2Hi), 2,63 (t, 2Hj, J = 7,8), 1 ,63 (m, 2Hk), 1 ,29 (m, 14Hl+m), 0,91 (t, 3Hn, J= 6,8)
RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) δ = 143,1 (C7), 138,8 (C10), 129,2 (C9+11), 127,8 (C8+12), 65,9 ( ), 36,3 (Cj), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (C,+k pour les 5 pics), 23,3 (Cm), 14,7 (Cn)
Masse (GCMS) : m/z = 246,2 [M]+, masse calculée = 248,2 g. mol"1
4-décylbenzaldéhvde (5)
- PM : 246,4 g. mol"1
A du chlorure d'oxalyle (390 μί - 4,63 mmol) à -78 °C est ajouté, avec précaution, du diméthylsulfoxyde (460 μί - 6,49 mmol) en solution dans 10 mL de CH2CI2 à -78 °C, sous argon et sous agitation pendant 10 min. Puis du 4-décylphényl méthanol (768 mg - 3,09 mmol) dissous dans 10 mL de CH2CI2 est ajouté prudemment à -78 °C. La solution résultante est agitée pendant 20 min. De la triéthylamine (1 ,73 mL - 12,4 mmol) est ensuite ajoutée puis la solution est laissée revenir à température ambiante. 20 mL d'une solution de NaHC03 saturée sont ensuite ajoutés au milieu réactionnel. La phase aqueuse est extraite avec du diéthyl éther (1 fois 50 mL). Les phases organiques réunies sont lavées avec une solution de KHS04 saturée, avec une solution de NaHC03 saturée et avec de la saumure puis séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite pour conduire au produit 5 obtenu sous la forme d'une huile incolore (662 mg - Rdt : 87%).
CCM : Rf = 0,7 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v)
RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 9,98 (s, 1 Hi), 7,80 (d, 2H8+12, J = 8,0), 7,34 (d, 2H9+11 , J = 8,1 ), 2,69 (t, 2H, J = 7,8), 1 ,65 (m, 2Hk), 1 ,27 (m, 14Hl+m), 0,89 (t, 3Hn, J= 6,6)
RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) δ = 192,5 (Q), 151 ,1 (C10), 135,1 (C7), 130,5 (C8+12), 129,7 (C9+11), 36,9 (Cj), 32,6, 31 ,7, 30,2, 30,1 , 30,0 (C,+k pour les 5 pics), 23,3(Cm), 14,7 (Cn) Masse : m/z = 247,2 [M+H]+, masse calculée = 246,2 g. mol"1
4-bromophénéthoxytriisopropylsilane (6b) g.mol"
De l'alcool 4-bromophénéthyle (500 mg - 2,48 mmol) est dissous dans 10 ml_ CH2CI2 puis du chlorure de triisopropylsilyle (720 mg - 3,73 mmol) et de l'imidazole (506 mg - 7,44 mmol) y sont ajoutés. La solution est agitée à température ambiante pendant 2 h. La phase organique est lavée avec une solution de NaHC03 saturée (2 fois 10 mL), avec de l'eau (1 fois 10 mL) et avec de la saumure (1 fois 10 mL). La phase aqueuse est extraite avec du CH2CI2 (2 fois 30 mL). Les deux phases organiques collectées sont séchées sur MgS04j filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/10 v/v) pour conduire au produit 6b obtenu sous la forme d'une huile incolore (880 mg - Rdt : 99 %).
CCM : Rf = 0,9 (cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v)
RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,40 (m, 2H3+5), 7,1 1 (m, 2H2+6), 3,87 (t, 1 Hb, J = 6,9), 2,81 (t, 1 Ha, = 6,9), 1 ,05 (m, 21 Hc+d)
RMN 13C (CDCI3) δ = 139,0 (d), 131 ,9 (C3+5), 131 ,6 (C2+6), 120,6 (C4), 65,1 (Cb), 39,8 (Ca), 18,6 (Cd), 12,7 (Cc)
Masse : m/z = 357,1 [M+H]+, masse calculée = 356,1 g.mol 1
Synthèse de (4-décylphényl)(4-(2-(triisopropylsilyleoxy)éthyl)phényl)méthanol (7b)
- PM : 524,9 g.mol"1
L'alcool protégé 6b (957 mg - 2,67 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation, sous argon et à -78 °C dans un bicôl sec. Puis du n-butyl lithium (1 ,8 mL - 2,92 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution et celle-ci est laissée sous agitation à -78 °C pendant 1 h. L'aldéhyde 5 (600 mg - 2,43 mmol) dissous dans 10 mL de THF est ensuite ajouté, goutte à goutte, à la solution maintenue à -78°C puis on laisse le milieu réactionnel revenir à température ambiante et la solution est agitée pendant 12 h. 20 mL d'une solution de NaHC03 saturée sont ajoutés à la solution et celle-ci est ensuite extraite avec AcOEt. Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution de NaHC03 saturée et de la saumure puis séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution Cyclohexane/AcOEt 100/0 à 100/7 v/v) pour conduire au produit 7b obtenu sous la forme d'une huile incolore (892 mg- Rdt : 70%)
CCM : Rf = 0,6 (Cyclohexane/AcOEt 8/2 v/v)
RMN 1 H (400 MHz ; CDCI3) δ = 7,32 - 7,13 (m, 8Η2ι3,5,6,β,9,ι ι ,ΐ2) , 5,81 (s, 1 H,), 3,89 (dt, 2Hb, J = 10,6, 7,2), 2,86 (dt, 2Ha, J = 10,6, 7,2), 2,59 (t, 2Hj, J = 7,8), 1 ,59 (m, 2Hk), 1 ,30 (m, 14Hl+m), 1 ,05 (m, 21 Hc+d), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,7)
RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) δ = 142,9, 142,5 (C7+4 pour les 2 pics), 141 ,9 (C10), 139,2 (d), 129,9, 129,1 , 127,1 (C2,3,5,6,8,9,i i ,i2 pour les 3 pics), 76,7 (Q), 65,5(Cb), 40,1 (Ca), 36,3 (Cj), 32,6, 32,2, 30,3, 30,2, 30,0 (CkJ pour les 5 pics), 23,4 (Cm), 18,6 (Cd), 14,8 (Cn), 12,7 (Cc) Masse : m/z = 547,4 [M+Na]+, masse calculée = 524,4 g. mol"1
Synthèse de 2-(4-((4-décylphényl)(hvdroxy)méthyl)phényl)éthanol (8)
- PM : 368,5 g. mol"1
7b (842 mg - 1 ,60 mmol) est dissous dans 10 mL de THF sous agitation et du fluorure de tetra-n-butylammonium (3 mL - 3 mmol) est ajouté à la solution. Celle-ci est laissée sous agitation pendant 1 ,5 h. 10 mL d'une solution de NaHC03 saturée sont ajoutés à la solution et celle-ci est ensuite extraite avec AcOEt. Les phases organiques récupérées sont lavées avec une solution de NaHC03 saturée puis séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2CI2/MeOH 100/0 à 98/2 v/v) pour conduire au produit 8 obtenu sous la forme d'un solide blanc (427 mg- Rdt : 73%)
CCM : Rf = 0,5 (CH2CI2/MeOH 9/1 v/v)
RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,36 - 7,14 (m, 8H2,3,5,6,8,9,i i ,i2), 5,82 (s, 1 Hj), 3,85 (m, 2Hb), 2,86 (t, 2Ha, J = 6,5), 2,58 (t, 2Hj, J = 7,8), 1 ,59 (m, 2Hk), 1 ,26 (m, 14H,+m), 0,89 (t, 3Hn, J = 6,7)
RMN 13C (50 MHz ; CDCI3) δ = 143,0 (C7), 142,9 (C4), 141 ,8 (C10), 138,3 (d), 129,7 (Cg. ), 129,2 (C2,6), 127,4 (CW2), 127,1 (C3,5), 76,6 (C,), 64,2 (Cb), 39,5 (Ca), 36,3 (Q), 32,6, 32,1 , 30,3, 30,2, 30,0 (Ck+, pour les 5 pics), 23,4 (Cm), 14,8 (Cn)
Masse : m/z = 351 ,2 [M+H-H20]+, masse calculée = 368,3 g. mol"1
Acide (4-(4-décylbenzoyl)phénv0éthanoiaue (1c)
C25H3203 - PM : 380,5 g. mol"1
8 (410 mg - 1 ,1 1 mmol) est dissous dans 10 mL d'acétone puis 1 mL de réactif de Jones 2,67 M (26,72 g de trioxyde de chrome, 23 mL d'acide sulfurique concentré, 77 mL d'eau) est ajouté goutte à goutte à la solution. Celle-ci est agitée à température ambiante pendant 2 h. L'excès de réactif est réduit par quelques gouttes d'isopropanol. 20 mL d'eau sont ensuite ajoutés au milieu réactionnel pour dissoudre le précipité de sel de chrome. L'acétone est évaporée sous pression réduite. La phase aqueuse est alors extraite avec du CH2CI2 (4 fois 20 mL). Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution Cyclohexane/AcOEt 95/5 à 85/15 v/v) pour conduire au produit 1 c obtenu sous la forme d'un solide blanc (384 mg - Rdt : 91 %)
CCM : Rf = 0,4 (CH2CI2/MeOH 9/1 v/v)
Point de fusion : 71 .0 - 72.5 °C
RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,77 (dd, 4H3,5,8,12, J = 12,8, 8,2), 7,35 (dd, 4H2,6,9i11 , J= 38,7, 8,1 ), 3,76 (s, 2Ha), 2,69 (t, 2Hj, J = 7,7), 1 ,64 (m, 2Hk), 1 ,28 (m, 14Hl+m), 0,89 (t, 3Hn, J= 6,4) RMN ,3C (50 MHz ; CDCI3) δ = 196,8 (Q), 177,4 (Cb), 149,0 (C10), 138,3, 137,6, 135,6 (C ,7 pour les 3 pics), 131 ,0, 130,0, 129,0 (C2,3,5,6,8,9,i i ,i2 pour les 3 pics), 41 ,6 (Ca), 36,7 (C,), 32,6, 31 ,8, 30,2, 30,0 (Ck+, pour les 4 pics), 23,3 (Cm), 14,8 (Cn)
Masse : m/z = 381 ,2 [M+H]+, masse calculée = 380,2 g. mol"1
Rhod-Dpr(FABP)-NH-C,fiH^
Boc-L-Dpr(FABP)-OH (9)
À une solution de FABP (1 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1 éq) sont ajoutés. La solution est agitée pendant 10 min afin d'activer l'acide. Puis, du Boc-L-Dpr-OH (1 éq) solubilisé dans un mélange de dichlorométhane anhydre et de méthanol (3/2 v/v) est ajouté à la solution précédente. La solution résultante est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Puis, la phase organique est lavée avec une solution de NaHC03 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2CI2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2CI2/MeOH 100/0 à 100/15 v/v).
Exemple avec l'acide (S)-2-(tert-butoxycarbonylamino)-3-(6-(4-(4-hexylbenzoyl)phényl) hexanamido) propanoïque (9a)
Temps de réaction : 12h ; CCM : Rf = 0,3 (CH2CI2/MeOH v/v 9/1 ) ; RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,67 (m, 4H), 7,24 (m, 4H), 4,14 (m, 1 H), 3,73 (q, 1 H, J = 7,0), 3,14 (q, 1 H, J = 7,0), 2,65 (m, 4H), 2,17 (m, 2H), 1 ,62 - 1 ,21 (m, 23H), 0,87 (m, 3H). Masse : m/z = 567,4 [M+H]+, masse calculée = 566,3 g. mol"1
Boc-L-Dpr(FABP)-NH-CiBH∞ (10)
À une solution de Boc-L-Dpr(FABP)-OH (1 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1 ,3 éq) sont ajoutés et cette solution est agitée pendant 1 0 min afin d'activer l'acide. Puis, de l'hexadécylamine (1 éq) est ajouté à la solution qui est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Ensuite la phase organique est lavée avec une solution de NaHC03 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2CI2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2CI2/MeOH 100/0 à 100/4 v/v).
Exemple avec (S)-tert-butyl 1 -(hexadécylamino)-3-(6-(4-(4- hexylbenzoyl)phényl)hexanamido)-1 -oxopropan-2-ylcarbamate (10a)
Temps de réaction : 6h ; CCM : Rf = 0,4 (CH2CI2/MeOH 9/2 v/v) ; RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,73 (m, 4H), 7,27 (m, 4H), 6,86 (s, 1 H), 6,35 (s, 1 H), 5,98 (d, 1 H, J = 6,0), 4,16 (m, 1 H), 3,71 (m, 1 H), 3,51 (m, 1 H), 3,23 (m, 2H), 2,69 (t, 4H, J = 7,5), 2,20 (t, 2H, J = 7,5), 1 ,70 - 1 ,25 (m, 51 H), 0,88 (m, 6H) ; RMN 13C (75 MHz ; CDCI3) δ = 196,9, 175,5, 1 71 ,1 , 148,6, 148,0, 136,3, 136,0, 130,9, 128,9, 81 ,0, 42,7, 40,2, 37,0, 36,7, 36,4, 32,6, 32,4, 31 ,8, 31 ,5, 30,4-29,5, 29,0, 27,5, 26, 1 , 23,3, 14,7. Masse : m/z = 790,7 [M+H]+, masse calculée = 789,6 g. mol 1
H-L-Dpr(FABP)-NH-C1 RH33 (1 1 )
Du Boc-L-Dpr(FABP)-NH-C16H33 est dissous dans une solution de CH2CI2/TFA 1 /1 v/v. Cette solution est agitée pendant 1 h à température ambiante protégée de la lumière puis diluée avec CH2CI2. La phase organique est lavée avec une solution de NaHC03 saturée et la phase aqueuse est extraite avec du CH2CI2. Les phases organiques récupérées sont séchées sur MgS04, filtrées et le solvant est évaporé sous pression réduite.
Exemple avec (S)-N-(2-amino-3-(hexadecylamino)-3-oxopropyl)-6-(4-(4- hexylbenzovDphényl) hexanamide (1 1 a)
Temps de réaction : 1 h ; CCM : Rf = 0,4 (CH2CI2/MeOH 9/1 v/v) ; RMN 1 H (300 MHz ; CDCI3) δ = 7,73 (m, 4H), 7,50 (m, 1 H), 7,27 (m, 4H), 6,29 (m, 1 H), 3,65 (m, 1 H), 3,47 - 3,37 (m, 2H), 3,23 (m, 2H), 2,69 (t, 4H, J = 7,5), 2,20 (t, 2H, J = 7,5), 1 ,66 - 1 ,25 (m, 42H), 0,88 (m, 6H) ; RMN 13C (75 MHz ; CDCI3) δ = 196,9, 174,8, 173,9, 148,6, 148,0, 136,2, 136,0, 130,8, 128,9, 55,9, 44,3, 39,8, 37,2, 36,6, 36,4, 32,6, 32,3, 31 ,8, 31 ,4, 30,3-29,5, 27,6, 26,1 , 23,3, 14,7. Masse : m/z = 690,5 [M+H]+, masse calculée = 689,5 g. mol"1
Rhod-Dprf FABPl-NH-CiwHaa (12)
À une solution de CTMR (1 ,3 éq) dans le dichlorométhane anhydre, de la DIEA (5 éq) et du PyBOP (1 ,3 éq) sont ajoutés et cette solution est agitée pendant 10 min afin d'activer l'acide. Puis, du H-L-Dpr(FABP)-NH-Ci6H33 (1 éq) solubilisé dans le dichlorométhane anhydre est ajouté à la solution précédente. La solution résultante est agitée à température ambiante, protégée de la lumière. Puis, le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (gradient d'élution CH2CI2/MeOH 100/0 à 100/15 v/v). Exemple avec Rhod-Dpr(CO-C -BP-CR)-NH-CiRH^ M 2a)
Temps de réaction : 24h ; CCM : Rf = [0,7 ; 0,5] (CH2CI2/MeOH 9/2 v/v) ; HRMS calculée pour CegHgsNgO/ = 1 102.6997 trouvée 1 102.6961 ; HPLC : Tr = 13,6 min
Exemple de méthode d'identification :
Réactifs :
La dodécylphosphocholine (DPC) et la bactériorhodopsine de Halobacterium salinarum proviennent de SIGMA. La phosphatidylcholine de jaune d'oeuf (PC) et le cholestérol (chol, 99% pur) proviennent d'Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA).
Préparation des liposomes :
PC, chol et le lipide-outil (12a-c) (65:30:5 rapport molaire) dissous dans du chloroforme sont mélangés dans un tube à essai. Après évaporation du solvant à la chaleur (45 min à 37 'Ό), le film sec est hydraté par addition de 300 μΙ de PBS pH 7.4 pour obtenir une concentration finale de 5 mM en lipides. Le mélange est agité et la suspension résultante est chauffée à 37°C, puis refroidie dans l'azote liquide 5 fois, puis passée à travers une extrudeuse équipée de 2 filtres de 100 nm (35 passages).
Spectroscopie de fluorescence :
Les spectres d'excitation et d'émission des composés sondes selon l'invention au sein de liposomes sont enregistrés à 32 °C sur un spectrofluorimètre TECAN Infinité M1000. La composition en lipides des liposomes est PC:chol:lipide-outil 65:30:5 (rapport molaire). Les liposomes contrôle « blancs >> sont composés de PC:chol, et leur fluorescence résiduelle est soustraite des spectres de fluorescence mesurés. Photomarquage de la bactériorhodopsine :
DPC est ajoutée à une solution composé dans chloroforme-méthanol (2/1 , v/v), dans la proportion composé/détergent 1 :50 molaire. Après évaporation sous vide poussé pendant 2h, le film lipidique sec est hydraté par addition de 50 μΙ d'eau distillée et 50 μΙ de Tris-HCI pH 8.0. La bactériorhodopsine resuspendue dans l'eau distillée, est incubée avec les composés selon l'invention en micelles de détergent, dans un rapport molaire protéine- composé de 1 :5. Le mélange est ensuite laissée 1 h à l'obscurité à 4°C, puis soumis pendant 45s à T'irradiation UV avec un dispositif UV Flood Dymax, équipé d'une lampe à mercure haute pression 400W, placée à une distance de 10 cm de l'échantillon dans une cuvette en quartz. Le tampon de Laëmmli est ensuite ajouté au mélange irradié, puis incubé 15 min à température ambiante. L'analyse se fait sur gel d'électrophorèse (15% d'acrylamide / 20% glycérol). Après migration, le gel est d'abord analysé sur un Fluorimager Typhoon 8600 équipé d'un filtre rhodamine, pour détecter la fluorescence ; le gel est ensuite coloré au bleu de Coomassie pour visualiser toutes les bandes protéiques.
On constate alors que la protéine n'est visualisée par Fluorimager qu'après photomarquage et qu'elle n'est pas dégradée dans les conditions de notre test (coloration Coomassie). De plus, l'efficacité du pontage covalent dépend de la distance entre le double cycle aromatique de la benzophénone et le carbonyle (cf. tableau 1 ).
médium FABP
proximal FABP
QÇ)
Tableau 1

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle substituée par
• au moins un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
• une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité liée à la plateforme ;
• une deuxième chaîne hydrocarbonée, comprenant un groupement photoréactif et fonctionnalisée en une extrémité liée à la plateforme.
2. composé selon la revendication 1 qui est hydrophobe.
3. Composé de formule (I) selon les revendications 1 ou 2 comprenant
• une plateforme de liaison Q au moins trifonctionnelle, substitué par
• au moins un groupement chromophore Q1 choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
• une première chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L1 ;
• une deuxième chaîne hydrocarbonée liée à Q par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel L2 et comprenant un groupement photoréactif Q2 ;
dans laquelle
• Q représente une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ;
• p représente 1 , 2 ou 3 ;
• Q1, identique ou différent, représente indépendamment un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent ou un groupement luminescent ;
• L1 et L2, identiques ou différents, représentent indépendamment un groupement choisi parmi NH, C(O), S, O ;
• Q2 représente un groupement photoréactif ;
• m représente un nombre entier allant de 0 à 24 ; • n représente un nombre entier allant de 1 à 24 ;
• la somme de m et de n est comprise entre 1 et 30 ;
• q représente un nombre entier allant de 1 à 30.
4. Composé selon la revendication 3 pour lequel
• p représente 1 et Q1 représente un groupement fluorescent ; ou
• p représente 2 et Q1 représente indépendamment deux groupements fluorescents, identiques ou différents ; un groupement fluorescent et un groupement absorbant ; un groupement fluorescent et un groupement luminescent ; ou
· p représente 3 et Q1 représente indépendamment un groupement luminescent et deux groupements fluorescents, identiques ou différents.
5. Composé selon les revendications 1 à 4 pour lequel la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement choisi parmi les dérivés acides aminés, les dérivés du glycérol, les dérivés triacides carboxyliques, les dérivés triamines.
6. Composé selon la revendication 5 pour lequel la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ou Q représente un groupement dérivé d'un alpha-aminoacide et comprenant deux fonctions aminés et une fonction carbonyle.
7. Composé de formule (II) selon la revendication 6
dans laquelle Q1 , L1, L2, Q2, m, n et q sont tels que définis par les revendications 3 et 4.
8. Composé de formule (III) selon la revendication 7
(III)
dans laquelle Q1 , Q2, m, n et q sont tels que définis par les revendications 3 et 4.
9. Composé selon les revendications 1 à 8 pour lequel le groupement chromophore ou Q1 est indépendamment choisi parmi la rhodamine, la fluorescéine, les dérivés de la rhodamine, la rhodamine substituée, les dérivés de la fluorescéine, la fluorescéine substituée, les colorants, les substances colorées absorbant dans le visible (400 à 800 nm), la luciférine, le luminol, les dérivés du luminol.
10. Composé selon la revendication 9 pour lequel le groupement chromophore ou Q1 est choisi parmi la rhodamine et ses analogues.
1 1. Composé selon la revendication 10 pour lequel le groupement chromophore ou Q1 est la carboxytétraméthylrhodamine.
12. Composé selon les revendications 3 à 1 1 pour lequel
• m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou
• n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; ou
• q représente un nombre entier allant de 6 à 26 ; ou
· la somme de m et de n est comprise entre 4 et 24.
13. Composé selon la revendication 12 pour lequel
• m représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et
• n représente un nombre entier allant de 1 à 12 ; et
· q représente un nombre entier allant de 8 à 24 ; et
• la somme de m et de n est comprise entre 6 et 18.
14. Composé selon les revendications 1 à 13 pour lequel le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi les groupements générateurs de carbène, les groupements générateurs de nitrène, les dérivés d'arylcétone.
15. Composé selon la revendication 14 pour lequel le groupement photoréactif ou Q2 est indépendamment choisi parmi un groupement comprenant une fonction diazo ou diazoester, un groupement dérivé de la diazirine, un groupement comprenant une fonction arylazide, acylazide, alkylazide, diazoester, un groupement dérivé de la benzophénone et un groupement de formule (IV)
(IV)
16. Procédé de préparation d'un composé selon les revendications 1 à 15 par réaction
• d'un composé comprenant une plateforme de liaison au moins trifonctionnelle ;
• d'au moins un composé comprenant un groupement chromop ore choisi parmi un groupement absorbant, un groupement fluorescent et un groupement luminescent ;
• d'un composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ;
• d'un composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif.
17. Procédé selon la revendication 16 pour lequel le composé comprenant la plateforme de liaison au moins trifonctionnelle comprend une fonction aminé primaire libre, une fonction aminé primaire protégée et une fonction acide carboxylique.
18. Procédé selon la revendication 17 comprenant
• la réaction de la fonction aminé primaire avec le composé comprenant une première chaîne hydrocarbonée et fonctionnalisée en une extrémité ;
• la réaction de la fonction acide carboxylique avec le composé comprenant une deuxième chaîne hydrocarbonée, fonctionnalisée en une extrémité et comprenant un groupement photoréactif ;
• la déprotection de la fonction aminé primaire protégée ;
• la réaction de la fonction aminé primaire déprotégée avec le composé comprenant un groupement chromophore choisi parmi un groupement absorbant, groupement fluorescent ou un groupement luminescent.
19. Procédé selon les revendications 16 à 18 pour la préparation d'un composé selon les revendications 1 à 15.
20. Méthode d'identification d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 15.
21. Méthode d'identification selon la revendication 20 d'un fragment hydrophobe au sein d'une protéine comprenant l'utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 15.
22. Méthode selon la revendication 21 pour l'identification d'un ou plusieurs domaines transmembranaires au sein d'une protéine membranaire.
23. Méthode selon les revendications 20 à 22 pour l'identification d'une protéine de fusion.
24. Méthode selon les revendications 20 à 23 pour l'identification d'un peptide de fusion virale.
25. Méthode selon les revendications 20 à 24 pour l'identification d'une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite, du VIH, d'un virus de la grippe, d'un virus vétérinaire.
26. Méthode selon la revendication 25 pour l'identification d'une protéine de fusion d'un virus de l'hépatite B ou de l'hépatite C.
27. Méthode selon les revendications 20 à 26 comprenant
a- la mise en contact du composé avec la protéine ;
b- la photoactivation du composé ou du groupement photoréactif du composé ; c- la réaction du groupement photoactivé du composé avec la protéine ;
d- l'activation et la détection ou la détection de la fluorescence ou de l'absorbance du groupement chromophore au sein du produit de réaction.
28. Méthode selon la revendication 27 pour laquelle la mise en contact du composé avec la protéine est effectuée au moyen de micelles ou de systèmes à bicouches lipidiques.
29. Méthode selon la revendication 28 pour laquelle les systèmes à bicouches lipidiques sont des liposomes.
30. Méthode selon les revendications 27 à 29 pour laquelle la photoactivation est réalisée · avec une source choisie parmi une lampe ou un laser ; ou
• la puissance d'activation est comprise entre 0,1 et 1000 W ; ou • la longueur d'onde est comprise entre 250 et 500 nm ; ou
• la durée d'activation est comprise entre 1 seconde et 2 heures.
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