EP2673298A1 - Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse - Google Patents

Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse

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EP2673298A1
EP2673298A1 EP12703098.9A EP12703098A EP2673298A1 EP 2673298 A1 EP2673298 A1 EP 2673298A1 EP 12703098 A EP12703098 A EP 12703098A EP 2673298 A1 EP2673298 A1 EP 2673298A1
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EP
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seq
antibody
cells
antibodies
cdr3
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Withdrawn
Application number
EP12703098.9A
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German (de)
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Inventor
François Paris
Stéphane BIRKLE
Ariane DESSELLE
Jacques Aubry
Marie-Hélène GAUGLER
Denis COCHONNEAU
Tanguy CHAUMETTE
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Universite de Nantes
Institut de Radioprotection et de Surete Nucleaire (IRSN)
Original Assignee
Universite de Nantes
Institut de Radioprotection et de Surete Nucleaire (IRSN)
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Publication date
Application filed by Universite de Nantes, Institut de Radioprotection et de Surete Nucleaire (IRSN) filed Critical Universite de Nantes
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • Anti-Gb3 Antibodies useful in the treatment of angiogenesis-associated diseases include:
  • the present invention is in the field of new anticancer therapies, more specifically in the field of anti-angiogenic molecules.
  • it relates to anti-Gb3 antibodies having specific CDR sequences, as well as to the use of anti-Gb3 antibodies that are not coupled to a therapeutic molecule in the treatment of diseases associated with angiogenesis.
  • Cancer cells because of their genetic instability, can acquire resistance to cancer treatments, which is at the origin of therapeutic failures or cancer recurrences.
  • the endothelial cells of the tumor's blood vessels are genetically stable. In addition, they are essential for neovasculansation without which the tumor can not continue to grow, for lack of nutrients. Therefore, a strategy to inhibit angiogenesis, i.e., proliferation of tumor endothelial cells, would not be sensitive to the genetic variability of the tumor, with endothelial cells being genetically stable.
  • Targeting endothelial cells also has other benefits
  • the tumor cells are difficult to reach. Indeed, with traditional anti-cancer therapies, the penetration of the treating agents into the tumor tissues is diminished because of the high interstitial pressure in most tumors. This is not the case in vessels that are a more easily accessible target. Because of this accessibility, endothelial cell targeting allows efficient distribution and rapid accumulation in the tumor vessels. Therefore, targeting the vasculature is a strategy that can be applied to the majority of tumor types.
  • the vast majority of endothelial cells are in a quiescent state.
  • the endothelium of the tumor networks is composed of endothelial cells presenting a proliferating "angiogenic" phenotype that it is theoretically possible to target.
  • the vessels that irrigate the tumors have structural and functional characteristics different from those of the normal vessels. It is thus expected that this strategy is selective and causes few side effects on so-called "physiological" angiogenesis.
  • targeting proliferating endothelial cells has many advantages, both in terms of accessibility of targeted cells, the number of tumors that can be treated, reduction of side effects if only proliferating endothelial cells are targeted, and prevention of metastases.
  • Globotriasosylceramide or globotriaosylceramide (Gb3), also called CD77, P k , ceramide trihexoside (CTH), and Burkitt Lymphoma Antigen (BLA) is a glycosphingolipid in the form of Galactoseal ⁇ 4Galactose i ⁇ 4Glucose i ⁇ Cerami de, synthesized by the enzyme Lactosylceramide. 4-alpha-galactosyltransferase (A4GALT). It is expressed by the HUVEC endothelial cell line, more when this line is proliferating than when the cells are confluent and are no longer in the exponential phase of growth. It therefore constitutes a marker of the endothelial cells involved in angiogenesis (Heath-Engel et al., Obrig et al).
  • the ceramide the hydrophobic part of the molecule anchored in the outer leaflet of the plasma membrane, is formed of a fatty acid chain composed of 16 to 28 carbon atoms, linked by an amide linkage to a sphingoid base, generally sphingosine. . It can have variations in the length but also in the number of unsaturation of its chain of fatty acids. In particular, the main possible variations for the sphingoid base and the fatty acid chain are shown in Table 1 below.
  • Gb3 is a natural receptor of certain bacterial toxins such as Shiga toxin, produced by Shigella dysenteriae, and verotoxins produced by Escherichia coli. These toxins are composed of two subunits A and B, the subunit B being involved in the binding to Gb3, while the subunit A corresponds to the toxic part inhibiting the protein synthesis.
  • the binding of these bacterial toxins to Gb3 leads to the transport of toxin from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum via early endosomes and the Golgi apparatus.
  • Subunit A produces its toxic effects in the endoplasmic reticulum.
  • Shiga toxin and verotoxins have therefore been proposed to exert cytotoxic activity on endothelial cells, in particular on proliferating endothelial cells (Heath-Engel et al., Obrig et al., WO98 / 51326).
  • Verotoxins and Shiga toxin have also been proposed as a therapeutic agent in the treatment of tumors expressing Gb3 on their surface, the subunit B for targeting, while the A subunit plays a cytotoxic role.
  • verotoxin 1 has been shown to be capable of inducing apoptosis of Burkitt lymphoma cells (Tétaud et al).
  • Gb3 is expressed in many other tissues, such as the tissue of the stomach, esophagus, prostate and kidney. Since Shiga toxin and verotoxins are small molecules (about 68 kilodaltons (kDa)), they can leave the bloodstream and enter healthy tissues, where they have the same cytotoxic properties for Gb3-expressing cells as for tumor cells. Because of their lack of specificity of action, these toxins lead to unacceptable side effects.
  • Bast et al show that two hours after administration to rabbits, verotoxin 1 is no longer present in the bloodstream and can be found in target organs expressing Gb3.
  • the small molecular weight of these toxins and their exit from the bloodstream also reduces their duration of action on the cells of the blood vessels, thus also decreasing their effectiveness.
  • Monoclonal antibodies can be generated for many types of ligands, including glycosphingolipids, although some are immunogenic. Monoclonal antibodies directed against Gb3 were already used for labeling Gb3-expressing cells, in particular monoclonal antibody 38.13 (Bordron et al., Chark et al).
  • this monoclonal antibody 38.13 does not bind Gb3 in the same way as verotoxins (Chark et al).
  • an anti-Gb3 monoclonal antibody obtained from ascites 1A4 induced apoptosis of Burkitt's lymphoma cells by a mechanism different from that of verotoxin 1 (Tétaud et al). It was therefore unlikely that an anti-Gb3 monoclonal antibody could have the same anti-angiogenic effect as verotoxins.
  • W098 / 51326 which describes the use of Gb3-binding molecules as anti-angiogenic agents, provides as such agents verotoxins and anti-Gb3 antibodies coupled to a toxic molecule, such as toxins. The authors of this document therefore considered that an anti-Gb3 antibody alone would not have an anti-angiogenic effect.
  • anti-Gb3 monoclonal antibodies have anti-angiogenic activity on proliferating endothelial cells.
  • These monoclonal antibodies can therefore be used in the treatment of diseases associated with angiogenesis, and in particular solid tumors, with all the previously mentioned advantages that this targeting comprises (less risk of resistance, applicable to any type of tumor, targets easily). reached, prevention of metastases).
  • this targeting comprises (less risk of resistance, applicable to any type of tumor, targets easily). reached, prevention of metastases).
  • Shiga toxin and verotoxins have several advantages over Shiga toxin and verotoxins:
  • the antibodies Depending on their isotype, the antibodies have a molecular weight that varies between 150 (IgG) and 1000 (IgM) kDa, and therefore have a higher molecular weight than the Shiga toxin and verotoxins. This should allow them to stay longer in the bloodstream and therefore have a longer duration of action than these toxins on the endothelial cells of tumor neovessels.
  • the isotypes IgG (in particular IgG1) and IgM are the most advantageous. Indeed, the IgM have the largest molecular weight, about 80% remaining in the bloodstream, and they have an in vivo half-life of about 10 days.
  • Mouse antibodies obtained by the inventors can be humanized, so as to minimize any immune response of the recipient, which is not possible for bacterial toxins, which generate an immune response may reduce their effectiveness.
  • the present invention therefore relates to an antibody directed against the glycosphingolipid membrane globotriaosylceramide (Gb3), or a functional fragment or a derivative thereof, characterized in that it has at least one complementarity determining region (CDR) having a amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 42, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96% at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 1 to 42.
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has a heavy chain comprising at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 1 to 3, 7 to 9, 13 to 15, 19 to 21, 25 to 27, 31 to 33, and 37 to 39, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85% at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 1 to 3, 7 to 9, 13 to 15, 19 to 21, 25 to 27, 31 to 33, and 37 to 39.
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has a light chain comprising at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 4 to 6, 10 to 12, 16 to 18, 22 to 24, 28 to 30, 34 to 36, and 40 to 42, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85% %, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 4 to 6, 10 to 12 , 16 to 18, 22 to 24, 28 to 30, 34 to 36, and 40 to 42.
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has: a heavy chain comprising at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 3, 7 to 9, 13 to 15, 19 to 21, 25 to 27, 31 at 33, and 37 to 39, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least
  • CDR complementarity determining region
  • a light chain comprising at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 4 to 6, 10 to 12, 16 to 18, 22 to 24, 28 to 30, 34 at 36, and 40 to 42, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%), at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 4 to 6, 10 to 12, 16 to 18, 22 to 24, 28 to 30, 34 to 36, and 40 to 42.
  • CDR complementarity determining region
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention may also advantageously have a heavy chain comprising three CDR-H (heavy chain CDR) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%), at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the following sequences:
  • CDR1-H-3E2 SEQ ID NO: 1
  • CDR2-H-3E2 SEQ ID NO: 2
  • CDR3-H-3E2 SEQ ID NO: 3
  • CDR1-H-25C10 SEQ ID NO: 25, CDR2-H-25C10: SEQ ID NO: 26, CDR3-H-25C10: SEQ ID NO: 27, f) CDR1-H-11E10: SEQ ID NO: 31, CDR2-H-11E10: SEQ ID NO: 32, CDR3-H-11E10: SEQ ID NO: 33, or
  • CDR1-H-16G8 SEQ ID NO: 37
  • CDR2-H-16G8 SEQ ID NO: 38
  • CDR3-H-16G8 SEQ ID NO: 39.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention may also advantageously have a light chain comprising three CDR-L (light chain CDR) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80% preferably at least 85%>, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the following sequences: a) CDR1- L-3E2: SEQ ID NO: 4, CDR2-L-3E2: SEQ ID NO: 5, CDR3-
  • L-3E2 SEQ ID NO: 6
  • CDR1-L-15C11 SEQ ID NO: 16
  • CDR2-L-15C11 SEQ ID NO: 17
  • CDR3-L-15C11 SEQ ID NO: 18
  • CDR3-L-11E10 SEQ ID NO: 36, or
  • CDR1-L-16G8 SEQ ID NO: 40
  • CDR2-L-16G8 SEQ ID NO: 41
  • CDR3-L-16G8 SEQ ID NO: 42.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has heavy and light chains respectively comprising CDR-H and CDR-L having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80 %, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the following sequences:
  • CDR1-H-3E2 SEQ ID NO: 1
  • CDR2-H-3E2 SEQ ID NO: 2
  • H-3E2 SEQ ID NO: 3, CDR1-L-3E2: SEQ ID NO: 4, CDR2-L-3E2: SEQ ID NO: 5, CDR3-L-3E2: SEQ ID NO: 6, b) CDR1-H-14C11: SEQ ID NO: 7, CDR2-H-14C11: SEQ ID NO: 8, CDR3-H-14C11: SEQ ID NO: 9, CDR1-L-14C11: SEQ ID NO: 10, CDR2-L-14C11: SEQ ID NO: 11, CDR3-L-14C11: SEQ ID NO: 12,
  • CDR1-H-15C11 SEQ ID NO: 13
  • CDR2-H-15C11 SEQ ID NO: 14
  • CDR3-H-15C11 SEQ ID NO: 15
  • CDR1-L-15C11 SEQ ID NO: 16
  • L-15C11 SEQ ID NO: 17
  • CDR3-L-15C11 SEQ ID NO: 18
  • CDR1-H-22F6 SEQ ID NO: 19
  • CDR2-H-22F6 SEQ ID NO: 20
  • CDR3-H-22F6 SEQ ID NO: 21
  • CDR1-L-22F6 SEQ ID NO: 22
  • CDR2-L-22F6 SEQ ID NO: 23
  • CDR3-L-22F6 SEQ ID NO: 24,
  • CDR3-H-25C10 SEQ ID NO: 27, CDR1-L-25C10: SEQ ID NO: 28, CDR2-L-25C10: SEQ ID NO: 29, CDR3-L-25C10: SEQ ID NO: 30,
  • CDR1-H-16G8 SEQ ID NO: 37
  • CDR2-H-16G8 SEQ ID NO: 38
  • CDR3-H-16G8 SEQ ID NO: 39
  • CDR1-L-16G8 SEQ ID NO: 40
  • CDR2-L-16G8 SEQ ID NO: 41
  • CDR3-L-16G8 SEQ ID NO: 42.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has a heavy chain comprising a variable region having a sequence chosen from SEQ ID NO: 43 to 49 or a sequence having at least 80% preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 43 at 49.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has a light chain comprising a variable region having a sequence chosen from SEQ ID NO: 50 to 56 or a sequence having at least 80 %, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 50 to 56.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention has: a heavy chain comprising a variable region having a sequence selected from SEQ ID NO: 43 to 49 or a sequence having at least 80%, preferably at least 85%>, at least 90%, at least 95%, at least 96% at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 43 to 49, and
  • a light chain comprising a variable region having a sequence selected from SEQ ID NO: 50 to 56 or a sequence having at least 80%), preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96% at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 50-56.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention may be chosen from among the anti-Gb3 monoclonal antibodies generated by the inventors or variants thereof, which have heavy chains. and light ones whose variable regions have the following amino acid sequences or sequences having at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%), at least 99% identity with the following sequences:
  • Antibody 3E2 heavy chain: SEQ ID NO: 43, light chain: SEQ ID NO: 50,
  • Antibody 15C11 heavy chain: SEQ ID NO: 45 light chain: SEQ ID NO: 52,
  • 22F6 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 46, light chain: SEQ ID NO: 53,
  • g) 16G8 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 49, light chain: SEQ ID NO: 56.
  • antibody or “immunoglobulin” is meant a glycoprotein composed of two types of glycopolypeptide chains called “heavy chain” and “light chain”, an antibody consisting of two heavy chains and two light chains, linked by disulfide bridges. Each chain consists of a variable region and a constant region. The constant region of a particular isotype of heavy or light chain is normally identical from one antibody to another of the same isotype, except somatic mutations. In contrast, the variable region varies from one antibody to another.
  • the genes coding for the heavy and light chains of the antibodies are generated by recombination of respectively three and two distinct gene segments called VH, DH and JH-CH for the heavy chain and VL and JL-CL for the light chain.
  • the CH and CL segments do not participate in the recombination and form the constant regions of the heavy and light chains respectively.
  • the recombinations of the VH-DH-JH and VL-JL segments form the variable regions of the heavy and light chains, respectively.
  • the VH and VL regions have 3 hyper-variable areas or complementarity determining regions (CDRs), called CDR1, CDR2 and CDR3, the CDR3 region being the most variable, since it is located at the recombination zone.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDR1, CDR2 and CDR3 regions are each preceded by the FR1, FR2 and FR3 regions respectively, corresponding to the framework regions (FR region framework) which vary at least from one VH or VL segment to another.
  • the CDR3 region is also followed by an FR4 framework region.
  • the CDRs of an antibody are defined from the amino acid sequence of its heavy and light chains with respect to criteria known to those skilled in the art.
  • Various methods for determining CDRs have been proposed, and the portion of the amino acid sequence of a heavy or light chain variable region of an antibody defined as a CDR varies depending on the method chosen.
  • the first one The method of determination is that proposed by Kabat et al (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions).
  • CDRs are defined by looking for the amino acids responsible for antigen binding of the antibody.
  • a 2nd method was proposed by IMGT, this time based on the determination of the hypervariable regions.
  • Table 2 summarizes the amino acid sequences of the CDRs and variable regions of the heavy and light chains of the anti-Gb3 antibodies generated by the inventors:
  • Variable Region SEQ ID NO 43 Variable Region SEQ ID NO 47
  • Variable Region SEQ ID NO 50 Variable Region SEQ ID NO 54
  • Variable Region SEQ ID NO 44 Variable Region SEQ ID NO 48
  • Variable Region SEQ ID NO 51 Variable Region SEQ ID NO 55
  • Variable Region SEQ ID NO 45 Variable Region SEQ ID NO 49
  • Variable Region SEQ ID NO 52 Variable Region SEQ ID NO 56
  • SEQ ID NO 53 variable region By “functional fragment” is meant an antibody fragment retaining the antigen-binding domain and therefore having the same antigenic specificity as the original antibody, such as Fv, ScFv, Fab, F (ab fragments). ') 2, Fab', scFv-Fc or di-antibodies ("diabodies").
  • derivative of an antibody is meant a binding protein formed of a carrier peptide and at least one of the CDRs of the original antibody to preserve its ability to recognize Gb3.
  • the antibodies, functional fragments or derivatives according to the invention can be obtained by genetic recombination or by chemical synthesis, according to technologies well known to those skilled in the art.
  • the antibody according to the invention is a monoclonal antibody.
  • monoclonal is meant an antibody obtained from a substantially homogeneous antibody population, i.e. the antibodies forming this population are essentially identical except for possible natural mutations that may be present in minor quantities. These antibodies are directed against a single epitope and are therefore very specific.
  • epitope is meant the site of the antigen to which the antibody binds. Regardless of the antigen, an epitope is a three-dimensional region formed by portions of the antigen that may or may not be adjacent in a linear, non-dimensional structure of the antigen.
  • the antibodies, functional fragments or derivatives are of course not in a natural form, but isolated, obtained by purification from a natural source, by genetic recombination or by chemical synthesis.
  • the "percent identity" between two nucleic acid or amino acid sequences means the percentage of identical nucleotides or amino acids between the two compared sequences, obtained after optimal alignment of the two sequences. . This percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are distributed randomly over their entire length.
  • the comparison of two nucleic acid or amino acid sequences is generally performed after optimally aligning them, the comparison being possible by segment or using an "alignment window".
  • the optimal sequence alignment can be achieved using different software well known to those skilled in the art, including BLAST NR (nucleic acid) or BLAST P (protein) software.
  • the percentage identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences, in which the compared nucleic acid or amino acid sequence may have deletions or insertions by compared to the reference sequence.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which the nucleotide or amino acid is identical between the two sequences, preferably between the two complete sequences, and dividing it by the total number of positions in the window. alignment (preferably the complete sequences) and multiplying the result by 100. This percentage of identity can be calculated easily using for example the BLAST software with default parameters.
  • the CDR or the variable region of an antibody according to the invention has an amino acid sequence which is not 100% identical to one of those described above and in the sequence listing (reference sequences ) but which has at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with at least such a reference sequence, it may have insertions, deletions or substitutions with respect to the reference sequence.
  • the substitution is preferably carried out by an "equivalent" amino acid, that is to say any amino acid whose structure is close to that of the original amino acid and is therefore unlikely to alter the biological activities of the antibody. Examples of such substitutions are shown in the following Table 3:
  • Gb3 is represented by immunolabeling with a doublet corresponding to the presence of 2 different fatty acid chains at the ceramide level. Porcine cells also express two forms of Gb3, represented by a doublet.
  • the 3E2 antibody recognizes both forms of Gb3 of the porcine doublet, as well as the upper band, but not the lower band, of the doublet expressed by HMEC-1 cells.
  • the 22F6 antibody also recognizes this upper band of the Gb3 doublet expressed by the HMEC-1 cells and should therefore be particularly specific for proliferating endothelial cells, as well as any antibody having the same CDR1, CDR2 and CDR3 or the same variable regions. .
  • the antibody, functional fragment or derivative according to the invention is the antibody 3E2 or 22F6 as defined above by the sequences of the variable regions of their heavy and light chains, advantageously the 3E2 antibody, or an antibody of the same antigenic specificity.
  • the antibody, functional fragment or derivative according to the invention may have at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence chosen from SEQ ID NO: 1 to 6 and 19 to 24, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 1 to 6 and 19 to 24.
  • CDR complementarity determining region
  • the antibody, functional fragment or derivative according to the invention may have a heavy chain comprising at least one complementarity determining region ( CDR) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 3, and 19 to 21, or having an amino acid sequence of at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO: 1 to 3, and 19 to 21 and / or has a light chain comprising at least one complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 4 to 6, and 22 to 24, or having an amino acid sequence having at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with one of SEQ ID NO 4 to 6, and 22 to 24.
  • CDR complementarity determining region
  • CDR-H heavy chain comprising three CDR-H (heavy chain CDRs) having the following amino acid sequences, or sequences having at least 80%), preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the following sequences: a) CDR1-H-3E2: SEQ ID NO: 1, CDR2-H-3E2: SEQ ID NO: 2, b) CDR1-H-22F6: SEQ ID NO: 19, CDR2-H-22F6: SEQ ID NO: 20, CDR3-H-22F6: SEQ ID NO: 21,
  • CDR-L light chain CDR
  • amino acid sequences or sequences having at least 80%, preferably at least 85%,> 90%, at least minus 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the following sequences:
  • CDR1-L-3E2 SEQ ID NO: 4
  • CDR2-L-3E2 SEQ ID NO: 5
  • CDR3-L-3E2 SEQ ID NO: 6
  • CDR3-L-22F6 SEQ ID NO: 24.
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention can have:
  • a heavy chain comprising a variable region having a sequence selected from SEQ ID NO: 43 and 46 or a sequence having at least
  • a light chain comprising a variable region having a sequence selected from SEQ ID NO: 50 and 53 or a sequence having at least
  • the anti-Gb3 antibody, functional fragment or derivative according to the invention can be chosen in particular from the anti-Gb3 monoclonal antibodies generated by the inventors or variants thereof, which possess chains.
  • heavy and light whose variable regions have the following amino acid sequences or sequences having at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97% , at least 98%), at least 99% identity with the following sequences: a) Antibody 3E2: heavy chain: SEQ ID NO: 43, light chain: SEQ ID NO: 50, and
  • 22F6 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 46, light chain:
  • the most advantageous isotypes are the IgG isotypes, in particular IgG1, and IgM, more particularly the IgM isotype, which has the highest molecular weight. Therefore, any antibody according to the invention is preferably of IgG or IgM isotype, preferably IgM.
  • any antibody, functional fragment or derivative according to the invention may advantageously be chimeric or humanized. Indeed, this makes it possible to avoid the immune reactions of the patient against the administered antibody.
  • the antibody according to the invention may advantageously be any of the chimeric or humanized versions of the antibodies 3E2, 14C1 1, 15C11, 22F6, 25C10, 11E10, and 16G8 described above, advantageously 3E2 and 22F6 antibodies. , and in particular of the antibody 3E2.
  • chimeric antibody an antibody which contains a naturally occurring variable (light chain and heavy chain) derived from an antibody of a given species in association with the constant light chain and heavy chain regions of an antibody of a heterologous species to said given species.
  • the chimeric type antibodies according to the invention can be prepared using genetic recombination techniques.
  • the chimeric antibody may be made by cloning a recombinant DNA comprising a promoter and a sequence coding for the variable region of a non-human monoclonal antibody, in particular murine monoclonal antibody, according to the invention and a sequence coding for the constant region. human antibody.
  • a chimeric antibody of the invention encoded by such a recombinant gene will for example be a mouse-human chimera, the specificity of this antibody being determined by the variable region derived from murine DNA and its isotype determined by the constant region derived from the murine DNA. Human DNA. This will notably be the case for the chimeric antibodies obtained from the murine monoclonal antibodies 3E2, 14C11, 15C11, 22F6, 25C10, 11E10, and 16G8 described in the present description. For methods of preparing antibodies For example, it is possible to refer to Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74, 1988).
  • humanized antibody is meant an antibody which contains CDRs regions derived from an antibody of non-human origin, the other parts of the antibody molecule being derived from one (or more) human antibodies.
  • some of the skeletal segment residues (referred to as FR) may be modified to maintain binding affinity (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986, Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 1988, Riechmann et al., Nature 332: 323-327, 1988).
  • the humanized antibodies according to the invention may be prepared by techniques known to those skilled in the art such as “CDR grafting", “resurfacing”, Superhumanization, "Human string content", “FR libraries” technologies. ",” Guided Selection ",” FR shuffling “and” Humaneering "as summarized in the review by Almagro et al.
  • the anti-Gb3 antibody, or functional fragment or derivative thereof according to the invention may also have been optimized for certain effector functions.
  • it may include mutations increasing its affinity for the Fc receptor to which its isotype binds. It can also be produced under specific conditions (cells, medium, etc.) to obtain a particular glycosylation of the antibody.
  • certain substitutions of the Fc ⁇ portion and low or no fucosylation make it possible to increase the affinity for the Fc ⁇ RIII receptor (see in particular Shields et al., Journal of Biological Chemistry, Vol 276, No. 9 , Issue of March 2, pp. 6591-6604, 2001, EP1176195A1, EP1331266A1, WO 01/77181).
  • the antibody can also, especially when it is an IgG isotype and in particular an IgG1 isotype, have been modified to limit its ability to fix the complement and therefore its activity of complement-dependent cytotoxicity (CDC), while preserving its antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) functions.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • an anti-GD2 antibody it has been shown that a point mutation in the constant part of the human IgG1 region (replacement of the lysine at position 322 of the human Fc constant part of the light chain ⁇ by alanine) allowed to reduce its complement fixation while maintaining its ADCC properties, and to reduce some side effects associated with the administration of this antibody (US7432357B2).
  • the anti-Gb3 antibody according to the invention is an antibody with a low CDC activity, that is to say that in a CDC activity test in vitro, the CDC activity of the antibody at a concentration of 0, 1 ⁇ g / ml is not significantly different from that of the control without antibodies.
  • an advantageous embodiment relates to a humanized anti-Gb3 IgG1 isotype antibody, comprising an ⁇ isotype light chain, in which the lysine at position 322 of the human Fc constant part of the ⁇ light chain is replaced by an alanine or an equivalent amino acid, preferably an alanine.
  • the invention also relates to a nucleic acid (also called nucleic or nucleotide sequence) coding for any of the anti-Gb3 antibodies, or functional fragments or derivatives according to the invention as described above.
  • nucleic acid also called nucleic or nucleotide sequence
  • All the different nucleic sequences, because of the degeneracy of the genetic code, encoding a particular amino acid sequence are within the scope of the invention.
  • Such nucleic sequences may have been optimized to promote its expression in a host cell of interest.
  • Particular sequences of interest are those of the variable regions of the heavy and light chains of the antibodies generated by the inventors, represented as follows:
  • Antibody 3E2 heavy chain: SEQ ID NO: 57, light chain: SEQ ID NO: 64,
  • 14C11 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 58, light chain: SEQ ID NO: X65
  • 15C11 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 59, light chain: SEQ ID NO: 66,
  • Antibody heavy chain: SEQ ID NO: 61 light chain: SEQ ID NO: 68,
  • 11E10 antibody heavy chain: SEQ ID NO: 62, light chain: SEQ ID NO: 69,
  • the invention also relates to a vector comprising at least one of the nucleic sequences described above.
  • a vector comprises the elements necessary for the expression of said nucleic sequence, and in particular a promoter, a transcription initiation codon, termination sequences, and appropriate transcriptional regulatory sequences. These elements vary according to the host serving for the expression and are readily selected by those skilled in the art in view of his general knowledge.
  • the vector may especially be plasmidic or viral. It is used to clone or express the nucleic sequences according to the invention.
  • the invention also relates to a host cell comprising one or more nucleic sequences or one or more vectors according to the invention.
  • the host cell may be of procary or eukaryotic origin, and may especially be selected from bacterial cells, insect cells, plants, yeast or mammals.
  • the antibody, functional fragment or derivative according to the invention can then be produced by culturing the host cell under appropriate conditions. It can also be obtained by chemical synthesis, in particular in the solid or semi-solid phase.
  • the antibodies, functional fragments or derivatives according to the invention have anti-angiogenic properties as such.
  • they exhibit cytostatic and cytotoxic activity on proliferating endothelial cells. They can therefore be used alone in the treatment of diseases associated with angiogenesis, as defined below.
  • the antibodies according to the invention described above are not coupled to a therapeutic molecule, in particular a cytotoxic, cytostatic or anti-angiogenic molecule such as a toxin, in particular an angiogenesis-inhibiting toxin.
  • an antibody is "coupled" to a molecule if there is a covalent bond between the antibody and the molecule.
  • the fact that the antibody according to the invention is not coupled to a therapeutic molecule means that it is not bound by a covalent bond to such a molecule.
  • this does not prevent the antibody, which is not coupled to a therapeutic molecule, from being administered in combination (simultaneously or sequentially) with another therapeutic molecule, including a cytotoxic, cytostatic or anti-angiogenic molecule in the case of tumors.
  • the two molecules can act independently of one another.
  • the anti-Gb3 antibodies, or functional fragments or derivatives thereof according to the invention as described above can nevertheless also be coupled to another therapeutic molecule.
  • the present invention also relates to an antibody, directed against the Gb3 membrane glycosphingolipid and not coupled to a therapeutic molecule, for its use as a medicament in the treatment of angiogenesis-associated diseases. It also relates to the use of an antibody directed against the Gb3 membrane glycosphingolipid and not coupled to a therapeutic molecule, for the preparation of a medicament for the treatment of diseases associated with angiogenesis. It also relates to a method of treating angiogenesis-associated diseases in a subject in need, comprising administering an effective amount of an antibody directed against Gb3 membrane glycosphingolipid and not coupled to a therapeutic molecule. It also relates to a method for inhibiting angiogenesis in a subject in need, comprising administering an effective amount of an antibody directed against Gb3 membrane glycosphingolipid and not coupled to a therapeutic molecule.
  • diseases associated with angiogenesis any disease whose evolution requires angiogenesis to develop, that is to say the formation of new vessels from a pre-existing vascular network.
  • diseases associated with angiogenesis include solid tumors; psoriasis; angiomas; prominent eye diseases, including age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, or neovascular glaucoma; autoimmune diseases, including lupus or rheumatoid arthritis, as well as atherosclerosis-related diseases; obesity or Alzheimer's disease. Indeed, the development of all these diseases involves angiogenesis.
  • blood cell diseases such as leukemias or lymphomas
  • cytotoxic, cytostatic or anti-angiogenic is used in the treatment of solid tumors.
  • Solid tumors for which anti-Gb3 antibodies are useful include adenomas, sarcomas, and carcinomas; and in particular adenocarcinomas, ovarian, breast, pancreatic, skin, lung, brain, kidney, liver, nasopharyngeal cavity, thyroid, central nervous system (neuroblastoma by example), prostate, colon, rectum, cervix, testes, or bladder.
  • the anti-Gb3 antibody used is any of those described above in the section concerning the antibodies as such.
  • the anti-Gb3 antibody recognizes the upper band but not the lower band of the Gb3 doublet expressed by HMEC-1 cells.
  • it may be antibodies 22F6 and 3E2, or an antibody possessing at least one CDR or all the CDRs, or even one and / or the other of the variable regions of these antibodies.
  • the anti-Gb3 antibody may be administered in combination with another treatment, including surgical resection of the tumor, radiotherapy treatment or chemotherapy with another therapeutic molecule, provided that another therapeutic molecule is not coupled to the antibody.
  • the treatment radiotherapy / radiotherapy / other therapeutic molecule
  • the combination may also be administered first (simultaneously or sequentially) and then the treatment continued with only one of the two therapies.
  • a therapeutic molecule is not coupled to the antibody, it can be selected from all other anticancer molecules, whether they also target angiogenesis or the tumor itself.
  • FIG. 1 HPTLC profiles of growth phase (lane 1) or confluent (track 2) HMEC-1 cells, rat brain ganglioside markers (lane 3) and standard neutral glycolipids (lane 4).
  • B HPTLC profiles of HMEC-1 cells incubated in depleted (lane 1) or complete (lane 2) culture media, ganglioside markers of rat brain (lane 3), and a mixture of standard neutral glycosphingolipids (lane 4).
  • C HPTLC profiles of HMEC-1 cells treated with PET (lane 1) or S1P (lane 2), rat brain ganglioside markers (lane 3), and standard neutral glycolipids (lane 4).
  • the migration solvent used is C / M / H 2 O, 0.2% CaCl 2 , 55: 45: 10 v / v / v. All bands are revealed by orcinol.
  • FIG. 1 Protocol for obtaining antibodies against HMVEC-L endothelial cells cultured in the presence of T84 human adenocarcinoma cells.
  • Figure 3 Principle of 96-well microplate limiting dilution cloning.
  • Panel B represents the theoretical number of cells remaining after dilution.
  • FIG. 1 Electrophoretic analysis of IgM 3E2 mAb on a 6% polyacrylamide gel under non-reducing conditions (A) on a 12% polyacrylamide gel under reducing conditions (B).
  • FIG. 1 Analysis of flow cytometric labeling of HMEC-1, Raji and NXS2 cells with purified anti-Gb3 monoclonal antibodies 3E2.
  • C A
  • 25C 10.a B
  • 16G8.h C
  • ld D
  • 15C7.2e E
  • All cells were labeled with 10 ⁇ g / ml of antibody. Percentages of positive cells are noted in the panel figures A, B, C, D, E and F.
  • FIG. 6 Study of the Specificity of the 3E2 Antibody by ELIS A (Panel A) Fixation of the 3E2 Antibody Measured by ELISA on Raji Cells, HMEC-1 Cells and IMR32 Cells (Panel B) Attachment of the 3E2 antibody and the 38.13 anti-Gb3 rat monoclonal antibody to the HMEC-1 cells measured by ELISA. The initial concentration of the antibodies is equal to 10 ⁇ g / ml (3 independent analyzes).
  • Figure 7. Immunostaining on HPTLC of HMEC-1 cells with mAb 3E2, mAb 3, 8, and supernatant of uncleaved hybridoma 3E2.
  • FIG 8. Immunostaining on HPTLC of HMEC-1 cells by mouse mAbs 3E2 and A4.
  • Rat brain ganglioside markers (lane M), neutral glycolipid mixture (lane 1), purified porcine Gb3 (lane 2) and glycolipid extracts of HMEC-1 cells (lane 3).
  • the lines are chemically revealed by orcinol.
  • Patent B Immunostaining is performed with 5 ⁇ g / ml of MAb 3E2 or 1 A4.
  • Figure 9 Analysis of the specificity of the antibody 3E2 by flow cytometry on HMEC-1, Raji and NXS2 cells. Expression of Gb3 on HMEC-1, Raji and NXS2 cells by flow cytometry with 10 ⁇ g / ml mAb 3E2 (A), 1A4 (B) and IgM isotype control, ⁇ (C). Percentages of positive cells are noted in Table 10.
  • FIG. 10 HPTLC glycolipid profile revealed in orcinol of HMEC-1 (4), Raji (5), NXS2 (6) and T84 (7) cells.
  • FIG. 11 Expression of Gb3 on HMEC-1, HMVEC-L and HUVEC cells by flow cytometry with 10 ⁇ g / ml mAb 3E2 (A), 1 A4 (B) and isotypic IgM control, ⁇ (C) . Percentages of positive cells are noted in FIG. 11 and the fluorescence intensity average values are listed in Table 11.
  • Figure 13 Nucleotide sequences of the variable regions of the V H (panel A) and V L (panel B) gene segments of the 3E2 antibody.
  • Figure 14 Flow cytometric analysis of Gb3 expression of HMEC-1 cells incubated for 24 h in depleted media (MA) and in complete medium (MC). Fixation was measured using mAb 3E2 (Panel A) and mAb 1 A4 (Panel B). The percentage of positive cells and the fluorescence intensity average values are listed in Table 14 (3 independent experiments).
  • FIG. 15 Flow cytometric analysis of Gb3 expression of HMEC-1 cells incubated in depleted media supplemented with S ⁇ SIP or PET. Fixation was measured using mAb 3E2 at 24 h (Panel A) and 72 h (Panel B). The percentage of positive cells and the average fluorescence intensity values are listed in Table 15 (3 independent experiments).
  • Figure 16 Cell viability of HMEC-1, Raji and NXS2 cells measured by MTT after 24 h incubation of mAb 3E2 and 1A4. Cell viability of HMEC-1 cells in the presence of mAb 3E2 and A4 (Panel A) and Raji and NXS2 cells in the presence of ⁇ mAb 3E2 (panel B), 3 independent experiments.
  • Figure 18 Representation of the number of HMEC-1 cells as a function of the incubation time of the mAb 3E2 at 20 ⁇ .
  • Figure 19 Percentage of HMEC-1 cells in division and estimation of their cell division time in the presence of the antibody 3E2.
  • (Panel A) Microvessels in development from transverse sections of murine aortic rings. Photo 1, growth of microvessels at implantation of aortic sections (J0). Photo 2, microvessel growth after five days after incubation in complete culture medium. Photos 3 and 4, aortic rings treated with respectively 20 ⁇ g / ml and 40 ⁇ g / ml of mAb 3E2.
  • Figure 21 Evaluation of the CDC activity of mAb 3E2 and 1A4. Specific lysis of the cells was determined by flow cytometry by measuring the percentage of cells having incorporated propidium iodide. The CDC activity is measured in the presence of decomplemented human serum (') or not decomplemented (c').
  • CDC activity performed on HMEC-1 cells,
  • Panel B Raji cells and
  • Panel C on NXS2 cells.
  • Figure 22 Nucleotide sequences of the variable regions of the heavy chain of 7 anti-Gb3 antibodies.
  • Figure 23 Nucleotide sequences of the variable regions of the anti-Gb3 antibody light chain.
  • FIG. 24 Reduction of the growth of a subcutaneous tumor by the 3E2 antibody.
  • Female AI mice were inoculated subcutaneously in the right flank with 10 6 NXS2 cells (neuroblastoma line) alive (viability> 95%) resuspended in 150 ⁇ l of PBS.
  • the tumors reached a volume V of 100-150 mm 3
  • the mice received a single injection of 3E2 antibody directed against the upper band of the doublet Gb3 expressed by the HMEC-1 cells, anti-GD2 14G2a antibody, IgM isotype control antibody or PBS alone.
  • the graph represents the tumor volume, expressed as a percentage of the tumor volume during the injection of the treatment, as a function of the duration after treatment.
  • FIG. 25 The 3E2 antibody inhibits the growth of metastases in vivo.
  • A Representative photograph of mouse livers at day 28 after intravenous injection of NXS2 cells. The scale bars represent 1 cm.
  • Endothelial cells HMVEC-L, HMEC-1, HUVEC.
  • HMVEC-L cells are primary human microvascular endothelial cells from lungs (Cambrex, Clonetics ®, USA). Each ampoule corresponds to a single Caucasian donor. They were seeded at a density of 5 10 4 cells / cm 2 in 6-well plates, then cultured in a humid atmosphere enriched with C0 2 at 37 ° C in the middle of specific EGM -2 ® MV Culture (Cambrex, USA) having 25 ml of FCS (fetal calf serum), 0.2 ml of hydrocortisone, 2 ml of hFGF-B, 0.5 ml of VEGF, 0.5 ml of R3-IGF-1, 0.5 ml of ascorbic acid, 0.5 ml of hEGF and 0.5 ml of GA-1000, per 500 ml of medium.
  • FCS fetal calf serum
  • hydrocortisone 2 ml of hFGF-B
  • VEGF 0.5 m
  • the line FDVIEC-1 human microvascular endothelial cells
  • Pr. FJ Candal Center for Disease Control, Atlanta, Ades et al., 1992
  • a plasmid containing the coding region of the SV40 virus T antigen retain the main characteristics specific to microvascular endothelial cells (Ades et al., 1992) and are cultured between passages 13 and 20 in order to limit phenotypic drift related to cell culture.
  • HUVEC cells are human macrovascular primary cells extracted from umbilical cord veins (Cambrex). Each ampoule corresponds to several donors. They are seeded at a density of 3.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in 6-well plates and then cultured in a humid atmosphere.
  • EGM -2 enriched in C0 2 at 37 ° C in the specific culture medium EGM -2 (Cambrex, USA) according to: 10 ml of FCS, 0.2 ml of hydrocortisone, 2 ml of hFGF-B, 0.5 ml of VEGF, 0.5 ml of R3-IGF-1, 0.5 ml of ascorbic acid, 0.5 ml of hEGF, 0.5 ml of GA-1000 and 0.5 ml of heparin, per 500 ml of middle. They can be grown from the first to the sixth pass.
  • Tumor lines Raji, NXS2, IMR32 and T84.
  • the Raji human lymphoma cells and the IMR32 human neuroblastoma cell line are from ATCC (Rockville, USA).
  • the NXS2 cells of murine neuroblastoma were provided by Prof. H. Lode (Charity Children's Hospital, Berlin, Germany).
  • the Raji cells are inoculated at 0.1 ⁇ 10 6 cells / ml in RPMI 1640 medium (Invitrogen) supplemented with 10% inactivated FCS, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml. streptomycin.
  • the IMR32 cells are cultured in the same medium but are inoculated at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the NXS2 cells inoculated at a rate of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2, are maintained in DMEM medium containing 4.5 g / l of glucose (Sigma), 10% of inactivated SVF, 2 mM of L-glutamine, 100 IU / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the T84 epithelial cells of a human colon adenocarcinoma were provided by Dr. M. Neunlist (INSERM UMR913, France).
  • Gb3 was rationally given to us as ascites by Dr. J. Wiels (Institut Gustave Roussy, Villejuif, France). It was purified by affinity chromatography using a mannan column (Pierce, Rockford, USA) and conditioned at 4 ° C in PBS.
  • the 38.13 anti-Gb3 rat IgM monoclonal antibody and isotype control of mice (clone 11E10) were obtained in purified form from Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA).
  • Biotinylated secondary goat antibodies such as mouse anti-IgG + IgM (H + L) antibodies, mouse anti-IgG (H + L) antibodies, mouse anti-mouse antibodies were provided by Jackson Immunoresearch (Laboratories, Westgrove, PA, USA).
  • Peroxidase-coupled goat antibodies specific for the rat ⁇ chain and biotinylated goat secondary antibodies specific for mouse subclasses Fc Y i, Fc Y 2a, Fc Y 2b, Fc Y 3
  • Biotinylated goat antibodies specific for mouse light ( ⁇ and ⁇ ) chains were provided by Southernbiotech (Birmingham, AL, USA).
  • the streptavidin-R-phycoerythrin complex was obtained from Biosource (Camarillo, CA, USA), the streptavidin-horseradish-peroxidase complex and the streptavidin-FITC complex were obtained from Beckman Coulter.
  • the mixture of neutral glycosphingolipids comprising lactosylceramide (LacCer), galactosylceramide (GalCer), ceramide trihexoside (Gb3) and globoside (Gb4) as well as purified Gb3 were obtained from Matreya (Pleasant Gap, PA, USA). These glycolipids are either of porcine origin (Gb3 and Gb4) or of bovine origin (LacCer and GalCer).
  • the purified Gb3 was redissolved with 1 ml of a chloroform: methanol (2: 1 v / v) mixture so as to obtain a final concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l.
  • Sphingosine-1-phosphate S1P was obtained from Biomol International (Plymouth Meeting, PA, USA) and rehydrated (Morita et al., 2000) in order to obtain a concentration of 10 ⁇ in the PET diluent consisting of 5% of polyethylene glycol, 2.5% ethanol and 0.8% Tween-80.
  • the mixture of gangliosides markers standards (GMi, GDi has GDi, GTi b) was prepared in the laboratory by extraction of rat brain gangliosides, according to the technique described by Folch (Folch et al. 1951). 1.2. Extraction and purification of glycolipids.
  • the glycolipids were extracted from cell pellets according to the method of S. Ladish (Ladish and Li, 2000). The cells are trypsinized, washed twice in PBS pH 7.3 and then incubated at -20 ° C. overnight. They then undergo hypotonic lysis in 1 ml of distilled water. Aliquots are then removed and centrifuged at 15,000 g, 4 ° C, for 15 min to remove insoluble particles, debris cell and DNA. The protein concentration of the aliquots is then determined by absorbance at 280 nm (Nanodrop ND-1000, Labtech, Palaiseau, France) in order to deposit on a thin layer of silica a quantity of glycolipids corresponding to 0.5 - 2.5 mg of protein equivalent per sample.
  • DIPE / 1-butanol partition The total lipid extract is redissolved in 5 ml of an organic mixture containing DIPE / 1-butanol (60:40, v / v). Series of vortex and sonication (Diagenode's Bioruptor, Sparta, USA) are alternated and repeated until an opalescent solution is obtained. By adding and mixing 2.5 ml of 0.1% NaCl saline, a partition is obtained after centrifugation at 750 g for 10 min at 4 ° C. The upper organic phase containing neutral lipids and phospholipids is pipetted and can be stored at -20 ° C.
  • the lower aqueous phase and the interface containing the acidic glycolipids and the more hydrophilic neutral glycolipids are again partitioned with a new volume of DIPE / 1-butanol (60:40, v / v).
  • the glycolipids contained in the aqueous phase are evaporated in a speed-vac (Eppendorf, Hamburg, Germany).
  • Second step desalting by gel filtration. In order to remove salts and contaminants such as proteins that can be co-extracted at this stage, the dry residues are redissolved and vortexed in 500 ⁇ of solvent A (chloroform: methanol: H 2 O (30: 60: 8).
  • glycolipids recovered are taken up in a small volume of chloroform: methanol (1: 2, v / v) so as to deposit, with the aid of a TLC ATS4 deposition automaton (Camag, Muttenz, Switzerland) 2 to 2, 5 mg of protein equivalent per glycolipid sample.
  • the glycolipids are separated on HPTLC plates consisting of a silica gel 60 covering an aluminum foil (Merck, Darmstadt, Germany). Before deposition, these silica plates are subjected to a first migration in a glass vessel (Camag) containing a mixture of chloroform: methanol (1: 1, v / v), in order to rid them of possible contaminants.
  • a first migration system consisting of chloroform: methanol solvent (2: 1, v / v) makes it possible to migrate and eliminate very apolar lipids which can be coextracted and which can interfere with the separation of glycolipids of interest.
  • the latter are then separated during a final development in a saturated tank for 4 h with 70 ml of chloroform: methanol: 0.2% aqueous CaCl 2 (55: 45: 10, v / v / v).
  • the strips are chemically exposed at 150 ° C. after spraying the plate with a solution of orcinol previously prepared by dissolving 0.2 g of orcinol (Sigma-Al drich, St. Louis, USA) in 40 ml of water.
  • glycolipids can then be quantified by ImageQuant 5 ' 2 densitometry software (GE Healthcare, Waukesha, USA).
  • the specificity of the antibodies can be determined on glycolipids separated by HPTLC. After separation by chromatography of glycolipids for which 2 to 2.5 mg of protein equivalent per sample is exposed to orcinol and 0.5 mg of protein equivalent for the samples which will be labeled by the antibodies, the HPTLC plates are cut into strips and plasticized by incubation for 1 min in 0.1% polyisobutyl methacrylate dissolved in hexane, then saturated at room temperature for 1 hour with 1% PBS-BSA. The strips are then incubated overnight at 4 ° C. with the antibodies (either directly incubated with the hybridoma supernatants or incubated with 5 ⁇ g / ml of purified antibody diluted in 0.1% PBS-BSA).
  • the antibody binding is detected by two successive incubation steps, a first incubation step of 1 h at room temperature of the biotinylated secondary antibodies (diluted 1: 2000 in PBS). 0.1% BSA), followed by incubation of the streptavidin-horseradish-peroxidase complex, diluted 1: 2000 for 1 hour at room temperature.
  • the bound peroxidase is revealed by a solution of 4-chloro-1-naphthol (Sigma) which is prepared extemporaneously at the rate of 1 mg of product dissolved in 1 ml of methanol, taken up in 20 ml of PBS. and added 30 ⁇ of hydrogen peroxide 30 volumes. 1.5. Analysis of antibody specificity by enzyme immunoassay
  • the desiccated cell plates were prepared in the following manner. The cells are trypsinized and washed three times with cold PBS, and then diluted to obtain a cell concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml. Is then deposited 50 ⁇ of this suspension to the bottom of each of the 96 wells of a microtiter plate Immuno-Plate (Nunc, Maxisorp ®, Denmark). After desiccation of the cells overnight in an oven at 37 ° C, the plates are either used immediately or stored at room temperature for several months under aluminum.
  • the antibodies diluted in 0.1% PBS-BSA (10 ⁇ g / ml of initial concentration) are deposited in each of the triplicate wells, with a volume of 100 ⁇ of antibody in a dilution range of 1: 256.
  • the plates are incubated for 2 hours at room temperature and then washed. three times with PBS.
  • the binding of the antibody is detected successively by a first incubation for 1 h at room temperature with the biotinylated secondary antibodies (diluted 1: 4000 in PBS-BSA 0.1%), then after washing, by incubation.
  • streptavidin-horseradish-peroxidase complex (diluted 1: 4000, 1 hr at room temperature). After several washes with PBS, the fixation of the peroxidase is revealed by a solution of ABTS (Merck) which reveals a progressive green coloration. The reaction can then be blocked by the addition of 10% SDS. The measurement of the optical density is determined by reading the plate with a spectrophotometer at 405 nm (Multiskan Thermo Electron reader, Illkirch, France).
  • the cells are then directly incubated with 100 ⁇ l of primary antibodies diluted to 10 ⁇ g / ml in PBSF for 45 minutes on ice. After incubation, the cells are washed 3 times with cold PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde (Electron Microscopy Science, Washington, USA) in PB S, on ice for 15 minutes, in order to prevent the internalization of the cells. antigen-antibody complexes. After three weeks at PB S, antibody fixation is first detected by incubation for 30 minutes on ice of biotinylated secondary antibodies (diluted 1: 400 in PBSF) followed by washes and then incubation. streptavidin-phycoerythrin complex (diluted 1: 400, 30 minutes on ice).
  • the cells are seeded in their culture medium on glass slides 14 mm in diameter (Thermo Scientific, Hudson, USA) in a 24-well plate, 24 to 48 hours before labeling, at a rate of 2 ⁇ 10 5 cells. / cm 2 .
  • the non-specific sites are blocked by incubating 5% inactivated human serum on ice and then the cells are incubated with the antibodies diluted to 40 ⁇ g / ml in PBSF for 45 minutes on ice. After labeling, the cells are washed 3 times with cold PBS and then fixed with 4% paraformaldehyde on ice for 15 minutes.
  • the cells are again washed 3 times with PBS and the binding of the antibody is detected first by a 30 minute incubation on ice of the biotinylated secondary antibodies (diluted 1: 400 in PBSF) followed by 30 minutes of ice incubation of streptavidin-FITC complex (diluted 1: 400). After staining of the cell membrane, the nuclei are labeled for 15-20 min at room temperature, Drag5 (Biostatus, Leicestershire, UK) diluted 1: 1000 in PBS.
  • the slides are assembled in Fluoromount-G medium (Southernbiotech, Birmingham, AL, USA) and the cell labeling is observed under the confocal microscope TCS-SP1 (Leica, Mannheim, Germany, PICell platform, IFR 26, Inserm, France) at a magnification of 63 X.
  • mice are raised at the animal center of the INSERM U892 unit (under the control of AFSTAL, French association of Sciences and Techniques of Laboratory Animal).
  • Raji cells and IMR32 cells (2.5 ⁇ 10 5 cells) diluted 1: 2 in Matrigel highly concentrated in growth factors (BD Biosciences, Bedford, USA) were injected subcutaneously into the flank of mice.
  • the mice were sacrificed by elongation as soon as small blood capillaries appeared on the xenografted tumors. Directly after excision, the tumors were pre-immersed in the isopentane and then immersed for a few seconds in liquid nitrogen to be stored at -80 ° C.
  • the frozen sections are incubated successively with 50 ⁇ g / ml of antibody anti-Gb3 or mouse IgM isotype control antibody (clone 1 1E10) for 1 h at room temperature, and then incubated after several washes at PB S, with biotinylated goat anti-mouse IgM secondary antibody, diluted at 1: 100. Detection is performed using a chromogenic substrate.
  • the sections are incubated for 30 minutes with VECTASTAIN ® Elite ABC reagent (Vector Laboratories). The peroxidase activity is detected with the DAB ® Menarini Kit substrate (Rungis, France) diluted 1:50, resulting in the deposition of a brown pigment.
  • the sections are then counter-stained with hematoxylin and observed at 40X magnification with a DM IRB (Leica) microscope. 1.9. Obtaining anti-Gb3 antibody 3E2 (IgM.
  • HMVEC-L cells Five Balb / c @ BYJ Rj mice, 6 weeks old, were immunized with HMVEC-L cells previously co-cultured with T84 human colonic adenocarcinoma cells via membranes allowing the exchange of soluble factors between the cells. two cell compartments (Gaugler et al., 2007). HMVEC-L cells were seeded in 6-well plates in an amount of 5 10 4 cells / cm 2 in their culture medium EGM -2 ® MV.
  • the T84 cells (1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 ) were seeded in their DMEM: F 12 culture medium, on the porous membrane filter (pores of 0, 4 mm) of a Transwell 6-well Transwell-Clear insert (Corning, The Netherlands) for 72 hours.
  • FDVIVEC-L cells were then trypsinized, washed in PBS, fixed with 4% paraformaldehyde and stored at 4 ° C in incomplete Freund's adjuvant (Sigma, St. Louis, USA).
  • mice were injected intraperitoneally with five injections at 0, 8, 10, 32, and 60 weeks of 2, 1-2.8 10 6 HMVEC-L cells previously co-cultured, as well as one dose. at 65 weeks of 1.5 ⁇ 10 6 cells (stored in PBS without adjuvant), 6 days before sacrifice.
  • the kinetics of the humoral response of the mice was analyzed during the immunization period by ELISA tests carried out on desiccated HMVEC-L cells but also on desiccated HMEC-1 cells in order to envisage the use of these transformed cells. for antibody screening studies.
  • mouse splenocytes were fused to SP2 / 0 murine myeloma cells at a 5/1 fusion ratio: 2.5 splenocytes were fused with polyethylene glycol (PEG 1500, Sigma) at 0.5 ⁇ 10 8 murine myeloma cells SP2 / 0 (cultured in RPMI 1640).
  • the cells were taken up in 200 ml of RPMI 1640 medium supplemented with 20% inactivated SVF, 2 mM L-glutamine, hypoxanthine-aminopterin-thymidine HAT IX medium (Sigma-Aldrich) and inoculated at 100 ⁇ into 35 microplates of 96 wells. After 15 days, the first hybridomas were visible and could be amplified in 12 well microplates in RPMI 1640 medium supplemented with 20% inactivated serum, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • the selected hybridomas were cloned by the limiting dilution method (Fig. 3). Each clone obtained was then tested again by ELISA using the anti-IgG + IgM detection antibodies, then the isotype of the positive monoclonal antibodies was determined using anti-isotype detection antibodies ( ⁇ , ⁇ , y2a). , y2b and ⁇ 3) and anti-light chain ( ⁇ and ⁇ ).
  • the eluates are selected after measurement of the absorbance at 280 nm (Nanodrop) and pooled to be dialysed in PBS, filtered through 0.22 ⁇ and stored at 4 ° C.
  • the degree of purity of the antibodies is assessed by an electrophoretic analysis under denaturing conditions (SDS-PAGE) that is reducing with 12% acrylamide (375 mM Tris pH 8.8, SDS 0.1%, APS 0.1%, TEMED), which is non-reducing with 6% acrylamide.
  • SDS-PAGE electrophoretic analysis under denaturing conditions
  • the migration on the gel is carried out with 5 ⁇ g of antibody per condition, at 90 V for 45 h in Tris-Glycine-SDS buffer (Biorad, Hercules, USA).
  • the electrophoretic profile is detected by staining with Coomassie Blue.
  • the antibodies are first labeled with iodine 125 in the presence of an oxidant, iodogen.
  • an oxidant iodogen.
  • 200 ⁇ g of anti-Gb3 antibody 3E2 is deposited, and the tube is then supplemented with 100 ⁇ l of phosphate buffer at 0, 1M, pH 7.2.
  • Iodine 125 Perkin Elmer, Waltham, USA
  • the reaction mixture is incubated for 30 minutes with gentle stirring at room temperature.
  • the purity of the radiolabelled antibody was monitored by thin layer chromatographic analysis. For this, 2 ⁇ l of the reaction mixture were deposited on an ITLC-SG strip (PALL Science, Iris Parkway, USA). By migrating in 10% trichloroacetic acid, the free 125 I separates from 125 I bound to the antibody. It is thus possible to evaluate the level of labeled antibody which must be greater than 90% and which can be reinforced by purification on a NAP-5 TM column (GE Healthcare, Waukesha, USA) and be evaluated again by thin layer chromatography. ITLC-SG.
  • the number of Gb3 antigenic sites was determined according to the Scatchard technique, on Raji lymphoma lines and on HMEC-1 endothelial cells.
  • HMEC-1 cells the number of antigenic sites was evaluated in particular after 24 h of incubation in depleted medium (MCDB 131 medium supplemented with 0.1% decomplemented FCS, 2 mg / ml of hydrocortisone, 2 mM of L-glutamine, 100 IU / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin) and after 24 h incubation in complete medium (MCDB 131 medium supplemented with 15% FCS decomplemented, 10 ng / ml EGF, 2 mg ml of hydrocortisone, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin).
  • the tubes After centrifugation at 15,000 g for 3 minutes, the tubes are immersed in liquid nitrogen, cut into two portions and immediately placed in hemolysis tubes for radioactive counting. The lower end containing the cells constitutes the bound fraction and the upper end containing the supernatant constitutes the unbound fraction. Measurements are made at the ⁇ counter (1480 Wizard 3, Perkin Elmer, Finland) and the results are analyzed with GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). 1.11. Biological properties of the 3E2 antibody.
  • the MTT assay (Mosmann, 1983) is based on the transformation of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) into blue crystals of formazan by a mitochondrial enzyme. succinate dehydrogenase. The formazan crystals formed by the cells are solubilized chemically and detected spectrophotometrically at a wavelength of 570 nm. This test is used to compare the viability of control cells with that of cells treated with molecules.
  • the assay is performed in 24-well plates with cells seeded at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • HMEC-1 cells were seeded in a 24-well microplate at 2 ⁇ 10 5 cells / cm 2 and then maintained for 12 hours in their complete medium at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the 3E2 antibodies and the isotype control were then diluted to 20 ⁇ g / ml in complete culture medium and incubated with the cells in triplicate.
  • digital images were recorded for 24 to 72 h in order to produce an accelerated film (Leica, DMI6000B / PICell platform). Observations were on the number of cells per time interval, the rate of dividing cells per time interval, and the cell division time (mean of observations from three different wells). Tests of the aortic rings.
  • mice aged 4 weeks were provided by the Janvier breeding farm (St Berthevin, France). Abdominal aorta were isolated when the mice were 6 to 8 weeks old. They were then cleaned in complete MCDB 131 medium and cut into cross sections 0.5-1 mm wide. These rings were then deposited at the bottom of the wells of a 96-well microplate previously treated with 30 ⁇ l of Matrigel (ECM Gel, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) diluted half in PB S. The rings were then were covered with 20 ⁇ l of undiluted Matrigel and then kept for 5 days at 37 ° C., 5% of C0 2 in complete medium containing 0, 20 and 40 ⁇ g / ml of antibody.
  • Matrigel ECM Gel, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
  • the culture medium with or without antibodies was renewed every 2 days. After 5 days of incubation, the formation of vascular buds was observed by microscopy (IRB DM microscope, Leica). In order to objectively measure the formation of these buds, we asked a 5-person jury to independently participate in a blind notation of images of the aortic rings recorded at 10X magnification and asked them to assign each image a score, based on the number, length and density of microvessels formed (scale from 0 to 5, the minimum value of 0 corresponding to the absence of buds), in order to evaluate the anti-angiogenic activity of the antibodies.
  • the CDC activity is measured by flow cytometry using a solution of propidium iodide (PI) capable of incorporating the DNA of the cells.
  • PI propidium iodide
  • the cells are trypsinized, taken up in culture medium and then placed in conical bottom 96-well plates (Nunc, Denmark) at a rate of 0.2 10 6 cells / well. The plates are then centrifuged to remove the supernatant, and the cells are incubated with the antibodies to give a final concentration of 0.1 to 10 ⁇ g / ml.
  • Fresh filtered serum is collected 24 h after the blood sample in the absence of anti-coagulant. A fraction is decomplemented at 56 ° C for 45 min, filtered again and stored at 4 ° C.
  • Human serum is then added which represents 1: 5 of the final volume, either in its decomplemented form or in its non-decomplemented form.
  • the plates containing the cells, the antibodies and the serum are then incubated for 2 h at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the cell pellets are then collected by brief centrifugation of the plate and the cells taken up with 0.6 ⁇ g of a solution of propidium iodide in a volume of 100 ⁇ . After an incubation of 30 min at 37 ° C in the dark, the cells are analyzed directly using the cytometer at a rate of 1.10 5 cells per analysis. 1.12. Nucleotide sequencing of variable regions of heavy and light chains of anti-Gb3 antibodies.
  • RNA of the mouse hybridomas was extracted according to the method described by Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi, 1987) with the RNAble ® reagent (Eurobio, Les Ulis, France).
  • the cells are homogenized in a denaturing solution containing guanidinium isothiocyanate and phenol.
  • the nucleic acids are denatured, the proteins dissociated thanks to the formation of complexes between RNA and guanidine isothiocyanate which makes it possible to break the hydrophilic interactions between the DNA and the proteins.
  • the DNA and proteins are extracted from the aqueous phase while the RNA remains in this phase.
  • the cell pellet of hybridomas (10 10 6 cells) is washed twice in PB S and then taken up in 2 ml of RNAble.
  • the cells are lysed by repeated pipetting to dissociate the nucleoprotein complexes.
  • the homogenate is mixed vigorously for 15-30 seconds. This step makes it possible to separate, by differential solubilization, the nucleic acids (the RNAs being insoluble in phenol) from the proteins.
  • the mixture is incubated on ice for 5 minutes and then centrifuged for 15 minutes at 12,000 g at 4 ° C.
  • the aqueous phase containing the RNA is removed and transferred to a microtube.
  • RNA concentration is determined spectrophotometrically by measuring the absorbance at 260 nm of an aliquot as well as its purity at 280 nm by the ratio of the absorbances at 260 nm / 280 nm for a value of about 2.
  • the RNA thus extracted are either stored at -80 ° C or directly treated with DNAse.
  • the DNAse is treated according to the protocol of the supplier.
  • the reaction is carried out in a final volume of 10 ⁇ l comprising 2 ⁇ g of total RNA, a 20 mM Tris-HCl buffer solution, pH 8.4, 2 mM MgCl 2 , 50 mM KCl, and 1 U of DNAse 1. (Sigma, St-Quentin-Favier, France).
  • the DNAse is inactivated by the addition of 1 ⁇ l of a 25 mM EDTA solution, followed by incubation at 65 ° C. for 10 minutes.
  • the treated RNAs can also be stored at -80 ° C, or be directly subjected to a reverse transcription step.
  • RNA in complementary DNA RNA
  • the cDNAs are synthesized from 0.2 ⁇ g of RNA in a final volume of 40 ⁇ . According to the supplier's protocol (Invitrogen), the total RNAs are denatured by incubation at 65 ° C. for 5 min. 500 ng of poly- (dT) i2-is oligonucleotides and 1 nM of each dNTP in 12 ⁇ l of H 2 0 wg QSP. After incubation, the RNAs are placed rapidly on ice to prevent refolding.
  • reaction medium consisting of reaction buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl 2), 0.2 ⁇ DTT, 40 U of RNaseOUT ® and 200 U of M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase). After incubating for 50 minutes at 37 ° C., the reaction is stopped by incubation for 15 minutes at 70 ° C. The cDNAs thus obtained can be stored at -20 ° C. or directly amplified by PCR.
  • V H and V L DNAs Amplification of V H and V L DNAs by PCR.
  • the PCR gene amplifications of the V H and V L DNAs are carried out using specific oligonucleotide pairs described in Table 4 (Clackson et al., 1991, Lefranc and Lefranc, 1997). On the 5 'side, the oligonucleotides hybridize to the FR1 region and to the 3' side, to the different 1 ⁇ 2 or J L segments.
  • Table 5 proposes four different amplification conditions for the amplification of the heavy chain variable regions (a, b, c and d) and two different conditions for the amplification of the light chain variable regions (e and f). .
  • For each of the conditions there are primer mixtures that hybridize on the 5 'side (primers back) and 3' (forward primers).
  • primer mixtures that hybridize on the 5 'side (primers back) and 3' (forward primers).
  • PCR reactions were carried out in a final volume of 25 ⁇ l containing 1 ⁇ l of cDNA, each primer (10 ⁇ M), each dNTP (10 nM), MgCl 2 (62.5 nM), reaction buffer, 5 U GoTaq ® DNA polymerase (Promega, Charbonippos-les-Bains, France) and VH 2 mQ 25 ⁇ qs.
  • Thirty cycles of amplification (Gene Amp ® PCR-System 2700, Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) were performed after a denaturation step of 94 ° C for 5 min. Each of the cycles included a step of 10 minutes at 72 ° C to complete the synthesis of the DNA strands.
  • the amplification products were then visualized on a 1% agarose gel (QA-Agarose-TM, MP Biomedicals, France) containing 0.1% GelRed TM (FluoProbes, Montlucon, France).
  • RNA extractions and three independent PCR amplifications were performed in order to perform three independent sequencing of the heavy and light chain variable regions.
  • the amplification conditions chosen for each hybridoma are listed in Table 5.
  • the nucleotide sequencing was performed by the platform of "Sequencing DNA and Genotyping" of the IFR 26 of the University of France, according to the method of Sanger (Sanger et al., 1977) with an AB3730 sequencer of 48 capillaries (Applied Biosystems). ). For each sequencing, 1 ⁇ l of appropriate primer back (Table 6) and 5 ⁇ l of PCR product V H OR V L were used .
  • the PCR products were purified by the ExoSAP-IT process (Amersham GE Healthcare) which allows, under the action of a enzyme degrade single strand fragments less than 100 bp and eliminate nucleotide primers and excess dNTPs.
  • the three independent sequencing made from three different RNA extractions enabled us to compare and determine the exact sequences of the heavy and light chain variable regions of each hybridoma.
  • the nucleotide sequences obtained were then aligned with data from the International Immunogenetics Information System® (IMGT) database, http: //www.imgt.org, in order to study the repertoire of V H and V L genes used in mice. .
  • IMGT International Immunogenetics Information System®
  • HMEC-1 cells were transformed with SV40 virus, so as to make them more easily used in culture while allowing them to retain their microvascular endothelial cell characteristics. They were then placed under different culture conditions close to the stimuli that the endothelial cells can undergo in a tumor microenvironment, which involves the sending of chemical signals by the tumor as growth factors that will induce their proliferation.
  • Figure 1A shows the HPTLC analysis of glycolipids extracted when the HMEC-1 cells were in the growth phase (lane 1), or at confluence (lane 2). The cells were also analyzed by densitometry.
  • HMEC-1 endothelial cells are in the proliferating phase two or three days after seeding, or having reached confluence after five days, a difference in glycolipid expression is observed, especially for the more apolar complex gangliosides. (No. 1 and 2) but also for glycolipid Gb3 (No. 12, Fig. 1). Densitometric analysis showed that the Gb3 content is almost twice as high for proliferating cells as for confluent cells (value equal to 1.716 ⁇ 0.069, two independent analyzes). Glycolipid expression profile of HMEC-1 cells following the culture medium composition.
  • FIG. 1B shows the HPTLC analysis of HMEC-1 cells which have been seeded at 20,000 cells / cm 2 and then incubated for 24 hours, as soon as the subconfluence state is reached, in depleted culture medium (lane 1) or in complete culture medium (lane 2). The cells were also analyzed by densitometry.
  • Figure 1C shows the FIPTLC analysis of HMEC-1 cells that were seeded at 20,000 cells / cm 2 and cultured in complete medium, until the subconfluency state is reached, and then incubated for 24 h in depleted medium supplemented with either sphingosine-1-phosphate 1 ⁇ l (lane 2) or its diluent, PET (lane 1).
  • glycolipids are derived from the aqueous phase of a partition DIPE / 1-butanol, 60:40 v / v, NaCl 0, 1% and revealed by orcinol, which revealed 14 bands of variable intensity that correspond to at least 7 molecular species.
  • DIPE / 1-butanol 60:40 v / v, NaCl 0, 1%
  • orcinol which revealed 14 bands of variable intensity that correspond to at least 7 molecular species.
  • This glycolipid Gb3 is in particular present in the form of a doublet corresponding to two types of ceramide fatty acid chains.
  • the cells In the presence of depleted media, the cells enter the GO phase of the cell cycle, which is a quiescent non-divisional stage.
  • This stage of non-division is reversible because under the influence of growth factors that order the cell to divide, they can then return to the Gl phase cell cycle to continue a normal progression of the cell cycle and proliferate.
  • the Gb3 content of the proliferating cells is greater than that of the quiescent cells.
  • a proangiogenic factor such as sphingosine-1-phosphate
  • the Gb3 content of the cells increases by 50%, whereas in complete medium it is twice as much. higher.
  • the increase of the content in Gb3 more important in the presence of complete medium can be explained in particular by a synergistic action of growth factors present in the fetal calf serum of the complete medium.
  • mice To generate mouse monoclonal antibodies against glycolipids of intratumoral endothelial cells, we chose to immunize Balb / c mice with endothelial cells that had previously been cultured in the presence of tumor cells in a co-culture model. mimicking the tumor microenvironment.
  • HPTLC revealed the presence of at least seven more or less expressed glycolipid molecular species, including a neutral glycolipid present in the form of a doublet corresponding to glycolipid Gb3.
  • ELISA glycolipid antigens
  • HMVEC-L human primary lung endothelial cells were co-cultured in the presence of T84 human colonic adenocarcinoma cells through porous membranes allowing the exchange of soluble factors between the two compartments (6-well Transwell-Clear, 0.4 mm pores, Corning, the Netherlands). Once Isolated and fixed with paraformaldehyde, these endothelial cells were used to immunize five Balb / c mice.
  • This co-culture system has been developed in the laboratory and has been previously described to study the influence of endothelial cell irradiation on non-irradiated T84 cells co-cultured with irradiated endothelial cells (Gaugler et al., 2007). .
  • the endothelial cells were proliferating at the time when the adenocarcinoma cells were implanted three days later and were still proliferating at the time they were trypsinized and then 4% paraformaldehyde, for immunization.
  • mice Five Balb / c mice were immunized with these endothelial cells co-cultured and fixed with 4% PFA. Sera were collected before each injection and the kinetics of the mouse humoral response was analyzed by desiccated ELISA on both HMVEC-L primary endothelial cells and SV40-transformed HMEC-1 endothelial cells. .
  • For the anti-IgM response we used polyclonal biotinylated goat antibodies directed against the ⁇ chain of mouse antibodies and for the anti-IgG response, polyclonal biotinylated goat antibodies directed against the (H + L) antibody fragments mouse.
  • the immunoglobulin isotype analysis shows that this is an early ⁇ response followed by a lower ⁇ response. Indeed, for the anti-IgM response, antibody levels are detectable from the first immunization (week 8) and for the anti-IgG response, antibody levels are detectable after the second injection (week 10) . We also observe a cross-reaction of these antibodies on HMEC-1 endothelial cells that allows us to consider the use of these SV40-transformed cells for screening studies.
  • Somatic hybridization yielded 1086 hybridomas. Their supernatants were removed for screening and stored at 4 ° C and these 1086 hybridomas were taken up in SVF containing 10% dimethylsulphoxide, to be stored at -80 ° C.
  • the generated hybridomas were selected using goat detection antibodies directed against both mouse IgM ( ⁇ ) and IgG (H + L) and in two approaches.
  • the hybridoma supernatants were tested by ELISA on desiccated HMEC-1 cells in order to preferentially screen for antibodies directed against antigens of glycolipidic nature.
  • the antibodies selected by ELISA were then screened by flow cytometry and the nature of the antigens was determined by immunolabeling glycolipids of HMEC-1 cells separated by HPTLC (iTLC).
  • iTLC immunolabeling glycolipids of HMEC-1 cells separated by HPTLC
  • the cell membranes are damaged and the antibodies selected by ELISA can be directed against intracellular antigens while we are looking for antigens present on the surface of the membranes.
  • flow cytometry we were able to isolate 13 hybridomas and in order to determine the nature of the recognized antigen, we immunolabeled HPTLC-separated glycolipids with these hybridoma supernatants (data not shown).
  • the supernatants of the 13 hybridomas recognize for 6 of them (25C10 (1), 1E10 (3), 3E2 (4), 15C1 1 (5), 16G8 (10) and 22F6 (12)), the same antigen of glycolipidic nature present in the form of a doublet that migrates above GM1, previously identified as Gb3.
  • Immunolabeling shows that Gb3 is present as a doublet corresponding to two types of ceramide fatty acid chains. It is found that some antibodies recognize both bands of Gb3 (antibodies 3E2 and 15C11), others recognize rather the upper band (antibody 22F6) and others the lower band (antibodies 25C10, 1 1E10 and 16G8). It has already been shown that the composition of the ceramide fatty acid chain can influence the conformation of a glycolipid and thus modify the reactivity of the antigen for its antibody.
  • the 13 selected hybridomas were cloned by limit dilution, again tested by ELISA on desiccated HMEC-1 cells, and their isotype was determined by a new ELISA using anti- ⁇ , ⁇ , y2a, y2b and ⁇ 3 antibodies. and their type of light chain with anti- ⁇ and ⁇ antibodies.
  • the hybridomas selected by this first screening approach are listed in the following Table 7. This table notably presents the isotypes of each of the selected antibodies as well as the name of the corresponding monoclonal antibody. Table 7. Hybridomas selected by the first screening strategy.
  • Immunolabeling on HPTLC is a sensitive detection method that can directly detect purified glycolipids extracted from about 10 6 to 30 6 6 cells while in flow cytometry, whole cells are analyzed at a rate of 0. , 4 10 6 cells. Immunostaining on HPTLC would thus make it possible to detect antibodies that bind to minority glycolipids which, due to their low content, could be undetectable by flow cytometry.
  • the hybridomas were cloned by limiting dilution and isotyped by ELISA using anti-isotype detection antibodies ( ⁇ , ⁇ , y2a, y2b and ⁇ 3) and detection antibodies directed against the light chains (K and ⁇ ).
  • the SDS-PAGE profile of the purified antibody 3E2 is shown in Figure 4.
  • the monoclonal antibody 3E2 is pure and undenatured.
  • the migration of the monoclonal antibody 3E2 on a polyacrylamide gel under denaturing conditions allows us to visualize, under reducing conditions, three bands corresponding to the heavy (H) and light (L) chains and to the characteristic J segment of ⁇ -type immunoglobulins. Due to its high molecular weight, equal to 900,000 Da, IgM can not migrate in the 6% acrylamide gel under non-reducing conditions. Analysis of the specificity of purified anti-Gb3 antibodies by affinity chromatography.
  • Anti-Gb3 3E2 Antibody C. 25C10.a. 16G8.h. 14Cl l. ld and 15C7.2e.
  • Fig. 5 shows the cell labeling in flow cytometry of the purified anti-Gb3 monoclonal antibodies selected by the first screening strategy (3E2.c, 25C 10.a, 16G8.h) or by the second screening strategy (HC ll. and 15C7.2e). Tagging was performed on HMEC-1 cells, Raji lymphoma cells for which Gb3 is a marker, and NXS2 cells of murine neuroblastoma that do not express Gb3, which we had previously verified with an ELISA on NXS2 cells desiccated using anti-Gb3 antibody 38.13 (data not shown).
  • 3E2 antibodies. C, 25C10.a, 16G8.h and 14Cl. ld (A, B, C and D) we used secondary antibodies specific for the ⁇ chain of mouse antibodies and for the 15C7.2e (E) antibody which would be a light chain dimer we used secondary antibodies directed against IgG (H + L).
  • Antibodies from the second screen appear to have a lower affinity for Gb3 than antibodies from the first screening as shown by the percentages of positive cells obtained with the 14C1 antibody. ld and 15C7.2e on HMEC-1 cells (respectively 25.3 and 11.7%) and with the 14C1 1 antibody. ld on Raji cells (10.0%).
  • HMEC-1 cells When the labeling is carried out with the antibody 3E2.c, 68.2% of the HMEC-1 cells and 87.9% of the Raji cells are positive. Unlike Raji cells, the labeling of HMEC-1 cells is heterogeneous and shows that some cells strongly express Gb3 and others express it more weakly. For the 25C10.a and 16G8.h antibodies resulting from the first screening, the HMEC-1 cells are more weakly homogeneously labeled (respectively 50.7% and 15.4%) and the Raji cells are labeled at 87, 1% and 51, 1%.
  • the 12E10.1c antibody of IgG1 isotype which was fixed on the Gb3 HMEC-1 cells by immunostaining on HPTLC.
  • the IgG1 isotype antibodies are capable of significantly activating the complement pathway, which gives them interesting cytotoxic properties.
  • the hybridoma was therefore cloned and purified and the antibodies were tested by flow cytometry on HMEC-1, NXS2 cells and Daudi cells, which are human Burkitt lymphoma cells expressing Gb3.
  • HMVEC-L in proliferation that had previously been co-cultured in the presence of tumor cells through a membrane system allowing the passage and exchange of growth factors between cells, in order to mimic the tumor microenvironment. Since the immunogenic power of lipids is low, we first verified the serum kinetics of the antibody response by an ELISA test on desiccated cells, which allows antibodies to be screened preferentially. directed against desiccation-resistant antigens such as glycolipids. We obtained an antibody response against HMVEC-L primary cells and then a cross-reaction on HMEC-1 cells that allowed the use of these SV40 transformed cells as a cell model for further work.
  • This co-culture model had already been developed in the laboratory (Gaugler et al., 2007) and it had previously been demonstrated in a similar co-culture system that the presence of tumor cells amplified cell proliferation and migration.
  • primary endothelial cells by acquiring phenotypic and genotypic modifications (Khodarev et al., 2003).
  • the ELIS A technique which uses desiccated cells, was developed in the laboratory and is based on preliminary studies with other cell types, such as the screening of monoclonal antibodies against membrane components of human mononuclear cells.
  • mouse pancreatic cells have been used in a desiccated form for the detection and quantification of antibodies present in ELISA. in the serum of insulin-dependent diabetics.
  • our antibody generation strategy we chose to immunize Balb / c mice with whole endothelial cells. Many anti-glycolipid antibodies have already been generated as a result of the immunization of whole tumor cells and in this way new molecular species of glycolipidic nature have been identified.
  • HMVEC-L cells fixation of HMVEC-L cells with 4% paraformaldehyde was chosen to screen hybridoma supernatants on cells treated under the same conditions as those used for immunization, but in this way also The plasma membrane of HMVEC-L cells could be stabilized and the cells for the different immunizations during the 65 weeks could be from the same co-culture.
  • the glycolipids being weakly immunogenic, they can be assimilated to molecules such as haptens incapable of triggering an immune reaction by themselves. To make them more immunogenic, they can be coupled to a "carrier" protein molecule whose role will be to expose, more importantly, the hapten molecule.
  • the somatic hybridization made it possible, from the 1086 hybridomas obtained, to preselect the first 139 hybridomas by ELISA on dried cells, which were then screened according to two strategies.
  • the first which was to screen hybridomas on living cells by flow cytometry, allowed 13 of them to be selected and by HPTLC immunolabeling of glycolipid extracts from cells, we determined that 6 of them recognized the glycolipid Gb3.
  • a second screening strategy which consisted of screening by immunostaining the 139 hybridomas obtained by ELISA, made it possible to select many other antibodies, mostly directed against Gb3 but also against glycolipids being characterized. After purification, it was found that the antibodies generated by the second screen had a lower affinity.
  • monoclonal antibodies IgM, ⁇ directed against Gb3: monoclonal antibodies 25C10 and 16G8 which, by immunostaining on HPTLC, instead recognize the lower band of the doublet Gb3 ; which is shown in a minority manner in HMEC-1 cells, and the monoclonal antibody 3E2 which has the best immunostaining binding profile on HPTLC and in flow cytometry.
  • Gb3 is a globotriaosylceramide, also called Gb3 / CD77, or CTH (ceramide trihexoside). He first identified as an antigen of a rare blood group, the Pk group on the surface of erythrocytes and is also known as a marker of Burkitt lymphoma (BLA, Burkitt Lymphoma Antigen). On the surface of endothelial cells, its expression is regulated by pro-inflammatory cytokines such as T F- ⁇ involved in tumorigenesis processes.
  • BLA Burkitt Lymphoma Antigen
  • this glycolipid is known as a specific receptor for bacterial toxins and Preliminary studies have shown that verotoxin binding to Gb3 could inhibit in vitro angiogenesis (Heath-Engel and Lingwood, 2003). These results support us in the interest of developing therapeutic antibodies targeting Gb3, especially since the content of this glycolipid seems to be modulated when the endothelial cells are proliferating (see Example 2). In addition, the vast majority of anti-glycolipid antibodies generated as a result of somatic hybridization were directed against Gb3, suggesting that this glycolipid is quite immunogenic in Balb / c mice.
  • the affinity of the antibody 3E2 was evaluated at 30 nM.
  • the number of Gb3 sites is of the order of 2 ⁇ 6 sites for both cell types but there are slightly more sites on Raji cells than on HMEC-1 cells.
  • flow cytometry FIGG 9, Example 3
  • the distribution of Gb3 was homogeneous for Raji cells for which 87.9% of the cells are positive, and heterogeneous for the HMEC-1 cells for which 68 2% of the cells are positive. Indeed, in the population of HMEC-1 cells, some cells weakly express Gb3 while others express it more strongly, unlike Raji cells.
  • mAb 3E2 was evaluated by an ELISA test on Raji, HMEC-1 desiccated cells and IMR32 cells of human neuroblastoma that do not express Gb3, using an anti-detection antibody.
  • Mouse ⁇ chain (Fig. 6).
  • the 3E2 antibody does not bind to the IMR32 cells. It binds to Gb3-positive HMEC-1 and Raji cells but their ELISA binding profile is different (A). Indeed, the antibody binds more weakly on HMEC-1 cells. This difference could be explained by the average number of Gb3 sites which is slightly larger for Raji cells. Moreover, in the population of HMEC-1 cells, it is observed by flow cytometry that there is a heterogeneity of labeling with the 3E2 antibody and that some cells express Gb3 more weakly (Fig. 5, Example 3). It could also be envisaged that the Gb3 of HMEC-1 cells is less well recognized when it is present in a desiccated form, since it is recognized that the conformation of a glycolipid can influence its recognition by an antibody.
  • the binding of the antibody 3E2 is revealed by the successive incubation of a biotinylated anti-mouse secondary antibody followed by the incubation of a streptavidin-peroxidase complex, whereas that of the antibody 38.13 is revealed by the incubation of a secondary antibody anti- ⁇ rat directly coupled to peroxidase.
  • Antibody 38.13 recognizes Gb3 of HMEC-1 cells as a doublet (lane 3), whereas the 3E2 antibody recognizes only the upper lane (lane 4).
  • the antibodies that is to say before cloning the hybridomas, it is found that when immunolabeling with the supernatant of the antibody 3E2, it also recognized the Gb3 in the form a doublet (track 5). It is thus assumed that cloning has made it possible to select, in a mixture of several hybridomas of different specificities, a monoclonal antibody which binds only to the upper band of the Gb3 doublet.
  • the mouse monoclonal antibodies 3E2 and 1A4 have different chromatographic binding profiles: the 3E2 antibody recognizes the Gb3 upper band of the HMEC-1 cells whereas the 1A4 antibody recognizes the Gb3 in the form of a doublet (B) . In contrast, both the 3E2 and the A4 antibodies recognize the porcine source purified Gb3 (Matreya) as a doublet. Moreover, it is found that the binding of the antibody 3E2 is weaker than that of the antibody A4, probably because the antibody 1A4 has a better affinity for Gb3 than the antibody 3E2. Immunofluorescence cell staining study in flow cytometry.
  • Table 10 Mean fluorescence intensity after analysis in flow cytometry.
  • the binding profile of the 3E2 antibody is different from that of the 1A4 antibody: 68.2% of the cells are positive with the 3E2 antibody (A) and 90.8% of the cells are positive with the antibody 1A4 (B).
  • the average fluorescence intensity value is 568.3 for the 3E2 antibody and 984.2 for the 1A4 antibody (Table 10).
  • Raji cells The labeling of Raji cells is homogeneous and the percentage of positive cells is comparable between the two antibodies (87.9% of positive cells and 423.8 of average fluorescence intensity for antibody 3E2, and 93.6% positive cells and 498, 1 mean fluorescence intensity value for the antibody 1A4).
  • Raji cells strongly express Gb3 homogeneously within the cell population and both antibodies seem to recognize the glycolipid in comparable affinities.
  • HMEC-1 cells the upper band of Gb3 is major.
  • the antibody 3E2 preferentially recognizes this form with respect to the antibodies 38, 13 and 1 A4 which recognize Gb3 as a doublet (Fig. 10).
  • flow cytometry after labeling the HMEC-1 cells with the antibody 3E2 (Fig. 10, A), the presence of a predominantly less marked population was observed.
  • the molecular species corresponding to the upper band of Gb3 is found on a high proportion of cells that express it more weakly than a more marked minority population.
  • flow cytometry after labeling HMEC-1 cells with the 1A4 antibody (Fig. 10, B), the presence of a predominantly more marked population was observed. There would then be a small proportion of HMEC-1 cells that strongly express the lower form of Gb3 or both forms undifferentiated.
  • the 3E2 antibody does not recognize non-co-cultured HMVEC-L cells (3.4% positive cells). This lack of fixation is due to an overall decrease in the Gb3 doublet observed by HPTLC, because even if the overall Gb3 content is low, the upper band remains predominant in HMVEC-L cells. Since the 1A4 antibody binds to the Gb3 of HMVEC-L cells (26.1% positive cells) and since the upper band is predominant, the difference in binding is due to a difference in affinity between the two antibodies. The affinity of the 1A4 antibody for Gb3 seems superior to that of the 3E2 antibody, since the low Gb3 content that can be visualized in HPTLC can be detected by flow cytometry only with the 1A4 antibody. . In HUVEC cells, almost no Gb3 is detected by HPTLC. In flow cytometry, only 7.5% of the cells are positive with the A4 antibody instead of 2.5% positive cells with the 3E2 antibody.
  • HPTLC analysis shows that the overall content of neutral glycolipids is limited in HUVEC cells (lane 6).
  • HMVEC-L cells it is the proportion of Gb3 within the total neutral glycolipid fraction which is limited (lane 5) since these cells strongly express a glycolipid present in the form of a doublet probably corresponding to glycolipid Gb4.
  • HMEC-1 it is the lower band of Gb4 which is maj oritaire.
  • Primary cells have higher levels of complex gangliosides migrating below GDi a .
  • ganglioside migrating above GM1 would be the most abundant of the total ganglioside fraction. Since the preponderance of GM 3 in the total ganglioside fraction has already been demonstrated in human endothelial cells (Obrig et al., 1993, Muthing et al., 1999, Kanda et al., 2004), it is likely that this predominant ganglioside HMEC-1, HMVEC-L and HUVEC cells are GM 3 .
  • the 3E2 antibody is an immunohistochemical tool that seems to meet expectations. It recognizes the presence of Gb3 which is localized at the membrane level of Gb3-positive tumors (Raji) and shows no non-specific binding on non-expressing tumors (IMR32).
  • the antiparasitic antibody is also suitable for immunohistochemical studies because it does not exhibit specificity.
  • RT-PCR the nucleotide sequences of the variable regions VH and VL in order to align them with the data of the IMGT (International Immunogenetics Information System®) bank.
  • the primers used for heavy and light chain sequencing are listed in Table 12.
  • the nucleotide sequences of the heavy and light chains are shown in FIG. 13 and the genes used for these variable regions are listed in Table 13.
  • Monoclonal antibody 3E2 has more than 99% homology with the germ-line IGHV4 gene (genomic DNA). There are two nucleotides that are mutated in the FR1 region. The antibody has 65.96% homology with the IGHJ2 gene and 78.57% with the IGHD1 gene. The VK of the antibody has a homology of 90.91% on 220 nucleotides with the IGKV14 gene and has 100% homology with the IGKJ5 gene. Due to the differences observed with the germinal configuration genes, it is thus demonstrated that the antibody has been subjected to a maturation process revealed by several somatic mutations. 4.2. Conclusion
  • hybridoma lines were obtained by somatic hybridization, including the antibody 3E2 (IgM, ⁇ ) directed against the neutral glycolipid Gb3.
  • IgM antibody 3E2
  • Gb3 is a marker
  • IMR32 human and murine NXS2 neuroblastoma cells that do not express Gb3, and primary endothelial cells
  • HMVEC- microvascular lung cells L
  • macrovascular umbilical cord cells HUVEC macrovascular umbilical cord cells
  • the antibody has a good affinity of the order of 30 nM.
  • the membrane localization of Gb3 was demonstrated by immunocytochemistry, followed by immunohistochemistry, its ability to specifically bind to Gb3 on sections of frozen Raji tumors.
  • the 3E2 antibody thus constitutes a new tool for analyzing Gb3, in addition to the antibodies that have already been generated previously, such as the rat IgM antibody 38.13 and the mouse IgM antibody 1A4 that were obtained in the team. Pr. S. Hakomori.
  • Gb3 was used to establish Gb3 as a marker of Burkitt's lymphoma, to show that Gb3 was involved in the apopototic phenomena of Gb3-positive lymphoma B cells and that Gb3 targeting by Gb3 antibodies (Taga et al 1997, Tetaud et al., 2003) or recombinant verotoxin B subunit (Mangeney et al., 1993) could also induce an apoptotic response.
  • a third antibody, BGR-23 obtained more recently (Kotani et al., 1994) was used to study the tissue distribution of Gb3 in Fabry disease (Askari et al., 2007).
  • These antibodies are specific for the Gakx1 ⁇ 4Gai terminal motif and can not recognize (1) the Gakx1 ⁇ 3Gai motif present at the terminal end of the oligosaccharide chain of isoglobotriosylceramide (iGb3) and (2) the Galal ⁇ 4Gai motif present at the of the oligosaccharide chain of the Gb 4 globoside (GalNac 1 ⁇ 3Gakx1 ⁇ 4Gal 1 ⁇ 4Glc 1 ⁇ Cer).
  • the 3E2 antibody recognized on HPTLC the band of the Gb3 doublet of HMEC-1 cells and the porcine Gb3 as a doublet, unlike the anti-Gb3 antibodies of rat 38. 13 and mouse A4, which recognized the two molecular species of Gb3 cells HMEC-1 and porcine Gb3.
  • the molecular species corresponding to this upper band is expressed heterogeneously on HMEC-1 cells.
  • Antibodies 3E2 and 1A4 equally recognized Gb3 of Raji cells, which express on their surface the superior form in a largely major and homogeneous manner because all the cells are marked extensively. Moreover, in an in vitro model, it has been very clearly shown that incorporation of GDi a into HUVEC cells makes these cells more sensitive to low levels of VEGF. They thus propose that, in the tumor microenvironment, glycolipids of tumor cells released and incorporated into the endothelial cells by a shedding phenomenon, would promote tumor progression. Since T84 cells do not express Gb3, the antibodies generated as a result of the immunization were directed against Gb3 expressed by HMVEC-L endothelial cells derived from co-culture.
  • HBMECs Human microvascular brain endothelial cells express 2 times more Gb3 than umbilical cord endothelial cells (HUVEC) (612 ⁇ 185 and 269 ⁇ 62 ng / mg protein) (Kanda et al., 2004).
  • Tumor transformation may also influence glycolipid content, as evidenced by the abnormal overexpression of GD 2 disialoganglioside acid in neuroblastomas, most melanomas and some other tumors, or the overexpression of Gb3 on several tumor cell lines such as lymphoma. Burkitt (Wiels et al., 1981), breast cancer cells, ovarian cancer cells astrocytic tumors (Gariepy 2001, LaCasse et al., 1999), epithelial carcinoma cells of the upper digestive tract (Marques Filho et al., 2006) or in human tumor tissues such as breast cancer (Johansson et al., 2009). ), colorectal tumors or metastases (F aiguines et al., 2008).
  • the biochemical changes observed during the malignant transformation of cells also affect the biosynthesis of ceramide. These modifications are manifested as well by variations in the length of the aliphatic chain, the number of substitutions or the degree of unsaturation. If in healthy tissues, the chains of fatty acids are shorter (C14: 0 to C18: 0), gangliosides of tumor cells have longer chains of fatty acids (C22: 0, C22: 1 and C24: 1 ) (Hakomori and Kannagi, 1983). Aberrant ⁇ -hydroxylation of the fatty acids of tumor gangliosides can also be observed.
  • the porcine Gb3 obtained from Matreya consists of a mixture of two types of ceramide chains (C: 16 and C: 20) which are composed of 70% saturated fatty acids and 30% unsaturated fatty acids. .
  • M immunoglobulins would mimic the pentameric structure of these toxins and collect naturally occurring glycolipids in the form of rafts lipid levels, based on synthetic plasma membrane models. These data notably explain why an IgG1 isotype antibody such as the 12E10.1c antibody selected by the second screening strategy had a bad affinity for Gb3, as shown by the weak binding of this antibody to Gb3 of the HMEC-cells. 1.
  • Verotoxin binding also depends on the length of the fatty acid chain of Gb3 ceramide. Glycolipids with medium or long fatty acid chains (Cl 6 and C24) are preferentially recognized, while short chains (Cl 2 and Cl 4) have minimal binding. C20: 0 and C22: 1 fatty acid chains have greater binding capacity and the presence of unsaturated fatty acids significantly increases verotoxin binding. Hydroxylation of fatty acids also increases binding. The binding of the verotoxin to the terminal Gal (al-4) Gal motif of glycolipids thus depends on the entire structure of the molecule and its molecular environment at the level of the plasma membrane of the target cells. These results highlight that glycolipids are involved in a cellular tropism closely related to their structure.
  • the antibody 3E2 thus targets an original glycolipid present on the endothelial cells. It would be important to determine the structure of the two molecular species of Gb3 present in the HMEC-1 and HMVEC-L cells, in order to highlight the structural variations that are responsible for the differential specificity of the 3E2 and 1 A4 antibodies.
  • Gb3 expression was heterogeneous in HMEC-1 cells and appeared to be modulated according to the state of proliferation of these cells. In particular, it should be investigated whether these results can be corroborated with biological activity, in order to determine the therapeutic potentialities of the antibody.
  • Table 15 Percentage of positive cells and average fluorescence intensity of the cells after flow cytometry analysis.
  • the Gb3 content at the surface of HMEC-1 cells increases slightly. In flow cytometry, this content is detectable only after 72 hours whereas this increase was visualized as early as 24 hours in HPTLC (FIG. The cells are positive at 42.0 + 0.3% after incubation with S1P, whereas only 24.4 + 1.6% are positive in the presence of depleted medium supplemented with PET diluent.
  • the increase in Gb3 content is greater (Fig. 14).
  • the fetal calf serum present in the complete medium comprises a mixture of growth factors and this increase may be due to a synergistic action of the growth factors.
  • the inhibition of cell viability induced by the antibodies 3E2 and 1A4 is comparable and leads to a saturation plateau of 20 to 40 ⁇ g / ml of antibody, for which values equal to 14.6 ⁇ 1.6% and 16.3 ⁇ 3, 1% inhibition.
  • No inhibition of cell viability is observed with the isotypic control antibody on these HMEC-1 cells.
  • This inhibition is more important for Raji cells (B) which have more Gb3 sites (2.0 10 6 sites against 1.7 10 6 sites for HMEC-1 cells) and which express Gb3 homogeneously. Within the HMEC-1 cell population, some cells express Gb3 more weakly, which may explain why the inhibition of viability is lower. No inhibition is observed for NXS2 cells that do not express Gb3. Inhibition of cell viability is therefore dependent on Gb3.
  • Fig. 18 represents the number of HMEC-1 cells as a function of the incubation time with 20 ⁇ g / ml of 3E2 antibody or isotype control antibody. It is observed that there are fewer HMEC-1 cells in the presence of the 3E2 antibody at 24 h of incubation. This decrease is significant from 6 hours of incubation (A). After 24 hours, there is a decrease in the number of cells that can be evaluated at about 18%, which is close to the 14.6% inhibition of cell viability that was observed at 24 hours in the morning. MTT (Fig. 16).
  • Figure 19 shows the proportion of cells that enter cell division per time interval (A) and their division time during these 24 hours of cumulative incubation (B).
  • the dividing cells can be detected and counted: the cells lose their adhesion, become detached from the support, become more refractive and adopt a circular morphology whereas they exhibit cytoplasmic expansions when they are adherent. It is thus possible to identify dividing cells and also their dividing time until both daughter cells adhere back to the support.
  • the 3E2 antibody exhibits cytostatic activity: it induces an inhibition of cell viability at 24 h, a decrease in the number of cell divisions with an extension of the dividing time. It also induces inhibition of vascular bud formation on explants of aortic cross sections in culture. These observations were obtained in the absence of complement.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • Fig. 21 presents the CDC activity of the antibodies 3E2, 1A4 and the isotype control (10 ⁇ g / ml of antibody) on the FDVIEC-1, Raji and NXS2 cells, in the presence of decomplemented human serum and not decomplemented.
  • the 3 ⁇ 2 antibody exhibits CDC activity on HMEC-1 cells (Table 17, 51.3 ⁇ 9.2% lysed cells) and Raji cells (71.8 ⁇ 5.5%). lysed cells). The activity can be detected at low concentrations of the order of 0.5 ⁇ ⁇ of antibodies (20.6 ⁇ 3.2 of lysed HMEC-1 cells and 36.4 ⁇ 6.8% of lysed Raji cells). ).
  • the 1A4 antibody also has a significant CDC activity at 10 ⁇ g / ml (65.2 ⁇ 13.2% of HMEC-1 cells positive and 82.9 ⁇ 7.7% of Raji positive cells). The CDC activity can be detected as soon as 0.1 ⁇ g / ml of antibody (37.2 ⁇ 12.6% of HMEC-1 positive cells and 25.8 ⁇ 3.9% of Raji positive cells).
  • NXS2 cells which do not express Gb3, are not lysed in the presence of the 3E2 and 1 A4 antibodies and the HMEC-1 and Raji cells, which express Gb3, are not lysed in the presence of isotype control: thus the observed cytotoxic activity is clearly dependent on Gb3.
  • the NXS2, HMEC-1 and Raji cells are not lysed in the presence of non-decomplemented serum, so there is no activation of the alternative complement pathway which plays a role. important in innate nonspecific immune defenses.
  • HMEC-1 and Raji cells are not lysed in the presence of the antibodies A4 or 3E2 when they are incubated in the presence of decomplemented serum or in the absence of human serum: they do not observe apoptosis-type cell death or necrosis.
  • the cytolytic activity observed is therefore very dependent on complement activation, via the binding of antibodies to Gb3.
  • Antibodies act primarily in three ways that can be cumulative. By direct fixation, they can induce cytostatic activities (cell cycle blocking type) or cytotoxic activities (apoptosis type, necrosis). By CDC, they can induce the activation of complement proteins by binding of the Clq protein complex to the Fc region of antibody bound to their target, resulting in the formation of the membrane attack complex and cell lysis. By ADCC, the Fc ⁇ R receptors bind to the Fc region of antibody bound to their target thereby leading to lysis or phagocytosis induced by an effector cell of the immune system.
  • the various biological tests used show that the antibody 3E2 initially has a complement-independent cytostatic activity.
  • MTT is observed to inhibit the cell viability of FDVIEC-1 cells equal to 14.6 ⁇ 1.6% for 20 ⁇ g / ml of antibody as early as 24 hours (Fig. 16). This result is confirmed by a video-kinetic study of HMEC-1 cells.
  • FIG 18 When the cells are incubated with 20 ⁇ g / ml of antibody, there is a decrease in the overall number of cells close to the inhibition value obtained in MTT (FIG 18). There are fewer cells dividing and their dividing time is generally longer.
  • the cell viability inhibition of HMEC-1 cells is 22.2 ⁇ 9.1%.
  • mitotic aberrations In the presence of the antibody 3E2, there is also an increase in the frequency of mitotic aberrations associated with the presence of cells blocked in division for several hours and which do not break out, as well as the presence of cells that can not enter in division and which alternate repeated cycles of cellular attachment and detachment.
  • mitotic aberrations can be attributed to death mechanisms involving adhesion, such as death by anoikis, as has already been demonstrated for an antibody targeting GD 2 ganglioside in small cell lung cancers.
  • Anoikis is a phenomenon of death that was first identified in 1994 and characterizes the loss of contact of cells with their extracellular matrix.
  • an anti-GD 2 antibody induces apoptosis via the ubiquitous cytoplasmic protein FAK (Focal Adhesion Kinase) found within the adhesion complex and which can be activated by integrins but also by different growth factors. cytokines or hormones.
  • FAK Fluor Adhesion Kinase
  • Gb3 it has already been shown for microvascular endothelial cells from patients with Fabry disease, that Gb3 present in large amounts was associated with an increased expression of molecules involved in cell adhesion such as ICAM proteins. -1, VCAM-1 and selectin E. Zemunic et al. (2004) compared the distribution of Gb3 with that of E-selectin in H FUVEC cells stimulated by T F- ⁇ .
  • Gb3 may have a potential role in adhesion mechanisms within the endothelium (Zemunik et al., 2004).
  • the migration of the cells requires the establishment of a finely regulated system of organization of the cytoskeleton and adhesion complexes.
  • treatment with IFN- ⁇ increases the relative proportion of intracellular Gb4 that is associated with the cytoskeleton of the cell.
  • the specific modulation of glycosphingolipids by IFN- ⁇ suggests that they may play a role in the adhesion mechanisms of activated endothelial cells.
  • the most abundant glycolipids HUVEC, the Gb4 and GM 3 are located at the surface and intracellularly where they are associated with the intermediate filament vimentin cytoskeleton could play a role in the transport of glycosphingolipids.
  • the strong membrane expression of an antigen can make it possible to obtain a high density of antigen-antibody complexes at the membrane, favoring the recruitment of the effectors of the antigen. immunity, and in particular complement.
  • the classical pathway is activated by the antigen-antibody complex and among immunoglobulins, IgM are effective activators of complement-dependent cytotoxicity.
  • the 3E2 antibody is capable of activating CDC as early as 0.5 ⁇ g / ml on HMEC-1 cells (20.6 +/- 3.2% of lysed cells) which have 1.7-10 6 Gb3 sites and 0.1 g / ml on Raji cells (15.7 ⁇ 5.2%) which have 2.0 June 10 sites.
  • the CDC activity is observed as soon as 0.1 g / l on the HMEC-1 (22.2 ⁇ 6.9%) and Raji (25.8 ⁇ 3.9%) cells. Both antibodies are thus able to activate the complement pathway for weak antibody concentrations. This complement-dependent activity allows us to consider future preclinical studies in mice.
  • 25C10, 11E10, 16G8) were obtained from a single somatic hybridization and a single cloning. They are all IgM isotype and all have a ⁇ light chain.
  • the nucleotide sequences of the heavy chains of the seven anti-Gb3 antibodies are shown in FIG. 22.
  • the seven Gp3 glycolipid-specific antibodies each use a different V gene with a germline homology degree of greater than 98% except for the 15C1 1 and 25C10 MABs which are respectively distinguishable. by 96.8% and 93, 1% homology.
  • mAb 14C1 1 a homology of the V gene identical to the IGHV2-6-7 * 01 or 02 allele.
  • mAb 15C11 which has 100% homology with the IGHJ3 allele.
  • * 01 the other 6 mAbs all use the same gene J (IGHJ2 * 01) which combines with a D gene, different products VH sequences, different for each hybridoma.
  • the length of the hypervariable region CDR3H is between 5 and 12 amino acids.
  • the nucleotide sequences of the heavy chains of the seven anti-Gb35 antibodies are shown in FIG. 23.
  • the genes used for the variable regions of the light chains are listed in the following table.
  • the MAb 3E2 is encoded by the same J gene (IGKJ5 * 01) as the 14C 11 and 22F6 mAbs with the same degree of homology but with a different amino acid junction expression. one hybridoma to another.
  • the seven anti-Gb3 antibodies were generated in a single somatic hybridization and the similarities observed in the heavy and light chains suggest that the antibodies are cloned.
  • Our results indicate that Variety of V H and V L chains can encode for anti-Gb3 antibodies and some are subject to a maturation process revealed by several somatic mutations.
  • the set of nucleotide data collected for the expression of the seven specific Gb3 mAbs confirms after cloning of the hybridomas the existence of distinct combinations of the VDJ and VJ genes for the expression of the mAbs without apparently any restriction.
  • V H and V L regions of mAb are essential for designing and optimizing for human therapeutic purposes chimeric or even humanized antibodies failing to obtain human antibodies.
  • This approach requires at least a three-dimensional modeling of the variable regions V H and V L of the antibody adapted to the specific recognition of Gb3 to substitute the hypervariable regions of a human antibody by those of the mAb 3E2 that we have defined as the leader of the seven antibodies that we have characterized with respect to glycolipid Gb3.
  • EXAMPLE 7 In Vivo Confirmation of the Anti-Angiogenic Properties of the 3E2 Antibody in Two Tumor Models
  • the therapeutic potential of the 3E2 antibody in the treatment of solid tumors was confirmed in vivo in two tumor models based on the murine neuroblastoma NXS2 line, and compared to that of an anti-GD2 antibody.
  • NXS2 neuroblastoma
  • the GD2 being another glycolipid which is, unlike Gb3, expressed by the NXS2 tumor cells and not expressed by the cells of the blood vessels.
  • mice Male A / J mice (6-8 weeks old) were obtained from Harlan Sprague-Dawley (Sulzfeld, Germany). Animal studies were carried out in accordance with Directive 86/609 / EEC.
  • mice were treated with intravenous injections of monoclonal antibodies at day 1, 2, 7 and 8 for the antibody 3E2 (IgM, 200 ⁇ g in 150 ⁇ l of PBS), or at days 1 and 2 for the antibody 14G2a ( IgG, 100 ⁇ g in 100 ⁇ l) or IgG isotype control antibody (100 ⁇ g in 100 ⁇ l), respectively.
  • IgM antibody 3E2
  • IgG antibody 14G2a
  • IgG IgG isotype control antibody
  • the molar amounts of antibody of each injection are similar for all antibodies, the larger mass used for the antibody 3E2 (IgM) relative to the other antibodies (IgG) being due to the higher molecular weight of IgM compared to IgG. .
  • the new 3E2 antibody injections at days 7 and 8 are necessitated by the limited half-life of IgM in vivo (approximately 1 week), which is not the case for the other antibodies. isotype IgG, IgG having an in vivo half-life of about 3 weeks.
  • mice received only PBS. The animals were sacrificed at day 28, their liver was weighed and the number of metastases evaluated.
  • Frozen tumors were cut and fixed with cold acetone for 10 minutes.
  • the samples were labeled for 90 minutes with the following monoclonal antibodies: a rat antibody against CD31 Murin (1: 50, Millipore, Molsheim, France) and a biotinylated antibody 3E2, 14G2a (anti-GD2) or its isotype control (Beckmann Coulter, Fullerton, CA, USA) (40 ⁇ g / ml).
  • Antibody 3E2 and isotype control were biotinylated with an EZ-Link Sulfo-HS-LC-Biotinylation kit (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France).
  • the labeling was revealed by 90 minutes of incubation with a goat anti-rat antibody conjugated with AF 488 (1: 400, Invitrogen) for CD31 and with streptavidin conjugated with AF 568 (1: 200, Invitrogen) for the 3E2 antibody or isotype control thereof.
  • the samples were finally coated with a ProLong gold antifade reagent with DAPI. Healthy animal organs have also been labeled with the 3E2 antibody or its isotype control using the same protocol. The markings were observed under a confocal fluorescence microscope (Nikon, Champigny sur Marne, France). Muscle sections were used as a normal tissue control.
  • Tumor volumes ranged from 120 to 130 mm 3 and did not differ significantly upon injection of treatment (3E2, 14G2a, IgM control, or PB S).
  • FIG. 24 The evolution of the tumor volume after treatment is shown in FIG. 24.
  • the antitumor efficacy of the 3E2 antibody was then determined in the model of experimental liver metastases of mouse neuroblastoma NSX2 developed by Lode et al.
  • the 3E2 antibody specifically targets the vessels within the tumor mass by histology and immunohistochemical staining.
  • the results are shown in Table 21 below, and show that the antibody 3E2 generates an intense colocalized labeling with that of the anti-CD31 antibody (marker cells of the blood vessels), and no markings in the tumor mass.
  • the muscle sections showed no Gb3 staining, only the endothelial cells within the tumor vessels being labeled with the 3E2 antibody.
  • NXS2 tumor cells showed a high level of GD2.
  • Table 21 Distribution of Gb3 within the tumor mass of NXS2 metastases.
  • mice with 3E2 and 14G2a antibodies were highly effective in reducing hepatic neuroblastoma metastases, as indicated by decreased liver weight from 39 ⁇ 6.23 g (PBS-treated mice) to 17 ⁇ 5.03 g (3E2 antibody treated mice) and 6.75 ⁇ 2.06 g (14G2a antibody treated mice) (p> 0.05). These last two values are not significantly different from those found in healthy control animals (p> 0.1). The effect of treatment with monoclonal antibody 3E2 is not significantly different from treatment with monoclonal antibody 14G2a (p> 0.5). These data further confirm the specificity of 3E2 antibody therapy, since treatment with a control isotype antibody is completely ineffective.
  • the 3E2 antibody is an IgM, whose distribution is limited to the intravascular compartment and because it recognizes blood vessels in solid tumors but not in healthy tissues, the results suggest that its therapeutic effects are related to its action. on these blood vessels.
  • the 3E2 antibody injection is also effective for inhibiting subcutaneous NXS2 neuroblastoma tumors in the A / J mouse.

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Description

Anticorps anti-Gb3 utiles dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine des nouvelles thérapies anticancéreuses, plus précisément dans le domaine des molécules anti-angiogéniques. Elle concerne notamment des anticorps anti-Gb3 possédant des séquences spécifiques de CDR, ainsi que l'utilisation d'anticorps anti-Gb3 non couplés à une molécule thérapeutique dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse.
ART ANTERIEUR
Les cellules cancéreuses, de part leur instabilité génétique, peuvent acquérir des résistances aux traitements anticancéreux, ce qui est à l'origine d'échecs thérapeutiques ou de récidives de cancers.
Il existe donc un besoin en nouveaux agent anticancéreux moins sensibles à la variabilité génétique des cellules tumorales.
Contrairement aux cellules tumorales elles-mêmes, les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins de la tumeur sont stables génétiquement. De plus, elles sont indispensables à la néovasculansation sans laquelle la tumeur ne peut continuer à croître, faute de nutriments. Par conséquent, une stratégie vi sant à inhiber l'angiogénèse, c'est-à-dire la prolifération des cellules endothéliales tumorales, ne serait pas sensible à la variabilité génétique de la tumeur, les cellules endothéliales étant stables génétiquement.
Le fait de cibler les cellules endothéliales présente également d'autres avantages
Dans le cadre d'une tumeur solide, les cellules tumorales sont difficiles à atteindre. En effet, avec les thérapies anti-cancéreuses traditionnelles, la pénétration des agents traitants dans les tissus tumoraux est diminuée à cause de la pression interstitielle élevée dans la plupart des tumeurs. Ceci n'est pas le cas dans les vaisseaux qui constituent une cible plus facilement accessible. Du fait de cette accessibilité, le ciblage des cellules endothéliales permet une distribution efficace et une accumulation rapide au niveau des vaisseaux tumoraux. De ce fait, cibler la vascularisation est une stratégie qui peut être appliquée à la majorité des types tumoraux.
Dans un organisme adulte, les cellules endothéliales sont, pour leur immense majorité, dans un état quiescent. En revanche, l'endothélium des vai sseaux tumoraux est composé de cellules endothéliales présentant un phénotype proliférant dit « angiogénique » qu'il est théoriquement possible de cibler. En effet, les vaisseaux qui irriguent les tumeurs présentent des caractéristiques structurales et fonctionnelles différentes de celles des vaisseaux normaux. Il est ainsi attendu que cette stratégie soit sélective et provoque peu d'effets secondaires sur l'angiogenèse dite « physiologique ».
Enfin, cibler la vascularisation et inhiber la formation des métastases sont des aspects primordiaux, puisque l'invasion est un des aspects les plus graves de la maladie.
Ainsi, cibler les cellules endothéliales en prolifération présente de nombreux avantages, aussi bien en termes d'accessibilité des cellules ciblées, du nombre de tumeurs qui peuvent être traitées, de diminution des effets secondaires si seules les cellules endothéliales en prolifération sont ciblées, et de prévention des métastases.
Le globotriasosylceramide ou globotriaosylceramide (Gb3), également appelé CD77, Pk, ceramide trihexoside (CTH), et Burkitt Lymphoma Antigen (BLA) est un g l y c o s p h i n g o l i p i d e n e u t r e d e f o r m u l e Galactoseal→4Galactose i→4Glucose i→Cerami de, synthéti sé par l ' enzyme Lactosylceramide 4-alpha-galactosyltransferase (A4GALT). Il est exprimé par la lignée de cellules endothéliales HUVEC, davantage lorsque cette lignée est en prolifération que lorsque les cellules sont confluentes et ne sont donc plus en phase exponentielle de croissance. Il constitue donc un marqueur des cellules endothéliales impliquées dans l'angiogénèse (Heath-Engel et al. Obrig et al).
Le céramide, partie hydrophobe de la molécule ancrée dans le feuillet externe de la membrane plasmique, est formé d'une chaîne d'acides gras composée de 16 à 28 atomes de carbone, reliée par une liaison amide à une base sphingoïde, généralement la sphingosine. Il peut présenter des variations dans la longueur mais aussi dans le nombre d'insaturation de sa chaîne d' acides gras. Notamment, les principales variations possibles pour la base sphingoïde et la chaîne d'acide gras sont représentées dans le Tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1. Principales espèces moléculaires d'acides gras et de bases sphingoïdes utilisées dans le céramide
Acides gras Bases sphingoïdes
Acide palmitique (16 : 0) Sphingosine (18 : 1)
Acide stéarique (18 : 0) Dihydrosphingosine (18 : 0)
Acide oléique (18 : 1) C20-dihydrosphingosine (20 : 0) Acide arachidonique (20 : 0) C20-sphingosine (20 : 1)
Acide béhénique (22 : 0)
Acide lignocérique (24 : 0)
Acide nervonique (24 : 1)
Le Gb3 est un récepteur naturel de certaines toxines bactériennes telles que la toxine Shiga, produite par Shigella dysenteriae, et les vérotoxines produites par Escherichia coli. Ces toxines sont composées de deux sous-unités A et B, la sous-unité B étant impliquée dans la liaison à Gb3, tandis que la sous-unité A correspond à la partie toxique inhibant la synthèse protéique. La liaison de ces toxines bactériennes sur Gb3 conduit au transport de la toxine de la membrane plasmique vers le réticulum endoplasmique via les endosomes précoces et l'appareil de Golgi. La sous-unité A produit ses effets toxiques dans le réticulum endoplasmique.
La toxine Shiga et les vérotoxines ont donc été proposées pour exercer une activité cytotoxique sur les cellules endothéliales, en particulier sur les cellules endothéliales en prolifération (Heath-Engel et al. Obrig et al. W098/51326).
Les vérotoxines et la toxine Shiga ont également été proposées comme agent thérapeutique dans le traitement des tumeurs exprimant Gb3 à leur surface, la sous-unité B servant au ciblage, tandis que la sous-unité A joue un rôle cytotoxique. En particulier, la vérotoxine 1 a été montrée comme capable d'induire l' apoptose de cellules de lymphome de Burkitt (Tétaud et al).
Cependant, ces approches ne sont pas réellement applicables en thérapie des cancers du fait d'effets secondaires très importants de la sous-unité A toxique sur le reste du corps humain. En effet, outre le tissu vasculaire, Gb3 est exprimé dans de nombreux autres tissus, tels que le tissu de l'estomac, de l'œsophage, de la prostate et du rein. Or, comme la toxine Shiga et les vérotoxines sont de petites molécules (environ 68 kilodaltons (kDa)), elles peuvent sortir de la circulation sanguine et entrer dans les tissus sains, où elles ont les mêmes propriétés cytotoxiques pour les cellules exprimant Gb3 que pour les cellules tumorales. Du fait de leur absence de spécificité d'action, ces toxines conduisent à des effets secondaires inacceptables. Ainsi, par exemple, Bast et al montrent que deux heures après administration à des lapins, la vérotoxine 1 n'est plus présente dans la circulation sanguine et peut être retrouvée dans les organes cibles exprimant Gb3.
De plus, outre les effets secondaires associés, la petite masse moléculaire de ces toxines et leur sortie de la circulation sanguine diminue aussi leur durée d'action sur les cellules des vaisseaux sanguins, diminuant ainsi également leur efficacité.
Il a également été proposé d'utiliser seulement la sous-unité B de ces toxines, et notamment de la toxine Shiga, pour cibler les cellules de tumeurs exprimant Gb3, une molécule thérapeutique cytotoxique étant couplée à la sous-unité B (Janssen et al. Viel et al). Cependant, pour peu que la molécule thérapeutique couplée à la sous-unité B (seulement environ 8 kDa par sous-unité B) soit de petit poids moléculaire, alors cette stratégie pose les mêmes problèmes de toxicité et de durée d'action sur les cellules des vaisseaux sanguins que la précédente.
Il existe donc un besoin pour de nouvelles molécules capables de se fixer sur Gb3 et d'inhiber l'activité angiogénique des cellules endothéliales des vaisseaux sanguins tumoraux, qui soient moins toxiques et qui aient une durée d' action plus importante.
Des anticorps monoclonaux peuvent être générés pour de nombreux types de ligands, y compris pour les glycosphingolipides, même si certains sont peu immunogènes. Des anticorps monoclonaux dirigés contre Gb3 étaient d'ailleurs déjà utilisés pour le marquage des cellules exprimant Gb3 , en particulier l' anticorps monoclonal 38.13 (Bordron et al. Chark et al).
Cependant, il avait été décrit que cet anticorps monoclonal 38.13 ne se liait pas de la même façon à Gb3 que les vérotoxines (Chark et al). En outre, il avait également été décrit qu'un anticorps monoclonal anti-Gb3 obtenu à partir d'ascite 1A4, induisait l'apoptose de cellules de lymphome de Burkitt par un mécanisme différent de celui de la vérotoxine 1 (Tétaud et al). Il était donc peu probable qu'un anticorps monoclonal anti- Gb3 puisse avoir le même effet anti-angiogénique que les vérotoxines.
D'ailleurs, W098/51326, qui décrit l'utilisation de molécules se liant à Gb3 comme agents anti-angiogéniques, propose comme tels agents les vérotoxines et des anticorps anti-Gb3 couplés à une molécule toxiques, telles que des toxines. Les auteurs de ce document estimaient donc qu'un anticorps anti-Gb3 seul n'aurait pas d'effet anti- angiogénique.
En outre, Bordron et al décrit l'effet apoptotique sur les cellules endothéliales de différents anticorps anti-cellules endothéliales (spécificités antigéniques précises non déterminées, probablement des mélanges d'anticorps de spécificités différentes) issus de patients souffrant de maladies auto-immunes, ainsi que de plusieurs anticorps monoclonaux de spécificité connue, parmi lesquels un anticorps monoclonal anti-Gb3 (clone 38/13). Les résultats présentés dans ce document montrent que seulement 8% des cellules endothéliales sont en état d'apoptose suite à leur mise en contact avec l'anticorps monoclonal 38/13 anti-Gb3, pourcentage qui est inférieur à celui obtenu en présence de milieu seul, sans anticorps (14%). Ces résultats suggèrent également que les anticorps monoclonaux anti-Gb3 n'ont pas le même effet sur les cellules endothéliales que la toxine Shiga ou les vérotoxines.
Pourtant, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante que plusieurs anticorps monoclonaux anti-Gb3 ont une activité anti-angiogénique sur les cellules endothéliales en prolifération. Ces anticorps monoclonaux peuvent donc être utilisés dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse, et notamment des tumeurs solides, avec tous les avantages mentionnés précédemment que ce ciblage comporte (moins de risque de résistance, applicable à tout type de tumeur, cibles facilement atteintes, prévention des métastases). En outre, ils présentent plusieurs avantages par rapport à la toxine Shiga et aux vérotoxines :
En fonction de leur isotype, les anticorps ont une masse moléculaire qui varie entre 150 (IgG) et 1000 (IgM) kDa, et ont donc une masse moléculaire plus importante que la toxine Shiga et les vérotoxines. Cela devrait leur permettre de rester plus longtemps dans la circulation sanguine et donc d'avoir une durée d'action plus importante que ces toxines sur les cellules endothéliales des néovaisseaux tumoraux. Les isotypes IgG (notamment IgGl) et IgM sont les plus avantageux. En effet, les IgM ont la masse moléculaire la plus importante, environ 80% restant dans la circulation sanguine, et ils ont une demi-vie in vivo d'environ 10 jours. Concernant les IgG, 45% restent dans la circulation sanguine, et leur demi-vie est d'environ 20 jours (Nikolayenko et al). Cela est à mettre en parallèle avec le fait que l'administration de vérotoxine 1 à des lapins montre que seulement 2% de la vérotoxine 1 sont encore présents dans la circulation sanguine au bout de deux heures, le reste étant retrouvé dans les tissus exprimant Gb3.
Ces anticorps ne sont pas toxiques en eux-mêmes, ce qui devrait limiter leurs effets secondaires sur les autres tissus exprimant Gb3, le fait qu'ils restent principalement dans la circulation sanguine limitant également ces effets secondaires,
Les anticorps de souris obtenus par les inventeurs peuvent être humanisés, de façon à limiter au maximum toute réaction immunitaire du receveur, ce qui n'est pas possible pour les toxines bactériennes, qui génèrent une réponse immunitaire susceptible de diminuer leur efficacité.
Ces anticorps ont donc en commun de reconnaître le Gb3 et d'être utiles dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse. De plus, deux de ces anticorps (3E2 et 22F6) ont en outre en commun de reconnaître la bande supérieure mais pas la bande inférieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1 , bande supérieure qui semble être particulièrement surexprimée lorsque les cellules endothéliales prolifèrent, par rapport aux cellules quiescentes. Cela est susceptible de leur conférer une spécificité accrue pour les cellules endothéliales en cours d'angiogénèse.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Anticorps
La présente invention concerne donc un anticorps dirigé contre le glycosphingolipide membranaire globotriaosylceramide (Gb3), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il possède au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 42, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 42.
Dans un mode de réalisation, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède une chaîne lourde comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39.
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède une chaîne légère comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42.
Avantageusement, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède : une chaîne lourde comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins
96%), au moins 97%, au moins 98%>, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : l à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39, et
une chaîne légère comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%), au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42.
L'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut aussi avantageusement posséder une chaîne lourde comprenant trois CDR-H (CDR de chaîne lourde) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%), au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) CDR1-H-3E2 : SEQ ID NO : 1, CDR2-H-3E2 : SEQ ID NO : 2, CDR3- H-3E2 : SEQ ID NO : 3,
b) CDR1-H-14C11 : SEQ ID NO : 7, CDR2-H-14C11 : SEQ ID NO : 8,
CDR3-H-14C11 : SEQ ID NO : 9,
c) CDR1-H-15C11 : SEQ ID NO : 13, CDR2-H-15C11 : SEQ ID NO : 14, CDR3-H-15C11 : SEQ ID NO : 15,
d) CDR1-H-22F6 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-22F6 : SEQ ID NO : 20, CDR3-H-22F6 : SEQ ID NO : 21,
e) CDR1-H-25C10 : SEQ ID NO : 25, CDR2-H-25C10 : SEQ ID NO : 26, CDR3-H-25C10 : SEQ ID NO : 27, f) CDR1-H-11E10 : SEQ ID NO : 31, CDR2-H-11E10 : SEQ ID NO : 32, CDR3-H-11E10 : SEQ ID NO : 33, ou
g) CDR1-H-16G8 : SEQ ID NO : 37, CDR2-H-16G8 : SEQ ID NO : 38, CDR3-H-16G8 : SEQ ID NO : 39.
L'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut aussi avantageusement posséder une chaîne légère comprenant trois CDR-L (CDR de chaîne légère) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes : a) CDR1-L-3E2 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L-3E2 : SEQ ID NO : 5, CDR3-
L-3E2 : SEQ ID NO : 6,
b) CDR1-L-14C11 : SEQ ID NO : 10, CDR2-L-14C11 : SEQ ID NO : 11, CDR3-L-14C11 : SEQ ID NO : 12,
c) CDR1-L-15C11 : SEQ ID NO : 16, CDR2-L-15C11 : SEQ ID NO : 17, CDR3-L-15C11 : SEQ ID NO : 18,
d) CDR1-L-22F6 : SEQ ID NO : 22, CDR2-L-22F6 : SEQ ID NO : 23, CDR3-L-22F6 : SEQ ID NO : 24,
e) CDR1-L-25C10 : SEQ ID NO : 28, CDR2-L-25C10 : SEQ ID NO : 29, CDR3-L-25C10 : SEQ ID NO : 30,
f) CDR1-L-11E10 : SEQ ID NO : 34, CDR2-L-11E10 : SEQ ID NO : 35,
CDR3-L-11E10 : SEQ ID NO : 36, ou
g) CDR1-L-16G8 : SEQ ID NO : 40, CDR2-L-16G8 : SEQ ID NO : 41, CDR3-L-16G8 : SEQ ID NO : 42.
Encore avantageusement, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède des chaînes lourdes et légères comprenant respectivement des CDR-H et CDR-L ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) CDR1-H-3E2 : SEQ ID NO : 1, CDR2-H-3E2 : SEQ ID NO : 2, CDR3-
H-3E2 : SEQ ID NO : 3, CDR1-L-3E2 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L-3E2 : SEQ ID NO : 5, CDR3-L-3E2 : SEQ ID NO : 6, b) CDR1-H-14C11 : SEQ ID NO : 7, CDR2-H-14C11 : SEQ ID NO : 8, CDR3-H-14C11 : SEQ ID NO : 9, CDR1-L-14C11 : SEQ ID NO : 10, CDR2-L- 14C11 : SEQ ID NO : 11, CDR3-L-14C11 : SEQ ID NO : 12,
c) CDR1-H-15C11 : SEQ ID NO : 13, CDR2-H-15C11 : SEQ ID NO : 14, CDR3-H-15C11 : SEQ ID NO : 15, CDR1-L-15C11 : SEQ ID NO : 16, CDR2-
L-15C11 : SEQ ID NO : 17, CDR3-L-15C11 : SEQ ID NO : 18,
d) CDR1-H-22F6 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-22F6 : SEQ ID NO : 20, CDR3-H-22F6 : SEQ ID NO : 21, CDR1-L-22F6 : SEQ ID NO : 22, CDR2-L- 22F6 : SEQ ID NO : 23, CDR3-L-22F6 : SEQ ID NO : 24,
e) CDR1-H-25C10 : SEQ ID NO : 25, CDR2-H-25C10 : SEQ ID NO : 26,
CDR3-H-25C10 : SEQ ID NO : 27, CDR1-L-25C10 : SEQ ID NO : 28, CDR2- L-25C10 : SEQ ID NO : 29, CDR3-L-25C10 : SEQ ID NO : 30,
f) CDR1-H-11E10 : SEQ ID NO : 31, CDR2-H-11E10 : SEQ ID NO : 32, CDR3-H-11E10 : SEQ ID NO : 33, CDR1-11E10L : SEQ ID NO : 34, CDR2- L-11E10 : SEQ ID NO : 35, CDR3-L-11E10 : SEQ ID NO : 36, ou
g) CDR1-H-16G8 : SEQ ID NO : 37, CDR2-H-16G8 : SEQ ID NO : 38, CDR3-H-16G8 : SEQ ID NO : 39, CDR1-L-16G8 : SEQ ID NO : 40, CDR2-L- 16G8 : SEQ ID NO : 41, CDR3-L-16G8 : SEQ ID NO : 42.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède une chaîne lourde comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 43 à 49 ou une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 43 à 49.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède une chaîne légère comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 50 à 56 ou une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 50 à 56.
Avantageusement, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention possède : une chaîne lourde comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 43 à 49 ou une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 43 à 49, et
une chaîne légère comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 50 à 56 ou une séquence ayant au moins 80%), de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 50 à 56.
Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut notamment être choisi parmi les anticorps monoclonaux anti-Gb3 générés par les inventeurs ou des variants de ceux-ci, qui possèdent des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%), au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) Anticorps 3E2 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO : 50,
b) Anticorps 14C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 44, chaîne légère : SEQ ID NO : 51,
c) Anticorps 15C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 45 chaîne légère : SEQ ID NO : 52,
d) Anticorps 22F6 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère : SEQ ID NO : 53,
e) Anticorps 25C10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 47, chaîne légère : SEQ ID NO : 54,
f) Anticorps 11E10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 48 chaîne légère : SEQ ID NO : 55, et
g) Anticorps 16G8 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 49, chaîne légère : SEQ ID NO : 56. Par "anticorps" ou "immunoglobuline", on entend une glycoprotéine composée de deux types de chaînes glycopolypeptidiques appelées « chaîne lourde » et « chaîne légère », un anticorps étant constitué de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, liées par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée d'une région variable et d'une région constante. La région constante d'un isotype particulier de chaîne lourde ou légère est normalement identique d'un anticorps à un autre de même isotype, sauf mutations somatiques. En revanche, la région variable varie d'un anticorps à un autre. En effet, les gènes codant pour les chaînes lourdes et légères des anticorps sont générés par recombinaison de respectivement trois et deux segments de gènes distincts appelés VH, DH et JH-CH pour la chaîne lourde et VL et JL-CL pour la chaîne légère. Les segments CH et CL ne participent pas à la recombinaison et forment les régions constantes des chaînes lourdes et légères respectivement. Les recombinaisons des segments VH-DH-JH et VL-JL forment les régions variables des chaînes lourdes et légères respectivement. Les régions VH et VL possèdent 3 zones hyper variables ou régions déterminant la complémentarité (CDR), appelées CDR1 , CDR2 et CDR3, la région CDR3 étant la plus variable, puisqu' elle se situe au niveau de la zone de recombinaison. Ces trois régions CDR, et particulièrement la région CDR3, se trouvent dans la partie de l' anticorps qui sera en contact avec l' antigène et sont donc très importantes pour la reconnaissance de l'antigène. Ainsi, les anticorps conservant les trois régions CDR et chacune des chaînes lourde et légère d'un anticorps conservent en grande majorité la spécificité antigénique de l'anticorps d'origine. Dans un certain nombre de cas, un anticorps ne conservant que l'un des CDR, et notamment le CDR3, conserve également la spécificité de l'anticorps d'origine. Les régions CDR1, CDR2 et CDR3 sont chacune précédées des régions FR1 , FR2 et FR3 respectivement, correspondant aux régions charpentes (framework région FR) qui varient le moins d'un segment VH ou VL à un autre. La région CDR3 est également suivie d'une région charpente FR4.
Les CDR d'un anticorps sont définis à partir de la séquence d'acides aminés de ses chaînes lourdes et légères par rapport à des critères connus de l'homme du métier. Différentes méthodes de détermination des CDR ont été proposées, et la portion de la séquence d'acides aminés d'une région variable de chaîne lourde ou légère d'un anticorps définie comme un CDR varie en fonction de la méthode choisie. La première méthode de détermination est celle proposée par Kabat et al (Kabat et al. Séquences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U. S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later éditions). Dans cette méthode, les CDR sont définis en recherchant les acides aminés responsables de la liaison à l'antigène de l'anticorps. Une 2eme méthode a été proposée par l'IMGT, fondée cette fois sur la détermination des régions hypervariables. Dans cette méthode, une numérotation unique a été définie pour comparer les régions variables quels que soient le récepteur à l'antigène, le type de chaîne ou l'espèce (Lefranc et al. 2003). Cette numérotation fournit une délimitation standardisée des régions charpentes ((FR1-IMGT : positions 1 à 26, FR2-IMGT : 39 à 55, FR3-IMGT : 66 à 104 et FR4-IMGT : 118 à 128) et des régions déterminant la complémentarité (CDR1-IMGT : positions 27 à 38, CDR2-IMGT : positions 56 à 65 and CDR3-IMGT : positions 105 à 117). Enfin, il existe également une numérotation dite « commune », dans laquelle la séquence d'un CDR particulier correspond à la séquence commune entre la numérotation de Kabat et la numérotation IMGT. Dans toute la présente description, les séquences de CDR sont indiquées dans la numérotation IMGT. En particulier, les CDR ont été déterminés en utilisant le programme IMGT/V- QUEST disponible sur http : //imgt. cines.fr et décrit dans Brochet et al (2008).
Le Tableau 2 ci-dessous résume les séquences d'acides aminés des CDR et des régions variables des chaînes lourdes et légères des anticorps anti-Gb3 générés par les inventeurs :
Anticorps 3E2 Anticorps 25C10
Chaîne lourde Chaîne lourde
CDR1 SEQ ID NO 1 CDR1 SEQ ID NO 25
CDR2 SEQ ID NO 2 CDR2 SEQ ID NO 26
CDR3 SEQ ID NO 3 CDR3 SEQ ID NO 27
Région variable SEQ ID NO 43 Région variable SEQ ID NO 47
Chaîne légère Chaîne légère
CDR1 SEQ ID NO 4 CDR1 SEQ ID NO 28
CDR2 SEQ ID NO 5 CDR2 SEQ ID NO 29
CDR3 SEQ ID NO 6 CDR3 SEQ ID NO 30
Région variable SEQ ID NO 50 Région variable SEQ ID NO 54
Anticorps 14C11 Anticorps 11E10
Chaîne lourde Chaîne lourde
CDR1 SEQ ID NO 7 CDR1 SEQ ID NO 31
CDR2 SEQ ID NO 8 CDR2 SEQ ID NO 32
CDR3 SEQ ID NO 9 CDR3 SEQ ID NO 33
Région variable SEQ ID NO 44 Région variable SEQ ID NO 48
Chaîne légère Chaîne légère
CDR1 SEQ ID NO 10 CDR1 SEQ ID NO 34
CDR2 SEQ ID NO 1 1 CDR2 SEQ ID NO 35
CDR3 SEQ ID NO 12 CDR3 SEQ ID NO 36
Région variable SEQ ID NO 51 Région variable SEQ ID NO 55
Anticorps 15C11 Anticorps 16G8
Chaîne lourde Chaîne lourde
CDR1 SEQ ID NO 13 CDR1 SEQ ID NO 37
CDR2 SEQ ID NO 14 CDR2 SEQ ID NO 38
CDR3 SEQ ID NO 15 CDR3 SEQ ID NO 39
Région variable SEQ ID NO 45 Région variable SEQ ID NO 49
Chaîne légère Chaîne légère
CDR1 SEQ ID NO 16 CDR1 SEQ ID NO 40
CDR2 SEQ ID NO 17 CDR2 SEQ ID NO 41
CDR3 SEQ ID NO 18 CDR3 SEQ ID NO 42
Région variable SEQ ID NO 52 Région variable SEQ ID NO 56
Anticorps 22F6
Chaîne lourde
CDR1 SEQ ID NO 19
CDR2 SEQ ID NO 20
CDR3 SEQ ID NO 21
Région variable SEQ ID NO 46
Chaîne légère
CDR1 SEQ ID NO 22
CDR2 SEQ ID NO 23
CDR3 SEQ ID NO 24
Région variable SEQ ID NO 53 Par « fragment fonctionnel », on entend un fragment d'anticorps conservant le domaine de liaison à l'antigène et ayant donc la même spécificité antigénique que l'anticorps d'origine, tels que les fragments Fv, ScFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou les dianticorps (« diabodies »).
Par « dérivé » d'un anticorps, on entend une protéine de liaison formée d'un peptide support et d' au moins un des CDR de l' anticorps d'origine permettant de préserver sa capacité à reconnaître Gb3.
Les anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés selon l'invention peuvent être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique, selon des technologies bien connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation préféré, l' anticorps selon l'invention est un anticorps monoclonal. Par « monoclonal », on entend un anticorps obtenu à partir d'une population d'anticorps substantiellement homogènes, c'est-à-dire que les anticorps formant cette population sont essentiellement identiques à l'exception de possibles mutations naturelles pouvant être présentes dans des quantités mineures. Ces anticorps sont dirigés contre un seul épitope et sont par conséquent très spécifiques. Par « épitope », on entend le site de l'antigène auquel l'anticorps se lie. Quel que soit l'antigène, un épitope est constitué d'une région tridimensionnelle formée par des parties de l'antigène qui peuvent ou non être adjacentes dans une structure linéaire, non tridimensionnelle de l'antigène.
Les anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés ne sont bien entendu pas sous une forme naturelle, mais isolés, obtenus par purification à partir d'une source naturelle, par recombinaison génétique ou bien par synthèse chimique.
Au sens de la présente description, le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés signifie le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences comparées, obtenu après alignement optimal des deux séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont distribuées au hasard sur toute leur longueur. La comparaison de deux séquences d' acides nucléiques ou d' acides aminés est généralement réalisée après les avoir alignées de façon optimale, la comparaison pouvant être réalisée par segment ou en utilisant une « fenêtre d'alignement ». L'alignement optimal des séquences peut être réalisé en utilisant différents logiciels bien connus de l'homme du métier, dont les logiciels BLAST NR (acides nucléiques) ou BLAST P (protéines).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, dans lesquelles la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés comparée peut avoir des délétions ou insertions par rapport à la séquence de référence. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, de préférence entre les deux séquences complètes, et en le divisant par le nombre total de positions dans la fenêtre d'alignement (de préférence les séquences complètes) et en multipliant le résultat par 100. Ce pourcentage d'identité peut être calculé aisément en utilisant par exemple le logiciel BLAST avec des paramètres par défaut.
Lorsque le CDR ou la région variable d'un anticorps selon l'invention possède une séquence d'acides aminés qui n'est pas 100% identique à l'une de celles décrites ci- dessus et dans le listing de séquences (séquences de référence) mais qui possède au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec une telle séquence de référence, elle peut présenter des insertions, délétions ou substitutions par rapport à la séquence de référence. Lorsqu'il s'agit de substitutions, la substitution est de préférence réalisée par un acide aminé « équivalent », c'est-à-dire tout acide aminé dont la structure est proche de celle de l'acide aminé d'origine et est donc peu probable de modifier les activités biologiques de l'anticorps. Des exemples de telles substitutions sont présentés dans le Tableau 3 suivant :
Tableau 3. Substitutions par des acides aminés équivalents
Tous les anticorps mentionnés ci-dessus reconnaissent le Gb3. Chez les cellules HMEC-1 humaines utilisées par les inventeurs, le Gb3 est représenté en immunomarquage par un doublet correspondant à la présence de 2 chaînes d'acides gras différentes au niveau du céramide. Les cellules porcines expriment également deux formes de Gb3, représentées par un doublet. L'anticorps 3E2 reconnaît les deux formes de Gb3 du doublet porcin, ainsi que la bande supérieure, mais pas la bande inférieure, du doublet exprimé par les cellules HMEC-1. Des résultats préliminaires suggèrent que la bande supérieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1 est sur-exprimée dans les cellules HMEC-1 en cours d'angiogénèse par rapport aux cellules HMEC-1 quiescentes (voir Figure 14, où le pourcentage de cellules reconnues par l'anticorps 3E2 spécifique de cette bande supérieure augmente quand les cellules sont en milieu complet, alors que le pourcentage de cellules reconnues par l'anticorps 1A4, qui reconnaît les deux bandes indifféremment, ne varie pas). Par conséquent, la spécificité de l'anticorps 3E2, et de tout anticorps ayant les mêmes CDR 1, CDR2 et CDR3 ou les mêmes régions variables, pour cette bande supérieure augmente encore vraisemblablement sa spécificité pour les cellules endothéliales en prolifération, par rapport aux cellules endothéliales quiescentes, ce qui est susceptible de diminuer encore ses effets secondaires. L'anticorps 22F6 reconnaît lui aussi cette bande supérieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1 et devrait donc être particulièrement spécifique des cellules endothéliales en prolifération, ainsi que tout anticorps ayant les mêmes CDR 1, CDR2 et CDR3 ou les mêmes régions variables. Ce n'est pas le cas des anticorps de l'art antérieur 38.3 et 1 A4, qui reconnaissent les deux bandes du doublet (voir Figures 7 et 8), l'anticorps 38.3 semblant même reconnaître principalement la bande inférieure du doublet (voir Figure 7-1). Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention est l'anticorps 3E2 ou 22F6 tels que définis ci-dessus par les séquences des régions variables de leurs chaînes lourdes et légères, avantageusement l'anticorps 3E2, ou un anticorps de même spécificité antigénique. Notamment, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut posséder au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 6 et 19 à 24, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 6 et 19 à 24. Plus précisément, l'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut posséder une chaîne lourde comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 3, et 19 à 21, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 3, et 19 à 21 et/ou posséder une chaîne légère comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4 à 6, et 22 à 24, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 4 à 6, et 22 à 24. Il peut également avantageusement posséder une chaîne lourde comprenant trois CDR-H (CDR de chaîne lourde) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%), de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes : a) CDR1-H-3E2 : SEQ ID NO : 1, CDR2-H-3E2 : SEQ ID NO : 2, b) CDR1-H-22F6 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-22F6 : SEQ ID NO : 20, CDR3-H-22F6 : SEQ ID NO : 21,
et/ou posséder une chaîne légère comprenant trois CDR-L (CDR de chaîne légère) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) CDR1-L-3E2 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L-3E2 : SEQ ID NO : 5, CDR3-L-3E2 : SEQ ID NO : 6,
b) CDR1-L-22F6 : SEQ ID NO : 22, CDR2-L-22F6 : SEQ ID NO : 23,
CDR3-L-22F6 : SEQ ID NO : 24.
Avantageusement, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut posséder :
une chaîne lourde comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 43 et 46 ou une séquence ayant au moins
80%), de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 43 et 46, et /ou
une chaîne légère comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 50 et 53 ou une séquence ayant au moins
80%), de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 50 et 53.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti-Gb3, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut notamment être choisi parmi les anticorps monoclonaux anti-Gb3 générés par les inventeurs ou des variants de ceux-ci, qui possèdent des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%), au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes : a) Anticorps 3E2 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO : 50, et
b) Anticorps 22F6 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère :
SEQ ID NO : 53.
Comme indiqué en introduction, les isotypes les plus avantageux sont les isotypes IgG, notamment IgGl , et IgM, plus particulièrement l'isotype IgM, qui possède le plus haut poids moléculaire. Par conséquent, un quelconque anticorps selon l'invention est avantageusement d'isotype IgG ou IgM, de préférence IgM.
En outre, un quelconque anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut avantageusement être chimérique ou humanisé. En effet, cela permet d'éviter les réactions immunitaires du patient contre l'anticorps administré. Notamment, l'anticorps selon l'invention peut avantageusement être l'une quelconque des versions chimériques ou humanisées des anticorps 3E2, 14C1 1, 15C11, 22F6, 25C10, 1 1E10, et 16G8 décrits ci-dessus, avantageusement des anticorps 3E2 et 22F6, et notamment de l'anticorps 3E2.
Par anticorps « chimérique », on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée. Les anticorps de type chimérique selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Ce sera notamment le cas des anticorps chimériques obtenus à partir des anticorps monoclonaux murins 3E2, 14C11, 15C11, 22F6, 25C10, 11E10, et 16G8 décrits dans la présente description. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8 : 74, 1988).
Par anticorps « humanisé », on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivée d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al. Nature, 321 : 522-525, 1986 ; Verhoeyen et al. Science, 239 : 1534-1536, 1988 ; Riechmann et al. Nature, 332 : 323-327, 1988). Les anticorps humanisés selon l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art telles les technologies de « CDR grafting » , de « resurfacing », de SuperHumanisation, de « Human string content », de « FR libraries », de « Guided sélection », de « FR shuffling » et de « Humaneering », comme résumé dans la revue de Almagro et al.
L'anticorps anti-Gb3, ou fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'invention peut aussi avoir été optimisé pour certaines fonctions effectrices. Ainsi, il peut notamment comporter des mutations augmentant son affinité pour le récepteur Fc auquel son isotype se lie. Il peut aussi être produit dans des conditions (cellules, milieu, etc..) particulières permettant d'obtenir une glycosylation particulière de l'anticorps. Notamment, pour les IgG, certaines substitutions de la portion Fcy ainsi qu'une fucosylation faible ou nulle permettent d'augmenter l'affinité pour le récepteur FcyRIII (voir notamment Shields et al. Journal of Biological Chemistry. Vol. 276, No. 9, Issue of March 2, pp. 6591-6604, 2001, EP1176195A1, EP1331266A1, WO 01/77181). De manière alternative ou en sus, l'anticorps peut également, en particulier lorsqu'il s'agit d'un isotype IgG et notamment d'un isotype IgGl, avoir été modifié pour limiter sa capacité à fixer le complément et donc son activité de cytotoxicité dépendante du complément (CDC), tout en préservant ses fonctions de cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC). En effet, dans le cas d'un anticorps anti-GD2, il a été montré qu'une mutation ponctuelle dans la partie constante de la région IgGl humaine (remplacement de la lysine en position 322 de la partie constante Fc humaine de la chaîne légère κ par une alanine) permettait de diminuer sa fixation au complément tout en maintenant ses propriétés d'ADCC, et de diminuer certains effets secondaires associés à l'administration de cet anticorps (US7432357B2). Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3 selon l'invention est un anticorps à faible activité CDC, c'est-à-dire que dans un test d'activité CDC in vitro, l'activité CDC de l'anticorps à une concentration de 0, 1 μg/ml n'est pas significativement différente de celle du contrôle sans anticorps. En particulier, un mode de réalisation avantageux concerne un anticorps anti-Gb3 humanisé d' isotype IgGl, comprenant une chaîne légère d'isotype κ, dans lequel la lysine en position 322 de la partie constante Fc humaine de la chaîne légère κ est remplacée par une alanine ou un acide aminé équivalent, de préférence par une alanine. L'invention concerne également un acide nucléique (encore appelé séquence nucléique ou nucléotidique) codant pour l'un quelconque des anticorps anti-Gb3, ou fragments fonctionnels ou dérivés selon l'invention tels que décrits ci-dessus. Toutes les séquences nucléiques différentes, du fait de la dégénérescence du code génétique, codant pour une séquence d'acides aminés particulière sont dans la portée de l'invention. De telles séquences nucléiques peuvent avoir été optimisées pour favoriser son expression dans une cellule hôte d'intérêt. Des séquences particulières d'intérêt sont celles des régions variables des chaînes lourdes et légères des anticorps générés par les inventeurs, représentées comme suit :
Anticorps 3E2 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 57, chaîne légère : SEQ ID NO : 64,
Anticorps 14C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 58, chaîne légère : SEQ ID NO : X65
Anticorps 15C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 59, chaîne légère : SEQ ID NO : 66,
- Anticorps 22F6 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 60, chaîne légère : SEQ
ID NO : 67
Anticorps 25C10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 61 chaîne légère : SEQ ID NO : 68,
Anticorps 11E10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 62, chaîne légère : SEQ ID NO : 69,
Anticorps 16G8 : chaîne lourde : SEQ ID NO : X63 chaîne légère : SEQ ID NO : 70. L'invention concerne aussi un vecteur comprenant au moins une des séquences nucléiques décrites ci-dessus. Un tel vecteur comprend les éléments nécessaires à l'expression de ladite séquence nucléique, et notamment un promoteur, un codon d'initiation de la transcription, des séquences de terminaison, et des séquences de régulation de la transcription appropriées. Ces éléments varient en fonction de l'hôte servant pour l'expression et sont choisis aisément par l'homme du métier au vu de ses connaissances générales. Le vecteur peut notamment être plasmidique ou viral. Il est utilisé pour cloner ou exprimer les séquences nucléiques selon l'invention.
L'invention concerne également une cellule hôte comprenant une ou plusieurs séquences nucléiques ou un ou plusieurs vecteurs selon l'invention. La cellule hôte peut être d'origine procary ote ou eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules bactériennes, les cellules d' insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. L'anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé selon l'invention peut alors être produit en cultivant la cellule hôte dans des conditions appropriées. Il peut également être obtenu par synthèse chimique, notamment en phase solide ou semi-solide.
Les anticorps, fragments fonctionnels ou dérivés selon l'invention ont des propriétés anti-angiogéniques en tant que tels. Notamment, ils présentent une activité cytostatique et cytotoxique sur les cellules endothéliales en prolifération. Ils peuvent donc être utilisés seuls dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse, telles que définies ci-dessous. Ainsi, dans un mode de réalisation, les anticorps selon l'invention décrits ci-dessus ne sont pas couplés à une molécule thérapeutique, notamment cytotoxique, cytostatique ou anti-angiogénique telle qu'une toxine, en particulier une toxine inhibant l'angiogénèse. Au sens de la présente invention, on considère qu'un anticorps est « couplé » à une molécule s'il existe une liaison covalente entre l'anticorps et la molécule Ainsi, le fait que l'anticorps selon l'invention ne soit pas couplé à une molécule thérapeutique signifie qu'il n'est pas lié par une liaison covalente à une telle molécule. Cela n'empêche cependant pas que l'anticorps, non couplé à une molécule thérapeutique, puisse être administré en combinaison (simultanément ou séquentiellement) avec une autre molécule thérapeutique, y compris une molécule cytotoxique, cytostatique ou anti-angiogénique dans le cas des tumeurs solides, les deux molécules pouvant alors agir indépendamment l'une de l'autre. Dans un autre mode de réalisation, les anticorps anti-Gb3, ou fragments fonctionnels ou dérivés de ceux-ci selon l'invention tels que décrits ci-dessus peuvent néanmoins aussi être couplés à une autre molécule thérapeutique. Traitement des maladies associées à l'angiogénèse
La présente invention concerne également un anticorps, dirigé contre le glycosphingolipide membranaire Gb3 et non couplé à une molécule thérapeutique, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse. Elle concerne aussi l 'utilisation d'un anticorps dirigé contre le glycosphingolipide membranaire Gb3 et non couplé à une molécule thérapeutique, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies associées à l'angiogénèse. Elle concerne également une méthode de traitement des maladies associées à l'angiogénèse chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un anticorps dirigé contre le glycosphingolipide membranaire Gb3 et non couplé à une molécule thérapeutique. Elle concerne aussi une méthode pour inhiber l'angiogénèse chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'un anticorps dirigé contre le glycosphingolipide membranaire Gb3 et non couplé à une molécule thérapeutique.
Par « maladies associées à l'angiogénèse », on entend toute maladie dont l'évolution nécessite une angiogénèse pour se développer, c'est-à-dire la formation de nouveaux vaisseaux à partir d'un réseau vasculaire préexistant. Parmi ces maladies associées à l'angiogénèse, on peut citer les tumeurs solides ; le psoriasis ; les angiomes ; les maladies oculaires prohfératives, notamment la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), la rétinopathie diabétique, ou le glaucome néovasculaire ; les maladies auto-immunes, notamment le lupus ou la polyarthrite rhumatoïde ainsi que des maladies liées à l'athérosclérose ; l'obésité ou la maladie d'Alzheimer. En effet, l e développement de toutes ces maladies implique une angiogénèse. Bien entendu, les maladies des cellules du sang, telles que leucémies ou lymphomes, sont des tumeurs « liquides » qui n'ont pas besoin d'une angiogénèse, et ne sont donc pas considérées comme des maladies associées à l'angiogénèse au sens de la présente invention. Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3, non couplé à une molécule cytotoxique, cytostatique ou anti-angiogénique, est utilisé dans le traitement des tumeurs solides.
Les tumeurs solides pour le traitement desquelles les anticorps anti-Gb3 sont utiles incluent notamment les adénomes, les sarcomes, et les carcinomes ; et notamment les adénocarcinomes, les cancers de l' ovaire, du sein, du pancréas, de la peau, du poumon, du cerveau, du rein, du foie, de la cavité nasopharyngée, de la thyroïde, du système nerveux central (neuroblastome par exemple), de la prostate, du côlon, du rectum, du col utérin, des testicules, ou de la vessie.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'application au traitement des maladies associées à l'angiogénèse, notamment pour le traitement des tumeurs solides, l'anticorps anti-Gb3 utilisé est l'un quelconque de ceux décrits ci-dessus dans la partie concernant les anticorps en tant que tels.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-Gb3 reconnaît la bande supérieure mais pas la bande inférieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1. Il peut notamment s' agir des anticorps 22F6 et 3E2, ou d'un anticorps possédant au moins un CDR ou tous les CDR, voire l'une et/ ou l' autre des régions variables de ces anticorps.
Dans le cadre du traitement des tumeurs solides, l'anticorps anti-Gb3 peut être administré en combinaison avec un autre traitement, notamment une résection chirurgicale de la tumeur, un traitement de radiothérapie ou une chimiothérapie avec une autre molécule thérapeutique, pour peu que l'autre molécule thérapeutique ne soit pas couplée à l'anticorps. L e s d e ux t r a i t e m e nt s ( an ti c o rp s e t chirurgie/radiothérapie/autre molécule thérapeutique) peuvent alors être administrées simultanément (c'est-à-dire en même temps, dans une même composition ou dans deux compositions séparées) ou séquentiellement (l'une puis l' autre, éventuellement en alternance). Elles peuvent aussi être administrées d' abord simultanément puis séquentiellement, ou l'inverse. La combinaison peut aussi être administrée d'abord (simultanément ou séquentiellement) puis le traitement être poursuivi avec une seule des deux thérapies. Pourvu qu'une molécule thérapeutique ne soit pas couplée à l'anticorps, elle peut être choisie parmi toutes les autres molécules anticancéreuses, qu'elles ciblent également l'angiogénèse ou bien la tumeur elle-même. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. (A) Profils HPTLC des cellules HMEC-1 en phase de croissance (piste 1) ou confluentes (piste 2), marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 3) et glycolipides neutres standards (piste 4). (B) Profils HPTLC de cellules HMEC-1 incubées dans du milieu de culture appauvri (piste 1) ou complet (piste 2), marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 3), et mélange de glycosphingolipides neutres standards (piste 4). (C) Profils HPTLC de cellules HMEC-1 traitées par le PET (piste 1) ou la S1P (piste 2), marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 3), et glycolipides neutres standards (piste 4). Le solvant de migration utilisé est le C/M/H20,CaCl2 0,2%, 55 : 45 : 10 v/v/v. Toutes les bandes sont révélées par l'orcinol.
Figure 2. Protocole d' obtention d' anticorps dirigés contre les cellules endothéliales HMVEC-L cultivées en présence de cellules T84 d' adénocarcinome humain.
Figure 3. Principe du clonage par dilution limite en microplaque de 96 puits. (Panneau A) En position Al sont ensemencées 1000 cellules d'hybridomes qui sont ensuite diluées en cascade au demi de haut en bas, des puits A à H, puis de gauche à droite, des puits 1 à 12. Le panneau B représente le nombre théorique de cellules restantes après dilution.
Figure 4. Analyse électrophorétique de 1 ' AcM IgM 3E2 sur un gel de polyacrylamide de 6 % en conditions non-réductrices (A) sur un gel de polyacrylamide de 12 % en conditions réductrices (B).
Figure 5. Analyse du marquage par cytométrie de flux des cellules HMEC-1, Raji et NXS2 avec les anticorps monoclonaux anti-Gb3 purifiés 3E2. C (A), 25C 10.a (B), 16G8.h (C), 14Cl l . ld (D), 15C7.2e (E). Toutes les cellules ont été marquées avec 10 μg/ml d'anticorps. Les pourcentages de cellules positives sont notées sur les figures du panneau A, B, C, D, E et F.
Figure 6. Etude de la spécificité de l'anticorps 3E2 par ELIS A (Panneau A) Fixation de l'anticorps 3E2 mesurée par ELISA sur les cellules Raji, les cellules HMEC-1 et les cellules IMR32. (Panneau B) Fixation de l ' anticorps 3E2 et de l'anticorps monoclonal de rat anti-Gb3 38.13 sur les cellules HMEC-1 mesurée par ELISA. La concentration initiale des anticorps est égale à 10 μg/ml (3 analyses indépendantes). Figure 7. Immunomarquage sur HPTLC de cellules HMEC-1 par l'AcM 3E2, l ' AcM 3 8. 1 3 et l e surnageant de l ' hybridome 3E2 non cl oné . Marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 1) et extraits glycolipidiques des cellules HMEC-1 (pistes 2, 3, 4 et 5). (A) Les bandes sont révélées chimiquement par l'orcinol. (B) L' immunomarquage est réalisé avec 5 μg/ml d'AcM de rat anti-Gb3 38-13 (piste 3), 5 μg/ml d'AcM 3E2 (piste 4) et le surnageant de l'hybridome 3E2 avant clonage (piste 5)·
Figure 8. Immunomarquage sur HPTLC de cellules HMEC-1 par les AcM de souris 3E2 et 1 A4. Marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste M), mélange de glycolipides neutres (piste 1), Gb3 porcin purifié (piste 2) et extraits glycolipidiques des cellules HMEC-1 (piste 3). (Panneau A) Les lignes sont révélées chimiquement par l'orcinol. (Panneau B) L' immunomarquage est réalisé avec 5μg/ml d' AcM 3E2 ou 1 A4.
Figure 9. Analyse de la spécificité de l'anticorps 3E2 par cytométrie de flux sur les cellules HMEC-1, Raji et NXS2. Expression du Gb3 sur les cellules HMEC-1, Raji et NXS2 par cytométrie de flux avec 10 μg/ml d' AcM 3E2 (A), 1A4 (B) et de contrôle isotypique IgM, κ (C). Les pourcentages de cellules positives sont notés dans le Tableau 10.
Figure 10. Profil glycolipidique par HPTLC révélé à l' orcinol des cellules HMEC-1 (4), Raji (5), NXS2 (6) et T84 (7). Marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 1), mélange de glycolipides neutres standards (piste 2) et Gb3 porcin purifié (piste 3).
Figure 11. Expression du Gb3 sur les cellules HMEC-1, HMVEC-L et HUVEC par cytométrie de flux avec 10 μg/ml d' AcM 3E2 (A), 1 A4 (B) et de contrôle isotypique IgM, κ (C). Les pourcentages de cellules positives sont notés sur la Fig. 11 et les valeurs de moyenne d'intensité de fluorescence sont répertoriées dans le tableau 11.
Figure 12. Profil glycolipidique par HPTLC révélé à l'orcinol des cellules HMEC-1 (4), HMVEC-L (5), HUVEC (6). Marqueurs gangliosidiques de cerveau de rat (piste 1), mélange de glycolipides neutres standards (piste 2) et Gb3 porcin purifié (piste 3)·
Figure 13. Séquences nucléotidiques des régions variables des segments géniques VH (panneau A) et VL (panneau B) de l'anticorps 3E2. Figure 14. Analyse par cytométrie de flux de l'expression du Gb3 des cellules HMEC-1 incubées pendant 24 h en milieu appauvri (MA) et en milieu complet (MC). La fixation a été mesurée à l' aide de l 'AcM 3E2 (Panneau A) et de l 'AcM 1 A4 (Panneau B). Le pourcentage de cellules positives et les valeurs de moyenne d'intensité de fluorescence sont répertoriées dans le tableau 14 (3 expériences indépendantes).
Figure 15. Analyse par cytométrie de flux de l'expression du Gb3 des cellules HMEC-1 incubées en milieu appauvri supplémenté de SIP ΙμΜ ou de PET. La fixation a été mesurée à l'aide de l'AcM 3E2 à 24 h (Panneau A) et à 72 h (Panneau B). Le pourcentage de cellules positives et les valeurs de moyenne d'intensité de fluorescence sont répertoriées dans le tableau 15 (3 expériences indépendantes).
Figure 16. Viabilité cellulaire des cellules HMEC-1, Raji et NXS2 mesurée par MTT après 24 h d'incubation des AcM 3E2 et 1A4. Viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 en présence des AcM 3E2 et 1 A4 (Panneau A) et des cellules Raji et NXS2 en présence de Γ AcM 3E2 (panneau B), 3 expériences indépendantes.
Figure 17. Cinétique de la viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 mesurée par
MTT après 24 h, 48 h et 72 h d'incubation de l'AcM 3E2 à 20 μg/ml (3 expériences indépendantes).
Figure 18. Représentation du nombre de cellules HMEC-1 en fonction du temps d'incubation de l' AcM 3E2 à 20 ^πιΐ.
Figure 19. Pourcentage de cellules HMEC-1 en division et estimation de leur temps de division cellulaire en présence de l'anticorps 3E2. (Panneau A) Proportion de cellules qui entrent en division cellulaire par rapport au nombre de cellules au départ, en fonction du temps d'incubation (n=3). (Panneau B) Temps de division cellulaire : proportion de cellules entrées en division en fonction de leur temps de division cellulaire, par rapport au nombre total de divisions cellulaires sur les 24 h d'incubation (n=3).
Figure 20. Test des anneaux aortiques réalisé avec les AcM 3E2 et 1A4 (n=3). (Panneau A) Microvaisseaux en développement à partir de coupes transversales d'anneaux aortiques murins. Photo 1, croissance des microvaisseaux à l'implantation des coupes aortiques (J0). Photo 2, croissance des microvaisseaux au bout de cinq jours après incubation dans du milieu de culture complet. Photos 3 et 4, anneaux aortiques traités avec respectivement 20 μg/ml et 40 μg/ml d'AcM 3E2. (Panneau B) Scores assignés sur la longueur, la densité et le nombre de bourgeons vasculaires à partir de l'analyse des images des anneaux aortiques (échelle allant de 0 à 5, n = 5).
Figure 21. Evaluation de l'activité CDC des AcM 3E2 et 1A4. La lyse spécifique des cellules a été déterminée par cytométrie de flux en mesurant le pourcentage de cellules ayant incorporé l'iodure de propidium. L'activité CDC est mesurée en présence de sérum humain décomplémenté (de') ou non décomplémenté (c'). (Panneau A) Activité CDC réalisée sur les cellules HMEC-1 , (Panneau B) les cellules Raji et (Panneau C) sur les cellules NXS2.
Figure 22. Séquences nucléotidiques des régions variables de la chaîne lourde de 7 anticorps anti-Gb3.
Figure 23. Séquences nucléotidiques des régions variables de la chaîne légère de 7 anticorps anti-Gb3.
Figure 24. Réduction de la croissance d'une tumeur sous-cutanée par l'anticorps 3E2. Des souris AI femelles ont été inoculées en sous-cutané dans le flanc droit avec 106 cellules NXS2 (lignée de neuroblastome) vivantes (viabilité >95%) resuspendues dans 150 μΕ de PBS. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume V de 100-150 mm3, les souris ont reçu une unique injection d'anticorps 3E2 dirigé contre la bande supérieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1, d'anticorps anti-GD2 14G2a, d'un anticorps contrôle d' isotype IgM ou de PBS seul. Le graphe représente le volume tumoral, exprimé en pourcentage du volume tumoral lors de l'injection du traitement, en fonction de la durée après traitement.
Figure 25. L' anticorps 3E2 inhibe la croissance de métastases in vivo. (A) Photographie représentative de foies de souris à jours 28 après l'injection intraveineuse de cellules NXS2. Les barres d'échelle représentent 1 cm. (B) Nombre de métastases évalué pour chaque foie d'animal (PBS n=4, 3E2 n=6 ; 14G2a n=4 ; IgM contrôle n = 13 ; moyenne ± SEM ; * p<0,05). EXEMPLES
EXEMPLE 1. Matériels et méthodes des Exemples 2 à 6
1.1. Culture des cellules.
Cellules endothéliales : HMVEC-L, HMEC-1, HUVEC.
Les cellules HMVEC-L sont des cellules endothéliales microvasculaires primaires humaines issues de poumons (Cambrex, Clonetics®, USA). Chaque ampoule correspond à un seul donneur de type caucasien. Elles sont ensemencées à une densité de 5 104 cellules/cm2 en plaques de 6 puits, puis cultivées en atmosphère humide enrichie en C02 à 37 °C dans le milieu de culture spécifique EGM®-2 MV (Cambrex, USA) comportant 25 ml de SVF (sérum de veau fœtal), 0,2 ml d' hydrocortisone, 2 ml d'hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, 0,5 ml de R3-IGF-1, 0,5 ml d'acide ascorbique, 0,5 ml d'hEGF et 0,5 ml de GA-1000, pour 500 ml de milieu. Elles sont livrées au troisième passage et peuvent être cultivées jusqu'au septième passage. La lignée FDVIEC-1 (human microvascular endothelial cells) a été obtenue par l'équipe du Pr. F. J. Candal (Center for Disease Control, Atlanta ; Ades et al. 1992) après immortalisation de cellules endothéliales microvasculaires de peau humaines par transfection avec un plasmide contenant la région codante de l'antigène T du virus SV40. Ces cellules conservent les principales caractéristiques propres aux cellules endothéliales microvasculaires (Ades et al. 1992) et sont cultivées entre les passages 13 et 20 afin de limiter la dérive phénotypique liée à la culture cellulaire. Elles sont ensemencées à une densité cellulaire de 2 104 cellules/cm2 et cultivées pendant 5 jours jusqu'à confluence en atmosphère humide enrichie en C02 à 37 °C dans le milieu de culture MCDB 13 1 (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France) comportant 15% de SVF inactivé à 56 °C pendant 45 mn, 10 ng/ml d'EGF (Becton-Dickinson, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France), 2 μg/ml d' hydrocortisone (Sigma- Al drich, Saint Quentin-Favier, France), 2 mM de L-glutamine (Gibco-BRL, Cergy Pontoise, France), 100 Ul/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine (Gibco-BRL). Les cellules HUVEC sont des cellules primaires humaines macrovasculaires extraites à partir de veines de cordons ombilicaux (Cambrex). Chaque ampoule correspond à plusieurs donneurs. Elles sont ensemencées à une densité de 3,5 104 cellules/cm2 dans des plaques de 6 puits, puis cultivées en atmosphère humide enrichie en C02 à 37 °C dans le milieu de culture spécifique EGM -2 (Cambrex, USA) suivant : 10 ml de SVF, 0,2 ml d' hydrocortisone, 2 ml d'hFGF-B, 0,5 ml de VEGF, 0,5 ml de R3-IGF-1, 0,5 ml d'acide ascorbique, 0,5 ml d'hEGF, 0,5 ml de GA- 1000 et 0,5 ml d'héparine, pour 500 ml de milieu. Elles peuvent être cultivées du premier jusqu'au sixième passage.
Lignées tumorales : Raji, NXS2, IMR32 et T84.
Les cellules du lymphome humain Raji et la lignée cellulaire du neuroblastome humain IMR32 proviennent de l'ATCC (Rockville, USA). Les cellules NXS2 du neuroblastome murin nous ont été fournies par le Pr. H. Lode (Charité Children' s Hospital, Berlin, Allemagne). Les cellules Raji sont ensemencées à raison de 0, 1 106 cellules/ml dans du milieu RPMI 1640 (Invitrogen) supplémenté de 10% de SVF inactivé, 2 mM de L-glutamine, 100 IU/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Les cellules IMR32 sont cultivées dans le même milieu mais sont ensemencées à raison de 2 104 cellules/cm2. Les cellules NXS2, ensemencées à raison de 2 104 cellules/cm2 sont maintenues dans du milieu DMEM contenant 4,5 g/1 de glucose (Sigma), 10% de SVF inactivé, 2 mM de L-glutamine, 100 IU/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Les cellules épithéliales T84 d'un adénocarcinome colique humain ont été fournies par le Dr. M. Neunlist (INSERM UMR913, Nantes). Elles sont ensemencées à une densité de 2 105 cellules/cm2 et cultivées dans du milieu DMEM/F12 (1 : 1, Gibco-BRL) avec 10% de SVF inactivé, 2 mM de L-glutamine, 100 IU/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine.
Réactifs utilisés.
L'anticorps monoclonal IgM de souris 1A4 dirigé contre le glycolipide neutre
Gb3 nous a été fourni gracieusement sous forme d'ascite par le Dr. J. Wiels (Institut Gustave Roussy, Villejuif, France). Il a été purifié par chromatographie d'affinité à l'aide d'une colonne de mannane (Pierce, Rockford, USA) et conditionné à 4 °C dans du PBS. L'anticorps monoclonal IgM de rat 38.13 anti-Gb3 et le contrôle isotypique de souris (clone 11E10) ont été obtenus sous forme purifiée chez Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA). L'anticorps contrôle « isotypique », étant conditionné dans une solution de borate 100 mM, il a été dialysé dans du PBS, puis filtré sur membrane 0,22 μηι. Les anticorps secondaires biotinylés de chèvre tels que les anticorps anti IgG + IgM (H+L) de souris, les anticorps anti IgG (H+L) de souris, les anticorps anti-μ de souris ont été fournis par Jackson Immunoresearch (Laboratories, WestGrove, PA, USA). Les anticorps de chèvre couplés à la peroxydase spécifiques de la chaîne μ de rat et les anticorps secondaires de chèvre biotinylés spécifiques des sous-classes de souris (FcYi, FcY2a, FcY2b, FcY3) proviennent du même fournisseur. Les anticorps de chèvre biotinylés spécifiques des chaînes légères (κ et λ) de souris ont été fournis par Southernbiotech (Birmingham, AL, USA). Ces anticorps ont été adsorbés contre des protéines de sérum humain, bovin ou de lapin. Le complexe streptavidine-R- phycoérythrine-(R-PE) a été obtenu chez Biosource (Camarillo, CA, USA), le complexe streptavidine-horseradish-peroxidase et le complexe streptavidine-FITC ont été obtenus chez Beckman Coulter.
Le mélange de glycosphingolipides neutres comportant le lactosylcéramide (LacCer), le galactosylcéramide (GalCer), le céramide trihexoside (Gb3) et le globoside (Gb4) ainsi que le Gb3 purifié ont été obtenus chez Matreya (Pleasant Gap, PA, USA). Ces glycolipides sont soit d'origine porcine (Gb3 et Gb4), soit d'origine bovine (LacCer et GalCer). Le Gb3 purifié a été redissout avec 1 ml d'un mélange chloroforme : méthanol (2 : 1 v/v) de façon à obtenir une concentration finale de 1 μg/μl . La sphingosine-1 -phosphate (S1P) a été obtenue chez Biomol International (Plymouth Meeting, PA, USA) et réhydratée (Morita et al. 2000) de façon à obtenir une concentration de 10 μΜ dans le diluant PET constitué de 5 % de polyéthylène glycol, 2,5 % d'éthanol et 0,8 % de Tween-80. Le mélange des marqueurs gangliosides standards (GMi, GDia, GDi , GTib) a été préparé au laboratoire par extraction des gangliosides du cerveau de rat, selon la technique décrite par Folch (Folch et al. 1951). 1.2. Extraction et purification des glycolipides.
Extraction des glycolipides totaux à partir de culots cellulaires.
Les glycolipides ont été extraits à partir de culots cellulaires selon la méthode de S. Ladish (Ladish et Li, 2000). Les cellules sont trypsinées, lavées deux fois dans du PBS pH 7,3 puis incubées à - 20 °C toute la nuit. Elles subissent ensuite une lyse hypotonique dans 1 ml d'eau distillée. Des aliquots sont alors prélevés et centrifugés à 15,000 g, 4 °C, pendant 15 mn afin d'éliminer les particules insolubles, les débris cellulaires et l'ADN. La concentration protéique des aliquots est alors déterminée par absorbance à 280 nm (Nanodrop ND-1000, Labtech, Palaiseau, France) dans le but de déposer sur une couche mince de silice une quantité de glycolipides correspondant à 0,5 - 2,5 mg d'équivalent protéique par échantillon. L'extraction des lipides des cellules lysées dans l'eau distillée est effectuée dans du chloroforme : méthanol (1 : 1, v/v ; 20 ml/109 cellules) pendant 18 heures sous agitation mécanique à température ambiante. Les échantillons sont ensuite centrifugés pendant 10 mn à 750 g, et les culots cellulaires de nouveau extraits pendant 4 h dans un volume additionnel de chloroforme : méthanol (1 : 1, v/v). Après évaporation du solvant organique contenant les glycolipide sous flux d'azote, on obtient l'extrait lipidique total.
Purification des glycolipides.
Première étape : partition DIPE/l-butanol. L'extrait lipidique total est redissout dans 5 ml d'un mélange organique contenant du DIPE/ 1-butanol (60 : 40, v/v). Des séries de vortex et de sonication (Diagenode's Bioruptor, Sparta, USA) sont alternées et répétées jusqu'à l'obtention d'une solution opalescente. En ajoutant et en mélangeant 2,5 ml d'une solution saline à 0, 1 % de NaCl, on obtient une partition après une centrifugation à 750 g pendant 10 mn à 4 °C. La phase organique supérieure contenant les lipides neutres et les phospholipides est recueillie à la pipette et peut être conservée à - 20 °C. La phase aqueuse inférieure et l'interface contenant les glycolipides acides et les glycolipides neutres les plus hydrophiles, sont de nouveau partitionnés avec un nouveau volume de DIPE/l-butanol (60 : 40, v/v). Les glycolipides contenus dans la phase aqueuse sont évaporés dans un speed-vac (Eppendorf, Hamburg, Germany). Deuxième étape : dessalage par gel filtration. Afin d'éliminer les sels et les contaminants tels que des protéines qui peuvent être co-extraites à ce stade, les résidus secs sont redissouts et vortexés dans 500 μΐ de solvant A (chloroforme : méthanol : H20 (30 : 60 : 8, v/v/v)) puis introduits dans une colonne de 10 ml de LH-20 Sephadex, 1 x 30 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède) pré-équilibrée avec du solvant A. Après ajout des glycolipides à dessaler, les 3 premiers ml de solvant A sont élués puis les 3 ml suivants sont récoltés en tant que fraction glycolipidique dessalée. Cette fraction est ensuite évaporée sous flux d'azote et conservée à - 20 °C. 1.3. Analyse des glycolipides par chromatographie sur couche mince de silice
(HPTLC).
Les glycolipides récupérés sont repris dans un petit volume de chloroforme : méthanol (1 : 2, v/v) de façon à déposer, à l'aide d'un automate de dépôt TLC ATS4 (Camag, Muttenz, Suisse) 2 à 2, 5 mg d'équivalent protéique par échantillon glycolipidique. Les glycolipides sont séparés sur des plaques HPTLC constituées d'un gel de silice 60 recouvrant une feuille d'aluminium (Merck, Darmstadt, Allemagne). Avant dépôt, ces plaques de silice sont soumises à une première migration dans une cuve en verre (Camag) renfermant un mélange de chloroforme : méthanol (1 : 1, v/v), afin de les débarrasser d'éventuels contaminants. Après dépôt des glycolipides, un premier système de migration constitué du solvant chloroforme : méthanol (2 : 1, v/v) permet de faire migrer et d'éliminer les lipides très apolaires qui peuvent être co-extraits et qui peuvent gêner la séparation des glycolipides d'intérêt. Ces derniers sont ensuite séparés lors d'un dernier développement dans une cuve saturée pendant 4 h avec 70 ml de chloroforme : méthanol : 0,2% CaCl2 aqueux (55 : 45 : 10, v/v/v). Les bandes sont révélées chimiquement à 150 °C après pulvérisation de la plaque avec une solution d'orcinol préalablement préparée par dissolution de 0,2 g d'orcinol (Sigma- Al drich, Saint-Louis, USA) dans 40 ml d'eau distillée et 10 ml d'acide sulfurique. Ce réactif permet la visualisation de bandes violettes caractéristiques de la présence de résidus glycosylés. Les glycolipides peuvent ensuite être quantifiés par un logiciel de densitométrie ImageQuant5'2 (GE Healthcare, Waukesha, USA).
1.4. Immunofixation des glycolipides séparés par HPTLC (iTLC).
La spécificité des anticorps peut être déterminée sur des glycolipides séparés par HPTLC. Après séparation par chromatographie des glycolipides pour lesquels on dépose 2 à 2,5 mg d'équivalent protéique par échantillon révélé à l'orcinol et 0,5 mg d'équivalent protéique pour les échantillons qui seront marqués par les anticorps, les plaques HPTLC sont découpées en bandelettes et plastifiées par incubation pendant 1 mn dans du poly-isobutyl-méthacrylate 0, 1 % dissous dans l'hexane, puis saturées à température ambiante pendant 1 heure avec du PBS- BSA 1 %. Les bandelettes sont ensuite incubées toute la nuit à 4 °C avec les anticorps (soit directement incubées avec les surnageants d'hybridomes soit incubées avec 5 μg/ml d'anticorps purifié dilué dans du PBS-BSA 0, 1 %). Après trois lavages avec du PBS, la fixation de l'anticorps est détectée par deux étapes d'incubation successive, une première étape d'incubation d' 1 h à température ambiante des anticorps secondaires biotinylés (dilués au 1 : 2000 dans du PBS-BSA 0, 1 %), suivie de l'incubation du complexe streptavidine-horseradish- peroxidase, dilué au 1 : 2000 pendant 1 h à température ambiante. Après plusieurs lavages avec du PBS, la peroxydase liée est révélée par une solution de 4-chloro-l- naphtol (Sigma) qui est préparée extemporanément à raison de 1 mg de produit dissous dans 1 ml de méthanol, repris dans 20 ml de PBS et additionné de 30 μΐ d'eau oxygénée 30 volumes. 1.5. Analyse de la spécificité des anticorps par test immunoenzymatique
(ELISA) sur cellules dessiquées en plaque de microtitration à 96 puits.
Les plaques de cellules dessiquées ont été préparées de la manière suivante. Les cellules sont trypsinées et lavées trois fois avec du PBS froid, puis diluées de façon à obtenir une concentration cellulaire de 2 106 cellules/ml. On dépose alors 50 μΐ de cette suspension au fond de chacun des 96 puits d'une plaque de microtitration Immuno-Plate (Nunc, Maxisorp®, Danemark). Après dessiccation des cellules toute la nuit dans une étuve à 37 °C, les plaques sont soit utilisées immédiatement, soit conservées à température ambiante pendant plusieurs mois sous aluminium.
Après lavage des cellules dessiquées avec du PB S et blocage des sites d'interaction non-spécifiques avec du PBS-BSA 1 % pendant 1 h à température ambiante sous agitation lente, les anticorps dilués dans du PBS-BSA 0, 1 % (10 μg/ml de concentration initiale) sont déposés dans chacun des puits en triplicatas, à raison d'un volume de 100 μΐ d'anticorps suivant une gamme de dilution de 1 : 256. Les plaques sont incubées pendant 2 h à température ambiante puis lavées trois fois avec du PBS. La fixation de l'anticorps est détectée successivement par une première incubation d' 1 h à température ambiante avec les anticorps secondaires biotinylés (dilués au 1 : 4000 dans du PBS-BSA 0, 1 %), puis après lavage, par l'incubation du complexe streptavidine- horseradish-peroxidase (dilué au 1 : 4000, 1 h à température ambiante). Après plusieurs lavages avec du PBS, la fixation de la peroxydase est révélée par une solution d'ABTS (Merck) qui laisse apparaître une coloration verte progressive. La réaction peut alors être bloquée par l'addition de SDS 10%. La mesure de la densité optique est déterminée par une lecture de la plaque au spectrophotomètre à 405 nm (lecteur Multiskan Thermo Electron, Illkirch, France).
1.6. Etude du marquage cellulaire par immunofluorescence en cytométrie de flux. Pour détecter les antigènes de surface cellulaire par cytométrie de flux, les cellules sont trypsinées et lavées deux fois dans du PBS froid contenant 2,5 % de SVF décomplémenté (PBSF). Elles sont ensuite reprises dans du PBSF et déposées, à raison de 4 105 cellules par puits d'une plaque à fond conique (Nunc, Danemark). La plaque est centrifugée à 750 g pendant 1 mn afin d'éliminer le surnageant puis les sites de liaison non spécifiques sont bloqués par une incubation de 30 mn directement sur glace avec 5 % de sérum humain, préalablement filtré (0,22 μιη) et décomplémenté à 56 °C pendant 45 mn (donneurs de l'EFS, Nantes). Les cellules sont ensuite directement incubées avec 100 μΐ d'anticorps primaires dilués à 10 μg/ml dans du PBSF pendant 45 mn sur glace. Après incubation, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS froid, puis fixées au paraformaldéhyde 4 % (Electron Mi croscopy Science, Washington, USA) dans du PB S, sur glace pendant 1 5 mn, afin d' empêcher l ' internalisation des complexes « antigènes-anticorps » . Après troi s l avages au PB S, l a fixati on de l'anticorps est détectée d'abord par une incubation de 30 mn sur glace des anticorps secondaires biotinylés (dilués au 1 : 400 dans du PBSF) suivie de lavages puis de l'incubation du complexe streptavidine-phycoérythrine (dilué au 1 : 400, 30 mn sur glace). Après plusieurs lavages avec du PBS, la détermination de la distribution et de l'intensité de la fluorescence des cellules (1 105 cellules) est effectuée à l'aide d'un cytomètre de flux FAC SCalibur et du logiciel d' exécution Cell Quest Pro (BD Biosciences, San José, Etats-Unis). 1.7. Localisation cellulaire du Gb3 par immunocytochimie.
Les cellules sont préalablement ensemencées dans leur milieu de culture sur des lamelles de verre de 14 mm de diamètre (Thermo Scientific, Hudson, USA) dans une plaque de 24 puits, 24 à 48 h avant le marquage, à raison de 2 105 cellules/cm2. Le blocage des sites non-spécifiques est réalisé par l'incubation sur glace de 5 % de sérum humain inactivé puis les cellules sont incubées avec les anticorps dilués à 40 μg/ml dans du PBSF pendant 45 mn sur glace. Après le marquage, les cellules sont lavées 3 fois avec du PBS froid, puis fixées au paraformaldéhyde 4% sur glace pendant 15 mn. Les cellules sont de nouveau lavées 3 fois au PBS et la fixation de l'anticorps est détectée d'abord par une incubation de 30 mn sur glace des anticorps secondaires biotinylés (dilués au 1 : 400 dans du PBSF) suivie de 30 mn d'incubation sur glace du complexe streptavidine-FITC (dilué au 1 : 400). Après marquage de la membrane cellulaire, les noyaux sont marqués pendant 15-20 mn à température ambiante, au Drag5 (Biostatus, Leicestershire, Royaume-Uni) dilué au 1 : 1000 dans du PBS. Le montage des lames est réalisé dans du milieu Fluoromount-G (Southernbiotech, Birmingham, AL, USA) et le marquage cellulaire est observé au microscope confocal TCS-SP1 (Leica, Mannheim, Allemagne, plate-forme PICell, IFR 26, Inserm, Nantes) à un grossissement de 63 X.
1.8. Analyse de la distribution du Gb3 par immunohistochimie sur des coupes de tumeurs congelées.
Les souris sont élevées à l'animalerie de l'unité INSERM U892 (sous le contrôle de l 'AFSTAL, association Française des Sciences et Techniques de l'Animal de Laboratoire).
Des cellules Raji et des cellules IMR32 (2,5 105 cellules) diluées au 1 : 2 dans du Matrigel hautement concentré en facteurs de croissance (BD Biosciences, Bedford, USA) ont été injectées par voie sous-cutanée sur le flanc de souris Balb/c@BYJ Rj âgées de 12 semaines (Janvier, St Berthevin, France). Les souris ont été sacrifiées par élongation dès l'apparition de petits capillaires sanguins sur les tumeurs xénogreffées. Directement après excision, les tumeurs ont été pré-immergées dans l'isopentane puis plongées quelques secondes dans de l'azote liquide pour être conservées à - 80 °C. Des coupes congelées de 5 μπι réalisées au cryostat Leica CM- 1900 (plateforme de morphologie de l'IFR 26, Inserm, Nantes) ont été déposées sur des lames Starfrost (Knittel Glàser, Braunschweig, Allemagne) . Elles sont ensuite traitées par réchauffement à température ambiante pendant 30 mn, fixées dans l'acétone froid pendant 10 mn, séchées à l'air pendant 30 mn et lavées dans du PBS, avant de passer à la procédure de coloration. Tout d'abord, les sites de liaison non spécifiques sont bloqués avec le réactif de blocage du Kit MOM (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Les coupes congelées sont incubées successivement avec 50 μg/ml d'anticorps anti-Gb3 ou d'anticorps contrôle « isotypique » IgM de souris (clone 1 1E10) pendant 1 h à température ambiante, puis incubées après plusieurs lavages au PB S, avec l'anticorps secondaire biotinylé de chèvre anti-IgM de souris, dilué au 1 : 100. La détection s'effectue à l'aide d'un substrat chromogénique. Les coupes sont incubées pendant 30 mn avec le réactif VECTASTAIN® Elite ABC (Vector Laboratories). L'activité peroxydase est détectée avec le substrat DAB® Menarini Kit (Rungis, France) dilué au 1 : 50, qui entraîne le dépôt d'un pigment brun. Les coupes sont ensuite contre- colorées à l'hématoxyline et observées à un grossissement de 40 X avec un microscope DM IRB (Leica). 1.9. Obtention de l'anticorps 3E2 (IgM. κ) anti-Gb3.
Protocole d'immunisation des souris et hybridation somatique.
Cinq souris Balb/c@BYJ Rj, âgées de 6 semaines, ont été immunisées avec des cellules HMVEC-L préalablement co-cultivées avec les cellules d'adénocarcinome colique humain T84 par le biais de membranes permettant l'échange de facteurs solubles entre les deux compartiments cellulaires (Gaugler et al. 2007). Les cellules HMVEC-L ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits à raison de 5 104 cellules/cm2 dans leur milieu de culture EGM®-2 MV. Trois jours plus tard, alors que les cellules endothéliales étaient toujours en prolifération, les cellules T84 (1 105 cellules/cm2) ont été ensemencées dans leur milieu de culture DMEM : F 12, sur la membrane poreuse filtrante (pores de 0,4 mm) d'un insert Transwell 6-well Transwell- Clear (Corning, Pays-Bas) pendant 72 heures. Les cellules FDVIVEC-L ont ensuite été trypsinées, lavées dans du PBS, fixées avec 4 % de paraformaldéhyde et conservées à 4 °C dans de l'adjuvant incomplet de Freund (Sigma, Saint-Louis, USA). Au total, les souris ont reçu par voie intra-péritonéale, cinq injections aux semaines 0, 8, 10, 32, et 60 de 2, 1-2,8 106 cellules HMVEC-L préalablement co-cultivées ainsi qu'une dose de rappel à 65 semaines de 1,5 106 cellules (conservées dans du PBS sans adjuvant), 6 jours avant leur sacrifice. La cinétique de la réponse humorale des souris a été analysée durant la période d'immunisation par des tests ELIS A réalisés sur des cellules HMVEC- L dessiquées mais également sur des cellules HMEC-1 dessiquées afin d'envisager l'utilisation de ces cellules transformées pour les études de criblage des anticorps. Une fois la réponse anti-anticorps positive, les splénocytes de souris ont été fusionnés aux cellules de myélome murin SP2/0 selon un rapport de fusion de 5/1 : 2,5 10 splénocytes ont été fusionnés avec du polyéthylène glycol (PEG 1500, Sigma) à 0,5 108 cellules de myélome murin SP2/0 (cultivées dans du RPMI 1640). A l'issu de la fusion, les cellules ont été reprises dans 200 ml de milieu RPMI 1640 supplémenté de 20 % de SVF inactivé, de 2 mM de L-glutamine, de milieu hypoxanthine-aminoptérine- thymidine HAT IX (Sigma-Aldrich) et ensemencées à raison de 100 μΐ dans 35 microplaques de 96 puits. Au bout de 15 jours, les premiers hybridomes étaient visibles et pouvaient être amplifiés dans des microplaques de 12 puits dans du milieu RPMI 1640 supplémenté avec 20 % de sérum inactivé, 2 mM de L-glutamine, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Les surnageants de ces hybridomes ont tous été prélevés en vue du criblage et conservés à 4°C et tous les hybridomes ont été repris dans du SVF contenant 10 % de diméthylsulphoxide, pour être conservés à - 80 °C. Le schéma de la génération des anticorps est récapitulé dans la Figure 2. Clonage et purification des anticorps.
Clonage des anticorps. Les hybridomes sélectionnés ont été clonés par la méthode de dilution limite (Fig. 3). Chaque clone obtenu a ensuite été de nouveau testé en ELISA à l'aide des anticorps de détection anti IgG+IgM, puis l'isotype des anticorps monoclonaux positifs a été déterminé grâce à des anticorps de détection anti-isotype (μ, γΐ, y2a, y2b et γ3) et anti-chaîne légère (κ et λ).
Purification des anticorps par chromatographie d' affinité. Les anticorps sélectionnés ont ensuite été purifiés selon le protocole du fournisseur en utilisant une colonne de 5 ml de protéine L (Pierce, Rockford, USA) qui possède une affinité pour les chaînes légères « kappa » des immunoglobulines. Le surnageant des hybridomes a été dilué avec une solution de Tris-HCl 0, 1 M, pH 7.8 (dilution 1 : 1), filtré sur 0.22 μπι puis passé lentement sur la colonne. Les protéines liées de façon non-spécifique ont été éliminées par 5 volumes de PBS. Les anticorps sont recueillis par une élution avec une solution tampon de glycine-HCl à 0.1 M, pH 2.5 et l' éluat est neutralisé avec une solution tampon de Tris 0, 1 M, pH 9. Les éluats sont sélectionnés après mesure de l'absorbance à 280 nm (Nanodrop) et regroupés pour être dialysés dans du PBS, filtrés sur 0,22 μπι et conservés à 4 °C. Le degré de pureté des anticorps est apprécié par une analyse électrophorétique en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) soit réductrices avec 12 % d'acrylamide (375 mM de Tris pH 8,8, SDS 0, 1%, APS 0, 1%, TEMED), soit non-réductrices avec 6 % d'acrylamide. La migration sur le gel est effectuée avec 5 μg d'anticorps par condition, à 90 V pendant lh45 dans du tampon Tris-Glycine- SDS (Biorad, Hercules, USA). Le profil électrophorétique est détecté par coloration au Bleu de Coomassie.
1.10. Détermination des constantes d'affinité de l'anticorps 3E2 anti-Gb3.
Les anticorps sont tout d'abord marqués à l'iode 125 en présence d'un oxydant, l'iodogène. Dans un tube de verre dont la paroi a été traitée par 10 μg d'iodogène dans un volume de 100 μΐ, on dépose 200 μg d'anticorps 3E2 anti-Gb3, puis le tube est complété avec 100 μΐ de tampon phosphate à 0, 1 M, pH 7,2. L'iode 125 (Perkin Elmer, Waltham, USA) est ajouté de façon à obtenir une activité de 1 μCi/μg d'anticorps, soit 200 μθ d'activité. Le mélange réactionnel est incubé pendant 30 mn sous agitation lente à température ambiante. Après incubation, la pureté de l'anticorps radiomarqué a été contrôlée par une analyse chromatographique sur couche mince. Pour cela, 2 μΐ du mélange réactionnel ont été déposés sur une bandelette ITLC-SG (PALL Science, Iris Parkway, USA). En migrant dans de l'acide trichloroacétique à 10 %, l'125 I libre se sépare de l' 125 1 liée à l'anticorps. On peut ainsi évaluer le taux d'anticorps marqué qui doit être supérieur à 90% et qui peut être renforcé par une purification sur une colonne NAP-5 TM (GE Healthcare, Waukesha, USA) et être de nouveau évalué par chromatographie sur couche mince ITLC-SG.
Une fois l'anticorps 3E2 radiomarqué, le nombre de sites antigéniques Gb3 a été déterminé selon la technique de Scatchard, sur les lignées de lymphome Raji et sur les cellules endothéliales HMEC-1. Pour les cellules HMEC-1 , le nombre de sites antigéniques a notamment été évalué après 24 h d'incubation en milieu appauvri (milieu MCDB 131 supplémenté avec 0, 1% de SVF décomplémenté, 2 mg/ml d'hydrocortisone, 2 mM de L-glutamine, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine) et après 24 h d'incubation en milieu complet (milieu MCDB 131 supplémenté avec 15% de SVF décomplémenté, 10 ng/ml d'EGF, 2 mg/ml d'hydrocortisone, 2 mM de L- glutamine, 100 Ul/ml de pénicilline et 100 mg/ml de streptomycine). En bref, dans un plaque de 96 puits à fond rond, 2,5 105 cellules ont été mises en présence des anticorps préalablement radiomarqués, et dilués de demi en demi, de 555 nM à 0, 13 nM (n=3). Parallèlement, des puits contenant un mélange de 500 nM d'anticorps froid avec 5 nM d'anticorps radiomarqué, dilués quatre fois de demi en demi, servent à déterminer la fixation non spécifique. Le mélange réactionnel a été incubé à 4 °C sous agitation pendant 1 h, puis 50 μΐ de ce mélange ont été ajoutés dans des tubes de Scatchard (Sarstedt, Numbrecht, Allemagne) renfermant 200 μΐ d'une solution de séparation composée de 10 % de paraffine et de 90 % de dibutylphtalate. Après une centrifugation à 15,000 g pendant 3 minutes, les tubes sont plongés dans l'azote liquide, sectionnés en deux parties pour être aussitôt placés dans des tubes à hémolyse pour le comptage radioactif. L'extrémité inférieure contenant les cellules constitue la fraction liée et l' extrémité supérieure contenant le surnageant constitue la fraction non liée. Les mesures sont effectuées au compteur γ (Compteur 1480 Wizard 3, Perkin Elmer, Finlande) et les résultats sont analysés avec le logiciel GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). 1.11. Propriétés biologiques de l'anticorps 3E2.
Test de viabilité cellulaire au MTT.
Le test au MTT (Mosmann, 1983) est basé sur la transformation du MTT (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide) en cristaux bleus de formazan par une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase. Les cristaux de formazan formés par les cellules sont solubilisés chimiquement et détectés par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 570 nm. On utilise ainsi ce test pour comparer la viabilité de cellules témoins à celle de cellules traitées par des molécules.
Brièvement, le test est réalisé dans des plaques de 24 puits avec des cellules ensemencées à une densité de 2 104 cellules/cm2. Les cellules adhérentes comme les cellules HMEC-1 et NXS2, sont incubées, 12 heures après leur ensemencement, avec les anticorps primaires préalablement dilués dans 300 μΐ de milieu complet pour donner une concentration finale de 100, 60, 40, 20, 10 et 0 μg/ml (n=3). Les cellules Raji en suspension sont ensemencées directement dans le milieu de culture contenant les anticorps (n=3). Elles sont alors incubées pendant 24 heures à 37 °C, 5 % de C02. On aj oute ensuite 500 μg/puits de la solution stock de MTT (Roche, Mannheim, Allemagne) et les cellules sont maintenues à 37 °C pendant 4 h, afin de permettre la synthèse des cri staux de formazan. On aj oute 100 μΐ/puits de la solution de solubilisation (SDS à 10 % dans de l'HCl 10 mM). Après une incubation d'une nuit à 37 °C, la lecture des plaques est effectuée avec un lecteur Multiskan (Thermo Electron, Illkirch, France) en mesurant l'absorbance à 570 nm et, pour le bruit de fond, à 650 nm. Etude vidéo-cinétique.
Les cellules HMEC-1 ont été ensemencées dans une microplaque de 24 puits à raison de 2 105 cellules/cm2 puis ont été maintenues pendant 12 heures dans leur milieu complet à 37 °C, 5 % de C02. Les anticorps 3E2 et le contrôle isotypique ont ensuite été dilués à 20 μg/ml dans du milieu de culture complet et incubés avec les cellules, en triplicatas. Immédiatement après incubation, des images numériques ont été enregistrées pendant 24 à 72 h dans le but de produire un film accéléré (Leica, DMI6000B / plateforme PICell). Les observations ont porté sur le nombre de cellules par intervalle de temps, le taux de cellules en division par intervalle de temps et le temps de division des cellules (moyenne des observations de trois puits différents). Tests des anneaux aortiques.
Des souris C57bl6 âgées de 4 semaines ont été fournies par l'élevage Janvier (St Berthevin, France). Les aortes abdominales ont été isolées lorsque les souris étaient âgées de 6 à 8 semaines. Elles ont ensuite été nettoyées dans du milieu MCDB 131 complet et découpées en sections transversales de 0,5 à 1 mm de largeur. Ces anneaux ont ensuite été déposés au fond des puits d'une microplaque de 96 puits préalablement traités avec 30 μΐ de Matrigel (ECM Gel, Sigma- Al drich, Saint-Louis, USA) dilué au demi dans du PB S. Les anneaux ont ensuite été recouverts avec 20 μΐ de Matrigel non dilué puis maintenus pendant 5 jours à 37 °C, 5 % de C02 dans du milieu complet contenant 0, 20 et 40 μg/ml d'anticorps. Le milieu de culture avec ou sans anticorps a été renouvelé tous les 2 j ours. A l'issue de 5 j ours d'incubation, la formation de bourgeons vasculaires a été observée par microscopie (Microscope DM IRB, Leica). Afin d'établir une mesure obj ective de la formation de ces bourgeons, nous avons demandé à un jury de 5 personnes de participer de façon indépendante à une notation en aveugle des images des anneaux aortiques enregistrées au grossissement 10 X et nous leur avons demandé d'attribuer à chacune des images, un score, fondé sur le nombre, la longueur et la densité de microvaisseaux formés (échelle de 0 à 5, la valeur minimale de 0 correspondant à l'absence de bourgeons), afin d'évaluer l'activité anti-angiogénique des anticorps.
Evaluation de l'activité cytotoxique en présence de complément.
L'activité CDC est mesurée par cytométrie de flux à l' aide d'une solution d'iodure de propidium (IP) capable d'incorporer l'ADN des cellules. Les cellules sont trypsinées, reprises dans du milieu de culture, puis disposées dans des plaques de 96 puits à fond conique (Nunc, Danemark) à raison de 0,2 106 cellules/puits. Les plaques sont ensuite centrifugées afin d'éliminer le surnageant, et les cellules sont incubées avec les anticorps pour donner une concentration finale de 0, 1 à 10 μg/ml. Du sérum frais filtré est recueilli 24 h après le prélèvement sanguin en l'absence d'anti-coagulant. Une fraction est décomplémentée à 56 °C pendant 45 mn, filtrée de nouveau puis conservée à 4 °C. On ajoute ensuite du sérum humain qui représente 1 : 5 du volume final, soit sous sa forme décomplémentée, soit sous sa forme non-décomplémentée. Les plaques contenant les cellules, les anticorps et le sérum sont ensuite incubées pendant 2 h à 37 °C, 5 % de C02. Les culots cellulaires sont ensuite collectés par une centrifugation brève de la plaque et les cellules reprises avec 0,6 μg d'une solution d'iodure de propidium dans un volume de 100 μΐ. Après une incubation de 30 mn à 37 °C à l'abri de la lumière, les cellules sont analysées directement à l'aide du cytomètre à raison de 1.105 cellules par analyse. 1.12. Séquençage nucléotidique des régions variables des chaînes lourdes et légères des anticorps anti-Gb3.
Extraction de l'ARN total.
L' ARN total des hybridomes de souris a été extrait selon la méthode décrite par Chomczynski et Sacchi (Chomczynski et Sacchi, 1987) avec le réactif RNAble® (Eurobio, Les Ulis, France). Les cellules sont homogénéisées dans une solution dénaturante contenant de l'isothiocyanate de guanidinium et du phénol. Les acides nucléiques sont dénaturés, les protéines dissociées grâce à la formation de complexes entre l'ARN et l'isothiocyanate de guanidine qui permet de rompre les interactions hydrophiles entre l'ADN et les protéines. Ainsi l'ADN et les protéines sont extraits de la phase aqueuse alors que l ' ARN reste dans cette phase. Le culot cellulaire d' hybridomes (10 106 cellules) est lavé deux fois dans du PB S puis repris dans 2 ml de RNAble . Les cellules sont lysées par pipetages répétés afin de dissocier les complexes nucléoprotéiques. Après l'ajout de 0,2 ml de chloroforme, l'homogénat est mélangé vigoureusement pendant 15-30 secondes. Cette étape permet de séparer par solubilisation différentielle les acides nucléiques (les ARN étant insolubles dans le phénol) des protéines. Le mélange est incubé sur de la glace pendant 5 mn, puis centrifugé pendant 15 mn à 12,000 g à 4 °C. La phase aqueuse contenant les ARN est prélevée puis transférée dans un microtube. Une fois précipités par 2 ml d'isopropanol pendant 10 mn à température ambiante, ils sont récupérés par centrifugation à 12,000 g pendant 5 mn à 4 °C, puis lavés deux fois avec 1 ml d'une solution d'éthanol 75 % (v/v), séchés à l'air et repris dans 15 μΐ d'H20-DEPC 0, 1 % (eau traitée au préalable contre les ribonucléases par le diéthyl pyrocarbonate). La concentration en ARN est déterminée par spectrophotométrie en mesurant l'absorbance à 260 nm d'un aliquot ainsi que sa pureté à 280 nm par le rapport des absorbances à 260 nm/280 nm pour une valeur d'environ 2. Les ARN ainsi extraits sont soit conservés à - 80 °C, soit directement traités à la DNAse.
Traitement à la DNAse 1.
Afin d'éliminer toute trace d'ADN génomique, on procède par un traitement à la DNAse suivant le protocole du fournisseur. La réaction est réalisée dans un volume final de 10 μΐ comprenant 2 μg d'ARN totaux, une solution tampon de réaction Tris- HC1 20 mM, pH 8,4, MgCl2 2 mM, KC1 50 mM, et 1 U de DNAse 1 (Sigma, St- Quentin-Favier, France). Après une incubation de 15 mn à température ambiante, la DNAse est inactivée par l'addition d' 1 μΐ d'une solution d'EDTA à 25 mM, suivie d'une incubation à 65 °C pendant 10 mn. Les ARN traités peuvent également être conservés à - 80 °C, ou bien être directement soumis à une étape de transcription inverse.
Synthèse de l'ADN complémentaire.
Une rétro-transcription suivie d'une polymérisation permet de stabiliser l'ARN simple brin en ADN complémentaire (ADNc). Les ADNc sont synthétisés à partir de 0,2 μg d' ARN dans un volume final de 40 μΐ . Selon le protocole du fournisseur (Invitrogen), les ARN totaux sont dénaturés par une incubation à 65 °C pendant 5 mn en présence de 500 ng d'oligonucléotides poly-(dT)i2-is et d' 1 nM de chaque dNTP dans 12 μΐ d'H20wg QSP- Après incubation, les ARN sont placés rapidement sur glace afin d'empêcher le repliement de leurs structures secondaires, puis sont ajoutés 14 μΐ de milieu réactionnel composé de tampon de réaction (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KC1 375 mM, MgCl2 15mM), DTT 0,2 μΜ, 40 U de RNaseOUT® et 200 U de M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase). Après 50 mn d'incubation à 37 °C, la réaction est arrêtée par 15 mn d'incubation à 70 °C. Les ADNc ainsi obtenus peuvent être conservés à - 20 °C ou directement amplifiés par PCR.
Amplification des ADN VH et VL par PCR.
Les amplifications géniques par PCR des ADN VH et VL sont effectuées au moyen de couples d'oligonucléotides spécifiques décrits dans le tableau 4 (Clackson et al. 1991, Lefranc et Lefranc, 1997). Du côté 5', les oligonucléotides s'hybrident à la région FR1 et du côté 3', aux différents segments ½ ou JL.
Tableau 4. Amorces utilisées pour l'amplification des régions variables des segments géniques VH et VL des anticorps monoclonaux de souris.
A - Amorces VH
Amorces VH back (22-mer)
VH1 A back 5' - AGG TGC AGC TTC AGG AGT CAG G - 3' SEQ ID NO : 71 VH1 B back 5' - AGG TGC AGC TAG AGG AGT CAG G - 3' SEQ ID NO : 72 VH2 A back 5' - AGG TCC AGC TGC AGC AGT CAT G - 3' SEQ ID NO : 73 VH2 B back 5' - AGG TCC ACC TGC AGC AGC CTG G - 3' SEQ ID NO : 74 VH2 C back 5' - AGG TCC AGC TGC AGC AGT CTG G - 3' SEQ ID NO : 75 VLB A back 5' - AGG TGA AGC TGG TGG AGT CTG G - 3' SEQ ID NO : 76 VLB B back 5' - AGG TGA AGC TTC TCG AGT CTG G - 3' SEQ ID NO : 77 VLB C back 5' - AAG TGA AGC TTG AGG AGT CTG G - 3' SEQ ID NO : 78 VLB D back 5' - AAG TGA TGC TGG TGG AGT CGT G - 3' SEQ ID NO : 79 VH5 back 5' - AGG TTC AGC TCC AGC AGT CTG G - 3' SEQ ID NO : 80
Amorces JH for (24-mer)
JH1 for 5' - TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC - 3' SEQ ID NO : 81 JH2 for 5' - TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT GCC - 3' SEQ ID NO : 82 JH3 for 5' - TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT CCC - 3' SEQ ID NO : 83 JH4 for 5' - TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT TCC - 3' SEQ ID NO : 84 B - Amorces VK
Amorces VK back (24-mer)
VKA back 5 ' - GAT GTT TTG ATG ACC CAA ACT CCA - 3 ' SEQ ID NO : 85 VKB back 5 ' - GAT ATT GTG ATA ACC CAG GAT GAA - 3 ' SEQ ID NO : 86 VKC back 5 ' - GAC ATT GTG CTA/G ACC CAA/G TCT CCA - 3 ' SEQ ID NO : 87 VKD back 5 ' - GAC ATC CAG ATG AC(N) CAG TCT CCA - 3 ' SEQ ID NO : 88 VKE back 5' - CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA - 3 ' SEQ ID NO : 89 VKF back 5' - GAA AAT GTG CTC ACC CAG TCT CCA - 3 ' SEQ ID NO : 90
Amorces JK for (24-mer)
JKI for 5 ' - CCG TTT GAT CAG CTT GGT GCC - 3 ' SEQ ID NO : 91
JK2 for 5 ' - CCG TTT TAT TTC CAG CTT GGT CCC - 3 ' SEQ ID NO : 92
JK3 for 5 ' - CCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC - 3 ' SEQ ID NO : 93
JK4 for 5 ' - CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC - 3 ' SEQ ID NO : 94
Les conditions d'amplification par PCR, spécifiques à chaque hybridome sont décrites dans le tableau 5 (Lefranc et Lefranc, 1997).
Tableau 5. Conditions expérimentales d'amplification par PCR des ADN VH et
VL de souris.
Type Amorces Amorces Conditions d'amplification VH ou VK JH ou JK de PCR
back for
VH a VH1 A, VH1 JH1, JH2, 94°C, 50s
B JH3, JH4 60°C, 90s
72°C, 90s b VH2 A, VH2 JH1, JH2, 94°C, 50s
B, JH3, JH4 60°C, 120s
VH2 C, VH5 72°C, 120s c VH3 A, VH3 JH1, JH2, 94°C, 50s
B JH3, JH4 65°C, 90s
72°C, 90s d VH3 C , VH3 JH1, JH2, 94°C, 60s
D JH3, JH4 55°C, 120s
72°C, 120s
VL e VKA, VKB, JKI , JK2, 94°C, 90s
VKE, VKF JK3, JK4 60°C, 90s
72°C, 90s f VKC, VKD JKI , JK2, 94°C, 50s
JK3, JK4 65°C, 90s
72°C, 90s Le tableau 5 propose quatre conditions d'amplification différentes pour l'amplification des régions variables de la chaîne lourde (a, b, c et d) et deux conditions différentes pour l'amplification des régions variables de la chaîne légère (e et f). Pour chacune des conditions, il existe des mélanges d'amorces qui s'hybrident du côté 5'(amorces back) et 3'(amorces forward). Afin de réaliser le séquençage des régions variables des chaînes lourdes et légères, nous avons dans un premier temps identifié par PCR la condition (a, b, c et d, e et f) qui permettait une amplification optimale des ADN VH et VL puis, nous avons, dans un deuxième temps, identifié par PCR l'amorce back qui permettait la meilleure amplification.
Toutes les réactions PCR ont été effectuées dans un volume final de 25 μΐ contenant 1 μΐ d'ADNc, chaque amorce (10 pM), chaque dNTP (10 nM), du MgCl2 (62,5 nM), du tampon de réaction, 5 U de GoTaq® DNA polymérase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et de VH2 mQ 25 μΐ qsp. Trente cycles d'amplification (Gene-Amp® PCR System 2700, Applied Biosystem, Courtaboeuf, France) ont été réalisés après une étape de dénaturation de 94 °C pendant 5 mn. Chacun des cycles comportait une étape de 10 mn à 72 °C pour terminer la synthèse des brins d'ADN. Les produits d'amplification ont ensuite été visualisés sur un gel d'agarose 1% (QA- Agarose-TM, MP Biomedicals, Strasbourg, France) contenant 0, 1 % de GelRed™ (FluoProbes, Montluçon, France).
Pour chaque hybridome, trois extractions d'ARN indépendantes et trois amplifications PCR indépendantes ont été effectuées dans le but de réaliser trois séquençages indépendants des régions variables des chaînes lourdes et légères. Les conditions d'amplification choisies pour chaque hybridome sont répertoriées dans le tableau 5.
Séquençage nucléotidique.
Le séquençage nucléotidique a été réalisé par la plateforme de « Séquençage ADN et Génotypage » de l'IFR 26 de l'Université de Nantes, selon la méthode de Sanger (Sanger et al. 1977) avec un séquenceur AB3730 de 48 capillaires (Applied Biosystems). Pour chaque séquençage, il a été utilisé 1 μΐ d' amorce back appropriée (Tableau 6) et 5 μΐ de produit de PCR VH OU VL. Les produits de PCR ont été purifiés par le procédé ExoSAP-IT (Amersham GE Healthcare) qui permet, sous l'action d'une enzyme de dégrader les fragments simples brins inférieurs à 100 pb et d'éliminer les amorces nucléotidiques et les dNTP en excès.
Tableau 6. Amorces back utilisées pour le séquençage nucléotidique.
Les trois séquençages indépendants réalisés à partir de trois extractions d'ARN différentes nous ont permis de comparer et de déterminer les séquences exactes des régions variables des chaînes lourdes et légères de chaque hybridome. Les séquences nucléotidiques obtenues ont été ensuite alignées avec les données de la banque IMGT (International Immunogenetics Information System®, http : //www.imgt.org) afi n d'étudier le répertoire de gènes VH et VL utilisés chez la souris.
EXEMPLE 2. Recherche de marqueurs glycolipidiques des cellules endothéliales en cours d'angiogénèse
Afin de rechercher des marqueurs glycolipidiques des cellules endothéliales intra-tumorales, nous avons étudié le polymorphisme glycolipidique de ces cellules en fonction de différents stimuli. Les cellules HMEC-1 ont été transformées par le virus SV40, de façon à les rendre plus facilement utilisables en culture tout en leur permettant de conserver leurs caractéristiques de cellules endothéliales microvasculaires. Elles ont ensuite été placées dans différentes conditions de culture proches des stimulis que les cellules endothéliales peuvent subir dans un micro-environnement tumoral, qui comporte l'envoi par la tumeur de signaux chimiques comme des facteurs de croissance qui vont induire leur prolifération. Nous avons ainsi comparé les profils d'expression glycolipidique de cellules HMEC-1 en prolifération ou à l'état de confluence, incubées en milieu complet ou en milieu appauvri (en sérum et en facteur de croissance), ou incubées ou non avec un facteur pro-angiogénique, la sphingosine-1 -phosphate. L'estimation des proportions des différents glycolipides a pu ensuite être réalisée par densitométrie (ImageQuant 5'2).
2.1. Résultats : Mise en évidence d'un polymorphisme d'expression glycolipidique des cellules endothéliales HMEC-1
Nous avons cherché à mettre en évidence un polymorphisme d'expression des cellules endothéliales en fonction de différentes conditions, pour rechercher la présence de nouveaux marqueurs glycolipidiques et/ou la présence de glycolipides surexprimés. Nous avons ainsi comparé l'expression glycolipidique des cellules HMEC-1 en fonction de leur état de culture (glycolipides extraits de cellules en phase de croissance ou à confluence), en fonction de leur état physiologique (cellules quiescentes en milieu de culture appauvri, et cellules prolifératives en milieu de culture complet), ainsi que sous l'effet de facteurs pro-angiogéniques (sphingosine-1 -phosphate). En effet, s'il existe des marqueurs glycolipidiques de cellules endothéliales en prolifération, alors ces marqueurs constituent des cibles d'intérêt dans une perspective de thérapie anti- angiogénique intra-tumorale.
Profil d'expression glycolipidique des cellules HMEC-1 prolifératives ou confluentes (par HPTLC).
La Figure 1A présente l'analyse HPTLC de glycolipides extraits lorsque les cellules HMEC-1 étaient en phase de croissance (piste 1), ou à confluence (piste 2). Les cellules ont aussi été analysées par densitométrie.
Suivant que les cellules endothéliales HMEC-1 sont en phase de prolifération deux ou trois jours après l'ensemencement, ou parvenues à confluence au bout de cinq j ours, on observe une différence d'expression glycolipidique, notamment pour les gangliosides complexes les plus apolaires (n° 1 et 2) mais aussi pour le glycolipide Gb3 (n° 12, Fig. 1). L'analyse densitométrique a montré que la teneur du Gb3 est presque deux fois supérieure pour les cellules prolifératives que pour les cellules confluentes (valeur égale à 1,716 ± 0,069, deux analyses indépendantes). Profil d'expression glycolipidique des cellules HMEC-1 s u ivant la composition de milieu de culture.
La Figure 1B présente l'analyse HPTLC de cellules HMEC-1 qui ont été ensemencées à 20,000 cellules/cm2 puis incubées pendant 24 h, dès l'état de sub- confluence atteint, en milieu de culture appauvri (piste 1) ou en milieu de culture complet (piste 2). Les cellules ont aussi été analysées par densitométrie.
Suivant que les cellules sont cultivées dans du milieu MCDB-131 avec 15 % de SVF (milieu complet) ou 0, 1 % de SVF, sans EGF (milieu appauvri), on observe par FIPTLC qu'il existe une différence d'expression pour les gangliosides complexes les plus apolaires (n° 1, 2 et 3, Fig. 2) et pour le glycolipide neutre Gb3 (n° 12). L'analyse densitométrique montre que la teneur du Gb3 des cellules incubées en milieu complet est presque deux fois supérieure à celle des cellules incubées en milieu appauvri (valeur égale à 1,512 ± 0,061, deux analyses indépendantes).
Profil d'expression glycolipidique des cellules HMEC-1 traitées ou non pendant 24 h avec la sphingosine-l-phosphate (par HPTLC).
La Figure 1C présente l'analyse FIPTLC de cellules HMEC-1 qui ont été ensemencées à 20,000 cellules/cm2 et cultivées en milieu complet, jusqu'à ce que l'état de sub-confluence soit atteint, puis incubées pendant 24 h en milieu appauvri supplémenté soit de sphingosine-l-phosphate 1 μΜ (piste 2), soit de son diluant, le PET (piste 1).
Cette analyse HPTLC montre qu'il existe une différence d'expression pour le Gb3 (n° 12, Fig. 1C), la teneur en Gb3 des cellules incubées 24 h avec la S 1P est presque 1,5 fois supérieure à celle des cellules incubées avec le polyéthylène-glycol (valeur égale à 1,271 ± 0,020, deux analyses indépendantes).
2.2. Conclusion
Pour les cellules endothéliales humaines microvasculaires HMEC-1 transformées par le SV40, nous avons pu mettre au point une méthode d'analyse reproductible des glycolipides qui permettait d'envisager leur caractérisation ainsi que l'étude du polymorphisme d'expression glycolipidique. Les glycolipides sont issus de la phase aqueuse d'une partition DIPE/l-butanol, 60 : 40 v/v, NaCl 0, 1% et révélés par l'orcinol, ce qui a permis de mettre en évidence 14 bandes d'intensité variable qui correspondraient à au moins 7 espèces moléculaires. Nous avons pu ainsi identifier la présence d'un glycolipide neutre qui n'est pas révélé au résorcinol/HCl mais qui est reconnu par un anticorps de rat anti-Gb3 disponible commercialement. Ce glycolipide Gb3 est notamment présent sous la forme d'un doublet correspondant à deux types de chaînes d'acides gras du céramide.
L'analyse de l'expression des glycolipides des cellules HMEC-1 en fonction de différents stimuli a permis de mettre en évidence des modifications d' expression glycolipidique des cellules endothéliales HMEC-1. On observe une augmentation de la teneur en gangliosides complexes, et en glycolipide neutre Gb3, lorsque les cellules sont en phase exponentielle de croissance (Fig. 1 A), dans leur milieu complet (Fig. 1B) mais également une augmentation de la teneur en Gb3 lorsqu'elles sont stimulées par la présence d'un facteur pro-angiogénique, la sphingosine-1 -phosphate (Fig. 1C). La teneur en Gb3 peut être deux fois plus faible lorsque les cellules sont incubées en milieu appauvri (0, 1 % de SVF, sans EGF). En présence de milieu appauvri, les cellules entrent dans la phase GO du cycle cellulaire qui constitue un stade quiescent de non- division. Nous avons vérifié au préalable par un comptage cellulaire que le nombre de cellules FDVIEC-1 après 24 h d'incubation en milieu appauvri était quasiment identique au nombre de cellules avant incubation, alors que le nombre de cellules FDVIEC-1 après incubation pendant 24 h en milieu complet, pouvait presque doubler. Ce stade de non- division est réversible car sous l'influence de facteurs de croissance qui ordonnent à la cellule de se diviser, elles peuvent alors de nouveau renter dans le cycle cellulaire en phase Gl pour continuer une progression normale du cycle cellulaire et proliférer.
Autrement dit, la teneur en Gb3 des cellules en prolifération est supérieure à celle des cellules quiescentes. De la même manière, lorsque l'on ajoute au milieu de culture appauvri un facteur pro-angiogénique comme la sphingosine-1 -phosphate, la teneur en Gb3 des cellules augmente de 50 %, alors qu'en milieu complet, elle est deux fois supérieure. Nous avions également déjà démontré précédemment au laboratoire par des tests d'incorporation de thymidine, qu'après 24 h d'incubation des cellules FDVIEC- 1 avec du milieu appauvri supplémenté par 1 μΜ de S IP, le taux de prolifération des cellules était 1,2 fois supérieur en comparaison des cellules non traitées, confirmant l'action pro-angiogénique de la SIP (Bonnaud et al. 2007). L'augmentation de la teneur en Gb3 plus importante en présence de milieu complet peut notamment s'expliquer par une action synergique des facteurs de croissance présents dans le sérum de veau fœtal du milieu complet.
EXEMPLE 3. Préparation d'anticorps dirigés contre les cellules endothéliales stimulées par des cellules tumorales
Pour générer des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des glycolipides de cellules endothéliales intra-tumorales, nous avons choisi d'immuniser des souris Balb/c avec des cellules endothéliales qui avaient été préalablement cultivées en présence de cellules tumorales dans un modèle de co-culture mimant le micro- environnement tumoral. Dans les cellules endothéliales HMEC-1, nous avions mis en évidence par HPTLC la présence d'au moins sept espèces moléculaires glycolipidiques plus ou moins exprimées, dont un glycolipide neutre présent sous la forme d'un doublet correspondant au glycolipide Gb3. Nous avons choisi d'immuniser les souris avec les cellules entières, et non pas avec un glycolipide purifié, car nous ne souhaitions pas privilégier un glycolipide en particulier, ni écarter la possibilité de générer des anticorps dirigés contre des antigènes de nature glycoprotéique. A la suite de l'immunisation, tous les hybridomes générés ont été congelés, tous les surnageants conservés à 4 °C, puis nous avons utili sé deux stratégies de criblage permettant de sélecti onner préférentiellement des anticorps dirigés contre des antigènes de nature glycolipidique (ELISA sur cellules endothéliales dessiquées).
3.1. Résultats
Obtention des anticorps
Mise en place du modèle de co-culture.
Afin de générer de nouveaux anticorps dirigés contre des marqueurs glycolipidiques de cellules endothéliales, nous avons, dans un premier temps, mis en place un modèle de co-culture mimant le micro-environnement tumoral (Fig. 2). Des cellules endothéliales primaires humaines de poumon HMVEC-L ont été co-cultivées en présence de cellules d'adénocarcinome colique humain T84 par le biais de membranes poreuses permettant l ' échange de facteurs solubles entre les deux compartiments (6-well Transwell-Clear, pores de 0,4 mm, Corning, Pays-Bas). Une fois isolées et fixées au paraformaldéhyde, ces cellules endothéliales ont servi à immuniser cinq souris Balb/c.
Ce système de co-culture a été développé au laboratoire et a déjà été décrit précédemment pour étudier l'influence de l'irradiation de cellules endothéliales sur des cellules T84 non irradiées co-cultivées avec les cellules endothéliales irradiées (Gaugler et al. 2007). Afin de simuler le plus possible les conditions du micro-environnement tumoral, les cellules endothéliales étaient en prolifération au moment où les cellules d'adénocarcinome ont été implantées trois j ours plus tard et étaient touj ours en prolifération au moment où elles ont été trypsinées puis fixées au paraformaldéhyde 4%, en vue de l'immunisation.
Immunisation des souris et hybridation somatique.
Cinq souris Balb/c ont été immunisées avec ces cellules endothéliales co- cultivées et fixées au PFA 4%. Les sérums ont été prélevés avant chaque injection et la cinétique de la réponse humorale des souris a été analysée par un ELIS A sur cellules dessiquées à la fois sur les cellules endothéliales primaires HMVEC-L et sur les cellules endothéliales HMEC-1 transformées par le SV40. Pour la réponse anti-IgM, nous avons utilisé des anticorps polyclonaux de chèvre biotinylés dirigés contre la chaîne μ des anticorps de souris et pour la réponse anti-IgG, des anticorps polyclonaux de chèvre biotinylés dirigés contre les fragments (H+L) des anticorps de souris.
L'analyse des isotypes des immunoglobulines montre qu'il s'agit d'une réponse μ précoce suivie d'une réponse γ plus faible. En effet, pour la réponse anti-IgM, des taux d'anticorps sont détectables dès la première immunisation (semaine 8) et pour la réponse anti-IgG, des taux d'anticorps sont détectables au bout de la deuxième injection (semaine 10). Nous observons également une réaction croisée de ces anticorps sur les cellules endothéliales HMEC-1 qui nous permet d'envisager l'utilisation de ces cellules transformées par le SV40 pour les études de criblage.
Criblage des anticorps sur les cellules HMEC-1 après hybridation somatique
L'hybridation somatique a permis d'obtenir 1086 hybridomes. Leur surnageant ont été prélevés en vue du criblage et conservés à 4°C et ces 1086 hybridomes ont été repris dans du SVF contenant 10 % de diméthylsulphoxide, pour être conservés à - 80 °C.
Du fait de la réaction croisée que l'on observe avec les anticorps présents dans le sérum des souris immunisées, sur les cellules HMEC-1 transformées par le virus SV40, nous pouvions envisager l'utilisation de ces cellules transformées pour les études de criblage. Les hybridomes générés ont été sélectionnés en utilisant des anticorps de détection de chèvre dirigés à la fois contre les IgM (μ) et les IgG (H+L) de souris et selon deux approches.
Pour la première approche, les surnageants des hybridomes ont été testés par un ELISA sur des cellules HMEC-1 dessiquées afin de cribler préférentiellement des anticorps dirigés contre des antigènes de nature glycolipidique. Les anticorps sélectionnés par ELISA ont ensuite été criblés par cytométrie de flux puis la nature des antigènes a été déterminée par un immunomarquage de glycolipides de cellules HMEC- 1 séparés par HPTLC (iTLC). Pour la deuxième approche, tous les anticorps pré- sélectionnés par l'ELISA ont été analysés par un immunomarquage de glycolipides de cellules HMEC-1 séparés par HPTLC (iTLC).
Première stratégie de criblage des anticorps
A partir des 1086 hybridomes, nous avons pré-sélectionné 139 hybridomes par ELISA sur les cellules HMEC-1 dessiquées. En plus d' être simple, rapide, et de présenter l ' avantage de la sélection de motifs glycolipidiques rési stants à la dessiccation, cette technique permet également de ne pas privilégier une espèce moléculaire en particulier, puisque les anticorps sont criblés sur des cellules entières au lieu de glycolipides purifiés. Les 139 hybridomes pré-selectionnés par ELISA ont ensuite été criblés par cytométrie de flux. Cette méthode permet de sélectionner les anticorps dirigés contre des antigènes membranaires à la surface de cellules vivantes. En effet, la technique ELISA peut présenter certains inconvénients. Lors de la dessiccation, les membranes cellulaires sont endommagées et les anticorps sélectionnés par ELISA peuvent être dirigés contre des antigènes intracellulaires alors que nous recherchons des antigènes présents à la surface des membranes. Par cytométrie de flux, nous avons pu isoler 13 hybridomes et afin de déterminer la nature de l'antigène reconnu, nous avons réalisé un immunomarquage des glycolipides séparés par HPTLC, par ces 13 surnageants d'hybridomes (données non montrées).
Les surnageants des 13 hybridomes reconnaissent pour 6 d'entre eux (25C10 (1), 1 1E10 (3), 3E2 (4), 15C1 1 (5), 16G8 (10) et 22F6 (12)), un même antigène de nature glycolipidique présent sous la forme d'un doublet qui migre au dessus du GM1 , préalablement identifié comme étant du Gb3.
L' immunomarquage montre que le Gb3 est présent sous la forme d'un doublet correspondant à deux types de chaînes d'acides gras du céramide. On constate que certains anticorps reconnaissent indifféremment les deux bandes de Gb3 (anticorps 3E2 et 15C11), d'autres reconnaissent plutôt la bande supérieure (anticorps 22F6) et d'autres la bande inférieure (anticorps 25C10, 1 1E10 et 16G8). Il a déjà été démontré que la composition de la chaîne d'acides gras du céramide pouvait influencer la conformation d'un glycolipide et modifier ainsi la réactivité de l'antigène pour son anticorps.
Afin de vérifier la spécificité des anticorps pour le Gb3, nous avons réalisé un immunomarquage d'un mélange standard de glycolipides neutres comportant le GalCer, le LacCer, le Gb3 et le Gb4, avec le surnageant de l'anticorps de l'hybridome 3E2 qui présente, parmi tous les anticorps anti-Gb3, le meilleur profil chromatographique par immunomarquage iTLC et le meilleur profil de fixation par cytométrie de flux. Les résultats montrent que cet anticorps reconnaît uniquement le Gb3 présent sous la forme d'un doublet sans présenter de réaction croisée avec le globoside Gb4, ni avec le GalCer et le LacCer.
Les 13 hybridomes sélectionnés ont été clonés par dilution limite, de nouveau testés par ELISA sur cellules HMEC-1 dessiquées puis nous avons déterminé leur isotype par un nouvel ELISA à l'aide des anticorps anti-μ, γΐ, y2a, y2b et γ3, et leur type de chaîne légère avec des anticorps anti-κ et λ. Les hybridomes sélectionnés par cette première approche de criblage sont répertoriés dans le tableau 7 suivant. Ce tableau présente notamment les isotypes des chacun des anticorps sélectionnés ainsi que le nom de l'anticorps monoclonal correspondant. Tableau 7. Hybridomes sélectionnés par la première stratégie de criblage.
Deuxième stratégie de criblage des anticorps.
Pour la seconde stratégie de criblage, nous avons réalisé des immunomarquages sur les glycolipides de cellules HMEC-1 séparés par HPTLC avec les 139 surnageants d' hybridomes pré-selectionnés en ELIS A avec les anticorps de détection anti-IgG (H+L)+ anti-IgM (μ). De nouveaux hybridomes (au nombre de 15) ont pu être sélectionnés par cette seconde approche, notamment 7 anticorps anti-Gb3 et d'autres anticorps dirigés contre des antigènes de nature glycolipidique en cours de caractérisation.
L'immunomarquage sur HPTLC est une méthode de détection sensible qui permet de détecter directement des glycolipides purifiés extraits à partir d'environ 20 106 à 30 106 cellules alors qu'en cytométrie de flux, on analyse des cellules entières à raison de 0,4 106 cellules. L' immunomarquage sur HPTLC permettrait ainsi de détecter des anticorps se fixant sur des glycolipides minoritaires qui pourraient, du fait de leur faible teneur, être non-détectables par cytométrie de flux. De plus, à ce stade du criblage, nous utilisons des surnageants d'hybridome non clonés dont la concentration en anticorps n'est pas connue. Ces hybridomes ne peuvent contenir que de très faibles concentrations en anticorps d'intérêt (si l'hybridome est un mauvais producteur, s'il y a un mélange d'hybridomes). L'immunomarquage sur HPTLC permettrait ainsi de détecter des anticorps anti-Gb3 présents en faible quantité dans les surnageants testés.
Les hybridomes ont été clonés par dilution limite et isotypés par ELISA à l'aide d'anticorps de détection anti-isotypes (μ, γΐ, y2a, y2b et γ3) et d'anticorps de détection dirigés contre les chaînes légères (K et λ).
En dehors des anticorps dont l'isotype a pu être déterminé par cette technique
(comme l'anticorps 12E10 d'isotype γΐ, ou les anticorps 21D4 et 14C11 d'isotype μ), certains d'entre eux n'étaient pas détectables avec les anticorps anti-isotype (μ, γΐ, y2a, y2b, γ3). Nous supposons que ces anticorps pourraient être des dimères de chaînes légères connus pour être sécrétés par les cellules de myélome puisqu'on ne peut les détecter qu'avec des anticorps secondaires anti-IgG (H+L) et des anticorps secondaires spécifiques de la chaîne légère κ.
Les hybridomes sélectionnés par cette seconde approche de criblage, leur isotype et le nom des anticorps monoclonaux correspondants, sont répertoriés dans le tableau 8 suivant.
Tableau 8. Anticorps sélectionnés par la seconde stratégie de criblage.
Purification des anticorps.
En dehors de l ' anticorps 7G10. 1 e de chaîne légère λ, dirigé contre un glycolipide en cours de caractérisation et obtenu lors du second criblage, tous les anticorps de chaîne légère κ pouvaient potentiellement être purifiés par chromatographie d'affinité sur colonne de protéine L. L'anticorps monoclonal de souris 1A4 spécifique du Gb3; fourni sous forme d'ascite par J. Wiels, ne se fixe pas sur la colonne de protéine L et a été purifié avec une colonne de mannane MBP (Pierce).
Après purification, la pureté des anticorps a été analysée par SDS-PAGE. Cette technique permet notamment de vérifier si les anticorps ont subit une dénaturation lors de l'étape d'élution des anticorps dans du tampon acide constitué de 0.1 M de glycine- HCl, pH 2.5. Le profil SDS-PAGE de l'anticorps 3E2 purifié est présenté sur la Figure 4. L'anticorps monoclonal 3E2 est pur et non dénaturé. La migration de l'anticorps monoclonal 3E2 sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes nous permet de visualiser, en conditions réductrices trois bandes correspondant aux chaînes lourde (H) et légère (L) et au segment J caractéristique des immunoglobulines de type μ. Du fait de son haut poids moléculaire, égal à 900.000 Da, l'IgM ne peut migrer dans le gel d'acrylamide à 6 % en conditions non-réductrices. Analyse de la spécificité des anticorps anti-Gb3 purifiés par chromatographie d'affinité.
Anticorps anti-Gb3 3E2. C. 25C10.a. 16G8.h. 14Cl l . ld et 15C7.2e.
La Fig. 5 présente le marquage des cellules en cytométrie de flux des anticorps monoclonaux purifiés anti-Gb3 sélectionnés par la première stratégie de criblage (3E2.c, 25C 10.a, 16G8.h) ou par la seconde stratégie de criblage (HC l l . ld et 15C7.2e). Le marquage a été réalisé sur les cellules HMEC-1, les cellules de lymphome Raji pour lesquelles le Gb3 est un marqueur, et les cellules NXS2 de neuroblastome murin qui n'expriment pas le Gb3, ce que nous avions au préalable vérifié avec un ELISA sur cellules NXS2 dessiquées à l'aide de l'anticorps anti-Gb3 38.13 (données non présentées). Pour les anticorps 3E2. C, 25C10.a, 16G8.h et 14C1 l . ld (A, B, C et D) nous avons utilisé des anticorps secondaires spécifiques de la chaîne μ des anticorps de souris et pour l'anticorps 15C7.2e (E) qui serait un dimère de chaîne légère, nous avons utilisé des anticorps secondaires dirigés contre les IgG (H+L).
Il n'y a pas de fixation sur les cellules NXS2 quels que soient les anticorps anti- Gb3 testés. Les anticorps issus du second criblage paraissent avoir une moins bonne affinité pour le Gb3 que les anticorps issus du premier criblage comme le montrent les pourcentages de cellules positives obtenus avec l'anticorps 14C1 l . ld et 15C7.2e sur les cellules HMEC-1 (respectivement 25,3 et 11,7 %) et avec l'anticorps 14C1 l . ld sur les cellules Raji (10,0 %).
Lorsque le marquage est réalisé avec l'anticorps 3E2.c, 68,2 % des cellules HMEC-1 et 87,9 % des cellules Raji sont positives. A la différence des cellules Raji, le marquage des cellules HMEC-1 est hétérogène et montre que certaines cellules expriment fortement le Gb3 et que d' autres l' expriment plus faiblement. Pour les anticorps 25C10.a et 16G8.h issus du premier criblage, les cellules HMEC-1 sont plus faiblement marquées de façon homogène (respectivement 50,7 % et 15,4 %) et les cellules Raji sont marquées à hauteur de 87, 1 % et 51, 1 %. L'immunomarquage sur HPTLC des cellules HMEC-1 montrait que les anticorps 16G8.h et 25C 10. a, reconnaissaient plutôt la bande inférieure du doublet Gb3 (données non montrées) dont la teneur est plus faible que la bande supérieure, ce qui pourrait expliquer la plus faible fixation de ces anticorps par cytométrie. La fixation de l'anticorps purifié 13D2.2d (données non présentées) dirigé contre un antigène glycolipidique en cours de caractérisation, n'a pas pu être détectée en cytométrie de flux probablement à cause de la faible quantité de ce glycolipide dans les cellules HMEC-1 , ou à cause d'une mauvaise affinité de l'anticorps.
Anticorps 12E10.1c.
Lors du second protocole de criblage, nous avions sélectionné l'anticorps 12E10.1c d'isotype IgGl, qui se fixait sur le Gb3 des cellules HMEC-1 par immunomarquage sur HPTLC. En effet, les anticorps d'isotype IgGl sont capables d'activer de façon importante la voie du complément, ce qui leur confère des propriétés cytotoxiques intéressantes. L'hybridome a donc été cloné, purifié et les anticorps ont été testés par cytométrie de flux sur les cellules HMEC-1, NXS2 et les cellules Daudi qui sont des cellules humaines du lymphome de Burkitt qui expriment le Gb3. Nous avons également comparé la fixation par cytométrie de flux des AcM 3E2 et 12E10. le, sur des cellules humaines du lymphome du manteau JEKO-1.
Les résultats (non présentés) indiquent que l' anticorps 12E10.1 c ne se fixe quasiment pas sur les cellules HMEC-1 et ne se fixe que très faiblement sur les cellules Daudi, probablement du fait de sa faible affinité pour le Gb3. Par ailleurs, il se fixe de façon plus importante sur les cellules JEKO-1 alors que l'anticorps monoclonal 3E2 ayant une bonne affinité pour le Gb3, ne se fixe pas sur ces cellules (données non montrées). L'anticorps 12E10.1c reconnaît sans doute un antigène différent du Gb3 qui est présent sur les cellules de lymphome du manteau JEKO-1 et présenterait une réaction croisée avec le Gb3 qui expliquerait pourquoi il se fixe sur le Gb3 par immunomarquage sur HPTLC des cellules HMEC-1.
3.2. Conclusion Cinq souris Balb/c ont été immunisées avec des cellules endothéliales primaires
HMVEC-L en prolifération qui avaient été préalablement co-cultivées en présence de cellules tumorales par le biais d'un système de membrane permettant le passage et l'échange des facteurs de croissance entre les cellules, afin de mimer le microenvironnement tumoral. Le pouvoir immunogène des lipides étant faible, nous avons dans un premier temps vérifié la cinétique sérique de la réponse anticorps par un test ELISA sur des cellules dessiquées permettant de cribler préférentiellement des anticorps dirigés contre des antigènes résistants à la dessiccation tels que les glycolipides. Nous avons obtenu une réponse anticorps dirigés contre les cellules primaires HMVEC-L puis une réaction croisée sur les cellules HMEC-1 qui permettait d'envisager l'utilisation de ces cellules transformées par le SV40 comme modèle cellulaire pour la poursuite des travaux.
Ce modèle de co-culture avait déjà été mis au point au laboratoire (Gaugler et al. 2007) et il avait déjà été démontré précédemment dans un système de co-culture similaire que la présence de cellules tumorales amplifiaient la prolifération et la migration de cellules endothéliales primaires en leur faisant acquérir des modifications phénotypiques et génotypiques (Khodarev et al. 2003). La technique ELIS A qui met en œuvre des cellules dessiquées a été développée au laboratoire et s'inspire d'études préliminaires réalisées avec d'autres types cellulaires, comme le criblage d'anticorps monoclonaux dirigés contre des composants membranaires de cellules mononuclées humaines. Egalement, du fait de la fragilité du tissu pancréatique qui se dégrade rapidement d'où la nécessité de le stabiliser par fixation, des cellules pancréatiques de souris ont été utilisées sous forme dessiquée, pour la détection et la quantification en ELIS A d'anticorps présents dans le sérum de diabétiques insulino-dépendants. Lors de notre stratégie de génération d'anticorps, nous avons choisi d'immuniser les souris Balb/c avec des cellules endothéliales entières. De nombreux anticorps anti-glycolipides ont déjà été générés à la suite de l'immunisation de cellules tumorales entières et de cette façon, de nouvelles espèces moléculaires de nature glycolipidique ont pu être identifiées. Au départ, la fixation des cellules HMVEC-L par le paraformaldéhyde 4 % avait été choisie pour cribler les surnageants d'hybridome sur des cellules traitées dans les mêmes conditions que celles qui avaient servi à l'immunisation, mais de cette manière également, la membrane plasmique des cellules HMVEC-L pouvait être stabilisée et les cellules destinées aux différentes immunisations pendant les 65 semaines pouvaient être issues de la même co-culture. D'autre part, les glycolipides étant faiblement immunogènes, on peut les assimiler à des molécules telles que des haptènes incapables de déclencher à elles-seules une réaction immunitaire. Pour les rendre plus immunogènes, on peut les coupler à une molécule protéique « porteuse » dont le rôle sera d'exposer de façon plus importante, la molécule haptène. En fixant les glycolipides avec du paraformaldéhyde sur les membranes des cellules endothéliales, on peut simuler la formation de complexes « haptène-porteur » afin d'induire une réponse immunitaire plus importante. Afin de vérifier que la fixation par le paraformaldéhyde ne modifiait pas la fixation des anticorps, nous avons réalisé un ELISA sur des cellules HMEC-1 dessiquées, fixées ou non avec du PFA 4 %, avant ou après dessiccation (données non présentées). Les analyses d'une cinquantaine d'hybridomes issus des 139 hybridomes sélectionnés lors de la première stratégie de criblage, montrent qu'il n'y avait pas de modification de la fixation des anticorps sur les cellules dessiquées qu'elles soient fixées ou non. L'hybridation somatique a permis, à partir des 1086 hybridomes obtenus, de présélectionner par ELISA sur cellules dessiquées 139 premiers hybridomes qui avaient alors été criblés selon deux stratégies. La première, qui consistait à cribler les hybridomes sur des cellules vivantes par cytométrie de flux, a permis de sélectionner 13 d'entre eux et par immunomarquage sur HPTLC des extraits glycolipidiques de cellules, nous avons déterminé que 6 d'entre eux reconnaissaient le glycolipide Gb3. Une seconde stratégie de criblage, qui consistait à cribler par immunomarquage les 139 hybridomes obtenus par ELISA, a permis de sélectionner de nombreux autres anticorps, pour la plupart dirigés contre le Gb3 mais également contre des glycolipides en cours de caractérisation. Après purification, il s'est avéré que les anticorps générés par le second criblage présentaient une affinité moins importante. Aussi, nous avons choisi de retenir trois anticorps monoclonaux (IgM, κ) dirigés contre le Gb3 : les anticorps monoclonaux 25C10 et 16G8 qui, par immunomarquage sur HPTLC, reconnaissent plutôt la bande inférieure du doublet Gb3; qui est représentée de façon minoritaire chez les cellules HMEC-1, et l'anticorps monoclonal 3E2 qui présente le meilleur profil de fixation en immunomarquage sur HPTLC et en cytométrie de flux.
Le Gb3 est un globotriaosylcéramide, également appelé Gb3/CD77, ou CTH (céramide trihexoside). Il a d'abord identifié en tant qu'antigène d'un groupe sanguin rare, le groupe Pk à la surface des érythrocytes et est également connu en tant que marqueur du lymphome de Burkitt (BLA, Burkitt Lymphoma Antigen). A la surface des cellules endothéliales, son expression est régulée par des cytokines pro-inflammatoires telles que le T F-α impliqué dans les processus de tumorigénèse. De plus, ce glycolipide est connu en tant que récepteur spécifique de toxines bactériennes et des études préliminaires ont montré que la liaison de la vérotoxine sur le Gb3 pouvait inhiber l'angiogenèse in-vitro (Heath-Engel et Lingwood, 2003). Ces résultats nous confortent dans l'intérêt de développer des anticorps thérapeutiques ciblant le Gb3, d'autant plus que la teneur de ce glycolipide semble être modulée lorsque les cellules endothéliales sont en prolifération (Voir Exemple 2). De plus, la très grande majorité des anticorps anti-glycolipides générés à la suite de l'hybridation somatique étaient dirigés contre le Gb3, ce qui suggérerait que ce glycolipide est assez immunogène chez la souris Balb/c. Concernant les sept autres anticorps générés lors de la première stratégie de criblage et dont les antigènes sont en cours de caractérisation, il est possible qu'ils soient dirigés contre d'autres glycolipides des cellules HMEC-1 qui ne sont pas extraits selon notre méthode de purification par partition (comme des glycolipides neutres et apolaires) ou bien qu'il s'agisse d'antigènes de nature glycoprotéique, car il est envisageable que des motifs glycosylés portés par des glycoprotéines soient résistants à la dessication. EXEMPLE 4. Caractérisation de V anticorps monoclonal murin 3E2 anti-Gb3
4.1. Résultats
Détermination de la constante d'affinité.
L'analyse de la courbe de saturation obtenue par la technique de Scatchard nous a permis d'évaluer la constante d'affinité de l'anticorps 3E2 pour le Gb3 des cellules Raji et des cellules HMEC-1, ainsi que le nombre de sites à leur surface. Les résultats sont répertoriés dans le Tableau 9 suivant.
Tableau 9. Constante d'affinité de l'anticorps 3E2 pour les cellules Raji et
HMEC-1.
L'affinité de l'anticorps 3E2 a été évaluée à 30 nM. Le nombre de sites Gb3 est de l'ordre de 2 106 sites pour les deux types cellulaires mais il y a légèrement plus de sites sur les cellules Raji que sur les cellules HMEC-1. Précédemment, nous avions montré par cytométrie de flux (Fig. 9, Exemple 3) que la répartition du Gb3 était homogène pour les cellules Raji pour lesquelles 87,9 % des cellules sont positives, et hétérogène pour les cellules HMEC-1 pour lesquelles 68,2 % des cellules sont positives. En effet, au sein de la population de cellules HMEC-1, certaines cellules expriment faiblement le Gb3 tandis que d'autres l'expriment plus fortement, à la différence des cellules Raji.
Etude de la spécificité de l'anticorps 3E2.
Par un test immunoenzymatique (ELISA) sur cellules dessiquées.
Dans un premier temps, la spécificité de AcM 3E2 a été évaluée par un test ELISA sur les cellules dessiquées Raji, HMEC-1 et l es cellul es IMR32 de neuroblastome humain qui n' expriment pas le Gb3, en utilisant un anticorps de détection anti-chaîne μ de souris (Fig. 6).
L'anticorps 3E2 ne se fixe pas sur les cellules IMR32. Il se fixe sur les cellules Gb3-positives HMEC-1 et Raji mais leur profil de fixation par ELISA est différent (A). En effet, l'anticorps se fixe plus faiblement sur les cellules HMEC-1. On pourrait expliquer cette différence par le nombre moyen de sites Gb3 qui est légèrement plus important pour les cellules Raji. De plus, dans la population de cellules HMEC-1, on observe par cytométrie de flux qu' il existe une hétérogénéité du marquage par l'anticorps 3E2 et que certaines cellules expriment plus faiblement le Gb3 (Fig. 5, Exemple 3). On pourrait également envisager que le Gb3 des cellules HMEC-1 est moins bien reconnu lorsqu'il est présent sous une forme dessiquée, puisqu'il est reconnu que la conformation d'un glycolipide peut influencer sa reconnaissance par un anticorps.
Malgré leur faible immunogénicité, des anticorps monoclonaux anti-glycolipides ont été obtenus par d'autres laboratoires. Nous avons donc comparé la fixation de l'anticorps 3E2 avec celle de l'anticorps de rat 38.13. Nous n'avons pas inclus les données concernant l'anticorps contrôle isotypique et un autre anticorps de souris monoclonal anti-Gb3 1 A4, car ils se fixent de façon non spécifique au fond des puits des plaques de microtitration, même après l'étape de saturation des puits ( 1 h d'incubation à température ambiante avec du PBS-BSA 1 %) (données non présentées). L'anticorps 38.13 reconnaît le Gb3 des cellules HMEC-1. La fixation des anticorps 38. 13 et 3E2 n'est pas tout à fait identique car ces anticorps sont révélés par deux systèmes de détection. En effet, la fixation de l ' anticorps 3E2 est révélée par l'incubation successive d'un anticorps secondaire biotinylé anti-μ de souris suivi de l'incubation d'un complexe streptavidine-peroxidase, alors que celle de l'anticorps 38.13 est révélée par l'incubation d'un anticorps secondaire anti-μ de rat directement couplé à la peroxidase.
Immunomarquage des glycolipides séparés par HPTLC (iTLC).
Nous avons comparé le profil chromatographique de fixation de l'anticorps 38.13 avec celui de l'anticorps 3E2 (Fig. 7).
L'anticorps 38.13 reconnaît le Gb3 des cellules HMEC-1 sous la forme d'un doublet (piste 3), alors que l'anticorps 3E2 ne reconnaît que la bande supérieure (piste 4). Lors du criblage des anticorps, c'est-à-dire avant clonage des hybridomes, on constate que lorsque que l'on effectuait un immunomarquage avec le surnageant de l'anticorps 3E2, celui-ci reconnaissait lui-aussi le Gb3 sous la forme d'un doublet (piste 5). On suppose ainsi que le clonage a permis de sélectionner, dans un mélange de plusieurs hybridomes de spécificités différentes, un anticorps monoclonal se fixant uniquement sur la bande supérieure du doublet Gb3.
Nous avons par la suite comparé les deux anticorps monoclonaux anti-Gb3 de souris : l'anticorps 3E2 généré au laboratoire et l'anticorps 1 A4 (Fig. 8).
Les anticorps monoclonaux de souris 3E2 et 1A4 ont des profils de fixation chromatographique différents : l'anticorps 3E2 reconnaît la bande supérieure du Gb3 des cellules HMEC-1 alors que l'anticorps 1A4 reconnaît le Gb3 sous la forme d'un doublet (B). Par contre, les anticorps 3E2 et 1 A4 reconnaissent tous les deux le Gb3 purifié de source porcine (Matreya) sous la forme d'un doublet. Par ailleurs, on constate que la fixation de l'anticorps 3E2 est plus faible que celle de l' anticorps 1 A4, probablement car l'anticorps 1A4 possède une meilleure affinité pour le Gb3 que l'anticorps 3E2. Etude du marquage cellulaire par immunofluorescence en cytométrie de flux.
Afin de comparer la fixation des anticorps de souris anti-Gb3, nous avons réalisé un marquage en cytométrie de flux des cellules HMEC-1, Raji et NXS2 à l'aide des anticorps monoclonaux 3E2, 1A4 et du contrôle isotypique (IgM, κ) et révélé leur fixation par des anticorps de détection anti-μ de souris(Fig. 9 et Tableau 10).
Tableau 10. Moyenne d'intensité de fluorescence après analyse en cytométrie de flux.
Pour les cellules HMEC-1 , le profil de fixation de l ' anticorps 3E2 est différent de celui de l'anticorps 1A4 : 68,2 % des cellules sont positives avec l'anticorps 3E2 (A) et 90,8 % des cellules sont positives avec l'anticorps 1A4 (B). La valeur moyenne d'intensité de fluorescence est de 568,3 pour l'anticorps 3E2 et 984,2 pour l'anticorps 1A4 (Tableau 10). Il y a donc plus de cellules positives quand les cellules sont marquées avec l'anticorps 1A4, mais pour les deux anticorps, le marquage des cellules HMEC-1 est hétérogène. On note en effet, la présence de deux populations cellulaires : pour l'anticorps 3E2, la présence d'une population moins marquée prédominante et pour l' anticorps 1A4, une population prédominante fortement marquée. Le marquage des cellules Raji est homogène et le pourcentage de cellules positives est comparable entre les deux anticorps (87,9 % de cellules positives et 423,8 de valeur moyenne d'intensité de fluorescence pour l'anticorps 3E2, et 93 ,6 % de cellules positives et 498, 1 de valeur moyenne d'intensité de fluorescence pour l'anticorps 1A4). Ainsi les cellules Raji expriment fortement le Gb3 de manière homogène au sein de la population cellulaire et les deux anticorps semblent reconnaître le glycolipide selon des affinités comparables. Nous avons alors cherché à comparer par analyse HPTLC la teneur en Gb3 des cellules HMEC-1, Raji et NXS2 (Fig. 10).
Dans les cellules HMEC-1 , la bande supérieure du Gb3 est maj oritaire. L'anticorps 3E2 reconnaît préférentiellement cette forme par rapport aux anticorps 38. 13 et 1 A4 qui reconnaissent le Gb3 sous la forme d'un doublet (Fig. 10). En cytométrie de flux, après marquage des cellules HMEC-1 avec l'anticorps 3E2 (Fig 10, A), on observait la présence d'une population moins marquée prédominante. On peut alors suggérer que chez les cellules HMEC-1, l'espèce moléculaire correspondant à la bande supérieure du Gb3, est retrouvée sur une forte proportion de cellules qui l'expriment plus faiblement qu'une population plus marquée minoritaire. En cytométrie de flux, après marquage des cellules HMEC-1 avec l'anticorps 1A4 (Fig. 10, B), on observait la présence d'une population plus marquée prédominante. Il existerait alors, une faible proportion de cellules HMEC-1 qui expriment fortement la forme inférieure de Gb3 ou les deux formes de façon indifférenciée.
Lorsque l'on compare par HPTLC les profils d'expression glycolipidique des cellules HMEC-1 avec les cellules Raji (Fig. 10, pistes 4 et 5), on constate que les cellules Raji ne comportent pas beaucoup de glycolipides chargés comme les gangliosides, ce sont surtout des glycolipides neutres (piste 5). La bande supérieure du Gb3 est très largement majoritaire. Du fait de la faible teneur de l'espèce correspondant à la bande inférieure, la fixation de l'anticorps 1 A4 est limitée à la forme supérieure, ce qui explique pourquoi les anticorps 3E2 et 1A4 reconnaissent le Gb3 des cellules Raji de façon équivalente en cytométrie de flux.
Les cellules NXS2 du neuroblastome murin, et les cellules T84 issu d'un adénocarcinome colique humain, utilisées dans le système de co-culture avec les cellules primaires HMVEC-L, n'expriment pas le Gb3. Ce résultat est important car il a déj à été suggéré qu e de s gly c ol i pi de s i s su s de cel l ul e s tum oral e s du microenvironnement pouvaient être incorporés aux cellules endothéliales à la suite d'une libération spontanée de glycolipides tumoraux, les rendant ainsi plus sensibles au VEGF. Les cellules T84 n'exprimant pas le Gb3, les anticorps générés par les souris Balb/c après immunisation reconnaissaient bien un antigène exprimé à la surface des cellules HMVEC-L et non pas un antigène glycolipidique provenant des cellules T84 et incorporé aux cellules HMVEC-L. Nous avons ainsi analysé la teneur en Gb3 des cellules HMVEC-L en les comparant par cytométrie de flux (Fig. 1 1 ) et par HPTLC (Fig. 12) aux profils d'expression des cellules FDVIEC-1 et des cellules macrovasculaires humaines HUVEC pour lesquelles la présence de Gb3 a déjà été démontrée dans la littérature (Obrig et al. 1993 ; Muthing et al. 1999 ; Kanda et al. 2004).
Tableau 11. Moyenne d'intensité de fluorescence après analyse en cytométrie de flux.
Que ce soit par cytométrie de flux (Fig. 11), ou par analyse HPTLC (Fig. 12), on constate que les cellules endothéliales primaires HMVEC-L et HUVEC expriment moins de Gb3 que les cellules endothéliales transformées HMEC-1.
En cytométrie de flux, l'anticorps 3E2 ne reconnaît pas les cellules HMVEC-L non co-cultivées (3,4 % de cellules positives). Cette absence de fixation est due à une diminution globale du doublet Gb3 observée par HPTLC, car même si la teneur globale de Gb3 est faible, la bande supérieure reste majoritaire chez les cellules HMVEC-L. Puisque l'anticorps 1A4 se fixe sur le Gb3 des cellules HMVEC-L (26, 1 % de cellules positives) et puisque la bande supérieure est prédominante, la différence de fixation est due à une différence d'affinité entre les deux anticorps. L'affinité de l'anticorps 1A4 pour le Gb3 semble supérieure à celle de l'anticorps 3E2, puisque la faible teneur en Gb3 que l'on peut visualiser en HPTLC ne peut être détectée par cytométrie de flux qu'avec l'anticorps 1A4. Chez les cellules HUVEC, on ne détecte quasiment pas de Gb3 par HPTLC. En cytométrie de flux, seulement 7,5 % des cellules sont positives avec l'anticorps 1 A4 au lieu de 2,5 % de cellules positives avec l'anticorps 3E2.
L'analyse HPTLC montre que la teneur globale en glycolipides neutres est limitée dans les cellules HUVEC (piste 6). Pour les cellules HMVEC-L, c' est la proportion de Gb3 au sein de la fraction totale de glycolipides neutres qui est limitée (piste 5) puisque ces cellules expriment fortement un glycolipide présent sous la forme d'un doublet correspondant probablement au glycolipide Gb4. Pour les cellules HMVEC-L et HUVEC, c'est la bande supérieure du globoside Gb4 qui est majoritaire alors que pour les cellules HMEC-1, c'est la bande inférieure du Gb4 qui est maj oritaire. Les cellules primaires présentent des teneurs plus importantes en gangliosides complexes migrant en dessous du GDia. Par ailleurs, pour les trois types cellulaires, c'est le ganglioside migrant au dessus du GM1 qui serait le plus abondant de la fraction gangliosidique totale. La prépondérance du GM3 au sein de la fraction gangliosidique totale ayant déjà été démontrée chez les cellules endothéliales humaines (Obrig et al. 1993 ; Muthing et al. 1999 ; Kanda et al. 2004), il est probable que ce ganglioside prépondérant chez les cellules HMEC-1, HMVEC-L et HUVEC soit du GM3.
Immunofluorescence sur cellules en culture.
Nous avons analysé par immunofluorescence la localisation cellulaire du Gb3. Les résultats montrent que l'anticorps 3E2 convient à l ' étude des cellules en immunofluorescence. L' avantage de cette technique est que l' on peut observer la répartition antigénique de cellules vivantes directement sur leur support de culture, sans qu'elles soient trypsinées avant marquage comme c'est le cas en cytométrie de flux. D'après les résultats obtenus avec le contrôle isotypique, le signal obtenu ne provient pas d'interactions non-spécifiques. On observe que la distribution du Gb3 est localisée à la membrane cellulaire et que sa répartition membranaire est plutôt homogène au sein de la cellule (données non montrées).
Immunohistochimie sur des coupes de tumeurs congelées.
Nous avons analysé par immunohistochimie la distribution du Gb3 sur des coupes congelées de tumeurs Raji exprimant le Gb3, et de tumeurs IMR32 n'exprimant pas le Gb3, ce que nous avions au préalable vérifié par ELISA avec l'anticorps 3E2 et par cytométrie de flux. Ces tumeurs ont été implantées avec du Matrigel et prélevées au bout de 3 à 4 semaines.
Les résultats (non montrés) indiquent que l' anticorps 3E2 est un outil immunohistochimique qui semble répondre aux attentes. Il reconnaît la présence de Gb3 qui est localisé au niveau de la membrane des tumeurs Gb3-positives (Raji) et ne présente pas de liaison non-spécifique sur des tumeurs ne l'exprimant pas (IMR32). L ' anti corp s contrôl e i sotopi que e st égal ement appropri é p our de s étude s immunohistochimiques puisqu'il ne présente pas d'aspécificité.
Séquences nucléotidiques des régions variables VH et VL de l'anticorps 3E2.
Afin de finaliser la caractérisation de l'anticorps 3E2, nous avons analysé après
RT-PCR, les séquences nucléotidiques des régions variables VH et VL afin de les aligner avec les données de la banque IMGT (International Immunogenetics Information System®). Les amorces utilisées pour le séquençage des chaînes lourde et légère sont répertoriées dans le tableau 12. Les séquences nucléotidiques des chaînes lourde et légère sont présentées dans la Fig. 13 et les gènes utilisés pour ces régions variables sont répertoriés dans le tableau 13.
Tableau 12. Amorces back utilisées pour l'amplification des régions variables des segments géniques VH et VL de l'anticorps 3E2.
Tableau 13. Gènes utilisés pour les régions variables des chaînes légères.
L'anticorps monoclonal 3E2 présente plus de 99 % d'homologie avec le gène IGHV4 de configuration germinale (ADN génomique). On note la présence de deux nucl éoti des qui sont mutés dans l a région FR1 . L ' anticorps présente 65 ,96 % d'homologie avec le gène IGHJ2 et 78,57 % avec le gène IGHDl . Le VK de l'anticorps présente une homologie de 90,91 % sur 220 nucléotides avec le gène IGKV14 et présente 100 % d'homologie avec le gène IGKJ5. Du fait des différences observées avec les gènes de configuration germinale, on met ainsi en évidence que l'anticorps a été soumis à un processus de maturation révélé par plusieurs mutations somatiques. 4.2. Conclusion
Nous avons obtenu par hybridation somatique plusieurs lignées d'hybridomes, parmi lesquels l'anticorps 3E2 (IgM, κ) dirigé contre le glycolipide neutre Gb3. Nous avons poursuivi sa caractérisation en utilisant des cellules de lymphome humain Raji pour lesquelles le Gb3 est un marqueur, des cellules du neuroblastome humain IMR32 et murin NXS2 qui n'expriment pas le Gb3 et des cellules endothéliales primaires, les cellules microvasculaires de poumon HMVEC-L, et les cellules macrovasculaires de cordon ombilical HUVEC.
Nous avons déterminé par la représentation de Scatchard que l 'anticorps présentait une bonne affinité de l'ordre de 30 nM. Sur des cellules HMEC-1, nous avons mis en évidence par immunocytochimie la localisation membranaire du Gb3, puis par immunohistochimie, sa capacité à se lier de façon spécifique au Gb3 sur les coupes de tumeurs congelées Raji. Nous avons analysé sa spécificité par ELIS A sur cellules dessiquées, par cytométrie de flux et par immunomarquage sur des glycolipides séparés par HPTLC. L'anticorps 3E2 constitue ainsi un nouvel outil d'analyse du Gb3, en plus des anticorps qui ont déjà été générés auparavant, comme l'anticorps IgM de rat 38.13 et l'anticorps IgM de souris 1A4 qui ont été obtenus dans l'équipe du Pr. S. Hakomori. Ce sont ces anticorps qui ont permis d'établir le Gb3 en tant que marqueur du lymphome de Burkitt, de montrer que le Gb3 était impliqué dans les phénomènes d'apopotose des cellules de lymphome B Gb3 -positives et que le ciblage du Gb3 par des anticorps (Taga et al. 1997 ; Tetaud et al. 2003) ou par la sous-unité B recombinante de la vérotoxine (Mangeney et al. 1993) pouvait également induire une réponse de type apoptotique. Un troisième anticorps, le BGR-23 obtenu plus récemment (Kotani et al. 1994) a servi à l'étude de la distribution tissulaire du Gb3 dans la maladie de Fabry (Askari et al. 2007). Ces anticorps sont spécifiques du motif terminal Gakxl→4Gai et ne peuvent pas reconnaître (1) le motif Gakxl→3Gai présent à l'extrémité terminale de la chaîne oligosaccharidique de isoglobotriosylcéramide (iGb3) et (2) du motif Galal→4Gai présent à l'intérieur de la chaîne oligosaccharidique du globoside Gb4 (GalNac l→3Gakxl→4Gal l→4Glc l→Cer).
Lors de l ' analy se de la spécifi cité, nous avons mi s en évi dence les caractéristiques suivantes. L'anticorps 3E2 reconnaissait sur HPTLC la bande supérieure du doublet Gb3 de cellules HMEC-1 et le Gb3 porcin sous la forme d'un doublet, à la différence des anticorps anti-Gb3 de rat 38. 13 et de souris 1 A4, qui reconnaissaient les deux espèces moléculaires du Gb3 des cellules HMEC-1 et du Gb3 porcin. L'espèce moléculaire correspondant à cette bande supérieure est exprimée de façon hétérogène sur les cellules HMEC-1. Il existe deux populations cellulaires : une population prédominante qui exprime plus faiblement ce Gb3 et une population minoritaire qui exprime fortement ce Gb3. Les anticorps 3E2 et 1A4 reconnaissaient de façon équivalente le Gb3 des cellules Raji qui expriment à leur surface la forme supérieure de façon largement maj oritaire et homogène car toutes les cellules sont marquées de façon importante. Par ailleurs, dans un modèle in- vitro, il a été très clairement montré que l'incorporation de GDia à des cellules HUVEC rendaient ces cellules plus sensibles à de faibles taux de VEGF. Ils proposent ainsi que, dans le microenvironnement tumoral, des glycolipides de cellules tumorales relargués et incorporés aux cellules endothéliales par un phénomène de shedding, favoriseraient la progression tumorale. Les cellules T84 n'exprimant pas le Gb3, les anticorps générés à la suite de l'immunisation étaient dirigés contre le Gb3 exprimé par les cellules endothéliales HMVEC-L issues de la co-culture.
Concernant les cellules endothéliales primaires, on note que la présence de Gb3 est globalement diminuée, indépendamment de la forme du céramide. Cette différence d'expression avec les cellules HMEC-1 peut être due à l'origine tissulaire des cellules. Les cellules endothéliales humaines microvasculaires de rein (HRMEC) expriment 48 fois plus de Gb3 que les cellules endothéliales macrovasculaires de cordons ombilicaux (HUVEC) (3,2 nmoles/106 cellules HRMEC et 0,067 nmoles/106 cellules HUVEC) (Obrig et al. 1993). Les cellules endothéliales humaines microvasculaires de cerveau (HBMEC) expriment 2 fois plus de Gb3 que les cellules endothéliales macrovasculaires de cordons ombilicaux (HUVEC) (612 ± 185 et 269 ± 62 ng/mg de protéines) (Kanda et al. 2004).
La transformation tumorale peut également influencer la teneur d'un glycolipide, comme le montre la surexpression anormale du disialoganglioside acide GD2 dans les neuroblastomes, la plupart des mélanomes et quelques autres tumeurs ou l a surexpression du Gb3 sur plusieurs lignées cellulaires tumorales comme le lymphome de Burkitt (Wiels et al. 1981), des cellules de cancers du sein, ovariens, des cellules tumorales astrocytaires (Gariepy, 2001 ; LaCasse et al. 1999), des cellules de carcinomes épithéliaux des voies digestives supérieures (Marques Filho et al. 2006) ou au niveau de tissus tumoraux humains, comme les cancers du sein (Johansson et al. 2009), des tumeurs colorectales ou des métastases (F aiguières et al. 2008). Le fait que les cellules endothéliales primaires expriment moins de Gb3 que les cellules transformées est un résultat intéressant car nous voulons cibler des cellules endothéliales pro-angiogéniques tout en épargnant les cellules endothéliales de tissus sains. De plus, nous avons analysé la teneur en glycolipides de cellules HMVEC-L cultivées seules en l'absence de co-culture avec d'autres types cellulaire et il a été démontré que la présence de cellules tumorales en co-culture induisait un changement phénotypique et génotypique des cellules endothéliales primaires (Khodarev et al. 2003).
Les modifications biochimiques observées lors de la transformation maligne des cellules affectent également la biosynthèse du céramide. Ces modifications se manifestent aussi bien par des variations dans la longueur de la chaîne aliphatique, le nombre de substitutions ou encore par le degré d' insaturation. Si dans les tissus sains, les chaînes des acides gras sont plus courtes (C14 : 0 à C18 : 0), les gangliosides des cellules tumorales présentent des chaînes d'acides gras plus longues (C22 : 0, C22 : 1 et C24 : 1) (Hakomori et Kannagi, 1983). Une α-hydroxylation aberrante des acides gras des gangliosides tumoraux peut être également observée.
Il est habituel de retrouver des glycosphingolipides présents sous la forme d'un doublet sur des chromatogrammes colorés à l'orcinol. Ces doublets reflètent la présence des substitutions diverses, la longueur de la chaîne d'acide gras, les différences d'hydroxylation et de saturation, au niveau du céramide des glycolipides qui peuvent donc migrer de manière différentielle par HPTLC. Le Gb3 porcin obtenu chez Matreya est constitué d'un mélange de deux types de chaînes de céramide (C : 16 et C : 20) qui sont composées de 70 % d'acides gras saturés et de 30 % d'acides gras non-saturés. Ces deux formes sont reconnues par l'anticorps 3E2 et il est très probable que le doublet Gb3 que l'on trouve dans les cellules HMEC-1 soit lui-même constitué de deux types de chaînes d'acides gras et que la forme inférieure qui n'est pas reconnue par l'anticorps possède une chaîne d'acides gras encore différente. Il a déjà été démontré par HPTLC des cellules HUVEC que le Gb3 était présent sous la forme d'un doublet qui correspondait à deux types de chaînes de céramide (C24 : 0) et (Cl 6 : 0) déterminées par spectrométrie de masse (Miithing et al. 1998). En plus de l'origine tissulaire des cellules vasculaires, il semblerait que le profil glycolipidique varie d'une espèce à l' autre. Seulement quelques traces de Gb3 ont pu être détectées dans les cellules endothéliales aortiques bovines primaires BAEC, dans lesquels différents types de chaînes d'acides gras allant de C24 : 0 ou C24 : 1 au C16 ont pu être détectées.
La présence de ces groupements hydroxyles ainsi que les variations de longueur du céramide modifient la conformation de l ' antigène et ainsi son accessibilité à l'anticorps. L'affinité des anticorps anti-glycolipides augmenterait en fonction de la longueur de la chaînes d'acides gras du céramide, ce qui pourrait être le cas pour la forme supérieure du Gb3 reconnue par l'anticorps 3E2 dans les cellules HMEC-1, alors que l'anticorps ne présente pas d'affinité pour la forme inférieure. Un anticorps anti- GD3 (AcM 4.2) obtenu après immunisation de souris avec des cellules de mélanome humain contenant une teneur importante en GD3 C : 24 ne se fixe que légèrement à des cellules comportant de faibles teneurs en GD3 C : 24. De plus, il a été montré que les anticorps monoclonaux dirigés contre les glycolipides étaient capables de reconnaître des antigènes de haute densité et que ces mêmes anticorps ne seraient pas capables de réagir avec les même antigènes de faible densité.
Les données concernant les différences de fixation des anticorps sont à corréler avec des études qui montrent que la densité, et pas seulement la présence de Gb3, est nécessaire à la fixation la toxine Shiga-like. D'autres études démontrent que la sous- unité B de la Shiga-toxine (StxB), induit en se fixant une « clusterisation » du Gb3 à la membrane qui est responsable de l' invagination de la membrane et qui permet l'internalisation de la sous-unité et son acheminement dans le compartiment intracellulaire. Ceci est rendu possible car la StxB est homopentamérique, ce qui est également le cas de la vérotoxine. La très grande majorité des anticorps que nous avons sélectionnés appartenait à l ' i sotype IgM. Du fait de leur pentavalence, les immunoglobulines M permettraient de mimer la structure pentamérique de ces toxines et de rassembler des glycolipides naturellement présents sous la forme de radeaux lipidiques, d'après des modèles de membranes plasmatiques synthétiques. Ces données expliquent notamment pourquoi un anticorps d'isotype IgGl comme l'anticorps 12E10.1 c sélectionné par la seconde stratégie de criblage présentait une mauvaise affinité pour le Gb3, comme le montrait la faible fixation de cet anticorps sur le Gb3 des cellules HMEC-1.
Il a déj à été démontré que la structure moléculaire du Gb3, c'est à dire sa composition en acides gras, déterminait la localisation des lipides dans les bicouches lipidiques, et contribuait considérablement à la formation de « clusters » du Gb3. Dans le cas de bicouches synthétiques composées de phosphatidylcholine et de Gb3, cette constatation est corroborée par le fait que l'affinité de la STxB augmenterait si la longueur de la chaîne d'acide gras des phosphatidylcholines diminue, ce qui engendrerait une exposition supérieure du Gb3 à la surface de cette bicouche. Ainsi, de la même manière que les anticorps, des études de modélisation moléculaire ont montré que la composition en acides gras influençait la conformation du Gb3 à l'interface membranaire et que cela avait une incidence directe sur l' affinité de la STxB . La fixation de la vérotoxine dépend elle-aussi de la longueur de la chaîne d'acides gras du céramide du Gb3. Les glycolipides présentant des chaînes d'acide gras moyennes ou longues (Cl 6, et C24) sont reconnus préférentiellement alors que les chaînes courtes (Cl 2 et Cl 4) présentent une fixation minimale. Les chaînes d'acides gras C20 : 0 et C22 : 1 ont une plus grande capacité de liaison et la présence d'acides gras insaturés augmentent significativement la liaison de la vérotoxine. L'hydroxylation des acides gras augmentent la liaison également. La liaison de la vérotoxine au motif terminal Gal(al-4)Gal de glycolipides dépend ainsi de la structure entière de la molécule et de son environnement moléculaire au niveau de la membrane plasmique des cellules cibles. Ces résultats mettent en évidence que les glycolipides sont impliqués dans un tropisme cellulaire étroitement lié à leur structure.
L'anticorps 3E2 cible ainsi un glycolipide original présent sur les cellules endothéliales. Il serait important de déterminer la structure des deux espèces moléculaires du Gb3 présentes dans les cellules HMEC-1 et HMVEC-L, afin de mettre en évidence les variations structurales qui sont responsables de la spécificité différentielle des anticorps 3E2 et 1 A4. Nous avions montré précédemment que l'expression du Gb3 était hétérogène dans les cellules HMEC-1 et qu'elle semblait être modulée en fonction de l'état de prolifération de ces cellules. Il faudrait notamment rechercher si ces résultats peuvent être corroborés avec une activité biologique, afin de déterminer les potentialités thérapeutiques de l'anticorps.
EXEMPLE 5. Propriétés biologiques in vitro de VAcM 3E2 anti-Gb3 Nous avons également voulu déterminer si cet anticorps peut présenter des propriétés biologiques et s'il peut constituer un nouvel outil thérapeutique.
5.1. Résultats
Etude du polymorphisme d'expression du Gb3 par cytométrie de flux avec l'anticorps 3E2.
Nous avions au préalable démontré par HPTLC (voir Exemple 2) que la teneur du glycolipide Gb3 pouvait être modulée lorsque les cellules étaient en prolifération, soit incubées en milieu complet, soit incubées en milieu appauvri supplémenté d'un facteur pro-prolifératif, la sphingosine-1 -phosphate (S1P). L'anticorps 3E2 constituant un nouvel outil d'analyse, nous avons de nouveau analysé l'expression du Gb3 sur les cellules HMEC-1 par deux méthodes différentes qui diffèrent de l'analyse HPTLC permettant d'analyser les glycolipides totaux des cellules indépendamment de leur localisation dans la cellule. Par cytométrie de flux, on peut analyser l'homogénéité de l'expression du Gb3 à la surface des cellules et par la technique de Scatchard, on peut déterminer le nombre de sites Gb3 à la surface des cellules.
Nous avons dans un premier temps analysé par cytométrie de flux, l'expression du Gb3 après 24 h d'incubation en milieu de culture appauvri ou complet (Fig. 14).
Nous confirmons par cytométrie que la teneur en Gb3 diminue quand les cellules HMEC-1 sont incubées pendant 24 h en milieu appauvri. En effet, en milieu complet, on note la présence de deux populations cellulaires après marquage avec l'anticorps 3E2. Lorsque les cellules sont incubées en milieu appauvri, il y a moins de cellules marquées (66,4 ± 5,5 % en milieu complet et 42,0 ± 2,0 % en milieu appauvri (n=3)) jusqu'à ce qu'il n'y ait quasiment plus qu'une seule population cellulaire qui exprime faiblement le Gb3. La moyenne d'intensité de fluorescence est diminuée de plus de 50 % (Tableau 14). Tableau 14. Pourcentage de cellules positives et moyenne d'intensité de fluorescence des cellules après analyse en cytométrie de flux.
La diminution de la teneur en Gb3 est moins importante lorsque les cellules sont marquées avec l'anticorps 1 A4. Bien que ce résultat soit préliminaire, il pourrait notamment suggérer que la bande supérieure du doublet Gb3 est particulièrement surexprimée en milieu complet, c'est-à-dire lorsque les cellules endothéliales prolifèrent. Cela montrerait que l'anticorps 3E2, qui reconnaît spécifiquement cette bande supérieure, et tout autre anticorps ayant cette même spécificité, reconnaîtrait en priorité les cellules endothéliales en prolifération, contrairement aux anticorps reconnaissant les deux bandes du doublet.
Nous avons aussi analysé par immunocytochimie avec l'anticorps 3E2, 24 h après leur ensemencement, la répartition du Gb3 membranaire de deux cellules HMEC-1 en interaction cultivées dans leur milieu complet. On observe que la répartition n'est pas homogène comme on peut l'observer lorsque la cellule est isolée (données non montrées). Il existe une polarisation membranaire du Gb3 au niveau de la zone de contact entre les cellules et également la présence de cellules plus isolées plus faiblement marquées (signalées par les flèches blanches). Ainsi, en plus de l'hétérogénéité du marquage des cellules HMEC-1 au sein de la population cellulaire, il existe une hétérogénéité de répartition du Gb3 au niveau de la membrane de cellules en interaction. La présence de cellules isolées signalées par les flèches blanches, qui sont plus faiblement marquées par l'anticorps 3E2 confirment la présence de populations de cellules observées en cytométrie de flux, qui expriment de façon différente le Gb3 à leur surface. Nous avons ensuite analysé par cytométrie de flux avec l'anticorps 3E2, l'expression du Gb3 de cellules HMEC-1 incubées pendant 24 h et 72 h en milieu appauvri supplémenté de sphingosine-1 -phosphate ou de son diluant, le PET (Fig. 15).
Tableau 15. Pourcentage de cellules positives et moyenne d'intensité de fluorescence des cellules après analyse en cytométrie de flux.
Lorsque les cellules sont incubées en présence de S 1P, la teneur en Gb3 à la surface des cellules HMEC-1 augmente légèrement. En cytométrie de flux, cette teneur n'est détectable qu'au bout de 72 h alors que l'on visualisait cette augmentation dès 24 h en HPTLC (Fig. 1C). Les cellules sont positives à hauteur de 42,0 + 0,3 % après incubation avec la S1P, alors que seulement 24,4 + 1,6 % sont positives en présence de milieu appauvri supplémenté par le diluant PET. Lorsque les cellules sont incubées dans du milieu complet, l'augmentation de la teneur en Gb3 est plus importante (Fig. 14). Le sérum de veau fœtal présent dans le milieu complet comporte un mélange de facteurs de croissance et cette augmentation peut être due à une action synergique des facteurs de croissance.
Nous avons ensuite évalué par la technique de Scatchard, le nombre de sites Gb3 à la surface des cellules HMEC-1 incubées 24 h en milieu appauvri ou en milieu complet. L'analyse de la courbe de saturation selon l'équation de Scatchard nous permet de déterminer précisément le nombre de sites Gb3 des cellules HMEC-1, reconnus par l'anticorps 3E2 (tableau 16). Tableau 16. Nombre de sites Gb3 évalué par l'anticorps 3E2 (Kd = 30 nM) pour les cellules HMEC-1 après incubation en milieu de culture appauvri (MA) et en milieu complet (MC).
Il y a 8,5 fois plus de sites Gb3 lorsque les cellules HMEC-1 sont incubées pendant 24 h avec du milieu de culture complet que lorsque les cellules sont incubées avec du milieu de culture appauvri.
II apparaît clairement que la teneur en Gb3 de cellules en prolifération est modulée : la moyenne d'intensité de fluorescence des cellules est augmentée de plus de 50 % (Fig. 14), on observe une polarisation du Gb3 lorsque les cellules HMEC-1 en culture sont en contact alors que les cellules HMEC-1 isolées sont plus faiblement marquées (données non montrées) et il y a 8,5 fois plus de sites Gb3 à la surface des cellules HMEC-1 en prolifération (tableau 15). Ces résultats confirment une fois de plus l'intérêt de générer des anticorps anti-Gb3, il reste à déterminer les propriétés biologiques de l'anticorps.
Propriétés biologiques in-vitro de l'anticorps monoclonal murin 3E2.
Propriétés cytostatiques de l'anticorps 3E2.
Etude de la viabilité cellulaire (MTT) de cellules traitées par l'anticorps 3E2.
Nous avons mesuré d'une part l'inhibition de la viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 et Raji après 24 h d'incubation avec les anticorps 3E2 et 1 A4 à différentes concentrations (Fig. 16) et d' autre part la cinétique de l'inhibition de la viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 après 24 h, 48 h et 72 h d'incubation avec 20 μg/ml d'anticorps 3E2 (Fig. 17).
A 24 h (Fig. 16, A), l'inhibition de la viabilité cellulaire induite par les anticorps 3E2 et 1A4 est comparable et conduit à un plateau de saturation dès 20 à 40 μg/ml d'anticorps, pour lesquels on atteint des valeurs égales à 14,6 ± 1,6 % et 16,3 ± 3, 1 % d'inhibition. Aucune inhibition de la viabilité cellulaire n'est observée avec l'anticorps contrôle isotypique sur ces cellules HMEC-1. Cette inhibition est plus importante pour les cellules Raji (B) qui possèdent plus de sites Gb3 (2,0 106 sites contre 1,7 106 sites pour les cellules HMEC-1) et qui expriment le Gb3 de façon homogène. Au sein de la population de cellules HMEC-1, certaines cellules expriment plus faiblement le Gb3, ce qui pourrait expliquer pourquoi l'inhibition de la viabilité est plus faible. Aucune inhibition n'est observée pour les cellules NXS2 qui n'expriment pas le Gb3. L'inhibition de la viabilité cellulaire est donc dépendante du Gb3.
Nous avons observé l'inhibition de la viabilité cellulaire pendant 72 h à une dose unique de 20 μg/ml d'anticorps 3E2 (Fig. 17). La valeur maximale de l'inhibition de la viabilité cellulaire est presque atteinte dès 24 h d'incubation. A 72 h, on observe que l'inhibition de la viabilité cellulaire est légèrement plus élevée (22,2 ± 9, 1 %). Pour l'anticorps 1A4, la cinétique de l'inhibition est comparable à celle de l'anticorps 3E2 (données non présentées). Aucune inhibition de la viabilité cellulaire n'est observée avec l'anticorps 3E2 sur les cellules NXS2 qui n'expriment pas le Gb3, à 48 h et à 72 h (données non présentées).
Etude vidéo-cinétique des cellules HMEC-1 traitées par l'anticorps 3E2.
Nous avons cherché à déterminer quelle pouvait être la nature de l'inhibition de la viabilité cellulaire observée et pour cela nous avons réalisé une étude vidéo-cinétique en accéléré des cellules HMEC-1 pendant 24 h, en présence de 20 μg/ml d'anticorps 3E2 ou 20 μg/ml d'anticorps contrôle isotypique. Pour chacune des conditions, nous avons comparé le nombre de cellules HMEC-1 par intervalle de temps (Fig. 18), le taux de cellules en division par intervalle de temps et le temps de division des cellules (Fig. 19).
La Fig. 18 représente le nombre de cellules HMEC-1 en fonction du temps d'incubation avec 20 μg/ml d'anticorps 3E2 ou d'anticorps contrôle isotypique. On observe qu'il y a moins de cellules HMEC-1 en présence de l'anticorps 3E2 à 24 h d'incubation. Cette diminution est significative dès 6 h d'incubation (A). Au bout de 24 h, on observe une diminution du nombre de cellules que l'on peut évaluer à environ 18 %, ce qui est proche des 14,6 % d'inhibition de la viabilité cellulaire que l'on observait à 24 h en MTT (Fig. 16). La figure 19 représente la proportion de cellules qui entre en division cellulaire par intervalle de temps (A) et leur temps de division pendant ces 24 h d'incubation cumulées (B). En effet, on peut détecter et comptabiliser les cellules qui entrent en division : les cellules perdent leur adhérence, se décollent du support, deviennent plus réfringentes et adoptent une morphologie circulaire alors qu' elles présentent des expansions cytoplasmiques lorsqu'elles sont adhérentes. On peut ainsi identifier les cellules en division et également leur temps de division jusqu'à ce que les deux cellules- filles adhèrent de nouveau au support.
On observe que le nombre de cellules HMEC-1 en division est moins important lorsque les cellules sont incubées en présence de l'anticorps 3E2 (A). Cette diminution est significative dès 12 h. Lorsque l'on analyse leur temps de division cellulaire sur l' ensemble des 24 h d'incubation, on constate que ce temps est globalement augmenté (B). En présence de l'anticorps 3E2, il y a moins de cellules qui mettent entre 0 et 40 mn ou entre 41 et 80 mn pour se diviser, au profit de cellules qui mettent plus de 80 mn pour se diviser. On note également la présence de cellules qui mettent plus de 120 mn à se diviser (« sup 120 », B), de cellules qui ne parviennent pas à terminer leur division avant la fin des 24 h d'incubation et de cellules qui ne parviennent pas à entrer en division (« recolle », B). Nous avons classé ces cellules dans la catégorie des aberrations mitotiques (Fig. 19, B).
L' analyse des images enregistrées correspondant aux temps de division de cellules incubées en présence du contrôle isotypique et de l'anticorps 3E2 montre que la cellule indiquée par la flèche, met environ 40 mn pour se diviser en présence du contrôle isotypique et une autre cellule incubée avec l'anticorps 3E2 met 130 mn (données non montrées).
L'analyse des images enregistrées des cellules classées dans la catégorie des aberrations mitotiques montre la présence de cellules qui ne parviennent pas à terminer leur division dans les 24 h d'incubation, et le devenir d'une telle cellule observée à 27 h et qui finit par éclater en 120 mn.
Parmi les aberrations mitotiques que nous avons observées, on note également une présence significativement plus importante de cellules qui tentent d' entrer en division cellulaire sans pouvoir y parvenir. Ces cellules se décollent, deviennent réfringentes puis adhèrent de nouveau, de façon successive. Propriétés anti-angiogéniques de l'anticorps 3E2.
Nous avons évalué les propriétés anti-angiogéniques de l'anticorps 3E2 par le test des anneaux aortiques qui constitue le test ex vivo de référence pour mesurer les activités pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques de molécules (Fig. 20).
Au bout de cinq jours d'incubation des anneaux dans du milieu complet sans anticorps (A, photo 2), on observe la formation d'un nombre important de bourgeons vasculaires caractérisés par leur longueur et leur densité. Lorsque les anneaux sont incubés avec l'anticorps 3E2 (Fig. 20, B), on observe une inhibition de la formation des bourgeons dès 20 μg/ml, qui est significative à 40 μg/ml. Cette inhibition est dépendante du Gb3, l'anticorps 1 A4 présente une activité anti-angiogénique comparable à l'anticorps 3E2, alors que l'anticorps contrôle isotypique n'induit pas de diminution significative de la formation de bourgeons. Propriétés cytotoxiques de l'anticorps 3E2 en présence de complément humain
(CDC).
Nous avons évalué ci-dessus que l' anticorps 3E2 présentait une activité cytostatique : il induit une inhibition de la viabilité cellulaire à 24 h, une diminution de nombre de divisions cellulaires avec un allongement du temps de division. Il induit également une inhibition de la formation de bourgeons vasculaires sur des explants de coupes transversales d'aorte en culture. Ces observations ont été obtenues en l'absence de complément. Nous avons cherché à mesurer l'activité CDC (cytotoxicité dépendante du complément) de l'anticorps par cytométrie de flux selon une méthode mise au point au laboratoire en utilisant la capacité de l'iodure de propidium à se lier à ADN des cellules. Si les membranes des cellules ont été endommagées par une activité CDC, leur ADN sera accessible et l'iodure de propidium pourra être visualisé en cytométrie de flux.
La Fig. 21 présente l' activité CDC des anticorps 3E2, 1A4 et du contrôle isotypique (10 μg/ml d'anticorps) sur les cellules FDVIEC-1, Raji et NXS2, en présence de sérum humain décomplémenté et non décomplementé. Le tableau 17 répertorie le pourcentage de cellules lysées pour des concentrations en anticorps allant de 0, 1 à 10 μg/ml (moyenne de 3 expérimentations indépendantes). Tableau 17. Pourcentages de cellules lysées (n=3) après fixation des anticorps
3E2 et 1 A4 sur les cellules HMEC-1, Raji et NXS2.
ND : non déterminé. ISO : contrôle isotypique.
En l'absence de sérum non décomplémenté, les cellules sont incubées avec du sérum décomplémenté. A 10 μ /ηι1, l'anticorps 3Ε2 présente une activité CDC sur les cellules HMEC-1 (Tableau 17, 51,3 ± 9,2 % de cellules lysées) et les cellules Raji (71,8 ± 5, 5 % de cellules lysées). L'activité peut être détectée à des concentrations faibles de l'ordre de 0,5 μ ηύ d'anticorps (20,6 ± 3,2 de cellules HMEC-1 lysées et 36,4 ± 6,8 % de cellules Raji lysées). L'anticorps 1A4 possède également une activité CDC importante à 10 μg/ml (65,2 ± 13,2 % de cellules HMEC-1 positives et 82,9 ± 7,7 % de cellules Raji positives). L'activité CDC peut être détectée dès 0, 1 μg/ml d'anticorps (37,2 ± 12,6 % de cellules HMEC-1 positives et 25,8 ± 3,9 % de cellules Raji positives).
Les cellules NXS2, qui n'expriment pas le Gb3, ne sont pas lysées en présence des anticorps 3E2 et 1 A4 et les cellules HMEC-1 et Raji, qui expriment le Gb3, ne sont pas lysées en présence du contrôle isotypique : ainsi l'activité cytotoxique observée est clairement dépendante du Gb3. En l'absence d'anticorps, les cellules NXS2, HMEC-1 et Raji ne sont pas lysées en présence de sérum non décomplémenté, : il n'y a donc pas d'activation de la voie alterne du complément qui j oue un rôle important dans les défenses immunitaires non spécifiques innées. Les cellules HMEC-1 et Raji ne sont pas lysées en présence des anticorps 1 A4 ou 3E2 lorsqu'elles sont incubées en présence de sérum décomplémenté ou en l'absence de sérum humain : il n' observe pas de mort cellulaire de type apoptose ou nécrose. L' activité cytolytique observée est donc bien dépendante de l'activation du complément, via la fixation des anticorps sur le Gb3.
Parallèlement aux marquages à l'iodure de propidium qui traduisent l'activité CDC des anticorps, nous avons mesuré l'expression du Gb3 par cytométrie de flux, afin d'évaluer les ratios « activité CDC / marquage cellulaire » pour 10 μg/ml d'anticorps, qui sont répertoriés dans le tableau 18.
Tableau 18. Ratios « activité CDC / marquage cellulaire ».
Marquage du
Marquage à l'iodure
Gb3 Ratios de propidium (CDC)
membranaire
Cellules 3E2 51,3 + 9,2 % 75,0 + 1 1,3 % 68,2 + 6,2 % HMEC-1 1A4 65,2 ± 13,2 % 92,7 + 5,9 % 69,9 + 10,2 %
3E2 71,8 ± 5,5 % 91,6 + 5,3 % 78,7 + 8,2 %
Cellules Raji
1A4 82,9 ± 7,7 % 99,3 + 0,2 %, 83,4 + 7,8 % Pour les cellules HMEC-1, le ratio est évalué à 68,2 ± 6,2 % pour l'anticorps 3E2 et 69,9 ± 10,2 % pour l'anticorps 1A4. Pour les cellules Raji, le ratio est évalué à 78,7 ± 8,2 % pour l'anticorps 3E2 et 83,4 ± 7,8 % pour l'anticorps 1A4. Ainsi les deux anticorps ont des activités CDC comparables. L'anticorps 1A4 présente des valeurs d'activités CDC supérieures à celles de l'anticorps 3E2 car son affinité pour le Gb3 est supérieure.
5.2. Conclusion
Les anticorps agissent principalement de trois manières qui peuvent être cumulatives. Par fixation directe, ils peuvent induire des activités cytostatiques (de type blocage du cycle cellulaire) ou des activités cytotoxiques (de type apoptose, nécrose). Par CDC, ils peuvent induire l'activation des protéines du complément par fixation du complexe protéique Clq sur la région Fc d'anticorps liés à leur cible, aboutissant ainsi à la formation du complexe d'attaque membranaire et à la lyse cellulaire. Par ADCC, les récepteurs FcyR se fixent sur la région Fc d'anticorps liés à leur cible conduisant ainsi à la lyse ou la phagocytose induite par une cellule effectrice du système immunitaire.
Les différents tests biologiques mis en œuvre montrent que l'anticorps 3E2 présente dans un premier temps une activité cytostatique indépendante du complément. On observe par MTT une inhibition de la viabilité cellulaire des cellules FDVIEC-1 égale à 14,6 ± 1,6 % pour 20 μg/ml d'anticorps, dès 24 h (Fig. 16). Ce résultat est confirmé par une étude vidéo-cinétique des cellules HMEC-1. Lorsque les cellules sont incubées avec 20 μg/ml d'anticorps, on observe une diminution du nombre global de cellules proche de la valeur d'inhibition que l'on obtient en MTT (Fig. 18). Il y a moins de cellules qui se divisent et leur temps de division est globalement allongé. A 72 h, l'inhibition de la viabilité cellulaire des cellules HMEC-1 est égale à 22,2 ± 9,1 %. Cette valeur est proche de la valeur maximale que l'on obtenait à 24 h avec 40 μg/ml d'anticorps 3E2 (16,3 ± 3, 1 % ; Fig. 16). Cela peut s'expliquer par la présence de cellules HMEC-1 exprimant plus faiblement le Gb3, qui sont alors moins sujettes à l'inhibition de la viabilité cellulaire induite par l'anticorps 3E2 et par la croissance très rapide de ces cellules transformées par le virus SV40. C'est pourquoi nous avons réduit notre étude vidéo-cinétique sur les premières 24 h car au delà, les cellules HMEC-1 envahissent les champs d'analyse très rapidement et il n'est plus possible de les comptabiliser.
En présence de l'anticorps 3E2, on observe également une augmentation de la fréquence des aberrations mitotiques associées à la présence de cellules bloquées en division pendant plusieurs heures et qui finissent pas éclater, ainsi que la présence de cellules qui n' arrivent pas à entrer en division et qui alternent des cycles répétés d'attachement et de détachement cellulaires. De telles aberrations mitotiques peuvent être attribuées à des mécanismes de mort impliquant l'adhérence, telle que la mort par anoikis, comme cela a déjà été démontré pour un anticorps ciblant le ganglioside GD2 dans les cancers du poumon à petites cellules. L' anoikis est, un phénomène de mort qui a été mis en évidence pour la première fois en 1994 et qui caractérise la perte de contact des cellules avec leur matrice extracellulaire. Il a été montré qu'un anticorps anti-GD2 induisait une apoptose via la protéine cytoplasmique ubiquitaire FAK (Focal Adhésion Kinase) retrouvée au sein du complexe d'adhérence et qui peut être activée par les intégrines mais aussi par différents facteurs de croissance, des cytokines ou des hormones. Concernant le Gb3, il a déjà été montré pour des cellules endothéliales microvasculaires issues de patients atteints de la maladie de Fabry, que le Gb3 présent en quantité importante était associé à une expression accrue de molécules impliquées dans l'adhérence cellulaire telles que les protéines ICAM-1, VCAM-1 et la sélectine E. Zemunic et al. (2004) ont comparé la distribution du Gb3 avec celle de la sélectine E au sein de cellules HUVEC stimulées par le T F-α. Les cellules activées étaient caractérisées par une augmentation de l'expression de la sélectine E associée à une augmentation de l'expression de Gb3. Ces résultats suggèrent que le Gb3 pourrait avoir un rôle potentiel dans les mécanismes d'adhésion au sein de l'endothélium (Zemunik et al. 2004).
Nous avons par ailleurs mis en évidence par immunocytochimie sur des cellules en prolifération, qu'il existait une polarisation du Gb3 membranaire au niveau de la zone de contact de deux cellules HMEC-1 en interaction (données non montrées). Lorsque la cellule est isolée, la répartition membranaire du Gb3 est plutôt homogène (données non montrées). Il a été récemment décrit que l'augmentation de la teneur en glycosphingolipides dans le tissu tumoral, comme le Gb3 dont la teneur est 2 à 3 fois supérieure dans les carcinomes épithéliaux, pouvait se traduire par des modifications morphologiques au niveau des microdomaines membranaires (Marques Filho et al. 2006). Ces modifications seraient responsables d'une meilleure interaction des cellules entre elles et des cellules avec leur matrice extracellulaire, ce qui augmenterait ainsi leur pouvoir d'infiltration et leur pouvoir métastastatique (Marques Filho et al. 2006). La migration des cellules nécessite la mise en place d'un système finement régulé d' organisation du cytosquelette et des complexes d' adhérence. Chez les cellules endothéliales, le traitement par l'IFN-γ augmente la proportion relative de Gb4 intracellulaire qui est associé au cytosquelette de la cellule. La modulation spécifique des glycosphingolipides par l'IFN-γ suggère qu'ils peuvent j ouer un rôle dans les mécanismes d'adhésion des cellules endothéliales activées. Notamment, les glycolipides les plus abondants des cellules HUVEC, le Gb4 et le GM3, sont localisés à la surface et au niveau intracellulaire où ils sont associés aux filaments intermédiaires de vimentine du cytosquelette qui pourraient jouer un rôle dans le transport des glycosphingolipides. Il a ensuite été montré qu'après fixation sur le Gb3, la vérotoxine est internalisée jusqu'au réticulum endoplasmique rugueux et à l'enveloppe nucléaire, suggérant que le Gb3 peut jouer un rôle dans la croissance cellulaire puisque son expression varie en fonction du cycle cellulaire et que les cellules en phase Gl/S sont plus sensibles à la liaison de la toxine alors que les cellules en phase stationnaire y sont réfractaires. Il semblerait ainsi que les variations d'expression du Gb3 soient associées au cycle cellulaire, à la migration des cellules et à leur adhérence.
La forte expression membranaire d'un antigène, surtout s'il n'est pas soumis à des phénomènes d'internalisation, peut permettre d'obtenir une densité de complexes antigène-anticorps élevée à la membrane, favorisant le recrutement des effecteurs de l'immunité, et en particulier du complément. La voie classique est activée par le complexe antigène-anticorps et parmi les immunoglobulines, les IgM sont des activateurs efficaces de la cytotoxicité dépendante du complément. L'anticorps 3E2 est capable d'activer la CDC dès 0,5 xglm\ sur les cellules HMEC-1 (20,6 ± 3,2 % de cellules lysées) qui possèdent 1,7 106 sites Gb3 et dès 0, 1 μg/ml sur les cellules Raji (15,7 ± 5,2 %) qui possèdent 2,0 106 sites. Pour l'anticorps 1A4, l'activité CDC est observée dès 0, 1 xglm\ sur les cellules HMEC-1 (22,2 ± 6,9 %) et Raji (25,8 ± 3,9 %). Les deux anticorps sont ainsi capables d'activer la voie du complément pour de faibles concentrations en anticorps. Cette activité dépendante du complément nous permet d'envisager de futures études précliniques chez la souris.
EXEMPLE 6. Séquences des anticorps anti-Gb3 selon l'invention Les sept anticorps monoclonaux sélectionnés (3E2, 14C 1 1 , 15C 1 1 , 22F6,
25C10, 11E10, 16G8) ont été obtenus à partir d'une seule hybridation somatique et d'un seul clonage. Ils sont tous d' isotype IgM et présentent tous une chaîne légère de type κ. Pour analyser les mécanismes de la réponse immune au Gb3 et leur relation structure- fonction, nous avons séquencé les segments géniques VH et VL des anticorps dirigés spécifiquement contre le glycolipide Gb3. La problématique était de déterminer à quoi cette spécificité pouvait être due : soit à l'expression restreinte du répertoire des gènes VDJ, soit à la présence de mutations somatiques.
Gènes utilisés pour les régions variables de la chaîne lourde des anticorps anti- Gb3.
Les séquences nucléotidiques des chaînes lourdes des sept anticorps anti-Gb3 sont représentées dans la Fig. 22.
Les gènes utilisés pour les régions variables des chaînes lourdes sont répertoriés dans le tableau 19 suivant.
Tableau 19. Gènes utilisés pour les régions variables des chaînes lourdes.
Gène J Longueur des Séquence en
Nom Gène V Gène D
et son AA de séquence et son allèle Homologie Homologie et son allèle CDR FR
allèle de la jonction
IIGGHHVV11-- 99 66 ., 88 33 %% 1 0 0 %
5C11 VH2A IGHJ3*01 IGHD3-3*01 8.8.10 [2.17.38.7] CA GD AW
82*01 (214/221 nt) (35/35 nt) FAYW
IGHV1S22 9 8 , 7 1 % 9 3 , 3 3 % CTRKFLFDY2F6 VH2B IGHJ2*01 IGHD5-1*01 8.8.8 [6.17.38.10]
*01 (229/232 nt) (42/45 nt) W
IGHV1-
74*01,ou 9 3 , 0 9 % 8 4 , 7 8 % CAGGDRYG5C10 VH2B IGHJ2*01 IGHD3-3*01 8.8.8 [6.17.38.10]
IGHV1- (216/232 nt) (39/46 nt) YW
74*04
IGHV2-6-
7*01, ou 1 0 0 % 81,65 % CARNGNYL4C11 VH1A IGHJ2*01 IGHD2-1*01 8.7.11 [9.17.38.11]
IGHV2-6- (238/238 nt) (39/48 nt) AFDYW
7*02
IGHV4- 9 9 , 1 5 % 6 5 , 9 6 % CARGDYYGE2 VH1A IGHJ2*01 IGHD1-1*01 8.8.12 [7.17.38.11]
1*02 (233/235 nt) (31/47 nt) SRCDYW
IGHV5- 9 8 , 7 3 % 9 3 , 7 5 % CARPTYGYF6G8 VH3A IGHJ2*01 IGHD2-11*01 8.8.10 [8.17.38.11]
12*02 (234/237 nt) (45/48 nt) DYW
IGHV9-3- 9 8 , 7 3 % 8 4 , 0 9 %
1E10 VH2C IGHJ2*01 IGHD2-3*01 8.8.5 [7.17.38.11] CASGVYW
1*01 (233/236 nt) (37/44 nt)
D'après le tableau ci-dessus, les sept anticorps spécifiques du glycolipide Gb3 utilisent chacun un gène V différent avec un degré d'homologie à la configuration 5 germinale supérieure à 98% hormis le cas des AcM 15C1 1 et 25C10 qui se distinguent respectivement par 96,8 % et 93, 1 % d'homologie. On notera pour l'AcM 14C1 1 une homologie du gène V identique à l'allèle IGHV2-6-7*01 ou 02. De plus excepté pour l'AcM 15C 1 1 qui a 100 % d'homologie avec l' allèle IGHJ3 *01 , les 6 autres AcM utilisent tous le même gène J (IGHJ2*01) qui combine avec un gène D, différents0 produits des séquences VH, différentes pour chaque hybridome. La longueur de la région hypervariable CDR3H est comprise entre 5 et 12 acides aminés.
Gènes utilisés pour les régions variables de la chaîne légère des anticorps anti-Gb3.
Les séquences nucléotidiques des chaînes lourdes des sept anticorps anti-Gb35 sont représentées dans la Fig. 23. Les gènes utilisés pour les régions variables des chaînes légères sont répertoriés dans le tableau 20 suivant.
Tableau 20. Gènes utilisés pour les régions variables des chaînes légères.
Longueur du Séquence en
Nom Gène V Gène J
AA
de et son et son CDR CDR CDR
Homologie Homologie FR de la séquence allèle allèle 1 2 3
jonction
11E10 VK IGKV1- 1 0 0 % 1 0 0 % CVQGTH##
IGKJ1*01 11 3 X [6.17.36.7]
A 133*01 (234/234 nt) (28/28 nt) TF
25C10_V IGKV3- 1 0 0 % 1 0 0 % CQQSKEVP
IGKJ1*01 10 3 9 [6.17.36.7]
KA 2*01 (233/233 nt) (26/26 nt) RTF
16G8 VK IGKV4- 9 9 , 5 3 % 1 0 0 % CQQWSSNP
IGKJ5*01 5 3 9 [5.17.36.7]
F 72*01 (214/215 nt) (25/25 nt) PTF
15C11_V IGKV4- 1 0 0 % 1 0 0 % CQQGSSIP
IGKJ2*01 7 3 9 [5.17.36.8]
KF 91*01 (221/221 nt) (23/23 nt) RTF
14C11_V IGKV5- 1 0 0 % 1 0 0 % CQNGHSFP
IGKJ5*01 6 3 9 [7.17.36.10]
KA 39*01 (222/222 nt) (38/38 nt) LTF
IGKV5- 9 9 , 5 5 % 1 0 0 % CQQSNSWP
22F6_VKF IGKJ5*01 6 3 9 [6.17.36.10]
45*01 (220/221 nt) (35/35 nt) HTF
IGKV14- 9 0 , 9 1 % 1 0 0 % CLQHGESP
3E2_VKF IGKJ5*01 6 3 9 [6.17.36.10]
111*01 (200/220 nt) (38/38 nt) LTF L'alignement des séquences nucléotidiques codant pour la région variable VK des sept anticorps monoclonaux montre tout d'abord une utilisation de gènes V tous différents mais qui toutefois, sont quasiment tous en configuration germinale à l'exception de l'AcM 3E2 que nous avons sélectionné comme le plus affin de tous. Sa spécificité est associée très vraisemblablement à la variabilité du segment J de VH (65,9 %) combinée à celle du segment génique V de VK (90,9 %). Il est par ailleurs intéressant de noter que l'AcM 3E2 est codé par le même gène J (IGKJ5*01) que les AcM 14C 1 1 et 22F6 avec le même degré d'homologie mais avec une expression jonctionnelle en acides aminés différente d'un hybridome à l'autre. Les sept anticorps anti-Gb3 ont été générés lors d'une unique hybridation somatique et les similitudes que l' on observe dans les chaînes lourdes et légères suggèrent que les anticorps sont liées par le clonage. Nos résultats indiquent qu'une variété de chaînes VH et VL peuvent coder pour les anticorps anti-Gb3 et que certains sont soumis à un processus de maturation révélés par plusieurs mutations somatiques. L'ensemble des données nucléotidiques recueillies pour l'expression des sept AcM spécifiques du Gb3 confirme après clonage des hybridomes l'existence de combinaisons distinctes des gènes VDJ et VJ pour l'expression des AcM sans apparemment aucune restriction.
Il pourrait effectivement être très intéressant de suivre parallèlement la mesure de l'affinité de l'anticorps monoclonal et l'état des séquences nucléotidiques respectives pour comprendre la nature des interactions des AcM et du glycolipide Gb3. Par mutagenèse dirigée il pourrait être plus facile de définir les acides aminés critiques des régions variables et plus particulièrement des régions hypervariables qui confèrent classiquement la spécificité des anticorps.
Nous sommes actuellement en train d'évaluer les affinités de chacun des sept anticorps par la technique de Scatchard afin de mettre en évidence plus précisément les relations existant entre la structure nucléotidique de l'anticorps et son affinité.
Touj ours est-il que le séquençage des régions VH et VL des AcM est indispensable pour concevoir et optimiser à des fins thérapeutiques chez l'homme des anticorps chimériques voire humanisés à défaut de pouvoir obtenir des anticorps humains. Cette démarche nécessite pour le moins une modélisation tridimensionnelle des régions variables VH et VL de l'anticorps adaptée à la reconnaissance spécifique du Gb3 pour substituer les régions hypervariables d'un anticorps humain par celles de l'AcM 3E2 que nous avons défini comme le chef de file des sept anticorps que nous avons caractérisés vis à vis du glycolipide Gb3. EXEMPLE 7. Confirmation in vivo des propriétés anti- angiogéniques de l'anticorps 3E2 dans deux modèles tumoraux
Le potentiel thérapeutique de l'anticorps 3E2 dans le traitement des tumeurs solides a été confirmé in vivo dans deux modèles tumoraux reposant sur la ligné de neuroblastome murin NXS2, et comparé à celui d'un anticorps anti-GD2.
Ces deux modèles reposant sur le neuroblastome murin NXS2 ont été choisis pour les raisons suivantes : - Dans la mesure où les cellules NXS2 n'expriment pas le Gb3 (voir Exemple 3 et résultats ci-dessous), ces modèles permettent d'évaluer précisément les effets in vivo de l'anticorps 3E2 sur les vaisseaux tumoraux (c'est-à-dire ses propriétés anti-angiogéniques), et non une combinaison des effets sur les vaisseaux tumoraux et sur les cellules tumorales elles-mêmes, comme ce serait le cas si les cellules tumorales choisies exprimaient aussi le Gb3,
- Il existe dans ce modèle un traitement anticorps de référence, correspondant aux anticorps anti-GD2, le GD2 étant un autre glycolipide qui est, contrairement au Gb3, exprimé par les cellules tumorales NXS2 et non exprimé par les cellules des vaisseaux sanguins.
Ces deux modèles permettent donc d'évaluer les propriétés anti-angiogéniques in vivo de l'anticorps 3E2, et de comparer son efficacité à celle d'un anticorps considéré comme traitement de référence dans la pathologie choisie.
7.1. Matériels et méthodes
Tumeurs NSX2 établies en sous-cutané
Des souris AJ femelles ont été inoculées en sous-cutané dans le flanc droit avec 106 cellules NSX2 (lignée de neuroblastome) vivantes (viabilité >95%) resuspendues dans 150 μΐ. de PBS. La progression tumorale a été mesurée chaque jour. Les diamètres long (D) et court (d) de chaque tumeur ont été mesurés avec un pied à coulisse. Le volume tumoral V a été calculé en utilisant la formule suivante : V = 0,5 x D x d2. Lorsque les tumeurs ont atteint un volume V de 100-150 mm3, les souris ont reçu un traitement avec l'anticorps 3E2 dirigé contre la bande supérieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1, l'anticorps anti-GD2 14G2a, un anticorps contrôle d'isotype IgM ou du PBS seul. Le traitement a consisté en une unique injection dans 150 μΕ de PB S. La progression tumorale a été mesurée comme précédemment et exprimée en pourcentage d'augmentation par rapport au volume tumoral au moment de l'injection. Modèle de tumeur NSX2 métastatique
Souris
Des souris A/J mâles (âgées de 6-8 semaines) ont été obtenus de Harlan Sprague-Dawley (Sulzfeld, Germany). Les études animales ont été réalisées en accord avec la Directive 86/609/CEE.
Modèle tumoral
Des métastases hépatiques expérimentales ont été induites par injection dans la veine de la queue à jour 0 de 2,5 105 cellules tumorales NSX2 (viabilité>95%) dans 200 de PBS. Les souris ont été traitées avec des injections intraveineuses d'anticorps monoclonaux à jours 1, 2, 7 et 8 pour l'anticorps 3E2 (IgM, 200 μg dans 150μΕ de PBS), ou à jours 1 et 2 pour l'anticorps 14G2a (IgG, 100 μg dans 100 μΕ) ou pour un anticorps contrôle isotypique IgG (100 μg dans 100 μΐ.) respectivement. Les quantités molaires d'anticorps de chaque injection sont similaires pour tous les anticorps, la masse plus importante utilisée pour l' anticorps 3E2 (IgM) par rapport aux autres anticorps (IgG) étant due au poids moléculaire plus élevé des IgM par rapport aux IgG. De manière similaire, les nouvelles inj ections d' anticorps 3E2 à j ours 7 et 8 sont rendues nécessaires par la demi-vie limitée des IgM in vivo (environ 1 semaine), ce qui n'est pas le cas pour les autres anticorps d'isotype IgG, les IgG ayant une demi-vie in vivo d'environ 3 semaines.
Des souris contrôles n'ont reçu que du PBS. Les animaux ont été sacrifié à jour 28, leur foie a été pesé et le nombre de métastases évalué.
Histologie et marquage immunohistochimique
Des tumeurs congelées ont été découpées et fixées à l'acétone froid pendant 10 minutes. Les échantillons ont été marqués pendant 90 minutes avec les anticorps monoclonaux suivants : un anticorps de rat dirigé contre le CD31 Murin (1 :50; Millipore, Molsheim, France) et un anticorps biotinylé 3E2, 14G2a (anti-GD2) ou son contrôle isotypique (Beckmann Coulter, Fullerton, CA, USA) (40μg/ml). L'anticorps 3E2 et le contrôle isotypique ont été biotinylés avec un kit EZ-Link Sulfo- HS-LC- Biotinylation (Thermo Scientific, Courtaboeuf, France). Le marquage a été révélé par 90 minutes d'incubation avec un anticorps de chèvre anti-rat conjugué avec AF 488 (1 :400; Invitrogen) pour CD31 et avec de la streptavidine conjuguée avec AF 568 (1 :200; Invitrogen) pour l'anticorps 3E2 ou son contrôle isotypique. Les échantillons ont finalement été recouverts avec un réactif ProLong gold antifade avec du DAPI. Des organes d'animaux sains ont également été marqués avec l'anticorps 3E2 ou son contrôle isotypique en utilisant le même protocole. Les marquages ont été observés sous un microscope confocal à fluorescence (Nikon, Champigny sur Marne, France). Des sections de muscle ont été utilisées comme contrôle de tissu normal.
7.2. Résultats
Tumeurs NSX2 établies en sous-cutané
Les volumes tumoraux étaient compris entre 120 et 130 mm3 et ne différaient pas significativement lors de l'inj ection du traitement (anticorps 3E2, 14G2a, IgM contrôle, ou PB S).
L'évolution du volume tumoral après traitement est représentée sur la Figure 24. A 24 heures après traitement, une unique injection par l'anticorps 3E2 permet de réduire significativement le volume tumoral à 24H par rapport au traitement par PB S seul (volume tumoral de 178,3 ± 13,19 mm3 avec le PBS (n=l l) vs 137,9 ± 11,08 mm3 pour l'anticorps 3E2 (n=8)). Ce n'est pas le cas pour les autres traitements (anticorps 14G2a ou IgM contrôle).
A 48 et 72 heures, le traitement par l'anticorps 3E2 conduit à un volume tumoral plus faible, même si la différence n'est pas statistiquement significative. Cela s'explique probablement par le fait qu'un nombre trop faible d'animaux a été testé à 48 et 72 heures après traitement.
Modèle de tumeur NSX2 métastatique
L'efficacité antitumorale de l'anticorps 3E2 a ensuite été déterminée dans le modèle de métastases hépatiques expérimentales du neuroblastome de souris NSX2 développé par Lode et al.
Il a d'abord été vérifié que l'anticorps 3E2 cible spécifiquement les vaisseaux au sein de la masse tumorale par histologie et marquage immunohistochimique. Les résultats sont présentés dans le Tableau 21 ci-dessous, et montrent que l'anticorps 3E2 génère un marquage intense colocalisé avec celui de l'anticorps anti-CD31 (marqueur des cellules des vaisseaux sanguins), et aucun marquage dans la masse tumorale. Les sections de muscle ne montraient aucun marquage Gb3, seules les cellules endothéliales au sein des vaisseaux tumoraux étant marquées par l' anticorps 3E2. Les cellules tumorales NXS2 montraient en revanche un fort taux de GD2.
Cellules
Cellules de
Antigène endothéliales Muscle neuroblastome
tumorales
GD2 +
CD31 +
Gb3 +
Anticorps
contrôle
Tableau 21. Distribution du Gb3 au sein de la masse tumorale de métastases NXS2. La distribution de GD2, Gb3 et CD31 distribution au sein de la masse tumorale de métastases NXS2 de souris non traitées a été détectées par immunohistochimie. -, pas de marquage; +, marquage positif. Des sections de muscle ont été utilisées comme contrôle.
Pour évaluer le bénéfice thérapeutique d'injections de l'anticorps monoclonal 3E2 et le comparer avec une immunothérapie avec l'anticorps monoclonal anti-GD2 14G2a, le nombre de métastases hépatiques de NSX2 et le poids du foie ont été évalués après ces différents traitements (Figure 25).
Le traitement des souris par les anticorps 3E2 et 14G2a s'est révélé très efficace pour réduire les métastases hépatiques de neuroblastome, comme indiqué par la diminution du poids du foie de 39 ±6,23 g (souris traitées par le PBS) à 17 ± 5,03 g (souris traitées par l'anticorps 3E2) et 6,75 ±2,06 g (souris traitées par l'anticorps 14G2a) (p>0,05). Ces deux dernières valeurs ne sont pas significativement différentes de celles trouvées chez des animaux contrôles sains (p>0.1). L'effet du traitement par l'anticorps monoclonal 3E2 n'est pas significativement différent de celui du traitement par l'anticorps monoclonal 14G2a (p>0,5). Ces données confirment en outre la spécificité de la thérapie par l'anticorps 3E2, puisque le traitement par un anticorps isotype contrôle est complètement inefficace.
Parce que l' anticorps 3E2 est une IgM, dont la distribution est limitée au compartiment intravasculaire et parce qu'il reconnaît les vaisseaux sanguins dans les tumeurs solides mais pas dans les tissus sains, les résultats suggèrent que ses effets thérapeutiques sont liés à son action sur ces vaisseaux sanguins.
7.3. Conclusion
Ces résultats montrent pour la lere fois qu'une immunothérapie passive avec l'anticorps anti-Gb3 3E2 est efficace pour supprimer la croissance de métastases tumorales dans un modèle pertinent de neuroblastome syngénique chez la souris, qui est similaire à la maladie humaine (Lode et al). Ce modèle tumoral exprime le disialoganglioside GD2, un antigène associé au neuroblastome bien connu ( Lode et al), mais pas le Gb3, comme démontré in vitro et in vivo.
De manière similaire, l'injection d'anticorps 3E2 est également efficace pour inhiber des tumeurs de neuroblastome NXS2 sous-cutanées chez la souris A/J.
La distribution du Gb3 au sein des métastases NXS2, mise en évidence par marquage avec l'anticorps 3E2 et validée par marquage CD31 de coupes de tissu, est clairement limitée aux cellules endothéliales des vaisseaux sanguins du compartiment tumoral. Par conséquent, les résultats obtenus démontrent que l'activité anti-vasculaire des anticorps anti-Gb3 3E2 est suffisante pour inhiber la croissance tumorale in vivo. Les résultats obtenus démontrent également que l'efficacité anti-tumorale de l'anticorps anti-Gb3 3E2 est comparable à celle de l'anticorps anti6GD2 14G2a, qui cible directement les cellules de neuroblastome NXS2 et qui a fait l'objet d'évaluations cliniques avec des résultats positifs (Murray et al). REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Anticorps dirigé contre le glycosphingolipide membranaire globotriaosylceramide (Gb3), ou un fragment fonctionnel ou un dérivé de celui-ci, caractérisé en ce qu'il possède au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 42, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 42.
2. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne lourde comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 1 à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39, ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 1 à 3, 7 à 9, 13 à 15, 19 à 21, 25 à 27, 31 à 33, et 37 à 39.
3. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne légère comprenant au moins une région de détermination de la complémentarité (CDR) ayant une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42,ou ayant une séquence d'acides aminés ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 4 à 6, 10 à 12, 16 à 18, 22 à 24, 28 à 30, 34 à 36, et 40 à 42. 4. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne lourde comprenant trois CDR-H (CDR de chaîne lourde) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%), au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%>, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) CDR1-H-3E2 : SEQ ID NO : 1, CDR2-H-3E2 : SEQ ID NO : 2, CDR3-H-3E2 :
SEQ ID NO : 3,
b) CDR1-H-14C11 : SEQ ID NO : 7, CDR2-H-14C11 : SEQ ID NO : 8, CDR3-H- 14C11 : SEQ ID NO : 9,
c) CDR1-H-15C11 : SEQ ID NO : 13, CDR2-H-15C11 : SEQ ID NO : 14, CDR3- H-15C11 : SEQ ID NO : 15,
d) CDR1-H-22F6 : SEQ ID NO : 19, CDR2-H-22F6 : SEQ ID NO : 20, CDR3-H- 22F6 : SEQ ID NO : 21,
e) CDR1-H-25C10 : SEQ ID NO : 25, CDR2-H-25C10 : SEQ ID NO : 26, CDR3- H-25C10 : SEQ ID NO : 27,
f) CDR1-H-11E10 : SEQ ID NO : 31, CDR2-H-11E10 : SEQ ID NO : 32, CDR3- H-l 1E10 : SEQ ID NO : 33, ou
g) CDR1-H-16G8 : SEQ ID NO : 37, CDR2-H-16G8 : SEQ ID NO : 38, CDR3-H- 16G8 : SEQ ID NO : 39.
5. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne légère comprenant trois CDR-L (CDR de chaîne légère) ayant les séquences d'acides aminés suivantes, ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%), au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) CDR1-L-3E2 : SEQ ID NO : 4, CDR2-L-3E2 : SEQ ID NO : 5, CDR3-L-3E2 :
SEQ ID NO : 6,
b) CDR1-L-14C11 : SEQ ID NO : 10, CDR2-L-14C11 : SEQ ID NO : 11, CDR3- L-14C11 : SEQ ID NO : 12,
c) CDR1-L-15C11 : SEQ ID NO : 16, CDR2-L-15C11 : SEQ ID NO : 17, CDR3- L-15C11 : SEQ ID NO : 18, d) CDR1-L-22F6 : SEQ ID NO : 22, CDR2-L-22F6 : SEQ ID NO : 23, CDR3-L- 22F6 : SEQ ID NO : 24,
e) CDR1-L-25C10 : SEQ ID NO : 28, CDR2-L-25C10 : SEQ ID NO : 29, CDR3- L-25C10 : SEQ ID NO : 30,
f) CDR1-L-11E10 : SEQ ID NO : 34, CDR2-L-11E10 : SEQ ID NO : 35, CDR3-
L-l 1E10 : SEQ ID NO : 36, ou
g) CDR1-L-16G8 : SEQ ID NO : 40, CDR2-L-16G8 : SEQ ID NO : 41, CDR3-L- 16G8 : SEQ ID NO : 42. 6. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne lourde comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 43 à 49 ou une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 43 à 49.
7. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il possède une chaîne légère comprenant une région variable ayant une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 50 à 56 ou une séquence ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec l'une de SEQ ID NO : 50 à 56.
8. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il possède des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) Anticorps 3E2 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO :
50, b) Anticorps 14C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 44, chaîne légère : SEQ ID NO : 51,
c) Anticorps 15C11 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 45 chaîne légère : SEQ ID NO :
52,
d) Anticorps 22F6 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère : SEQ ID NO :
53,
e) Anticorps 25C10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 47, chaîne légère : SEQ ID NO : 54,
f) Anticorps 11E10 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 48 chaîne légère : SEQ ID NO :
55, et
g) Anticorps 16G8 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 49, chaîne légère : SEQ ID NO :
56.
9. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il possède des chaînes lourdes et légères dont les régions variables ont les séquences d'acides aminés suivantes ou des séquences ayant au moins 80%, de préférence au moins 85%>, au moins 90%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec les séquences suivantes :
a) Anticorps 3E2 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 43, chaîne légère : SEQ ID NO :
50, et
b) Anticorps 22F6 : chaîne lourde : SEQ ID NO : 46, chaîne légère : SEQ ID NO :
53.
10. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est d' isotype IgG ou IgM.
11. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps chimérique ou humanisé.
12. Fragment fonctionnel d'anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les fragments Fv, ScFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou les dianticorps (« diabodies »). 13. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'il n'est pas couplé à une molécule cytotoxique.
14. Acide nucléique codant pour un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
15. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 14.
16. Cellules hôte comprenant un acide nucléique selon la revendication 14 ou un vecteur selon la revendication 15.
17. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci, dirigé contre le glycosphingolipide membranaire Gb3 et non couplé à une molécule thérapeutique, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement des maladies associées à l'angiogénèse.
18. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon la revendication 17, destiné au traitement des tumeurs solides; du psoriasis ; des angiomes ; des maladies oculaires prolifératives, notamment la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), la rétinopathie diabétique, ou le glaucome néovasculaire ; des maladies auto-immunes, notamment le lupus ou la polyarthrite rhumatoïde ainsi que des maladies liées à l'athérosclérose.
19. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon la revendication 18, destiné au traitement des adénomes, des sarcomes ; et des carcinomes, et notamment des adénocarcinomes, des cancers de l'ovaire, du sein, du pancréas, de la peau, du poumon, du cerveau, du rein, du foie, de la cavité nasopharyngée, de la thyroïde, du système nerveux central, de la prostate, du côlon, du rectum, du col utérin, des testicules, ou de la vessie.
20. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que l'anticorps est tel que défini dans les revendications 1 à 13.
21. Anticorps, fragment fonctionnel ou dérivé de celui-ci selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé en ce qu'il reconnaît la bande supérieure mais pas la bande inférieure du doublet Gb3 exprimé par les cellules HMEC-1.
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