EP2621470A1 - Procédé de préparation d'une structure chimique présentant une partition de phases, apte à générer un spectre de fluorescence spécifique et ses applications - Google Patents

Procédé de préparation d'une structure chimique présentant une partition de phases, apte à générer un spectre de fluorescence spécifique et ses applications

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Publication number
EP2621470A1
EP2621470A1 EP11773216.4A EP11773216A EP2621470A1 EP 2621470 A1 EP2621470 A1 EP 2621470A1 EP 11773216 A EP11773216 A EP 11773216A EP 2621470 A1 EP2621470 A1 EP 2621470A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrophobic
fluorescence
microparticles
mixture
hydrophilic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11773216.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Didier Tousch
Olivier Thomas
Fabrice Taly
Alain Thierry
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2621470A1 publication Critical patent/EP2621470A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent
    • C09K11/06—Luminescent materials, e.g. electroluminescent or chemiluminescent containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
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    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/18—Metal complexes
    • C09K2211/181—Metal complexes of the alkali metals and alkaline earth metals

Definitions

  • the subject of the invention is a process for preparing a fluorescent assembled chemical structure in phase partition, which is specific in that each phase of the partition solubilizes and physically separates fluorescent molecules in separate compartments such as for a particle or a liposome.
  • the invention also relates to said assembled structures and their mixture as well as compositions or kits comprising them.
  • the invention also relates to the use of these assembled structures and their mixing, in particular for in vivo medical imaging or for in vitro diagnosis of pathology, but also for the marking of a sample, an object or a liquid composition or for their authentication.
  • the invention also includes objects or liquids marked by the assembled structures, their mixture or by the compositions according to the invention.
  • Fluorescence is the property of some bodies to emit light after absorbing photons of higher energy.
  • a fluorescent molecule fluorophore or fluorochrome
  • fluorophore or fluorochrome has the property of absorbing light energy (excitation light) and quickly restoring it in the form of fluorescent light (emission light).
  • the light re-emitted by the excited molecule may be of the same wavelength (resonance fluorescence) or longer wavelength (in liquid media) or smaller. This shift of the emission spectrum to higher wavelengths greatly facilitates the separation and detection of fluorescence light.
  • fluorescein organic, natural or synthetic fluorochromes
  • each fluorochrome can be characterized by its excitation and emission spectra.
  • Biological tagging for medical diagnosis or imaging has largely developed the use of these fluorescent molecules.
  • Fluorescence microscopy is based on the formation of an image by detection of this emitted light (Huang B et al, 2009). Many marking techniques are used: the simple labeling is done by affinity between a fluorochrome and the molecule to be labeled,
  • immunolabeling which involves a fluorochrome-labeled antibody
  • GFP green fluorescent protein
  • FRET Fluorescent Resonance Energy Transfer
  • Fluorescent molecules are also used in other applications, such as object marking, ink marking, etc. . They are powerful identification tools thanks to their specific physical properties.
  • the inventors have demonstrated that it is possible to combine in structures assembled in phase partition different fluorescent molecules whose physicochemical properties do not allow their miscibility in the same solvent. Said structures have distinct compartments in which the combined fluorescent molecules are distributed according to their miscibility, which has the effect of generating a specific and unexpected resultant fluorescence, notably in that this resultant fluorescence is not the simple resultant of the mixing of the fluorescent molecules. . These assembled structures or a mixture of such structures are able to generate a specific and unexpected fluorescence spectrum. This effect is now revealed, the method which is the subject of the present invention makes it possible to obtain chemical structures assembled in phase partition capable of generating fluorescences. specific ones such as composite particles or liposomes allowing two levels of reading:
  • the subject of the present invention is a process for preparing, in phase partition, an assembled chemical structure capable of generating a specific fluorescence signal, said phase partition between a first phase and a second immiscible phase. between them structuring a first compartment and a second compartment, said compartments not being miscible with each other, said method comprising the following steps:
  • said first compartment contains a composition comprising at least one miscible compound capable of generating a fluorescence and said second compartment contains a composition comprising at least one miscible compound capable of generating a fluorescence.
  • the invention also comprises a process for preparing, in phase partition, an assembled chemical structure having a compartmentalization capable of generating a specific phase-phase fluorescence signal, said phase partition delimiting a first compartment and a second compartment, said first compartment and said second compartment being immiscible with each other, said method comprising the following steps:
  • said first compartment contains a composition comprising at least one miscible compound in this first phase capable of generating a fluorescence and the second compartment contains a composition comprising at least one miscible compound in this second phase capable of generating a fluorescence, and in which method, said first and second phases have been mixed with a third phase containing fluorescent compounds for some miscible in the first phase, or for others miscible in the second phase.
  • step a the preparation of said first phase and said second phase will be carried out by methods well known to those skilled in the art depending on the chosen chemical structures and the structure chemical assembly in phase partition that one wishes to obtain from these two chemical structures.
  • this assembled chemical structure is chosen from any structure assembled in partition or phase separation between at least two immiscible phases between them.
  • chemical structure assembled but not limited to, emulsion (in particular water / oil or oil / water), structures assembled using amphiphilic macromolecules, laminated films, gels, liposomes or even micro- or nanoparticles.
  • emulsions of squalene pluronic L35-phosphatidylcholine-surfactant or lecithin-phospholipid-surfactant type (Watrobska-Swietlikowska D and Sznitowska M, 2006). These are proposed mixtures for the delivery of drugs of a hydrophobic nature.
  • a set of methods for obtaining emulsions are proposed in the review of He C.X., He Z.G. and Gao J.Q. Expert Opin Drug Deliv, Apr 7 (4): 445-60 (2010) Microemulsions and drug delivery Systems to improve the solubility and bioavailability of poorly water-soluble drugs.
  • amphiphilic macromolecules of the Sodium dodecyl sulfate type, poly (gamma-glutamic acid) type (Akao T et al., 2010), poly (propylenimine) dendrimer (Chooi KW et al, 2010).
  • hydrogel type gels such as copolymers of alkyl (meth) acrylates (Black JK et al, 2010) or else copolymers of polyethylene oxide and ethylene oxide (PEO-b). -PPO) (Sakai T et al, 2010).
  • laminated films that is to say superimposed layers, made of monolayers made from inorganic materials (Hench and Polak, 2002) such as calcium phosphate or organic materials such as natural or synthetic polymers ().
  • inorganic materials Hench and Polak, 2002
  • organic materials such as natural or synthetic polymers ().
  • biopolymer-based hydrogels such as alginate and chitosan are widely advocated.
  • Liduir-Blodgett films that consist of building a monolayer film by depositing surfactant or amphiphilic molecules at an air / water interface. This monolayer is then transferred to a solid support by dipping it in the sub-phase. The adsorption is based on hydrophilic / hydrophobic type interactions.
  • the author cites multilayer films with linear growth, harder and denser that do not allow the diffusion of molecules thus acting as a barrier. They can act as a reservoir for the production of compartmental films.
  • Such architectures have been made by depositing for example poly (allylamine) / poly (styrene sulfonate) films on other poly (L-lysine) / hyaluronic acid type films.
  • the method or method for obtaining it will be selected from standard methods or methods for obtaining those structures that are well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is a method for preparing an assembled chemical structure according to the present invention, characterized in that said phase partition delimits a first phase of hydrophobic nature (hydrophobic phase) and a second phase of hydrophilic nature
  • said hydrophobic phase contains a composition comprising at least one hydrophobic compound capable of generating a fluorescence (called hydrophobic fluorescent compound) and said hydrophilic phase contains a composition comprising at least one hydrophilic compound capable of generating a fluorescence (called hydrophilic fluorescent compound)
  • the subject of the invention is a process for preparing an assembled chemical structure according to the present invention, characterized in that said process is a process for preparing microparticles or nanoparticles capable of generating a signal fluorescence-specific, said microparticles or nanoparticles comprising a rigid or fluid wall delimiting at least one intraparticle space, said wall being hydrophobic in nature and said intraparticle space being occupied by an aqueous solution, or, conversely, said wall being of a nature hydrophilic and said intraparticle space being occupied by a solution of hydrophobic nature, said method implementing a process for preparing microparticles or nanoparticles comprising the following steps: a) the preparation of an organic solution immiscible with water ( named hydrophobic solution) and a solution aque use
  • phase partition by mixing and emulsifying the hydrophobic solution with the aqueous solution
  • hydrophobic solution contains a composition comprising at least one hydrophobic compound capable of generating a fluorescence (called hydrophobic fluorescent compound) and the hydrophilic solution contains a composition comprising at least one hydrophilic compound capable of generating a fluorescence (called hydrophilic fluorescent compound); or
  • Said hydrophobic solution and hydrophilic solution are mixed with a third amphiphile containing a composition comprising at least one hydrophobic fluorescent compound and at least one hydrophilic fluorescent compound such that the mixture of the three solutions generates a phase partition between a hydrophilic phase; containing at least one hydrophilic fluorescent compound and a hydrophobic phase containing at least one hydrophobic fluorescent compound.
  • microparticles or nanoparticles is meant in particular any particle, whether of composite or synthetic type or of liposome type, preferably cylindrical, ovoid or spherical in shape, of diameter between 10 nm and 1 ⁇ for nanoparticles and 1 to 500 ⁇ for the microparticles, preferably of diameter between 30 nm for the nanoparticles and 50 ⁇ for the microparticles.
  • microparticles or nanoparticles generally comprising a rigid or fluid wall delimiting at least one intra-particle space.
  • microparticles or nanoparticles mention may be made in particular but without being limited to the following microparticles or nanoparticles:
  • polycaprolactone polymethylmethacrylate
  • Pluronic® such as Pluronic®P6100 or L92
  • nanoparticles with a metallic core
  • nanoparticles made from a mixture of the various polymers mentioned above
  • the wall (or shell) is hydrophobic in nature and said intraparticle space may be occupied by an aqueous solution
  • said nano- or microparticle may be composed of at least one polymer which may be chosen from the group comprising polycaprolactone, polymethyl methacrylate, Eudragit or Pluronic® such as Pluronic®P6100 or L92, preferably polymethyl methacrylate, a mixture of polymethyl methacrylate and polycaprolactone, a mixture of polymethyl methacrylate and Pluronic® and even more preferably polymethyl methacrylate.
  • polymers which may be chosen from the group comprising polycaprolactone, polymethyl methacrylate, Eudragit or Pluronic® such as Pluronic®P6100 or L92, preferably polymethyl methacrylate, a mixture of polymethyl methacrylate and polycaprolactone, a mixture of polymethyl methacrylate and Pluronic® and even more preferably polymethyl methacrylate.
  • latex chitosan, cellulose and viscose.
  • the wall or shell
  • said intraparticle space may be occupied by a lipid solution
  • Such supports are well known to those skilled in the art and can be obtained using solvent evaporation encapsulation processes (emulsion / precipitation), by coacervation, by interfacial polymerization, by nebulization, by spray drying, by coating in a fluidized bed, by gelling by freezing drops, preferably by evaporation of solvent.
  • solvent evaporation encapsulation processes emulsion / precipitation
  • coacervation by coacervation
  • interfacial polymerization by nebulization
  • spray drying by coating in a fluidized bed
  • gelling by freezing drops
  • the subject of the invention is a method for preparing microparticles or nanoparticles according to the invention, characterized in that the microparticles or nanoparticles are composite / synthetic particles and in that the process process for the preparation of these microparticles or nanoparticles is chosen from:
  • the subject of the invention is a process for the preparation of microparticles or nanoparticles, characterized in that the process used for the preparation of microparticles or nanoparticles is the double emulsion-solvent evaporation process, and
  • hydrophobic solution consists of a solution chosen from:
  • the subject of the invention is a process for the preparation of microparticles or nanoparticles according to the invention, characterized in that the said hydrophobic solution consists of a solution chosen from: a solution of polymethyl methacrylate (PMMA) dissolved in dichloromethane;
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • an aqueous solution containing, pure or as a mixture, at least one hydrophilic fluorescent substance
  • the subject of the invention is a method for preparing microparticles or nanoparticles according to the invention, characterized in that said microparticles or nanoparticles are liposomes and the process used for the preparation of microparticles or nanoparticles is a process for the preparation of liposomes, in particular using as a hydrophobic solution a phospholipid concentrate.
  • Non-limiting examples include, but are not limited to, standard liposome preparation methods such as:
  • vesicles are multi-lamellar, or unilamellar with very different sizes (50 to 1090 nanometers)
  • the subject of the invention is a process for preparing an assembled chemical structure or, preferably, microparticles or nanoparticles, according to the invention, characterized in that:
  • composition comprising at least one miscible compound in the first structure capable of generating a fluorescence or said composition comprising at least one miscible compound in the second structure capable of generating a fluorescence;
  • composition comprising at least one hydrophobic compound capable of generating a fluorescence or said composition comprising at least one compound hydrophilic capable of generating fluorescence,
  • a synthetic or natural extract is chosen from the group consisting of a synthetic or natural extract, plant or animal, or a mixture of synthetic and / or natural extracts, a hydrophobic or hydrophilic isolated or purified compound capable of generating a fluorescence, or a mixture of these compounds isolated or purified.
  • natural, plant or animal extract capable of generating a fluorescence
  • synthetic extract is understood to mean any structure or substance present in an organism belonging to the animal or vegetable kingdom but the synthesis of which has been carried out by chemical synthesis.
  • Examples of natural extract of plant origin include extracts of plants, seeds, pollen grains or plant spores.
  • the subject of the invention is a process for preparing an assembled chemical structure or, preferably, microparticles or nanoparticles, according to the invention, characterized in that in that said composition comprising at least least one hydrophobic fluorescent compound consists essentially of the hydrophobic portion of a plant or animal extract, or a mixture thereof, and in that said composition comprising at least one hydrophilic fluorescent compound consists essentially of that the hydrophilic part of a plant or animal extract, or a mixture thereof.
  • fluorescent compound is meant herein in particular compounds capable of generating fluorescence after being submitted to radiation, in particular ultraviolet type.
  • the subject of the invention is a process for the preparation of an assembled chemical structure or, preferably, of microparticles or nanoparticles, according to the invention, characterized in that in that said hydrophobic part and said hydrophilic portion are derived from the same extract or two separate extracts.
  • the present invention relates to a method of preparing a mixture of at least two assembled chemical structures and preferably a mixture of at least two microparticles or nanoparticles capable of generating an original signal in significantly different fluorescence (capable of being distinguished from each other ), each of said assembled chemical structures or said microparticles or nanoparticles being obtained by a process for preparing assembled chemical structure or microparticles or nanoparticles according to the present invention, characterized in that:
  • At least one of the compounds capable of generating a fluorescence and miscible in the first phase, and at least one of the compounds capable of generating a fluorescence and miscible in the second phase is different between these two assembled structures; or at least one of the hydrophobic or hydrophilic fluorescent compounds contained in said particle is different between these two particles.
  • the subject of the invention is a process for preparing a mixture of at least n assembled chemical structures or for the preparation of a mixture of at least n microparticles or nanoparticles ( n denoting the number of types of assembled structures or nano- and microparticles) capable of generating an original fluorescence signal significantly different between these n assembled structures or particles, each of said assembled structures or microparticles or nanoparticles being obtained by a method according to the present invention , characterized in that it implements for each of these assembled structures or particles a composition of a compound capable of generating a different fluorescence for each of these assembled structures or particles, and in that n is greater than or equal to 2, of preferably at 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • the present invention relates to assembled chemical structures or microparticles or nanoparticles, or a mixture of assembled structures or microparticles or nanoparticles, capable of generating an original signal in fluorescence or an original fluorescence spectrum, obtained (es) or obtainable by a process according to the present invention.
  • the present invention relates to a mixture at least n microparticles or nanoparticles, capable of generating an original fluorescence signal different between each of said particles, characterized in that each of said particles comprises:
  • a rigid or fluid wall delimiting at least one intraparticle space, said wall being hydrophobic in nature and said intraparticle space being occupied by an aqueous solution, or, conversely, said wall being hydrophilic in nature and said intraparticle space being occupied by a solution of hydrophobic nature;
  • said wall comprises at least one hydrophobic fluorescent compound and said intraparticle space comprises at least one hydrophilic fluorescent compound
  • said wall comprises at least one hydrophilic fluorescent compound and said intraparticle space comprises at least one hydrophobic fluorescent compound; and in that :
  • At least one of the hydrophobic or hydrophilic fluorescent compounds contained in said rigid or fluid wall and / or in said intraparticle space is different between these n particles
  • n being greater than or equal to 2, preferably 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
  • said particles are chosen from composite / synthetic particles or from liposomes, in particular as described for the above methods according to the present invention.
  • the subject of the invention is a mixture of at least n microparticles or nanoparticles, said particles being capable of generating a specific fluorescence signal according to the present invention, characterized in that said particles of this mixture are particles whose rigid or fluid wall is hydrophobic in nature and the intra-particle space is hydrophilic in nature.
  • the subject of the invention is a mixture of at least n microparticles or nanoparticles, capable of generating an original fluorescence signal according to the present invention, in which said particles are mixed with synthetic particles whose wall consists essentially of polymers selected from polymethyl methacrylate (PMMA), polystyrene, latex, chitosan, cellulose and viscose.
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • polystyrene polystyrene
  • latex latex
  • chitosan cellulose
  • viscose viscose
  • the subject of the invention is a mixture of at least n microparticles or nanoparticles, capable of generating an original fluorescence signal according to the present invention, characterized in that
  • composition comprising at least one miscible compound in the first phase capable of generating a fluorescence or said composition comprising at least one miscible compound in the second phase capable of generating a fluorescence;
  • composition comprising at least one hydrophobic compound capable of generating a fluorescence or said composition comprising at least one hydrophilic compound capable of generating a fluorescence,
  • a synthetic or natural extract is chosen from the group consisting of a synthetic or natural extract, plant or animal, or a mixture of natural synthetic extracts, a hydrophobic or hydrophilic isolated or purified compound capable of generating a fluorescence, or a mixture of these isolated or purified compounds .
  • the subject of the invention is a mixture of at least n microparticles or nanoparticles, capable of generating an original fluorescence signal according to the present invention, in which mixture, characterized in that said composition comprising at least least one hydrophobic compound capable of generating a fluorescence consists essentially of the hydrophobic portion of a plant or animal extract, natural or synthetic, or a mixture thereof, and in that said composition comprises at least one hydrophilic compound capable of generating a Fluorescence consists essentially of the hydrophilic portion of said plant or animal extract, or a mixture thereof.
  • the subject of the invention is a mixture of at least n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention, characterized in that the said hydrophobic part and the said hydrophilic part within the same particle are taken from the same extract or two separate extracts.
  • the present invention provides a composition for in vivo diagnosis or for in vivo medical imaging, characterized in that it comprises a mixture of at least n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention.
  • the composition according to the invention is characterized in that, in the case of particles in particular, the outer wall of said particle is labeled with a marker specific to the biological tissue or of the cell, or one of their element that one seeks to observe or to highlight, each of the n particles being marked with a different marker between each of the particles.
  • the specific markers of the biological tissue or of the cell mention may be made of, but not limited to, any compound capable of specifically recognizing a particular structure or a compound of said targeted tissue or cell, such as an antigen or a receptor expressed the outer surface of these cells, the specific marker may then be but not limited to an antibody directed against this antigen or a specific ligand of said receptor.
  • the present invention provides a kit or kit for in vivo diagnosis or for in vivo medical imaging, characterized in that said kit comprises a mixture of at least n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention, each of the assembled structures or particles being preferably marked by a different marker.
  • said marker is a biological marker capable of binding specifically to the element that it is desired to detect or observe, in particular an antibody directed specifically against this element.
  • the present invention relates to a method for marking a sample or an object characterized in that said sample or object is brought into contact with a mixture of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles. according to the present invention.
  • the object is included in the object group consisting of a work of art, of high value technical parts, of manufactured objects.
  • perfume bottles such as wine bottles, packaging, banknotes, clothing, watches, electrical products, books, passports, medicines, chemical formulations, food products such as meat, perfumes, wines, articles made from canvas, paper, plastic, inks, paint.
  • the object, composition or sample marking according to the invention can be done in any appropriate manner that does not cause modification of the characteristics of said objects, compositions or samples such as morphological or biological characteristics (if it is acts of biological materials).
  • the marking can be done by gluing or varnishing if the support of the composition used is respectively an adhesive or a varnish
  • the adhesives or varnishes will be chosen from glues or varnishes with little or no fluorescence at all, or in that the said glues or varnishes do not interfere with the interpretation of the essential signal, for example cellulose, polymethyl methacrylate. (PMMA), the latex,
  • the marking can be achieved by a mixing operation.
  • the marking can be achieved by including the mixture of said particles during the manufacture of the solid, such as a paste, a fabric, a fabric (for a painting), glass or for any material useful for the manufacture of an object.
  • said solids will preferably be chosen from neutral solids in terms of fluorescence emission, that is to say from among materials with little or no fluorescence, or in that said materials do not interfere with fluorescence. interpretation of the essential fluorescence signal resulting from the phase partition.
  • the marking can be carried out by:
  • compositions according to the invention with an ink or ink vehicle composition or with water or a combination of water and organic solvent and printing directly on a product, or
  • composition according to the invention directly to solutions or formulations of chemicals such as drugs or food products.
  • the marking according to the invention can be carried out by spraying.
  • Spraying can be done for example using a nozzle apparatus for marking many products or using an apparatus of the "aerosol" type.
  • the present invention relates to a method for marking a liquid composition, characterized in that a mixture of assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention is incorporated in said composition, in particular said composition being selected from an ink, an injectable liquid or a nutrient solution.
  • the present invention relates to a method of diagnosis, in particular pathology or a stage of advancement or regression of a pathology, from a sample biological sample, characterized in that it implements a step in which a mixture of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention is brought into contact with said sample and observed or analyzed by the fluorescence spectrum emitted by the sample thus marked, in particular at certain sample elements, preferably from a biopsy.
  • the present invention relates to a method for authenticating a sample or an object that may have been marked by a particular mixture or combination of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention.
  • invention characterized in that it comprises the following steps:
  • the present invention comprises an object or liquid characterized in that it is marked by a specific mixture or combination of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the invention.
  • the present invention relates to the use of a mixture or specific combination of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles according to the present invention as a biomarker, in particular for proteomic analysis, genomic analysis, diagnosis in synthetic chemistry, environmental diagnosis, traceability or object authentication, or for the fight against counterfeiting.
  • the present invention relates to a method for analyzing or detecting the presence of at least one assembled structure or microparticle or nanoparticle, or a mixture of n assembled structures or n microparticles or nanoparticles, capable of generating a original fluorescence signal obtained according to the invention or capable of being obtained by a method according to the present invention, characterized in that it implements a reading of the fluorescence spectrum resulting from the separation of the hydrophobic and hydrophilic phase of the particle by laser confocal microscopy to allow the identification of each spectral component of these two phases, these fluorescence spectra of each of the components being specific to the particle analyzed.
  • Fluorescent particle applications can also be numerous in public health, and industrial sectors such as agribusiness, environmental management, or chemistry.
  • This technology makes it possible to advantageously generate combinatorials specific and unique of these assembled chemical structures such as unique combinations of particles.
  • These particle mixtures generate a tamper-proof color code that can be analyzed by fluorescence readout.
  • the labeling is invisible to the eye and specific (unique molecular combinatorial), natural and easily detectable by a fluorescence reader that can be portable.
  • the present invention also has the advantage of being able to encapsulate fluorescent substances multiplexed in an innovative way by compartmentalization thanks to the hydrophilic or hydrophobicity properties of the latter.
  • This new method of encapsulating fluorescent substances makes it possible to propose the use of numerous natural plant substances, which constitutes an advantage of this invention.
  • Figure 1A Bl extract solution, fluorescein (F) and extract mixture B1 / fluorescein (M), lv / lv and put under the illumination of an ultraviolet lamp.
  • FIG. 1B After synthesis of the particles, the solutions are centrifuged in order to separate the beads from the supernatant containing the excess substances. The supernatants are recovered and observed under an ultraviolet lamp.
  • Figure 1C The particles after synthesis are pelleted by centrifugation and then resuspended in a solution of PVA at 0, 1%. This type of rinsing is repeated twice before final centrifugation and observation of the particle pellet and the rest of suspended particles under an ultraviolet lamp.
  • Figures 2A-2B Observation of composite particles on slides on a fluorescence microscope
  • Figure 2A PMMA composite particles enriched with extract B 1 containing hydrophobic fluorescent plant substances observed at 40 X magnification under a fluorescence microscope. The fluorescence emission is analyzed under a B2A filter (excitation> 410 nm, stop filter: 515 at 560 nm).
  • Figure 2B PMMA composites enriched with fluorescein after synthesis of the particles, the solutions are centrifuged to separate the beads of the supernatant containing the excess substances. The supernatants are recovered and observed under an ultraviolet lamp.
  • FIG. 3A Colloidal solutions of different liposome preparations: unlabeled liposomes (V), liposomes containing extract B1 (B1), liposomes containing a fluorescein solution (F) and liposomes containing both B1 extract and a fluorescein solution (M).
  • Figure 3B Colloidal solutions of different liposome preparations specified in A after dialysis.
  • S is a dialysate fraction of M.
  • Figures 4A-4B Confocal images of PF capsules (green channel only: 500-620 nm, scale bar: ⁇ ). (A) three typical capsules, (B) zoom on a capsule approximately ⁇ in diameter.
  • Figure 5 Confocal image of PA capsules (green channel: 500-620 nm, green channel: 630-800 nm, scale bar: ⁇ )
  • Figures 6A-6B Confocal images of the APF capsules (scale bar: 10 ⁇ ).
  • FIGS. 8A-8E Emission spectra obtained using a spectrofluorometer, after excitation at 488 nm
  • Figure 8C Spectrum of particles enriched in hydrophobic substances
  • Figure 8D Spectrum of hydrophobic substances in dichloromethane
  • Figure 8E Spectrum of particles enriched in fluorescein and substances hydrophobic.
  • Figure 9A Water-in-oil solutions: (1) solution of hydrophobic substances; (2) after adding 100 ⁇ . fluorescein (10 mg / mL) in 900 ⁇ . hydrophobic substances (12.5 mg / mL); (3) emulsion generated after stirring (vortex) of the mixture presented in (2)
  • Figure 9B "Oil-in-water” solutions: (4) 100 ⁇ mixture. hydrophobic substances in 900 ⁇ . fluorescein; (5) emulsion generated after stirring (vortex) of the solution in (4)
  • FIG. 9C Spectrum corresponding to the spectrum of the "water-in-oil" emulsion visualized in FIG. 9 A (C)
  • FIGS. 9D Spectrum corresponding to the spectrum of the "oil-in-water” emulsion visualized in FIG. 9B (D)
  • Figure 10 Photograph of kinetics obtained for a "water-in-oil" emulsion after stirring every two minutes. A photograph is taken every 3 minutes (0 mn (1), 3 mn (2), 6 mn (3), 9 mn (4), 12 mn (5).
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • the PMMA previously solubilized in a solvent such as dichloromethane is mixed with a plant extract composed of 98% of chlorophylls a and b (hydrophobic molecules) obtained by chloroform treatment of a 70 ° ethanol extract allowing
  • This mixture is the phase we call solvent / PMMA / extract.
  • a solute (aqueous phase) containing hydrophilic fluorescent molecules such as fluorescein mixed with the first (Solvent / PMMA) allows by sonication to create an emulsion of aqueous fine particles.
  • This emulsion mixed with water and then emulsified a second time by sonication then leads to fine particles in suspension in water (from 50 nm to 10 ⁇ ).
  • the latter consist of a PMMA shell / Bl extract containing small (s) globule (s) solute (s). The solvent is evaporated by stirring thus creating solid particles.
  • the PMMA powder (250 mg) is dissolved in 5 ml of pure dichloromethane. If the particles are enriched in extract B1, then 1ml of extract B1 at 25 mg / ml (chloroform) is poured into the PMMA solution. To the latter solution is added 1 ml of water or a solution of fluorescein (3 mM / ml). Everything went to the sonicator to obtain a very fine emulsion. The emulsion is then poured into a large volume of 0.1% PVA solution (500 ml). The whole is stirred for 16 h under a fume hood in order to completely evaporate the solvent.
  • the particles are recovered by centrifugation at 6000 rpm ("rpm" for rpm) for 20 minutes. The supernatant is removed and the pellet taken up in 0.1% PVA solution. Two centrifugations are repeated to remove any trace of Bl extract or fluorescein in the particle recovery buffer.
  • the particles are placed between blade and coverslip. Each assembly is sealed with paraffin.
  • the slides are then observed on a fluorescence microscope.
  • Example 1 The observations reported in Example 1 show that PMMA particles containing a water solution generate only a very weak ultraviolet fluorescence (V in part C of Example 1).
  • V in part C of Example 1 When the water is enriched with a fluorescent hydrophilic substance, fluorescein, then the PMMA particles produce a fluorescent emission under ultraviolet light whose yellow-green color is characteristic of the latter (see FIGS. 1A-1C, tube "F").
  • the organic phase containing the PMMA is enriched by the extract B1 (rich in hydrophobic substance (s) such as chlorophyll), the particles thus produced emit under ultraviolet a fluorescence of red color characteristic of the extract B1.
  • the compartmentalization effect is demonstrated by epifluorescence observations of the particles.
  • the hydrophobic substances of the B1 extract are preferentially distributed around the periphery of the particles (in the shell) (see FIG. 2A) while the hydrophilic substance fluorescein is only observed in the cavities of the particles (see FIG. 2B).
  • the method for obtaining liposomes is the injection into ethanol similar to that described by Thierry et al. (Gold, AR, Lunardi-Iskandar, Y, Bryant, JL, Rabinovitch, P., Gallo, RC, and Mahan, LC: Systemic gene therapy: biodistribution and long-term expression of a transgene in mice, Proc Natl Acad Sci USA 92, 9742-9746, 1995).
  • the various labeled and control liposome preparations are subjected after 1 hour incubation at 25 ° C. to a first dialysis of 2 hours in bags of porosity 160,000 d (Spectra) in distilled water at 25 ° C. Then the dialysis bags are subjected to a second dialysis of 12 hours at 25 ° C. The preparations are recovered in Eppendorf tubes and then placed under UV to evaluate their color emitted (See Figures 3 A-3B)
  • polymeric three-dimensional networks such as polymeric triblocks (solid or gel-like materials) containing by their composition a hydrophilic portion and a hydrophobic portion.
  • polymeric triblocks solid or gel-like materials
  • the spectral confocal microscopy experiments presented in this section were performed using a LEICA TCS-SP2 laser scanning microscope system (right frame).
  • the excitation was carried out using an Argon laser at the wavelength of 488 nm with a power of the order of that usually used when observing immunohistochemical markings conventionally encountered in biology (for information only : laser at a quarter of its maximum power and acousto-optic filter allowing less than 20% of the laser line).
  • the lens used was a high-aperture oil immersion objective specifically designed for confocal fluorescence microscopy (HCX PL APO CS 40.0 x 1.25 OIL). It allows a work between blade and lamella of 170 ⁇ .
  • the separation between excitation and emission (fluorescence) is carried out using a dichroic interference mirror of the RSP500 type (having a cut-off wavelength at 500 nm). With this mirror, the incident laser at 488 nm is reflected back to the sample, but the return light (wavelength greater than 488 nm) passes mainly through the mirror.
  • This LEICA system collects a specific fluorescence band. So this system allows spectral resolution and wavelength scanning of the collected fluorescence. In the images that will be presented, the green channel will correspond to a fluorescence collection between 500 nm and 620 nm and the red channel to a fluorescence collection between 630 nm and 800 nm.
  • the spectra presented will correspond to a wavelength scanning acquisition of 500 nm to 800 nm with a collection window of 10 nm.
  • Each image presented is obtained by scanning the excitation beam at a rate of 400 lines per second and corresponds to an average over several scans of the same area.
  • These images are also confocal sections (virtual sections) and are thus obtained by collecting the fluorescence mainly from an axial plane of reduced thickness (of the order of one micron).
  • the theoretical resolution given by the manufacturer is of the order of 0.160 ⁇ in lateral and 0,9 ⁇ in axial.
  • the samples were prepared from capsules in aqueous solution (with 0.1% surfactant additive to avoid aggregation). After centrifugation of these solutions, approximately 1 ⁇ l of solution was taken from the bottom of the tubes and mixed with a drop of mounting medium for fluorescence microscopy (Vectashield), then placed between slide and slide microscopy.
  • Figures 4A and 4B show the capsules typically observed on PF samples. Only the green channel is presented because no significant fluorescence could be observed beyond 630 nm. In the results of the spectral study illustrated in FIG. 7, a fluorescence typical of fluorescence with a maximum around 530 nm is found. The remarkable element on these samples is the inhomogeneous distribution of the fluorescent substance in the corresponding polymer particles to the cavities of the latter. Zooming on a large particle of about 10 ⁇ in diameter and shown in Figure 1B illustrates this inhomogeneity. On this particle, the fluorescence appears in areas of the order or less than one micron (see arrows in Figure 1B).
  • Figures 5A and 5B show three particles typically observed on PA type samples. There is the presence of solid or hollow particles, with more or less extensive cavities. The image is an overlay of the red and green tracks. This time, the distribution of the fluorescence is homogeneous within the polymer corresponding to the shell of the latter. Low fluorescence is found in the green channel and a larger one in the red channel. By playing on the sensitivities of the detectors of these two channels, we manage to balance the brightness of the images and we thus obtain capsules that appear in yellow.
  • APF type sample (vegetable substance and fluorescein mixture):
  • FIGS. 6A and 6B show the particles obtained following a mixture of the two substances mentioned above (fluorescein and plant substance). For the sake of clarity, the two red and green lanes were not superimposed here.
  • hydrophilic fluorescein
  • hydrophobic plant substance
  • the hydrophobic substance is inserted into the shell of the particle indicated by an arrow on the red path of Figure 6.
  • the hydrophilic substance occupies itself inside the particle (green channel).
  • the two spectral curves shown in Figure 7 corroborate this statement. Indeed, the spectra have been plotted by choosing as region of interest on the series of spectral images, either a ring of 15 pixels wide integrating the pixels of the shell, or a disk integrating the inner pixels.
  • the particles were suspended in water (1 mg of particles in 500 ⁇ ).
  • Fluorescein enriched particle spectrum (5mg / mL) (A); spectrum of a fluorescein solution (10 mg / mL) (B); spectrum of particles enriched in hydrophobic substances (chlorophylls especially at 12.5 mg / ml) (C); spectrum of hydrophobic substances in dichloromethane (12.5 mg / mL) (D); spectrum of particles enriched in fluorescein and hydrophobic substances (E).
  • This example demonstrates the possibility of obtaining the fluorescence emission spectra of the composite structures suspended in water under an excitation light of 488 nm, with the similarity of the spectra obtained for the pure fluorescein (hydrophilic substance). or coated (514 nm max) (at the heart of composite structures).
  • this example shows that compartmentalised composite structures containing both hydrophilic (such as fluorescein) and hydrophobic substances (like chlorophyll in particular) generate an original spectrum with 4 characteristic fluorescences: at 520 nm, at 562 nm and at 680 nm and 715 nm.
  • the spectrum essentially reveals a patent modification of the emission of fluorescein; this seems to lose all of its fluorescence intensity at 514 nm with a shift in the emission spectrum towards the higher wavelengths (520/562 nm). This result is in agreement with the measurements of the emission spectra obtained by confocal fluorescence microscopy.
  • the other two correspond to the hydrophobic substances (at 660/680 and at 720/740 nm).
  • the methods of the invention as described allow to create solid composite structures using polymer and / or lipids thus generating a physical barrier between immiscible substances in solution and unfit for mixtures as shown in the example.
  • the present invention is obj and a composition (and a process for obtaining it) capable of generating original fluorescent composite structures.
  • the claimed process makes it possible to create (obtain) this composite structure by producing an emulsion, a particle or a liposome using an aqueous solution of hydrophilic substances (such as fluorescein) and a solvent containing the hydrophobic substances. (such as chlorophyll) and the polymer (such as PMMA) or water immiscible lipids.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée ou un mélange de telles structures, cette structure présentant une partition de phases, notamment de nature hydrophobe et hydrophile, comme une particule composite/synthétique ou un liposome, et étant apte à générer un spectre de fluorescence original. L'invention a également pour objet lesdites structures assemblées et leur mélange ainsi que les compositions ou kit les comprenant. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces structures assemblées et leur mélange, notamment pour l'imagerie médicale in vivo ou pour diagnostic in vitro de pathologie, mais également pour le marquage d'un échantillon, d'un objet ou d'une composition liquide ou pour leur authentification. L'invention comprend également les objets ou liquides marqués par les structures assemblées, leur mélange ou par les compositions selon l'invention.

Description

PROCEDE DE PREPARATION D'UNE STRUCTURE CHIMIQUE PRESENTANT UNE PARTITION DE PHASES, APTE A GENERER UN SPECTRE DE
FLUORESCENCE SPECIFIQUE ET SES APPLICATIONS
L'invention a pour objet un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée fluorescente, spécifique en ce que chaque phase de la partition solubilise et sépare physiquement des molécules fluorescentes dans des compartiments distincts comme pour une particule ou un liposome. L'invention a également pour objet lesdites structures assemblées et leur mélange ainsi que les compositions ou kit les comprenant. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces structures assemblées et leur mélange, notamment pour l'imagerie médicale in vivo ou pour diagnostic in vitro de pathologie, mais également pour le marquage d'un échantillon, d'un objet ou d'une composition liquide ou pour leur authentification. L'invention comprend également les objets ou liquides marqués par les structures assemblées, leur mélange ou par les compositions selon l'invention.
La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). La lumière réémise par la molécule excitée peut être de même longueur d'onde (fluorescence de résonance) ou de longueur d'onde plus grande (dans les milieux liquides) ou plus petite. Ce déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'onde plus élevées, facilite grandement la séparation et la détection de la lumière de fluorescence. Il existe un grand choix de fluorochromes organiques, naturels ou synthétiques (la fluorescéine) ; chaque fluorochrome pouvant être caractérisé par ses spectres d'excitation et d'émission. Le marquage biologique pour le diagnostic médical ou l'imagerie a largement développé l'utilisation de ces molécules fluorescentes. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise (Huang B et al, 2009). De nombreuses techniques de marquage sont utilisées : - le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer,
- l'immunomarquage qui fait intervenir un anticorps marqué par un fluorochrome,
- la technique FISH qui sert à marquer des séquences nucléotidiques,
- l'utilisation de protéines de fusion (typiquement la GFP (« GFP » pour green fluorescent protein) consiste à introduire dans la cellule à observer un gène codant une protéine recombinante fluorescente,
- le FLIP et le FRAP consistent à irradier une zone dont la fluorescence va disparaître. Ces techniques permettent d'étudier la diffusion des molécules marquées,
- le FRET (Fluorescent Résonance Energy Transfert) utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules,
- le BRET (Bioluminescence Résonance Energy Transfer) est un phénomène similaire au FRET à la différence près que le donneur est bioluminescent (luciférase).
Pour mettre en évidence des substances ou molécules non fluorescentes dans des structures du vivant, il est possible de réaliser un marquage direct par ces fluorochromes, comme par exemple le DAPI qui marque l'ADN mais souvent le marquage est indirect, c'est à dire que la molécule fluorescente est elle-même fixée à la molécule qui révélera la cible recherchée tels que des anticorps spécifiques par exemple.
Les molécules fluorescentes sont aussi utilisées dans d'autres applications, tels que le marquage d'objet, le marquage d'une encre, etc . . Ce sont des outils puissants d'identification grâce à leurs propriétés physiques spécifiques.
Il existe pourtant de nombreuses limites à l'utilisation de ces molécules fluorescentes. Leur grande instabilité par exemple, et leur photo-blanchiment (photo- bleaching) où le fluorochrome perd ces propriétés de fluorescence. Plus récemment des molécules fluorescentes sont utilisées en mélange par encapsulation dans des particules de polymère(s) (Fornûsek L and Vëtvicka V, 1986). Une nouvelle génération de minéraux (nanocristaux) fluorescents souvent appelés "quantum dot" très stables et avec un photo-blanchiment très faible par rapport aux molécules précédentes font désormais parties d'une nouvelle génération de marqueurs moléculaires (Sukhanovaa A et al,
2004). Bien d'autres applications sont maintenant développées tel que les LED (Light- Emitting Diode) par exemple (Burroughes JH et al, 1990). Cependant, l'arsenal actuel ne permet pas encore de répondre à l'ensemble des problématiques de marquage.
Ainsi, il reste de pouvoir disposer de nouveaux marqueurs aptes à générer un spectre de fluorescence original.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont mis en évidence qu'il est possible de combiner dans des structures assemblées en partition de phases différentes molécules fluorescentes dont les propriétés physico-chimiques ne permettent pas leur miscibilité dans un même solvant. Lesdites structures présentent des compartiments distincts dans lesquels se répartissent les molécules fluorescentes combinées selon leur miscibilité ce qui a pour effet de générer une fluorescence résultante spécifique et inattendue, notamment en ce que cette fluorescence résultante n'est pas la simple résultante du mélange des molécules fluorescentes. Ces structures assemblées ou un mélange de telles structures sont aptes à générer un spectre de fluorescence spécifique et inattendu Cet effet étant maintenant révélé, le procédé objet de la présente invention permet d'obtenir des structures chimiques assemblées en partition de phase aptes à générer des fluorescences spécifiques telles que des particules composites ou liposomes permettant deux niveaux de lecture:
- soit la lecture combinée des deux molécules fluorescentes générant une réémission de fluorescence unique ; ou
- soit lorsqu'il s'agit par exemple de particules, une lecture séparée et simultanée avec une fluorescence propre à la coque ou paroi de la particule et une fluorescence propre au contenu. Ceci conduit à une diversité énorme de marquage et de combinaison possible pour la traçabilité des objets. Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée apte à générer un signal spécifique en fluorescence, ladite partition de phases entre une première phase et une deuxième phase non miscibles entre elles structurant un premier compartiment et un deuxième compartiment, lesdits compartiments n'étant pas miscibles entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase non miscible à la première; b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième compartiment non miscibles entre eux,
caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible apte à générer une fluorescence et ledit deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible apte à générer une fluorescence.
Sous un aspect particulier, l'invention comprend également un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée présentant une compartimentation apte à générer un signal spécifique en fluorescence en partition de phases, ladite partition de phases délimitant un premier compartiment et un deuxième compartiment, ledit premier compartiment et ledit deuxième compartiment n'étant pas miscible entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la préparation de la première phase et de la deuxième phase non miscibles; et b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième compartiment non miscibles entre eux,
caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette première phase apte à générer une fluorescence et le deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette deuxième phase apte à générer une fluorescence, et dans lequel procédé, lesdites première et deuxième phases ont été mélangées à une troisième phase contenant des composés fluorescents soit pour les uns miscibles à la première phase, ou bien pour les autres miscibles à la deuxième phase.
Dans le procédé selon l'invention, à l'étape a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase sera effectuée par les procédés bien connus de l'homme de l'art en fonction des structures chimiques choisies et de la structure chimique assemblée en partition de phase que l'on souhaite obtenir à partir de ces deux structures chimiques.
En générale cette structure chimique assemblée est choisie parmi toute structure assemblée en partition ou séparation de phases entre au moins deux phases non miscibles entre elles. Par exemple de structure chimique assemblée, mais sans s'y limiter, on peut citer l'émulsion (en particulier eau/huile ou huile/eau), les structures assemblées à l'aide de macromolécules amphiphiles, les films stratifiés, les gels, les liposomes ou encore les micro- ou nanoparticules.
Parmi les émulsions, on peut citer en particulier les émulsions de type squalene- pluronic L35-Phosphatidylcholine-surfactant ou encore lécithine-phospholipides- surfactant (Watrobska-Swietlikowska D and Sznitowska M, 2006). Ce sont là des mélanges proposés pour la délivrance de médicaments de nature hydrophobe. Un ensemble de méthodes d'obtention d'émulsion sont proposées dans la revue de He C.X., He Z.G. and Gao J.Q. Expert Opin Drug Deliv, Apr 7(4): 445-60 (2010) Microemulsions as drug delivery Systems to improve the solubility and the bioavailability of poorly water- soluble drugs.
Parmi les macromolécules amphiphiles, on peut citer en particulier les macromolécules amphiphiles de type Sodium dodecyl sulfate, poly(gamma-glutamic acid) (Akao T et al, 2010) , le poly(propylènimine) dendrimer (Chooi KW et al, 2010).
Parmi les gels, on peut citer en particulier les gels de type hydrogel tel que les copolymères de (méth)acrylates d'alkyle (Black JK et al, 2010 ) ou encore les copolymères de polyéthylène-oxyde et éthylène-oxyde (PEO-b-PPO) (Sakai T et al, 2010).
Parmi les films stratifiés, on peut citer en particulier les films stratifiés de type « scaffolds », c'est-à-dire couches superposées, faites de monocouches fabriquées à partir de matériaux inorganiques (Hench and Polak, 2002) comme le phosphate de calcium ou de matériaux organiques comme les polymères naturels ou synthétiques (). Parmi les polymères naturels, les hydrogels à base de biopolymères, comme l'alginate et le chitosan sont largement préconisés. Il y a les films de « Langmuir-Blodgett » qui consistent à construire un film monocouche par le dépôt de molécules tensioactives ou amphiphiles, à une interface air/eau. Cette monocouche est ensuite transférée sur un support solide par trempage de celui-ci dans la sous-phase L'adsorption est basée sur des interactions de type hydrophile/hydrophobe. Une deuxième immersion de la lame conduit à l'adsorption d'une seconde couche puis réitérée plusieurs fois de suite. Il y a également la fabrication des films multicouches par l'usage de polycations (Hoogeveen et al , 1996). Bon nombre de techniques pour l'obtention de ces films stratifiés sont décrites par H. Mjahed H. (Thèse de doctorat, Université de Strasbourg. Soutenue en Octobre 2009. Caractérisation physico-chimique des films multicouches de polyélectrolytes à base de polysaccharides et de polypeptides en vue d'applications dans le domaine des biomatériaux).
Notamment, l'auteur cite les films multicouches à croissance linéaire, plus durs et plus denses qui ne permettent pas la diffusion des molécules jouant donc le rôle d'une barrière. Ils peuvent jouer le rôle de réservoir permettant la réalisation des films à compartiments. De telles architectures ont été réalisées en déposant par exemple des films poly(allylamine)/poly(styrène sulfonate) sur d'autres films de type poly(L-lysine)/ acide hyaluronique.
Les étapes suivantes du procédé de l'invention seront déterminées et adaptées en fonction de la structure chimique assemblée que l'on souhaite obtenir et présentant cette partition de phases :
a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase; et b) la formation de ladite structure chimique présentant une partition de phases générée préalablement par mélange ou auto-structurée.
Une fois la structure chimique assemblée sélectionnée, la méthode ou procédé visant à l'obtenir sera choisie parmi les méthodes ou procédés standards pour obtenir ces structures qui sont bien connus de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la présente invention, caractérisé en ce que ladite partition de phases délimite une première phase de nature hydrophobe (phase hydrophobe) et une deuxième phase de nature hydrophile
(phase hydrophile), ledit procédé comprenant alors les étapes suivantes :
a) la préparation de la première phase de nature hydrophobe non miscible à l'eau et de la deuxième phase de nature hydrophile; et
b) la formation de ladite structure chimique assemblée en partition de phases préalablement obtenue par mélange ou auto-structurée,
caractérisé en ce que :
- ladite phase hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et ladite phase hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile)
- lesdites première et deuxième phases sont mélangées à une troisième phase amphiphile, miscible au deux premières phases, contenant des composés fluorescents miscibles soit à la première phase, où bien à la deuxième phase. Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit procédé est un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence, lesdites microparticules ou nanoparticules comprenant une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe, ledit procédé mettant en œuvre un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'une solution organique non miscible à l'eau (nommée solution hydrophobe) et d'une solution aqueuse ;
b) la formation de la partition de phase par mélange et émulsification de la solution hydrophobe avec la solution aqueuse ; et
c) la formation desdites particules,
caractérisé en ce que :
- ladite solution hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et la solution hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile) ; ou
- Lesdites solution hydrophobe et solution hydrophile sont mélangées à une troisième amphiphile contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et au moins un composé fluorescent hydrophile tel que le mélange des trois solutions génère une partition de phases entre une phase hydrophile contenant au moins un composé fluorescent hydrophile et une phase hydrophobe contenant au moins un composé fluorescent hydrophobe.
Par microparticules ou nanoparticules, on entend désigner en particulier toute particule, qu'elle soit de type composite ou synthétique ou encore de type liposome, de préférence cylindrique, de forme ovoïde ou sphérique, de diamètre compris entre 10 nm et 1 μιη pour les nanoparticules et 1 à 500 μιη pour les microparticules, de préférence de diamètre compris entre 30 nm pour les nanoparticules et 50 μιη pour les microparticules. Il existe un grand nombre de type différent de microparticules ou nanoparticules comprenant en général une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire.
Parmi ces microparticules ou nanoparticules, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules suivantes :
- polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle (l'Eudragit ou le Pluronic® tel que le Pluronic®P6100 ou L92
- nanoparticules de latex (Cartier R et al, 2007), viscose, cellulose et chitosan,
- nanoparticules de protéines,
- nanoparticules à cœur métallique,
-nanoparticules faites d'un mélange des différents polymères précités
(polyméthacrylate, polystyrène par exemple)
Les articles de Caldorera-Moore M et al., Expert Opin Drug Deliv. Apr;7(4):479-95 (2010) Designer nanoparticles: incorporating size, shape and triggered release into nanoscale drug carriers., de Giouroudi I and Kosel J. Récent Pat Nanotechnol. Jun;4(2): l l l-8 (2010) Récent progress in biomédical applications of magnetic nanoparticles ou encore Freitas S et al. dans Journal of Controlled Release vol. 102, Issue 2, pp 313-332 (2005) Microencapsulation by solvent extraction/evaporation: reviewing the state of the art of microsphere préparation process technology décrivent ces technologies d'obtention de particules composites.
Parmi celles dans lesquelles la paroi (ou coque), est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire peut être occupé par une solution aqueuse, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules suivantes :
- polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle, l'Eudragit ou le Pluronic® tel que le Pluronic®P6100 ou L92 Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, ladite nano- ou microparticule peut être composée d'au moins un polymère qui peut être choisi dans le groupe comprenant le polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle, l'Eudragit ou le Pluronic® tel que le Pluronic®P6100 ou L92, de préférence le polyméthacrylate de méthyle, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de polycaprolactone, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic® et encore plus préférentiellement le polyméthacrylate de méthyle. Parmi les polymères naturels préférés, nous pouvons citer le latex, le chitosan, cellulose et viscose.
Parmi celles dans lesquelles la paroi (ou coque), est de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire peut être occupé par une solution lipidique, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules de latex, de viscose, de cellulose et de chitosan
De tels supports sont bien connus de l'Homme du Métier et peuvent être obtenus à l'aide de procédés d'encapsulation par évaporation de solvant (émulsion/précipitation), par coacervation, par polymérisation interfaciale, par nébulisation, par séchage par pulvérisation, par enrobage en lit fluidisé, par gélification par congélation de gouttes, de manière préférée par évaporation de solvant. Ces procédés sont décrits notamment dans les articles suivants : Abrant A et al., Eur.polym. J .,37, 955-963, (2001) Microencapsulation par évaporation de solvant ; Taverdet J L . et al., Ann. Fais. Exp. Chim. , 94, 955, 103-1 13 (2001) Microencapsulation de matière active par coacervation complexe : influence de certains facteurs sur la vitesse de libération ; Fugit J L . et al., Polymer Int., 52, 670-675, (2003) Treatment of a plasticized PVC to reduce plasticizer/solvent migration : optimization with an experiment design ; Ponsart S et al. Eur.J. Sci. 4 Suppl. S75-S76, 996 (2004) Ces procédés sont décrits également dans les ouvrages suivants: The Science and Engineering of Thermal Spray Coatings de Lech Pawlowski et al., Journal of Thermal Spray Technology,
ASM International, vol. 13, n° 1, march
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé en ce que les microparticules ou nanoparticules sont des particules composites/synthétiques et en ce que le procédé mis en œuvre pour la préparation de ces microparticules ou nanoparticules est choisi parmi :
- le procédé de précipitation de polymères comme par exemple par désolvatation ou encore de simple émulsion-évaporation de solvant;
- le procédé de polymérisation radiale à partir d'un cœur métallique avec des ramifications aléatoires ou ordonnées (le dendrimère),
ces procédés permettant la synthèse de particules pleines (billes) parfois bipolaires (avec une surface hydrophobe et un cœur hydrophile) chargées dudit au moins composé fluorescent hydrophobes, et
- le procédé d'émulsion double-évaporation de solvant ;
- le procédé de réticulation chimique de macromolécules naturelles ;
- le procédé de polymérisation interfaciale,
ces procédés permettant l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophobe ou dudit au moins composé hydrophile, ou bien encore desdits composés hydrophobe et hydrophile.
Selon un mode également préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules, caractérisé en ce le procédé mis en œuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est le procédé de double émulsion- évaporation de solvant, et
en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisi parmi :
- une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du dichlorométhane ;
- le pluronic® dissout dans de l'éthanol;
- le polycaprolactone dissout dans de l'acétone; ou
- le polystyrène dissout dans du limonène ou chloroforme.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisie parmi : - une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du dichlorométhane ;
- un solvant contenant pure ou en mélange au moins une substance fluorescente hydrophobe;
- une solution aqueuse contenant pure ou en mélange au moins une substance fluorescente hydrophile
Dans ces conditions, deux sonications successives sont réalisées, la première par mélange du solvant et de la solution aqueuse puis la seconde en mélangeant la première émulsion avec une solution aqueuse/PVA à 0, 1. Cette dernière est alors versée dans 200 mL d'une solution PVA à 1% et le mélange est placé immédiatement sous une forte agitation qui permettra l'évaporation du dichl orométhane.
Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé en ce que lesdites microparticules ou nanoparticules sont des liposomes et le procédé mis en œuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est un procédé de préparation de liposomes, en particulier mettant en œuvre comme solution hydrophobe un concentré de phospholipides.
Là encore, les procédés standards de préparation de liposomes sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas explicités ci de manière exhaustive. On peut néanmoins citer en particulier, mais sans s'y limiter, les procédés standards de préparation de liposomes tels que :
-injection éthanol dans de l'eau
-préparation par sonication
-préparation par exclusion de membrane
-préparation par lyophilisation
-préparation par congélation décongélation
-préparation par évaporation en phase reverse
-solubilisation de détergents...
Ces méthodes produisant des vésicules soient multi lamellaire, ou unilamellaires aux tailles très variées (50 à 1090 nanomètres)
Ces technologies sont discutées dans l'article de revue de Walde P et al, Chembiochem May 3; 1 1(7):848-65 (2010) Giant vesicles: préparations and applications.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que :
- ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première structure apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième structure apte à générer une fluorescence ; ou
- ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence,
est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques et/ou naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un mélange de ces composés isolés ou purifiés.
On entend par exemple par extrait naturel, végétal ou animal, apte à générer une fluorescence, toute structure, substance, ou leur mélange, présent dans un organisme appartenant au règne animal ou végétal et dans lequel extrait ou mélange est contenu au moins un composé naturel apte à générer une fluorescence, notamment sous ultraviolets
On entend par ou extrait synthétique, toute structure ou substance présente dans un organisme appartenant au règne animal ou végétal mais dont la synthèse a été réalisée par synthèse chimique.
A titre d'exemples d'extrait naturel d'origine végétale, on peut citer des extraits de plantes, de graines, de grains de pollen ou de spores végétales.
Dans un mode de réalisation encore préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que en ce ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophile est constituée essentiellement de que la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
Par composé fluorescent, on entend désigner ici en particulier les composés aptes à générer une fluorescence après soumission à un rayonnement, notamment de type ultraviolet.
Dans un mode de réalisation encore préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que en ce ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
Sous un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange d'au moins deux structures chimiques assemblées et de façon préférée un mélange d'au moins deux microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal original en fluorescence significativement différent (capable d'être distingué l'un de l'autre), chacune desdites structures chimiques assemblée ou desdites microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou de microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce que :
- l'un au moins des composés apte à générer une fluorescence et miscibles dans la première phase, et l'un au moins des composés aptes à générer une fluorescence et miscibles dans la deuxième phase est différent entre ces deux structures assemblées; ou l'un au moins des composés fluorescents hydrophobes ou hydrophiles contenu dans ladite particule est différent entre ces deux particules.
Dans un mode particulier de réalisation, selon un mode préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange d'au moins n structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules (n désignant le nombre de types de structures assemblées ou nano- et microparticules) aptes à générer un signal original en fluorescence significativement différent entre ces n structures assemblées ou particules, chacune desdites structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il met en œuvre pour chacune de ces structures assemblées ou particules une composition en composé apte à générer une fluorescence différente pour chacune de ces structures assemblées ou particules, et en ce que n est supérieur ou égal à 2, de préférence à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet les structures chimiques assemblées ou microparticules ou nanoparticules, ou mélange de structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence ou un spectre original de fluorescence, obtenu(es) ou susceptibles d'être obtenu(es) par un procédé selon la présente invention.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence différent entre chacune desdites particules, caractérisé en ce que chacune desdites particules comprend :
- une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe ;
- i) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophile,
- ii) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophobe, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophile et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe ; et en ce que :
pour chacune de ces n microparticules ou nanoparticules, l'un au moins des composés fluorescents hydrophobe ou hydrophile contenu dans ladite paroi rigide ou fluide et/ou dans ledit espace intra-particulaire est différent entre ces n particules,
n étant supérieur ou égal à 2, de préférence à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
De manière préférée, lorsqu'il s'agit de particules, lesdites particules sont choisies parmi les particules composites/synthétiques ou parmi les liposomes, notamment comme décrits pour les procédés ci-avant selon la présente invention.
De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, lesdites particules étant aptes à générer un signal spécifique en fluorescence selon la présente invention, caractérisé en ce que lesdites particules de ce mélange sont des particules dont la paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et l'espace intra-particulaire est de nature hydrophile.
De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence selon la présente invention, dans lequel mélange lesdites particules sont des particules synthétiques dont la paroi est constituée essentiellement de polymères choisis parmi le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polystyrène, le latex, le chitosan, la cellulose et viscose.
De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence selon la présente invention, caractérisé en ce que
- ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première phase apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; ou
- ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence,
est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un mélange de ces composés isolés ou purifiés.
Dans un mode de réalisation également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence selon la présente invention, dans lequel mélange, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, naturel ou synthétique, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence est constitué essentiellement de la partie hydrophile dudit extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
Dans un mode de réalisation également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce que ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile au sein d'une même particule sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet une composition pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisée en ce qu'en comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que, lorsqu'il s'agit notamment de particules, la paroi externe de ladite particule est marquée à l'aide d'un marqueur spécifique du tissu biologique ou de la cellule, ou l'un de leur élément que l'on cherche à observer ou à mettre en évidence, chacune des n particules étant marquée à l'aide d'un marqueur différent entre chacune des particules.
Parmi les marqueurs spécifiques du tissu biologique ou de la cellule, on peut citer mais sans s'y limiter tout composé capable de reconnaître spécifiquement une structure particulière ou un composé dudit tissu ou de ladite cellule ciblé, comme notamment un antigène ou un récepteur exprimé à la surface externe de ces cellules, le marqueur spécifique pouvant être alors mais sans s'y limiter un anticorps dirigé contre cet antigène ou un ligand spécifique dudit récepteur.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un kit ou nécessaire pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisé en ce que ledit kit comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, chacune des structures assemblées ou particules étant de préférence marquée par un marqueur différent.
De préférence, ledit marqueur est un marqueur biologique capable de se fixer spécifiquement sur l'élément que l'on souhaite mettre en évidence ou observer, en particulier un anticorps dirigé spécifiquement contre cet élément. Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon ou objet avec un mélange n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention.
Dans le procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet selon l'invention, de préférence, l'objet est compris dans le groupe d'objet constitué d'une œuvre d'art, de pièces technique de haute valeur ajoutée, d'objets manufacturés.
A titre d'exemples d'objet, on peut encore citer les flacons de parfums, les bouteilles telles que les bouteilles de vin, les emballages, les billets de banque, les vêtements, les montres, les produits électriques, les livres, les passeports, les médicaments, les formulations chimiques, les produits alimentaires tels que les viandes, les parfums, les vins, les articles à base de toile, de papier, de plastique, d'encres, de peinture.
Le marquage d'objet, de composition ou d'échantillon selon l'invention peut se faire de toute manière appropriée qui ne provoque pas de modification des caractéristiques desdits objets, compositions ou échantillon telles que les caractéristiques morphologiques ou biologiques (s'il s'agit de matériaux biologiques).
A titre d'exemple, le marquage peut se faire par collage ou vernissage si le support de la composition utilisé est respectivement une colle ou un vernis
De préférence ici, les colles ou vernis seront choisis parmi les colles ou vernis peu ou pas du tout fluorescent, ou encore en ce que le lesdites colles ou vernis ne gênent pas l'interprétation du signal essentiel comme par exemple la cellulose, le polyméthyl méthacrylate (PMMA), le latex,
Lorsque le support de la composition est une particule et que l'objet ou composition à marquer est un fluide, le marquage peut être réalisé par une opération de mélange. Lorsque le support de la composition est une particule et que l'objet est une pâte ou un solide, le marquage peut être réalisé en incluant le mélange desdites particules lors de la fabrication du solide, comme une pâte, un tissu, une toile (pour un tableau), du verre ou pour toute matière utile pour la manufacture d'un objet.
De préférence ici, lesdits solides seront de préférence choisis parmi les solides neutres en terme d'émission de fluorescence, c'est-à-dire parmi des matières peu ou pas du tout fluorescentes, ou encore en ce que lesdites matières ne gênent pas l'interprétation du signal essentiel de fluorescence résultant de la partition de phases.
A titre d'exemples, lorsque le support de la composition est une particule, la le marquage peut être réalisé par :
- le mélange d'une composition selon l'invention avec une encre ou une composition de véhicule d'encre ou avec de l'eau ou une combinaison d'eau et de solvant organique et l'impression directement sur un produit, ou
- l'immersion d'au moins une partie de la surface de l'objet à marquer dans une solution comprenant une composition selon l'invention pour fixer, par exemple par adsorption ladite composition sur le produit, ou
- le mélange d'au moins une composition selon l'invention avec une matière colorante ou une peinture destinée à être utilisée avec un produit, ou
- l'addition d'une composition selon l'invention directement à des solutions ou formulations de produits chimiques tels que des médicaments ou des produits alimentaires.
Avantageusement, le marquage selon l'invention peut être réalisé par pulvérisation. La pulvérisation peut se faire par exemple à l'aide d'un appareil à buse pour le marquage de nombreux produits ou à l'aide d'un appareil de type « aérosol ».
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de marquage d'une composition liquide caractérisé en ce que l'on incorpore dans ladite composition un mélange de structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, en particulier ladite composition étant choisie parmi une encre, un liquide injectable ou une solution nutritive.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic, notamment de pathologie ou d'un stade d'avancement ou de régression d'une pathologie, à partir d'un échantillon biologique échantillon, caractérisé en ce qu'il met en œuvre une étape dans laquelle on met en contact un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention avec ledit échantillon et ce que l'observe ou analyse le spectre de fluorescence émis par l'échantillon ainsi marqué, en particulier au niveau de certains éléments de l'échantillon, de préférence à partir d'une biopsie.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'authentification d'un échantillon ou d'un objet susceptible d'avoir été marqué par un mélange ou combinaison particulière de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- l'observation ou analyse du spectre de fluorescence émis par l'échantillon ou l'objet susceptible d'être ainsi marqué ; et - la comparaison du spectre ainsi obtenu avec le spectre de fluorescence spécifique associé à ce mélange ou combinaison,
- l'échantillon ou l'objet étant déterminé comme authentique si les deux spectres ainsi comparés sont identiques.
Sous encore un nouvel aspect, la présente invention comprend un objet ou liquide caractérisé en ce qu'il est marqué par un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'invention. Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention comme biomarqueur, notamment pour l'analyse protéomique, l'analyse génomique, le diagnostic en chimie de synthèse, le diagnostic environnemental, la traçabilité ou l'authentification d'objet, ou pour la lutte contre la contrefaçon.
Enfin, la présente invention a pour objet un procédé d'analyse ou de détection de la présence d'au moins une structure assemblée ou microparticule ou nanoparticule, ou d'un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence obtenu(es) selon l'invention ou susceptibles d'être obtenu(es) par un procédé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il met en œuvre une lecture du spectre de fluorescence résultant de la séparation de la phase hydrophobe et hydrophile de la particule par microscopie confocale laser afin de permettre l'identification de chaque composante spectrale de ces deux phases, ces spectres de fluorescence de chacune des composantes étant spécifique de la particule analysée.
Les applications des particules fluorescentes peuvent être également nombreuses dans la santé publique, et les secteurs industriels tels que l'agroalimentaire, le management environnemental, ou la chimie.
On peut encore citer comme application leur utilisation en cytométrie de flux, en immuno-dosage, en imagerie cellulaire et microscopie,
Cette technologie permet de générer de manière avantageuse des combinatoires spécifiques et uniques de ces structures chimiques assemblées telles que des combinaisons uniques de particules. Ces mélanges de particules génèrent un code couleur infalsifiable analysables en lecture par fluorescence.
De manière également avantageuse, le marquage est invisible à l'oeil et spécifique (combinatoire moléculaire unique), naturel et aisément détectable par un lecteur en fluorescence qui peut être portatif.
La présente invention a également comme avantage de pouvoir encapsuler des substances fluorescentes multiplexées de manière innovante par compartimentation grâce aux propriétés d'hydrophilie ou d'hydrophobicité de ces dernières. Cette nouvelle méthode d'encapsulation de substances fluorescentes permet de proposer l'utilisation de nombreuses substances naturelles végétales ce qui constitue un avantage de cette invention.
Les figures dont les légendes sont ci-après, ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée.
Légendes des figures
Figures 1A-1C : Observation sous lampe ultra-violette de solutions d'extrait
Bl, de fluorescéine (F) et d'un mélange extrait Bl/fluorescéine (M),
Figure 1A : Solution d'extrait Bl, de fluorescéine (F) et mélange extrait Bl/fluorescéine (M), lv/lv et mis sous l'éclairage d'une lampe ultra-violette.
Figure 1B : Après synthèse des particules, les solutions sont centrifugées afin de séparer les billes du surnageant contenant les substances en excès. Les surnageant sont récupérés et observés sous une lampe ultra-violette.
Figure 1C : Les particules après synthèse sont culotées par centrifugation puis remises en suspension dans une solution de PVA à 0, 1 %. Ce type de rinçage est réitéré deux fois avant de réaliser une dernière centrifugation et d'observer le culot de particules et le reste de particules en suspension sous une lampe ultra-violette.
Figures 2A-2B : Observation de particules composites sur lames sur microscope à fluorescence Figure 2A : Particules composites de PMMA enrichies d'extrait B l contenant des substances végétales fluorescentes hydrophobes observées à un grossissement 40 X sous un microscope à fluorescence. L'émission de fluorescence est analysée sous un filtre B2A (excitation > 410 nm, filtre d'arrêt : 515 à 560 nm).
Figure 2B : Particules composites de PMMA enrichies de fluorescéine après synthèse des particules, les solutions sont centrifugées afin de séparer les billes du surnageant contenant les substances en excès. Les surnageant sont récupérés et observés sous une lampe ultra-violette.
Figures 3A-3B : Observation sous lampe ultra-violette de solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes
Figure 3A : Solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes : liposomes non marqués (V), liposomes contenant l'extrait B l (B l), liposomes contenant une solution de fluorescéine (F) et liposomes contenant à la fois l'extrait B l et une solution de fluorescéine (M).
Figure 3B : Solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes précisées en A après dialyse. S est une fraction de dialysat de M.
Figures 4A-4B : Images confocales des capsules PF (voie verte uniquement : 500-620 nm, barre d'échelle : ΙΟμπι). (A) trois capsules typiques, (B) zoom sur une capsule d'environ ΙΟμπι de diamètre.
Figure 5 : Image confocale des capsules PA (voie verte : 500-620 nm, voie verte : 630-800 nm, barre d'échelle : ΙΟμπι)
Figures 6A-6B : Images confocales des capsules APF (barre d'échelle : 10 μπι). (A) voie verte uniquement : 500-620 nm, (B) voie rouge uniquement : 630-800 nm
Figure 7 : Spectres d'émission typiques des différents types de capsules sous excitation à 488 nm
Figures 8A-8E : Spectres d'émission obtenus à l'aide d'un spectrofluorimètre, après une excitation à 488 nm
Figure 8A : Spectre des particules enrichies en fluorescéine
Figure 8B : Spectre d'une solution de fluorescéine
Figure 8C: Spectre des particules enrichies en substances hydrophobes
Figure 8D : Spectre des substances hydrophobes dans du dichlorométhane Figure 8E : Spectre des particules enrichies en fluorescéine et en substances hydrophobes.
Figure 9A-9D : Solutions « eau dans huile » et « huile dans eau »
Figure 9A : Solutions « eau dans huile » : (1) solution de substances hydrophobes ; (2) après ajout de 100 μΐ. de fluorescéine (10 mg/mL) dans 900 μΐ. de substances hydrophobes (12,5 mg/mL) ; (3) émulsion générée après agitation (vortex) du mélange présenté en (2)
Figure 9B : Solutions « huile dans eau » : (4) mélange de 100 μΐ. de substances hydrophobes dans 900 μΐ. de fluorescéine ; (5) émulsion générée après agitation (vortex) de la solution en (4)
Figures 9C : Spectre correspondant au spectre de l'émulsion « eau dans huile » visualisée en figure 9 A (C)
Figures 9D : Spectre correspondant au spectre de l'émulsion « huile dans eau » visualisée en figure 9B (D)
Figure 10 : Photographie d'une cinétique obtenue pour une émulsion « eau dans huile » après agitation toutes les deux minutes. Une photographie est prise toutes les 3 minutes (0 mn (1), 3 mn (2), 6 mn (3), 9 mn (4), 12 mn (5).
EXEMPLES EXEMPLE 1 : Observations de particules composites constituées de PMMA et enrichies en fluorescéine (molécule hydrophile) et en extrait Bl (molécule hydrophobe)
La méthode d'obtention des particules de polyméthyl méthacrylate (PMMA) est décrite par Alonso (1996).
Le PMMA préalablement solubilisé dans un solvant comme le dichlorométhane est mélangé à un extrait végétal composés à 98 % de chlorophylles a et b (molécules hydrophobes) obtenues par un traitement au chloroforme d'un extrait éthanolique 70° permettant
Ce mélange (extrait Bl) constitue la phase que nous nommons solvant/PMMA/extrait. Un soluté (phase aqueuse) contenant des molécules fluorescentes hydrophiles comme la fluorescéine en mélange avec la première (solvant/PMMA) permet par sonication de créer une émulsion de fines particules aqueuses. Cette émulsion mélangée à de l'eau puis émulsifiée une seconde fois par sonication conduit alors de fines particules en suspension dans l'eau (de 50 nm à 10 μιη). Ces dernières sont constituées d'une coque de PMMA/extrait Bl renfermant de petit(s) globule(s) de soluté(s). Le solvant est évaporé par agitation créant ainsi des particules solides.
La poudre de PMMA (250 mg) est dissoute dans 5 ml de dichlorométhane pur. Si les particules sont enrichies en extrait Bl, alors 1ml d'extrait Bl à 25 mg/ml (chloroforme) est versé dans la solution de PMMA. A cette dernière solution est ajoutée 1 ml d'eau ou d'une solution de fluorescéine (3 mM/ml). Le tout est passé au sonicateur afin d'obtenir une émulsion très fine. L' émulsion est alors versée dans un grand volume d'une solution PVA 0,1 % (500 ml). L'ensemble est mis sous agitation pendant 16 h sous une hotte aspirante afin d'évaporer totalement le solvant. Ensuite, les particules sont récupérées par centrifugation à 6000 rpm (« rpm » pour tours par minutes) durant 20 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot repris par une solution PVA 0,1%. Deux centrifugations sont répétées afin d'éliminer toute trace d'extrait Bl ou de fluorescéine dans le tampon de reprise des particules.
EXEMPLE 2: Observation en épi-fluorescence sur un microscope à fluorescence et sous une lumière d'excitation ultra-violette des particules composites présentées dans l'exemple 1.
Les particules sont placées entre lame et lamelle. Chaque montage est scellé à l'aide de paraffine.
Les lames sont alors observées sur un microscope à fluorescence.
Les observations rapportées dans l'exemple 1 montrent que des particules de PMMA renfermant une solution d'eau ne génèrent qu'une très faible fluorescence sous ultra-violet (V en partie C de l'exemple 1). Lorsque l'eau est enrichie par une substance hydrophile fluorescente, la fluorescéine, alors les particules de PMMA produisent sous ultra-violet une émission de fluorescence dont la couleur jaune-vert est caractéristique de cette dernière (voir Figures 1A-1C, tube « F »). Lorsque la phase organique contenant le PMMA est enrichie par l'extrait Bl (riche en substance(s) hydrophobe(s) comme la chlorophylle), les particules ainsi produites émettent sous ultra-violet une fluorescence de couleur rouge caractéristique de l'extrait Bl ((voir Figures 1A-1C, tube « Bl »). Enfin, lorsque les deux types de substances fluorescentes sont utilisées pour générer des particules, alors ces dernières ont une émission de fluorescence originale et spécifique à cette compartimentation dont la couleur résultante est orangée ((voir Figures 1A-1C, tube « M »). Pour démontrer l'originalité de cette émission résultante, nous avons mis seules ou en mélange les deux types de substances fluorescentes. Sous ultra-violet nous avons observé la couleur jaune-verte de la fluorescéine (« F « ) Figure 1A), rouge de l'extrait Bl (« Bl », figure 1A) et vert-jade du mélange émulsifié (« M », Figure 1A). Nous confirmons l'émission vert-jade du mélange lorsque nous observons les différents milieux après synthèse des particules (Figure 1B). L'excès de substances non encapsulées dans les particules génère la couleur vert-jade du mélange (« M », figure 1B).
L'effet de compartimentation est démontré par des observations en épifluorescence des particules. Les substances hydrophobes de l'extrait Bl se trouve préférentiellement réparties à la périphérie des particules (dans la coque) (voir Figure 2A) tandis que la substance hydrophile, la fluorescéine est uniquement observée dans les cavités des particules (voir Figure 2B).
EXEMPLE 3 : Observations de liposomes chargées en fluorescéine (molécule hydrophile) et/ou en extrait Bl (molécule(s) hydrophobe(s)) Le même type d'observations indiquées aux exemples 1 et 2 a été recueilli en utilisant la fabrication de liposomes. Les liposomes sont des vésicules qui se forment naturellement ou synthétiquement à partir de phospholipides concentrés mis en présence d'un excès d'eau. L'auto-assemblage des phospholipides en bicouche forme une membrane compartimentant un espace intra-vésiculaire aqueux. De la sorte, la membrane lipidique peut être enrichie de composé(s) hydrophobe(s) tels que l'extrait
Bl et le contenu enrichi en composé(s) hydrophile(s). La méthode d'obtention des liposomes est l'injection dans l'éthanol similaire à celle décrite par Thierry et al. (Thierry, A.R., Lunardi-Iskandar, Y, Bryant, J.L., Rabinovitch, P., Gallo, R.C., and Mahan, L.C. : Systemic gene therapy : biodistribution and long-term expression of a transgene in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9742- 9746, 1995).
Pour cette expérience une solution des lipides suivant, phosphatidylcholine, dimyristoyl-phosphatidylglycérol et cholestérol a été préparée dans l'éthanol avec le rapport massique 16,5/4,3/9,2, respectivement. 120 μΐ (3 mg lipides total) de cette solution ont été injectés dans 1080 μΐ d'eau stérile. Les liposomes marqués sont obtenus en ajoutant avant le mélange par injection des phases éthanolique et aqueuse:
- soit une quantité de la fraction végétale B l (5 mg/ml) dans la phase éthanolique
- soit une quantité de la solution de FITC (3mmole/ml) dans la phase aqueuse - soit une quantité de la fraction végétale B l (5 mg/ml) dans la phase éthanolique et une quantité de la solution de FITC (3 mM/ml) dans la phase aqueuse
Les différentes préparations de liposomes marqués et contrôles sont- soumis après incubation de 1 heure à 25 °C à une première dialyse de 2 heures dans des sacs à porosité de 160 000 d (Spectra) dans de l'eau distillé à 25 °C. Puis les sacs à dialyse sont soumis à une deuxième dialyse de 12 heures à 25 °C. Les préparations sont récupérées dans des tubes Eppendorf puis placés sous UV pour évaluer leur couleur émise (Voir Figures 3 A-3B)
Cet exemple confirme clairement les observations précédentes. La fabrication d'un autre type de particule que sont les liposomes a conduit aux mêmes résultats. Ces derniers structurent deux compartiments; la couche hydrophobe constituée de lipides d'une part et le contenu aqueux (substances hydrophiles) d'autre part. Les liposomes préparés à l'aide des deux substances exhibent sous ultra-violet une émission de fluorescence orangée (Voir Figure 3B, tube « M » et exemple 3) très différente de la couleur rouge ou vert-jaune émise par les particules obtenues respectivement avec l'extrait végétal B l seul (voir Figures 3 A et 3B, tube « B l » et de l'exemple 3) ou la fluorescéine seule (voir Figures 3A et 3B, tube « F » et de l'exemple 3). De façon remarquable cette couleur orangée résultante est clairement différente de la couleur vert-jade du mélange avant dialyse (voir Figures 3 A, tube « M » et de l'exemple 3)).
A la lumière des résultats obtenus avec les particules de PMMA et/ou les liposomes, les inventeurs ont mis en évident et clairement montrés que le procédé de et ses applications pouvait être généralisés à toute structure assemblée présentant une partition de phases, tel que tout environnement naturel ou synthétique permettant d'obtenir la compartimentation d'un espace hydrophile et d'un espace hydrophobe, comme une particule composite ou un liposome.
On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter l'utilisation de réseaux tridimensionnels polymériques tels que les triblocs polymériques (matériaux solides ou en forme de gel) renfermant de par leur composition une partie hydrophile et une partie hydrophobe. EXEMPLE 4 : Spectres d'émission de ces différents mélanges
A) Matériel et méthode
Les expériences de microscopie confocale spectrale présentées dans cette section ont été réalisées à l'aide d'un système de microscopie à balayage laser LEICA TCS-SP2 (bâti droit). L'excitation a été réalisée à l'aide d'un laser Argon à la longueur d'onde de 488nm avec une puissance de l'ordre de celle utilisé habituellement lors de l'observation de marquages immunohistochimiques classiquement rencontrés en biologie (à titre indicatif : laser au quart de sa puissance maximale et filtre acousto- optique laissant passer moins de 20 % de la raie laser). L'objectif utilisé était un objectif de grande ouverture numérique à immersion à huile spécialement étudié pour la microscopie confocale de fluorescence (HCX PL APO CS 40.0 x 1.25 OIL). Il permet un travail entre lame et lamelle de 170 μπι. La séparation entre excitation et émission (fluorescence) est réalisée à l'aide d'un miroir dichroïque interférentiel de type RSP500 (possédant une longueur d'onde de coupure à 500 nm). Grâce à ce miroir, le laser incident à 488 nm est réfléchi vers l'échantillon, mais la lumière retour (de longueur d'onde supérieure à 488 nm) passe majoritairement à travers le miroir. Ce système LEICA permet de collecter une bande spécifique de fluorescence. Ainsi, ce système permet une résolution spectrale et un balayage en longueur d'onde de la fluorescence collectée. Dans les images qui seront présentées, la voie verte correspondra à une collection de fluorescence entre 500 nm et 620 nm et la voie rouge à une collecte de fluorescence entre 630 nm et 800 nm. Les spectres présentés, quant à eux, correspondront à une acquisition par balayage en longueur d'onde de 500 nm à 800nm avec une fenêtre de collecte de 10 nm. Chaque image présentée est obtenue par balayage du faisceau d'excitation à une cadence de 400 lignes par seconde et correspond à une moyenne sur plusieurs balayages d'une même zone. Ces images sont également des coupes confocales (coupes virtuelles) et sont donc obtenues par collection de la fluorescence issue principalement d'un plan axial d'épaisseur réduite (de l'ordre du micron). A la longueur d'onde de travail choisie et avec l'objectif utilisé, la résolution théorique donnée par le constructeur est de l'ordre de 0,160μιη en latéral et 0,9μιη en axial. La préparation des échantillons s'est faite à partir de capsules en solution aqueuse (avec 0,1 % d'additif tensio-actif pour éviter l'agrégation). Après centrifugation de ces solutions, environ 1 μΐ de solution était prélevée au fond des tubes et mélangée à une goutte de milieu de montage pour microscopie de fluorescence (Vectashield), puis placé entre lame et lamelle de microscopie.
B) Résultats
Pour chaque lot de capsule fourni, plusieurs lames ont été réalisées et observées sous microscope confocal. Aucune fluorescence mesurable n'a pu être détectée sur des échantillons contenant le polymère seul (sans substance végétale ni fluorescéine). Les images présentées dans cette partie sont une compilation des résultats les plus représentatifs.
1) Echantillon de type PF (fluorescéine) :
Les figures 4A et 4B présentent les capsules typiquement observées sur les échantillons PF. Seule la voie verte est présentée car aucune fluorescence significative n'a pu être observée au delà de 630 nm. Dans les résultats de l'étude spectrale illustrée à la figure 7, on retrouve une fluorescence typique de la fluorescéine avec un maximum autour de 530 nm. L'élément remarquable sur ces échantillons est la répartition inhomogène de la substance fluorescente dans les particules de polymère correspondant aux cavités de ces dernières. Le zoom sur une grosse particule d'environ 10 μιη de diamètre et présenté à la figure 1B illustre cette inhomogénéité. Sur cette particule, la fluorescence apparaît dans des zones de l'ordre ou inférieure au micron (voir flèches sur la figure 1B).
2) Echantillon de type PA (substance végétale hydrophobe) :
Les figures 5A et 5B présentent trois particules typiquement observées sur les échantillons de type PA. On constate la présence de particules pleine ou creuses, avec des cavités plus ou moins étendues. L'image est une superposition de la voie rouge et de la voie verte. Cette fois-ci, la répartition de la fluorescence est homogène au sein du polymère correspondant à la coque de ces dernières. Une faible fluorescence est constatée dans la voie verte et une plus importante dans la voie rouge. En jouant sur les sensibilités des détecteurs de ces deux voies, on arrive à équilibrer la luminosité des images et on obtient donc des capsules qui apparaissent en jaune.
Plus précisément, on retrouve le spectre d'émission de ces capsules sur la figure 7. On constate effectivement deux bandes de fluorescence de niveaux différents: une bande faiblement intense et assez large qui s'étend du vert à l'orange (entre 500 nm et 625 nm), puis une bande plus intense et plus étroite dans le rouge de 625 à 725 nm correspondant au spectre attendu des chlorophylles.
3) Echantillon de type APF (mélange substance végétale et fluorescéine) :
Les figures 6A et 6B représentent enfin les particules obtenues suite à un mélange des deux substances évoquées précédemment (fluorescéine et substance végétale). Par souci de clarté, les deux voies rouge et vertes n'ont pas été superposées ici. On constate une compartimentation des deux substances hydrophile (fluorescéine) et hydrophobe (substance végétale). La substance hydrophobe s'insère dans la coque de la particule indiquée par une flèche sur la voie rouge de la figure 6. La substance hydrophile occupe quant à elle l'intérieur de la particule (voie verte). Les deux courbes spectrales présentées sur la figure 7 corroborent cette affirmation. En effet, les spectres ont été tracés en choisissant comme région d'intérêt sur les séries d'images spectrales, soit un anneau de 15 pixels de large intégrant les pixels de la coque, soit un disque intégrant les pixels intérieurs. Pour la région d'intérêt intérieure, on retrouve presque exclusivement le spectre obtenus avec les capsules PF (fluorescéine) et pour la région extérieure, un spectre très similaire au spectre obtenu pour les particules PA. Par ailleurs, il faut noter que cette compartimentation n'est pas observée pour toutes les particules. Comme pour l'échantillon PA, on retrouve des particules plus ou moins vide, mais où seule la fluorescence mesurée sur les échantillons PA (caractéristique de la substance végétale) apparaît. Il semble donc que ces particules ne contiennent pas de fluorescéine. EXEMPLE 5 : Spectres d'émission obtenus à l'aide d'un spectrofluorimètre, après une excitation à 488 nm (voir figures 8A-8E)
Les particules (structures composites solides et fluorescentes) ont été mises en suspension dans de l'eau (1 mg de particules dans 500 μί). Spectre des particules enrichies en fluorescéine (5mg/mL) (A) ; spectre d'une solution de fluorescéine (10 mg/mL) (B) ; spectre des particules enrichies en substances hydrophobes (chlorophylles notamment à 12,5 mg/mL) (C) ; spectre des substances hydrophobes dans du dichlorométhane (12,5 mg/mL) (D) ; spectre des particules enrichies en fluorescéine et en substances hydrophobes (E).
Cet exemple met en évidence la possibilité d'obtenir les spectres d'émissions de fluorescence des structures composites en suspension dans l'eau sous une lumière d'excitation de 488 nm, avec la similitude des spectres obtenus pour la fluorescéine (substance hydrophile) pure ou enrobée (514 nm max) (au cœur des structures composites).
Ces résultats démontrent que le polymère n'est pas impliqué dans le phénomène décrit ci-dessus. Les structures composites qui contiennent seulement les substances hydrophobes (chlorophylles notamment) positionnées en périphérie génèrent un spectre à deux émissions; l'une à 660 nm et l'autre à 720 nm, ce spectre représentant la signature spécifique de cette structure.
Enfin, cet exemple met en évidence que les structures composites compartimentées contenant à la fois les substances hydrophiles (comme la fluorescéine) et hydrophobes (comme la chlorophylle notamment) génèrent un spectre original à 4 fluorescences caractéristiques : à 520 nm, à 562 nm et 680 nm et 715 nm. Le spectre révèle essentiellement une modification patente de l'émission de la fluorescéine; celle-ci semble perdre toute son intensité de fluorescence à 514 nm avec un déplacement du spectre d'émission vers les longueurs d'onde plus élevées (520/562 nm). Ce résultat est en accord avec les mesures des spectres d'émission obtenus en microscopie confocale de fluorescence.
Au regard de ces résultats, il pourrait être admis que les substances hydrophobes en périphérie absorbent une grande partie de la lumière émise par la fluorescéine dans le vert. Cela renforce l'effet de position au sein de la particule (structure composite). Mais de plus, dans un second temps, la lumière émise par la fluorescéine va être réabsorbée en partie par les substances hydrophobes ce qui aura pour conséquence de renforcer leur intensité d'émission. EXEMPLE 6 : Description des propriétés de fluorescence des émulsions obtenues à l'aide d'une solution aqueuse de fluorescéine (10 mg/mL) et d'une solution de substances hydrophobes (chlorophylles et dérivés phénoliques à 12,5 mg/mL dans du dichlorométhane) (voir Figures 9A-9D). Dans la réalisation des émulsions, nous nommerons « eau » la solution de fluorescéine et « huile » la solution enrichie en chlorophylles. Des émulsions « huile » dans « eau » sont réalisées en mélangeant 100 μL de la solution enrichie en chlorophylles dans 900 de la solution fluorescéine. A l'inverse, une émulsion « eau » dans « huile » a été réalisée ; cette dernière correspondant auxdites structures composites.
- Solutions « eau dans huile » :
- 1) solution de substances hydrophobes (voir Figure 9A(1))
- 2) après ajout de 100 μΐ. de fluorescéine (10 mg/mL) dans 900 μL de substances hydrophobes (12,5 mg/mL) (voir Figure 9A(2)) ;
- 3) émulsion générée après agitation (vortex) du mélange présenté en (2) (voir
Figure 9A(3));
- Solutions « huile dans eau » : - 4) mélange de 100 μL· de substances hydrophobes dans 900 μL· de fluorescéine (voir Figure 9B(4)) ; et
- 5) émulsion générée après agitation (vortex) de la solution en (4)(voir Figure
9B(5)).
Les spectres correspondants ont été obtenus pour :
- Le spectre de l'émulsion « eau dans huile » visualisée en (3) (voir Figure 9C) ; et
- Le spectre de l'émulsion « huile dans eau » visualisée en (5) (voir Figure 9D)
Cet exemple montre les résultats obtenus à partir d'une expérience très simple où le polymère a été retiré du mélange ; des émulsions « eau dans huile » et/ou « huile dans eau » sont ainsi obtenus. L'émulsion « eau dans huile » correspondant aux structures composites précédemment présentées génère une couleur orange sous UV, tandis qu'à l'inverse « huile dans eau » génère une couleur vert jade ce qui corrobore les premières observations. Les spectres obtenus renforcent l'interprétation faite précédemment puisqu'il est retrouvé des spectres identiques aux structures composites étudiées dans l'exemple précédent.
Est présenté dans cet exemple le spectre très important de l'émulsion « huile dans eau » avec la fluorescéine cette fois en périphérie et les substances hydrophobes au cœur de la structure. Dans ces conditions est obtenu un spectre qui présente 3 longueurs d'onde : - l'une correspondant à l'émission de la fluorescéine (510/520 nm) ; et
- les deux autres correspondants aux substances hydrophobes (à 660/680 et à 720/740 nm).
Il peut être ainsi conclu que l'émulsion inverse « huile dans eau » émet une fluorescence et génère un spectre qui est la résultante des fluorescences des substances en mélange.
EXEMPLE 7 : Emulsion « eau dans huile » (voir Figure 10)
Dans cet exemple, a été réalisée une émulsion « eau dans huile » en mélangeant 150 μΐ^ de fluorescéine (10 mg/mL) dans 900 μΐ^ de substances hydrophobes (25 mg/mL) dans du dichlorométhane.
Une cinétique a été réalisée à température ambiante et en agitant toutes les deux minutes (vortex). Une photographie est prise toutes les 3 minutes (0 mn (voir figure 10 (1), 3 mn (voir figure 10 (2), 6 mn (voir figure 10 (3), 9 mn (voir figure 10 (4) et 12 mn (voir figure 10 (5).
Cet exemple met en évidence l'instabilité de la fluorescence générée par les émulsions ; entre 4 à 12 minutes après obtention de cette dernière, la fluorescence décroît rapidement jusqu'à l'extinction totale. Il est probable qu'une dégradation très rapide des substances s'opère au contact de solvants agressifs. Par ailleurs, les substances hydrophiles et hydrophobes prises séparément pour fabriquer des émulsions vont manifester la même instabilité au cours du temps ce qui renforce l'interprétation précédente.
Sachant que les substances prises dans leur milieu respectif de solubilisation sont stables et qu'il en va de même des structures composites, il apparaît clairement et certain qu'aucun phénomène de type « quentching » est en jeu ici. Ainsi, les procédés de l'invention telle que décrite permettent de créer des structures composites solides à l'aide de polymère et/ou des lipides générant ainsi une barrière physique entre des substances non miscibles en solution et inaptes à des mélanges comme cela est montré dans l'exemple.
Au regard de l'ensemble des exemples précédents, la présente invention a pour obj et une composition (et un procédé visant à son obtention) apte à générer des structures composites fluorescentes originales. Le procédé revendiqué permet de créer (d'obtenir) cette structure composite en produisant une émulsion, une particule ou un liposome à l'aide d'une solution aqueuse de substances hydrophiles (comme la fluorescéine) et d'un solvant contenant les substances hydrophobes (comme la chlorophylle notamment) et le polymère (tel que le PMMA) ou les lipides non miscibles à l'eau. Ces structures composites solides et fluorescentes génèrent des spectres d'émission totalement originaux et stables.
Le spectre de fluorescence ainsi obtenu avec ces structures n'est pas la résultante par superposition des spectres d'émission de chaque substance. Ce constat et ces résultats mettent en évidence une spécificité de ce spectre étroitement liée au choix des substances d'une part et à la fabrication des structures elles-mêmes d'autre part. Ces exemples et résultats mettent en évidence l'importance fondamentale de l'organisation des structures composites notamment de la cartographie des substances au sein de ces dernières. La lumière d'excitation atteint les substances séquentiellement avec des émissions/absorptions originales.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée présentant une compartimentation apte à générer un signal spécifique en fluorescence en partition de phases, ladite partition de phases délimitant un premier compartiment et un deuxième compartiment, ledit premier compartiment et ledit deuxième compartiment n'étant pas miscible entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la préparation de la première phase et de la deuxième phase non miscibles; et b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième compartiment non miscibles entre eux,
caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette première phase apte à générer une fluorescence et le deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette deuxième phase apte à générer une fluorescence.
2. Procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite partition de phases délimite un premier compartiment de nature hydrophobe et un deuxième compartiment de nature hydrophile, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) la préparation de la phase de nature hydrophobe non miscible à l'eau et de la phase de nature hydrophile, et
b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un compartiment hydrophobe et un compartiment hydrophile,
caractérisé en ce que :
- ladite phase hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et la phase hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile) ; ou
- lesdites phases hydrophobe et hydrophile sont mélangées à une troisième amphiphile contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et au moins un composé fluorescent hydrophile
3. Procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit procédé est un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence, lesdites microparticules ou nanoparticules comprenant une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe, ledit procédé mettant en œuvre un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules comprenant les étapes suivantes :
a) la préparation d'une solution organique non miscible à l'eau (nommée solution hydrophobe) et d'une solution aqueuse ;
b) la mise en contact de la solution hydrophobe avec la solution aqueuse ; et c) la formation desdites particules,
caractérisé en ce que :
- ladite solution hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommé composé fluorescent hydrophobe) et la solution hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommé composé fluorescent hydrophile) ; ou
- lesdites solutions hydrophobe et hydrophile sont mélangées à une troisième contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et au moins un composé fluorescent hydrophile
4. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 3, caractérisé en ce que les microparticules ou nanoparticules sont des particules composites/synthétiques et en ce que le procédé mis en œuvre pour la préparation de ces microparticules ou nanoparticules est le procédé de double émulsion-évaporation de solvant permettant l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophile et hydrophobes et le procédé d'émulsion simple- évaporation de solvant permet l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophobe.
5. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 4, caractérisé en ce le procédé mis en œuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est le procédé de double émulsion-évaporation de solvant.
6. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 5, caractérisé en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisi parmi :
- une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du dichlorométhane ;
- le polycaprolactone dissout dans de l'acétone; ou
- le polystyrène dissout dans du limonène ou chloroforme.
7. Procédé de préparation de liposomes selon la revendication 2, caractérisé en ce que le procédé mis en œuvre pour leur préparation met en œuvre comme solution hydrophobe un concentré de phospholipides.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que :
- ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première phase apte à générer une fluorescence et ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; ou
- ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence et ladite composition comprend au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence,
est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, un mélange d'extraits synthétiques et/ou naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, et un mélange de ces composés isolés ou purifiés.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophile est constituée essentiellement de la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
10. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 9, caractérisé en ce que en ce ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
1 1. Procédé de préparation d'un mélange d'au moins deux structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins deux microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence significativement différent (capable d'être distingué l'un de l'autre), chacune desdites structures chimiques assemblée ou desdites microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que :
- l'un au moins des composés apte à générer une fluorescence et miscibles dans la première phase, et l'un au moins des composés aptes à générer une fluorescence et miscibles dans la deuxième phase contenu dans ladite structure assemblée est différent entre ces deux structures assemblées; ou
- l'un au moins des composés fluorescents hydrophobes ou hydrophiles contenu dans ladite particule est différent entre ces deux micro- ou nanoparticules.
12. Procédé de préparation d'un mélange d'au moins n structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence significativement différent entre ces n structures assemblées ou particules ou liposomes, chacune desdites structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1 , caractérisé en ce qu'il met en œuvre pour chacune de ces structures assemblées ou particules ou liposomes une composition en composés apte à générer une fluorescence différente pour chacune de ces structures assemblées ou particules ou liposomes, et en ce que n est supérieur ou égal à 2.
13. Structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, ou mélange de structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal spécifique en fluorescence obtenu(es) par un procédé selon l'une des revendications 1 à 12.
14. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal spécifique en fluorescence différent entre chacune desdites particules, caractérisé en ce que chacune desdites particules comprend :
- une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe ;
- i) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophile,
- ii) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophobe, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophile et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe ; et en ce que :
- pour chacune de ces n microparticules ou nanoparticules, l'un au moins des composés fluorescents hydrophobe ou hydrophile contenu dans ladite paroi rigide ou fluide et/ou dans ledit espace intra-particulaire est différent entre ces n particules, et
- n étant supérieur ou égal à 2.
15. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que lesdites particules sont choisies parmi les particules composites/synthétiques.
16. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 14 à 15, caractérisé en ce que lesdites particules sont des particules dont ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile.
17. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que lesdites particules sont des particules synthétiques dont la paroi est constituée essentiellement de polymères choisis parmi le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycaprolactone, le polystyrène le latex, la cellulose, le chitosan, la viscose.
18. Mélange d'au moins deux structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que
- ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première phase apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; ou
- ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence,
est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un mélange de ces composés isolés ou purifiés.
19. Mélange d'au moins deux structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence est constitué essentiellement de que la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
20. Mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile au sein d'une même particule sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
21. Composition pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisée en ce qu'en comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20.
22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce que la paroi externe de ladite particule est marquée à l'aide d'un marqueur spécifique du tissu biologique ou de la cellule, ou l'un de leur élément que l'on cherche à observer ou à mettre en évidence, chacune des n particules étant marquée à l'aide d'un marqueur différent entre chacune des particules.
23. Kit pour le diagnostic in vitro, caractérisé en ce que le kit comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, chacune des structures assemblées ou particules étant de préférence marquée par un marqueur différent.
24. Composition selon la revendication 22 ou kit selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit marqueur est un par un marqueur biologique capable de se fixer spécifiquement sur l'élément que l'on souhaite mettre en évidence ou observer, en particulier un anticorps dirigé spécifiquement contre cet élément.
25. Procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon ou objet avec un mélange n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20.
26. Procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'objet est compris dans le groupe d'objet constitué d'une œuvre d'art, de pièces techniques de haute valeur ajoutée, d'obj ets manufacturés.
27. Procédé de marquage d'une composition liquide caractérisé en ce que l'on incorpore dans ladite composition un mélange de structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, en particulier ladite composition étant choisie parmi une encre, un liquide injectable ou une solution nutritive.
28. Procédé de diagnostic, notamment de pathologie ou d'un stade d'avancement ou de régression d'une pathologie, à partir d'un échantillon biologique échantillon, caractérisé en ce qu'il met en œuvre une étape dans laquelle on met en contact un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20 avec ledit échantillon et ce que l'observe ou analyse le spectre de fluorescence émis par l'échantillon ainsi marqué, en particulier au niveau de certains éléments de l'échantillon, de préférence à partir d'une biopsie.
29. Procédé d'authentification d'un échantillon ou d'un objet susceptible d'avoir été marqué par un mélange ou combinaison particulière de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- l'observation ou analyse du spectre de fluorescence émis par l'échantillon ou l'objet susceptible d'être ainsi marqué ; et
- la comparaison du spectre ainsi obtenu avec le spectre de fluorescence spécifique associé à ce mélange ou combinaison, - l'échantillon ou l'objet étant déterminé comme authentique si les deux spectres ainsi comparés sont identiques.
30. Objet ou liquide caractérisé en ce qu'il est marqué par un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20.
31. Utilisation d'un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20 comme biomarqueur, pour l'analyse protéomique, l'analyse génomique, diagnostic en chimie de synthèse, le diagnostic environnemental, la traçabilité ou l'authentification d'objet, ou pour la lutte contre la contrefaçon.
32. Procédé d'analyse ou de détection de la présence d'au moins une structure assemblée ou microparticule ou nanoparticule, ou d'un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules, selon l'une des revendications 13 à 20, ladite structure assemblée ou ladite particule étant apte à générer un signal original en fluorescence, caractérisé en ce qu'il met en œuvre une lecture du spectre de fluorescence résultant de la séparation de la phase hydrophobe et hydrophile de la particule par microscopie confocale laser afin de permettre l'identification de chaque composante spectrale de ces deux phases, ces spectres de fluorescence de chacune des composantes étant spécifique de la particule analysée.
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