EP2556361A1 - Histologisches verfahren - Google Patents

Histologisches verfahren

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Publication number
EP2556361A1
EP2556361A1 EP11709878A EP11709878A EP2556361A1 EP 2556361 A1 EP2556361 A1 EP 2556361A1 EP 11709878 A EP11709878 A EP 11709878A EP 11709878 A EP11709878 A EP 11709878A EP 2556361 A1 EP2556361 A1 EP 2556361A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tissue
refractive index
preparation
dibenzyl ether
clarifying
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11709878A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus Becker
Hans-Ulrich Dodt
Nina JÄHRLING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Wien
Original Assignee
Technische Universitaet Wien
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Wien filed Critical Technische Universitaet Wien
Publication of EP2556361A1 publication Critical patent/EP2556361A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

Definitions

  • the invention relates to the technical field of histological preparation of biological tissue, and comprises methods and means for producing transparent biological preparations for light microscopic examination.
  • light microscopic in particular fluorescence microscopic examination of biological tissue, especially cells
  • Known measures are to reduce differences in the refractive index within the fabric, which cause unwanted light scattering and prevent transparency, as far as possible.
  • the refraction of light at the transitions of media with different optical density should be suppressed.
  • a known clarifying agent composition is a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate (BABB), usually in a ratio of
  • prefixed tissue is first dewatered in an ascending series of drying agents (dehydrating agents).
  • desiccants are organic polar solvents or solvent compositions, especially methanol, ethanol and octanol, optionally in combination with a solubilizing agent such as DMSO or a detergent.
  • the dehydrated tissue is then incubated in clarifying agent which is intended to penetrate the tissue in order to obtain a clarified, ie optically substantially transparent, tissue preparation.
  • clarifying agent which is intended to penetrate the tissue in order to obtain a clarified, ie optically substantially transparent, tissue preparation.
  • an effective tissue clarification is desired.
  • Neuronal tissue usually has a high proportion of membranous refractive structures.
  • the transparency achieved for certain light microscopic techniques in particular so-called "light band microscopy” (ultramicroscopy), see, for example, Dodt et al., Nature Methods 4 (4): 331-336 (2007), can be further improved Clarification measures so far only comparatively thin tissue sections can be clarified, ie a transparency can be achieved, which allow a light microscopic, especially fluorescence microscopic examination of the tissue.
  • Hard microscopic and fluorescence microscopy procedures that require a transparent tissue preparation can not be disadvantageously performed on tissue samples or biopsies It is desirable to improve the clarification result in such a way that larger tissue sections, for example tissue sections, are also used. can be largely clarified with about 1 cm edge length or more.
  • GFP green fluorescent protein
  • xFP enhanced green fluorescent protein
  • Other fluorescent marker proteins are "red fluorescent protein” from Discosoma sp. (DsRed) and modifications thereof, for example dsRed monomer or drFP583.
  • this protein is excited to fluoresce can be registered by fluorescence microscopy techniques, such as ultramicroscopy, and the resulting image information evaluated
  • fluorescence labeling techniques preferably use molecules specifically binding to tissue structures, such as antibodies, to which fluorescent chromophores (dyes) are coupled show fluorescence without addition of external chromophores or expression of marker proteins.
  • the technical problem underlying the present invention is to provide improved methods and means for the preparation of biological tissues, which allow an improved clarification of the tissue in order to obtain improved transparent tissue preparations.
  • Another related technical problem is the provision of methods and means for preparing biological tissues which do not interfere with the fluorescence or coloring of marker proteins or other chromophores in the tissue during preparation, or prevent or inhibit or prevent the fluorescence or coloration from occurring ,
  • a tissue fixed in a step (a) is dehydrated in a subsequent step (b) with a desiccant.
  • a subsequent step (c) the dewatered tissue is clarified with a clarifying agent.
  • the inventive method is mainly characterized in that in step (b) a novel and / or prepared in a novel manner desiccant is used.
  • the process according to the invention is above all also characterized in that in step (c) a novel and / or clarifying agent prepared in a novel manner is used.
  • The is selected from the group of aromatic ethers and the aromatic ether-containing compositions having an optical refractive index, which is adapted to the refractive index of the fabric, in particular corresponding thereto.
  • the invention thus provides according to this first aspect to use a novel clarifier based on aromatic ether.
  • a novel clarifier based on aromatic ether As a result, it is surprisingly possible to achieve a much improved transparency of the clarified tissue compared to the clarification results with known clarifying agents such as BABB.
  • this novel clarifying agent surprisingly permits fluorescence or coloring present in the tissue, especially the fluorescence of expressed marker proteins such as GFP "green fluorescent protein”, YFP "yellow fluorescent protein”, RFP "red fluorescent protein”, CFP "cyan fluorescent protein”, BFP
  • autofluorescence frequently occurs in prepared tissue, which according to the invention can be used directly for microscopic examination, surprisingly, autofluorescence phenomena in the tissue are not or only partially achieved by the preparation according to the invention This allows for novel histological examination methods and allows improved information about the examined tissue.
  • the clarifying agent is an aromatic ether or a composition containing it, which preferably has a dynamic viscosity at room temperature (21 ° C.) of less than 6 Pa s (6,000 cP).
  • the dynamic viscosity at room temperature is preferably 5.4 Pa s (5,400 cP). Or less.
  • the comparatively low viscosity of the clarifier achieved according to the invention favors the penetration of the tissue and also aids clarification in the case of thicker tissue layers which could not be adequately penetrated by clarifying agents known per se.
  • the invention provides tissue preparation of pathological tissue samples or biopsies taken from human or animal bodies.
  • a typical application is surgical material (resection material) taken during a patient's operation.
  • the preparation method according to the invention advantageously allows the extension of the application of the light band microscopy or ultramicroscopy in the field of pathological or diagnostic examination of tissue preparations or biopsies, especially in tumor diagnostics.
  • breast tissue or lung tissue taken from the body, or otherwise can now be simplified and improved for the presence of carcinoma cells or others.
  • the aromatic ether used as a clarifying agent is free from aldehyde functions and hydroxy functions and other reactive functions.
  • the presence of reactive groups such as aldehyde functions and hydroxy functions in the clarifying agent suppresses fluorescence or coloring of chromophores, particularly marker proteins.
  • the invention therefore preferably provides for avoiding the presence of such reactive groups in a clarifying agent.
  • Preferred aromatic ether is dibenzyl ether (CAS 103-50-4).
  • the clarifying agent used is exclusively dibenzyl ether and no further solvent, especially no further clarifying agent.
  • the refractive index of the clarifying agent is preferably from 1.4 to 1.8, more preferably from 1.5 to 1.6.
  • the refractive index of the clarifying agent or of the clarifying agent composition is adjusted by adding at least one organic doping agent to the clarifying agent.
  • the dopant is preferably selected from the group consisting of organic electron-rich molecules which, in particular, have no fluorescence emission in the visible light range in order not to cover or superimpose the fluorescence signal of a chromophore or marker protein.
  • the dosing agents are selected from triphenylmethane and benzoquinoline as well as other corresponding organic electron-rich molecules. The person skilled in measures for adjusting the refractive index by such dopants are known per se.
  • the invention provides for the dehydration of the tissue in step (b) the use of a drying agent based on tetrahydrofuran (THF, CAS 109-99-9).
  • the drying agent used is preferably exclusively tetrahydrofuran or a solvent composition containing tetrahydrofuran.
  • the drying agent used is exclusively tetrahydrofuran and no further solvent, preferably no further substance.
  • the inventors have surprisingly found that tetra hydrofuran facilitates effective drainage of the tissue.
  • fluorescence or colouration by chromophores, especially marker proteins is obtained and significantly less affected than with known desiccants and methods.
  • the invention accordingly also relates to the use of tetrahydrofuran as a drying agent in the fluorescence-preserving preparation of biological tissue, in particular in connection with the preparation for tissue clarification or resin embedding or other permanent preparation processes.
  • the draining of the tissue with desiccant takes place in particular by repeated incubation of the tissue in ascending solvent concentration in a manner known per se.
  • drying agents and / or clarifying agents should be present in peroxide-free form.
  • organic solvents form particularly in contact with atmospheric oxygen and / or under the action of high-energy (UV radiation) reactive peroxides.
  • the invention therefore preferably provides that desiccants and / or clarifying agents, at least at the time of performing the preparation steps (b) and (c), are in each case peroxide-free, that is to say completely free from peroxides.
  • the peroxide is less than 0.1% peroxides, preferably less than 0.01% and more preferably less than 0.001% (by volume).
  • the peroxide-free nature of these agents is achieved by desiccants and / or clarifying agents, preferably immediately before carrying out the preparation steps (b) and (c), by adsorption of any peroxide compounds present therein to an inert carrier to activated, especially basic, alumina or related adsorber systems, is removed.
  • desiccants and / or clarifying agents preferably immediately before carrying out the preparation steps (b) and (c), by adsorption of any peroxide compounds present therein to an inert carrier to activated, especially basic, alumina or related adsorber systems, is removed.
  • Other measures of the removal of peroxide compounds does not exclude the invention.
  • a preferred embodiment provides the adsorptive chromatographic purification in at least one chromatography column. This is carried out, optionally by pressure or vacuum support, in a conventional manner.
  • the resulting peroxide-free compounds or compositions are then preferably held or stored to seal off oxygen under inert gas, in particular argon.
  • a Peroxidneu Struktur is optionally additionally prevented by the addition of stabilizing agents.
  • Preferred stabilizers are BHT (3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene) and propyl gallate (propyl 3,4,5-trihydroxybenzoate); These are preferably used in a concentration of 100 to 400 ppm.
  • the inventors also found, surprisingly, that such stabilizing agents also have a stabilizing effect on chromophores, such as marker proteins, and support the maintenance of fluorescence or coloring.
  • a fixation or prefixing of the tissue structures takes place.
  • This is preferably carried out in a manner known per se by using a fixing agent known per se, which is preferably selected from formaldehyde, paraformaldehyde and functional analogous substances and Compositions.
  • a fixing agent known per se which is preferably selected from formaldehyde, paraformaldehyde and functional analogous substances and Compositions.
  • step (a) also includes the removal of the tissue from the donor organism and the cutting of the tissue
  • Tissue in dimensions adapted to the requirements of the microscopic examinations and questions used.
  • step (d) embedded the clarified tissue in order to preferably prepare a permanent preparation and / or the handling of the preparation in the microscopic
  • the invention preferably provides that the clarified tissue in step (d) is embedded in a synthetic resin composition, wherein this likewise an optical
  • Refractive index which is adapted to the refractive index of the fabric to obtain the transparency.
  • the refractive index of the first lens is the refractive index of the second lens.
  • Synthetic resin composition by adding at least one of the above-described electron-rich dopants such as
  • the refractive index of the synthetic resin composition is preferably from 1.4 to 1.8, more preferably from 1.5 to 1.6, in particular 1.55.
  • the synthetic resin composition is an epoxy-based composition containing at least one epoxy resin component, at least one hardener component, and further preferably additionally at least one plasticizer component.
  • the presence of the present invention provided clarifying agent, which can also serve as a plasticizer of the resin composition, facilitated penetration of the fabric with the resin composition.
  • the invention also relates to a kit (kit-of-parts) which is intended and used for the purpose of preparing biological tissue suitable for light microscopy.
  • the kit contains at least the, preferably peroxide-free, aromatic ether or a composition containing it with an optical refractive index, which is adapted to the refractive index of the fabric, as a clarifying agent.
  • the aromatic ether is dibenzyl ether.
  • the kit contains as clarifying agent exclusively dibenzyl ether.
  • the kit contains in a preferred embodiment additionally, preferably peroxide-free, tetrahydrofuran or a solvent composition containing this as a drying agent.
  • the kit contains as drying agent exclusively tetrahydrofuran.
  • the kit additionally contains a synthetic resin composition containing epoxy resin component, hardener component and plasticizer component, the synthetic resin composition having an optical refractive index adapted to the refractive index of the fabric.
  • the invention also relates to the use of, preferably peroxide-free, aromatic ether or a composition containing this having an optical refractive index, which at the Refractive index of biological tissue is adjusted as a clarifying agent for the purpose of preparing the tissue for light microscopic examination.
  • the invention also relates to the use of, preferably peroxide-free, aromatic ether or a composition containing it having an optical refractive index, which is adapted to the refractive index of biological tissue, as a clarifying agent for the purpose of obtaining the fluorescence marking of the tissue during its preparation for light microscopy Examination.
  • the fluorescent label of the tissue is mediated by the expression of one or more fluorescent or coloring proteins.
  • these are selected from “green fluorescent protein” (GFP) and its modifications xFP and “enhanced green fluorescent protein” (EGFP) as well as analogous coloring marker proteins.
  • Other preferred fluorescent proteins include RF fluorescent red fluorescent protein and its modifications such as drFP583 as well as analogous coloring marker proteins, other preferred fluorescent proteins are YFP yellow fluorescent protein and its modifications and analogous coloring marker proteins.
  • Other preferred fluorescent proteins are CFP "cyan fluorescent protein” and its modifications as well as analogous coloring marker proteins.Other preferred fluorescent proteins are BFP "blue fluorescent protein” and its modifications as well as analogous coloring marker proteins.
  • the fluorescence label of the tissue additionally or alternatively exclusively, may be based on fluorescence of autofluorescent structures contained in the tissue.
  • the fluorescent label of the tissue may be based on other known fluorescence labels of tissues.
  • At least one specific labeling agent with a fluorescent chromophore coupled thereto is preferred, wherein the labeling agent is selected from monoclonal antibodies, polyclonal antibodies and other molecules specifically binding to structures of the tissue. These include, for example, tumor-specific staining.
  • the invention accordingly also provides the use of, preferably peroxide-free, aromatic ether or a composition containing it having an optical refractive index which is adapted to the refractive index of biological tissue as a clarifying agent for the purpose of achieving better transparency in the clarification of the tissue its preparation for light microscopic examination.
  • the tissue is a tissue preparation which has been taken from the human or animal body, preferably selected from surgical material (resection material) and biopsies.
  • a special embodiment of the use is the tumor diagnostics.
  • a further subject of the invention is also a, in particular microscopic, preparation of a biological tissue which can be produced or is concretely produced using preparation of the clarifying agent and / or drying agent characterized above, in particular according to the method according to the invention for the preparation of biological tissue characterized here.
  • a particular embodiment of the preparation according to the invention is a tissue preparation which has been taken from the human or animal body, preferably selected from surgical material (resection material) and biopsies, especially for the purpose of pathological or diagnostic examination, for example for the purpose of tumor diagnostics.
  • FIG. 1A shows a comparative representation of the results of tissue preparation of the same preparation (left and right hemisphere of a mouse brain).
  • the right hemisphere (right half of the picture) was clarified by a known method (desiccant: ethanol; clarifying agent: benzyl alcohol / benzyl benzoate (BABB)).
  • the left hemisphere (left half of the picture) was prepared according to one embodiment of the present invention (drying agent: tetrahydrofuran, clarifying agent: dibenzyl ether).
  • drying agent tetrahydrofuran
  • clarifying agent dibenzyl ether
  • FIG. 1B shows the results of a fluorescence microscopic examination by means of light band microscopy (ultramicroscopy) of the prepared pieces of tissue shown in FIG. 1A (according to the invention: left, comparative example: right).
  • the fluorescent marker protein GFP was expressed in cells.
  • the inverted representation chosen here shows the fluorescence as blackening. It shows a much stronger fluorescence in the sample prepared according to the invention (left half of the picture).
  • FIG. 2 shows the quantitative comparison of the intensity of the fluorescence signal along two locally identical profiles through the preparations according to FIG. 1 B.
  • the profile lines are identified in FIG. 1B by the arrows a and b.
  • the tissue prepared according to the invention shows a significantly higher fluorescence intensity (upper curve).
  • Tissue sections from the brain are prepared from transgenic mice expressing the fluorescent marker protein GFP in a subset of neurons and examined by ultramicroscopy.
  • the mice are subjected to transcardial perfusion after ten minutes of anesthesia with 50 ml of ice-cold 0.1 mmol / l PBS (pH 7.6) containing 1,000 U / ml heparin.
  • the prefixing of the tissue is then carried out by perfusion for 20 minutes with in each case 100 ml of 4% strength paraformaldehyde in 0.1 mmol / l of ice-cooled PBS.
  • the brain was incubated for about twelve hours in 15 ml of 4% paraformaldehyde in 0.1 mmol / l PBS at 4 ° C.
  • the fixative is then incubated in fresh 0.1 washed out 1 mmol / 1 PBS for one hour.
  • the washing process is carried out three times.
  • the dehydration according to the invention is carried out by incubation for 12 hours in an ascending concentration series of peroxide-free tetrahydrofuran: 1.50% by volume, 2.80% by volume, 3.96% by volume, 4. and 5. 100% by volume (5 ⁇ 12 hours).
  • the clarification is then carried out by incubation three times for twelve hours each in peroxide-free dibenzyl ether.
  • the tissue preparation obtained is transparent and can be used directly for ultramicroscopy (FIGS. 1 and 2).
  • the clarified tissue preparation is embedded in a synthetic resin composition in order to permanently store the preparations.
  • a synthetic resin composition for this purpose, a mixture of the synthetic resin "E12", the hardener “E1” and the plasticizer “AE10” (each Biodur, Heidelberg) in a volume ratio of 60: 35: 5 is used whose refractive index was adjusted with triphenylmethane At about 50 ° C., this mixture hardens to form completely transparent blocks with a refractive index of about 1.55 The GFP fluorescence remains largely intact even after embedding the preparation.

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Abstract

Verfahren zur Präparation von biologischem Gewebe, um die Klärung des Gewebes für die Lichtmikroskopie zu bewirken, enthaltend die Schritte: a) Fixieren des Gewebes mit Fixierungsmittel, b) Entwässern des Gewebes mit Trocknungsmittel und c) Klären des entwässerten Gewebes mit Dibenzylether oder einer Dibenzylether enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, als Klärungsmittel. Verwendung der Zusammensetzung und Kit zur Präparation von biologischen Gewebe.

Description

Histologisches Verfahren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet der histologischen Präparation von biologischem Gewebe, und umfasst Verfahren und Mittel zur Herstellung transparenter biologischer Präparate für die lichtmikroskopische Untersuchung. Im Zusammenhang mit der lichtmikroskopischen, insbesondere fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von biologischem Gewebe, besonders Zellen, kann es erforderlich sein, die Transparenz des Gewebes für Licht, besonders für Beleuchtung und Anregungslicht, zu verbessern. Bekannte Maßnahmen bestehen darin, Differenzen im Brechungsindex innerhalb des Gewebes, die unerwünschte Lichtstreuung verursachen und Transparenz verhindern, weitestgehend zu reduzieren. Die Lichtbrechung an den Übergängen von Medien mit unterschiedlicher optischer Dichte soll unterdrückt werden. Dieser Vorgang wird als„Klärung" bezeichnet. Zur Klärung werden be- kanntermaßen Lösungsmittel eingesetzt, die einen an die Gewebestrukturen angepassten optischen Brechungsindex aufweisen. Diese „Klärungsmittel" ersetzen die im Gewebe ursprünglich vorhandene optische Medien mit anderen Brechungsindizes, insbesondere intrazelluläres und interstitielles Wasser und Fett. Eine bekannte Klä- rungsmittel-Zusammensetzung ist eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat (BABB), üblicherweise in einem Verhältnis von Zur Klärung wird vorfixiertes Gewebe zunächst in einer aufsteigenden Reihe von Trocknungsmitteln (Dehydrationsmittel) entwässert. Bekannte Trocknungsmittel sind organische polare Lösungsmittel oder Lösungsmittelzusammensetzungen, besonders Methanol, Ethanol und Oktanol, gegebenenfalls in Verbindung mit einem lösungsvermittelnden Agens wie DMSO oder einem Detergens. Das entwässerte Gewebe wird anschließend in Klärungsmittel inkubiert, das das Gewebe durchdringen soll, um ein geklärtes, das heißt optisch weitgehend transparentes, Gewebepräparat zu erhalten. Besonders in Zusammenhang mit lichtmikroskopischen und besonders fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen von neuronalem Gewebe, besonders Gewebe des zentralen Nervensystems, ist eine wirksame Gewebeklärung erwünscht. Neuronales Gewebe weist in der Regel einen hohen Anteil an membranösen lichtbrechenden Strukturen auf. Mit bekannten Klärungsmitteln ist die erzielte Transparenz für bestimmte lichtmikroskopische Techniken, insbesondere die sogenannte „Lichtbandmikroskopie" (Ultramikroskopie), siehe zum Beispiel Dodt et al., Nature Methods 4 (4): 331-336 (2007), noch weiter verbesserungswürdig. Mit bekannten Klärungsmaßnahmen kann bisher nur vergleichsweise dünne Gewebeschnitte geklärt werden, d.h. eine Transparenz erzielt werden, die eine lichtmikroskopische, besonders fluoreszenzmikroskopische Untersuchung des Gewebes ermöglichen. Lichtmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Verfahren, die ein transpa- rentes Gewebepräparat voraussetzen, können bisher nachteiligerweise nicht an Gewebeproben oder Biopsaten durchgeführt werden. Es ist wünschenswert, das Klärungsergebnis derart zu verbessern, dass auch größere Gewebeabschnitte, beispielsweise Gewebestü- cke mit etwa 1 cm Kantenlänge oder mehr weitestgehend geklärt werden können.
In Gewebe aus genetisch veränderten Organismen, worin bestimmte Gewebezellen farbgebende Markerproteine exprimieren, sind diese lichtmikroskopisch erkennbar. Ein bekanntes Markerprotein ist „green fluorescent protein" (GFP) sowie Abwandlungen (xFP) davon wie„enhanced green fluorescent protein" (EGFP). Andere fluores- zente Markerproteine sind„red fluorescent protein" aus Discosoma sp. (dsRed) und Abwandlungen davon, zum Beispiel dsRed- Monomer oder drFP583. Durch entsprechendes Anregungslicht, beispielsweise Laserlicht (488 nm), wird dieses Protein zur Fluoreszenz angeregt. Die Fluoreszenz kann durch fluoreszenzmikroskopische Techniken, beispielsweise durch Ultramikroskopie, registriert und die erhaltene Bildinformation ausgewertet werden. Andere Verfahren der Fluoreszenzmarkierung verwenden vorzugsweise spezifisch an Gewebestrukturen bindende Moleküle, beispielsweise Antikörper, woran fluoreszente Chromophore (Farbstoffe) gekoppelt sind. Daneben bestehen in einigen Geweben autofluoreszente Strukturen, die ohne Hinzufügen externer Chromophoren oder Expression von Markerpro- teinen Fluoreszenz zeigen.
Es besteht das Problem, dass bekannte Maßnahmen zur Gewebeklärung, insbesondere die Schritte der Entwässerung durch bekannte Trocknungsmittel und der Klärung durch bekannte Klärungsmittel, das Fluoreszenzsignal abschwächen und reversibel oder irreversibel verändern. Die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von geklärtem Gewebe wird dadurch wesentlich erschwert oder unmöglich gemacht. Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, verbesserte Verfahren und Mittel zur Präparation biologischer Gewebe bereitzustellen, die eine verbesserte Klärung des Gewebes ermöglichen, um verbessert transparente Gewebe- präparate zu erhalten. Ein weiteres damit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zur Präparation biologischer Gewebe, welche die Fluoreszenz oder Farbgebung von Markerproteinen oder anderen Chromophoren in dem Gewebe bei der Präparation nicht beeinträchtigen oder verhindern bezie- hungsweise eine Beeinträchtigung oder Verhinderung der Fluoreszenz oder Farbgebung vermeiden.
Das technische Problem wird vollständig gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Präparation von biologischem Gewebe für die Lichtmikroskopie, insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie und/oder Ultramikroskopie, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte aufweist, die besonders in der dargestellten Reihenfolge durchgeführt werden:
Ein in einem Schritt (a) fixiertes Gewebe wird in einem nachfolgenden Schritt (b) mit einem Trocknungsmittel entwässert. In einem nachfolgenden Schritt (c) wird das entwässerte Gewebe mit einem Klärungsmittel geklärt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist vor allem dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) ein neuartiges und/oder auf neuartige Weise vorbereitetes Trocknungsmittel eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist vor allem auch dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) ein neuartiges und/oder auf neuartige Weise vorbereitetes Klärungsmittel eingesetzt wird. Das Klä- rungsmittel ist ausgewählt aus der Gruppe der aromatischen Ether und der aromatische Ether enthaltenden Zusammensetzungen, die einen optischen Brechungsindex aufweisen, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, insbesondere diesem entspricht. Die Erfindung sieht gemäß dieses ersten Aspekts also vor, ein neuartiges Klärungsmittel auf Basis von aromatischem Ether einzusetzen. Dadurch kann überraschenderweise eine gegenüber den Klärungsergebnissen mit bekannten Klärungsmitteln wie BABB weitaus verbesserte Transparenz des geklärten Gewebes erreicht werden. Weiter erlaubt dieses neuartige Klärungsmittel überraschenderweise in dem Gewebe vorhandene Fluoreszenz oder Farbgebung, besonders die Fluoreszenz von exprimierten Markerproteinen wie GFP „green fluorescent protein", YFP„yellow fluorescent protein", RFP „red fluorescent protein", CFP„cyan fluorescent protein", BFP„blue fluorescent protein" oder verwandten Proteinen sowie anderen Chro- mophoren, zu erhalten. Daneben tritt in präpariertem Gewebe häufig Autofluoreszenz auf, die gemäß der Erfindung zur mikroskopischen Untersuchung unmittelbar herangezogen werden kann. Überraschenderweise werden Autofluoreszenzerscheinungen im Gewebe durch die erfindungsgemäße Präparation nicht oder nur unwesentlich unterdrückt. Dies erlaubt neuartige histologische Untersuchungsmethoden und ermöglicht verbesserte Aussagen über das untersuchte Gewebe.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Klärungsmittel ein aroma- tischer Ether oder eine diesen enthaltende Zusammensetzung, das oder die bevorzugt eine dynamische Viskosität bei Raumtemperatur (21°C) von weniger als 6 Pa s (6.000 cP) aufweist. Bevorzugt beträgt die dynamische Viskosität bei Raumtemperatur 5,4 Pa s (5.400 cP) oder weniger. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, begünstigt die erfindungsgemäß erzielte vergleichsweise niedrige Viskosität des Klärungsmittels die Penetration des Gewebes und unterstützt die Klärung auch bei dickeren Gewebeschichten, die mit an sich bekannten Klärungsmitteln nicht hinreichend durchdrungen werden konnten.
In einer besonderen Ausgestaltung sieht die Erfindung die Gewebepräparation von pathologischen Gewebeproben oder Biopsaten, die aus den menschlichen oder tierischen Körpern entnommen wurden, vor. Eine typische Anwendung ist Operationsmaterial (Resektionsmaterial), das während einer Operation eines Patienten entnommen wird. Das erfindungsgemäße Präparationsverfahren erlaubt vorteilhafterweise die Erweiterung der Anwendung der Lichtbandmikroskopie oder Ultramikroskopie auch auf dem Gebiet der pathologischen oder diagnostischen Untersuchung von Gewebepräparaten oder Biopsien, besonders bei der Tumordiagnostik. Vorteilhafterweise kann dem Körper entnommenes Brustgewebe oder Lungengewebe oder anderes nunmehr vereinfacht und verbessert auf das Vorhandensein von Karzinomzellen oder anderen hin untersucht werden. In einer besonderen Ausgestaltung ist der als Klärungsmittel eingesetzte aromatische Ether frei von Aldehyd-Funktionen und Hydroxy- Funktionen und anderen reaktiven Funktionen. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, unterdrückt die Gegenwart reaktiver Gruppen wie Aldehyd-Funktionen und Hydroxy-Funktionen in dem Klä- rungsmittel Fluoreszenz oder Farbgebung von Chromophoren, besonders von Markerproteinen. Die Erfindung sieht deshalb bevorzugt vor, in einem Klärungsmittel die Gegenwart solcher reaktiver Gruppen zu vermeiden. Bevorzugter aromatischer Ether ist Dibenzylether (CAS 103-50-4). In einer Variante wird als Klärungsmittel ausschließlich Dibenzylether und kein weiteres Lösungsmittel, besonders kein weiteres Klärungsmittel, eingesetzt.
Bevorzugt beträgt der Brechungsindex des Klärungsmittels von 1 ,4 bis 1 ,8, besonders bevorzugt von 1 ,5 bis 1 ,6. In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung wird der Brechungsindex des Klärungsmittels beziehungsweise der Klärungsmittelzusammensetzung durch Zusatz mindestens eines organischen Dotierungsmittels zu dem Klärungsmittel angepasst. Das Dotierungsmittel ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus organischen elektronenreichen Molekülen, die insbesondere keine Fluoreszenzemission im Bereich des sichtbaren Lichts aufweisen, um das Fluoreszenzsignal eines Chromophors oder Markerproteins nicht zu überdecken oder überlagern. Bevorzugt sind die Dosierungsmittel ausgewählt aus Triphenylmethan und Benzochinolin sowie anderen entsprechenden organischen elektronenreichen Molekülen. Dem Fachmann sind Maßnahmen zur Anpassung des Brechungsindex durch solche Dotierungsmittel an sich bekannt.
In einem zweiten Aspekt oder als besondere Ausgestaltung des vor- genannten ersten Aspekts sieht die Erfindung zur Entwässerung des Gewebes in Schritt (b) die Verwendung eines auf Tetrahydrofuran (THF, CAS 109-99-9) basierenden Trocknungsmittels vor. Bevorzugt wird als Trocknungsmittel ausschließlich Tetrahydrofuran oder eine Tetrahydrofuran enthaltende Lösungsmittelzusammensetzung ein- gesetzt. In einer Variante wird als Trocknungsmittel ausschließlich Tetrahydrofuran und kein weiteres Lösungsmittel, bevorzugt keine weitere Substanz, eingesetzt. Die Erfinder fanden überraschend, dass Tetra hydrofu ran eine effektive Entwässerung des Gewebes ermöglicht. Gleichzeitig wird die Fluoreszenz oder Farbgebung durch Chromophoren, besonders von Markerproteinen, erhalten und signifikant weniger beeinträchtigt als mit bekannten Trocknungsmitteln und -verfahren.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch die Verwendung von Tetra hydrofu ran als Trocknungsmittel bei der fluoreszenzerhaltenden Präparation von biologischem Gewebe, insbesondere in Zusammenhang mit der Vorbereitung zur Gewebeklärung oder der Harz- einbettung oder anderer Dauerpräparationsverfahren. Das Entwässern des Gewebes mit Trocknungsmittel erfolgt besonders durch wiederholte Inkubation des Gewebes in aufsteigender Lösungsmittelkonzentration in an sich bekannter Weise.
Die Erfinder fanden weiter überraschend, dass für den Erhalt der Fluoreszenz oder Farbgebung von in dem Gewebe enthaltenen Markerproteinen Trocknungsmittel und/oder Klärungsmittel, bevorzugt beide, in peroxidfreier Form vorliegen sollen. Bekanntermaßen bilden organische Lösungsmittel besonders in Kontakt mit Luftsauerstoff und/oder unter Einwirkung energiereicher (UV-Strahlung) reak- tive Peroxide. Die Erfindung sieht deshalb bevorzugt vor, dass Trocknungsmittel und/oder Klärungsmittel, zumindest zum Zeitpunkt der Durchführung der Präparationsschritte (b) und (c), jeweils peroxidfrei, das heißt vollständig frei von Peroxiden, vorliegen. Die Peroxidfreiheit beträgt weniger als 0,1 % Peroxide, bevorzugt weniger als 0,01 % und besonders bevorzugt weniger als 0,001 % (Volumenanteil). In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung wird die Peroxidfreiheit dieser Mittel dadurch erreicht, dass, bevorzugt unmittelbar vor Durchführung der Präparationsschritte (b) und (c), Trocknungsmittel und/oder Klärungsmittel durch Adsorption von darin ge- gebenenfalls vorhandenen Peroxidverbindungen an einen inerten Träger, besonders an aktiviertes, insbesondere basisches, Aluminiumoxid oder an verwandte Adsorbersysteme, entfernt wird. Andere Maßnahmen der Entfernung von Peroxidverbindungen schließt die Erfindung nicht aus. Eine bevorzugte Ausführung sieht die adsorpti- onschromatographische Aufreinigung in mindestens einer Chromatographiesäule vor. Diese wird, gegebenenfalls durch Druck- oder Vakuumunterstützung, in an sich bekannter Weise durchgeführt. Die erhaltenen peroxidfreien Verbindungen oder Zusammensetzungen werden anschließend zum Abschluss von Sauerstoff bevorzugt unter Inertgas, insbesondere Argon, gehalten oder gelagert. Eine Peroxidneubildung wird gegebenenfalls zusätzlich durch die Zugabe von Stabilisierungsmitteln verhindert. Bevorzugte Stabilisierungsmittel sind BHT (3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxytoluen) und Propylgallat (Propyl- 3,4,5-trihydroxybenzoat); diese werden vorzugsweise in einer Kon- zentration von 100 bis 400 ppm eingesetzt. Die Erfinder fanden außerdem überraschend, dass solche Stabilisierungsmittel auch auf Chromophore wie Markerproteine stabilisierend wirken und den Erhalt der Fluoreszenz oder Farbgebung unterstützen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt im Zusammenhang mit oder zum Zwecke der Bereitstellung des Gewebes in Schritt (a) eine Fixierung oder Vorfixierung der Gewebestrukturen. Dies erfolgt bevorzugt in an sich bekannter Weise durch Einsatz eines an sich bekannten Fixierungsmittels, das bevorzugt ausgewählt ist aus Forma- lin, Paraformaldehyd und dazu funktionsanalogen Substanzen und Zusammensetzungen. In einer besonderen Ausgestaltung erfolgt die
Vorfixierung des Gewebes in situ zum Beispiel durch Perfusion. In einer bevorzugten Variante umfasst Schritt (a) auch die Entnahme des Gewebes aus dem Spenderorganismus und das Schneiden des
Gewebes in an die Anforderungen der jeweils eingesetzten mikroskopischen Untersuchungen und Fragestellungen angepassten Dimensionen.
In einer besonderen Ausgestaltung des Verfahrens wird in einem
zusätzlich anschließend ausgeführten Schritt (d) das geklärte Gewe- be eingebettet, um bevorzugt ein Dauerpräparat zu erstellen und/oder die Handhabung des Präparats bei der mikroskopischen
Untersuchung zu erleichtern. Dazu sieht die Erfindung bevorzugt vor, dass das geklärte Gewebe in Schritt (d) in eine Kunstharzzusammensetzung eingebettet wird, wobei diese ebenfalls einen optischen
Brechungsindex aufweist, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, um die Transparenz zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausgestaltung wird der Brechungsindex der
Kunstharzzusammensetzung durch Zusatz mindestens eines der vorstehend beschriebenen elektronenreichen Dotierungsmittel wie
Triphenylmethan und Benzochinolin oder anderen angepasst. Bevorzugt beträgt der Brechungsindex der Kunstharzzusammensetzung von 1 ,4 bis 1 ,8, besonders bevorzugt von 1 ,5 bis 1 ,6, insbesondere 1 ,55.
Die Kunstharzzusammensetzung ist eine Epoxid-basierte Zusam- mensetzung, die zumindest eine Epoxidharzkomponente, zumindest eine Härterkomponente und außerdem bevorzugt zusätzlich zumindest eine Weichmacherkomponente enthält. Die Komponenten Wer
lo den vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von etwa 55-65 % Harz zu 40-30 % Härter zu 8-2 % Weichmacher vermengt. Vorteilhafterweise erlaubt die Gegenwart des erfindungsgemäß vorgesehenen Klärungsmittels, das ebenfalls als Weichmacher der Kunst- harzzusammensetzung dienen kann, eine erleichterte Durchdringung des Gewebes mit der Kunstharzzusammensetzung.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit (kit-of-parts), das zum Zwecke der Präparation von biologischem Gewebe, das für die Lichtmikroskopie geeignet ist, vorgesehen ist und verwendet wird. Erfindungsgemäß enthält das Kit zumindest den, bevorzugt peroxidfreien, aromatischen Ether oder eine diesen enthaltende Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, als Klärungsmittel. Bevorzugt ist der aromatische Ether Dibenzylether. Bevorzugt enthält das Kit als Klärungsmittel ausschließlich Dibenzylether. Das Kit enthält in einer bevorzugten Ausgestaltung zusätzlich, bevorzugt peroxidfreies, Tetra hydrofu ran oder eine dieses enthaltende Lösungsmittelzusammensetzung als Trocknungsmittel. Besonders bevorzugt enthält das Kit als Trocknungsmittel ausschließlich Tetrahydrofuran. In einer weiteren Ausgestaltung enthält das Kit zusätzlich eine Kunstharzzusammensetzung, enthaltend Epoxydharzkomponente, Härterkomponente und Weichmacherkomponente, wobei die Kunstharzzusammensetzung einen optischen Brechungsindex aufweist, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von, bevorzugt peroxidfreiem, aromatischem Ether oder einer diesen enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel zum Zwecke der Präparation des Gewebes für die lichtmikroskopische Untersuchung.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von, bevorzugt peroxidfreiem, aromatischem Ether oder einer diesen enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel zum Zwecke des Erhalts der Fluoreszenzmarkierung des Gewebes bei dessen Präparation für die lichtmikroskopische Unter- suchung.
In einer besonderen Ausgestaltung ist die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes durch die Expression eines oder mehrerer fluoreszierender oder farbgebender Proteine vermittelt. Diese sind in einer bevorzugten Variante ausgewählt aus„green fluorescent protein" (GFP) und dessen Abwandlungen xFP und„enhanced green fluorescent protein" (EGFP) sowie analogen farbgebenden Markerproteinen. Andere bevorzugte fluoreszente Proteine sind RFP„red fluorescent protein" wie dsRed und dessen Abwandlungen wie drFP583 sowie dazu analoge farbgebende Markerproteine. Andere bevorzugte fluo- reszente Proteine sind YFP„yellow fluorescent protein" und dessen Abwandlungen sowie dazu analoge farbgebende Markerproteine. Andere bevorzugte fluoreszente Proteine sind CFP„cyan fluorescent protein" und dessen Abwandlungen sowie dazu analoge farbgebende Markerproteine. Andere bevorzugte fluoreszente Proteine sind BFP„blue fluorescent protein" und dessen Abwandlungen sowie dazu analoge farbgebende Markerproteine. Die Erfindung ist aber nicht auf diese vorgenannten konkreteren Beispiele autofluoreszenter Proteine beschränkt. Weiter kann die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes, zusätzlich oder alternativ ausschließlich, auf Fluoreszenz von in dem Gewebe enthaltenen autofluoreszenten Strukturen basieren.
Weiter kann die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes, zusätzlich oder alternativ ausschließlich, auf anderen an sich bekannten Fluoreszenzmarkierungen von Geweben basieren. Bevorzugt ist dabei mindestens ein spezifisches Markierungsmittel mit daran gekoppeltem fluoreszentem Chromophor, wobei das Markierungsmittel ausgewählt ist aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und anderen an Strukturen des Gewebes spezifisch bindenden Molekülen. Dazu zählen beispielsweise tumorspezifische Färbungen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß auch die Verwendung von, bevorzugt peroxidfreiem, aromatischem Ether oder einer diesen enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel zum Zwecke der Erzielung einer besseren Transparenz bei der Klärung des Gewebes bei dessen Präparation für die lichtmikroskopische Untersuchung.
In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser erfindungsgemäßen Ver- wendung ist das Gewebe ein Gewebepräparat, das dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurde, bevorzugt ausgewählt aus Operationsmaterial (Resektionsmaterial) und Biopsaten. Eine besondere Ausgestaltung der Verwendung ist die Tumordiagnostik. Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung auch ein, insbesondere mikroskopisches, Präparat eines biologischen Gewebes, welches herstellbar ist oder konkret hergestellt wird unter Verwen- dung des vorstehend charakterisierten Klärungsmittels und/oder Trocknungsmittels, besonders nach dem hier charakterisierten erfindungsgemäßen Verfahren zur Präparation von biologischem Gewebe. Eine besondere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Präparats ist ein Gewebepräparat, das dem menschlichen oder tierischen Körper entnommen wurde, bevorzugt ausgewählt aus Operationsmaterial (Resektionsmaterial) und Biopsaten, besonders zum Zwecke der pathologischen oder diagnostischen Untersuchung, beispielsweise zum Zwecke der Tumordiagnostik.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele und Figuren näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären.
Die Figuren zeigen: Figur 1A zeigt eine vergleichende Darstellung der Ergebnisse der Gewebepräparation desselben Präparats (linke und rechte Hemisphäre eines Mäusegehirns). Die rechte Hemisphäre (rechte Bildhälfte) wurde mit einer bekannten Methode geklärt (Trocknungsmittel: Ethanol; Klärungsmittel: Benzylalkohol/Benzylbenzoat (BABB)). Die linke Hemisphäre (linke Bildhälfte) wurde gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung präpariert (Trocknungsmittel: Tetrahydrofuran, Klärungsmittel: Dibenzylether). Anhand der verbesserten Sichtbarkeit des Musters des darunterliegenden Millimeterpapiers lässt sich die verbesserte Transparenz der erfindungsgemäß präparierten Hemisphäre unmittelbar erkennen. Figur 1 B zeigt die Ergebnisse einer fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung mittels Lichtbandmikroskopie (Ultramikroskopie) der in Figur 1A dargestellten präparierten Gewebestücke (erfindungsgemäß: links, Vergleichsbeispiel: rechts). In beiden Präparatehälften wurde in Zellen das fluoreszente Markerprotein GFP exprimiert. Die hier gewählte invertierte Darstellung zeigt die Fluoreszenz als Schwärzung. Es zeigt sich eine deutlich stärkere Fluoreszenz in der gemäß der Erfindung präparierten Probe (linke Bildhälfte).
Figur 2 zeigt den quantitativen Vergleich der Intensität des Fluores- zenzsignals entlang zweier ortsgleicher Profile durch die Präparate gemäß Figur 1 B. Die Profillinien sind in Figur 1 B durch die Pfeile a und b gekennzeichnet. Das erfindungsgemäß präparierte Gewebe zeigt eine signifikant höhere Fluoreszenzintensität (obere Kurve).
Beispiel: Präparation von ZNS-Gewebe für die Ultramikroskopie Von transgenen Mäusen, die das fluoreszente Markerprotein GFP in einer Untergruppe von Neuronen exprimieren, werden Gewebeschnitte vom Gehirn angefertigt und ultramikroskopisch untersucht. Dazu werden die Mäuse nach Anästhesie für zehn Minuten einer transcardialen Perfusion mit jeweils 50 ml eisgekühltem 0,1 mmol/l PBS (pH 7,6) mit 1.000 U/ml Heparin unterzogen. Anschließend erfolgt die Vorfixierung des Gewebes durch 20-minütige Perfusion mit jeweils 100 ml 4%ig Paraformaldehyd in 0,1 mmol/l eisgekühltem PBS. Die Transsektion für etwa fünf Minuten endet mit der Entnahme des Gehirns. Das Gehirn wurde für etwa zwölf Stunden in 15 ml 4%igem Paraformaldehyd in 0,1 mmol/l PBS bei 4°C inkubiert. Das Fixiermittel wird anschließend durch Inkubation in frischem 0,1 mmol/1 PBS für eine Stunde ausgewaschen. Der Waschvorgang wird dreimal durchgeführt.
Die erfindungsgemäße Entwässerung (Dehydrierung) erfolgt durch jeweils zwölfstündige Inkubation in einer aufsteigenden Konzentrati- onsreihe von peroxidfreiem Tetrahydrofuran: 1. 50 Vol.-%, 2. 80 Vol.-%, 3. 96 Vol.-%, 4. und 5. 100 Vol.-% (5 x 12 Stunden). Anschließend erfolgt die Klärung durch dreimalige Inkubation für jeweils zwölf Stunden in peroxidfreiem Dibenzylether.
Die Peroxidfreiheit im Trocknungsmittel und Klärungsmittel wird zu- vor durch säulenchromatographische Abtrennung der Peroxide an aktiviertem basischem AlOx (nach Brockmann, Aktivität 1) erreicht. Aufgrund der höheren Viskosität von Dibenzylether erfolgt dort die Abtrennung durch Unterdruckfiltration. Die erhaltenen peroxidfreien Lösungsmittel werden unter Sauerstoffabschluss (Inertgas Argon) gelagert. Als Stabilisator kann BHT verwendet werden.
Das gewonnene Gewebepräparat ist transparent und unmittelbar für die Ultramikroskopie einsetzbar (Figuren 1 und 2). Optional erfolgt eine Einbettung des geklärten Gewebepräparats in eine Kunstharzzusammensetzung, um die Präparate dauerhaft aufzubewahren. Da- zu wird eine Mischung des Kunstharzes„E12", des Härters„E1" sowie des Weichmachers„AE10" (jeweils Firma Biodur, Heidelberg) in einem Volumenverhältnis von 60:35:5 eingesetzt, dessen Brechungsindex mit Triphenylmethan angepasst wurde. Darin wird das geklärte Präparat inkubiert. Bei etwa 50°C härtet diese Mischung zu völlig transparenten Blöcken mit einem Brechungsindex von etwa 1 ,55 aus. Die GFP-Fluoreszenz bleibt auch nach Einbettung des Präparats weitestgehend erhalten.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Präparation von biologischem Gewebe, um die Klärung des Gewebes für die Lichtmikroskopie zu bewirken, enthaltend die Schritte: a) Fixieren des Gewebes mit Fixierungsmittel, b) Entwässern des Gewebes mit Trocknungsmittel und c) Klären des entwässerten Gewebes mit Dibenzylether oder einer Dibenzylether enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, als Klärungsmittel.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Trocknungsmittel Tetrahydrofuran (THF) oder eine THF enthaltende Lösungsmittelzusammensetzung ist.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Trocknungsmittel und Klärungsmittel zum Zeitpunkt der Durchführung der Schritte b) und c) jeweils frei von Peroxiden sind.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Trocknungsmittel und Klärungsmittel vor der Durchführung der Schritte b) und c) jeweils durch Adsorption an einem inerten Träger von Peroxid befreit und unter Inertgas gehalten werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei Trocknungsmittel und Klärungsmittel jeweils durch Adsorption an aktiviertem basischem Aluminiumoxid von Peroxid befreit werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Fixierungsmittel, ausgewählt ist aus Formalin, Paraformaldehyd und funktionsanalogen Substanzen und Zusammensetzungen.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Brechungsindex des Klärungsmittels durch Zusatz mindestens eines organischen Dotierungsmittels zu dem Klärungsmittels ange- passt ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Dotierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Triphenylmethan und Benzochinolin und anderen organischen elektronenreichen Molekülen, die keine Fluoreszenzemission im Bereich des sichtbaren Lichts aufweisen.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter enthaltend den Schritt: d) Einbetten des geklärten Gewebes in eine Kunstharzzusammensetzung, enthaltend Epoxidharzkomponente, Härterkomponente und Weichmacherkomponente, wobei die Kunstharzzusammensetzung einen optischen Brechungsindex aufweist, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist.
10. Kit zur Präparation von biologischem Gewebe für die Lichtmikroskopie, um die Klärung des Gewebes zu bewirken, enthaltend:
Dibenzylether oder eine Dibenzylether enthaltende Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex des Gewebes angepasst ist, als Klärungsmittel und THF oder eine THF-enthaltende Lösungsmittelzusammensetzung als Trocknungsmittel.
11. Kit nach Anspruch 10, weiter enthaltend:
Kunstharzzusammensetzung, charakterisiert in Anspruch 9.
12. Verwendung von Dibenzylether oder einer Dibenzylether enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel für die Präparation des Gewebes für die lichtmikroskopische Untersuchung.
13. Verwendung von Dibenzylether oder einer Dibenzylether enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel zum Erhalt der Fluoreszenzmarkierung des Gewebes bei dessen Präparation für die lichtmikroskopische Unter- suchung.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes durch Expression eines oder mehrerer fluor- eszenter Proteine vermittelt ist.
15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Fluoreszenzmar- kierung des Gewebes auf Fluoreszenz von in dem Gewebe enthaltenen autofluoreszenten Strukturen basiert.
16. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Fluoreszenzmarkierung des Gewebes durch mindestens ein Markierungsmittel mit daran gekoppeltem fluoreszentem Chromophor, ausgewählt aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern und anderen spezifisch bindenden Molekülen, vermittelt ist.
17. Verwendung von Dibenzylether oder einer Dibenzylether enthaltenden Zusammensetzung mit einem optischen Brechungsindex, der an den Brechungsindex von biologischem Gewebe angepasst ist, als Klärungsmittel zur Erzielung einer besseren Transparenz bei der Klärung des Gewebes bei dessen Präparation für die lichtmikroskopische Untersuchung.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus Operationsmaterial und Biopsaten des tierischen oder menschlichen Körpers.
19. Präparat eines biologischen Gewebes für die lichtmikroskopische Untersuchung, hergestellt nach dem in einem der Ansprüche 1 bis 9 charakterisierten Verfahren.
20. Präparat nach Anspruch 19, wobei das Gewebe ausgewählt ist aus Operationsmaterial und Biopsaten des tierischen oder menschlichen Körpers.
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