EP2485836A1 - Monolithische säule mit immobilisiertem monomerem avidin zur anreicherung und identifizierung biotinylierter spezies - Google Patents

Monolithische säule mit immobilisiertem monomerem avidin zur anreicherung und identifizierung biotinylierter spezies

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EP2485836A1
EP2485836A1 EP09771267A EP09771267A EP2485836A1 EP 2485836 A1 EP2485836 A1 EP 2485836A1 EP 09771267 A EP09771267 A EP 09771267A EP 09771267 A EP09771267 A EP 09771267A EP 2485836 A1 EP2485836 A1 EP 2485836A1
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EP
European Patent Office
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avidin
monolithic
immobilized
monolithic column
groups
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09771267A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jens Spross
Andrea Sinz
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Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Original Assignee
Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
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Publication date
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    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • analytes prior to separation and analysis within a complex sample or, ideally, separate from interfering (matrix) substances.
  • affinity chromatography has established itself as the method of choice. Since suitable interaction partners are available for a large number of analytes, their immobilization on a chromatographic medium allows specific analytes to be separated and / or accumulated in a targeted manner from complex mixtures.
  • biotin / avidin system which, due to its extremely high interaction (K D ⁇ 10 "14 M) and its high specificity, is used for a variety of analytical questions, indeed the interaction between biotin and avidin which is native in the tetrameric state, so strong that biotin-derivatized species (eg, ssDNA, RNA, proteins, peptides, etc.) are often attached to an avidin-loaded medium and used for further experiments can only be eluted from the avidin-loaded medium by means of denaturing reagents, such as guanidine hydrochloride or sodium dodecyl sulfate, these extreme conditions are naturally not suitable if further investigations are to be carried out on the previously bound analytes (eg proteins), which is a natural folding of the protein conditional to be meaningful An example of this is protein expression, in which a biotin label is used to isolate and purify the expressed protein.
  • analytes eg proteins
  • agarose monomeric avidin bound to particles
  • a major disadvantage of agarose materials is that they are broken down by bacteria and can only be poorly sterilized, making them poorly stored and allowing the analytes to be contaminated or degraded.
  • polystyrene or SiO 2 particles are used, which, however, have a lower avidin capacity than the agarose materials and are incompatible with some biologically important ions.
  • the particle format is unfavorable for LC / MS couplings, since it is only laborious to pack columns / Mirzaei, H., Proteomics, 2008, 8, 1516 /, which often have poor reproducibility due to the difficulty of the production process.
  • the monolithic column according to the invention consists of:
  • a monolithic separation medium prepared by: a) a radical polymerization, which is started by UV light or heat by means of appropriate reagents (eg ⁇ , ⁇ '-azobisisobutyronitrile, Benzoinmethylether), from acrylic acid derivatives (eg acrylamide), methacrylic acid derivatives (eg glycidyl methacrylate , Ethylene glycol dimethacrylate, alkyl methacrylates) and / or styrene derivatives (eg divinylbenzene, styrene, 4-chloro-styrene) in the presence of inert solvents (eg 1,4-butanediol, cyclohexanol, 1-dodecanol, 1-propanol) which are responsible for the pore properties of the Monoliths are in a pretreated with vinyl organosilicate (eg trimethoxysilyl-propyloxymethacrylate) quartz glass capillar
  • organosilicates e.g., tetramethoxysilane, trimethoxy- (glycidyloxy) -silane
  • inert solvents e.g., water, 1-propanol
  • the monolithic carrier material thus prepared is used by flushing the pore-forming solvent and remaining monomers with an organic solvent for attachment of the avidin.
  • various strategies are used for this: a) epoxy methacrylate monoliths:
  • Native avidin can be immobilized on the monolith directly at neutral to weakly basic pH (pH: 7-9) using the free, terminal amino groups of the amino acid side chains by utilizing the epoxide groups.
  • the epoxide groups of the monolith are reacted with amine derivatives (ammonia, 1,2-diaminoethane, etc.).
  • amine derivatives ammonia, 1,2-diaminoethane, etc.
  • the amine groups produced thereby react with a dialdehyde (glutaraldehyde, etc.), whereby aldehyde groups for an avidin bond are available on the monolith.
  • the terminal amino groups of the amino acid side chains of the native avidin react at neutral to weakly basic pH (pH 7 - 9) with the aldehyde groups.
  • the resulting Schiff base is reduced in a final step with a hydrogenation reagent (eg, sodium cyanoborohydride, sodium borohydride) to produce an amine bond that is stable over a wide pH range.
  • a hydrogenation reagent eg, sodium cyanoborohydride, sodium borohydride
  • monomeric avidin is generated from the immobilized, native (tetrameric) avidin.
  • Denaturing reagents (8 M urea, 6 M guanidine hydrochloride (pH 1.5), 10% SDS) are pumped through the monolithic column, denaturing the tetrameric avidin and rinsing out non-monolith bound subunits.
  • the monomeric avidin immobilized on the monolithic column is renatured by rinsing with aqueous buffer solutions having a neutral to weakly basic pH (pH 7-9) and stands for the reversible binding of biotin and biotinylated analytes (eg ssDNA, RNA, proteins, peptides, etc.).
  • the immobilized monomeric avidin monolithic columns can be shortened to a particular length as needed and used for offline or online HPLC / MS experiments, as well as other analytical techniques (e.g., capillary electrophoresis).
  • the process according to the invention produces a monolithic stationary phase with avidin for the first time since the process described in EP 0 423 938 Bl leads to a particle column which does not have the desired properties.
  • the solution according to the invention combines in an outstanding manner the advantages of previously used systems: the use of monomeric avidin enables elution under approximately native conditions, the monolithic carrier material causes improved contact between the biotinylated analytes and the interaction partner avidin due to the excellent mass transfer Carrier material for liquid chromatography and capillary electrophoresis is founded.
  • various detection methods such as UV spectroscopy, fluorescence spectroscopy and Especially the mass spectrometry results in an increase in the field of application, due to the high sensitivity of the individual methods.
  • Exemplary embodiment 1 is a diagrammatic representation of Exemplary embodiment 1:
  • a quartz glass capillary (internal diameter 100 .mu.m) is rinsed overnight with 1 M NaOH solution for activation and then washed with deionized water. • the activated capillary is now with a 50% solution (v / v) of [ ⁇ -
  • the resulting monolith is purged with acetonitrile for 8 hours to remove the pore-forming solvents. Subsequently, the monolith is flushed with conc. Ammonia + 50% acetonitrile (16h), 50% acetonitrile (8h), 50wt% glutardialdehyde solution + 50% acetonitrile (16h), 25% acetonitrile (4h) and 0.1M phosphate buffer (pH 7, 4h) for loading with avidin prepared. Immobilization of the avidin is accomplished by purging the monolith with a solution of avidin (2.5 mg / mL) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7) for 16 h.
  • the monolithic immobilized monomer avidin column is equilibrated with 100% solvent A (10% ACN with 100 ⁇ M MES buffer pH 7.0) prior to the liquid chromatographic experiments, then the sample containing biotinylated analytes (eg ssDNA, RNA, proteins, peptides, etc .) are injected.
  • a typical gradient for an HPLC / MS experiment is described below: 100% solvent A (10% ACN with 100 ⁇ M MES buffer pH 7) for 18 min, change over 2 min to 100% solvent B (50% ACN + 0.4% formic acid).
  • FIGS. 1 and 2 are identical Legend to FIGS. 1 and 2:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine monolithische Säule mit immobilisiertem monomerem Avidin zur Anreicherung und Identifizierung biotinylierter Spezies bestehend aus einer stationären Phase aus monolithischen Materialen, die eine reaktive Gruppe beinhalten, an die Avidin gebunden, monomerisiert und renaturiert wird. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung dieser monolithischen Säule.

Description

Monolithische Säule mit immobilisiertem monomeren Avidin zur Anreicherung und Identifizierung biotinylierter Spezies
Die Entwicklungen im Life Science-Bereich und in der pharmazeutischen Industrie stellen immer höhere Ansprüche an die Analytik. Um den steigenden Anforderungen gerecht zu werden, benötigt man immer leistungsstärkere Analysensysteme. Insbesondere auf dem Gebiet der Proteinreinigung ist die Entwicklung neuer analytischer Methoden von großem Interesse.
Von herausragender Bedeutung ist hierbei die Kopplung des Verfahrens der Flüssigkeitschromatographie (LC / HPLC) mit der Massenspektrometrie (MS). Dabei dient die Chromatographie zur Auftrennung komplexer Substanzgemische und die Massenspektrometrie zur Identifizierung der Substanzen. Durch die Kopplung beider Methoden wird als Ergebnis zu jedem Zeitpunkt des Chromatogramms ein Massenspektrum erhalten, was bei der Analyse von Proteinen von großer Bedeutung ist und einen hohen apparativen Aufwand erfordert.
Um die Sensitivität dieser Analysemethoden weiter zu erhöhen, ist es von Vorteil, die Analyten vor der Trennung und Analyse innerhalb einer komplexen Probe anzureichen oder, im Idealfall, von störenden (Matrix-)Substanzen abzutrennen. Hierfür hat sich in den letzten Jahren die Affmitätschromatographie als Mittel der Wahl etabliert. Da für eine Vielzahl von Analyten geeignete Interaktionspartner zur Verfügung stehen, lassen sich durch deren Immoblisierung auf einem chromatographischem Medium bestimmte Analyten gezielt aus komplexen Mischungen abtrennen und/oder anreichern. Eine herausragende Stellung unter diesen Interaktionspartnern genießt das Biotin/ Avidin-System, welches aufgrund der extrem starken Interaktion (KD ~ 10"14 M) und seiner hohen Spezifizität für eine Vielzahl an analytischen Fragestellungen genutzt wird. Tatsächlich ist die Wechselwirkung zwischen Biotin und Avidin, welches im nativen Zustand als Tetramer vorliegt, so stark, dass oft mit Biotin derivatisierte Spezies (z.B. ssDNA, RNA, Proteine, Peptide, etc.) auf einem mit Avidin beladenem Medium angebunden und für weitere Experimente genutzt werden. Die mit Biotin modifizierten Spezies können ausschließlich durch denaturierende Reagenzien, wie Guanidinhydrochlorid oder Natriumdodecylsulfat, von dem Avidin-beladenem Medium eluiert werden. Diese extremen Bedingungen eignen sich naturgemäß nicht, wenn an den zuvor gebundenen Analyten (z.B. Proteinen) weitere Untersuchungen vorgenommen werden sollen, die eine natürliche Faltung des Proteins bedingen, um aussagekräftig zu sein. Ein Beispiel hierfür ist die Proteinexpression, bei der eine Biotin-Markierung zur Isolation und Reinigung des exprimierten Proteins genutzt wird. Hier liegt die große Stärke des monomeren Avidins, welches aus nativem, tetrameren Avidin durch Denaturierung gewonnen werden kann und dabei nichts von seiner herausragenden Spezifizität einbüßt, aber gleichzeitig mildere Elutionsmethoden ermöglicht, wodurch die Funktionalität des angereicherten und/oder aufgereinigten Proteins erhalten bleibt. Diese Eigenschaft des monomeren Avidins wurde bereits /Henrikson,K.P., Analytical Biochemistry, 1979, 94, 366/ und wird auch in kommerziell erhältlichen Produkten, wie z. B. Pierce Monomerie Avidin Kit, Monomeric Avidin Agarose, Pierce Monomeric Avidin UltraLink Resin und Pierce Monomeric Avidin Agarose, genutzt.
Der große Nachteil dieser Produkte ist allerdings, dass das monomere Avidin an Partikel gebunden (Agarose u.a.) ist. Ein großer Nachteil der Agarosematerialien besteht darin, dass sie durch Bakterien abgebaut werden und nur schlecht sterilisiert werden können, wodurch sie schlecht zu lagern sind und die Analyten verunreinigt oder abgebaut werden können. Um diesen Nachteil zu eliminieren, werden Polystyrol- oder SiO2-Partikel verwendet, die allerdings eine geringere Avidinkapazität als die Agarosematerialien aufweisen und zu einigen biologisch wichtigen Ionen inkompatibel sind. Weiterhin ist das Partikelformat ungünstig für LC/MS-Kopplungen, da erst aufwändig Säulen gepackt werden müssen /Mirzaei,H., Proteomics, 2008, 8, 1516/, die aufgrund der Schwierigkeit des Herstellungsprozesses oft eine schlechte Reproduzierbarkeit aufweisen. Dies ist vor allem bei Kapillarsäulen (ID 50 - 200 μm) für die nanoHPLC der Fall, die aber für die Analytik von Proteinen und Peptiden stetig an Bedeutung zunimmt. Zudem sind die Trenneigenschaften dieser Partikelsäulen den monolithischen Säulen unterlegen, weswegen vermehrt monolithische Materialien zur Trennung von Protein- und Peptidproben zum Einsatz kommen. Dies beruht auf der exzellenten Interaktion zwischen den Analyten und der stationären Phase, die ihren Ursprung im Massentransfer (C-Term der van Deemter Funktion) der monolithischen Materialien hat. Gemäß vorliegender Erfindung ist dieser Massentransfer für die Bindung der biotinylierten Analyten an das immobilisierte monomere Avidin und deren spätere Elution verantwortlich.
Erfindungsgemäß werden diese Probleme durch die Verwendung von monolithischen Materialien, an die in einem späteren Schritt Avidin gebunden, monomerisiert und renaturiert wird, wodurch ein chromatographisches Medium zur Verfügung steht, das eine hohe Avidinkapazität, eine lange Lebenszeit und exzellente chromatographische Trenneigenschaften aufweist. Durch die Erfindung werden die Nachteile des im EP 0423 938 Bl beschriebenen Verfahrens, in welchem die Herstellung von mit monomerem Avidin beladenen Partikeln beschrieben wird, überwunden. Bei letzterem Verfahren besitzen die Partikel im Vergleich zu den monolithischen Materialien eine geringere Avidinkapazität. Zudem sind diese Partikelsäulen für online und offline LC-Experimente nur bedingt geeignet, da sie zuerst aufwendig hergestellt werden müssen, sie im Vergleich zu monolithischen stationären Materialien schlechtere Trenneigenschaften aufweisen und sie aufgrund des schlechten Massentransfers die Anbindung biotinylierter Analyten erschweren.
Die erfindungsgemäße monolithische Säule besteht aus:
1) einem monolithischen Trennmedium, hergestellt durch: a) eine radikalische Polymerisation, die durch UV-Licht oder Hitze mittels entsprechender Reagenzien (z.B. α,α'-Azobisisobutyronitril, Benzoinmethylether) gestartet wird, aus Acrylsäurederivaten (z.B. Acrylamid), Methacrylsäurederivaten (z.B. Glycidylmethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Alkylmethacrylate) und/oder Styrolderivaten (z.B. Divinylbenzol, Styrol, 4-Chlor-Styrol) in Gegenwart von inerten Lösungsmitteln (z.B. 1,4-Butandiol, Cyclohexanol, 1-Dodecanol, 1-Propanol), die für die Poreneigenschaften des Monolithen verantwortlich sind, in einer mit Vinylorganosilicat (z.B. Trimethoxysilyl-propyloxymethacrylat) vorbehandelten Quarzglaskapillare. b) einen Sol-Gel-Prozeß aus Organosilicaten (z.B. Tetramethoxysilan, Trimethoxy- (glycidyloxy)-silan) in Gegenwart von inerten Lösungsmitteln (z.B. Wasser, 1- Propanol), die für die Poreneigenschaften des Monolithen verantwortlich sind.
2) Das so hergestellte monolithische Trägermaterial wird durch das Ausspülen der porenbildenden Lösungsmittel und verbliebener Monomere mit einem organischen Lösungsmittel zur Anbindung des Avidin genutzt. Dafür kommen in Abhängigkeit der reaktiven Gruppen des Monolithen verschiedene Strategien zur Anwendung: a) Epoxymethacrylate-Monolithe:
I) Natives Avidin kann aufgrund der vorhandenen freien, endständigen Aminogruppen der Aminosäureseitenketten direkt bei neutralem bis schwach basischem pH- Wert (pH: 7 - 9) unter Ausnutzung der Epoxidgruppen auf dem Monolith immobilisiert werden.
II) Die Epoxidgruppen des Monolithen werden mit Aminderivaten (Ammoniak, 1,2-Diaminoethan, etc.) umgesetzt. In einem zweiten Schritt reagieren die dadurch erzeugten Amingruppen mit einem Dialdehyd (Glutardialdehyd, etc.), wodurch auf dem Monolithen Aldehydgruppen für eine Avidinanbindung zur Verfügung stehen. Die endständigen Aminogruppen der Aminosäureseitenketten des nativen Avidins reagieren bei neutralem bis schwach basischem pH- Wert (pH 7 - 9) mit den Aldehydgruppen. Die entstandene Schiff sehe Base wird in einem letzten Schritt mit einem Hydrierungsreagenz (z.B. Natriumcynaoborhydrid, Natriumborhydrid) reduziert, um eine Aminbindung zu erzeugen, die über einen weiten pH- Bereich stabil ist.
b) Anbindung über weitere funktionelle Gruppen
3) In einem letzten Schritt wird aus dem immobilisiertem, nativen (tetrameren) Avidin monomeres Avidin erzeugt. Durch die monolithische Säule werden denaturierenden Reagenzien (8 M Harnstoff, 6 M Guanidinhydrochlorid (pH 1.5), 10% SDS) gepumpt, die das tetramere Avidin denaturieren und nicht auf dem Monolithen gebundene Untereinheiten ausspülen. Das auf der monolitischen Säule immobilisierte monomere Avidin wird durch Spülen mit wässrigen Pufferlösungen mit neutralem bis schwach basischem pH-Wert (pH 7 - 9) renaturiert und steht für die reversible Anbindung von Biotin und biotinylierten Analyten (z.B. ssDNA, RNA, Proteine, Peptide, etc.) zur Verfügung. Die monolithischen Säulen mit immobilisiertem monomeren Avidin können je nach Bedarf auf eine bestimmte Länge gekürzt und für offline oder online HPLC/MS- Experimente, sowie für weitere Analysenmethoden (z.B. Kapillarelektrophorese) genutzt werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erstmals eine monolithische stationäre Phase mit Avidin erzeugt, da das in EP 0 423 938 Bl beschriebene Verfahren zu einer Partikelsäule führt, welche nicht die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die erfindungsgemäße Lösung kombiniert hierbei in hervorragender Weise die Vorteile bislang verwandter Systeme: der Einsatz von monomerem Avidin ermöglicht eine Elution unter annähernd nativen Bedingungen, das monolithische Trägermaterial bewirkt aufgrund des exzellenten Massentransfers einen verbesserten Kontakt zwischen den biotinylierten Analyten und dem Interaktionspartner Avidin worin die Eignung des Trägermaterials für Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese begründet liegt. Durch die Kopplung mit vielfältigen Detektionsmethoden, wie UV-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie und besonders der Massenspektrometrie, ergibt sich eine Vergrößerung des Anwendungsgebietes, bedingt durch die hohe Sensitivität der einzelnen Methoden. Zudem ermöglicht die Kopplung mit der Massenspektrometrie weitere Einblicke in die Zusammensetzung und Struktur der untersuchten Analyten. Zudem erlaubt die hohe Permeabilität der Monolithen chromatographische Trennungen bei höheren Flussraten durchzuführen, wie es bei Partikelsäulen mit gleichem Innendurchmesser möglich wäre, wodurch die Analysenzeit verringert werden kann. Zusätzlich ist es aufgrund der Automatisierungsoption vieler LC/MS, HPLC/MS und CE/MS Systeme möglich, im Routinebetrieb einen hohen Probendurchsatz zu erzielen.
Ausfuhrungsbeispiel 1:
Eine Quarzglaskapillare (Innendurchmesser 100 μm) wird zur Aktivierung über Nacht mit 1 M NaOH-Lösung gespült und anschließend mit deionisiertem Wasser ausgewaschen. Die • aktivierte Kapillare wird nun mit einer 50%igen Lösung (v/v) von [γ-
(Methacryloyloxy)propyl]trimethoxysilan in Aceton gefüllt und für Ih bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Prozedur wird wiederholt, wobei die Inkubationszeit auf 2h erhöht wird. Durch Spülen mit deionisiertem Wasser werden die verbliebenen Reaktanden entfernt. Anschließend wird die Kapillare mit der entgasten Reaktionsmischung, bestehend aus 180 mg Glycidylmethacrylat, 120 mg Ethylenglycoldimethacrylat, 588 mg Cyclohexanol, 112 mg 1- Dodecanol und 3 mg α,α'-Azobisisobutyronitril, gefüllt, mit Septen verschlossen und im Wasserbad bei 550C für 16h polymerisiert. Der entstandene Monolith wird zur Entfernung der porenbildenden Lösungsmittel für 8h mit Acetonitril gespült. Anschließend wird der Monolith durch das Spülen mit konz. Ammoniak + 50% Acetonitril (16h), 50% Acetonitril (8h), 50wt% Glutardialdehydlösung + 50% Acetonitril (16h), 25% Acetonitril (4h) und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7, 4h) für die Beladung mit Avidin vorbereitet. Die Immobilisierung des Avidin geschieht durch Spülen des Monolithen mit einer Lösung von Avidins (2,5 mg/mL) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) für 16h. Abschließend wird für 8h mit einer 50 mM Natriumcyanoborhydridlösung gespült und das monomere Avidin durch Spülen mit 6 M Guanidinhydrochlorid in 0.2 M KCl-HCl-Puffer (pH 1,5) für 66h erzeugt. Nach dem Reinigen der monolithischen Säule steht diese für die Analyse biotinylierter Spezies (z.B. ssDNA, RNA, Proteine, Peptide, etc.) zur Verfügung. Ausführungsbeispiel 2:
Die monolithische Säule mit immobilisiertem monomeren Avidin wird vor den flüssigkeitschromato graphischen Experimenten mit 100% Laufmittel A (10% ACN mit lOOμM MES-Puffer pH 7.0) äquilibriert, anschließend kann die biotinylierte Analyten enthaltende Probe (z.B. ssDNA, RNA, Proteine, Peptide, etc.) injiziert werden. Ein typischer Gradient für ein HPLC/MS-Experiment ist im Folgenden beschrieben: 100% Laufmittel A (10% ACN mit lOOμM MES-Puffer pH 7) für 18 min, Wechsel innerhalb von 2 min auf 100% Laufmittel B (50% ACN + 0,4% Ameisensäure). Nach 10 min Spülen mit 100% Laufmittel B wird innerhalb von 2 min wieder auf 100% Laufmittel A umgestellt und die monolithische Säule mit immobilisiertem monomeren Avidin 7 min äquilibriert, um für weitere Experimente zur Verfügung zu stehen. Während der gesamten 45 min erfolgt die Detektion der eluierten Spezies mittels eines Massenspektrometers, welches mit einer ESI- Quelle (Elektrosprayionisation) ausgerüstet ist.
Legende zu Fig. 1 und 2:
100% Laufinittel A (Fig. 1) (10% ACN mit 100μM MES-Puffer pH 7.0) von 0-18 min und 32-45 min, von 20-30 min 100% Laufmittel B (Fig. 2) (50% ACN + 0.4% Ameisensäure), Verzögerung aufgrund der internen Volumina ca. 10 min (d.h. nach 28-30 min erfolgt die Detektion des mit 100% Laufmittel B eluierten. Biotins). Wie zu erkennen ist, wird alles Biotin gebunden (nur minimale Signale zw. 10-15 min "-► 36x Vergrößerung) und nach 30 min, sofort wenn Laufmittel B durchgespült wird, wieder eluiert!
Legende zu Fig. 3 :
MS-Summenspektrum für die Zeit von 29.85 - 31.60 min: Biotin ist detektierbar z. B. als [2M+H]+ und [2M+Na]+; mcaic = 489.184 Da bzw. 511.166 Da (intensivste Peaks).

Claims

Patentansprüche
1. Monolithische Säule mit immobilisierten monomeren Avidin zur Anreicherung und Identifizierung biotinylierter Spezies bestehend aus einer stationären Phase aus monolithischen Materialien, die eine reaktive Gruppe beinhalten, an die Avidin gebunden, monomerisiert und renaturiert wird.
2. Verfahren zur Herstellung der monolithischen Säule gemäß Patentanspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass ein monolithisches Trennmedium durch eine radikalische Polymerisation, die durch UV-Licht oder Hitze mittels entsprechender Reagenzien wie α,α'-Azobisisobutyronitril, Benzoinmethylether gestartet wird, aus Acrylsäurederivaten, Methacrylsäurederivaten und/oder Styrolderivaten in Gegenwart von inerten Lösungsmitteln, in einer mit Vinylorganosilicat vorbehandelten Quarzglaskapillare erzeugt wird.
3. Verfahren zur Herstellung der monolithischen Säule gemäß Patentanspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, dass ein monolithisches Trennmedium durch einen Sol-Gel- Prozeß aus Organosilicaten in Gegenwart von inerten Lösungsmitteln erzeugt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, dass natives Avidin direkt bei neutralem bis schwach basischem pH- Wert (pH: 7 - 9) unter Ausnutzung der Epoxidgruppen auf dem Monolith immobilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, dass die Epoxidgruppen des Monolithen mit Aminderivaten umgesetzt, die so erzeugten Amingruppen mit einem Dialdehyd umgesetzt und an die Aldehydgruppen des Monolithen Avidin angebunden werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5 gekennzeichnet dadurch, dass die endständigen Aminogruppen der Aminosäureseitenketten des nativen Avidins bei neutralem bis schwach basischem pH- Wert (pH 7 - 9) mit den Aldehydgruppen reagieren und anschließend mit einem Hydrierungsreagenz reduziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, dass aus dem immobilisiertem, nativen (tetrameren) Avidin monomeres Avidin mittels denaturierender Reagenzien (6 M Guanidinhydrochlorid (pH 1.5)) erzeugt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7 gekennzeichnet dadurch, dass das auf der monolitischen Säule immobilisierte monomere Avidin durch Spülen mit wässrigen Pufferlösungen mit neutralem bis schwach basischem pH- Wert (pH 7 - 9) renaturiert wird.
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