EP2435168A1 - Verfahren zum schutz von membranen - Google Patents

Verfahren zum schutz von membranen

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Publication number
EP2435168A1
EP2435168A1 EP10720777A EP10720777A EP2435168A1 EP 2435168 A1 EP2435168 A1 EP 2435168A1 EP 10720777 A EP10720777 A EP 10720777A EP 10720777 A EP10720777 A EP 10720777A EP 2435168 A1 EP2435168 A1 EP 2435168A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
use according
soluble
water
aqueous solution
membranes
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10720777A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Thorsten Singer
Martin Schlumpberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2435168A1 publication Critical patent/EP2435168A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/02—Inorganic material
    • B01D71/024—Oxides
    • B01D71/027—Silicium oxide
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0081—After-treatment of organic or inorganic membranes
    • B01D67/0088—Physical treatment with compounds, e.g. swelling, coating or impregnation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D67/00—Processes specially adapted for manufacturing semi-permeable membranes for separation processes or apparatus
    • B01D67/0081—After-treatment of organic or inorganic membranes
    • B01D67/0097—Storing or preservation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/02—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor characterised by their properties

Definitions

  • the present invention relates to a method and a use for the protection of matrices, such as membranes, in particular silica membranes.
  • matrices such as membranes, in particular silica membranes.
  • the device and the use are for example suitable for applications in biochemistry, molecular biology, molecular genetics, microbiology, medical diagnostics or forensic medicine.
  • Matrices particularly membranes, such as silica membranes, are widely used in the field of biochemistry, molecular biology, molecular genetics, microbiology, medical diagnostics or forensic medicine, and are commonly used for the purification / isolation of biomolecules.
  • a commonly used method is e.g. the use in the isolation of nucleic acids such as DNA or RNA.
  • a sample which contains the DNA and / or RNA to be isolated for example in the presence of a so-called "chaotropic" reagent, is bound to the (purification) matrix
  • the remaining constituents of the sample can subsequently be removed by rinsing and washing the DNA or RNA is released and examined.
  • the object is achieved by a method according to claim 1 of the present invention. Accordingly, a method of protecting membranes by treating with an aqueous solution containing at least one water-soluble, nucleophilic compound is proposed.
  • the object is also achieved by a use according to claim 2 of the present invention. Accordingly, the use of an aqueous solution containing at least one water-soluble, nucleophilic compound for the protection of membranes is proposed.
  • the term "aging" of matrices, in particular of membranes is understood as meaning the loss of the binding capacity of nucleic acids under chaotropic conditions to a corresponding matrix
  • nucleic acid in the context of the present invention particularly, but not limited to, natural, preferably linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or Ribozymes, genomic, bacterial or viral DNA (single-stranded and double-stranded), chromosomal and episomal DNA, free-circulating nucleic acid and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example plasmids or oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used with the PCR, with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes labeled nucleic acids or so-called LNAs (locked nucleic acids) or PNAs ("peptide nucleic acids”) understood.
  • RNA in particular mRNA, single-stranded and double-stranded viral RNA, siRNA, miRNA, snRNA,
  • matrices is understood as meaning, in particular but not limited to, solid phases which are capable of reversibly binding biomolecules, preferably nucleic acids
  • a solid phase is preferably a membrane within the meaning of the invention, particularly preferably a silica membrane
  • filter materials with mineral constituents such as metal oxides, in particular aluminum oxide, nitrides, carbides, in particular silicon carbide, or hydrophilic particles which are capable of forming loose or solid packings are to be understood as matrices within the meaning of the invention
  • immobilization in the sense of the present invention is understood to mean, in particular but not limited to, a reversible immobilization to a suitable solid phase.
  • nucleophilic is meant the ability of a negatively polarized molecule to attack a positively polarized or charged atom in a molecule to form a covalent bond. "Typical nucleophiles are often negatively charged or have at least one lone pair in a high energy orbital.
  • the water-soluble, nucleophilic compound according to the invention is a negatively charged detergent and / or has at least one molecule having at least two OH groups.
  • the method and / or use according to the invention involve treatment with an aqueous solution containing at least one water-soluble, nucleophilic compound, since such a compound has similar chemical properties as the solid phase itself and thus is most likely capable of having its surface, e.g. the surface of a silica membrane, "imitate".
  • the protection of the solid phase resp. The matrix proceeds by a simple and very rapid operation, since the treatment is a simple impregnation of the matrix in an aqueous according to the invention
  • the method and / or the use of the present invention are preferably protective (impregnation of the matrix), ie the impregnation takes place before the storage of the matrix. Thus, this does not mean an additional step for the end user.
  • the matrices are hydrophilic.
  • the matrices are hydrophilic membranes.
  • An example of the binding of nucleic acids to hydrophilic membranes is illustrated by the so-called "boom method" (EP819696) using silica membranes.
  • a chaotropic substance such as guanidinium thiocyanate
  • proteins are also denatured and inactivated, the nucleic acids are released and bind to the OH groups of the silica membrane, and the remaining components of the sample can then be removed by washing subsequent analysis will be released again.
  • preferred hydrophilic membranes are, in particular, silica membranes, also known as glass fiber filters, quartz or glass wool, but also filter membranes with or without functional groups of natural or synthetic organic polymers, such as regenerated cellulose, cellulose acetate, cellulose nitrate, polyamide or poly (ether ) sulfone.
  • the binding of nucleic acids, for example, to the silica surface occurs via hydrogen bonding to the Si-OH groups (silanol groups) of the silica membrane.
  • the abovementioned exudations of plastic components can also bind to these Si-OH groups and thus lead to the hydrophobicity of the matrix.
  • the water-soluble compound according to the invention is able to provide an electron pair for the formation of a covalent bond because of its nucleophilic property.
  • the OH groups according to the invention are alcoholic OH groups.
  • OH " as a classical Lewis base is nucleophilic and has lone pairs of electrons which it can provide for bonds.
  • membranes are used for the immobilization of nucleic acids.
  • the method according to the invention is an impregnation method and / or the use according to the invention is a use for impregnation.
  • the membrane is treated before storage with an aqueous solution according to the invention and thereby protected from the described aging.
  • the method according to the invention and / or the use according to the invention after the treatment with the aqueous solution comprise a drying step.
  • the temperature range is not up or down limited, however, temperatures up to 45 ° C for handling reasons are preferred.
  • the duration of the drying step preferably takes place between ⁇ 1 s to ⁇ 60 min, but is in principle not limited upwards or downwards. For reasons of handling or production, times of 1 min, 2 min, 3 min, 4 min or up to 5 min are preferred.
  • This drying step is advantageous for reasons of handling, for example in the case of a treatment prior to the assembly of spin columns, and / or for storage reasons.
  • the water-soluble, nucleophilic compound of the invention is a solid.
  • the water-soluble, nucleophilic compound can remain as a thin impregnation layer on the matrix surface until it is used.
  • no separate washing step is required to remove the water-soluble nucleophilic compound since the compound is dissolved upon contact with the nucleic acid sample and thus can be removed in the usual washing steps of a nucleic acid purification procedure.
  • the water-soluble, nucleophilic compound according to the invention comprising at least one molecule having at least two OH groups is a sugar alcohol.
  • the water-soluble, nucleophilic compound according to the invention comprising at least one molecule having at least two OH groups selected from the group containing sorbitol, xylitol, lactitol, threitol, erythritol, mannitol, isomalt, inositol, palmitate and / or citrate or a Mix of it.
  • the aqueous solution according to the invention contains at least one mixture of at least one negatively charged detergent and at least one water-soluble, nucleophilic compound having at least one molecule having at least two OH groups.
  • the negatively charged detergent is selected from the group comprising fatty alcohol sulfates, in particular sodium dodecyl sulfate (SDS), and / or alkylbenzenesulfonic acids and / or sulfonates, in particular sodium dodecylbenzenesulfonate, benzenesulfonic acid, dodecylbenzenesulfonate, ammonium dodecylbenzenesulfonate, and / or N- Lauroylsarcosine ("sarcosyl”) or a mixture thereof.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • alkylbenzenesulfonic acids and / or sulfonates in particular sodium dodecylbenzenesulfonate, benzenesulfonic acid, dodecylbenzenesulfonate, ammonium dodecylbenzenesulfonate, and / or N- Lauroylsarc
  • the water-soluble compound according to the invention is most likely able to "mimic" the matrix surface because of its nucleophilic property, so that the compound according to the invention is presumably attacked by the perspiration of the plastic components instead of the matrix surface.
  • the aqueous solution according to the invention additionally contains a compound which prevents the growth of microorganisms.
  • a compound which prevents the growth of microorganisms are particularly preferred.
  • the treatment with an aqueous solution according to the invention preferably takes place for ⁇ 1 second to ⁇ 60 minutes.
  • the duration of the treatment is not limited to the maximum, however, in most applications it has been found that treatment of more than 5 minutes does not produce significantly improved binding capacity.
  • the preferred treatment time is from 1 minute, 2 minutes, 3 minutes, 4 minutes to 5 minutes.
  • the treatment with an aqueous solution according to the invention is further preferably carried out at a temperature of ⁇ 5 ° C to ⁇ 45 ° C, with temperatures of 20 0 C, 21 ° C, 22 ° C, 23 ° C, 24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C, 29 ° C or 30 0 C. are preferred.
  • the temperature range is not limited up or down, but temperatures up to 45 ° C for handling reasons are preferred.
  • the pH of the aqueous solution according to the invention is preferably ⁇ 4.5 to ⁇ 9.5, more preferably ⁇ 6 to ⁇ 8, and most preferably about 7.
  • the pH of the aqueous solution of the invention is most preferably substantially neutral.
  • the aqueous solution according to the invention is preferably present in a concentration of ⁇ 0.5 to ⁇ 20%, more preferably in a concentration of ⁇ 1 to ⁇ 10% and most preferably in a concentration of ⁇ 1 to ⁇ 5%.
  • Fig. 1 shows the experimental setup for inducing membrane aging.
  • Fig. 3 shows a diagram of the binding capacity with respect to plasmid DNA of silica membranes pretreated with various concentrations of sorbitol or SDS or comparative examples.
  • FIG. 4 shows a diagram of the binding capacity with respect to RNA of silica membranes pretreated according to the invention or comparative examples.
  • Fig. 5 shows a graph of binding ability with respect to RNA of silica membranes pretreated with various concentrations of sorbitol or SDS, and comparative examples, respectively.
  • Silica membrane discs (GF51, Fa. PaII) were punched out and each soaked in an aqueous solution of the corresponding substance.
  • the corresponding (used) substances are mentioned below.
  • the impregnation was carried out for 5 minutes at room temperature, that is at about 20 0 C.
  • the membrane discs were briefly dried at 50 0 C in the presence of a larger number of frits (Vyon F, polyethylene; Fa Kopp.) Incubated. Incubation induced the aging of the membrane discs. The incubation took place for 7 days (FIG. 2 and FIG. 4) or 3 weeks (FIG. 3 and FIG. 5).
  • the experimental setup for this purpose is shown in FIG. 1.
  • a closed beaker (1) is filled with a large number of frits (3).
  • On the frits then open Aluschiffchen, in which the treated membrane discs are located (2), laid.
  • the membrane discs were then assembled directly before testing (for binding) in mini spin columns (bottom to top construction: frit / 1 x membrane GF51 / collet).
  • the "recovery rate" of the silica membranes can be seen in Table 1 and Fig. 2. In each case, the binding ability of a new, an untreated and treated with sorbitol, NaCl, SDS or Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) membrane disk is shown.
  • CTCl Cetyltrimethylammoniumbromid
  • Table 1 Comparison of various chemicals for their effectiveness in protecting silica membranes against aging upon binding of plasmid DNA
  • Membranes pretreated with sorbitol and / or SDS according to the present invention have surprisingly retained their binding capacity and show no aging effect.
  • silica membrane discs were pretreated as described in Example 1 and assembled into the mini spin columns.
  • the "recovery rate" of the silica membranes is shown in Table 3 and Fig. 4.
  • Example 1 the membranes treated according to the present invention with SDS and / or sorbitol showed no aging effect.
  • RNA-binding ability of silica membranes pretreated with different concentrations (1%, 5% or 10%) on sorbitol or SDS is shown in Table 4 and FIG.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz von Membranen, durch Behandeln mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung, sowie die Verwendung dieser wässrigen Lösung zum Schutz von Matrices.

Description

VERFAHREN ZUM SCHUTZ VON MEMBRANEN
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Verwendung zum Schutz von Matrices, wie beispielsweise Membranen, insbesondere Silikamembranen. Die Vorrichtung sowie die Verwendung sind beispielsweise für Anwendungszwecke in der Biochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Mikrobiologie, medizinischen Diagnostik oder forensischen Medizin geeignet.
Technischer Hintergrund
Matrices, insbesondere Membranen, wie beispielsweise Silikamembranen, sind im Gebiet der Biochemie, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Mikrobiologie, medizinischen Diagnostik oder forensischen Medizin weit verbreitet und werden üblicherweise zur Aufreinigung/Isolierung von Biomolekülen eingesetzt. Eine häufig eingesetzte Methode ist z.B. der Einsatz bei der Isolierung von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA.
Hierzu wird eine Probe, die die zu isolierende DNA und/oder RNA enthält, beispielsweise in Gegenwart eines sog. „chaotropen" Reagens an die (Aufreinigungs-) Matrix gebunden. Die übrigen Bestandteile der Probe können anschließend durch Spülen und Waschen entfernt werden. Anschließend wird die DNA bzw. RNA freigesetzt und untersucht.
Im Zuge von internen Untersuchungen der Anmelderin ist nun aufgefallen, dass bei einigen, insbesondere kommerziell vertriebenen Matrices, insbesondere wenn diese in Form von Membranen vorliegen, das Problem auftritt, dass vereinzelt die Fähigkeit, Nukleinsäuren zu binden mit der (Lager-)-Zeit abnimmt. Dies gilt insbesondere, wenn diese bei Raumtemperatur oder höheren Temperaturen gelagert werden. Dieses Problem kann zwar durch eine Lagerung bei 4°C gemindert, aber nicht vollständig verhindert werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen, sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zumindest weitgehend zu überwinden und insbesondere für eine weite Spanne von Anwendungen ein Verfahren sowie eine Verwendung zu schaffen, durch die Matrices vor Alterung geschützt werden können.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird ein Verfahren zum Schutz von Membranen durch Behandeln mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung vorgeschlagen.
Die Aufgabe wird ebenfalls durch eine Verwendung gemäß Anspruch 2 der vorliegenden Erfindung gelöst. Demgemäß wird die Verwendung einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung zum Schutz von Membranen vorgeschlagen.
Unter dem Term „Alterung" von Matrices, wie insbesondere von Membranen, wird im Sinne der vorliegenden Erfindung der Verlust der Bindefähigkeit von Nukleinsäuren unter chaotropen Bedingungen an eine entsprechende Matrix verstanden. Die Erfinder vermuten, dass die Ursache hierfür die längere Lagerung der Matrices in Gegenwart verschiedener Plastikmaterialien, bzw. in Form fertig assemblierter Spinsäulen, sein kann. So kann es zu Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen, wie zum Beispiel Weichmachern oder sonstigen Additiven und/oder Styrolen oder kurzkettigen Aliphaten, kommen. Dies kann im Extremfall zur völligen Hydrophobizität der Matrix, verbunden mit drastischen Ausbeuteverlusten in verschiedenen Nukleinsäureaufarbeitungs-Protokollen führen, da diese Ausdünstungen mit hoher Wahrscheinlichkeit an die hydrophile Oberfläche der Matrix binden können. Unter dem Term „Nukleinsäure" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - natürliche, vorzugsweise lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, einzelsträngige und doppelsträngige virale RNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, genomische, bacterielle oder virale DNA (einzelsträngig und doppelsträngig), chromosomale und episomale DNA, frei zirkulierende Nukleinsäure und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Plasmide oder Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digoxigenin, Biotin oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder sogenannte LNAs (locked nucleic acids) oder PNAs {„peptide nucleic acids") verstanden.
Unter dem Term „Matrices" werden insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - feste Phasen, die in der Lage sind Biomoleküle, vorzugsweise Nukleinsäuren, reversibel zu binden, verstanden. Eine solche feste Phase ist im Sinne der Erfindung bevorzugt eine Membran, besonders bevorzugt eine Silikamembran. Aber auch Filtermaterialien mit mineralischen Bestandteilen, wie Metalloxiden, insbesondere Aluminiumoxid, Nitride, Carbide, insbesondere Siliciumcarbid, oder hydrophile Partikel, die in der Lage sind, lose oder feste Packungen zu bilden, sind als Matrices im Sinne der Erfindung zu verstehen
Unter dem Term „Immobilisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung wird insbesondere - aber nicht darauf beschränkt - eine reversible Immobilisierung an eine geeignete feste Phase verstanden.
Unter dem Term „nukleophil" wird die Fähigkeit eines negativ polarisierten Moleküls, ein positiv polarisiertes oder geladenes Atom in einem Molekül unter Ausbildung einer kovalenten Bindung anzugreifen, verstanden. Typische Nukleophile sind oft negativ geladen oder besitzen zumindest ein freies Elektronenpaar in einem energiereichen Orbital. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein negativ geladenes Detergens und/oder weist mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH- Gruppen auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung beinhalten die Behandlung mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung, da eine solche Verbindung ähnliche chemische Eigenschaften wie die feste Phase selbst aufweist und somit höchstwahrscheinlich in der Lage ist, deren Oberfläche , z.B. die Oberfläche einer Silikamembran, „nachzuahmen".
Die Gründe für die überraschende Wirkung des Verfahrens und/oder der Verwendung der vorliegenden Erfindung sind bisher noch nicht bekannt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung vermuten jedoch, dass das Verfahren und/oder die Verwendung der vorliegenden Erfindung das Abfangen der für die Alterung der Matrices verantwortlichen bereits erwähnten Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen bewirken. Sie vermuten, dass möglicherweise die wasserlösliche, nukleophile Verbindung die Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen binden kann. Auf diese Weise wird die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung höchstwahrscheinlich anstelle der Matrix von den Ausdünstungen angegriffen.
Ein derartiges Verfahren und/oder eine derartige Verwendung bieten für eine weite Spanne von Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindungen mindestens einen der folgenden Vorteile:
- Der Schutz der festen Phase resp. der Matrix verläuft mittels eines einfachen und sehr schnellen Arbeitsschritts, da die Behandlung eine einfache Tränkung der Matrix in einer erfindungsgemäßen wässrigen
Lösung ist. - Das Verfahren und/oder die Verwendung der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise protektiv (Imprägnierung der Matrix), dass heißt die Imprägnierung erfolgt vor der Lagerung der Matrix. Somit bedeutet dies keinen zusätzlichen Arbeitsschritt für den Endverbraucher.
- Es kann durch die Imprägnierung eine gleichbleibende Qualität und Funktion der Matrix gewährleistet werden.
- Bei den meisten Anwendungen innerhalb der vorliegenden Erfindung ist der Schutz so vollständig, dass auf eine Lagerung bei kalten
Temperaturen verzichtet werden kann.
- Die Reproduzierbarkeit in der Anwendung steigt dadurch signifikant.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Matrices hydrophil. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Matrices hydrophile Membranen. Ein Beispiel zur Bindung von Nukleinsäuren an hydrophile Membranen erläutert das sogenannte „Boom-Verfahren" (EP819696) anhand von Silikamembranen. Zur selektiven Bindung von Nukleinsäuren werden Proben in einem Lysepuffer, das eine chaotrope Substanz, wie zum Beispiel Guanidiniumthiocyanat, enthält, lysiert. Dabei werden nicht nur die Zellen lysiert, sondern Proteine werden auch denaturiert und inaktiviert. Die Nukleinsäuren werden freigesetzt und binden an die OH-Gruppen der Silikamembran. Die übrigen Bestandteile der Probe können anschließend durch Waschen entfernt werden. Die DNA bzw. RNA kann schließlich für die anschließende Analyse wieder freigesetzt werden.
Bevorzugte hydrophile Membranen sind demnach insbesondere Silikamembranen, auch bekannt als Glasfaserfilter, Quarz- oder Glaswolle, aber auch Filtermembranen mit oder ohne funktionellen Gruppen aus natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren, wie regenerierte Cellulose, Cellulose- Acetat, Cellulose-Nitrat, Polyamid oder Poly(ether)sulfon. Die Bindung von Nukleinsäuren zum Beispiel an die Silikaoberfläche geschieht über Wasserstoffbrücken zu den Si-OH-Gruppen (Silanolgruppen) der Silikamembran. An diese Si-OH-Gruppen können vermutlich auch die bereits erwähnten Ausdünstungen von Kunststoffbestandteilen binden und somit zur Hydrophobizität der Matrix führen. Ebenso wie die Silikamembran über die Si- OH-Gruppen ist die erfindungsgemäße wasserlösliche Verbindung aufgrund ihrer nukleophilen Eigenschaft in der Lage, ein Elektronenpaar für die Bildung einer kovalenten Bindung zur Verfügung zu stellen. Die Erfinder vermuten, dass durch die Behandlung mit der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung die erfindungsgemäße Verbindung anstelle der Matrixoberfläche von den Ausdünstungen der Kunststoffbestandteile angegriffen wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen OH-Gruppen alkoholische OH-Gruppen. OH" als klassische Lewisbase ist nukleophil. Es hat freie Elektronenpaare, die es für Bindungen zur Verfügung stellen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Membranen für die Immobilisierung von Nukleinsäuren verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Imprägnierungsverfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung eine Verwendung zur Imprägnierung. Die Membran wird vor der Lagerung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung behandelt und dadurch vor der beschriebenen Alterung geschützt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen das erfindungsgemäße Verfahren und/oder die erfindungsgemäße Verwendung nach der Behandlung mit der wässrigen Lösung einen Trocknungsschritt. Dieser findet bevorzugt bei einer Temperatur von ≥5°C bis <45°C statt, wobei Temperaturen von 200C, 21 °C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C oder 300C bevorzugt sind. Prinzipiell ist der Temperaturbereich nicht nach oben oder unten begrenzt, jedoch sind Temperaturen bis 45°C aus Handhabbarkeitsgründen bevorzugt. Die Dauer des Trocknungsschrittes findet bevorzugt zwischen ≥1 s bis <60 min statt, ist prinzipiell aber nicht nach oben oder unten begrenzt. Aus Handhabbarkeitsgründen bzw. Produktionsgründen sind Zeiten von 1 min, 2 min, 3 min, 4 min oder bis zu 5 min bevorzugt. Dieser Trocknungsschritt ist aus Handhabbarkeitsgründen, beispielsweise im Fall einer Behandlung vor dem Assemblieren von Spinsäulen, und/oder aus lagerungstechnischen Gründen vorteilhaft.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein Feststoff. So kann die wasserlösliche, nukleophile Verbindung nach einem Trocknungsschritt als dünne Imprägnierungsschicht bis zur Verwendung auf der Matrixoberfläche verbleiben. Aufgrund der wasserlöslichen Eigenschaft der nukleophilen Verbindung ist auch kein separater Waschschritt zur Entfernung der wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung erforderlich, da die Verbindung bei dem Kontakt mit der Nukleinsäureprobe gelöst wird und somit bei den üblichen Waschschritten einer Nukleinsäure-Aufreinigungsprozedur entfernt werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ein Zuckeralkohol. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Sorbitol, Xylitol, Lactitol, Threit, Erythrit, Mannitol, Isomalt, Inosit, Palmitat und/oder Citrat oder einer Mischung daraus.
Gemäß einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße wässrige Lösung mindestens eine Mischung aus mindestens einem negativ geladenen Detergens und mindestens einer wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das negativ geladene Detergens ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Fettalkoholsulfate, insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS), und/oder Alkylbenzolsulfonsäuren und/oder -sulfonate, insbesondere Natriumdodecylbenzolsulfonat, Benzolsulfon- säure, Dodecylbenzolsulfonat, Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, und/oder N- Lauroylsarcosin („Sarcosyl") oder einer Mischung daraus.
Die erfindungsgemäße wasserlösliche Verbindung ist, wie bereits erläutert wurde, aufgrund ihrer nukleophilen Eigenschaft höchstwahrscheinlich in der Lage, die Matrixoberfläche „nachzuahmen". Auf diese Weise wird vermutlich die erfindungsgemäße Verbindung anstelle der Matrixoberfläche von den Ausdünstungen der Kunststoffbestandteile angegriffen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße wässrige Lösung ergänzend eine Verbindung, die das Wachstum von Mikroorganismen verhindert. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Natriumazid, Thiomersal, Phenol, Benzylalkohol und/oder Kresol.
Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung findet bevorzugt ≥1 Sekunde bis <60 Minuten statt. Prinzipiell ist die Dauer der Behandlung nicht nach oben begrenzt, jedoch hat sich bei den meisten Anwendungen herausgestellt, dass eine Behandlung von länger als 5 Minuten, keine wesentlich verbesserte Bindefähigkeit hervorruft. Somit ist die bevorzugte Behandlungsdauer von 1 min, 2 min, 3 min, 4 min bis hin zu 5 Minuten.
Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen wässrigen Lösung findet weiterhin bevorzugt bei einer Temperatur von ≥5°C bis <45°C statt, wobei Temperaturen von 200C, 21 °C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C oder 300C bevorzugt sind. Prinzipiell ist der Temperaturbereich nicht nach oben oder unten begrenzt, jedoch sind Temperaturen bis 45°C aus Handhabbarkeitsgründen bevorzugt.
Weiterhin beträgt der pH der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung bevorzugt ≥4,5 bis <9,5, besonders bevorzugt ≥6 bis <8 und ganz besonders bevorzugt bei etwa 7. D.h. der pH der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung ist am meisten bevorzugt im Wesentlichen neutral.
Weiterhin liegt die erfindungsgemäße wässrige Lösung bevorzugt in einer Konzentration von ≥0,5 bis ≤20%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von ≥1 bis <10% und ganz besonders bevorzugt in einer Konzentration von ≥1 bis <5% vor.
Die vorgenannten sowie die beanspruchten und in den Ausführungsbeispielen beschriebenen erfindungsgemäß zu verwendenden Komponenten unterliegen in ihrer Größe, Formgestaltung, Materialauswahl und technischen Konzeption keinen besonderen Ausnahmebedingungen, so dass die in dem Anwendungsgebiet bekannten Auswahlkriterien uneingeschränkt Anwendung finden können.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile des Gegenstandes der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung, den zugehörigen Figuren und Ausführungsbeispielen, in denen - exemplarisch - mehrere Ausführungs- sowie Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung dargestellt sind. Fig. 1 zeigt den Versuchsaufbau zur Induktion der Membranalterung.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich Plasmid DNA von Silikamembranen, die erfindungsgemäß vorbehandelt wurden, bzw.
Vergleichsbeispiele.
Fig. 3 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich Plasmid DNA von Silikamembranen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Sorbitol oder SDS vorbehandelt wurde, bzw. Vergleichsbeispiele.
Fig. 4 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich RNA von Silikamembranen, die erfindungsgemäß vorbehandelt wurden, bzw. Vergleichsbeispiele.
Fig. 5 zeigt ein Diagramm der Bindefähigkeit bezüglich RNA von Silikamembranen, die mit verschiedenen Konzentrationen von Sorbitol oder SDS vorbehandelt wurde, bzw. Vergleichsbeispiele.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert, soll aber nicht auf diese beschränkt werden.
Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
Beispiel 1 :
Silikamembranscheiben (GF51 , Fa. PaII) wurden ausgestanzt und jeweils in einer wässrigen Lösung der entsprechenden Substanz getränkt. Die entsprechenden (verwendeten) Substanzen werden im Folgenden genannt. Die Tränkung erfolgte für 5 Minuten bei Raumtemperatur, d.h. bei ca. 200C. Anschließend wurden die Membranscheiben kurz getrocknet und bei 500C in Gegenwart einer größeren Anzahl von Fritten (Vyon F, Polyethylen; Fa. Kopp) inkubiert. Durch die Inkubation wurde die Alterung der Membranscheiben induziert. Die Inkubation erfolgte für 7 Tage (Fig. 2 und Fig. 4) bzw. 3 Wochen (Fig. 3 und Fig. 5). Der Versuchsaufbau hierzu ist in Fig. 1 dargestellt. Ein geschlossenes Becherglas (1 ) wird mit einer großen Anzahl von Fritten gefüllt (3). Auf die Fritten werden dann offene Aluschiffchen, in denen sich die behandelten Membranenscheiben befinden (2), gelegt.
Die Membranscheiben wurden dann direkt vor dem Test (auf Bindefähigkeit) in Mini Spinsäulen assembliert (Aufbau von unten nach oben: Fritte / 1 x Membran GF51 / Spannring).
Für die DNA Testung wurden 10 μg pUC21 Plasmid in 500 μl Puffer PB (QIAGEN) gelöst, auf die Säule gebracht und durch die Membran zentrifugiert. Anschließend wurde mit 700 μl Puffer PE (QIAGEN) gewaschen, trocken zentrifugiert und mit 200 ml Puffer EB (QIAGEN) eluiert. Die Eluate wurden photometrisch bei 260 nm vermessen.
Die „Wiederfindungsrate" der Silikamembranen ist in Tabelle 1 und Fig. 2 zu sehen. Dabei ist jeweils die Bindefähigkeit einer neuen, einer unbehandelten und einer mit Sorbitol, NaCI, SDS oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) vorbehandelten Membranscheibe gezeigt.
Tabelle 1 : Vergleich verschiedener Chemikalien im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von Plasmid DNA
MW = Mittelwert
Als Ergebnis ist festzustellen, dass die unbehandelten Membranen stark hydrophob waren und ihre Bindefähigkeit nahezu verloren haben. Auch die Behandlung mit NaCI oder dem kationischen Detergens CTAB brachte keine Verbesserung.
Membranen, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit Sorbitol und/oder SDS vorbehandelt wurden, haben überraschenderweise ihre Bindefähigkeit behalten und zeigen keinen Alterungseffekt.
In separaten Experimenten (in Fig. 2 nicht gezeigt) wurden zudem PEG 600 und PEG 4000 getestet. Bei beiden Substanzen blieben die Membranen zwar im Gegensatz zu unbehandelten Membranen hydrophil, zeigten aber dennoch keine verbesserte Bindefähigkeit nach der Lagerung.
Die Bindefähigkeit von mit unterschiedlichen Konzentrationen (1%, 5% oder 10%) an Sorbitol oder SDS vorbehandelten Silikamembranen ist in Tabelle 2 und Fig. 3 zu sehen. Tabelle 2: Vergleich verschiedener Konzentrationen an SDS und Sorbitol im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von Plasmid DNA
MW = Mittelwert
Als Ergebnis ist festzustellen, dass die unbehandelten bzw. in Wasser getränkten Membranscheiben ihre Bindefähigkeit nahezu vollständig verloren haben. Im Gegensatz dazu lagen alle mit Sorbitol oder SDS getränkte Membranen im Bereich der nicht gelagerten Referenz.
Beispiel 2:
Die Silikamembranscheiben wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben vorbehandelt und in die Mini Spinsäulen assembliert.
Für den Test wurden pro Präparation 5 x 105 HeLa-Zellen in 350 μl RLT Puffer homogenisiert, mit demselben Volumen 70%-igem Ethanol gemischt, auf die vorbereiteten Spinsäulen aufgebracht und durch die Membranen zentrifugiert. Die Spinsäulen wurden entsprechend der normalen RNeasy-Prozedur aufgearbeitet (QIAGEN RNeasy Mini Handbuch; Protokoll: Purification of Total RNA from Animal CeIIs Using Spin Technology). Die Elution erfolgte in 30 μl RNase-freiem Wasser. Die Eluate wurden photometrisch bei 260 nm vermessen.
Die „Wiederfindungsrate" der Silikamembranen ist in Tabelle 3 und Fig. 4 zu sehen. Dabei ist jeweils die RNA-Bindefähigkeit einer normalen RNeasy Säule (QIAGEN), einer neuen, einer unbehandelten und einer mit Sorbitol, NaCI, SDS oder Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) vorbehandelten Silikamembran gezeigt.
Tabelle 3: Vergleich verschiedener Chemikalien im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von RNA
MW = Mittelwert; RNy Std. Spin = normale RNeasy Säule (2 Membranlagen)
Überraschenderweise zeigten wie in Beispiel 1 auch hier die gemäß der vorliegenden Erfindung mit SDS und/oder Sorbitol behandelten Membranen keinerlei Alterungseffekt.
Die Behandlung mit NaCI zeigte dagegen keine signifikante Verbesserung, und die Behandlung mit CTAB führte sogar zu einer signifikanten Ausbeuteverschlechterung. Die RNA-Bindefähigkeit von mit unterschiedlichen Konzentrationen (1 %, 5% oder 10%) an Sorbitol oder SDS vorbehandelten Silikamembranen ist in Tabelle 4 und Fig. 5 zu sehen.
Tabelle 4: Vergleich verschiedener Konzentrationen an SDS und Sorbitol im Hinblick auf ihre Wirksamkeit beim Schutz von Silikamembranen gegen Alterung bei der Bindung von RNA
MW = Mittelwert
Alle gemäß der vorliegenden Erfindung mit Sorbitol und/oder SDS getränkten Membranen lagen im Bereich der nicht gelagerten Referenzmembran.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Schutz von Membranen durch Behandlung mit einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile
Verbindung.
2. Verwendung einer wässrigen Lösung enthaltend mindestens eine wasserlösliche, nukleophile Verbindung zum Schutz von Membranen.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein negativ geladenes Detergens ist und/oder mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen aufweist.
4. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die OH-Gruppen alkoholische OH-Gruppen sind.
5. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen für die Immobilisierung von Nukleinsäuren verwendet werden.
6. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein
Imprägnierungsverfahren und/oder die Verwendung eine Verwendung zur Imprägnierung ist.
7. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren und/oder die
Verwendung nach der Behandlung mit der wässrigen Lösung einen Trocknungsschritt umfasst.
8. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung ein Feststoff ist.
9. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH-Gruppen ein Zuckeralkohol ist.
10. Verfahren und/oder Verwendung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche, nukleophile Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH- Gruppen ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Sorbitol, Xylitol, Lactitol, Threit, Erythrit, Mannitol, Isomalt, Inosit, Palmitat und/oder Citrat oder einer Mischung daraus.
1 1. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das negativ geladene Detergenz ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Fettalkoholsulfate, insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS), und/oder
Alkylbenzolsulfonsäuren und/oder -sulfonate, insbesondere
Natriumdodecylbenzolsulfonat, Benzolsulfonsäure, Dodecylbenzolsulfonat, Ammoniumdodecylbenzolsulfonat, und/oder N-Lauroylsarcosin oder einer Mischung daraus.
12. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung mindestens eine Mischung aus mindestens einem negativ geladenen Detergens und mindestens einer wasserlöslichen, nukleophilen Verbindung aufweisend mindestens ein Molekül aufweisend mindestens zwei OH- Gruppen enthält.
13. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung ergänzend eine Verbindung, die das Wachstum von Mikroorganismen verhindert, enthält.
14. Verfahren und/oder Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die zusätzliche Verbindung ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend Natriumazid, Thiomersal, Phenol, Benzylalkohol und/oder Kresol.
15. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung von ≥ 1 Sekunde bis <60 Minuten erfolgt.
16. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei einer Temperatur von ≥5°C bis <45°C stattfindet.
17. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung bei einem pH von ≥4,5 bis <9,5 erfolgt.
18. Verfahren und/oder Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung in einer
Konzentration von ≥0,5 bis <20% vorliegt.
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