EP2406392A1 - Quantifizierung von nukleinsäuren - Google Patents

Quantifizierung von nukleinsäuren

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Publication number
EP2406392A1
EP2406392A1 EP10707901A EP10707901A EP2406392A1 EP 2406392 A1 EP2406392 A1 EP 2406392A1 EP 10707901 A EP10707901 A EP 10707901A EP 10707901 A EP10707901 A EP 10707901A EP 2406392 A1 EP2406392 A1 EP 2406392A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
quantified
oligonucleotide probe
sequence
nucleic acid
nucleic acids
Prior art date
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Ceased
Application number
EP10707901A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nan Fang
Andreas Missel
Dirk Löffert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qiagen GmbH
Original Assignee
Qiagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen GmbH filed Critical Qiagen GmbH
Publication of EP2406392A1 publication Critical patent/EP2406392A1/de
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology and chemistry, in particular molecular biology.
  • the invention relates to the quantification of nucleic acids by means of oligonucleotide probes and gene expression analysis, in particular by means of polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Quantification of nucleic acids plays an important role in many molecular biology applications, particularly in gene expression analysis. Gene expression analyzes are used primarily in the fields of basic research, drug research and molecular diagnostics.
  • nucleic acid quantification methods the concentrations and / or relative or absolute amounts of particular nucleic acids in samples are usually determined. In the gene expression analysis, especially the amounts of mRNA and / or cDNA in biological samples are relevant. Northern blot, RNase protection assays, competitive reverse transcription PCR, quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR), microarrays, and high-throughput sequencing techniques. Quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR) is most commonly used because of its high specificity, sensitivity, reproducibility and speed. However, the results are influenced by various critical factors, such as the starting amount and integrity of the mRNA, as well as the effectiveness of reverse transcriptase and polymerase.
  • the present invention relates to a quantification method for nucleic acids, which can be used in particular for gene expression analysis.
  • a quantification method for nucleic acids which can be used in particular for gene expression analysis.
  • both the amount and quality of the nucleic acids used and the effectiveness of the subsequent enzyme reactions can be taken into account.
  • the method according to the invention can also be used for normalization in the quantification of specific nucleic acids.
  • an exogenous oligonucleotide probe is added to a sample which contains the nucleic acid (s) to be quantified.
  • This exogenous oligonucleotide probe comprises a nucleic acid sequence which is not present in the sample but can specifically bind to the nucleic acid (s) to be quantified.
  • the hybridized oligonucleotide probe is elongated (extended) by means of a polymerase, wherein the nucleic acid to be quantified, to which the probe is hybridized, acts as a template.
  • the oligonucleotide probes may also contain further sequences in addition to the sequences used for hybridization to the nucleic acid (s) to be quantified ("hybridization sequence") .Such additional sequences may be, for example, quantification of the elongated probes in a PCR reaction ("Tag Sequence").
  • the tag sequence is preferably located 5 'to the hybridization sequence.
  • the present invention therefore relates to a method for quantifying one or more nucleic acids in a sample, comprising the following steps:
  • oligonucleotide probe comprises a sequence which can hybridize specifically to the nucleic acid to be quantified or to a common sequence of the nucleic acids to be quantified
  • Quantification of the hybridized oligonucleotide probes as a measure of the amount of nucleic acid (s) to be quantified.
  • extension takes place by means of a polymerase, i. the sample is incubated with a polymerase under conditions allowing extension of hybridized probes.
  • the extension of hybridized probes takes place by means of a polymerase.
  • the probes which have hybridized to another nucleic acid and have been elongated are quantified. They are therefore a measure of the amount of nucleic acid to be quantified.
  • the sequence of the probe is at least 85%, 90% and most preferably more than 95% complementary to a sequence on the nucleic acid (s) to be quantified.
  • the unhybridized or non-elongated probes are removed from the sample prior to quantification of the hybridized oligonucleotide probes. This can be achieved, for example, by enzymatic see reactions (eg, nuclease degradation), chemical reactions, heat or physical processes, such as chromatographic or electrophoretic methods take place.
  • the removal of the unhybridized probes preferably takes place by means of a nuclea se which can specifically degrade single-stranded nucleic acids.
  • the nuclease is preferably an exonuclease.
  • the exonuclease is preferably selected from the group of exonuclease I, Sl nuclease, lambda exonuclease and exonuclease VII.
  • Oligonucleotides are oligoterries composed of a few nucleotides, ie they are short, preferably single-stranded, nucleic acids.
  • the oligonucleotides have a length of 10-200 nucleotides, preferably 30-100 nucleotides, preferably 70-90 nucleotides.
  • the oligonucleotide probe is a single-stranded oligonucleotide. It is preferably selected from the group of DNA, RNA, PNA and LNA. In any case, the oligonucleotide probe must be a nucleic acid that can be extended to be complementary to the template. Preferably, the oligonucleotide probe is a DNA oligonucleotide.
  • the oligonucleotide probe may also contain modified nucleobases and / or modified linkers.
  • At least two nucleic acids are quantified and the quantified amounts of at least two nucleic acids are related to one another. This can e.g. by using different oligonucleotide probes containing different hybridization sequences and tag sequences.
  • the nucleic acid (s) to be quantified are / are preferably RNA (s) or DNA (s).
  • the nucleic acid (s) to be quantified may, for example, be a nucleic acid (1) selected from the group of cDNA (complementary DNA), LNA (locked nucleic acid), mRNA (mRNA), mtRNA (mitochondrial RNA), rRNA (ribosomal RNA), tRNA (transfer RNA), nRNA (nuclear RNA), siRNA (short interfering RNA), snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA), scaRNA (Small Cajal Body-specific RNA), microRNA, dsRNA (double-stranded RNA), ribozymes, riboswitches, viral RNA, dsDNA (double-stranded DNA), ssDNA (single-stranded DNA), plasmid DNA, cosmid DNA, chromoso
  • the nucleic acid (s) to be quantified are / are mRNA (s) or cDNA (s).
  • the common sequence of the nucleic acid (s) to be quantified may be e.g. be a poly-A sequence, e.g. the Poyl A tail of mRNA.
  • the common sequence is preferably poly-dT.
  • nucleic acid (s) to be quantified is / are mRNA and the common sequence is a poly A sequence.
  • nucleic acid (s) to be quantified is cDNA and the common sequence is a poly-dT sequence.
  • the oligonucleotide probe In order to be able to hybridize to poly-A or poly-dT sequences, the oligonucleotide probe must contain a poly-T or poly-dT or poly-A or poly-dA sequence.
  • the oligonucleotide probe contain a poly-T or poly-dT sequence.
  • the oligonucleotide probe contain a poly A or poly d A sequence.
  • the poly-dT, poly-T, poly-dA or poly-A sequences are preferably located at the 3 'end of the oligonucleotide probe.
  • the poly-dT, poly-T, poly-dA, or poly-I sequences are between 8 and 10 nucleotides in length, more preferably between 10 and 20.
  • the oligonucleotide probe contains a tag sequence.
  • Particularly preferred tag sequences are sequences that are not Have homology in eukaryotic genomes.
  • the quantification of the hybridized oligonucleotide probe is preferably carried out by means of quantitative PCR.
  • the quantification of the tag sequence was carried out by quantitative PCR.
  • the oligonucleotide probe can serve as a primer for reverse transcription of mRNA to cDNA in an RT-PCR.
  • the resulting cDNA can be quantified by quantitative PCR (qPCR).
  • the quantification of the hybridized probe can take place directly via a qPCR.
  • the DNA polymerase used during the quantitative (real-time) PCR is preferably a polymerase from a thermophilic organism or is a thermostable polymerase or is a polymerase selected from the group of Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase , Thermus acquaticus (Taq) DNA polymerase, Thermotoga marimima (Tma) DNA polymerase, Thermococcus litoralis (TIi) DNA polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo) DNA polymerase, Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA polymerase, Thermus filiformis (Tfi) DNA polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA polymerase, Thermus pacificus (Tpac) DNA polymerase, Thermus eggertsonii (Teg) DNA polymerase
  • RNA for example mRNA
  • the RNA has to be reverse transcribed in DNA.
  • an enzyme with reverse transcriptase activity may be, for example, reverse transcriptases from viruses, bacteria, Archae bacteria and eukaryotes, in particular from thermostable organisms. These include, for example, enzymes from introns, retrotransposons or retroviruses.
  • an enzyme with reverse transcriptase activity is an enzyme which is able to incorporate deoxyribonucleotides complementary to ribonucleic acid at the 3 'end of a deoxyoligonucleotide or ribo-oligonucleotide hybridized to the ribonucleic acid hybridase under suitable buffer conditions.
  • the enzyme having reverse transcriptase activity is an enzyme selected from the group consisting of HIV reverse transcriptase, M-MLV reverse transcriptase, EAIV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase, Thermite thermophilus DNA polymerase I, M-MLV RNAse H, Superscript, Superscript II, Superscript III, Monsterscript (Epicenter), Omniscript, Sensiscript Reverse Transcriptase (Qiagen), TheraioScript and Thermo-X (both Invitrogen).
  • enzymes which have reverse transcriptase activity as enzyme only after a modification of the gene sequence.
  • a reverse transcriptase activity which has an increased error accuracy.
  • here is e.g. AccuScript reverse transcriptase (Stratagene) mentioned. It will be apparent to those skilled in the art that the use of mixtures of two or more enzymes with reverse transcriptase activity is also possible.
  • a divalent ion is present in those enzymes which require a divalent ion.
  • Preferred are Mg 2+ , Mn 2+ .
  • Preferred combinations of enzymes are HIV reverse transcriptase or M-MLV reverse transcriptase or EAIV reverse transcriptase or AMV reverse transcriptase or Thennus thermophilus DNA polymerase I or M-MLV RNAse H, Superscript, Superscript II, Superscript III or Monsterscript (Epicenter) or Omniscript reverse Transcriptase (Qiagen) or Sensiscript reverse transcriptase (Qiagen), ThermoScript, Thermo-X (both Invitrogen) or a mixture of two or more enzymes with reverse transcriptase activity and poly (A) -PoI ymerase from Escherichia coli.
  • Fluorescence-labeled primers and / or probes can be used in the quantitative (real-time) PCR, eg LightCycler probes (Roche), TaqMan probes (Roche), Molecular heacons, Scorpion primers, Sunrise primers, LUX primers or Amplifluor primers.
  • probes and / or primers can be covalently or non-covalently bound fluorescent dyes such as fluorescein isothiocyanates (FITC), 6-carboxyfluorescein (FAM), xanthene, rhodamines,, 6-carboxy-2 ', 4', 7 ', 4,7- hexachlorofluorescein (HEX), 6-carboxy-4 ', 5'-dichloro-2 ⁇ 7'-dimethylyfluorescein (JOE), N, N, N ⁇ N'-tetramethyl-6-carboxy rhodamate (TAMRA), 6-carboxy-X -rhodamine (ROX), 5-carboxyhodamine-6G (R6G5), 6-carboxyrhodamine-6G (RG6), Rhodamine 110; Coumarins such as umbelliferones, benzimides such as Hoechst 33258; Phenanthridines such as Texas Red,
  • amplification methods may also be used; these may be selected from the group comprising the rolling circle amplification (as described in Liu, et al., Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594 (1996)), the “isothermal amplification” (as described in Walker, et al., “Strand displacement amplification ⁇ at isothermal, in vitro DNA amplification technique, "Nucleic Acids Res.
  • rolling circle amplification as described in Liu, et al., Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNA polymerases, J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594 (1996)
  • the “isothermal amplification” as described in Walker, et al., "Strand displacement amplification ⁇ at isothermal, in vitro DNA amplification technique, "Nucleic Acids
  • the invention also relates to a kit for nucleic acid quantification, comprising: at least one nuclease, preferably exonuclease, optionally dNTPs (preferably as a solution of a mixture of dCTP, dATP, dGTP and dTTP (eg in each case 5 mM, "dNTP Mix”),
  • a buffer solution or a buffer stock solution optionally a buffer solution or a buffer stock solution
  • oligonucleotide probe optionally a reverse transcriptase, an oligonucleotide probe, wherein the oligonucleotide probe comprises a tag sequence and a sequence which can hybridize specifically to the nucleic acid to be quantified or to a common sequence of the nucleic acids to be quantified,
  • Primer and / or a second oligonucleotide probe capable of hybridizing to the tag sequence.
  • kits and methods of the invention can be used to analyze gene expression in a biological sample.
  • SEQ ID NO: 2 AmpliF, forward primer for the amplification of oligoamp
  • SEQ ID NO: 3 AmpliR, reverse primer for amplification of oligoamp
  • FIG. 1a Quantification of the oligoAmp oligos by qPCR, after reverse transcription and exol digestion. Amplification plot.
  • FIG. 1b Quantification of the oligoAmp oligos by qPCR, after reverse transcription and exol digestion. Diagram Ct values against RNA levels in RT.
  • FIG. 2 Quantification of the oligoAmp oligos by qPCR, after reverse transcription, without exol digestion. Amplification plot.
  • Fig. 3a Quantification of the endogenous TBP gene by qPCR, after reverse transcription and exol digestion. Amplification plot.
  • FIG. 3b Quantification of the endogenous TBP gene by qPCR, after reverse transcription and exol digestion. Diagram Ct values against RNA levels in RT Examples
  • Reverse transcriptase reactions were performed using the omniscript (Qiagen) according to the manufacturer's instructions.
  • the reverse transcriptase reactions contained the following components: total RNA of Ramos human Burkitt's lymphoma cells as template (1 ⁇ g, 500 ng, 250ng, 125 ng and 0 ng); Oligonucleotides oligoAmp (0.1 nM final concentration) with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 as a reverse transcriptase primer; Reverse transcriptase omniscript; dNTPs, RNase inhibitor; Reverse transcriptase buffer and RNase-free water.
  • the sequence of OligoAmp comes from the potato genome and has no homologue in the human genome.
  • Table 3 Quantification of the endogenous TBP gene by qPCR, after reverse transcription and exol digestion. Summary of Ct values.
  • Exonuk ⁇ ease I treated reverse transcription products were used as template in the SyBr green-based qPCR (QuantiFast SyBr Green, Qiagen). TBP specific cDNA primers were used for amplification in the qPCR.
  • the available data show that the quantification method can be used in the normalization strategy by means of mRNA-binding, nuclease-resistant exogenous oligonucleotides in order to check the starting mRNA quantity as well as the efficiency of the reverse transcription and the PCR.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Quantifizierung von einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einer Probe. Das Verfahren umfasst dabei die Schritte Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens eine zu quantifizierende Nukleinsäure, Zugabe einer Oligonukleotidsonde zur Probe, wobei die Oligonukleotidsonde eine Sequenz umfasst, die spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure bzw. an eine gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäuren hybridisieren kann, Inkubation unter Bedingungen, die das Hybridisieren der Oligonukleotidsonde an die zu quantifizierende Nukleinsäure(n) erlauben, Inkubation der Probe unter Bedingungen, die die Verlängerung von hybridisierten Sonden erlauben, wobei jeweils die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) als Template dienen, Entfernung der nicht-hybridisierten Sonden aus der Probe und Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonden als Maß für die Menge der zu quantifizierenden Nukleinsäure(n). Die Erfindung betrifft auch einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Quantifizierung von Nukleinsäuren
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Biologie und Chemie, insbesondere der Molekularbiologie. Im Einzelnen betrifft die Erfindung die Quantifizierung von Nukleinsäuren mittels Oligonukleotidsonden und die Genexpressionsanalyse, insbesondere mittels Polymer asekettenreaktion (PCR).
Hintergrund der Erfindung
Die Quantifizierung von Nukleinsäuren spielt eine wichtige Rolle in vielen molekularbiologischen Anwendungen, insbesondere in der Genexpressionsanalyse. Genexpressions- analysen werden vor allem auf den Gebieten der Grundlagenforschung, der Pharmaforschung und der molekularen Diagnostik eingesetzt.
hi Nukleinsäurequantifizierungs- Verfahren werden gewöhnlich die Konzentrationen und/oder relativen oder absoluten Mengen von bestimmten Nukleinsäuren in Proben bestimmt. In der Genexpressionsanalyse sind vor allem die Mengen von mRNA und/oder cDNA in biologischen Proben relevant. Northern Blot, RNase-Schutzassays, kompetitive reverse Transkriptions-PCR, quantitative reverse Transkriptions-PCR (qRT-PCR), Microarrays sowie Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren. Die quantitative reverse Transkriptase-PCR (qRT- PCR) wird auf Grund ihrer hohen Spezifizität, Sensitivität, Reproduzierbarkeit und Geschwindigkeit am häufigsten eingesetzt. Allerdings werden die Ergebnisse durch verschiedene kritische Faktoren durch die Startmenge und die Integrität der mRNA sowie die Effektivität der reversen Transkriptase und der Polymerase beeinflusst. Um die Vergleichbarkeit der Genexpressionsanalysen in verschiedenen Proben zu gewährleisten, ist es notwendig eine Normalisierung der bestimmten Mengen vorzunehmen. Verbreitete Normalisierungsstrategien beruhen auf der Expressionsanalyse von sogenannten Haushaltsgenen. Dabei geht man davon aus, dass die Expression der Haushaltsgene sich in verschiedenen Proben nicht unterscheidet. Diese Annahme ist jedoch nicht zutreffend. Andere Normalisierungsverfaiiren beruhen auf der Bestimmung der Gesamt-RNA in der Probe, der Probengröße (Zellzahl oder Gewebevolumen) oder auf eingebrachter Frernd-RNA. All diese Ansätze haben jedoch ihre Nachteile. Ribosomale RNA macht zum Beispiel einen Großteil der Gesamt-RNA in einer Zelle aus. Daher ist die Gesamt-RNA-Menge nicht immer repräsentativ für die Gesamt mRNA-Menge. Normalisierungsverfahren basierend auf der Zellzahl oder Gewebevolumen berücksichtigen nicht, dass verschiedene Zellen verschiedene Transkriptionsaktivitäten aufweisen können. Außerdem berücksichtigen diese Verfahren nicht die mRN A- Qualität und die Effektivität der reversen Transkriptase sowie der Polymerase. In die Probe eingebrachte Fremd-RNA berücksichtigt zwar die Enzymeffektivität während der reversen Transkriptions-PCR, jedoch nicht die Menge und Qualität der anfänglichen mRN A in der Probe.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Quantifizierungsverfahren für Nukleinsäuren, welches insbesondere zur Genexpressionsanalyse genutzt werden kann. In dem erfindungsgemäßen Quantifizierungsverfahren können sowohl die Menge und Qualität der eingesetzten Nukleinsäuren, als auch die Effektivität der nachfolgenden Enzymreaktionen berücksichtigt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Normalisierung in der Quantifizierung von bestimmten Nukleinsäuren eingesetzt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine exogene Oligonukleotidsonde zu einer Probe gegeben, die die zu quantifizierenden Nukleinsäure(n) enthält. Diese exogene Oligonukleotidsonde umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die in der Probe nicht vorhanden ist, aber spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure(n) binden kann. Die hybridisierte Oligonukleotidsonde wird mittels einer Polymerase elongiert (verlängert), wobei die zu quantifizierende Nukleinsäure, an die die Sonde hybridisiert ist, als Template fungiert. Nach Hybridisierung und Verlängerung der Sonde werden die ursprünglich nicht hybridisierten und daher nicht elongierten Sonden aus der Probe entfernt, so dass nur noch diejenigen Sonden in der Probe verbleiben, die an die zu quantifizierende Nukleinsäure(n) hybridisierten und daher verlängert wurden. Die Oligonukleotidsonden können neben der zur Hybridisierung an die zu quantifizierende Nukleinsäure(n) dienenden Sequenzen („Hybridisierungssequenz") auch weitere Sequenzen enthalten. Solche zusätzlichen Sequenzen können z.B. der Quantifizierung der elongierten Sonden in einer PCR-Reaktion dienen („Tag-Sequenz"). Die Tag-Sequenz befindet sich vorzugsweise 5' von der Hybridisierungssequenz.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Quantifizierung einer oder mehre- rer Nukleinsäuren in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens eine zu quantifizierende Nukleinsäure,
Zugabe einer Oligonukleotidsonde zur Probe, wobei die Oligonukleotidsonde eine Sequenz umfasst, die spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure bzw. an eine gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäuren hybridisieren kann,
Inkubation unter Bedingungen, die das Hybridisieren der Oligonukleotidsonde an die zu quantifizierenden Nukleinsäure(n) erlauben,
Inkubation der Probe unter Bedingungen, die die Verlängerung von hybridisierten Sonden erlauben, wobei jeweils die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) als Template dienen,
Entfernung der nicht-hybridisierten Sonden aus der Probe,
Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonden als Maß für die Menge der zu quantifizierenden Nukleinsäure(n).
Vorzugsweise findet die Verlängerung mittels einer Polymerase statt, d.h. die Probe wird mit einer Polymerase unter Bedingungen inkubiert, die die Verlängerung von hybridisierten Sonden erlauben. Vorzugsweise findet also die Verlängerung von hybridisierten Sonden mittels einer Polymerase stattfindet.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden nur die Sonden quantifiziert, die an eine andere Nukleinsäure hybridisiert haben und entsprechend elongiert wurden. Sie sind also ein Maß für die Menge an zu quantifizierenden Nukleinsäure. Je nach Sequenz der Sonde, werden nur ganz bestimmte Nukleinsäuren oder ganze Gruppen von Nukleinsäuren, die eine im Wesentlichen entsprechend zur Sonde komplementäre Sequenz enthalten, quantifiziert. Bevorzugt ist die Sequenz der Sonde zu mindestens 85%, 90% und am meisten bevorzugt über 95% komplementär zu einer Sequenz auf der bzw. den zu quantifizierenden Nukleinsäure(n)
Die nicht-hybridisierten bzw. nicht elongierten Sonden werden vor der Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonden aus der Probe entfernt. Dies kann etwa durch enzymati- sehe Reaktionen (z.B. Nukleaseabbau), chemische Reaktionen, Hitze oder physikalische Prozesse, z.B. chromatographische oder elektrophoretische Verfahren, stattfinden.
Vorzugsweise geschieht die Entfernung der nicht-hybridisierten Sonden mittels einer Nuclea- se, die spezifisch einzelsträngige Nukleinsäuren abbauen kann. Die Nuclease ist vorzugsweise eine Exonuclease. Die Exonuclease ist vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe von Exo- nuclease I, Sl Nuclease, Lambda Exonuclease und Exonuclease VII.
Oligonukleotide sind aus wenigen Nukleotiden aufgebaute Oligornere, sind also kurze, vor- zugsweise einzelsträngige Nukleinsäuren. Vorzugsweise haben die Oligonukleotide eine Länge von 10-200 Nukleotiden, vorzugsweise 30-100 Nukleotiden, bevorzugt 70-90 Nukleotiden.
Die Oligonukleotidsonde ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid. Es ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe von DNA, RNA, PNA und LNA. In jedem Fall muss die Oligonukleo- tidsonde eine Nukleinsäure sein, die komplementär zum Template verlängert werden kann. Vorzugsweise ist die Oligonukleotidsonde ein DNA-Oligonukleotid.
Die Oligonukleotidsonde kann auch modifizierte Nukleobasen und/oder modifizierte Linker enthalten.
In einer besonderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden mindestens zwei Nukleinsäuren quantifiziert und die quantifizierten Mengen mindestens zweier Nukleinsäuren miteinander ins Verhältnis gesetzt. Dies kann z.B. durch die Verwendung verschiedener Oligonukleotidsonden geschehen, die unterschiedliche Hybridisierungssequenzen und Tag-Sequenzen enthalten.
Die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) ist/sind vorzugsweise RNA(s) oder DNA(s). Die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) kann/können z.B. eine Nukleinsäure^) ausgewählt aus der Gruppe von cDNA (complementary DNA), LNA (locked nucleic aeid), mRNA (mes- senger RNA), mtRNA (mitochondriale RNA), rRNA (ribosomale RNA), tRNA (transfer- RNA), nRNA (nucleäre RNA), siRNA (short interfering RNA), snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA), scaRNA (Small Cajal Body-spezifische RNA), microRNA, dsRNA (doppelsträngige RNA), Ribozyme, Riboswitche, virale RNA, dsDNA (doppelsträn- gige DNA), ssDNA (einzelsträngige DNA), Plasmid-DNA, Cosmid-DNA, chromosomale DNA, virale DNA, mtDNA (mitochondriale DNA), nDNA (nucleäre DNA)3 snDNA (small nuclear DNA) sein. Die zu quantifizierende Nukleinsäure(n) kann auch die Gesamtheit einer Gruppe von Nukleinsäuren sein, vorzugsweise die Gesamtheit von mRNA in der Probe („Ge- samt-mRNA") oder die Gesamtheit von cDNA in der Probe („Gesamt-cDNA").
In einer bevorzugten Ausfulirungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist/sind die zu quantiflzierende(n) Nukleinsäure(n) mRNA(s) oder cDNA(s).
Die gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäure(n) kann z.B. eine PoIy-A- Sequenz sein, z.B. der Poyl-A-Schwanz von mRNA. Im Falle von cDNA ist die gemeinsame Sequenz vorzugsweise Poly-dT.
Es ist besonders bevorzugt, dass die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) mRNA ist/sind und die gemeinsame Sequenz eine poly-A-Sequenz ist.
Weiterhin ist bevorzugt, dass die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) cDNA ist/sind und die gemeinsame Sequenz eine poly-dT-Sequenz ist.
Um an PoIy-A- bzw. Poly-dT-Sequenzen hybridisieren zu können, muss die Oligonukleotid- sonde eine PoIy-T- oder Poly-dT- bzw. poly-A- oder poly-dA-Sequenz enthalten.
Daher ist es in einer Ausführungsform bevorzugt, dass die Oligonukleotidsonde eine poly-T- oder poly-dT-Sequenz enthält.
In einer anderen Ausführungsfoπn ist es bevorzugt, dass die Oligonukleotidsonde eine poly- A- oder poly-d A- Sequenz enthält.
Die poly-dT-, poly-T-, poly-dA- bzw. poly-A-Sequenzen befinden sich vorzugsweise am 3'- Ende der Oligonukleotidsonde. Vorzugsweise sind die poly-dT-, poly-T-, poly-dA- bzw. po- Iy-A- Sequenzen zwischen 8und lOONuHeotiden lang, besonders bevorzugt zwischen 10 und 20.
Wie oben beschrieben, enthält die Oligonukleotidsonde in einer bevorzugten Ausführungsform eine Tag-Sequenz. Besonders bevorzugte Tag-Sequenzen sind Sequenzen, die keine Homologie in eukaryotischen Genomen haben.
Die Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonde wird vorzugsweise mittels quantitativer PCR durchgeführt. Dafür wird z.B. die Quantifizierung der Tag-Sequenz mittels quantitativer PCR durchgeführt.
Die Oligonukleotidsonde kann als Primer für die reverse Transkription von mRNA zu cDNA in einer RT-PCR dienen. Die so entstandene cDNA kann mittels quantitativer PCR (qPCR) quantifiziert werden.
Wenn die zu quantifizierende Nukleinsäure eine DNA ist, kann die Quantifizierung der hybridisierten Sonde direkt über eine qPCR stattfinden.
Die DNA-Polymerase, die während der quantitativen (real-time) PCR verwendet wird, ist vorzugsweise eine Polymerase aus einem thermophilen Organismus oder ist eine thermo stabile Polymerase oder ist eine Polymerase ausgwqählt aus der Gruppe von Thermus thermophi- lus (Tth) DNA Polymerase, Thermus acquaticus (Taq) DNA Polymerase, Thermotoga mari- tima (Tma) DNA Polymerase, Thermococcus litoralis (TIi) DNA Polymerase, Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA Polymerase, Pyrococcus woesei (Pwo) DNA Polymerase, Pyrococcus kodakaraensis KOD DNA Polymerase, Thermus filiformis (Tfi) DNA Polymerase, Sulfolobus solfataricus Dpo4 DNA Polymerase, Thermus pacificus (Tpac) DNA Polymerase, Thermus eggertsonii (Teg) DNA Polymerase, Thermiis brockianus (Tbr) und Thermus flavus (TfI) DNA Polymerase.
Im Falle das RNA, beispielsweise mRNA, quantifiziert werden soll, muss die RNA in DNA revers transkribiert werden. Dies geschieht mit einem Enzym mit Reverser Transkriptase- Aktivität. Solche Enzyme können z.B. Reverse Transkriptasen aus Viren, Bakterien, Archae- Bakterien und Eukaryonten, insbesondere aus thermostabilen Organismen sein. Hierzu zählen z.B. auch Enzyme aus Introns, Retrotransposons oder Retroviren. Ein Enzym mit reverser Transkriptaseaktivität ist erfindungsgemäß ein Enzym, welches in der Lage ist, an einer Ribonukleinsäure am 3 '-Ende eines an die Ribonukleinsäure-hybridisierten Desoxyoligonukleotides oder Ribooligonukleotides bei geeigneten Pufferbedingungen Desoxyribonukleotide komplementär einzubauen. Dies umfasst zum einen Enzyme, die natürlicherweise diese Funktion aufweisen aber auch Enzyme, die eine solche Funktion erst durch Veränderung ihrer Gensequenz wie z.B. Mutagenese oder durch entsprechende Pufferbedingungen erhalten.
Bevorzugt ist das Enzym mit reverser Transkriptaseaktivität ein Enzym, welches ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend HIV reverse Transkriptase, M-MLV reverse Transkriptase, EAIV reverse Transkriptase, AMV reverse Transkriptase, Thermits thermophilus DNA Polymerase I, M-MLV RNAse H, Superscript, Superscript II, Superscript III, Monsterscript (Epicentre), Omniscript, Sensiscript Reverse Transkriptase (Qiagen), TheraioScript und Thermo-X (beide Invitrogen). Erfindungsgemäß können auch Enzyme verwendet werden, die erst nach einer Modifikation der Gensequenz als Enzym reverse Transkriptaseaktivität aufweisen. Es kann auch eine Reverse Transkriptaseaktivität verwendet werden, die eine erhöhte Fehlergenauigkeit aufweist. Beispielhaft sei hier z.B. AccuScript reverse Transcriptase (Stratagene) erwähnt. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass auch die Verwendung von Mischungen von zwei oder mehr Enzymen mit reverser Transkriptaseaktivität möglich ist.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die meisten Enzyme mit reverser Transkriptaseaktivität ein divalentes Ion benötigen. Somit liegt einer bevorzugten Ausfülirungsform bei jenen Enzymen, die ein divalentes Ion benötigen, ein divalentes Ion vor. Bevorzugt sind Mg2+, Mn2+.
Bevorzugte Kombinationen von Enzymen sind HIV reverse Transkriptase oder M-MLV reverse Transkriptase oder EAIV reverse Transkriptase oder AMV reverse Transkriptase oder Thennus thermophilus DNA Polymerase I oder M-MLV RNAse H, Superscript, Superscript II, Superscript III oder Monsterscript (Epicentre) oder Omniscript Reverse Transkriptase (Qiagen) oder Sensiscript Reverse Transkriptase (Qiagen), ThermoScript, Thermo-X (beide Invitrogen) oder eine Mischung von zwei oder mehr Enzymen mit reverser Transkriptaseaktivität und PoIy-(A)-PoI ymerase aus Escherichia coli. Außerdem HIV reverse Transkriptase oder M-MLV reverse Transkriptase oder EAIV reverse Transkriptase oder AMV reverse Transkriptase oder Thermits thermophilus DNA Polymerase I oder M-MLV RNAse H, Superscript, Superscript II, Superscript III oder Monsterscript (Epicentre) oder Omniscript Reverse Transkriptase (Qiagen) oder Sensiscript Reverse Transkriptase (Qiagen), ThermoScript, Thermo-X (beide Invitrogen) oder eine Mischung von zwei oder mehr Enzymen mit reverser Transkriptaseaktivität und Poly-(A)-Polymerase aus Hefe. In der quantitativen (real-time) PCR können fluoreszenzmarkierte Primer und/oder Sonden verwendet werden, z.B. LightCycler-Sonden (Roche), TaqMan Sonden (Roche), Molecular heacons, Scorpion-Primer, Sunrise-Primer, LUX-Primer oder Amplifluor-Primer. Sonden und/oder Primer können z.B. kovalent oder nicht-kovalent gebundene Fluoreszenzfarb Stoffe beispielsweise Fluoresceinisothiocyanate (FITC), 6-Carboxyfluorescein (FAM), Xanthen, Rhodamine, ,6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorofluorescein (HEX), 6-Carboxy-4',5'-dichloro- 2\7'-dimethodyfiuorescein (JOE), N,N,N\N'-Tetramemyl-6-carboxyrhodamme (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamine (ROX), 5-Carboxyrhodamine-6G (R6G5), 6-carboxyrhodamine-6G (RG6), Rhodamine 110; Coumarine, wie Umbelliferone, Benzimide, wie Hoechst 33258; Phenanthridine, wie Texas Red, Ethidiumbromide, Acridinfarbstoffe, Carbazolfarbstoffe, Phenoxazinefarbstoffe, Poφhyrinfarbstoffe, Polymethinfarbstoffe, Cyaninfarbstoffe, wie Cy3, Cy5, Cy7, BODIPY-Farbstoffe, Quinolinfarbstoffe und Alexa Farbstoffe enthalten.
Dem Fachmann sind die geeigneten Bedingungen für eine quantitative PCR oder eine quanti- tative Reverse Transkriptions-PCR bekannt. Dies betrifft z.B. das Primer-Design, die Wahl von geeigneten Prozessierungstemperaturen (Reverse Transkription, Denaturierung, Primer Annealing, Elongation), die Zahl der PCR-Zyklen, die Pufferbedingungen. Reverse Transkription und
Es können neben der PCR auch andere Atnplifikationsverfahren zur Anwendung kommen, diese können ausgewählt aus der Gruppe umfassend, die "rolling circle amplification" (wie in Liu, et al., "Rolling circle DNA synthesis: Small circular oligonucleotides as efficient templa- tes for DNA polymerases," J. Am. Chem. Soc. 118:1587-1594 (1996) beschrieben), die "iso- theπnal amplification" (wie in Walker, et al., "Strand displacement amplification~an isother- mal, in vitro DNA amplification technique," Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992) beschrieben), die "ligase chain reaction" (wie in Landegren, et al., "A Ligase-Mediated Gene Detection Technique," Science 241:1077-1080, 1988, oder in Wiedmann, et al., "Ligase Chain Reaction (LCR)-Overview and Applications," PCR Methods and Applications (CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor Laboratory, NY, 1994) pp. S51-S64.) beschrieben. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist jedoch bevorzugt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Kit für die Nukleinsäurequantifizierung, umfassend: - mindestens eine Nuclease, vorzugsweise Exonuclease, optional dNTPs (vorzugsweise als Lösung einer Mischung aus dCTP, dATP, dGTP und dTTP (z.B. jeweils 5 mM, „dNTP Mix"),
- optional eine Pufferlösung oder eine Pufferstammlösung,
- eine DNA Polymerase
- optional eine Reverse Transkriptase, - eine Oligonukleotidsonde, wobei die Oligonukleotidsonde eine Tag-Sequenz sowie eine Sequenz umfasst, die spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure bzw. an eine gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäuren hybridisieren kann,
- Primer und/oder eine zweite Oligonukleotidsonde, die an die Tag- Sequenz hybri- disieren kann.
Für die Polymerasen, Reversen Transkriptasen, Oligonukleotidsonden und Primer des erfin- dungsgemäßen Kits gilt das oben für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebene.
Die erfindungsgemäßen Kits und Verfahren können zur Analyse von Genexpression in einer biologischen Probe verwendet werden.
Sequenzen
SEQ ID NO:l: OligoAmp 5 ' -
CACCACGTAAGACATAAAACGGCCACATAACTTGGCTTTAATGGACCTCCAATTTTGAGTGT GGTGCCATGTAAGGATGAATGTTTTTTTTTTTTTTTTT-S '
SEQ ID NO:2: AmpliF, Vorwärts-Primer für die Amplifizierung von OligoAmp
5 ' -CACCACGTAAGACATAAAACGG-3 '
SEQ ID NO:3: AmpliR, Rückwärts-Primer für die Amplifϊzierang von OligoAmp
5 ' -ACATTCATCCTTACATGGCACCA-B '
Beschreibung der Figuren
Fig. Ia: Quantifizierung des OligoAmp Oligos durch qPCR, nach Reverser Tanskription und Exol Verdau. Amplifikationsplot.
Fig. Ib: Quantifizierung des OligoAmp Oligos durch qPCR, nach Reverser Tanskription und Exol Verdau. Diagram Ct Werten gegen RNA Mengen in RT.
Fig. 2: Quantifizierung des OligoAmp Oligos durch qPCR, nach Reverser Tanskription, ohne Exol Verdau. Amplifikationsplot.
Fig. 3a: Quantifizierung des endogenen TBP Genes durch qPCR, nach Reverser Tanskription und Exol Verdau. Amplifikationsplot.
Fig. 3b: Quantifizierung des endogenen TBP Gens durch qPCR, nach Reverser Tanskription und Exol Verdau. Diagram Ct Werten gegen RNA Mengen in RT Beispiele
Beispiel 1
Reverse Transkriptasereaktionen wurden mittels des Omniskript (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die reverse Transkriptasereaktionen enthielten die folgenden Komponenten: Gesamt-RNA von Ramos humanen Burkitt's Lymphoma Zellen als Template (1 μg, 500 ng, 250ng, 125 ng und 0 ng); Oligonukleotide OligoAmp (0,1 nM Endkonzentration) mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 als reverser Transkripase-Primer; Reverse Transkriptase Omniskript; dNTPs, RNase-Inhibitor; Reverse Transkriptase-Puffer und RNase-freies Wasser. Die Sequenz von OligoAmp stammt aus dem Kartoffelgenom und hat kein Homologes im Humangenom.
18 μl jedes reversen Transkriptionsprodukts wurden dann mit jeweils 2 μl Exonuklease I (20 U/μl, Epicentre) oder Wasser (als nicht Exonuklease behandelte Kontrolle) versetzt und für
60 Minuten bei 37 0C dem Verdau ausgesetzt. Nach dem Verdau wurde die Exonuklease I bei
95 0C für 10 Minuten inaktiviert. 2 μl jedes Exonuklease I Reaktionsgemisches bzw. der
Templat-freien Kontrollen wurden mit QuantiFast SYBR Green Mix (Qiagen) und spezifischen Primera gemischt, um die unverdauten OligoAmps zu quantifizieren. Die Sequenzen der in der qPCR verwendeten Primer, AmpliF und AmpliR, sind in SEQ ID Nr. 2 und SEQ ID Nr. 3 gezeigt.
Aus dem Amplifikations-Plot in Fig. Ia und Tabelle 1 ist ersichtlich, dass nach reverser Transkription und Exonukleasebehandlung verschiedene Mengen von verbleibenden OligoAmp detektiert und quantifiziert wurden. Wie erwartet wurden in den Reaktionen mit höherem RNA-Ausgangsmengen größere Mengen von OligoAmp vor dem Exonuklease- Abbau geschützt und blieben daher unverdaut. Dies schlägt sich in niedrigeren Ct- Werten in der qPCR nieder. Die Ct-Werte und der Logarithmus der Ausgangs-RNA-Menge zeigen eine gute lineare Korrelation.
Tabelle 1 : Quantifizierung des OligoAmp Oligos durch qPCR, nach Revers er Tanskription und Exol Verdau. Zusammenfassung der Ct Werte.
Im Gegensatz zu den mit Exonuklease I behandelten reversen Transkriptionsprodukten wurden die OligoAmp-Oligonukleotide in den Wasser-Kontrollproben alle mit ähnlichen Ct- Werten detektiert, ungeachtet der Ausgangs-RNA-Menge (siehe Fig. 2, Tabelle T).
Tabelle 2: Quantifizierung des OligoAmp Oligos durch qPCR, nach Reverser Tanskription, ohne Exol Verdau. Zusammenfassung der Ct Werten.
In der selben reversen Transkriptasereaktion konnten endogene Gene mit hoher Konfidenz revers transkribiert und später mittels qPCR quantifiziert werden. Dies ist in den Figuren 3a und 3b sowie in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3: Quantifizierung des endogenen TBP Gens durch qPCR, nach Reverser Tanskription und Exol Verdau. Zusammenfassung der Ct Werte.
Die Exonukϊease I behandelten reverse Transkriptionsprodukte wurden als Template in der SyBr grün-basierten qPCR (QuantiFast SyBr Green, Qiagen) genutzt. TBP spezifische cDNA Primer wurden für die Amplifikation in der qPCR benutzt.
Die vorliegenden Daten zeigen, dass das Quantifizierungsverfahren mittels mRNA- bindenden, nuklease-resistenten exogenen Olϊgonukleotiden in der Normalisierungsstrategie genutzt werden kann, um die Ausgangs-mRNA-Menge sowie die Effizienz der reversen Transkription und der PCR zu überprüfen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Quantifizierung einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einer Probe, umfassend die folgenden Schritte: - Bereitstellung einer Probe enthaltend mindestens eine zu quantifizierende Nukleinsäure,
- Zugabe einer Oligonukleotidsonde zur Probe, wobei die Oligonukleotidsonde eine Sequenz umfasst, die spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure bzw. an eine gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäuren hybridisieren kann,
- Inkubation unter Bedingungen, die das Hybridisieren der Oligonukleotidsonde an die zu quantifizierenden Nukleinsäure(n) erlauben,
- Inkubation der Probe unter Bedingungen, die die Verlängerung von hybridisierten Sonden erlauben, wobei jeweils die zu quantifizierende(n) Nukleinsäu- re(n) als Template dienen,
- Entfernung der nicht-hybridisierten Sonden aus der Probe,
- Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonden als Maß für die Menge der zu quantifizierenden Nukleinsäure(n).
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verlängerung von hybridisierten Sonden mittels einer Polymerase stattfindet.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, wobei die Entfernung der nicht-hybridisierten Sonden mittels einer Nuclease geschieht, die spezifisch einzel strängige Nukleinsäuren abbauen kann.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Nuclease eine Exonuclease ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Exonuclease ausgewählt ist aus der Gruppe von Exonuclease I, Sl Nuclease, Lambda Exonuclease und Exonuclease VII.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, wobei die Oligonukleotidsonde ein einzelsträngiges Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe von DNA, RNA, PNA und LNA ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Oligonukleotidsonde modifizierte Nukleobasen und/oder modifizierte Linker enthält.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei Nukleinsäuren quantifiziert werden und die quantifizierten Mengen mindestens zweier Nukleinsäuren miteinander ins Verhältnis gesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, wobei die zu quantifizierende(n) Nukleinsäure(n) RNA(s) oder DNA(s) sind.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zu quantifizierende(n) RNA(s) mRNA(s) und die zu quantifizierende(n) DNA(s) cDNA(s) sind.
11. Verfaliren nach Anspruch 10, wobei die zu quantifizierenden RNAs mRNAs sind und die gemeinsame Sequenz eine poly-A-Sequenz ist.
12. Verfaliren nach Anspruch 10, wobei die zu quantifizierenden DNAs cDNAs sind und die gemeinsame Sequenz eine poly-dT- Sequenz ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Oligonukleotidsonde eine poly-T- oder poly- dT-Sequenz enthält.
14. Verfaliren nach Anspruch 12, wobei die Oligonukleotidsonde eine poly-A- oder poly- dA-Sequenz enthält.
15. Verfaliren nach Anspruch 1 bis 14, wobei die Oligonukleotidsonde eine Tag-Sequenz enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, wobei die Quantifizierung der hybridisierten Oligonukleotidsonde mittels quantitativer PCR durchgeführt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Quantifizierung der Tag-Sequenz mittels quantitativer PCR durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Oligonukleotidsonde als Primer für die re- verse Transkription von mRNA zu cDNA in einer RT-PCR dient.
19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, wobei die Oligonukleotidsonde einen Fluoreszenzfarbstoff enthält.
20. Kit für die Nukleinsäurequantifizierung, umfassend: - Nuclease, vorzugsweise Exonuclease,
- dNTPs,
- Puffer,
- Polymerase, z.B. Reverse Transkriptase,
Oligonukleotidsonde, wobei die Oligonukleotidsonde eine Tag-Sequenz sowie ei- ne Sequenz umfasst, die spezifisch an die zu quantifizierende Nukleinsäure bzw. an eine gemeinsame Sequenz der zu quantifizierenden Nukleinsäuren hybridisieren kann,
Primer und/oder eine zweite Oligonukleotidsonde, die an die Tag-Sequenz hybridisieren kann.
21. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder des Kits nach Anspruch 20 zur Analyse von Genexpression in einer biologischen Probe.
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