EP2406375A1 - ZELLSPEZIFISCH WIRKSAME MOLEKÜLE AUF GRUNDLAGE VON siRNA SOWIE APPLIKATIONSKITS ZU DEREN HERSTELLUNG UND VERWENDUNG - Google Patents

ZELLSPEZIFISCH WIRKSAME MOLEKÜLE AUF GRUNDLAGE VON siRNA SOWIE APPLIKATIONSKITS ZU DEREN HERSTELLUNG UND VERWENDUNG

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EP2406375A1
EP2406375A1 EP10718039A EP10718039A EP2406375A1 EP 2406375 A1 EP2406375 A1 EP 2406375A1 EP 10718039 A EP10718039 A EP 10718039A EP 10718039 A EP10718039 A EP 10718039A EP 2406375 A1 EP2406375 A1 EP 2406375A1
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EP
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sirna
linker
cell
amino
ampoule
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EP10718039A
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English (en)
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Diana Imhof
Sandra KÖHN
Tobias PÖHLMANN
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Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Original Assignee
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
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Publication date
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    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
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    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the invention relates to special biologically active molecules based on "short interfering RNA” (siRNA) .
  • siRNA short interfering RNA
  • the said biologically active molecules interact after activation with the mRNA of the target gene and together with specific endoribonucleases form an RNA-protein complex named "RISC” (US Pat. RNA induced silencing complex).
  • the RISC complex binds to the target mRNA, with endonucleases cleaving the target mRNA. In this way, gene expression is prevented and thus the emergence of target proteins is inhibited.
  • the cell-specifically activatable, biologically active molecules can be used, for example, for controlling and inhibiting the growth of abnormal cells, in particular in the treatment of tumors, in the treatment of viral infections, in age-specific treatments, etc.
  • the cell-specifically activatable, biologically active molecules can be used to modulate the gene expression of the target cells. Not only can the expression of genes be reduced, but they can also be increased by achieving a reduction in the expression of the negative regulator of the target gene by the biologically active molecules.
  • RNA molecules double-stranded RNA molecules
  • siRNA double-stranded RNA molecules
  • the siRNA molecules can be introduced directly into the cell, in particular via transfection reagents and electroporation (Zhang M et al .: Downregulation-enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol. 2004 May Gilmore IR et al .: Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22, Gurr Drag Deliv. 2006 Apr, 3 (2), 147-5, US 6,506,559). ,
  • siRNA is relatively unstable, which can be improved by chemical modifications (US 6,107,094).
  • tissue- or cell-specific-labeled transfection reagents eg antibody / antigen-labeled
  • siRNA molecules by binding fluorochromes in their biological action and to reconvert them into their active form by irradiation with light of a specific wavelength
  • QN Nguyen et al. Light-controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta, 2006.
  • This activation is initiated from the outside and is in no way cell-specific.
  • the said siRNA molecules after their activation in turn also act unintentionally in all other transfected cells and not only in the intended target cells.
  • siRNA molecules by binding peptides in their biological activity, which are designed so that these peptides in target cells by Zielzeil-specifically active
  • Peptidases are cleaved while they remain inactive in non-target cells (WO002008098569A2). In this way, molecules can be on
  • siRNA are very selectively activated in target cells, without these molecules unfold a negative effect on their cell function in other cells.
  • siRNA molecule is during the Effectively inactivates peptide bond, but influence the investigated linkers that remain after peptide cleavage on the siRNA, and possibly also said peptide residues, the induction of RNA interference negative, whereby the biological activity of the siRNA is inhibited.
  • the invention is based on the object to provide a connection between the siRNA and one or more peptides, in which the siRNA is activated after peptide cleavage, without that by the remaining linker and / or remaining peptide residues, the biological activity of the siRNA activated in the cell appreciably affected.
  • This covalent bond inactivates the biologically active siRNA molecules. There is thus no inhibition of specific gene expression after transfection of such inactive molecules, as long as only one of the bound peptides remains due to the absence of the corresponding target cell-typical enzyme on the siRNA molecules.
  • the peptide or peptides are cleaved off from the siRNA, leaving the amino-Cn linker and possibly a peptide residue on the siRNA.
  • the siRNA-based molecules which are not disrupted by the cell-specific enzymes of the target cell (see WO002008098569A2), remain reliably inactive and are activated upon molecule break-up after transfection into or to the target cell with effective biological activity of the siRNA.
  • the inactivated active substance molecules can be transfected into the target cells in a known manner.
  • said inactivating covalent bonds are cell-typically disrupted by the cell-specific enzyme or enzymes which are relevant to the binding sequences of the coupling peptide (s), thereby activating the biological activity of the molecule now in the target cell and dissolved by peptides. This then binds to the specific mRNA of the target cell and thereby inhibits gene expression in a known manner in this particular cell.
  • the active agent molecules remain reliably inactive because the covalent bonds between the biologically active molecule, in particular siRNA, and the peptide (s) are due to the absence of or the target cell specific enzymes completely (no peptide bond was broken) or partially (not all peptide bonds were broken) remain. Due to the further covalent peptide bond, the biologically active molecule does not bind to the mRNA of this cell or no RISC is initiated.
  • the molecule of the invention to be transfected in its inactive (bound) form not only get into or on tumor-targeted cells, but (which is virtually unavoidable in practice) can also reach healthy cells are selectively exclusively in or on activated the tumor-targeted cells with the local cell-specific enzymes, the said molecule in its biological effect and effectively inhibited the drug-related expression of the target gene.
  • This gene expression and thus the protein formation for the survival of healthy cells remains unaffected by this active substance despite the non-diseased (or not intended for the intended biological effect) cells, but permanently inactive molecule.
  • the biologically inactive molecule complexes to be transfected can be systemically administered with appropriate peptide binding (with defined amino acid combinations).
  • the molecular trays can also be bound to other substances (for example nanoparticles as a carrier system) for better transport into or onto the target cells and for their stabilization.
  • substances for example nanoparticles as a carrier system
  • mis-transfection can not be prevented by use of the invention, the mis-transfected molecules in these other cells than the target cells, although still undesirable, are not biologically active. This status remains unchanged despite the molecule activation in or on the target cells, so that the biological effect is selectively carried out exclusively in the target cells and, in contrast to the known mechanisms, a highly cell-selective modulation of gene expression is achieved.
  • an application kit in which the biologically active molecules to be used are provided with the selectable peptides (see WO002008098569A2), connected via a selectable linker, is advantageous.
  • the application kit should be in ampoule form containing all necessary ingredients, conveniently also a selection of suitable transfection systems (such as nanoparticles or lipids), other additives (such as antibodies, ligands and polyethylene glycol) and one or more probes or syringes with cannula for injection of the mixture of the Ampoule contents in containing the target cells containing medium.
  • suitable transfection systems such as nanoparticles or lipids
  • other additives such as antibodies, ligands and polyethylene glycol
  • probes or syringes with cannula for injection of the mixture of the Ampoule contents in containing the target cells containing medium.
  • the user can assemble and apply appropriate application mixtures for the intended use.
  • an application kit is conceivable with which a biologically active molecule can
  • FIG. 1 inactivated siRNA molecule by coupling the siRNA via the amino C6 linker with the peptide;
  • Fig. 2 cell-specifically activated siRNA molecule in which the peptide bond is broken and the siRNA molecule of the
  • Fig. 3 Enzyme activity of caspase-4 in target and non-target cells
  • a siRNA 2 coupled to a peptide 3 for their biological inactivation (inactivation of the action of siRNA in a cell).
  • the amino C6 linker 1 is connected to it via the 5 'end of the antisense strand of siRNA 2.
  • the siRNA molecule remains biologically inactivated.
  • the peptide bond is disrupted by a cell-specific enzyme of a target cell into which the inactivated siRNA molecule of FIG.
  • siRNA 1 has been transfected (complete cleavage of all peptides 3), biological activation of the remaining siRNA molecule occurs by the per se known ones cell-specific action of the siRNA intended for molecular transfection is activated (see also WO002008098569A2).
  • FIG. 3 shows the cell-specific activity of the cleavage enzyme caspase-4.
  • the enzyme caspase-4 is active in the target cells (Jeg-3 choriocarcinoma cells, dark diagram bars), whereas it is not active in the non-target cells (human embryonic kidney, HEK, bright diagram bar).
  • an siRNA inhibited by binding of the targeting peptide for caspase-4 via the linker structure of Fig. 1 is cleaved and activated in the target cells containing active caspase-4.
  • Fig. 4 shows the detection fluorescence intensities in the introduction of a control siRNA without function, a siRNA for the reduction of

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Abstract

1. Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung. 2.1. Aufgabe war es, eine Verbindung zwischen der siRNA sowie ein oder mehreren Peptiden zu schaffen, bei welcher die siRNA nach Peptidabspaltung aktiviert wird, ohne dass durch den verbleibenden Linker und/oder verbleibende Peptidreste die biologische Wirksamkeit der in der Zelle aktivierten siRNA nennenswert beeinträchtigt wird. 2.2. Erfindungsgemäß werden das oder die Peptide (3) über einen speziellen Amino-Cn-Linker, beispielsweise einen Amino-C6-Linker (1), an die siRNA (2) gekoppelt, welcher trotz seines Verbleibens an der siRNA und Verbleibens eventueller Peptidreste keine oder nur unwesentliche hemmende Beeinträchtigung der biologischen Wirksamkeit der siRNA ausübt. 2.3. Anwendung finden diese Moleküle beispielsweise zur Beeinflussung der Genexpression von vorzugsweise erkrankten und infizierten Organen bzw. Zellen oder zur Reduktion der Expression gewünschter Gene in Zellgemischen.

Description

Zellspezifisch, wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft spezielle biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von „short interfering RNA" (siRNA). Die besagten biologisch wirksamen Moleküle interagieren nach ihrer Aktivierung mit der mRNA des Zielgens und bilden zusammen mit speziellen Endoribonukleasen einen RNA-Proteinkomplex mit der Bezeichnung „RISC" (RNA induced silencing complex). Der RISC Komplex bindet an die Target-mRNA, wobei Endonukleasen die Ziel-mRNA schneiden. Auf diese Weise wird die Genexpression verhindert und somit das Entstehen von Zielproteinen gehemmt. Die zellspezifisch aktivierbaren, biologisch wirksamen Moleküle können beispielsweise zur Bekämpfung und Wachstumshemmung anormaler Zellen, insbesondere bei der Tumorbehandlung, bei der Behandlung von Virus-Infektionen, bei alterungsspezifischen Behandlungen etc. eingesetzt werden. Allgemein können die zellspezifisch aktivierbaren, biologisch wirksamen Moleküle zur Modulation der Genexpression der Zielzellen genutzt werden. Dabei kann die Expression von Genen nicht nur verringert, sondern auch erhöht werden, indem durch die biologisch aktiven Moleküle eine Verringerung der Expression der Negativ- Regulatoren des Zielgens erreicht wird.
Die Hemmung der Genexpression durch Einbringen von kurzen (19- 23bp), doppelsträngigen RNA-Molekülen (siRNA) in eukaryotische Zellen, die spezifisch für einen Sequenzabschnitt der mRNA eines Zielgens ist, wurde bereits beschrieben (Elbashir SM et al.: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature, 2001 May 24, 411(6836), 494-8; Liu Y et al.: Efficient and isoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleic acids, Biochemistry, 2004 Feb 24, 43(7), 1921-7; US 5,898,031; US 7,056,704). Mit Hilfe solcher Moleküle wird nicht das Ablesen eines Gens und die Produktion einer mRNA verhindert, sondern es wird durch die siRNA ein zelleigener Mechanismus initiiert, der die Target-mRNA abbaut. Schließlich wird, wie vorbeschrieben, die Bildung eines spezifischen Proteins unterdrückt, ohne die Expression weiterer Gene zu beeinträchtigen (post-transcriptional gene silencing).
Um die Expression eines Gens zu unterdrücken, können die siRNA Moleküle dabei insbesondere über Transfektionsreagenzien und Elektroporation direkt in die Zelle eingebracht werden (Zhang M et al.: Downregulation enhanced green fluorescence protein gene expression by RNA interference in mammalian cells, RNA Biol. 2004 May, 1(1), 74-7; Gilmore IR et al.: Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing, Epub 2004 May 22., Gurr Drag Deliv. 2006 Apr, 3(2), 147-5; US 6,506,559).
Von Nachteil ist dabei, dass die siRNA relativ instabil ist, was durch chemische Modifikationen verbessert werden kann (US 6,107,094).
Ein spezielles Problem der therapeutischen Anwendung von biologisch wirksamen Molekülen ist eine Applikation in vivo. Für eine solche Applikation wurden Möglichkeiten entwickelt, die siRNA zu stabilisieren, um den Abbau zu vermindern (Morrissey et. al.: „Chemical Modifications of Synthetic siRNA", Pharmaceutical Discovery, May 1, 2005), und es wurden Transfektionsreagenzen, beispielsweise Nanopartikel, in vivo-jetPEI™ (Polyplus), entwickelt, welche auch in vivo die siRNA in Zellen einbringen (Vernejoul et al.: Antitumor effect of in vivo somatostatin receptor subtype 2 gene transfer in primary and metastatic pancreatic Cancer modeis, Cancer Research 62, 2002, 6124- 31; Urban-Klein B, Werth S, Abuharbeid S, Czubayko F, Aigner A: RNAi-mediated gene-targeting through systemic application of polyethylenimine (PEI)-complexed siRNA in vivo, Gene Ther 12(5), 2005, 461-6.).
Ebenfalls wurden Methoden entwickelt, verstärkt Zellen eines Zielgewebes mit siRNA in vivo zu transfizieren (Ikeda et. al.: „Ligand- Targeted Delivery of Therapeutic siRNA", Pharmaceutical Research, Vol. 23, No. 8, August 2006). Die Verabreichung von biologisch aktiven Substanzen in vivo ist allerdings auf Grund der systemischen Wirkung oft problematisch. Das Einbringen dieser Substanzen selektiv in Zielzellen erfolgt nicht ausreichend spezifisch. Dies ist besonders bei siRNA Molekülen von Nachteil, die selektiv und ausschließlich in Zielzellen zur Wirkung kommen sollen. Durch gewebs- bzw. zellspezifisch-markierte Transfektionsreagenzien (z. B. Antikörper/ Antigen-markierte
Nanopartikel, TAT-Protein-Flankierang, u. a.) wird keine genügend große Zellspezifität erreicht. Fehltransfektionen sind die Folge.
Weiterhin ist bekannt, siRNA-Moleküle durch Bindung von Fluorochromen in ihrer biologischen Wirkung zu inaktivieren und durch Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge in ihre aktive Form wieder zu überführen (QN Nguyen et al.: Light controllable siRNAs regulate gene suppression and phenotypes in cells, Biochim Biophys Acta, 2006). Diese Aktivierung wird von außen initiiert und erfolgt in keiner Weise zellspezifisch. Dadurch wirken die besagten siRNA- Moleküle nach ihrer Aktivierung wiederum auch ungewollt in allen anderen transfizierten Zellen und nicht nur in den bestimmungsgemäßen Zielzellen.
Außerdem kann auch dieser Mechanismus nur schwer in vivo angewandt werden.
Des Weiteren ist bekannt, siRNA Moleküle durch Bindung von Peptiden in ihrer biologischen Wirkung zu inaktivieren, welche so gestaltet sind, dass diese Peptide in Zielzellen durch Zielzeil-spezifisch aktive
Peptidasen abgespaltet werden, während sie in nicht-Zielzellen inaktiv bleiben (WO002008098569A2). Auf diese Weise können Moleküle auf
Grundlage von siRNA sehr selektiv in Zielzellen aktiviert werden, ohne dass diese Moleküle in anderen Zellen eine für deren Zellfunktion nachteilige Wirkung entfalten.
In der Praxis hat sich gezeigt, dass die Verbindung der siRNA mit den Peptiden nicht unproblematisch ist und dass nach Abspaltung des oder der Peptide der an der siRNA verbleibende Linker bzw. auch verbleibende Peptidreste die Wirkung der siRNA in den Zielzellen nachteilig hemmen. Zwar ist das siRNA Molekül während der Peptidbindung wirksam inaktiviert, doch beeinflussen die untersuchten Linker, die nach Peptidabspaltung an der siRNA verbleiben, und ggf. ebenfalls auch die besagten Peptidreste die Induktion der RNA Interferenz negativ, wodurch die biologische Wirksamkeit der siRNA gehemmt wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine Verbindung zwischen der siRNA sowie ein oder mehreren Peptiden zu schaffen, bei welcher die siRNA nach Peptidabspaltung aktiviert wird, ohne dass durch den verbleibenden Linker und/oder verbleibende Peptidreste die biologische Wirksamkeit der in der Zelle aktivierten siRNA nennenswert beeinträchtigt wird.
Erfindungsgemäß wird ein spezieller Amino-Cn-Linker (mit Cn = Cl, C2, C3, C4, C5 oder Cό), beispielsweise ein Amino-C6- Linker, vorgeschlagen, über welchen die siRNA an ihrem 3'- oder/und 5 '-Ende mit dem zumindest einem Peptid kovalent gekoppelt ist. Durch diese kovalente Bindung werden die biologisch wirksamen siRNA Moleküle inaktiviert. Es findet somit nach einer Transfektion solcher inaktiven Moleküle keine Hemmung einer spezifischen Genexpression statt, solang auch nur eine der gebundenen Peptide durch das Nichtvorhandensein des entsprechenden zielzellentypischen Enzyms an den siRNA-Molekülen verbleibt.
Zur Aktivierung der biologisch-wirksamen Moleküle werden das oder die Peptide von der siRNA abgespalten, wobei der Amino-Cn-Linker und eventuell ein Peptidrest an der siRNA verbleibt.
Wenngleich auch der vorgeschlagene spezielle Linker nach der Abtrennung des oder der Peptide vom Molekül an der siRNA verbleibt (und auch ggf. Peptidreste bei der Abpaltung zurückbleiben), zeigt sich überraschend, dass mit dem Verbleiben dieses Linkers und ggf. der besagten Peptidreste so gut wie keine (oder, sofern überhaupt, dann nur unwesentliche) Beeinträchtigung der aktivierten siRNA Wirksamkeit des gespaltenen Moleküls gegeben ist, obwohl es in der fachmännischen Erwartung liegt, dass jeglicher an der siRNA verbleibende Molekülteil eine die biologische Wirksamkeit der siRNA einschränkende Wirksamkeit ausüben würde. Linker, wie auch der für das siRNA Molekül vorgeschlagene Amino-Cn-Linker, sind an sich bekannt, werden aber in der Praxis nicht zur Verbindung mit abspaltbaren Peptiden eingesetzt. Über solche Verwendungen, ist auch in der Fachwelt nicht bekannt geworden. Mit der Erfindung bleiben die Moleküle auf siRNA-Basis, welche durch die zellspezifischen Enzyme der Zielzelle nicht aufgebrochen werden (vgl. (WO002008098569A2) zuverlässig inaktiv und werden bei Molekülaufbruch nach Transfektion in oder an die Zielzelle mit effektiver biologischer Wirksamkeit der siRNA aktiviert.
Der erfindungsgemäße Effekt wurde anhand des Amino-C6-Linkers nachgewiesen, wobei es sich allerdings gezeigt hat, dass auch kleinere oder größere Strukturen dieses Linkertyps (wie Amino-C2, -C3, -C4, -C5-Linker) mit vergleichbarer Wirkung Anwendung finden können.
Durch ein geeignetes Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel oder Hüllmoleküle wie Liposomen, können die inaktivierten Wirkstoffmoleküle bekannter Weise in die Zielzellen transfiziert werden. Dort werden die besagten inaktivierenden kovalenten Bindungen durch das oder die zellspezifischen Enzyme, welche für die Bindungssequenzen des oder der Kopplungspeptide relevant sind, zelltypisch aufgebrochen, wodurch das nunmehr in der Zielzelle befindliche und von Peptiden gelöste Molekül in seiner biologischen Wirksamkeit aktiviert wird. Dieses bindet darauf hin an die spezifische mRNA der Zielzelle und hemmt dadurch in ebenfalls bekannter Weise die Genexpression in dieser speziellen Zelle.
In allen anderen Zellen des Organismus als die vorbestimmten Zielzellen, in welche die besagten inaktiven Molekülkonstrukte ebenfalls gelangen können, bleiben die Wirkstoffmoleküle zuverlässig inaktiv, da die kovalenten Bindungen zwischen dem biologisch wirksamen Molekül, insbesondere siRNA, und dem oder den Peptiden durch das NichtVorhandensein des oder der zielzellenspezifischen Enzyme vollständig (keine Peptidbindung wurde aufgebrochen) oder teilweise (nicht alle Peptidbindungen wurden aufgebrochen) bestehen bleiben. Das biologisch wirksame Molekül geht auf Grund der weiterhin kovalenten Peptidbindung keine Bindung mit der mRNA dieser Zelle ein, bzw. es wird kein RISC initiiert.
Wenngleich beispielsweise bei der Tumorbehandlung die zu transfizierenden erfindungsgemäßen Molekülkonstrakte in ihrer inaktiven (gebundenen) Form nicht nur in bzw. an tumorerkrankte Zielzellen gelangen, sondern (was in der Praxis kaum zu vermeiden ist) auch gesunde Zellen erreichen können, werden selektiv ausschließlich in oder an den tonorerkrankten Zielzellen mit dem dortigen zellspezifischen Enzymen das besagte Molekül in seiner biologischen Wirkung aktiviert und die wirkstoffbezogene Expression des Zielgens wirkungsvoll gehemmt. Diese Genexpression und damit die Proteinbildung für den Fortbestand der gesunden Zellen bleibt trotz der in diesen nicht erkrankten (bzw. für die beabsichtigte biologische Wirkung nicht zweckbestimmten) Zellen befindlichen, jedoch permanent inaktiven Molekülkonstrakte von diesem Wirkstoff unberührt.
Durch die vorgeschlagene hochselektive Wirkung der Moleküle infolge Zielzellen-enzymspezifischer Inaktivität/Aktivierung können die zu transfizierenden biologisch inaktiven Molekülkonstrakte bei entsprechender Peptid-Bindung (mit definierten Aminosäure- kombinationen) systemisch verabreicht werden.
Die Molekülkonstrakte können zum besseren Transport in bzw. an die Zielzellen sowie zu ihrer Stabilisierung außerdem an weitere Stoffe (beispielsweise Nanopartikel als Trägersystem) gebunden werden.
Durch Anwendung der Erfindung können diese Fehltransfektionen zwar nicht verhindert werden, jedoch sind die fehltransfizierten Moleküle in diesen anderen Zellen als die Zielzellen, wenngleich nach wie vor unerwünscht, biologisch nicht wirksam. Dieser Status bleibt auch trotz der Molekülaktivierung in oder an den Zielzellen unverändert, so dass die biologische Wirkung selektiv ausschließlich in den Zielzellen erfolgt und im Gegensatz zu den bekannten Mechanismen eine hochgradig zellselektive Modulation der Genexpression erreicht wird.
Weiterhin kann in Betracht gezogen werden, anstatt 18-23bp große siRNA Moleküle, auch kleinere doppelsträngige RNA-Moleküle zu verwenden.
Die Verwendungsmöglichkeiten solcher Moleküle mit einer kovalenten Bindung der siRNA an ein oder mehrere Peptide sind bereits in der WO002008098569A2 erwähnt.
Vorteilhaft ist ein Applikationskit, in welchem die einzusetzenden biologisch wirksamen Moleküle mit den auswählbaren Peptiden (vgl. WO002008098569A2), verbunden über einen wählbaren Linker bereitgestellt werden. Der Applikationskit sollte in Ampullenform alle notwendigen Inhaltsstoffe, in zweckmäßiger Weise auch eine Auswahl geeigneter Transfektionssysteme (wie Nanopartikel oder Lipide), sonstige Zusatzstoffe (wie Antikörper, Liganden und Polyethylenglycol) sowie eine oder mehrere Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen aufweisende Medium enthalten. Gemäß einer beiliegenden Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung der Moleküle kann der Nutzer für den bestimmungsgemäßen Einsatz entsprechende Applikationsmischungen zusammenstellen und zur Anwendung bringen. Des Weiteren ist ein Applikationskit denkbar, mit dem ein besagten biologisch wirksames Molekül hergestellt werden kann.
Es bietet sich an, einen solchen Applikationskit spezifisch für ausgewählte Zielzellen und Zielgene sowie je nach Anwendungsbereich (in vitro oder in vivo) bereitzustellen. Die Erfindung soll nachstehend anhand des in der Zeichnung dargestellten Amino-C6-Linkers als Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 : inaktiviertes siRNA-Molekül durch Kopplung der siRNA über den Amino-C6-Linker mit dem Peptid; chemische Struktur des Amino-C6-Linkers
Fig. 2: zellspezifisch aktiviertes siRNA-Molekül, bei dem die Peptidbindung aufgebrochen ist und am siRNA-Molekül der
Amino-C6-Linker sowie ein Peptidrest verbleiben
Fig. 3 : Enzymaktivität von Caspase-4 in Ziel- und Nichtzielzellen
Fig. 4: Darstellung der zellspezifischen Reduktion der Expression des GFP-Gens durch Peptid-inhibierte siRNA
Fig. 1 zeigt als Beispiel eines Amino-Cn-Linkers mit Cn = Cl, C2, C3, C4, C5 oder C6 die chemische Struktur eines an sich bekannten Amino-C6-Linkers 1. Über diesen Amino-C6-Linker 1 ist eine siRNA 2 zu deren biologischen Inaktivierung (Inaktivierung der Wirkung der siRNA in einer Zelle) mit einem Peptid 3 gekoppelt. Der Amino-C6-Linker 1 ist über das 5 '-Ende des Antisense-Stranges der siRNA 2 mit derselben verbunden. Solange das Peptid 3 an dieses siRNA-Molekül gebunden ist, bleibt das siRNA-Molekül biologisch inaktiviert. Wenn die Peptidbindung durch ein zellspezifisches Enzym einer Zielzelle, in die das inaktivierte siRNA-Molekül gemäß Fig. 1 transfiziert wurde, aufgebrochen wird (vollständige Abspaltung aller Peptide 3), erfolgt eine biologische Aktivierung des verbleibenden siRNA-Moleküls, indem die an sich bekannte und mit der Molekül- Transfektion beabsichtigte zellspezifische Wirkung der siRNA aktiviert wird (siehe auch WO002008098569A2).
Überraschender Weise erfolgt diese Aktivierung, wenngleich der Amino-C6-Linker 1 und ggf. ein Rest des Peptids 3 nach besagtem Aufbruch der Peptidbindung an dem Rest des siRNA-Moleküls verbleiben (vgl. Fig. 2), so dass trotz dieses Verbleibens die besagte biologische Wirkung der siRNA 2 durch den am Molekül verbleibenden Amino-C6-Linker 1 sowie die Rudimente des Peptides 4 nicht bzw. nicht nennenswert beeinträchtigt wird.
In Fig.3 ist die zellspezifische Aktivität des Spaltenzyms Caspase-4 dargestellt. Dabei ist das Enzym Caspase-4 in den Zielzellen (Jeg-3 Chorionkarzinomzellen; dunkler Diagrammbalken) aktiv, während es in den Nicht-Zielzellen (Human Embryonic Kidney, HEK; heller Diagrammbalken) nicht aktiv ist. Daraus resultierend wird eine siRNA, die durch Bindung des Zielpeptides für Caspase-4 über die Linkerstruktur aus Fig. 1 inhibiert wurde, in den Zielzellen, welche aktive Caspase-4 enthalten, gespalten und auf diese Weise aktiviert.
Fig. 4 zeigt die Nachweisfluoreszenzintensitäten bei der Einbringung einer Kontroll siRNA ohne Funktion, einer siRNA zur Reduktion der
Expression des GFP-Gens sowie einer Peptid-inhibierten siRNA, welche durch Caspase-4 aktiviert werden kann. Die Verringerung der
Fluoreszenz korreliert hierbei mit der biologischen Aktivität der siRNA.
Es ist zu beobachten, dass in den Zielzellen (JEG-3 Chorionkarzinomzellen; dunkler Diagrammbalken) die siRNA aktiviert und somit die Expression des GFP-Gens reduziert wird, während es in den Nicht-Zielzellen (Human Embryonic Kidney, HEK; heller
Diagrammbalken) zu keiner Reduktion der Expression dieses Gens kommt. Auch wenn an der aktivierten siRNA die Linker-Struktur und ein Peptidrest verbleibt (In diesem Fall ein Amino-C6-Linker mit gebundenem Glycin), ist die Wirkung der siRNA vergleichbar der
Wirkung normaler siRNA.
Aufstellung der verwendeten Bezugszeichen
1 Ammo-C6-Linker
2 siRNA
3 Peptid zur Inaktivierung der siRNA
4 Peptidrest

Claims

Patentansprüche
1. Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA zur biologisch inaktiven Transfektion in eine Zielzelle, um in dieser nach biologischer Aktivierung durch Bindung an mRNA und unter
Formierung eines "RISC-Komplexes die Expression von Genen zu hemmen, wobei die siRNA zum Zweck ihrer biologischen Inaktivierung mit wenigstens einem Peptid über einen Linker gekoppelt ist, der nach der biologischen Aktivierung des Moleküls an der siRNA verbleibt, dadurch gekennzeichnet, dass die siRNA (2) über einen AminoCnLinker (1) mit Cn = Cl, C2, C3, C4, C5 oder C6 an das wenigstens ein Peptid (3) gekoppelt ist.
2. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C6-Linker vorgesehen ist.
3. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C5-Linker verwendet wird.
4. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C4-Linker vorgesehen ist.
5. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C3 -Linker eingesetzt wird.
6. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-C2-Linker dient.
7. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch I5 dadurch gekennzeichnet, dass als Amino-Cn-Linker ein Amino-Cl -Linker vorgesehen ist.
8. Zellspezifisch wirksame Moleküle gemäß Anspruch I5 dadurch gekennzeichnet, dass an dem biologisch wirksamen Molekül mit dem über den Amino-Cn-Linker zumindest einen kovalent gebundenen Peptid ein Transfektionssystem zur Transfektion in oder Bindung an die Zielzellen kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt ist, beispielsweise ein Trägersystem wie Nanopartikel, Ligand/Antiköφer/Antigenmarkierung oder Moleküle wie Nanopartikel, Polymere oder Lipide, mit denen die selektiv aktivierbaren biologisch wirksamen Moleküle zu ihrer Transfektion umhüllt werden, oder Lipid-basierte Methoden oder eine TAT-
Protein-Flankierung.
9. Applikationskit zur Anwendung und Verabreichung der zellspezifisch wirksamen Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, bestehend zumindest aus
10. -wenigstens einer Ampulle (Ampulle A), welche eine zum Zweck der Inaktivierung an ein ausgewähltes Peptid gebundene siRNA mit einem an diese gebundenem Amino-Cn-Linker enthält,
- wenigstens einer weiteren Ampulle (Ampulle B) mit einem Transfektionssystem, beispielsweise Nanopartikel oder Lipide,
- Verdünnungs- und Reaktionspuffer für die Inhalte der Ampullen A und B,
- einer oder mehreren Sonden bzw. Spritzen mit Kanüle und andere benötigte Materialien zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten in das die Zielzellen enthaltende Medium sowie
- einer Vorschrift zur Anwendung und Verabreichung
11. Applikationskit gemäß Anspruch 13, enthaltend wenigstens eine weitere Substanz, beispielsweise Antikörper zur semi-selektiven Bindung der biologisch wirksamen Moleküle an Zielzellen und/oder
Polyethylenglycolketten, zur Verankerung des Peptids und der biologisch wirksamen Moleküle.
12. Applikationskit zur Herstellung der zellspezifisch wirksamen Moleküle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, bestehend zumindest aus
- einer Ampulle (Ampulle A)5 welche das oder die Peptide enthält, welche zum Zwecke der Inaktivierung der siRNA an diese gebunden werden können,
- einer Ampulle (Ampulle B) mit Reaktionspuffern zur Bindung des oder der Peptide an die siRNA
- einer Ampulle (Ampulle C) zur Modifikation der Peptide nach der Bindung an die siRNA
- einer Ampulle (Ampulle D) mit weiteren Reaktionspuffern
- einem System zur Aufreinigung der Teil- oder Endprodukte nach der Bindung der Peptide an die siRNA
- eines oder mehrerer Injektionsmittel, wie Sonden oder Spritzen mit Kanüle zur Injektion der Mischung aus den Ampulleninhalten, sowie weitere benötigte Materialien wie Dialysemembranen oder Reaktionsgefäße, sowie
- einer Vorschrift zur Anwendung
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009043743B4 (de) 2009-03-13 2016-10-13 Friedrich-Schiller-Universität Jena Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung
DE102011009470A1 (de) * 2011-01-21 2012-08-09 Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch wirksame Nukleotid-Moleküle zur gezielten Abtötung von Zellen, Verwendung derselben sowie Applikationskit
DE102012022596B4 (de) * 2012-11-15 2017-05-04 Friedrich-Schiller-Universität Jena Neue zellspezifisch wirksame Nukleotid-Moleküle und Applikationskit zu deren Anwendung
US20200230251A1 (en) 2014-08-14 2020-07-23 Friedrich-Schiller-Universitaet Jena Peptide for use in the reduction of side effects in the form of immunostimulatory reactions/effects
DE102019000490A1 (de) 2019-01-23 2020-07-23 HAEMES Verwaltungsgesellschaft mbH Verwendung von Oligonukleotiden für die Behandlung von Tumoren
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006019430A2 (en) * 2004-04-20 2006-02-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Methods and compositions for enhancing delivery of double-stranded rna or a double-stranded hybrid nucleic acid to regulate gene expression in mammalian cells
WO2007056153A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Peptide-dicer substrate rna conjugates as delivery vehicles for sirna

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6589503B1 (en) 1998-06-20 2003-07-08 Washington University Membrane-permeant peptide complexes for medical imaging, diagnostics, and pharmaceutical therapy
IL129427A0 (en) 1999-04-13 2000-02-17 Yeda Res & Dev Preparation of biologically active molecules
CA2429814C (en) 2000-12-01 2014-02-18 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
EP1487995A4 (de) * 2002-02-13 2006-08-02 Medbridge Inc Proteinträgersystem für therapeutische oligonukleotide
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
AU2006325030B2 (en) * 2005-12-16 2012-07-26 Cellectis Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
DE102007008596B4 (de) 2007-02-15 2010-09-02 Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch wirksame Moleküle auf Grundlage von PNA und siRNA, Verfahren zu deren zellspezifischen Aktivierung sowie Applikationskit zur Verabreichung
DE102009043743B4 (de) 2009-03-13 2016-10-13 Friedrich-Schiller-Universität Jena Zellspezifisch wirksame Moleküle auf Grundlage von siRNA sowie Applikationskits zu deren Herstellung und Verwendung

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006019430A2 (en) * 2004-04-20 2006-02-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Methods and compositions for enhancing delivery of double-stranded rna or a double-stranded hybrid nucleic acid to regulate gene expression in mammalian cells
WO2007056153A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-18 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Peptide-dicer substrate rna conjugates as delivery vehicles for sirna

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIU Y-L ET AL: "RNAi in Human Cells: Basic Structural and Functional Features of Small Interfering RNA", MOLECULAR CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, MA, US, vol. 10, 1 September 2002 (2002-09-01), pages 549 - 561, XP002978510, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/S1097-2765(02)00652-4 *
CZAUDERNA F ET AL: "Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 31, no. 11, 1 June 2003 (2003-06-01), pages 2705 - 2716, XP002270732, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/NAR/GKG393 *
HARBORTH J ET AL: "Sequence, chemical, and structural variation of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing", ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT, MARY ANN LIEBERT, INC., NEW YORK, US, vol. 13, no. 2, 1 April 2003 (2003-04-01), pages 83 - 105, XP002284355, ISSN: 1087-2906, DOI: 10.1089/108729003321629638 *
JESSICA FLAGOTHIER ET AL: "Synthesis of two new alkyne-bearing linkers used for the preparation of siRNA for labeling by click chemistry with fluorine-18", APPLIED RADIATION AND ISOTOPES, ELSEVIER, OXFORD, GB, vol. 70, no. 8, 19 April 2012 (2012-04-19), pages 1549 - 1557, XP028401844, ISSN: 0969-8043, [retrieved on 20120427], DOI: 10.1016/J.APRADISO.2012.04.022 *
JI HOON JEONG ET AL: "siRNA conjugate delivery systems", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, ACS, WASHINGTON, DC, US, vol. 20, no. 1, 21 January 2009 (2009-01-21), pages 5 - 14, XP002624571, ISSN: 1043-1802, [retrieved on 20081117], DOI: 10.1021/BC800278E *
NETZEL-ARNETT S ET AL: "Continuously recording fluorescent assays optimized for five human matrix metalloproteinases", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS INC, NEW YORK, vol. 195, no. 1, 15 May 1991 (1991-05-15), pages 86 - 92, XP024828075, ISSN: 0003-2697, [retrieved on 19910515], DOI: 10.1016/0003-2697(91)90299-9 *
SCHWARZ D S ET AL: "EVIDENCE THAT SIRNAS FUNCTION AS GUIDES, NOT PRIMERS, IN THE DROSOPHILA AND HUMAN RNAI PATHWAYS", MOLECULAR CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, MA, US, vol. 10, no. 3, 1 September 2002 (2002-09-01), pages 537 - 548, XP009019083, ISSN: 1097-2765, DOI: 10.1016/S1097-2765(02)00651-2 *
See also references of WO2010102615A1 *
TURK B E ET AL: "Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING GROUP, NEW YORK, NY, US, vol. 19, no. 7, 1 July 2001 (2001-07-01), pages 661 - 667, XP002254824, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/90273 *
ZDRAVKA MEDAROVA ET AL: "In vivo imaging of siRNA delivery and silencing in tumors", NATURE MEDICINE, vol. 13, no. 3, 1 March 2007 (2007-03-01), pages 372 - 377, XP055031597, ISSN: 1078-8956, DOI: 10.1038/nm1486 *

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