EP2370075A1 - Utilisation d'inhibiteurs de gerany-geranyl transferase dans le traitement des lesions de la moelle epiniere - Google Patents

Utilisation d'inhibiteurs de gerany-geranyl transferase dans le traitement des lesions de la moelle epiniere

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Publication number
EP2370075A1
EP2370075A1 EP09799369A EP09799369A EP2370075A1 EP 2370075 A1 EP2370075 A1 EP 2370075A1 EP 09799369 A EP09799369 A EP 09799369A EP 09799369 A EP09799369 A EP 09799369A EP 2370075 A1 EP2370075 A1 EP 2370075A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
spinal cord
ggti
formula
geranyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09799369A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Isabelle Boquet
Dorothée BUTTIGIEG
Jean-Chrétien NORREEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pharmaxon
Original Assignee
Pharmaxon
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Filing date
Publication date
Application filed by Pharmaxon filed Critical Pharmaxon
Publication of EP2370075A1 publication Critical patent/EP2370075A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to compounds of general formula (I).
  • the present invention relates to the use of these compounds as a medicament.
  • the present invention finds particular application in the fields of human and veterinary medicine.
  • references in brackets ([]) refer to the list of references at the end of the text.
  • the medullary lesion causes dysfunction of the voluntary motility (paralysis) or reflex (spasticity), chronic pain, sensory disorders of the superficial type (cutaneous sensations) or deep (position of the body in space), neuro-vegetative disorders (sudden change in temperature or blood pressure), genito- sexual, bladder and intestinal disorders (spasmodic or flaccid sphincters), and respiratory disorders in case of high cervical lesion,
  • the biological response following a spinal cord injury can be divided into 3 stages: an acute, secondary and then chronic phase.
  • the acute phase which begins in the seconds following the trauma, there is a necrosis of the cells in the lesion zone, with the cell contents (ions, glutamate) being spilled into the extracellular medium, which is likely to lead to the death of the cells. other cells.
  • the appearance of small edema due to the rupture of the blood-brain barrier is also observed.
  • the secondary phase that begins within minutes of injury is dominated by lesion extension, immune response, and apoptotic cell death.
  • glial scar mainly composed of astrocytes but also of oligodendrocytes (Fawcett, JW, and Asher, RA (1999), The Brain Research Bulletin 49, 377-391 [1].
  • Astrocytes contribute to the maintenance of the blood-brain barrier that limits the central nervous system. They form a three-dimensional network between neurons and contribute to their proper development and survival. In adults and under normal conditions, astrocytes are immobile, star-shaped, with no preferential orientation in the gray matter where they predominate while they are extended and organized rostro-caudally in the white matter.
  • the astrocytes of the glial scar are characterized by hyperplasia and hypertrophy. There is a reorientation of these to the site of inflammation. Division, elongation and migration of astrocytes to the lesion lead to the formation of the glial scar.
  • Astrocytes will express on their surface highly glycosilated and sulphated proteins, proteoglycans, inhibitory molecules of neuronal regrowth. These hyperactivated cells will form a tight mesh constituting a physical and chemical barrier inhibiting axonal regrowth.
  • Oligodendrocytes, including myelin that surrounds neuronal extensions of a protective sheath, are also found in the glial scar.
  • MAG Myelin Assocoiated Glycoprotein
  • Omgp Oligodendrocyte Myelin Glycoprotein
  • Prenylation is an irreversible post-translational modification consisting of a covalent grafting by thioether bond of an isoprene lipid, famesylpyrophosphate (15 carbon atoms) or geranylgeranylpyrophosphate (20 carbon atoms), on a consensus sequence of the end COOH-terminal protein, usually a GTAPase.
  • the role of prenylation is major because it intervenes in the subcellular localization of proteins and thus in their mode of operation.
  • FTase farnesyl transferase
  • GTTase II geranylgeranyl transferase type II
  • XCC or CXC motifs Zhang, FL, and Casey, PJ (1996) Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences. Biochemistry 65, 241-269. [2]).
  • the nature of the transferred isoprene depends on the nature of the amino acid X.
  • the FTase reacts with the CAAX sequence when X is for example a serine or a methionine.
  • GGTase I When X is leucine, isoleucine or phenylalanine, the protein is recognized by GGTase I. There are inhibitors of these highly selective enzymes, and FTase inhibitors (lonafarnib, tipifarnib) are involved in clinical trials of treatment of certain cancers in which there is overactivation of the Ras protein.
  • FTase inhibitors lonafarnib, tipifarnib
  • GGtase I the small GTPases of the Rho family (RhoA, RhoC, Rac1, Rac2, cdc42) known for their involvement in survival and cell motility.
  • RhoA protein in particular is a target for the treatment of spinal cord injury (Dergham, P., Ellezam, B., Essagian, C., Avedissian, H., Lubell, WD, and McKerracher, L. (2002). J Neurosci 22, 6570-6577 [3]).
  • Rac1 may be implicated in the persistence of neuropathic pain after spinal cord injury (Tan, AM, Stamboulian, S., Chang, YW, Zhao, P., Hains, AB, Waxman, SG, and Hains, BC (2008) Neuropathic pain memory is maintained by radially-regulated dendritic spine remodeling after spinal cord injury.J Neurosci 28, 13173-13183. [4])
  • chondroitinase ABC partially restores neurological functions (Bradbury, EJ, Moon, LD, Popat , RJ, King, VR, Bennett, GS, Patel, PN, Fawcett, JW, and McMahon, SB (2002), Chondroitinase ABC promoted functional recovery after spinal cord injury, Nature 416, 636-640 [5]).
  • thermostabilized chABC enhances axonal sprouting and functional recovery after spinal cord injury (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [8]).
  • Cell transplants are also contemplated, so oligodendrocyte precursors derived from human embryonic stem cells (hESCs) were grafted into adult rats at different times after spinal cord injury at 7 days or 10 months.
  • the transplanted cells survived and differentiated into oligodendrocytes, migrating a few millimeters and allowed for individuals treated at 7 days remyelination of axons and partial recovery of locomotion (Sharp, J., Frame, J., Siegenthaler, M., Nistor, G., and Keirstead, HS (2009) Human Embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor CeII Transplants Improve Recovery after Cervical Spinal Cord Injury.Stem cells (Dayton, Ohio). [9]).
  • the present invention precisely makes it possible to solve the aforementioned problems and disadvantages of the state of the art by providing compounds of formula (I) and their use as a medicament.
  • the present invention also relates to the use of geranyl-geranyl transferase inhibitors for the treatment of spinal cord lesions.
  • R 1 is hydrogen, C 1 -C 6 alkyl, C 2 -C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 6 -C 10 aryl or an alkali metal cation (Na +, K +) :
  • R 2 is a hydrogen atom, an alkyl to C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 2 -C 6, alkoxy Cl to C 6, an aryl C 6 -C 1 0, a halogen atom (F, Cl, Br, I), -OH, -NO 2 , -CN, -CO 2 H, -SO 3 H, -NHNH 2 , -SH, -NH 2 , HO -NH-, isobutyl, secbutyl or benzyl;
  • R 3 and R 4 independently of one another a hydrogen atom, an alkyl to C 6 alkenyl, C 2 -C 6 alkynyl, C 2 -C 6;
  • R5 is five-membered heterocycle or heteroaryl Ci-C 6, for the manufacture of a medicament.
  • the compounds of the invention make it possible to promote axonal regrowth and thus restore nerve connections.
  • the compounds of the invention also make it possible to inhibit the migration of astrocytes at the level of the lesion of the spinal cord.
  • alkyl refers to, for example, a linear or branched, cyclic or acyclic saturated hydrocarbon radical.
  • the alkyl radical may comprise from 1 to 20 carbon atoms, preferably from 1 to 10 carbon atoms, more particularly from 1 to 8 carbon atoms. carbon, even more particularly from 1 to 6 carbon atoms.
  • an alkyl radical may be a methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, sec-pentyl, isopentyl or tert-pentyl radical.
  • alkenyl refers to, for example, a linear or branched, cyclic or acyclic unsaturated hydrocarbon radical comprising at least one carbon-carbon double bond.
  • the alkenyl radical may comprise from 2 to 20 carbon atoms, preferably from 2 to 10 carbon atoms, more particularly from 1 to 8 carbon atoms, even more particularly from 2 to 6 carbon atoms.
  • an alkenyl radical may be an allyl, ethenyl, propenyl, butenyl, 1-methyl-2-buten-1-yl or similar radicals.
  • alkynyl refers to, for example, a linear or branched, cyclic or acyclic unsaturated hydrocarbon radical comprising at least one carbon-carbon triple bond.
  • the alkynyl radical may comprise from 2 to 20 carbon atoms, preferably from 2 to 10 carbon atoms, more particularly from 1 to 8 carbon atoms, even more particularly from 2 to 6 carbon atoms.
  • an alkynyl radical may be an ethynyl, 2-propynyl (propargyl), 1-propynyl or similar radicals.
  • alkoxy refers to an alkyl radical, as defined above, attached to the remainder of the molecule via an oxygen atom.
  • the alkyl radical may comprise from 1 to 20 carbon atoms, preferably from 1 to 10 carbon atoms, more particularly from 1 to 8 carbon atoms, even more particularly from 1 to 6 carbon atoms.
  • an alkoxy radical may be methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, tert-butoxy, neopentoxy, n-hexoxy, or a similar radical.
  • aryl refers to, for example, a mono-, bi- or tricyclic hydrocarbon system comprising one, two or three cycles satisfying Hekel's aromaticity rule.
  • an aryl radical may be a phenyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl, indanyl, indenyl or similar group.
  • the aryl radicals may comprise from 6 to 20 carbon atoms, especially from 6 to 14 carbon atoms, more particularly from 6 to 10 carbon atoms.
  • alkylenyl refers to, for example, a divalent, linear or branched, cyclic or acyclic saturated hydrocarbon system.
  • the alkylenyl radical may comprise from 1 to 20 carbon atoms, preferably from 1 to 10 carbon atoms, more particularly from 1 to 8 carbon atoms, even more particularly from 1 to 6 carbon atoms.
  • an alkylenyl radical may be a methylenyl, ethylenyl, n-propylenyl, isopropylenyl, n-butylenyl, n-pentylenyl, n-hexylenyl, or similar radicals.
  • halogen atom refers to, for example, an atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • heteroaryl refers to alkyl as defined above comprising a hetero atom selected from sulfur, nitrogen and oxygen.
  • the arylalkyl and alkylaryl radicals may comprise, for example, from 7 to 25 carbon atoms, especially from 7 to 20 carbon atoms and in particular from 7 to 15 carbon atoms.
  • R 5 may be selected from the group consisting of the following heterocycles:
  • n 0, 1 or 2;
  • R 1A is H, C 1-4 alkyl;
  • R 1D represents H or C1-alkyl or a C1-C4 heteroalkyl with at least one heteroatom selected from nitrogen and / or sulfur.
  • R 2 may be selected from the group consisting of isobutyl, secbutyl or benzyl.
  • R 5 may be of formula (XIV), in which R 1A is H, and R 1D is H, or 2-aminoethylthio
  • the compound used can be the compound of formula (I) in which
  • R1 represents H
  • R2 represents isobutyl
  • R3 represents H
  • R4 represents H
  • R5 is of formula VR 1D (XIV) in which R 1A represents H, and
  • R 1D represents H, or the compound used may be the compound of formula (I) in which R 1 represents CH 3 ,
  • R2 represents an isobutyl
  • R3 represents H
  • R4 represents H
  • R5 represents -CH-NH 2 -CH 2 -SH for the manufacture of a medicament.
  • the compound used can be the compound of formula (XXIII)
  • the compound used may be the compound of formula (XXIII).
  • the term "geranyl geranyl transferase inhibitor” is intended to mean all the compounds known to those skilled in the art and / or commercially available; it may be, for example, the compounds described in US Pat. No. 6,693. 123, US 6,627,610, US 6,221,865, US 6,204,293, US 5,965,539 and US 5,789,558.
  • the present invention also relates to the different enantiomers of the abovementioned compounds of the invention.
  • the subject of the present invention is also the various polymorphs of the compounds of the invention.
  • polymorph it is understood crystals of molecules having different physical properties due to the arrangement of molecules in the crystal lattice.
  • drug is understood to mean, for example, any substance or compound having curative and / or preventive properties with regard to pathologies, injuries, trauma, human or animal diseases. It may be for example a pharmaceutical product for human and / or veterinary use.
  • the medicament may be in any form known to those skilled in the art, for example a tablet, capsule, patch, in liquid form, for example a solution suitable for oral administration, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, transcutaneous, or intrathecal.
  • the drug may also be in the form of a prodrug.
  • pro-drug is meant a derivative of a compound that comprises an additional moiety that is capable of being detached in vivo from the parent molecule to release the active compound.
  • a prodrug may be an ester that is cleaved in vivo to release the compound.
  • the medicament is a medicament for the treatment of lesions of the central nervous system, in particular for the treatment of spinal cord lesions.
  • cerebral lesion or spinal cord In the present, by lesion of the central nervous system, it is understood cerebral lesion or spinal cord.
  • cerebral lesion it is understood, for example, a traumatic brain injury (traumatic brain injury) or medical (stroke, cerebral compression).
  • traumatic brain injury traumatic brain injury
  • stroke cerebral compression
  • spinal cord injury means, for example, traumatic or medical injury to the spinal cord, ischaemia, degeneration of the spinal cord, e.g. neurodegenerative pathology or cancer. as intraspinal tumors; the lesion may be for example a total section of the spinal cord separating it into two parts, a partial section of the spinal cord or a medullary compression of traumatic or medical origin.
  • pharmaceutically acceptable salts, esters or ester salts means, for example, salts, esters and ester salts of the compound of the invention or any derivative thereof which are effective for example for the treatment of spinal cord injuries.
  • they may be salts, for example, basic or acidic salts.
  • the compounds of the invention may be for example hydrochloride salts, hydrobromide.
  • Pharmaceutically acceptable salts are known to those skilled in the art, for example, they may be pharmaceutically acceptable salts described in SM Berge et al., Describe pharmaceutically acceptable salts in detail in J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1 -19 [11].
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include those derived from bases and organic and / or inorganic acids.
  • Examples of pharmaceutically acceptable, non-toxic salts are, for example, amine group salts formed with an inorganic acid such as hydrochloric acid, bromic acid, phosphoric acid, sulfuric and perchloric acid or with an organic acid.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, bromic acid, phosphoric acid, sulfuric and perchloric acid or with an organic acid.
  • Other pharmaceutically acceptable salts further include adipate, alginate, ascorbate, aspartate, benzenesulfonate, benzoate, bisulfate, borate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, citrate, cyclopentanepropionate, digluconate, dodecylsulfate, ethanesulfonate, formate, fumarate, glucoheptonate, glycerophosphate, gluconate, hemisulfate, heptanoate, hexanoate, hydroiodide, 2-hydroxy-ethanesulfonate, lactobionate, lactate, laurate, lauryl sulfate, malate, maleate, malonate, methanesulfonate, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, oleate, oxalate, palmitate, pamoate, pect
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a compound according to the present invention or a salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutical composition is understood to mean a liquid composition, an emulsion, an ointment, a mousse, a paste, a scored tablet, a capsule, an effervescent tablet, a dermal patch or an injectable device, without the shape being limiting.
  • pharmaceutical composition is a liquid composition, for example a composition adapted for injection by a syringe, or pump.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” means an inert diluent agent, such as sorbitol, sugar, mannitol, microcrystalline cellulose, starch, sodium chloride, sodium phosphate, calcium, calcium phosphate, calcium sulphate, lactose, for example lactose monohydrate.
  • the compound of the invention or salt thereof may be used in a concentration of between 1 nM and 10 mM, preferably between 1 .mu.M and 1 mM and even more preferably between 10 .mu.M and 1 mM.
  • the compounds of the present invention in the pharmaceutical composition, may be in racemic form or in enantiomerically enriched or even pure form.
  • the compounds of the present invention or salts thereof can also be used for the treatment of spinal cord injuries.
  • the compounds of the invention may be administered to a subject to be treated, that is to say for example a subject having a spinal cord injury.
  • treatment it is generally understood that the compounds of the invention may be used independently in humans or animals.
  • subject to be treated is meant, for example, a human being or a mammal.
  • it may be a subject who has a traumatic or pathological lesion of the spinal cord.
  • an animal preferably a mammal and even more preferably a human being.
  • animal is understood to mean humans as well as non-human beings, at any stage of their development, including, for example, mammals, birds, reptiles and fish.
  • the non-human being may be a mammal, for example a rodent, a mouse, a rat, a monkey, a dog, a cat, a sheep, cattle, a primate or a pig.
  • the animal may also be, for example, a transgenic animal or a human clone.
  • the compounds of the present invention may be administered, for example one to three times a day, once every two days, once every three days, four days, five days, six days or once a week.
  • the compounds of the present invention are administered orally, intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, transdermally, or intrathecally.
  • the compound of the present invention can be obtained by any chemical synthesis method known to those skilled in the art.
  • FIG. 1 shows schematically the technique of the test injury ("scratch assay"). It represents a diagram of a monolayer of astrocytes in culture (A). A wound (z) is mechanically performed in the monolayer (B), which will close in time by recolonization of the area by the cells (scratch assay) (C).
  • FIG. 1 Photograph of a well (p) of 96-well culture plate (pc) not shown, representing the labeling of cells with calcein (fluorescent marker of living cells). The wound (z) is visualized by a black surface devoid of cells.
  • 3 photographs of 3 wells of a 96-well plate showing 3 treatment conditions: a negative control well treated with the carrier solution or with an inactive compound in which no residual streak is detected (A), a well treated by a cell migration blocking compound (C), a well treated with a toxic compound, which generates a surface greater than the starting surface, due to cell death.
  • FIG. 4 shows curves showing the concentration corresponding to 50% inhibition of migration (IC50) of simvastatin (A) and lovastatin (B) on the astrocyte migration test.
  • the abscissa represents the logarithm of the molar concentration and ordered the percentage of molar inhibition.
  • FIG. 5 shows the route of synthesis of cholesterol.
  • Statins act upstream by inhibiting the synthesis of L-mevalonate by HMG-CoA reductase. From the mevalonate are produced the prenatal residues geranylgeranyl-pyrophosphate and farnesyl-pyrophosphate which will be anchored on target proteins via geranylgeranyl transferases or farnesyl transferase.
  • - Figure 6 is a bar graph showing the inhibition of astrocyte migration in culture in the test "scratch assay" by the compound of formula (XXIV) (GGTI-298) at different concentrations. The effect is dependent on the concentration of the GGTI-298 compound. The positive control is lovastatin. The ordinate represents the inhibition of migration and the abscissa the culture conditions that is to say the test compound and its concentration.
  • FIG. 7 is a bar graph showing the inhibition of astrocyte migration in culture in the "scratch assay" test by the compound of formula (XXIII) (GGTI-2133). The effect is dependent on the concentration of the compound.
  • the positive control is lovastatin.
  • the ordinate represents the inhibition of migration and the abscissa the culture conditions that is to say the test compound and its concentration.
  • FIG. 8 is a curve for determining the IC50 of compound GGTI-2133 in the scratch assay model.
  • the abscissa represents the decimal logarithm of the molar concentration and the ordered the percent inhibition.
  • FIG. 9 is a bar graph showing the percentage of neural shoot as a function of the concentration of GGTI-2133. This compound stimulates the neuritic growth of cortical neurons cultured on an inhibitory substrate composed of myelin. Stimulation of neuritic growth is 20% at the concentration of 15 ⁇ M of GGTI-2133 in the culture medium.
  • FIG. 10 is a bar graph representing the percentage of neuritic (ordered) growth as a function of the concentration of GGTI-2133
  • GGTI-2133 stimulates neuritic growth of cortical neurons cultured on a permissive substrate composed of poly-D-Lysine (PDL). However, this effect of GGTI-2133 is weaker than the effect of the observed compound on neurons cultured on an inhibitory substrate.
  • 11 is a bar graph showing the effect of GGTI-2133 on cell survival. Cortical neurons grown on a permissive substrate (PDL) are treated with different concentrations of GGTI-2133 (abscissa). A slight positive effect is observed on the survival of GGTI-2133 cells. In culture conditions on inhibitory substrate (myelin) no effect of the compound on the survival of neurons is observed.
  • the abscissa represents the culture conditions that is to say the test compound and its concentration and ordered the percentage of the number of cells.
  • the purpose of this example was to identify novel compounds that can decrease the density of the glial scar following spinal cord injury.
  • an in vitro model of astrocyte migration was used: the colonization of an injury performed in a mat of confluent astrocytic cells (scratch assay). Small commercial molecules (sigma-aldrich) were tested to identify candidates with an inhibitory effect on astrocyte migration.
  • Tissues are enzymatically dissociated in 9 mL of Trypsin-EDTA (Gibco Trade Mark) 0.5% diluted
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • Complete DMEM 1 mM sodium / pyruvate (Gibco brand filed), 3mM penicillin (Sigma trademark) and 0.8mM streptomycin (Sigma trademark) (hereinafter referred to as "Complete DMEM").
  • the mixture was incubated at 37 ° C for 10 min and then an additional 10 min at 37 ° C in the presence of DNAse (1 mg / mL, Sigma trademark) to remove cell DNA released during trypsin treatment.
  • the cell suspension was then centrifuged for 1 min at 800 rpm.
  • the pellet was taken up in 5 mL of complete DMEM.
  • the suspension is sieved to remove cell clumps (70 ⁇ m, BD Falcon) and washed with about 20 ml of complete DMEM.
  • After centrifugation for 5 minutes at 800 rpm the pellet was taken up in 24 ml of complete DMEM and then placed in 3 dishes of 75 cm 2 (Techno Plastic AG Switzerland registered trademark) due to 8 ml per dish.
  • the medium was renewed after 24 hours of incubation to remove the dead cells and then performed every 48 hours until reaching confluence (after about a week).
  • the cultures were then stirred for 12 hours at 250 rpm (Heidolph Titramax 100 shaker) at room temperature and then re-seeded in 8 dishes and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 'at confluence.
  • the cell purity was evaluated at 95% (immunocytochemical labeling with an antibody directed against the GFAP protein).
  • the wells of a 96-well plate were previously incubated for 1 h at 37 ° C. with 50 ⁇ l of poly-D-lysine (10 ⁇ g / ml, Sigma registered trademark). ). The wells were then rinsed three times with 100 ml of filtered distilled water and dried. Each well was inoculated with 20,000 cells from a confluent primary culture of astrocytes. For this, the cells were resuspended with trypsin, rinsed and counted in the Malassez cell (Microgravure Preciss registered trademark) and 100 ⁇ L a cell suspension at 200,000 cells / mL, were deposited in each well.
  • Malassez cell Microgravure Preciss registered trademark
  • the culture medium used was Minimum Essential Medium (MEM, Invitrogen trademark, ref 11090-081) supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco trademark), 1mM sodium / pyruvate (Gibco registered trademark), 2mM of glutamine (Sigma trademark), 3mM penicillin (Sigma trademark) and 0.8mM streptomycin (Sigma trademark).
  • MEM Minimum Essential Medium
  • the use of MEM rather than DMEM is justified by a lower concentration of fluorescent elements, which reduces the background noise during acquisition with the flash cytometer.
  • the culture was automated using a TECAN Miniprep 75/2 robot.
  • the cells thus deposited in the plates were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 24 hours before depositing the compounds to be tested.
  • the molecules were tested at different concentrations. Each final concentration is obtained by depositing in the wells 2 .mu.l of a stock solution of the compound prepared in 25% DMSO. The compounds are distributed in an automated manner by a TECAN Miniprep 75/2 robot in the wells containing 100 ⁇ l of culture medium. The final concentration of DMSO is thus identical for each condition and equal to 0.5%. In each plate columns 1 and 12 are systematically reserved for the negative control (DMSO 0.5%).
  • a "scratch" or injury
  • a brush provided with 96 metal peaks (VP scientific; ref VP408FH).
  • 3 passes with the brush were performed ( Figure 1).
  • Figure 2 shows the appearance of the well just after the injury was created and the calcein staining. The scratch appears as a black surface devoid of cells.
  • the effect of test compounds on astrocyte migration is measured by calculating the area that was not recolonized by the cells after 3 days of incubation (J3), (black surface). This parameter is measured by the program in an automated way for all the wells of each plate. Thus, the larger the area of the lesion on day 3, the more the compound inhibits migration. This program also makes it possible to discriminate between toxic compounds (the surface at J3 is greater than the area at OJ) of those blocking migration or having no effect ( Figure 3).
  • statins (simvastatin, fluvastatin, lovasatin) were selected for their inhibitory effect on astrocyte migration.
  • the IC50 inhibition of astrocyte migration of simvastatin and lovastatin is shown in Figure 4.
  • Statins inhibit cholesterol synthesis, by acting on I 1 HMG-CoA reductase, an enzyme that transforms 3- hydroxy-3-methylglutaryl-CoA at L-mevalonate.
  • RhoA protein in particular is a therapeutic target known in the context of the medullary lesion (cethrin / Ba-210, Alseres therapeutics).
  • the inventors of the present invention sought to determine whether the inhibitory effect of statins on astrocyte migration was due to indirect inhibition of GTPase prenylation.
  • inhibitors of the prenylation of Rho proteins, Rac1, cdc42, GGTase type I inhibitors, on the astrocyte migration test (scratch assay) were tested.
  • Example 2 Effect of inhibitors of geranylgeranyl transferase type I on astrocyte migration in vitro.
  • the purpose of this example was to determine the action of a type of prenylation inhibitors on astrocyte migration in vitro.
  • the targeted enzyme here is geranyl geranyl transferase type I (GGTase I), inhibited by GGTI-298 compound, C 27 H 33 N 3 O 3 SC 2 HF 3 O 2 and GGTI-2133, C 27 H 2B N 4 O 3 -C 2 HF 3 O 2 , (Sigma trademark).
  • the compounds were tested in primary astrocyte cultures at several concentrations ranging from 10 ⁇ M to 0.5 nM, in particular 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 50 ⁇ M, 5 nm and 0.5 nM (FIGS. 6, 7) on the model.
  • astrocyte migration according to the protocol described in Example 1.
  • Lovastatin 10 .mu.M and 1 .mu.M (Sigma) was used as a positive control.
  • Astrocyte culture in 96-well plates The protocol used is identical to that described in Part A-2 of Example I.
  • FIGS. 6 and 7 show the percentage inhibition of astrocyte migration relative to the negative control well after three days of incubation as a function of the treatment administered, that is to say, respectively test of the compound of formula XXIV (GGTI- 298) and the compound of formula XXIII (GGTI-2133) at the following different concentrations: 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 50 ⁇ M, 5 ⁇ M and 5 nM for compound GGTI-298 and 100 ⁇ M, 50 ⁇ M, 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 50 ⁇ M , 5OnM and 5 nM for the compound GGTI-2133.
  • Figure 6 shows the results obtained with GGTI-298.
  • this figure represents the percentage inhibition as a function of the concentration of GGTI-298 in the culture medium.
  • the different concentrations tested were 0 ⁇ M, 5 ⁇ M, 50 ⁇ M, 5 nM and 0.5 nM.
  • the GGtase type I inhibitor used showed a classical dose effect with a significant inhibition efficiency of cell migration compared with the negative control, lovastatin at 10 ⁇ M. It is equivalent to that of lovastatin at a concentration of 1 ⁇ M ( Figure 6).
  • the inventors have thus shown here that the compound GGTI-298 inhibitor of GGTase I is capable of mimicking the effect of lovastatin on the astrocyte migration test. Therefore, it appears that the effect of lovastatin on astrocyte migration is at least partially due to an inhibition of the prenylation of GGTase type I target GTPases.
  • Mevalonate sensitizes the nociceptive transmission in the mouse spinal cord. Bread 134, 285-292. [13]). It has been shown in this paper that a local application on the spinal cord of GGTI-2133 was only able to inhibit mevalonate-induced hyperalgesia.
  • Figure 7 shows the results obtained with GGTI-2133.
  • this figure represents the percentage inhibition as a function of the concentration of GGTI-2133 in the culture medium.
  • the different concentrations tested were 100 ⁇ M, 50 ⁇ M, 25 ⁇ M, 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 50 ⁇ M and 5 nm.
  • Lovastatin corresponds to the negative control and was used in a concentration of 10 .mu.M and 1 .mu.M.
  • GGTI-2133 at the various concentrations tested inhibited astrocyte cell migration in vitro (FIG. 7).
  • the inventors have also surprisingly demonstrated that GGTI-2133 has a similar action to the compound GGTI-298 and that it is not toxic on astrocytes even at high concentration (100 ⁇ M and 50 ⁇ M).
  • Figure 8 shows the inhibition curve of the concentration of astrocyte migration as a function of the decimal logarithm of the concentration of the test compound. From this curve, the 50% inhibition concentration of the astrocyte migration (IC50) of the GGTI-2133 compound was evaluated at approximately 30 ⁇ M (FIG. 8), according to the protocol described in the Yung-Chi Cheng document. , William H prussof: Relationship between the constant inhibition and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction - Biocher. Pharmacol (Basso, D.M., Beattie, M.S., and Bresnahan, J.C. (1995), A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats, Journal of Neurotrauma 12, 1-21 [14]).
  • Example 3 Analysis of the ability of the GGTI-2133 compound to promote neuritic growth of neurons cultured on an inhibitory substrate (myelin) and cellular toxicity.
  • the homogenization buffer is composed of 1 mM Tris-HCl, 1 1.5 mM CaCl 2, 1 mM spermidine (Sigma), aprotinin 25 ⁇ g / ml (Sigma trademark), leupeptin 25 ⁇ g / ml (Sigma registered trademark), pepstatin At 5 ⁇ g / ml (Sigma trademark), 2.3 dehydro 2-desoxy-N-acetylneuraminic acid 15 ⁇ g / ml (Sigma trademark), sucrose pH 7.4.
  • the proteins contained in the homogenization buffer are protease inhibitors, with the exception of the 2,3 dehydro-2-desoxy-N-acetylneuraminic which protects the sugar groups of the proteins.
  • the homogenate was centrifuged at 500g for 10 min to remove the waste and the cores, denser than the other constituents. The supernatant was recovered and then separated on a three-phase sucrose gradient (19%, 25.5% and 35.5%) in an ultracentrifuge for 3h, 54000g at 4 ° C to separate plasma membranes from myelin. The fraction containing myelin corresponding to interphase 19 / 25.5% sucrose was washed several times and then removed. For each preparation, the amount of myelin to be used to have the desired inhibitory properties on the neurite shoot has been defined.
  • the 96-well plates were coated with Poly-D-Lysine for 2 hours at 37 ° C. and then 40 ⁇ l of the myelin preparation were deposited per well. The plates were allowed to dry under host for 12 hours.
  • a pregnant mouse (January) was euthanized by elongation of the cervical vertebrae and the 15.5 day embryos were removed from the uterus and placed in cold HBSS. After extracting the embryos from their amniotic pocket, the brains were recovered and dissected under a binocular loupe. The anterior part of the brain was cut off and the two hemispheres were separated, and the meninges removed. The cortex was dissected and placed in a 15 mL falcon (Trade Mark) tube containing HBSS and kept cold; At the end of the dissection, HBSS was replaced with 1 ml of 5 mg / mL trypsin (sigma trademark) to dissociate the tissues.
  • falcon Trade Mark
  • FIG. 9 represents the percentage of neuritic growth obtained in the presence of myelin and in the presence of myelin and of GGTI-2133 compound at the following concentrations: 15 ⁇ M, 10 ⁇ M and 5 ⁇ M.
  • the negative control corresponds to myelin alone and the positive control to the presence of a permissive subtrate Poly-D-lysine (PDL).
  • FIG. 10 represents the percentage of neuritic growth obtained in the absence of myelin and in the presence of myelin and of the compound GGTI-2133 at the following concentrations: 15 ⁇ M, 10 ⁇ M and 5 ⁇ M.
  • the results obtained by the inventors and represented in FIGS. 9 and 10 clearly demonstrate that GGTI-2133 makes it possible to stimulate neurite growth in the presence of myelin (FIG. 9) more significantly than on a permissive substrate (Poly-D-lysine). , Figure 9). This clearly demonstrates that at least one aspect of this stimulation is a response of neurons specific to inhibitory signals.
  • the compound GGTI-2133 exhibits no cellular toxicity and this surprisingly compared with the statins which they are at the concentrations used, on cortical neurons. Indeed, the inventors have demonstrated that regardless of the concentration of compound GGTI-2133, namely 15 ⁇ M, 10 ⁇ M or 5 ⁇ M, no toxicity has been observed on the cells as shown in FIG. 11 represents the percentage of the number of cells present in the culture as a function of the presence in the culture medium of GGTI-2133 at a concentration of 15 ⁇ M, 10 ⁇ M and 5 ⁇ M alone or in the presence of myelin.
  • GGTI-2133 is a compound that can be used according to the present invention for the treatment of the spinal cord because of its safety on this tissue, its inhibitory action on the model of formation of the glial scar (astrocyte migration) its stimulating effect on a model of neuronal regeneration in an inhibitory environment (neuronal growth on myelin).
  • geranylgeranyl transferase type I inhibitors could be used in the treatment of lesions of the central nervous system, in particular the lesions of the spinal cord.
  • the compounds of the present invention may be formulated in a liquid composition adapted for intramedullary administration by means of a syringe, for example in a vehicle solution composed of 0.9% NaCl, 0.5% to 20% DMSO, or 0.9% NaCl, 5% DMSO, 5% Cremophore or any other animal or vegetable oil of the compound of formula XXIII.
  • Example 5 Treatment of rats having suffered a spinal cord injury.
  • the lesion causes a loss of rat motility in the hind limbs.
  • the study of post-lesional motor recovery is performed by the BBB test at 1, 7, 14, 21, 28 and 35 days postoperatively. This motor test was developed by Drs. Basso, Beattie and Breshnahan at Ohio State University (Basso, DM, Beattie, MS, and Bresnahan, JC (1995).) A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats, Journal of Neurotrauma 12, 1-21 [14]).
  • This scoring system makes it possible to precisely analyze the voluntary movements of the hind legs of the animal.
  • the rat is placed in a standardized open field of
  • This score takes into account the mobility of the hip, knee and ankle joints, the weight support, the position of the steps during walking and their coordination, and the position of the tail.
  • Rho signaling pathway targeted to promote spinal cord repair. J Neurosci 22, 6570-6577.
  • Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature 416, 636-640
  • thermostabilized chABC enhances axonal sprouting and functional recovery after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des composés de formule (I). En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation de ces composés comme médicament, en particulier pour le traitement de lésions du système nerveux central, notamment le traitement des lésions de la moelle épinière. La présente invention trouve notamment une application dans les domaines de la médecine et vétérinaire.

Description

UTILISATION D'INHIBITEURS DE GERANY-GERANYL TRANSFERASE DANS LE TRAITEMENT DES LESIONS DE LA MOELLE EPINIERE
DESCRIPTION
Domaine technique
La présente invention se rapporte à des composés de formule générale (I). En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation de ces composés comme médicament. La présente invention trouve notamment une application dans les domaines de la médecine humaine et vétérinaire.
Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ([ ]) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
La lésion de la moelle épinière est une pathologie qui compte environ 35000 nouveaux cas par an dans le monde. Elle est d'origine traumatique (80%) ou médicale (20%). L'étiologie de ce traumatisme est dominée par l'accidentologie de la voie publique (60%), suivie des chutes de grandes hauteurs (accident du travail, tentatives de suicide) et des accidents de sport (plongeon, parapente). La nature de l'étiologie explique que la prédominance des blessés médullaires soit des sujets jeunes (20-30 ans) et masculins (3,5 hommes pour 1 femme). On compte dans le monde environ 2,5 millions de personnes atteintes d'une lésion irréversible de la moelle épinière.
La lésion médullaire entraîne des disfonctionnement de la motricité volontaire (paralysies) ou réflexe (spasticité), des douleurs chroniques, des troubles sensitifs de type superficiels (sensations cutanées) ou profonds (position du corps dans l'espace), des troubles neuro-végétatifs (variation brutale de la température ou de la pression artérielle), des troubles génito- sexuels, des troubles vésicaux et intestinaux (sphincters spasmodiques ou flasques), et des troubles respiratoires en cas de lésion cervicale haute,
La réponse biologique faisant suite à une lésion de la moelle épinière peut être divisée en 3 étapes : une phase aigϋe, secondaire puis chronique. Lors de la phase aigϋe qui débute dans les secondes suivant le traumatisme on assiste à une nécrose des cellules dans la zone de lésion avec déversement du contenu cellulaire (ions, glutamate) dans le milieu extracellulaire, ce qui est susceptible d'entraîner la mort d'autres cellules. On observe aussi l'apparition de petits œdèmes dus à la rupture de la barrière hémato-méningée. La phase secondaire qui débute dans les minutes suivant la lésion est dominée par l'extension de la lésion, la réponse immunitaire et la mort cellulaire par apoptose. Lors de la phase chronique qui s'étale sur les mois et années suivant la lésion on observe une démyélinisation des neurones ainsi que la l'apparition d'une cicatrice gliale majoritairement constituée d'astrocytes mais aussi d'oligodendrocytes (Fawcett, J.W., and Asher, R.A. (1999). The glial scar and central nervous System repair. Brain research bulletin 49, 377-391. [1]). Les astrocytes contribuent au maintien de la barrière hématoencéphalique qui limite le système nerveux central. Ils forment un réseau tridimensionnel entre les neurones et contribuent à leur bon développement et leur survie. Chez l'adulte et dans des conditions normales, les astrocytes sont immobiles, de forme étoilée, sans orientation privilégiée dans la substance grise où ils sont majoritaires tandis qu'ils sont allongés et organisés de manière rostro-caudale dans la substance blanche. Les astrocytes de la cicatrice gliale sont caractérisés par une hyperplasie et une hypertrophie. On assiste à une réorientation de ces derniers vers le site d'inflammation. Division, allongement et migration des astrocytes vers la lésion conduisent à la formation de la cicatrice gliale. Les astrocytes vont exprimer à leur surface des protéines hautement glycosilées et sulfatées, les protéoglycans, molécules inhibitrices de la repousse neuronale. Ces cellules ainsi hyperactivées vont former un maillage serré constituant une barrière physique et chimique inhibant la repousse axonale. On trouve aussi au sein de la cicatrice gliale des oligodendrocytes, dont la myéline qui entoure les prolongements neuronaux d'une gaine protectrice. Depuis quelques années il a été mis en évidence un nombre croissant de molécules exprimées à la surface de la myéline, et présentant des caractéristiques inhibitrices pour la pousse neuritique. Parmi les plus connues, on retrouve les protéines Nogo, Myelin Assocoiated Glycoprotein (MAG) et Oligodendrocyte Myelin Glycoprotein (Omgp) dont le signal inhibiteur est médié par le récepteur NogoR. L'activation de ce récepteur conduit à la transmission d'un signal vers l'actine via la voie de signalisation Rho / Rho kinase, qui participe à l'inhibition de la régénération neuronale (Wang, K.C., Kim, J.A., Sivasankaran, R., Segal, R., and He, Z. (2002). P75 interacts with the Nogo receptor as a co-receptor for Nogo, MAG and OMgp. Nature 420, 74- 78 [15])., ( Wong, ST., Henley, J.R., Kanning, K.C., Huang, K.H., Bothwell, M., and Poo, M. M. (2002). A p75(NTR) and Nogo receptor complex médiates répulsive signaling by myelin-associated glycoprotein. Nat Neurosci 5, 1302-1308. [16]).
La prénylation est une modification post-traductionnelle irréversible qui consiste en un greffage covalent, par liaison thioéther, d'un lipide isoprénique, famésylpyrophosphate (15 atomes de carbones) ou géranylgéranylpyrophosphate (20 atomes de carbones), sur une séquence consensus de l'extrémité COOH-terminale de la protéine, généralement une GTAPase. Le rôle de la prénylation est majeur car il intervient dans la localisation subcellulaire des protéines et ainsi dans leur mode de fonctionnement. Trois enzymes sont impliquées dans la prénylation : la farnésyl transférase (FTase) et la géranylgéranyl transférase de type I (GGTase I) reconnaisssent les protéines à motif CAAX alors que la géranylgéranyl transférase de type II (GGTase II) reconnaît les motifs XCC ou CXC (Zhang, F. L., and Casey, PJ. (1996). Protein prénylation: molecular mechanisms and functional conséquences. Annual review of biochemistry 65, 241-269. [2]). La nature de l'isoprène transféré dépend de la nature de l'acide aminé X. Ainsi la FTase réagit avec la séquence CAAX lorsque X est par exemple une serine ou une méthionine. Lorsque X est une leucine, isoleucine ou phénylalanine, la protéine est reconnue par la GGTase I. Il existe des inhibiteurs de ces enzymes extrêmement sélectifs, et des inhibiteurs de la FTase (lonafarnib, tipifarnib) sont impliqués dans des essais cliniques de traitement de certains cancers dans lesquels on retrouve une suractivation de la protéine Ras. Parmi les cibles de la GGtase I on trouve les petites GTPases de la famille Rho (RhoA, RhoC, Rac1 , Rac2, cdc42) connues pour leur implication dans la survie et la motilité cellulaire. La protéine RhoA en particulier est une cible pour le traitement de la lésion médullaire (Dergham, P., Ellezam, B., Essagian, C, Avedissian, H., Lubell, W.D., and McKerracher, L. (2002). Rho signaling pathway targeted to promote spinal cord repair. J Neurosci 22, 6570-6577. [3]). Par ailleurs des recherches récentes indiquent que Rac1 pourrait être impliqué dans la persistance de la douleur neuropathique après une lésion médullaire (Tan, A.M., Stamboulian, S., Chang, Y. W., Zhao, P., Hains, A.B., Waxman, S. G., and Hains, B.C. (2008). Neuropathic pain memory is maintained by Rad-regulated dendritic spine remodeling after spinal cord injury. J Neurosci 28, 13173-13183. [4])
De nombreuses voies de recherche ont été explorées afin de développer des traitements pour les personnes souffrant de para ou tétraplégie associées à une lésion médullaire.
Par exemple, des traitements chez des rats comprenant l'injection au site de lésion d'une enzyme capable de digérer les chaînes sulfatées des protéoglycanes, la chondroïtinase ABC permet de restaurer partiellement les fonctions neurologiques (Bradbury, EJ., Moon, L. D., Popat, R. J., King, V.R., Bennett, G.S., Patel, P.N., Fawcett, J.W., and McMahon, S.B. (2002). Chondroitinase ABC promûtes functional recovery after spinal cord injury. Nature 416, 636-640. [5]). Un anticorps dirigé contre la protéine Nogo a été testé dans un modèle de lésion médullaire cervicale chez le primate et a conduit à des résultats controversés (Freund, P., Schmidlin, E., Wannier, T., Bloch, J., Mir, A., Schwab, M. E., and Rouiller, E.M. (2006). Nogo-A- specific antibody treatment enhances sprouting and functional recovery after cervical lésion in adult primates. Nature medicine 12, 790-792. [6] ; Freund et al. Freund, P., Schmidlin, E., Wannier, T., Bloch, J., Mir, A., Schwab, M. E., and Rouiller, E.M. (2009). Anti-Nogo-A antibody treatment promotes recovery of manual dexterity after unilatéral cervical lésion in adult primates--re-examination and extension of behavioral data. Eur J Neurosci 29, 983-996. [7]). La greffe de microtubes d'hydogel recouverts de facteurs de croissance et/ou de chondroitinase ABC thermostable permet d'augmenter la récupération motrice (Lee, H., McKeon, RJ. , and Bellamkonda, R.V. (2009). Regenerative Medicine Spécial Feature: Sustained delivery of thermostabilized chABC enhances axonal sprouting and functional recovery after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. [8]). Des greffes cellulaires sont aussi envisagées, ainsi des précurseurs d'oligodendrocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été greffés chez des rats adultes à différents temps après une lésion de la moelle épinière, à 7 jours ou 10 mois. Les cellules transplantées ont survécu et se sont différenciées en oligodendrocytes, migrant de quelques millimètres et ont permis pour les individus traités à 7 jours une remyélinisation des axones et une récupération partielle de la locomotion (Sharp, J., Frame, J., Siegenthaler, M., Nistor, G., and Keirstead, H. S. (2009). Human embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor CeII Transplants Improve Recovery after Cervical Spinal Cord Injury. Stem cells (Dayton, Ohio). [9]). D'autres voies basées sur l'administration de petites molécules chimiques permettant de favoriser la régénération sont actuellement étudiées, comme les composés capables de bloquer le récepteur de l'Epidermal Growth Factor (Koprivica, V., Cho, K. S., Park, J. B., Yiu, G., Atwal, J., Gore, B., Kim, J. A., Lin, E., Tessier-Lavigne, M., Chen, D. F., He, Z. (2005) . EGFR activation médiates inhibition of axon régénération by myelin and chondroitin sulfate proteoglycans. Science vol 310: 106-110 [17]) ou comme le brillant blue G (Peng, W., Cotrina, M. L., Han, X., Yu, H., Bekar, L., Blum, L., Takano, T., Tian, CF., Goldman, S.A., and Nedergaard, M. (2009). Systemic administration of an antagonist of the ATP-sensitive receptor P2X7 improves recovery after spinal cord injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 12489-12493 [10]).
Des essais cliniques sont actuellement en cours, cependant aucun à l'heure actuelle n'a permis d'obtenir des résultats fiables et concluants chez l'homme. Par ailleurs, il n'existe pas actuellement de traitements de la lésion de la moelle épinière permettant une régénération axonale et une récupération de la motricité. En effet, pour les molécules et procédés de l'art antérieur, la présence de la cicatrice gliale empêche la repousse neuronale et donc la récupération de la motricité.
Il existe donc un réel besoin de trouver des molécules et/ou des procédés de traitement palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier un médicament et/ou molécule permettant de favoriser la repousse axonale et ainsi notamment d'améliorer le tableau clinique des patients souffrant de traumatismes médullaires
Description de l'invention
La présente invention permet précisément de résoudre les problèmes et inconvénients précités de l'état de la technique en fournissant des composés de formule (I) et leur utilisation comme médicament.
Par ailleurs, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'inhibiteurs de géranyl-géranyl transférases pour le traitement des lésions de la moelle épinière.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation du composé de formule (I)
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables ; dans lequel,
Ri est un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6, un aryle en C6 à C10 ou un cation de métal alcalin (Na+, K+) :
R2 est un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6, un alcoxy en Ci à C6, un aryle en C6 à C10, un atome d'halogène (F, Cl, Br, I), -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -SO3H, -NHNH2, - SH, -NH2, HO-NH-, isobutyl, secbutyle ou benzyle ;
R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6 ;
R5 est hétérocycle à cinq chainons ou un hétéroaryle en Ci à C6, pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, les composés de l'invention permettent de favoriser la repousse axonale et ainsi restaurer des liaisons nerveuses.
Avantageusement, les composés de l'invention permettent également d'inhiber la migration des astrocytes au niveau de la lésion de la moelle épinière.
Dans la présente, le terme "alkyle" désigne, par exemple un radical hydrocarbure saturé linéaire ou ramifié, cyclique ou acyclique. Le radical alkyle peut comprendre de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, plus particulièrement de 1 à 8 atomes de carbone, encore plus particulièrement de 1 à 6 atomes de carbone. Par exemple, un radical alkyle peut-être un radical méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, sec- pentyle, isopentyle, tert-pentyle, n-hexyle, sec-hexyle ou radicaux similaires.
Dans la présente, le terme "alcényle" désigne, par exemple un radical hydrocarbure insaturé linéaire ou ramifié, cyclique ou acyclique, comprenant au moins une double liaison carbone-carbone. Le radical alcényle peut comprendre de 2 à 20 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone, plus particulièrement de 1 à 8 atomes de carbone, encore plus particulièrement de 2 à 6 atomes de carbone. Par exemple, un radical alcényle peut-être un radical allyle, éthenyle, propenyle, butenyle, 1-méthyl-2-buten-l-yle ou radicaux similaires.
Dans la présente, le terme "alcynyle" désigne par exemple un radical hydrocarbure insaturé linéaire ou ramifié, cyclique ou acyclique, comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone. Le radical alcynyle peut comprendre de 2 à 20 atomes de carbone, de préférence de 2 à 10 atomes de carbone, plus particulièrement de 1 à 8 atomes de carbone, encore plus particulièrement de 2 à 6 atomes de carbone. Par exemple, un radical alcynyle peut-être un radical éthynyle, 2-propynyle (propargyie), 1-propynyle ou radicaux similaires.
Dans la présente, le terme "alcoxy" désigne un radical alkyle, comme défini ci-dessus, attaché au reste de la molécule via un atome d'oxygène. Comme indiqué précédemment, le radical alkyle peut comprendre de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, plus particulièrement de 1 à 8 atomes de carbone, encore plus particulièrement de 1 à 6 atomes de carbone. Par exemple, un radical alcoxy peut être un radical méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, n-butoxy, tert-butoxy, neopentoxy, n-hexoxy, ou un radical similaire. Dans la présente, le terme « aryle » désigne, par exemple un système hydrocarbure mono-, bi- ou tricyclique comprenant un, deux ou trois cycles satisfaisant la règle d'aromaticité de Hϋckel. Par exemple, un radical aryle peut être un groupe phényle, naphthyle, tétrahydronaphthyle, indanyle, indényle ou radicaux similaires. Les radicaux aryles peuvent comprendre de 6 à 20 atomes de carbone, notamment de 6 à 14 atomes de carbone, plus particulièrement de 6 à 10 atomes de carbone.
Dans la présente, le terme « alkylényl» désigne, par exemple un système hydrocarbure saturé divalent, linéaire ou ramifié, cyclique ou acyclique. Le radical alkylényl peut comprendre de 1 à 20 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10 atomes de carbone, plus particulièrement de 1 à 8 atomes de carbone, encore plus particulièrement de 1 à 6 atomes de carbone. Par exemple, un radical alkylényl peut-être un radical méthylènyl, éthylènyl, n-propylènyl, isopropylènyl, n-butylènyl, n- pentylènyl, n-hexylènyl, ou radicaux similaires.
Dans la présente, le terme « atome d'halogène » désigne, par exemple un atome choisi parmi le fluor, le chlore, le brome et l'iode.
Dans la présente, le terme «hétéroaryle » désigne un alkyle tel que défini précédemment comprenant un hétéro atome choisi parmi le souffre, l'azote et l'oxygène.
Dans la présente, les radicaux arylalkyles et alkylaryles peuvent comprendre, par exemple de 7 à 25 atomes de carbones, notamment de 7 à 20 atomes de carbone et en particulier de 7 à 15 atomes de carbone.
Dans un mode de réalisation préférée, R5 peut être choisi dans le groupe comprenant les hétérocycles suivants :
(H) (N) (III) (IV)
Oy- (V) (Vl) (VU) (VIII)
(IX) (X) (Xl) (XIi) (XlIl)
(XIV) (XV) (XVI) (XVII)
(XVIII) (XIX) (XX) (XXI) OU (XXII)
dans lequel, n est égale à 0, 1 ou 2 ; R1A représente H, Ci^alkyl ; R1D représente H ou Ci-ealkyl ou un hétéroalkyle en C1 à C4 avec au moins un hétéroatome choisi parmi l'azote et/ou le souffre.
Dans un mode de réalisation préférée, R2 peut être choisi dans le groupe comprenant l'isobutyle, secbutyle ou benzyle.
De manière encore plus préférée, R5 peut être de formule (XIV), dans lequel R1A représente H, et R1D représente H, ou le 2 amino2éthylthio
De manière préférée, le composé utilisé peut être le composé de formule (I) dans lequel
R1 représente H, R2 représente un isobutyle R3 représente H R4 représente H et
(RW)n^-(V
R5 est de formule V R1D (XIV) dans laquelle R1A représente H, et
R1D représente H, ou le composé utilisé peut être le composé de formule (I) dans lequel R1 représente CH3,
R2 représente un isobutyle
R3 représente H
R4 représente H et
R5 représente -CH-NH2-CH2-SH pour la fabrication d'un médicament.
De manière encore plus préférée, le composé utilisé peut être le composé de formule (XXIII)
(XXIII) ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables, ou le composé de formule (XXIV)
(XXIV) ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour la fabrication d'un médicament
De manière encore plus préférée, le composé utilisé peut être le composé de formule (XXIII). Dans la présente invention, on entend par inhibiteur de le géranyl géranyl transférase tous les composés connus de l'homme du métier et/ou disponible dans le commerce, il peut s'agir, par exemple des composés décrits dans le brevet américain US 6 693 123, US 6, 627 610, US 6 221 865, US 6 204 293, US 5 965 539 et US 5 789 558.
La présente invention a également pour objet les différents énantiomères des composés de l'invention précités.
L'homme du métier sait reconnaitre, de part ses connaissances générales, que différentes formes des composés décrits dans la présente peuvent être disponibles sous la forme de bases ou de sels, comme des stéréoisomères énantiomériquement pure et/ou des polymorphes. Sauf indication contraire dans le présent texte, l'indication d'un composé particulier, inclue les bases, sels, énantiomères et polymorphes des composés de l'invention, ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables, les racémates, les formulations énantiomériquement pures, les formes cristallines ou amorphes des composés de l'invention ainsi que leurs formes hydrates.
La présente invention a également pour objet les différents polymorphes des composés de l'invention. Par polymorphe, il est entendu des cristaux de molécules ayant différentes propriétés physiques due à l'arrangement des molécules dans le réseau cristallin.
Dans la présente, par « médicament » on entend, par exemple toute substance ou composé possédant des propriétés curatives et/ou préventives à l'égard de pathologies, lésions, traumatisme, maladies humaines ou animales. Il peut s'agir par exemple de produit pharmaceutique à usage humain et/ou vétérinaire.
Dans la présente, le médicament peut être sous toute forme connue de l'homme du métier, par exemple un comprimé, gélule, patch, sous forme liquide, par exemple une solution adaptée à l'administration orale, intra-péritonéale, intraveineuse, intramusculaire, transcutanée, ou intrathécale.
Dans la présente, selon un mode de réalisation particulier, le médicament peut être également sous la forme d'un pro-médicament. Selon la présente, par « pro-médicament » il est entendu un dérivé d'un composé qui comprend un groupement additionnel qui est susceptible d'être détaché in vivo de la molécule parente pour libérer le composé actif.
Par exemple, un pro-médicament peut être un ester qui est clivé in vivo afin de libérer le composé. L'homme du métier, de part ces connaissances générale connait les procédés permettant d'obtenir des pro-médicaments et saura adapter ces procédés afin d'obtenir un pro-médicament selon la présente invention.
De manière préférée, selon la présente invention, le médicament est un médicament destiné au traitement des lésions du système nerveux central, notamment au traitement des lésions de la moelle épinière.
Dans la présente, par lésion du système nerveux central, il est entendu lésion cérébrale ou de la moelle épinière.
Dans la présente, par lésion cérébrale, il est entendu, par exemple, une lésion cérébrale de type traumatique (traumatisme crânien) ou médicale (accident vasculaire cérébral, compression cérébrale).
Dans la présente, par « lésion de la moelle épinière », il est entendu, par exemple, une lésion de la moelle épinière de type traumatique ou médicale, par ischémie, par dégénérescence de la moelle due, par exemple une pathologie neurodégénérative ou par cancer comme les tumeurs intra médullaires ; la lésion peut-être par exemple une section totale de la moelle épinière séparant celle-ci en deux parties, une section partielle de la moelle épinière ou une compression médullaire d'origine traumatique ou médicale.
Dans la présente par « sels, esters ou ester de sels pharmaceutiquement acceptables », il est entendu, par exemple, des sels, ester et sels d'ester du composé de l'invention ou n'importe quel dérivé qui sont efficaces par exemple pour le traitement des lésions de la moelle épinière. Par exemple, il peut s'agir de sels, par exemple, des sels basiques ou acides. Les composés de l'invention peuvent être par exemple des sels d' hydrochiure, hydrobromure. Des sels pharmaceutiquement acceptables sont connus par l'homme du métier, par exemple, il peut s'agir des sels pharmaceutiquement acceptables décrits dans S. M. Berge et al., describe pharmaceutically acceptable salts in détail in J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19 [11]. Des sels pharmaceutiquement acceptables des composés de la présente invention comprennent ceux dérivés de bases et acides organique et/ou inorganiques. Des exemples de sels pharmaceutiquement acceptables, non toxiques sont par exemple des sels de groupe aminé formé avec un acide inorganique tel que l'acide hydrochlorique, l'acide bromique, l'acide phosphorique, l'acide sulfurique et perchlorique ou avec un acide organique tel que l'acide acétique, l'acide oxalique, l'acide maléique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide succinique ou malonique ou en utilisant d'autres méthode connues dans l'état de la technique comme échangeuse d'ions. D'autres sels pharmaceutiquement acceptables comprend en outre l'adipate, l'alginate, l'ascorbate, l'aspartate, le benzenesulfonate, le benzoate, le bisulfate, le borate, le butyrate, le camphorate, le camphorsulfonate, le citrate, le cyclopentanepropionate, le digluconate, le dodecylsulfate, l'éthanesulfonate, le formate, le fumarate, le glucoheptonate, le glycérophosphate, le gluconate, l'hémisulfate, l'heptanoate, l'hexanoate, le hydroiodide, le 2-hydroxy-éthanesulfonate, le lactobionate, le lactate, le laurate, le lauryl sulfate, le malate, le maleate, le malonate, le méthanesulfonate, le 2-naphthalènesulfonate, le nicotinate, le nitrate, l'oléate, l'oxalate, le palmitate, le pamoate, le pectinate, le persulfate, le 3- phénylpropionate, le phosphate, le picrate, le pivalate, le propionate, le stéarate, le succinate, le sulfate, le tartrate, le thiocyanate, le p- toluènesulfonate, l'undecanoate, le valérate et similaire. Des exemples de sels dérivés de bases appropriées comprennent les sels de métaux alcalin, de métaux alcalin terreux, d'ammonium et les sels N+(Ci-4alcyl)4.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un composé selon la présente invention ou un sel de celui-ci et un support pharmaceutiquement acceptable.
Dans la présente par « composition pharmaceutique » on entend une composition liquide, une émulsion, un onguent, une mousse, une pâte, un comprimé sécable, une gélule, un comprimé effervescent, un patch dermique ou un dispositif injectable, sans que la forme soit limitative. De préférence la composition pharmaceutique est une composition liquide, par exemple une composition adaptée pour une injection par une seringue, ou pompe.
Dans la présente par « support pharmaceutiquement » acceptable on entend un agent diluent inerte, tel que du sorbitol, du sucre, du mannitol, de la cellulose microcristalline, de l'amidon, de chlorure de sodium, du phosphate de sodium, du carbonate de calcium, du phosphate de calcium, du sulfate de calcium, du lactose, par exemple du lactose monohydrate.
Selon la présente invention, le composé de l'invention ou sel de celui- ci peut être utilisé dans une concentration comprise entre 1nM et 10OmM, de préférence entre 1μM et 1mM et, de manière encore plus préférée entre 10 μM et 1 mM
Selon un mode de réalisation de l'invention, dans la composition pharmaceutique, les composés de la présente invention peuvent être sous forme racémique ou sous forme énantiomériquement enrichie, voire pure.
Les composés de la présente invention ou sels de ceux-ci peuvent être également utilisés pour le traitement de lésions de la moelle épinière.
Par exemple, les composés de l'invention peuvent être administrés à un sujet à traiter, c'est-à-dire par exemple un sujet ayant une lésion de la moelle épinière.
Dans la présente par "traitement", il est entendu de manière générale que les composés de l'invention peuvent être utilisés indépendamment chez les hommes ou les animaux.
Dans la présente par "sujet à traiter", il est entendu, par exemple un être humain ou un mammifère. Il peut s'agir par exemple d'un sujet qui a une lésion traumatique ou pathologique de la moelle épinière.
Dans la présente par sujet, il est entendu un animal, de préférence un mammifère et de manière encore plus préférée un être humain.
Dans la présente par "animal", il est entendu des êtres humains ainsi que des êtres non humains, à n'importe quelle étape de leur développement, incluant par exemple des mammifères, des oiseaux, des reptiles et des poissons. En particulier, l'être non humain peut être un mammifère, par exemple un rongeur, une souris, un rat, un singe, un chien, un chat, un mouton, du bétail, un primate ou un porc. L'animal peut être également, par exemple un animal transgénique ou un clone humain.
Par exemple, les composés de la présente invention peuvent être administrés, par exemple une à trois fois par jour, une fois tous les deux jours, une fois tous les trois jours, quatre jours, cinq jours, six jours ou une fois par semaine. De préférence, les composés de la présente invention sont administrés par voie orale, intra-péritonéale, intraveineuse, intramusculaire, transcutanée, ou intrathécale.
Le composé de la présente invention peut être obtenu par tout procédé de synthèse chimique connu de l'homme du métier. On peut utiliser par exemple les procédés décrits dans le document Qian, Y., Vogt,
A., Vasudevan, A., Sebti, S.M., and Hamilton, A.D. (1998). Sélective inhibition of type-l geranylgeranyltransferase in vitro and in whole cells by
CAAL peptidomimetics. Bioorganic & médicinal chemistry 6, 293-299 [12] afin de produire les composés de la présente invention. D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
- Figure 1 représente schématiquement la technique de l'essai blessure ("scratch assay"). Elle représente un schéma d'une monocouche d'astrocytes en culture (A). Une blessure (z) est effectuée mécaniquement dans la monocouche (B), qui va se refermer dans le temps par recolonisation de la zone par les cellules (scratch assay) (C).
- Figure 2 : photographie d'un puits (p) de plaque de culture (pc) à 96 puits non représentée, représentant le marquage des cellules par la calcéine (marqueur fluorescent de cellules vivantes). La blessure (z) est visualisée par une surface noire dépourvue de cellules. - Figure 3 : photographies de 3 puits d'une plaque 96 puits montrant 3 conditions de traitement : un puits témoin négatif traité avec la solution véhicule ou avec un composé inactif dans lequel aucune rayure résiduelle n'est détectée (A), un puits traité par un composé bloquant la migration cellulaire (C), un puits traité par un composé toxique, ce qui génère une surface supérieure à la surface de départ, due à la mort cellulaire.
- Figure 4 représente des courbes montrant la concentration correspondant à 50% d'inhibition de la migration (IC50) de la simvastatine (A) et de la lovastatine (B) sur le test de migration d'astrocytes. L'abscisse représente le logarithme décimale de la concentration molaire et l'ordonné le pourcentage d'inhibition molaire.
- Figure 5 représente la voie de synthèse du cholestérol. Les statines agissent en amont en inhibant la synthèse du L-mevalonate par l'HMG- CoA réductase. A partir du mévalonate sont produits les résidus prénoïdes géranylgéranyl-pyrophosphate et farnésyl-pyrophosphate qui seront ancrés sur des protéines cibles par le biais des géranylgéranyl Transférases ou Farnésyl Transférase. - Figure 6 est un diagramme en bâton représentant l'inhibition de la migration d'astrocytes en culture dans le test de "scratch assay" par le composé de formule (XXIV) (GGTI-298) à différentes concentrations. L'effet est dépendant de la concentration du composé GGTI-298. Le contrôle positif est la lovastatine. L'ordonné représente l'inhibition de la migration et l'abscisse les conditions de culture c'est-à-dire le composé testé et sa concentration.
- Figure 7 est un diagramme en bâton représentant l'inhibition de la migration d'astrocytes en culture dans le test de "scratch assay" par le composé de formule (XXIII) (GGTI-2133). L'effet est dépendant de la concentration du composé. Le contrôle positif est la lovastatine. L'ordonné représente l'inhibition de la migration et l'abscisse les conditions de culture c'est-à-dire le composé testé et sa concentration.
- Figure 8 est une courbe de détermination de l'IC50 du composé GGTI- 2133 dans le modèle de scratch assay. L'abscisse représente le logarithme décimal de la concentration molaire et l'ordonné le pourcentage d'inhibition.
- Figure 9 est un diagramme en bâton représentant le pourcentage de la pousse neurique en fonction de la concentration du composé GGTI-2133. Ce composé stimule la pousse neuritique de neurones corticaux cultivés sur un substrat inhibiteur composé de myéline. La stimulation de la croissance neuritique est de 20% à la concentration de 15 μM de GGTI- 2133 dans le milieu de culture.
- Figure 10 est un diagramme en bâton représentant le pourcentage de pousse neuritique (ordonné) en fonction de la concentration de GGTI-2133
(abscisse). Le composé GGTI-2133 stimule la pousse neuritique de neurones corticaux cultivés sur un substrat permissif composé de poly-D- Lysine (PDL). Cependant cet effet de GGTI-2133 est plus faible que l'effet du composé observé sur des neurones cultivés sur un substrat inhibiteur. - Figure 11 est un diagramme en bâton représentant l'effet du composé GGTI-2133 sur la survie cellulaire. Des neurones corticaux cultivés sur un substrat permissif (PDL) sont traités avec différentes concentrations de GGTI-2133 (abscisse). Un léger effet positif est observé sur la survie des cellules du composé GGTI-2133. En condition de culture sur substrat inhibiteur (myéline) aucun d'effet du composé sur la survie des neurones n'est observé. L'abscisse représente les conditions de culture c'est-à-dire le composé testé et sa concentration et l'ordonné le pourcentage du nombre de cellules.
EXEMPLES
Exemple 1 : Sélection par criblage de composés capables d'inhiber la migration d'astrocytes in vitro.
L'objectif de cet exemple était de mettre en évidence de nouveaux composés capables de diminuer la densité de la cicatrice gliale à la suite d'une lésion de la moelle épinière. Pour cela un modèle in vitro de migration d'astrocytes a été utilisé : la colonisation d'une blessure effectuée dans un tapis de cellules astrocytaires confluentes (scratch assay). Des petites molécules commerciales (sigma-aldrich) ont été testées afin d'identifier des candidats présentant un effet inhibiteur sur la migration des astrocytes.
A Matériels et Méthodes
A. 1. Culture primaire d'astrocytes
Les cerveaux de 6 ratons âgés de 3 jours (Wistar.Janvier) ont été disséqués dans une solution Hank' Balanced Sait (HBSS pour « Hank'
Balanced Sait solution », Invitrogen marque déposée, ref 14170-138) à
4°C pour en prélever le cortex. Les tissus sont enzymatiquement dissociés dans 9 mL de Trypsine-EDTA (Gibco marque déposée) 0,5% diluée au
1/3 dans du Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM, Invitrogen, ref 61965059) complémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé
(Gibco marque déposée), 1 mM de sodium/pyruvate (Gibco marque déposée), 3mM de pénicilline (Sigma marque déposée) et 0,8 mM de streptomycine (Sigma marque déposée) (nommé par la suite "DMEM complet").
Le mélange a été incubé à 37°C pendant 10 min puis 10 min supplémentaires à 37°C en présence de DNAse (1 mg /mL, Sigma marque déposée) afin d'éliminer l'ADN cellulaire libéré lors du traitement à la trypsine. La suspension cellulaire a ensuite été centrifugée 1 min à 800 tours par minute. Le culot a été repris dans 5 mL de DMEM complet. Après dissociation mécanique, la suspension est passée sur un tamis pour éliminer les amas cellulaire (70 μm, BD Falcon) et lavé avec environ 20 mL de DMEM complet. Après centrifugation 5 min à 800 tours par minute, le culot a été repris dans 24 mL de DMEM complet puis placé dans 3 boites de 75 cm2 (Techno Plastic AG Switzerland marque déposée) en raison de 8 mL par boîte. Le milieu a été renouvelé après 24 heures d'incubation pour éliminer les cellules mortes puis effectué toutes les 48 heures jusqu'à atteindre la confluence (au bout d'environ une semaine). Afin d'éliminer les cellules microgliales, les cultures ont ensuite été agitées 12 heures à 250 tours par minute (agitateur Heidolph Titramax 100) à température ambiante puis ré-ensemencées dans 8 boites et incubées à 37°C, 5 % de CO2 jusqu'à confluence. La pureté cellulaire a été évaluée à 95% (marquage immuno-cytochimique avec un anticorps dirigé contre la protéine GFAP).
A.2. Mise en culture des astrocytes en plaques 96 puits
Afin d'augmenter l'adhérence cellulaire, les puits d'une plaque 96 puits (Fisher marque déposée) ont été préalablement incubés 1 h à 37°C avec 50 μL de poly-D-lysine (10 μg/mL, Sigma marque déposée). Les puits ont été ensuite rincés trois fois avec 100 mL d'eau distillée filtrée puis séchés. Chaque puits a été ensemencé avec 20 000 cellules provenant d'une culture primaire confluente d'astrocytes. Pour cela, les cellules ont été remises en suspension à l'aide de la trypsine, rincées puis comptées à la cellule de Malassez (Microgravure Preciss marque déposée) et 100 μL d'une suspension cellulaire à 200 000 cellules/mL, ont été déposés dans chaque puits. Le milieu de culture utilisé était du Minimum Essential Médium (MEM, Invitrogen marque déposée, ref 11090-081) complémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (Gibco marque déposée), 1mM de sodium/pyruvate (Gibco marque déposée), 2mM de glutamine (Sigma marque déposée), 3mM de pénicilline (Sigma marque déposée) et 0,8mM de streptomycine (Sigma marque déposée). L'emploi de MEM plutôt que de DMEM se justifie par une plus faible concentration en éléments fluorescents, ce qui diminue le bruit de fond lors de l'acquisition avec le flash-cytomètre. La mise en culture a été automatisée à l'aide d'un robot TECAN Miniprep 75/2.
Les cellules ainsi déposées dans les plaques ont été incubées à 37°C, 5 % CO2 durant 24h avant le dépôt des composés à tester.
A.3. Préparation et dépôt des molécules à tester
Les molécules ont été testées à différentes concentrations. Chaque concentration finale est obtenue par dépôt dans les puits de 2 μl d'une solution mère du composé préparée dans 25% DMSO. Les composés sont distribués de manière automatisée par un robot TECAN Miniprep 75/2 dans les puits contenant 100 μl de milieu de culture. La concentration finale de DMSO est ainsi identique pour chaque condition et égale à 0,5%. Dans chaque plaque les colonnes 1 et 12 sont réservées systématiquement au contrôle négatif (DMSO 0,5%). Quatre heures après le dépôt des composés, un « scratch » (ou blessure) est réalisé dans la monocouche de cellules confluentes à l'aide d'une brosse munie de 96 pics métalliques (VP scientific ; ref VP408FH). Pour éviter les dépôts cellulaires dans la blessure, 3 passages avec la brosse ont été réalisés (Figure 1 ). A.4. Suivi de la migration des astrocytes
Soixante-douze heures (J3) après le dépôt des composés à tester les cellules vivantes ont été rendues fluorescentes par traitement à la calcéine Acétoxyméthyl (Calbiochem marque déposée), (concentration finale de 4 μg/mL et incubée 40 min à 37°C). 15 μL d'une solution d'hémoglobine de bœuf (Sigma marque déposée) à 100 mg/mL ont été ajoutés afin de diminuer l'auto fluorescence du milieu de culture. Chaque puits a été photographié à l'aide d'un flash-cytomètre développé par la société Trophos. L'analyse des résultats a été réalisée avec le logiciel Metamorph (marque déposée). Ainsi, un programme répondant aux spécificités du criblage a été créé permettant une analyse automatisée de tous les puits de chaque plaque. Les cellules traitées avec la calcéine, fluorescentes, apparaissent blanches sur les photos. La figure 2 montre l'apparence du puits juste après la création de la blessure et le marquage à la calcéine. Le scratch apparaît comme une surface noire dépourvue de cellules. L'effet des composés testés sur la migration des astrocytes est mesuré par le calcul de la surface qui n'a pas été recolonisée par les cellules après 3 jours d'incubation (J3), (surface noire). Ce paramètre est mesuré par le programme de manière automatisé pour tous les puits de chaque plaque. Ainsi, plus la surface de la lésion à J3 est élevée plus le composé inhibe la migration. Ce programme permet de plus de discriminer les composés toxiques (la surface à J3 est supérieure à la surface à JO) de ceux bloquant la migration ou n'ayant pas d'effet (Figure 3).
A.5. Analyse statistique
Les données ont été soumises à une analyse de variance (Anova) suivi d'un post test de Dunnett. Toutes les analyses ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 4. Chaque expérience a été effectuée en triplicate. B. Résultats
Parmi les molécules testées 3 statines (simvastatin, fluvastatin, lovasatin) ont été sélectionnées pour leur effet inhibiteur sur la migration des astrocytes. L'IC50 d'inhibition de la migration des astrocytes de la simvastatine et de la lovastatine sont présentés dans la Figure 4. Les statines inhibent la synthèse du cholestérol, en agissant sur I1HMG-CoA réductase, une enzyme qui transforme le 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-CoA en L-mévalonate.
Dans la voie de synthèse du cholestérol, se trouve une bifurcation qui permet l'addition de radicaux prénoïdes sur des protéines de type GTPases (Figure 5). Il existe 3 enzymes de prénylation, chacune ayant des cibles spécifiques, la Farnésyltransférase modifie la protéine Ras alors que la géranylgéranyl transférase type I (GGTase I) modifie entre autres les enzymes RhoA, Rac, et cdc42 et la GGTase II a pour cible RhoB. Le processus de prénylation de ces GTPases permet leur ancrage à la membrane et leur accessibilité aux facteurs d'échange du GDP (facteurs GEF), ce qui assure leur recyclage (Figure 5). Ces GTPases sont connues pour leur rôle dans la dynamique des filaments d'actine, la migration et la survie cellulaire. La protéine RhoA en particulier est une cible thérapeutique connue dans le cadre de la lésion médullaire (cethrin/Ba- 210, Alseres therapeutics). Les inventeurs de la présente invention ont voulu déterminer si l'effet inhibiteur des statines sur la migration des astrocytes était dû à une inhibition indirecte de la prénylation des GTPases. Pour cela des inhibiteurs de la prénylation des protéines Rho, Rac1 , cdc42, les inhibiteurs de GGTase de type I, sur le test de migration des astrocytes (scratch assay) ont été testés.
Exemple 2 : Effet d'inhibiteurs de la géranylgéranyl Transférase de type I sur la migration d'astrocyte in vitro. L'objectif de cet exemple était de déterminer l'action d'un type d'inhibiteurs de prénylation sur la migration des astrocytes in vitro. L'enzyme ciblée ici est la géranyl géranyl transférase de type I (GGTase I), inhibée par le composé GGTI-298, C27H33N3O3S C2HF3O2 et GGTI-2133, C27H2BN4O3 -C2HF3O2, (Sigma marque déposée). Les composés ont été testés dans des cultures d'astrocytes primaires à plusieurs concentrations allant de 10 μM à 0,5 nM, en particulier 10 μM, 5 μM, 50OnM, 5nM et 0,5 nM (figures 6, 7) sur le modèle de migration d'astrocytes selon le protocole décrit dans l'exemple 1. La lovastatine 10 μM et 1 μM (Sigma) a été utilisée comme contrôle positif.
A.1 Culture primaire d'astrocytes
Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans la partie A-1 de l'exemple I.
A.2. Mise en culture des astrocytes en plaques 96 puits Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans la partie A-2 de l'exemple I.
A.3. Préparation et dépôt des molécules à tester
Le protocole utilisé est identique à celui décrit dans la partie A-3 de l'exemple I.
A.4. Suivi de la migration des astrocytes
Le protocole est identique à celui décrit dans la partie A-4 de l'exemple I.
A.5. Analyse statistique
Les données ont été soumises à une analyse de variance (Anova) suivi d'un post test de Dunnett. Toutes les analyses ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 4. Chaque expérience a été effectuée en triplicate.
B. Résultats Les figures 6 et 7 présentent le pourcentage d'inhibition de la migration des astrocytes par rapport au puits contrôles négatifs après trois jours d'incubation en fonction du traitement administré c'est-à-dire respectivement test du composé de formule XXIV (GGTI-298) et du composé de formule XXIII (GGTI-2133) aux différentes concentrations suivantes : 10 μM, 5 μM, 50OnM, 5OnM et 5 nM pour le composé GGTI- 298 et 100 μM, 50 μM, 10 μM, 5 μM, 50OnM, 5OnM et 5 nM pour le composé GGTI-2133.
- Effet du composé GGTI-298
La figure 6 représente les résultats obtenus avec le GGTI-298. En particulier, cette figure représente le pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration du GGTI-298 dans le milieu de culture. Les différentes concentrations testées étaient 0 μM, 5 μM, 50OnM, 5nM et 0,5 nM. L'inhibiteur de la GGtase type I utilisé a montré un effet dose classique avec une efficacité d'inhibition de la migration cellulaire significative par rapport au contrôle négatif, la lovastatine à 10μM. Elle est équivalente à celle de la lovastatine à une concentration de 1 μM (Figure 6). Les inventeurs ont donc montré ici que le composé GGTI-298 inhibiteur de la GGTase I est capable de mimer l'effet de la lovastatine sur le test de migration des astrocytes. Par conséquent il apparaît que l'effet de la lovastatine sur la migration des astrocytes est au moins partiellement dû à une inhibition de la prénylation des GTPases cibles de la GGTase de type I.
Effet du GGTI-2133
Le composé GGTI-2133 de formule suivante :
(XXIII) a également été testé.
Un des avantages de ce composé par rapport au composé GGTI- 298 est que son innocuité a été clairement démontrée sur la moelle épinière de rat adulte (Ohsawa, M., Mutoh, J., and Hisa, H. (2008).
Mevalonate sensitizes the nociceptive transmission in the mouse spinal cord. Pain 134, 285-292. [13]). Il a été montré dans cet article qu'une application locale sur la moelle épinière du composé GGTI-2133 était capable uniquement d'inhiber l'hyperalgésie induite par un traitement au mevalonate.
La figure 7 représente les résultats obtenus avec le GGTI-2133. En particulier, cette figure représente le pourcentage d'inhibition en fonction de la concentration du GGTI-2133 dans le milieu de culture. Les différentes concentrations testées étaient 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 5 μM, 50OnM et 5nM. La lovastatine correspond au contrôle négatif et a été utilisée dans une concentration de 10μM et 1μM.
Les inventeurs de la présente invention ont observé de manière inattendue que le GGTI-2133 aux différentes concentrations testées inhibe la migration des cellules astrocytaires in vitro (Figure 7). Les inventeurs ont également démontré de manière surprenante que le GGTI-2133 possède une action similaire au composé GGTI-298 et qu'il n'est pas toxique sur les astrocytes même à forte concentration (100 μM et 50 μM).
La figure 8 représente la courbe d'inhibition de la concentration de la migration des astrocytes en fonction du logarithme décimal de la concentration du composé testé. A partir de cette courbe, la concentration d'inhibition de 50% de la migration des astrocytes (IC50) du composé GGTI-2133 a été évaluée à environ 30 μM (Figure 8), selon le protocole décrit dans le document Yung-Chi Cheng, William H prussof: Relationship between the inhibition constant and the concentration of inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzymatic reaction - Biocher. Pharmacol (Basso, D. M., Beattie, M. S., and Bresnahan, J. C. (1995). A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of neurotrauma 12, 1-21 [14]).
Exemple 3 : Analyse de la capacité du composé GGTI-2133 à promouvoir la pousse neuritique de neurones cultivés sur un substrat inhibiteur (myéline) et de la toxicité cellulaire. A. Matériel et méthode A. 1. Préparation de la myéline Des moelles épinières de rats adultes (Wistar, nombre variable en fonction de la quantité de myéline désirée, Janvier, France) ont été récupérées, pesées et homogénéisées dans un tampon d'homogénéisation 10,9% sucrose dans un homogénéiseur (Dounce, kontes). Le tampon d'homogénéisation se compose de tris HCI 1 mM, CaCI2 1 ,5 mM, spermidine 1 mM (Sigma), aprotinine 25 μg/mL (Sigma marque déposée), leupeptine 25 μg/mL (Sigma marque déposée), pepstatine A 5 μg/mL (Sigma marque déposée), 2.3 dehydro 2-desoxy-N- acetylneuraminique 15 μg/mL (Sigma marque déposée), sucrose pH 7,4. Les protéines contenues dans le tampon d'homogénéisation sont des inhibiteurs de protéases, à l'exception du 2.3 dehydro 2-desoxy-N- acetylneuraminique qui protège les groupements sucrés des protéines. L'homogénat a été centrifugé à 500g pendant 10 min afin d'éliminer les déchets et les noyaux, plus denses que les autres constituants. Le surnageant a été récupéré puis séparé sur un gradient de sucrose à trois phases (19%, 25,5% et 35,5%) dans une ultracentrifugeuse pendant 3h, 54000g à 4°C afin de séparer les membranes plasmiques de la myéline. La fraction contenant la myéline correspondant à l'interphase 19/25,5% sucrose a été lavée plusieurs fois puis prélevée. Pour chaque préparation, la quantité de myéline à utiliser pour avoir les propriétés inhibitrices sur la pousse neuritique désirées a été définie.
A.2. Dépôt du substrat inhibiteur dans les puits de plaques 96 puits
Les plaques 96 puits ont été recouvertes avec de la Poly-D-Lysine pendant 2h à 37°C puis 40 μl de la préparation de myéline ont été déposés par puits. Les plaques ont été mises à sécher sous hôte durant 12 heures.
A.3. Culture primaire de neurones corticaux
Une souris gestante (Janvier) a été euthanasiée par élongation des vertèbres cervicales et les embryons de 15,5 jours ont été retirés de l'utérus et déposés dans du HBSS froid. Après avoir extrait les embryons de leur poche amniotique, les cerveaux ont été récupérés et disséqués sous loupe binoculaire. La partie antérieure du cerveau a été coupée et les deux hémisphères ont été séparés, puis les méninges retirées. Les cortex ont été disséqués et placés dans un tube falcon (marque déposée) de 15 mL contenant du HBSS et maintenu au froid ; A la fin de la dissection, le HBSS a été remplacé par 1 ml de trypsine à 5 mg/mL (sigma marque déposée) afin de dissocier les tissus. Après 5min à 37°C, 100 μL de Dnase I à 1 mg/mL ont été ajoutés et la suspension a été réincubée 5 min à 37°C pour éliminer l'ADN cellulaire libéré. L'action de la trypsine a ensuite été inhibée par 5 ml de DMEM 10% sérum de veau fœtal. La suspension a été centrifugée à 800 tours par minute 8 min. Le culot a été repris dans 1 mL de Neurobasal (Invitrogen marque déposée, ref 21103-049). Les cellules ont été dissociées avec un pipetman 1 ml puis avec un pipetman 200μl,puis dénombrés sur cellules de Mallassez. 1500 neurones corticaux ont été déposés dans chaque puits d'une plaque 96 puits. Après deux heures d'incubation à 37°C, les composés ont été ajoutés aux différentes concentrations testées. Le marquage à la calcéine a été fait après trois jours d'incubation, le nombre de cellules et la pousse neuritique ont été déterminés avec le Flash-cytomètre et le logiciel Metamorph (pluggin neurite outgrowth).
A.4. Analyses statistiques
Les données ont été soumises à une analyse de variance (Anova) suivi d'un post test de Dunnett. Toutes les analyses ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 4. Chaque expérience a été effectuée en triplicate.
B. Résultats
B.1 Analyse de l'effet du composé GGTI-2133 sur la pousse neuritique de neurones cultivés sur un substrat inhibiteur composé de myéline. Parmi les molécules inhibitrices de la régénération exprimées à la surface de la myéline, on trouve 3 protéines Nogo, Mag, Omgp qui agissent toutes par un mécanisme commun via récepteur NogoR, pour transmettre un signal vers l'actine par la voie de signalisation des Rho kinase (Wang, K.C., Kim, J.A., Sivasankaran, R., Segal, R., and He, Z. (2002). P75 interacts with the Nogo receptor as a co-receptor for Nogo, MAG and OMgp. Nature 420, 74-78 [15])., ( Wong, S.T., Henley, J.R., Kanning, K.C., Huang, K.H., Bothwell, M., and Poo, M. M. (2002). A p75(NTR) and Nogo receptor complex médiates répulsive signaling by myelin-associated glycoprotein. Nat Neurosci 5, 1302-1308. [16]). Suite à une lésion médullaire, les neurones doivent régénérer dans un environnement inhibiteur formé par la cicatrice gliale. Afin de permettre aux neurones de régénérer on peut tenter de diminuer la formation de la cicatrice gliale mais aussi la réponse des neurones aux divers signaux inhibiteurs.
Les expériences décrites dans cet exemple ont pour but de mettre en évidence un effet du composé GGTI-2133 qui stimule la pousse neuritique sur un substrat inhibiteur.
La figure 9 représente le pourcentage de pousse neuritique obtenue en présence de myéline et en présence de myéline et du composé GGTI- 2133 aux concentrations suivantes 15 μM, 10 μM et 5 μM. Le contrôle négatif correspond à la myéline seule et le contrôle positif à la présence d'un subtrat permissif la Poly-D-lysine (PDL).
La figure 10 représente le pourcentage de pousse neuritique obtenue en absence de myéline et en présence de myéline et du composé GGTI-2133 aux concentrations suivantes 15 μM, 10 μM et 5 μM. Les résultats obtenus par les inventeurs et représentés sur les figures 9 et 10 démontrent clairement que le GGTI-2133 permet de stimuler la pousse neuritique en présence de myéline (figure 9) de manière plus importante que sur un substrat permissif (Poly-D-lysine, Figure 9). Ceci démontre clairement qu'un aspect au moins de cette stimulation est une réponse des neurones spécifique à des signaux inhibiteurs.
B.2 Analyse de la toxicité sur neurones corticaux
Tel que démontré dans les expériences mises en œuvre par les inventeurs, le composé GGTI-2133 ne présente pas de toxicité cellulaire et ceci de manière surprenante par rapport aux statines qui elles le sont aux concentrations utilisées, sur des neurones corticaux. En effet, les inventeurs ont démontré que quelque soit la concentration du composé GGTI-2133, à savoir 15 μM, 10 μM ou 5μM, il n'a pas été observé de toxicité sur les cellules tel que le montre la Figure 11. La figure 11 représente le pourcentage du nombre de cellules présent dans la culture en fonction de la présence dans le milieu de culture du GGTI-2133 à la concentration de 15 μM, 10 μM et 5 μM seul ou en présence de myéline.
Les résultats obtenus et représentés montrent une très légère augmentation du pourcentage de nombre de neurones cultivés sur PDL en présence de GGTI 2133 seul, alors qu'en présence de myéline ce pourcentage reste constant.
Ces résultats démontrent clairement que l'effet de stimulation de la pousse de GGTI-2133 dans cette dernière condition n'est pas la conséquence d'une augmentation du nombre de cellules mais bien due à un effet sur la croissance des axones des neurones. Le composé GGTI 2133 stimule donc spécifiquement la croissance des axones des neurones sur le substrat composé de myéline.
L'ensemble de ces expériences présentées ci-dessus démontrent donc clairement que le GGTI-2133 est un composé qui peut être utilisé conformément à la présente invention pour le traitement de la moelle épinière de part son innocuité sur ce tissu, son action inhibitrice sur le modèle de formation de la cicatrice gliale (migration des astrocytes) son effet stimulant sur un modèle de régénération neuronale dans un environnement inhibiteur (pousse neuronale sur myéline).
Les inventeurs ont donc démontré que l'utilisation d'inhibiteurs de géranylgéranyl transférase de type I pourraient être utilisée dans le traitement des lésions du système nerveux central en particulier les lésions de la moelle épinière.
Exemple 4 : Composition pharmaceutique comprenant un composé de l'invention
Les composés de la présente invention peuvent être formulés dans une composition liquide adaptée pour une administration intramédullaire à l'aide d'une seringue, par exemple dans une solution véhicule composé de NaCI 0.9%, DMSO 0,5% à 20%, ou NaCI 0.9%, DMSO 5%, crémophore 5% ou n'importe quelle autre huile animale ou végétale du composé de formule XXIII.
Exemple 5 : traitement de rats ayant subis une lésion de la moelle épinière.
Des rats Wistar âgés de 9 semaines sont utilisés dans cet exemple pris afin d'induire une lésion de la moelle épinière. Après anesthésie profonde avec un mélange de Kétamine à 10 mg/Kg (Imalgène 1000 (marque déposée)) et de Xylazine à 80 mg/Kg (Rompun (marque déposée)), une laminectomie en T9 puis une hémisection dorsale de 1.8mm de profondeur sont pratiquées. Ce type de lésion permet d'administrer la solution localement, en s'affranchissant de la Barrière hémato-encéphalique. Les solutions testées sont administrées en aigu, directement dans le site de lésion, via un fragment de 10 x 10 mm, coupé en 4 de surgicoll (marque déposée) , il s'agit de collagène natif dermique purifié, d'origine porcine. Il est absorbé complètement par le tissu. Sur chaque morceau de surgicoll, 30 μl_ de solution contenant le composé GGTI-2133 sont imprégnés. Les concentrations testées sont par exemple 20μM et 200 μM.
La lésion entraine une perte de la motilité des rats au niveau des membres postérieurs. L'étude de la récupération motrice post-lésionnelle est réalisée par le test du BBB à 1 , 7, 14, 21 , 28 et 35 jours postopératoires. Ce test moteur a été développé par les Docteurs Basso, Beattie et Breshnahan à l'université de l'Ohio (Basso, D. M., Beattie, M. S., and Bresnahan, J. C. (1995). A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of neurotrauma 12, 1-21.[14]).
Ce système de notation permet d'analyser précisément les mouvements volontaires des pattes postérieures de l'animal. Le rat est placé dans un champ ouvert standardisé (open-field) de
90 cm de diamètre. Deux observateurs analysent le comportement moteur de l'animal pendant 4 minutes et attribuent un score à chaque patte arrière, compris entre 0 (absence de mouvement) et 21 (marche normale).
Ce score tient compte de la mobilité des articulations de la hanche, du genou et de la cheville, du support de poids, de la position des pas au cours de la marche et de leur coordination, de la position de la queue.
Listes des références
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W.D., and McKerracher, L. (2002). Rho signaling pathway targeted to promote spinal cord repair. J Neurosci 22, 6570-6577.
4. Tan, A.M., Stamboulian, S., Chang, Y.W., Zhao, P., Hains, A.B., Waxman, S. G., and Hains, B.C. (2008). Neuropathic pain memory is maintained by Rac1-regulated dendritic spine remodeling after spinal cord injury. J Neurosci 28, 13173-13183.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation du composé de formule (I)
ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables ; dans lequel,
Ri est un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6, un aryle en C6 à C10 ou un cation de métal alcalin (Na+, K+) :
R2 est un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6, un alcoxy en Ci à C6, un aryle en C6 à C10, un atome d'halogène (F, Cl, Br, I), -OH, -NO2, -CN, -CO2H, -SO3H, -NHNH2, - SH, -NH2, HO-NH-, isobutyl, secbutyle ou benzyle ;
R3 et R4 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un alkyle en Ci à C6, un alcényle en C2 à C6, un alcynyle en C2 à C6 ; R5 est hétérocycle à cinq chainons ou un hétéro alkyle en C1 à C6, pour la fabrication d'un médicament.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans lequel R5 est
(II) (H) (Hl) (IV)
(V) (Vl) (VII) (VIII)
(IX) (X) (Xl) (XII) (XIII)
(XIV) (XV)
(XVI) (XVII) (XVIII) (XIX) (XX)
(XXI) ou (XXII)
dans lequel, n est égale à O, 1 ou 2 ;
R1A représente H, Ci-6alkyl ;
R1D représente H ou C1-6alkyl, ou un hétéroalkyle en C1 à C4 avec au moins un hétéroatome choisi parmi l'azote et/ou le souffre.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle R5 est de formule (XIV),
R1A représente H, et R1D représente H.
4. Utilisation du composé de formule (I) selon la revendication 1 dans lequel
R1 représente H,
R2 représente un isobutyle
R3 représente H
R4 représente H et
R5 est de formule (XIV) dans laquelle R1Λ représente H, et R1D représente H.
5. Utilisation du composé de formule (XXIII)
(XXIII) ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables ; pour la fabrication d'un médicament
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le médicament est un médicament destiné au traitement des lésions de la moelle épinière.
7. Composé (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 ou d'un inhibiteur de géranyl-géranyl transférases destiné au traitement des lésions des lésions de la moelle épinière.
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