EP2268790A1 - Procede d'obtention de mycelium de tuber magnatum et mycelium obtenu par le procede - Google Patents

Procede d'obtention de mycelium de tuber magnatum et mycelium obtenu par le procede

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EP2268790A1
EP2268790A1 EP09742247A EP09742247A EP2268790A1 EP 2268790 A1 EP2268790 A1 EP 2268790A1 EP 09742247 A EP09742247 A EP 09742247A EP 09742247 A EP09742247 A EP 09742247A EP 2268790 A1 EP2268790 A1 EP 2268790A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
mycelium
roots
tuber
magnatum
tuber magnatum
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09742247A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marc Buee
Francis Martin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Recherche Agronomique INRA filed Critical Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Publication of EP2268790A1 publication Critical patent/EP2268790A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G18/00—Cultivation of mushrooms
    • A01G18/10—Mycorrhiza; Mycorrhizal associations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H15/00—Fungi; Lichens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H17/00—Symbiotic or parasitic combinations including one or more new plants, e.g. mycorrhiza

Definitions

  • the present invention relates to the field of production of Tuber magnatum, commonly referred to as white truffle, which is an edible mushroom with great commercial value.
  • Tuber magnatum also known as Piedmont white truffle or Alba truffle, is a rare edible mushroom that is very popular with consumers.
  • Tuber magnatum is an ectomycorrhizal fungus that grows and matures from October to December in the clay-limestone soils of northern Italy, usually at a depth of 5 to 50 centimeters. This fungus lives in symbiosis preferentially with poplars (black poplar, white poplar, aspen, etc.).
  • Tuber magnatum can also live in symbiosis with other tree species such as oaks, linden trees and hazel trees.
  • Tuber magnatum is rare in nature but is highly valued by consumers, there is a need for the development of techniques to make this fungus available to the public in the desired quantity and quality.
  • techniques for obtaining, in the desired quantity and quality, Tuber magnatum mycelium in order to achieve the mycorrhization of compatible species, then to cultivate mycorrhizal species for the production of these mushrooms.
  • mycorrhizal species for the production of these mushrooms.
  • Murat et al. had confirmed that no technique for the controlled production of Tuber magnatum was possible in 2005, while such techniques were fully available for Tuber borchii and Tuber uncinatum and Tuber melanosporum (Murat et al., 2005, FEMS Microbiology Letters, Vl. 245: 307-313).
  • these authors focused on studying the interactions of Tuber magnatum with its ecosystem and the results obtained concluded that additional analyzes were needed to improve knowledge of the Tuber magnatum ecosystem and thus increase the chances of success. of success for a future development of an experimental production of this mushroom.
  • Barbieri et al. Barbieri et al.
  • the present invention relates to a method for obtaining Tuber magnatum mycelium comprising the following steps: a) cultivating in vitro one or more fragments of Tuber magnatum tissue in the presence of plant roots, and b) collecting the Tuber magnatum mycelium. obtained at the end of step a), associated or not associated with the roots of plants.
  • the plant roots consist of roots transformed with Agrobacterium rhizogenes.
  • the roots are from plants of a genus selected from Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus and Daucus.
  • step a) of in vitro culture is carried out in a culture medium comprising one or more strains of bacteria naturally associated with fungi of the genus Tuber, including bacteria of the species Stenotrophomonas maltophilia.
  • said method comprises the following additional step: c) transferring the mycelium collected in step b) into a root-free culture medium.
  • said method after step c), comprises the following additional step: d) culturing in said root-free culture medium, the mycelium transferred to step c).
  • the present invention also relates to a Tuber magnatum mycelium characterized in that it is obtained by the process defined above.
  • the present invention also relates to a method of plant mycorrhization by Tuber magnatum comprising the following steps: a) inoculation by contacting the roots of seedlings or cuttings with a Tuber magnatum mycelium obtained by the method or with a mycelium of Tuber magnatum as defined above; b) in vitro culture of the seedlings or inoculated cuttings obtained in step a) until the appearance of mycorrhizae.
  • FIGURES Figure 1 illustrates the growth curve of Tuber magnatum in the presence of poplar roots transformed with Agrobacterium rhizogenes. On the ordinate: size of the Tuber magnatum mycelium, expressed in millimeters. On the abscissa, time elapsed from the incubation of the carpophore fragment with the poplar roots, expressed in days.
  • Figure 2 illustrates a comparison of the growth level of Tuber magnatum mycelium, respectively in the absence (left part of Figure 2) or in the presence (right part of Figure 2) of Ciste roots transformed with Agrobacterium rhizogenes. On the ordinate: production of mycelium cultures from a piece of Tuber magnatum (percent).
  • Figure 3 shows a snapshot of an agar explant containing Tuber magnatum mycelium in the absence of plant root.
  • Figure 4 shows a snapshot of an agar explant containing Tuber magnatum mycelium in the presence of Populus roots transformed with Agrobacterium rhizogenes, 6 weeks after the start of incubation.
  • Fig. 5 is a snapshot of an agar explant containing Tuber magnatum mycelium in the presence of Daucus carota roots transformed with Agrobacterium rhizogenes, 6 weeks after the start of incubation.
  • Figure 6 is a snapshot of an agar explant containing Tuber magnatum mycelium in the presence of Cistus roots transformed with Agrobacterium rhizogenes, 6 weeks after the start of incubation.
  • Figure 7 shows a snapshot of seedlings (cuttings) of Populus mycorrhizae by Tuber magnatum.
  • FIG. 8 illustrates the comparison of the growth level of the Tuber melanosporum mycelium, respectively in the absence (Mel-28) or in the presence (Mel-28 + cistus) of Ciste roots transformed with Agrobacterium rhizogenes, after 9 months of incubation. On the ordinate: percentage of production of mycelium cultures from T. melanosporum mycelium fragments.
  • Tuber magnatum mycelium can be obtained in a simple manner by cultivating in vitro, under controlled conditions, a fragment of Tuber magnatum tissue in the presence of plant roots.
  • the present invention relates to a process for obtaining mycelium from
  • Tuber magnatum comprising the following steps: a) cultivating in vitro one or more fragments of Tuber magnatum tissue in the presence of plant roots, and b) collecting the Tuber magnatum mycelium obtained at the end of step a), in association or not with plant roots.
  • a single fragment of Tuber magnatum tissue is sufficient in step a) to obtain mycelium at the end of step a).
  • two tissue fragments or more than two fragments of Tuber magnatum tissue can be cultured in vitro in step a) without particular disadvantage.
  • one or more Tuber magnatum carpophore fragments are used in step a) in step a) in step a).
  • the process according to the invention can also be carried out using, in step a), fragments of other types of Tuber magnatum tissue, such as mycorrhizal fragments or fragments of mycelium.
  • the fragments of carpophore include, inter alia, spores and / or gleba.
  • Gleba is condensed mycelium.
  • the method of producing mycelium can be implemented using directly gleba or spores from the carpophore, gleba and spores being considered fragments of carpophore.
  • Tuber magnatum carpophore fragments it will generally be preferred to use one or more Tuber magnatum carpophore fragments, because the carpophore is an organ for which the morphological characteristics of Tuber magnatum are most readily recognizable. Tuber magnatum mycelium grown in vitro obtained by said method will also be used.
  • Tuber magnatum fragments collected in the internal tissues of the carpophore to avoid introducing undesirable soil microorganisms into subsequent cultures. These undesirable microorganisms are located on the outer surface of the carpophores, in contact with the soil.
  • the Tuber magnatum tissue fragment (s) and the plant roots are contacted with each other during step a).
  • Tuber magnatum mycelium can be produced during step a) of in vitro culture without close physical contact between the Tuber magnatum tissue fragment and the plant roots.
  • the inventors believe that the roots of growing plants that are present in step a) of the process produce or release one or more metabolites that are necessary for the development or growth of the mycelium.
  • the Tuber magnatum tissue fragment (s) are simply incubated together in step a), the important characteristic being the presence of plant roots. This joint incubation allows metabolites released by the plant roots into the culture medium to diffuse into the culture medium to the Tuber magnatum tissue fragment (s). It should be noted that the root introduced into the environment is free of all mycorrhizae.
  • the plant root introduced into the culture medium is not mycorrhized by the mycelium of T magnatum, growing even after physical contact with each other.
  • the production process of the mycelium according to the present invention therefore, there is no close physical interaction (i.e., symbiotic association) between the growing mycelium and the plant root.
  • step a) can be performed with a wide variety of plant roots.
  • isolated root tissue that has been previously prepared from plants is used in step a).
  • the isolated root tissue is subjected to one or more intense washing steps, for example with sterile water or with culture medium, in order to eliminate almost all or all the microorganisms likely to be therein. initially associated.
  • one or more intense washing steps for example with sterile water or with culture medium, in order to eliminate almost all or all the microorganisms likely to be therein. initially associated.
  • plant roots isolated from a whole plant and having been subjected to one or more appropriate washing steps can be used successfully in step a) of the process.
  • roots isolated from whole plants have reduced longevity. Such roots have in particular the disadvantage of developing and differentiating in the culture medium and thus giving birth to seedlings.
  • step a) of the method is carried out preferentially with root tissue whose ability of the constituent cells to differentiate into tissues other than root tissue has been blocked.
  • plant roots are used which have been transformed with
  • Agrobacterium rhizogenes The roots of plants transformed with Agrobacterium rhizogenes are transformed into "hairy roots" which have the advantage of developing exclusively into a root tissue that can be grown in the long term and transplanted, without requiring a new recourse to a stage of isolation of roots from an entire plant.
  • the inventors believe that the roots transformed by Agrobacterium rhizogenes, also called “hairy roots” or “root organ cultures” (ROC), produce during their growth important secondary metabolites which contribute to the development of Tuber magnatum mycelium, in step a) of the process of the invention.
  • the plant roots used in step a) of the process may be derived from a transformation with different bacterial strains, such as strains 15384, 1724, 8196 or 2659 of Agrobacterium rhizogenes.
  • roots from a wide variety of plants can be used in step a) since tuber magnatum mycelium is produced with roots of plants as far apart as the species.
  • step a) roots of a plant belonging to a woody species are used.
  • step a) of the method roots of host plants of
  • roots originating from plants of a genus chosen from among Pinus, Picea, Abies, Salix, Ostrya, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus and Daucus are used. where appropriate in the form of plants or hybrid varieties.
  • Populus nigra, Populus alba, Populus trichocarpa, Populus deltoids, Populus simonii, Populus tremula, Populus yunnannensis, Populus canescens and Populus canescens may be used as roots of the genus Populus.
  • roots of plants of the genus Cistus it is possible to use the roots of the following species of cistus: Cistus albidus, Cistus crispus, Cistus creticus, Cistus incanus, Cistus monseliensis, Cistus ladaniferus, Cistus laurifolius, Cistus populifolius, Cistus salvifolius, Cistus clusii , Cistus inflatus and Cistus pouzolzii.
  • Corylus maxima, Corylus colurna, Corylus chinensis, Corylus americana, Corylus avellana, Corylus cornuta, Corylus ferox, Corylus heterophylla, Corylus jacquemontii, Corylus sieboldiana may be used as roots of plants of the genus Corylus. and Corylus tibetica.
  • Tilia platyphyllos Tilia americana, Tilia amurensis, Tilia chinensis, Tilia cordata, Tilia dasystyla, Tilia xeuchlora, Tilia xeuropacea, Tilia xflavescens, Tilia henryana, and Tilia platyphyllos, Tilia americana, Tilia , Tilia insularis, Tilia intonsa, Tilia japonica, Tilia kiusiana, Tilia mandshurica and Tilia maximaowicziana.
  • roots of plants of the genus Salix it is possible to use roots from the following willow species: Salix caprea and Salix viminalis.
  • the process for obtaining Tuber magnatum mycelium according to the invention is carried out under so-called axenic conditions, ie under controlled conditions in which the culture medium of step a) does not comprise undesirable microorganisms, for example microorganisms resulting from undesirable contamination of the plant roots used or undesirable contamination of the culture medium used.
  • a sterile culture medium is used as with any cell culture.
  • the sterility of the roots or fragments of Tuber magnatum tissue used can be obtained according to conventional techniques well known to those skilled in the art, such as that the elimination of microorganisms by one or more washing steps, and / or prior steps of incubation in a salt buffer, for example a culture medium, comprising antibiotics.
  • a salt buffer for example a culture medium, comprising antibiotics.
  • a liquid or solid medium comprising one or more antibiotics chosen from cefotaxime sodium, disodium carboline, vancomycin, ampicillin sodium, claforan, streptomycin sulfate or tetracycline, for example at a concentration which may be go from 100 to 500 ⁇ g / mL
  • prior decontamination of the plant roots is performed and the Tuber magnatum tissue fragment (s) are not decontaminated, such that the tissue fragments of Tuber magnatum are removed. are likely to contain cells of one or more bacterial species that are naturally present in the environment of this fungus when found in the ground.
  • said process is carried out under completely axenic conditions, with prior decontamination of both (i) the Tuber magnatum fragment (s) and (ii) plant, and use of a sterile culture medium.
  • step a) of in vitro culture is carried out in a culture medium comprising one or more strains of bacteria naturally associated with fungi of the genus Tuber.
  • step a) of culture is carried out with fragments of Tuber magnatum tissue which have not undergone a decontamination step by elimination of the associated microorganisms.
  • step a) of culture is carried out under axenic conditions and naturally occurring bacteria associated with fungi of the genus Tuber are added to the culture medium at the beginning of step a) .
  • Tuber and particularly bacteria associated with Tuber magnatum, may be selected from the bacteria described by Barbieri et al. (2007, Environmental Microbiology, Vol 9 (No. 9):
  • bacteria of the species Stenotrophomonas maltophilia are added.
  • tissue fragments of Tuber magnatum are cultured in step a).
  • plant roots in the presence of bacteria associated with fungi of the genus Tuber, and more particularly in presence of bacteria of the species Stenotrophomonas maltophilia are described in the examples.
  • step a) When the process of the invention is carried out under axenic conditions with addition of exogenous bacteria naturally associated with the fungus of the genus Tuber, at the beginning of step a) the amount of bacteria appropriate to obtain a final concentration of at least 10 and at most 10 9 bacterial cells per ml of culture medium at the time of their addition.
  • step a the growth of the bacteria is very moderate.
  • a ternary combination of (i) fragment (s) of Tuber magnatum tissue, (ii) plant roots and (iii) naturally occurring bacteria is cultured in vitro. associated with fungi of the genus Tuber, and more particularly bacteria associated with Tuber magnatum.
  • step a) of in vitro culture is carried out at a temperature ranging from 1 0 0 C to 30 0 C and very preferably from 15 0 C to 25 0 C.
  • step a) of in vitro culture is carried out in the dark.
  • the culture medium used in step a) may be any type of suitable culture medium, known to those skilled in the art.
  • medium M minimum medium
  • medium M the composition of which is described in particular by Bpati et al. (1988, New Phytol., Vol 108: 21-218).
  • a culture medium comprising a gelling agent is used.
  • agar may be used as a gelling agent to form an agar medium. It is also possible to use a gelling agent chosen from agar and phytogel. For example, the gelling agent sold under the name Phytagel® may be used by Sigma-Aldrich.
  • the amount of gelling agent present in the culture medium can be easily adapted by those skilled in the art.
  • the amount of gelling agent depends on the gelling agent used and the final viscosity desired for the culture medium used in step a) of the process.
  • the culture medium used in step a) may comprise an amount of gelling agent of at least 3 percent by weight, based on the total weight of the culture medium, preferably at least 5 percent by weight. percent by weight, based on the total weight of the culture medium.
  • the amount of gelling agent is at most 15 percent by weight, preferably at most 10 percent by weight, based on the total weight of the culture medium.
  • Step a) can be performed in various types of containers or culture dishes.
  • Step a) is conventionally carried out in petri dishes.
  • the mycelium, associated or not with the roots of plants, is collected in step b) at a time when the skilled person estimates that the amount of mycelium produced is sufficient for the intended use, for example to achieve a or several subcultures of mycelium by transplanting or to perform mycorhization of plants.
  • the mycelium can be recovered in step b) when its size at the end of step a) reaches 50 millimeters or more, for example 80 millimeters or more.
  • the duration of step a) of the method is about at least three weeks, for example about four or more six weeks.
  • the duration of step a) may be greater than six weeks but this is not generally necessary since the amount of mycelium produced is sufficient to carry out subcultures.
  • the cultures can be maintained for several months, for example for a period of two months or more and up to twelve months.
  • the mycelium that is collected in step b) can then be used to perform subcultures.
  • Tuber magnatum mycelium which is described above, one obtains mycelium whose culture can then be continued over a long period of time, without again requiring the use of the use of fragments. of Tuber magnatum tissue, other than the mycelium that is collected in step b).
  • the process for obtaining Tuber magnatum mycelium comprises a step of transplanting the mycelium collected in step b), in the presence of plant roots, in order to achieve one or more mycelium subcultures. Tuber magnatum in the presence of new plant roots (ROC or hairy roots).
  • the Tuber magnatum mycelium collected in step b) is subsequently used in a plant mycorrhizal method.
  • the production of mycelium subcultures or the realization of a mycorrhization process requires a step of transplanting the mycelium collected in step b) of the above process, by transfer into a suitable culture medium.
  • the method of the invention comprises the following additional step: c) transferring the mycelium collected in step b) into a culture medium.
  • said method comprises the following additional step: d) culturing in said root-free culture medium, the mycelium transferred to step c);
  • the mycelium may be cultured, or "subcultured” in vitro in step d) for several weeks, as long as the culture medium contains sufficient nutrients to maintain or grow the mycelium, without loss of viability.
  • mycelium collected in step b) of the method could be subcultured and cultured in vitro for at least six weeks.
  • the culture medium used in step d) may be the same as the culture medium used in step a).
  • the mycelium is incubated in the culture medium in the absence of plant roots and without the addition of exogenous bacteria.
  • step c) and d bacteria may nevertheless be present. Indeed, in the embodiments of step a) in which naturally occurring bacteria associated with fungi of the genus Tuber are present in the culture medium, these bacteria colonize the growing mycelium and can be transferred with the mycelium collected at the same time. step b) for the following process steps.
  • the mycelium is incubated in the culture medium in the absence of plant roots, but bacteria naturally associated with the fungi of the genus Tuber, in particular naturally associated bacteria, are added. Tuber magnatum, such as Stenotrophomonas maltophilia. In this case, the bacteria are added in the same quantity range as for step a) of the process.
  • the mycelium is incubated in the culture medium in the presence of plant roots. Any of the types of plant roots that can be used to carry out step a) of the method can be used.
  • the culture medium comprises (i) Tuber magnatum mycelium, (ii) plant roots and (iii) naturally occurring bacteria associated with Tuber fungi, especially bacteria associated with Tuber magnatum.
  • the present invention also relates to a method for subculture of Tuber magnatum mycelium, or for performing a subculture of Tuber magnatum mycelium, which comprises the following steps:
  • step B culturing in said culture medium the mycelium incubated in step A).
  • steps A) and B) of the above process are identical to the characteristics of steps c) and d) of the process for obtaining Tuber magnatum mycelium described above.
  • the present invention also relates to a Tuber magnatum mycelium which has been collected in step b) of the production process described above.
  • the present invention also relates to a Tuber magnatum mycelium which has been obtained at the end of step d) of the production process described above.
  • the subject of the invention is also a Tuber magnatum mycelium which has been obtained at the end of stage B) of the subculture process described above.
  • Tuber magnatum mycelium that can be obtained (i) either in step a) of the process of obtaining above, (ii) in step d) of the obtaining process above, (iii) either in step B) of the above subculturing process, can then be used for the mycorrhization of plants to produce ready-to-eat white truffles.
  • the present invention also relates to a method of plant mycorrhization by Tuber magnatum comprising the following steps: a) inoculation by contacting the roots of seedlings or cuttings with a Tuber magnatum mycelium, whether or not interacting with plant roots, obtained
  • seedlings of a genus chosen from among Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus are preferably used.
  • step c) of transplanting the mycorrhizal seedlings obtained in step b) into the earth comprises a step c) of transplanting the mycorrhizal seedlings obtained in step b) into the earth.
  • ready-to-eat white truffles are obtained after a period of at least about three years, sometimes at least about six years, following step c) transplanting in the ground.
  • strains provided by Yves Dessaux, CNRS DR,
  • Biological material Poplar roots (Populus tremula x Populus alba, INRA clone 717-1 B4) transformed with A rhizogenes strain 15834.
  • Cystic root (Cistus incanus) transformed by Agrobacterium rhizogenes.
  • Example 3 Molecular type of the specificity of Tuber magnatum mycelium culture
  • the specificity of mycelial culture was verified by molecular typing. DNA extraction was performed and sequencing of the extracted DNAs was performed.
  • Tuber magnatum carpophore from different truffles - carpophores -
  • rockrose roots Plant incanus
  • Populus tremula X hybrid Populus alba Some interaction experiments were also performed between poplar roots (Populus tremula X hybrid Populus alba) transformed by A. rhizogenes and T. magnatum.
  • Tuber magnatum is initiated very rapidly in the presence of poplar roots (Populus tremula X hybrid Populus alba) transformed by A. rhizogenes.
  • Populus tremula X hybrid Populus alba The growth of the fungus is obviously more important under these conditions than in the presence of roots of Cistus incanus transformed by A. rhizogenes.
  • Tuber magnatum from pieces of carpophores, in the presence and absence of root of Cistus incanus transformed by A. rhizogenes, one finds that for 60% (6/10) of the boxes containing the two biological partners (roots and fungus) the growth of Tuber magnatum is stimulated. In absence of root, no mycelial growth of Tuber magnatum is observable from pieces of carpophores in our growing conditions (medium M, 25 0 C and darkness).
  • Figure 2 illustrates this stimulation of the mycelial growth of Tuber magnatum in the presence or absence of roots of Cistus incanus transformed by A. Rhizogenes, six weeks after the incubation of the pieces of t tamaran carpophores with the transformed roots of Cistus. incanus.
  • EXAMPLE 5 Process for producing subcultures of Tuber magna tu m mycelium in the presence of carota roots It is important to point out that carrot roots (clone DC1), transformed by A. rhizogenes (provided by Pr. G. Bécard), also stimulate the growth of Tuber magnatum, from cultures of T. magnatum obtained in interaction with the transformed roots of Cistus or Populus (strain T magnatum, Tm520). The growth stimulation of Tuber magnatum is less important than with the roots of Populus or Cistus. However, these results demonstrate that transformed roots of non-host plants have a positive effect on mycelial growth of this fungus (see Figures 3 to 6).
  • Figures 3 to 6 show the Tm520 strain of Tuber magnatum in interaction or not with hairy roots (roots transformed by A. rhizogenes) of various plants, respectively Populus ( Figure 4), Daucus carota ( Figure 5) and Cistus ( Figure 6). ). It should be noted that under these culture conditions, the root present in the culture medium is not mycorrhizal.
  • Example 6 Method of mycorrhization with the mycelium of Tuber magnatum.
  • poplar cuttings (717-1 Populus tremula X Populus alba hybrid) are interacted with the Tuber magnatum mycelium from T. magnatum axenic cultures in interaction with the hairy roots (ROC) of poplar.
  • ROC hairy roots
  • axenic tube cultures have been made. Fragments of sterile poplar cuttings are deposited on medium M poured sterilely into glass tubes. After development of the root system (2 weeks), an agar explant containing a high density of T. magantum mycelium (from an axenic culture ROC x T. magnatum) is deposited in the bottom of the tube.
  • poplar root mycorrhizations were performed on square Petri dishes ( Figure 7).
  • An agar medium (medium M containing only 1 g / l of sucrose) is deposited on the lower half of the box and two pieces of poplar stem (cuttings) are introduced into the medium to generate new cuttings.
  • the dishes are incubated at a temperature of 20 to 25 ° C. with a day / night alternation (12h / 12h).
  • the lower parts of the boxes are protected from light by black plastic pouches or aluminum.
  • an agar explant of at least 2 to 3 cm 2 and containing T.
  • magnatum mycelium (from a axenic culture ROC x T. magnatum) is deposited on the agar part colonized by the roots.
  • the first results showed an initiation of the growth of T. magnatum in the presence of the roots of poplar cuttings. After several weeks, or months, of contact, the formation of fungal mantles (similar to ectomycorrhizae) is observable on certain root tips.
  • Example 7 Application of the method of production of T. magnatum mycelium for T. melanosporum.
  • Mycelium fragments of T. melanosporum (Mel-28) were cultured in M medium, in the presence (+ cistus) and in the absence of rockrose (Cistus incanus) roots transformed by A. rhizogenes. Culture conditions similar to those of Example 5 were used. As shown in Figure 8, no significant difference in mycelium growth was observed in the presence and absence of transformed root at the end of the culture period. In addition, the growth rate of the mycelium was similar in the presence and absence of root throughout the incubation period.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a).

Description

TITRE DE L'INVENTION
Procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum et mycélium obtenu par le procédé
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la production de Tuber magnatum, communément désignée truffe blanche, qui est un champignon comestible possédant une grande valeur commerciale.
ART ANTERIEUR
Tuber magnatum, aussi désignée truffe blanche du Piémont ou encore truffe d'Alba, est un champignon comestible rare et très apprécié des consommateurs. Tuber magnatum est un champignon ectomycorhizien qui pousse et mûrit d'octobre à décembre dans les terrains argilo- calcaires de l'Italie septentrionale, en général à une profondeur de 5 à 50 centimètres. Ce champignon vit en symbiose préférentiellement avec les peupliers (peuplier noir, peuplier blanc, peuplier tremble, etc.). Tuber magnatum peut aussi vivre en symbiose avec d'autres essences d'arbres tels que les chênes, les tilleuls et les noisetiers.
Du fait que Tuber magnatum est rare dans la nature mais qu'il est très apprécié des consommateurs, il existe un besoin pour la mise au point de techniques permettant la mise à la disposition du public de ce champignon en quantité et qualité désirées. Il existe en premier lieu un besoin pour la mise au point de techniques permettant l'obtention, en quantité et qualité désirées, de mycélium de Tuber magnatum, en vue de réaliser la mycorhization des essences compatibles, puis de réaliser la culture des essences mycorhizées pour la production de ces champignons. A la connaissance du demandeur, il n'existe à ce jour aucune technique ayant permis la production de mycélium de Tuber magnatum dans des conditions permettant la mycorhization des essences compatibles, malgré les nombreuses tentatives qui ont été réalisées dans l'état de la technique.
A la connaissance du demandeur, le seul article scientifique décrivant la production in vitro de mycélium de T. magnatum est l'article de Fontana et al. (Mycological Research, 1993, Vol. 97(N0I ) :40-44). A partir d'analyses morphologiques, Fontana et al. avaient pensé avoir obtenu du mycélium de T. magnatum à partir de mycorhizes. Cependant, quelques années plus tard, les mêmes auteurs ont montré par des analyses génomiques que ce mycélium n'appartenait pas à l'espèce T. magnatum mais à l'espèce T. melanosporum (MeIIo et al., 2001 , Microbiological Research, Vol.2001 (155), 279-284).
De plus, dans un article de revue relatif aux méthodes de culture des champignons comestibles, Hall et al. avaient observé que des techniques de production avaient été mises au point pour une variété de champignons, tels que Lactarius deliciosus, Lyophyllum shimeji, Rhizopogon rubescens, Suillus granulatus, Terfezia, ainsi qu'une grande variété de Tuber (Hall et al., 2003, Trends in Biotechnology, Vol. 21 (N0 10) : 433-438). Parmi les Tuber pour lesquels des techniques de culture avaient été mises au point, ces auteurs citent les exemples de Tuber borchii, Tuber melanosporum et Tuber uncinatum. Mais Hall et al. (2003, cité ci-dessus) avaient aussi souligné qu'aucune technique n'avait pu être mise au point pour la culture de Tuber magnatum.
Dans l'objectif de parvenir ultérieurement à définir des techniques de production contrôlée de Tuber magnatum, divers travaux scientifiques ont été réalisés afin de mieux comprendre la physiologie de ce champignon et en particulier la nature des interactions de ce champignon avec l'écosystème environnant.
Illustrativement, Murât et al. avaient confirmé qu'aucune technique de production contrôlée de Tuber magnatum n'était possible en 2005, alors que de telles techniques étaient pleinement disponibles pour Tuber borchii et Tuber uncinatum et Tuber melanosporum (Murât et al., 2005, FEMS Microbiology Letters, Vl. 245 : 307-313). En conséquence, ces auteurs s'étaient attachés à étudier les interactions de Tuber magnatum avec son écosystème et les résultats obtenus leur avaient permis de conclure que des analyses supplémentaires étaient nécessaires pour améliorer la connaissance de l'écosystème de Tuber magnatum et ainsi augmenter les chances de succès pour une future mise au point d'une production expérimentale de ce champignon. Egalement, Barbieri et al. avaient observé que, malgré les succès obtenus avec de nombreuses truffes comestibles, telles que Tuber melanosporum, Tuber aestivum et Tuber borchii, il n'avait pas été mis au point de technique de production contrôlée de Tuber magnatum (Barbieri et al., 2007, Environmental Microbiology, Vol. 9 (n° 9) : 2234-2246). Ces auteurs, qui avaient étudié la diversité des communautés microbiennes associées à Tuber magnatum, avaient conclu que des bactéries potentiellement aptes à fixer l'azote étaient susceptibles de contribuer au développement et à la maturation des ascomes de ces truffes.
Ainsi, à la connaissance du demandeur, le besoin pour un procédé de production contrôlée de Tuber magnatum n'a toujours pas été satisfait à ce jour.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé pour l'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a), associé ou non associé aux racines de plantes.
Dans certains modes de réalisation du procédé, les racines de plantes consistent en des racines transformées par Agrobacterium rhizogenes. Dans certains modes de réalisation du procédé, les racines proviennent de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus.
Dans certains modes de réalisation du procédé, l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, y compris des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia.
Dans certains modes de réalisation du procédé, ledit procédé comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture exempt de racine.
Dans certains modes de réalisation du procédé, ledit procédé, après l'étape c), comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) .
La présente invention est aussi relative à un mycélium de Tuber magnatum caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé défini ci-dessus.
La présente invention concerne aussi un procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules ou de boutures avec un mycélium de Tuber magnatum obtenu par le procédé ou avec un mycélium de Tuber magnatum tels que définis ci-dessus; b) culture in vitro des plantules ou boutures inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes.
DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre la courbe de croissance de Tuber magnatum en présence de racines de peuplier transformées par Agrobacterium rhizogenes. En ordonnées : taille du mycélium de Tuber magnatum, exprimée en millimètres. En abscisses, temps écoulé à partir de l'incubation du fragment de carpophore avec les racines de peuplier, exprimé en jours.
La Figure 2 illustre une comparaison du niveau de croissance du mycélium de Tuber magnatum, respectivement en l'absence (partie gauche de la figure 2) ou en présence (partie droite de la figure 2) de racines de Ciste transformées par Agrobacterium rhizogenes. En ordonnées : productions de cultures de mycélium à partir d'un morceau de carpophore de Tuber magnatum (pourcentage).
La Figure 3 représente un cliché d'un explant de gélose contenant du mycélium de Tuber magnatum en l'absence de racine de plante.
La Figure 4 représente un cliché d'un explant de gélose contenant du mycélium de Tuber magnatum en présence de racines de Populus transformées par Agrobacterium rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation. La Figure 5 représente un cliché d'un explant de gélose contenant du mycélium de Tuber magnatum en présence de racines de Daucus carota transformées par Agrobacteήum rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation.
La Figure 6 représente un cliché d'un explant de gélose contenant du mycélium de Tuber magnatum en présence de racines de Cistus transformées par Agrobacteήum rhizogenes, 6 semaines après le début de l'incubation.
La Figure 7 représente un cliché de plantules (boutures) de Populus mycorrhizées par Tuber magnatum.
La Figure 8 illustre la comparaison du niveau de croissance du mycélium de Tuber melanosporum, respectivement en l'absence (Mel-28) ou en présence (Mel-28+cistus) de racines de Ciste transformées par Agrobacterium rhizogenes, après 9 mois d'incubation. En ordonnées : pourcentage de production de cultures de mycélium à partir de fragments de mycélium de T. melanosporum.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De manière surprenante, les inventeurs ont montré que du mycélium de Tuber magnatum pouvait être obtenu de manière simple, en cultivant in vitro, dans des conditions contrôlées, un fragment de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plantes. Ainsi, la présente invention est relative à un procédé pour l'obtention de mycélium de
Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a), en association ou non avec des racines de plantes.
Comme cela est montré dans les exemples, un seul fragment de tissu de Tuber magnatum est suffisant à l'étape a) pour l'obtention de mycélium à la fin de l'étape a). Toutefois, deux fragments de tissu ou plus de deux fragments de tissu de Tuber magnatum peuvent être cultivés in vitro à l'étape a) sans entraîner d'inconvénient particulier. Dans certains modes de réalisation illustrés dans les exemples, on utilise à l'étape a) un ou plusieurs fragments de carpophore de Tuber magnatum. Toutefois, le procédé selon l'invention peut aussi être mis en oeuvre en utilisant, à l'étape a), des fragments d'autres types de tissu de Tuber magnatum, tels que des fragments de mycorhize ou encore des fragments de mycélium. II est à noter que les fragments de carpophore comprennent, entre autres, des spores et/ou de la gleba. La gleba correspond à du mycélium condensé. Ainsi dans certains modes de réalisation, le procédé de production de mycélium peut être mis en œuvre en utilisant directement la gleba ou des spores issues du carpophore, la gleba et les spores étant considérés comme des fragments de carpophore.
On préférera en général utiliser un ou plusieurs fragments de carpophore de Tuber magnatum, du fait que le carpophore est un organe pour lequel les caractéristiques morphologiques de Tuber magnatum sont le plus aisément reconnaissables. On utilisera également du mycélium de Tuber magnatum, cultivé in vitro, obtenu par ledit procédé.
On préférera utiliser des fragments de Tuber magnatum prélevés stérilement dans les tissus internes du carpophore pour éviter d'introduire des microorganismes telluriques indésirables dans les cultures ultérieures. Ces microorganismes indésirables se situent à la surface externe des carpophores, en contact avec le sol.
Dans certains modes de réalisation du procédé, le ou les fragment(s) de tissu de Tuber magnatum et les racines de plante sont mis en contact entre eux au cours de l'étape a).
Toutefois, comme cela est illustré dans les exemples, du mycélium de Tuber magnatum peut être produit au cours l'étape a) de culture in vitro sans contact physique étroit entre le fragment de tissu de Tuber magnatum et les racines de plante.
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les racines de plantes en croissance qui sont présentes à l'étape a) du procédé produisent ou libèrent un ou plusieurs métabolites qui sont nécessaires au développement ou à la croissance du mycélium. Ainsi, dans certains autres modes de réalisation du procédé, le ou les fragment(s) de tissu de Tuber magnatum sont simplement incubés ensemble au cours de l'étape a), la caractéristique importante étant la présence des racines de plante. Cette incubation conjointe permet que des métabolites libérés par les racines de plante dans le milieu de culture diffusent dans le milieu de culture jusqu'au fragment(s) de tissu de Tuber magnatum. II est à noter que la racine introduite dans lemilieu est exempte de tout mycorhize.
Il est également à noter que dans les conditions du procédé selon l'invention, la racine de plante introduite dans le milieu de culture n'est pas mycorhizée par le mycélium de T magnatum, en croissance même après contact physique entre eux. Au cours du procédé de production du mycélium selon la présente invention, il ne s'établit donc pas d'interaction physique étroite (c'est-à-dire d'association symbiotique) entre le mycélium en croissance et la racine de plante.
On a montré selon l'invention que l'étape a) peut être réalisée avec une grande variété de racines de plante.
Dans certains modes de réalisation, on utilise à l'étape a) du tissu racinaire isolé qui a été précédemment préparé à partir de plantes. Préférentiellement, le tissu racinaire isolé est soumis à une ou plusieurs étapes de lavage intenses, par exemple avec de l'eau stérile ou encore avec du milieu de culture, afin d'éliminer la presque totalité ou la totalité des microorganismes susceptibles d'y être initialement associés. Ainsi, des racines de plante isolées à partir d'une plante entière et ayant été soumises à une ou plusieurs étapes de lavage appropriées peuvent être utilisées avec succès, à l'étape a) du procédé.
Toutefois, des racines isolées à partir de plantes entières ont une pérennité réduite. De telles racines présentent en particulier l'inconvénient de se développer et se différencier dans le milieu de culture et ainsi de donner naissance à des plantules.
C'est la raison pour laquelle on réalise l'étape a) du procédé préférentiellement avec du tissu racinaire dont la capacité des cellules constitutives à se différencier en des tissus autres que du tissu racinaire a été bloquée. Préférentiellement, on utilise des racines de plantes qui ont été transformées avec
Agrobacterium rhizogenes. Les racines de plantes transformées avec Agrobacterium rhizogenes se transforment en « hairy roots » qui présentent l'avantage de se développer exclusivement en un tissu racinaire qui peut être cultivé à long terme et repiqué, sans nécessiter un nouveau recours à une étape d'isolement de racines à partir d'une plante entière. De plus, sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que les racines transformées par Agrobacterium rhizogenes, encore nommées « hairy roots » ou « root organ cultures » (ROC), produisent au cours de leur croissance des métabolites secondaires importants qui contribuent au développement du mycélium de Tuber magnatum, à l'étape a) du procédé de l'invention. Les techniques de transformation de tissu racinaire avec Agrobacterium rhizogenes sont bien connues par l'homme du métier. A titre illustratif, les racines de plante utilisées à l'étape a) du procédé peuvent être issues d'une transformation par différentes souches bactériennes, comme les souches 15384, 1724, 8196 ou 2659 de Agrobacterium rhizogenes.
De manière générale, comme cela est illustré dans les exemples, on peut utiliser à l'étape a) des racines originaires d'une grande variété de plantes, puisque du mycélium de tuber magnatum est produit avec des racines de plantes aussi éloignées que des essences ligneuses et les carottes.
Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise à l'étape a) des racines d'une plante appartenant à une essence ligneuse. De manière générale, on utilise à l'étape a) du procédé des racines de plantes hôtes de
Tuber magnatum.
Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise des racines originaires de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Salix, Ostrya, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus, le cas échéant sous la forme de plantes ou variétés hybrides.
Parmi les racines de plantes du genre Populus on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de peupliers : Populus nigra, Populus alba, Populus trichocarpa, Populus deltoïdes, Populus simonii, Populus tremula, Populus yunnannensis, Populus canescens et Populus lasiocarpa, ainsi que les hybrides de peupliers, y compris les hybrides de peupliers qui se sont fixés à l'état sauvage et les hybrides de peupliers qui forment des cultivars créés artificiellement par l'homme.
Parmi les racines de plantes du genre Cistus, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de cistes : Cistus albidus, Cistus crispus, Cistus creticus, Cistus incanus, Cistus monseliensis, Cistus ladaniferus, Cistus laurifolius, Cistus populifolius, Cistus salvifolius, Cistus clusii, Cistus inflatus et Cistus pouzolzii.
Parmi les racines de plantes du genre Qercus, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de chênes : Quercus rubra, Quercus agrifolia, Quercus alba, Quercus coccifera, Quercus faginea, Quercus nigra, Quercus robur, (=pedonculata) Quercus petraea, Quercus //ex, Quercus libani, Quercus pyrenaica et Quercus pubescens.
Parmi les racines de plantes du genre Corylus, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de noisetiers : Corylus maxima, Corylus colurna, Corylus chinensis, Corylus americana, Corylus avellana, Corylus cornuta, Corylus ferox, Corylus heterophylla, Corylus jacquemontii, Corylus sieboldiana et Corylus tibetica.
Parmi les racines de plantes du genre Tilia, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de tilleuls : Tilia platyphyllos, Tilia americana, Tilia amurensis, Tilia chinensis, Tilia cordata, Tilia dasystyla, Tilia xeuchlora, Tilia xeuropacea, Tilia xflavescens, Tilia henryana, Tilia insularis, Tilia intonsa, Tilia japonica, Tilia kiusiana, Tilia mandshurica et Tilia maximaowicziana.
Parmi les racines de plantes du genre Salix, on peut utiliser les racines provenant des espèces suivantes de saules : Salix caprea et Salix viminalis.
Parmi les racines de plantes du genre Ostrya, on peut utiliser les racines du charme- houblon (Ostrya carpinifolia). Parmi les racines de plantes du genre Daucus, on peut utiliser les racines provenant de n'importe laquelle des espèces de carottes couramment trouvées dans le commerce pour l'alimentation humaine ou des animaux d'élevage.
Préférentiellement, on utilise des racines provenant de plantes choisies parmi le peuplier, le ciste et la carotte, comme cela est illustré dans les exemples. De manière générale, le procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum selon l'invention est réalisé dans des conditions dites axéniques, c'est à dire dans des conditions contrôlées dans lesquelles le milieu de culture de l'étape a) ne comprend pas de microorganismes indésirables, par exemple des micro-organismes résultant d'une contamination indésirable des racines de plantes utilisées ou bien d'une contamination indésirable du milieu de culture mis en oeuvre.
Tout d'abord, comme pour toute culture cellulaire, on utilise un milieu de culture stérile.
La stérilité des racines ou bien des fragments de tissu de Tuber magnatum utilisés peut être obtenue selon des techniques conventionnelles bien connues de l'homme du métier, tels que l'élimination des micro-organismes par une ou plusieurs étapes de lavage, et/ou des étapes préalables d'incubation dans un tampon salin, par exemple un milieu de culture, comprenant des antibiotiques. On peut par exemple utiliser un milieu liquide ou solide comprenant un ou plusieurs antibiotiques choisis parmi le cefotaxime sodique, la carbenciline disodique, la vancomycine, l'ampiciline sodique, le claforan, le sulfate de streptomycine ou la tetracycline, par exemple à une concentration pouvant aller de 100 à 500 μg/mL
Dans certains modes de réalisation du procédé de l'invention, on réalise une décontamination préalable des racines de plante et le ou les fragment(s) de tissu de Tuber magnatum ne sont pas décontaminés, de telle sorte que les fragments de tissu de Tuber magnatum sont susceptibles de contenir des cellules d'une ou plusieurs espèces bactériennes qui sont présentes naturellement dans l'environnement de ce champignon lorsqu'il est retrouvé en pleine terre.
Dans d'autres modes de réalisation du procédé de l'invention, ledit procédé est réalisé dans des conditions totalement axéniques, avec décontamination préalable à la fois (i) du ou des fragment(s) de Tuber magnatum et (ii) des racines de plante, et utilisation d'un milieu de culture stérile.
Selon un aspect particulier de mise en oeuvre du procédé de l'invention, l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber. Dans un premier mode de réalisation de cet aspect particulier du procédé, l'étape a) de culture est réalisée avec des fragments de tissu de Tuber magnatum qui n'ont pas subi d'étape de décontamination par élimination des micro-organismes associés.
Dans un second mode de réalisation de cet aspect particulier du procédé, l'étape a) de culture est réalisée dans des conditions axéniques et des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber sont ajoutées au milieu de culture au début de l'étape a).
De manière générale, les bactéries naturellement associées aux champignons du genre
Tuber, et particulièrement les bactéries associées à Tuber magnatum, peuvent être choisies parmi les bactéries décrites par Barbieri et al. (2007, Environmental Microbiology, Vol. 9 (n °9) :
2234-2246). Préférentiellement, on ajoute des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia.
A titre illustratif, on peut utiliser une ou plusieurs souches de Stenotrophomonas maltophilia choisies dans le groupe constitué des souches déposées à l'ATCC et référencées sous les n°
BAA-902, 13637D-5, 13270, 13636, 13637, 13843, 14535, 15099, 17445, 17666, 17671 ,
17672, 17673, 17674, 17675, 17676, 17677, 17678, 17679 et 17806. Des illustrations de mise en oeuvre du procédé de l'invention dans lesquels on met en culture à l'étape a) les fragments de tissu de Tuber magnatum et les racines de plante en présence de bactéries associées aux champignons du genre Tuber, et plus particulièrement en présence de bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia sont décrites dans les exemples.
Lorsque le procédé de l'invention est réalisé dans des conditions axéniques avec ajout de bactéries exogènes naturellement associées aux champignon du genre Tuber, on ajoute au début de l'étape a) la quantité de bactéries appropriée pour obtenir une concentration finale d'au moins 10 et d'au plus 109 cellules bactériennes par ml_ de milieu de culture au moment de leur ajout.
Les exemples montrent qu'à l'étape a), la croissance des bactéries est très modérée.
Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que la présence de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber favorise le développement et la croissance du mycélium de Tuber magnatum.
Ainsi, dans des modes de réalisation préférés du procédé de l'invention, on cultive in vitro une combinaison ternaire de (i) fragment(s) de tissu de Tuber magnatum, (ii) des racines de plante et (iii) des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, et plus particulièrement des bactéries associées à Tuber magnatum.
Préférentiellement, l'étape a) de culture in vitro est réalisée à une température allant de 1 O0C à 300C et de manière tout à fait préférée allant de 150C à 250C.
Préférentiellement, l'étape a) de culture in vitro est réalisée à l'obscurité.
Le milieu de culture utilisé à l'étape a) peut être tout type de milieu de culture approprié, connu de l'homme du métier.
A titre illustratif, on utilise du milieu minimum, aussi désigné « Milieu M » dont la composition est décrite notamment par Bécart et al. (1988, New Phytol., Vol. 108 : 21 1 -218).
Préférentiellement, on utilise un milieu de culture comprenant un agent gélifiant.
On peut par exemple utiliser de la gélose comme agent gélifiant, afin de réaliser un milieu gélose. On peut aussi utiliser un agent gélifiant choisi parmi l'agar et le phytogel. On peut par exemple utiliser l'agent gélifiant commercialisé sous la désignation Phytagel® par la société Sigma-AIdrich.
La quantité d'agent gélifiant présent dans le milieu de culture peut être facilement adaptée par l'homme du métier. La quantité d'agent gélifiant dépend de l'agent gélifiant utilisé et de la viscosité finale désirée pour le milieu de culture utilisé à l'étape a) du procédé.
De manière générale, le milieu de culture utilisé à l'étape a) peut comprendre une quantité d'agent gélifiant d'au moins 3 pour cent en poids, par rapport au poids total du milieu de culture, de préférence d'au moins 5 pour cent en poids, par rapport au poids total du milieu de culture. Généralement, la quantité d'agent gélifiant est d'au plus 15 pour cent en poids, de préférence d'au plus 10 pour cent en poids, par rapport au poids total du milieu de culture.
L'étape a) peut être réalisée dans des types variés de conteneurs ou boîtes de culture. L'étape a) est classiquement réalisée dans des boîtes de Pétri. Le mycélium, associé ou non aux racines de plantes, est collecté à l'étape b) à un moment où l'homme du métier estime que la quantité de mycélium produit est suffisante pour l'utilisation qui est visée, par exemple pour réaliser une ou plusieurs sous-cultures de mycélium par repiquage ou bien pour réaliser une mycorhization de plantes. A titre illustratif, le mycélium peut être récupéré à l'étape b) lorsque sa taille à la fin de l'étape a) atteint 50 millimètres ou plus, par exemple 80 millimètres ou plus.
En général, pour collecter la quantité de mycélium suffisante pour réaliser des sous- cultures ou des mycorhizations, la durée de l'étape a) du procédé est d'environ au moins trois semaines, par exemple d'environ au moins quatre, cinq ou six semaines. La durée de l'étape a) peut être supérieure à six semaines mais cela n'est en général pas nécessaire puisque la quantité de mycélium produit est suffisante pour réaliser des sous-cultures. Pour une production massive d'inoculum, en vue d'une mycorhization contrôlée, les cultures peuvent être entretenues pendant plusieurs mois, par exemple pendant une durée de deux mois ou plus et pouvant aller jusqu'à douze mois. Comme cela est illustré dans les exemples, le mycélium qui est collecté à l'étape b) peut ensuite être utilisé pour réaliser des sous-cultures.
Ainsi, grâce au procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum qui est décrit ci- dessus, on obtient du mycélium dont la culture peut ensuite être poursuivie sur une longue période de temps, sans nécessiter à nouveau le recours à l'utilisation de fragments de tissu de Tuber magnatum, autres que le mycélium qui est collecté à l'étape b).
Dans des modes de réalisation préférés, le procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprend une étape de repiquage du mycélium collecté à l'étape b), en présence de racines de plantes, afin de réaliser un ou plusieurs sous-cultures de mycélium de Tuber magnatum en présence de nouvelles racines de plantes (ROC ou hairy roots). Dans d'autres modes de réalisation préférés, le mycélium de Tuber magnatum collecté à l'étape b) est ultérieurement utilisé dans un procédé de mycorhization de plantes.
La réalisation de sous-cultures de mycélium ou la réalisation d'un procédé de mycorhization nécessite une étape de repiquage du mycélium collecté à l'étape b) du procédé ci-dessus, par transfert dans un milieu de culture approprié. En conséquence, dans certains modes de réalisation, le procédé selon l'invention comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture.
Dans les modes de réalisation du procédé dans lesquels on réalise des sous-cultures, ledit procédé comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) ;
Le mycélium peut-être cultivé, ou « sous-cultivé » in vitro à l'étape d) pendant plusieurs semaines, tant que le milieu de culture contient suffisamment de nutriments permettant le maintien ou la croissance du mycélium, sans perte de viabilité. De manière générale, on a montré dans les exemples que du mycélium collecté à l'étape b) du procédé pouvait être repiqué et cultivé in vitro pendant au moins six semaines.
De manière générale, le milieu de culture utilisé à l'étape d) peut être le même que le milieu de culture utilisé à l'étape a). Dans certains modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en l'absence de racines de plante et sans ajout de bactéries exogènes.
Lorsqu'aucun ajout de bactéries exogènes n'est effectué aux étapes c) et d), des bactéries peuvent néanmoins être présentes. En effet, dans les modes de réalisation de l'étape a) dans lesquels des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber sont présentes dans le milieu de culture, ces bactéries colonisent le mycélium en croissance et peuvent être transférées avec le mycélium collecté à l'étape b) pour les étapes suivantes de procédé.
Dans certains autres modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en l'absence de racines de plante mais on ajoute des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, en particulier des bactéries naturellement associées aux Tuber magnatum, telle que Stenotrophomonas maltophilia. Dans ce cas, les bactéries sont ajoutées dans la même gamme de quantité que pour l'étape a) du procédé.
Dans encore d'autres modes de réalisation des étapes c) et d), le mycélium est incubé dans le milieu de culture en présence de racines de plante. On peut utiliser l'un quelconque des types de racines de plante qui peut être mis en oeuvre pour réaliser l'étape a) du procédé.
Ainsi, dans certains modes de réalisation des étapes c) et d), le milieu de culture comprend (i) du mycélium de Tuber magnatum, (ii) des racines de plante et (iii) des bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber, en particulier des bactéries associées aux Tuber magnatum.
Il résulte de l'exposé qui précède que la présente invention concerne aussi un procédé de repiquage de mycélium de Tuber magnatum, ou de réalisation d'une sous-culture de mycélium de Tuber magnatum, qui comprend les étapes suivantes :
A) placer dans un milieu de culture du mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape b) du procédé d'obtention décrit ci-dessus, et
B) cultiver dans ledit milieu de culture le mycélium incubé à l'étape A).
Les caractéristiques des étapes A) et B) du procédé ci-dessus sont identiques aux caractéristiques des étapes c) et d) du procédé d'obtention de mycélium de Tuber magnatum décrit précédemment. La présente invention est également relative à un mycélium de Tuber magnatum qui a été collecté à l'étape b) du procédé d'obtention décrit ci-dessus.
La présente invention concerne aussi un mycélium de Tuber magnatum qui a été obtenu à la fin de l'étape d) du procédé d'obtention décrit ci-dessus. L'invention a aussi pour objet un mycélium de Tuber magnatum qui a été obtenu à la fin de l'étape B) du procédé de repiquage décrit ci-dessus.
Le mycélium de Tuber magnatum qui peut être obtenu (i) soit à l'étape a) du procédé d'obtention ci-dessus, (ii) soit à l'étape d) du procédé d'obtention ci-dessus, (iii) soit à l'étape B) du procédé de repiquage ci-dessus, peut être ensuite utilisé pour la mycorhization de plantes en vue de produire des truffes blanches prêtes à être consommées.
On peut utiliser des techniques de mycorhization conventionnelles bien connues de l'homme du métier qui ont déjà été appliquées à des espèces de champignons autres que Tuber magnatum. Ainsi, la présente invention est également relative à un procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules ou de boutures avec un mycélium de Tuber magnatum, en interaction ou non avec des racines de plantes, obtenu
- par le procédé d'obtention décrit ci-dessus, - par le procédé de repiquage décrit ci-dessus, ou
- avec un mycélium de Tuber magnatum tel que décrit ci-dessus; b) culture in vitro des plantules inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes.
Pour la production d'inoculum et la réalisation du procédé de mycorhization ci-dessus, l'homme du métier peut se référer à de nombreuses publications ou ouvrages les décrivant, par exemple à l'article de Bokor (1954, Erdészeti Kutatàsok, Budapest, Vol. 1 1 , pp. 27-45), à l'article de Le Tacon et Valdenaire (1980, Revue Forestière Française, Vol. XXXII, n°3, pp.
1664-1668), à l'article de Le Tacon et al. (1983, Annales des Sciences Forestières, vol.40, n°2, pp. 165-176), à l'article de Boutekrabt et al. (1990, Agronomie, Vol. 2, pp. 127-132), à l'article de Garbaye et Churin (1997, Forest Ecology and Management, Vol. 98, pp. 221 -228), à l'article de Bécard et Piché (1989, Appl. Environ. Microbiol., Vol. 55, pp. 2320-2325), à l'article de
Mortier et al. (1989, Agric. Ecosyst. Environ., Vol. 28, pp. 351 -354), ou encore à l'article de
Wenkart et al. (2001 , Plant CeII Reports, Vol. 20, pp. 369-373).
Pour la mise en oeuvre du procédé de mycorhization ci-dessus, on utilise de préférence des plantules d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus,
Populus, Quercus, Cistus et Daucus, le cas échéant sous la forme de plantes ou variétés hybrides.
De manière tout à fait préférée, on utilise des plantules ou boutures choisies parmi Salix,
Ostrya, Populus, Quercus et Cistus. Dans certains modes de réalisation du procédé de mycorhization ci-dessus, celui comprend une étape c) de repiquage en terre des plantules mycorhizées obtenues à l'étape b). De manière générale, des truffes blanches, prêtes à être consommées sont obtenues après une durée d'au moins environ trois ans, parfois d'au moins environ six ans, suivant l'étape c) de repiquage en pleine terre.
La présente invention est également illustrée par les exemples de réalisation ci-après.
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé de production de mycélium de Tuber magnatum
1 -Travaux préliminaires :
A) Production de racines d'une plante hôte de Tuber magnatum, transformées par A . rhizogenes : Le peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba, clone INRA 717-1 B4)
A1) Transformation de boutures de Peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba) INRA
717-1 B4 par différentes souches d'A. rhizogenes.
Quatre souches bactériennes ont été testées (souches fournies par Yves Dessaux, DR CNRS,
Gif/Yvette. Ces souches appartiennent au domaine public et sont largement exploitées dans le milieu scientifique).
Il s'agit des souches :
- 15834 : Souche à mannopine et agropine
- 8196 : Souche à mannopine
- 2659 : Souche à mannopine - 1724 : Souche à mannopine
Dans un premier temps, une production classique de racines transformées par A. rhizogenes a été réalisée. Cela nécessite la mise en contact des souches bactériennes avec des tissus blessés de Peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) : fragments de feuilles et tiges issues de boutures produites en conditions axéniques au laboratoire INRA de l'UMR
1 136.
Des excellents résultats de transformation ont été obtenus avec les souches 15834 (100%) et 1724 (75%).
De ces travaux, une sélection d'un clone racinaire a été réalisée. Il est issu de la transformation du Peuplier (hybride Populus tremula x Populus alba INRA 717-1 B4) par la souche 15834 d'A. rhizogenes.
La transformation et l'entretien des racines transformées (« hairy roots » ou « Root Organ Cultures » -ROC-) se fait sur le milieu minimum, milieu M (Bécard et al. 1988, New Phytol. 108:21 1 -218) II est important de noter que les racines transformées par la souche 15834 d'Agrobacterium rhizogenes ne sont pas des Organismes Génétiquement Modifiés (OGM). Il s'agit seulement d'une transformation naturelle générée en conditions contrôlées et axéniques. 2-Mise en culture de Tuber maanatum :
Mise en contact de morceaux de carpophore de T. magnatum (1 cm3 environ) avec des racines (hairy roots) de ciste {Cistus incanus) et/ou de peuplier (Populus tremula x Populus alba) le 1 1 janvier 2006 sur milieu M (voir composition milieu minimum, dit « milieu M »). D'autres espèces hôtes ou éventuellement non hôtes pourrait être exploitées pour la synthèse de racines transformées dans la perspective de produire du mycélium de Tuber magnatum.
1. Matériel biologique : Racines de peuplier (Populus tremula x Populus alba, clone INRA 717-1 B4) transformées par la souche 15834 d'A rhizogenes.
Racines de Ciste (Cistus incanus) transformées par Agrobacterium rhizogenes.
Morceaux de carpophores de truffe blanche (Tuber magnatum) identifiés comme appartenant à la souche Tm(520).
2. Initiation de la culture du mycélium de truffe ( Tuber magnatum)
Après 2 à 3 semaines de culture à 25^ dans l'obscurité, on constate un développement du champignon, sous forme mycélienne, à partir des morceaux de carpophore en présence de racines transformées de Cistus, mais surtout en présence de racines de Peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes. Cette initiation de la croissance est induite sans même qu'il y ait contact entre les racines transformées et le morceau de carpophore, suggérant une induction de la croissance par des composés d'origine racinaire (présents dans les exsudats de racines transformées). Il est à noter que, dans ces conditions de culture, la racine introduite n'est pas mycorhizée. Dès cette première étape de culture, un troisième « partenaire » biologique est identifiable :
On note la présence récurrente d'une (ou plusieurs espèces) bactérienne(s). Le typage moléculaire (région 16S de l'ADN) de cultures bactériennes, isolées à partir de cette 1 ere expérience, révèle qu'il s'agit d'une souche de Stenotrophomonas maltophilia. Cette bactérie pourrait être également impliquée dans la croissance mycélienne.
Exemple 2 : Procédé de repiquage, ou de réalisation de sous-cultures, du mycélium de tuber magna tu m
Repiquage de l'ensemble du système (racine + mycélium + bactérie(s)) dans un milieu identique à celui utilisé à l'exemple 1. On note une très bonne croissance et une excellente reprise, indiquant la possibilité de réaliser des « sous-cultures » de cette première culture mycélienne de Tuber magnatum. A partir de cette nouvelle boîte, un nouveau repiquage est réalisé le 9/02/2007. Une bonne reprise de croissance de T magnatum est observée. Cette fois, seul le mycélium (avec éventuellement la ou les espèces bactériennes) a été prélevé et mis en contact de racines transformées de peuplier, fraîchement repiquées. On observe une très bonne croissance dans la totalité des boîtes de culture. La Figure 1 illustre la croissance du mycélium de Tuber magnatum en fonction du temps de culture. On peut noter que toutes les sous-cultures sont réalisées en présence de nouvelles racine de Peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba), transformées par A. rhizogenes, en croissance. Le mycélium seul ne pousse presque plus en absence de racine. On observe simplement quelques hyphes fongiques très dispersées en « recherche » du partenaire végétal, suivi d'un ralentissement rapide de la croissance. Les racines, les exsudats racinaires ou les métabolites issus de ces racines semblent être indispensables à la croissance du champignon. Le rôle positif (et donc la présence) de certaines bactéries, comme Stenotrophomonas maltophilia pourrait également être déterminant. Il faut noter que dans cette interaction, au moins tripartite, le développement bactérien est très modéré, éventuellement régulé par les autres éléments présents dans le milieu.
Exemple 3 : Typaqe moléculaire de la spécificité de la culture de mycélium de Tuber magnatum
On a vérifié, par typage moléculaire, la spécificité de la culture mycélienne (Tuber magnatum). On a réalisé une extraction des ADN et on a réalisé le séquençage des ADNs extraits.
On a confirmé le maintien de Tuber magnatum en culture axénique par la comparaison avec les bases de données du NCBI {h\t2h{l^^^.:Ω.ΦλS}.π\:B}h-£0lϋ des séquences de la région
ITS de l'ADNr amplifliées à partir de l'ADN extrait du mycélium néoformé en présence de hairy roots (Ciste et peuplier) et des morceaux de carpophore de Tuber magnatum, initialement fournis (Tm 520) : 98 à 100% d'homologie après correction des séquences brutes.
Exemple 4 : Procédé de production de mycélium de Tuber magnatum
Mise en contact de différents morceaux de carpophore de Tuber magnatum (issus de différentes truffes - carpophores -) avec des racines de ciste (Cistus incanus) transformées par A. rhizogenes.
Mise en interaction des racines transformées et des morceaux de carpophores sur milieu M, le 9/02/2007.
- Tm(614) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(616) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(616) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(618) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(620) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(631 ) + /- Cistus incanus (hairy root) - Tm(645) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(650) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(653) + /- Cistus incanus (hairy root)
- Tm(659) + /- Cistus incanus (hairy root)
Les expériences ont été réalisées à partir de morceaux de truffe blanche (Tuber magnatum) issus de 9 carpophores différents prélevés en pleine terre.
Quelques expériences d'interactions ont également été réalisées entre les racines de peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes et T. magnatum.
Tout d'abord, on constate que la croissance de Tuber magnatum est initiée très rapidement en présence de racines de peuplier (hybride Populus tremula X Populus alba) transformées par A. rhizogenes. La croissance du champignon est manifestement plus importante dans ces conditions qu'en présence de racines de Cistus incanus transformées par A. rhizogenes.
Dans l'expérience consistant à comparer la croissance de Tuber magnatum, à partir de morceaux de carpophores, en présence et en absence de racine de Cistus incanus transformées par A. rhizogenes, on constate que pour 60% (6/10) des boîtes contenant les deux partenaires biologiques (racines et champignon) la croissance de Tuber magnatum est stimulée. En absence de racine, aucune croissance mycélienne de Tuber magnatum n'est observable à partir de morceaux de carpophores dans nos conditions de croissance (milieu M, 250C et obscurité).
La Figure 2 illustre cette stimulation de la croissance mycélienne de Tuber magnatum en présence ou en l'absence de racines de Cistus incanus transformées par A. Rhizogenes, six semaines après l'incubation des morceaux de carpophores de T magnatum avec les racines transformées de Cistus incanus.
Exemple 5 : Procédé de réalisation de sous-cultures de mycélium de Tuber magna tu m en présence de racines de Daυcυs carota II est important de souligner que des racines de carotte (clone DC1 ), transformées par A. rhizogenes (fournies par le Pr. G. Bécard), stimulent également la croissance de Tuber magnatum, à partir des cultures de T. magnatum obtenues en interaction avec les racines transformées de Cistus ou Populus (souche T magnatum. Tm520). La stimulation de croissance de Tuber magnatum est moins importante qu'avec les racines de Populus ou Cistus. Cependant, ces résultats démontrent que des racines transformées de plantes non hôtes ont un effet positif sur la croissance mycélienne de ce champignon (voir figures 3 à 6). Les figures 3 à 6 montrent la souche Tm520 de Tuber magnatum en interaction ou non avec des hairy roots (racines transformées par A. rhizogenes) de diverses plantes, respectivement Populus (figure 4), Daucus carota (figure 5) et Cistus (figure 6). Il est à noter que dans ces conditions de culture, la racine présente dans le milieu de culture n'est pas mycorhyzée.
Exemple 6 : Procédé de mycorhization avec le mycélium de Tuber magnatum.
Plusieurs procédés de mycorhization contrôlée du peuplier par T. magnatum on été mis au point. Quel que soit le procédé, on met en interaction des boutures de peuplier (hybride 717- 1 B4 Populus tremula X Populus alba) avec le mycélium de Tuber magnatum issu des cultures axéniques de T. magnatum en interaction avec les hairy roots (ROC) de peuplier. Différents systèmes ont été développés.
Selon une première alternative de procédé, des cultures axéniques en tube ont été réalisées. Des fragments de boutures stériles de peuplier sont déposés sur du milieu M coulé stérilement dans des tubes de verre. Après développement du système racinaire (2 semaines), un explant de gélose contenant une forte densité de mycélium de T. magantum (issu d'une culture axénique ROC x T. magnatum) est déposé dans le fond du tube.
Selon une seconde alternative de procédé, des mycorhizations de racines de peupliers ont été réalisées sur boîtes de Pétri carrées (Figure 7). Un milieu gélose (milieu M contenant seulement 1 g/l de saccharose) est déposé sur la moitié inférieure de la boîte et deux morceaux de tige de peuplier (boutures) sont introduits dans le milieu pour générer de nouvelles boutures. Les boîtes sont incubées à une température de 20 à 250C avec une alternance jour/nuit (12h/12h). Les parties inférieures des boîtes sont protégées de la lumière par des pochettes plastiques noires ou de l'aluminium. Après initiation des bourgeons (partie supérieure de la boîte) et des racines (dans le milieu gélose, en partie inférieure), un explant gélose d'au moins 2 à 3 cm2 et contenant du mycélium de T. magnatum (issu d'une culture axénique ROC x T. magnatum) est déposé sur la partie gélosée colonisée par les racines. Les premiers résultats ont montré une initiation de la croissance de T. magnatum en présence des racines de boutures de peuplier. Après plusieurs semaines, ou mois, de contact, la formation de manchons fongiques (similaires à des ectomycorrhizes) est observable sur certaines extrémités racinaires.
Exemple 7 : Application du procédé de production du mycélium de T. magnatum pour T. melanosporum.
Des fragments de mycélium de T. melanosporum (Mel-28) ont été mis en culture dans du milieu M, en présence (+ cistus) et en l'absence de racines de ciste (Cistus incanus) transformées par A. rhizogenes. Des conditions de culture analogues à celles de l'exemple 5 ont été utilisées. Comme l'illustre la figure 8, il n'a pas été observé de différence significative de croissance du mycélium en présence et en l'absence de racine transformée à la fin de la période de culture. Par ailleurs, la vitesse de croissance du mycélium a été similaire en présence et en l'absence de racine pendant toute la durée de l'incubation.
Ces expériences mettent donc en évidence que, dans les conditions de culture utilisées, la croissance du mycélium de T. melanosporum n'est pas induite par la présence de racines dans le milieu de culture, contrairement à ce qui a été montré pour T. magnatum.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'obtention de mycélium de Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) cultiver in vitro un ou plusieurs fragments de tissu de Tuber magnatum en présence de racines de plante, et b) collecter le mycélium de Tuber magnatum obtenu à la fin de l'étape a).
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les fragments de tissu de Tuber magnatum sont choisis parmi des fragments de carpophore, des fragments de mycorhize et des fragments de mycélium.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que les racines de plantes consistent en des racines transformées par Agrobacterium rhizogenes.
4. procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les racines proviennent de plantes d'un genre choisi parmi Pinus, Picea, Abies, Corylus, Castanea, Tilia, Cedrus, Populus, Quercus, Cistus et Daucus.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les racines proviennent de plantes choisies parmi le peuplier, le ciste et la carotte.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape a) de culture in vitro est réalisée dans un milieu de culture comprenant une ou plusieurs souches de bactéries naturellement associées aux champignons du genre Tuber.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend des bactéries de l'espèce Stenotrophomonas maltophilia.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape a) est réalisée à l'obscurité.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) transférer le mycélium collecté à l'étape b) dans un milieu de culture.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : d) cultiver dans ledit milieu de culture exempt de racine, le mycélium transféré à l'étape c) ;
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'à l'étape d) le mycélium est cultivé pendant une durée allant jusqu'à 6 semaines ou plus
12. Mycélium de Tuber magnatum caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1.
13. Procédé de mycorhization de plantes par Tuber magnatum comprenant les étapes suivantes : a) inoculation par mise en contact des racines de plantules avec un mycélium de Tuber magnatum selon la revendication 12 ; b) culture in vitro des plantules inoculées obtenues à l'étape a) jusqu'à l'apparition de mycorhizes.
14. Procédé selon la revendication 13 , caractérisé en ce qu'il comprend une étape c) de repiquage en terre des plantules mycorhizées obtenues à l'étape b).
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