EP2254910A1 - Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie - Google Patents

Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie

Info

Publication number
EP2254910A1
EP2254910A1 EP09712515A EP09712515A EP2254910A1 EP 2254910 A1 EP2254910 A1 EP 2254910A1 EP 09712515 A EP09712515 A EP 09712515A EP 09712515 A EP09712515 A EP 09712515A EP 2254910 A1 EP2254910 A1 EP 2254910A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pinch
tumor
radiation
seq
chemotherapy
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09712515A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nils Cordes
Michael Baumann
Iris Eke
Ulrike Koch
Veit Sandfort
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Dresden filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP2254910A1 publication Critical patent/EP2254910A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]

Definitions

  • the invention relates to the use of agents to increase the sensitivity of tumor cells to treatment with radiation and / or chemotherapy.
  • the object of the present invention is to render the tumor cells more sensitive to the treatment by radiation and / or chemotherapy in order to reduce the duration and intensity of the radiation and / or chemotherapy and thus also the side effects associated with the radiation and / or chemotherapy.
  • the object is achieved by the administration of substances which block or limit the function of the PINCH-I protein.
  • the PINCH-I protein is sometimes also referred to in the literature as LIMS1 or "L / M and senescent cell antigen-like domains 1."
  • tumor cells are administered the substances according to the invention
  • the blocking of the PINCH-I protein (functionally or on the expression level) in tumor cells leads to an increase in the number of malignant tumors in hematological and solid tumors After treatment with radiation and / or cytostatics (chemotherapy), the tumor cells show a significantly reduced survival rate compared to those tumor cells in which the PINCH-I protein had not been blocked.
  • Chemotherapeutic agents are preferably selected from 5'-deoxy-5-fluorouridine, 5-fluorouracil, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, 9-aminocamptothecin, abarelix, azacitidine, actinomycin D, aldesleukin, alemtuzumab (MabCampath®), alitretinoin, altretamine, ametantrone , Amifostine, aminoglutethimide, amsacrine, anagrelide, anastrozole, arsenic (III) oxide, asparaginase, atrasentan (Xinlay®), azathioprine, BCG live (Theracys), bendamustine, bevacizumab, bexarotene, bicalutamide,
  • irradiation is preferably the irradiation with photons (X-rays, ⁇ -
  • the invention includes the use of substances for sensitizing
  • Protein is blocked or restricted at the gene expression or protein level.
  • the invention further encompasses a method of treating a tumor patient in which tumor cells are first sensitized to radiation and / or chemotherapy by the administration of substances which block or limit the function of the PINCH-I protein at the gene expression or protein level, and subsequently treated by radiation and / or chemotherapy.
  • the method of treating a benign or malignant tumor in a subject includes the following steps: a) One or more substances that block or limit the function of the PINCH-I protein at the gene expression or protein level are becoming a tumor-bearing animal administered topically or systemically, whereby the tumor is sensitized against the taking place in step b) radiation and / or chemotherapy. b) The tumor is then treated by radiation and / or chemotherapy.
  • the living being can be an animal or a human.
  • the erf ⁇ ndungsdorfe method is suitable for use in humans.
  • substances which block or limit the function of the PINCH-I protein are understood in the broadest possible sense. This includes both substances that inhibit the PINCH-I protein at the protein level by direct binding, such as antibodies or natural or modified ligands, as well as substances that prevent or significantly reduce expression of the gene at the transcriptional or posttranscriptional level and thereby cause no or insufficient PINCH-I protein to be formed, such as RNA interference or transcription factors.
  • the use of the substances according to the invention is preferably suitable for all types of tumors in which the PINCH-I protein is present, preferably for those tumors in which the PINCH-1 protein is overexpressed.
  • substances which block the function of the PINCH-I protein are understood to be active substances which are suitable for reducing, suppressing or preventing the function of the PINCH-I protein at the level of gene expression or protein level. They include, inter alia, organic chemical compounds, peptide analogues, peptide mimetics, nucleic acids, oligo- and polynucleotides, antibodies, etc.
  • the substances can either be administered directly as an active ingredient or be formed as so-called "prodrugs" by the body's own metabolism.
  • PINCH-1 antibodies preference is given to anti-PINCH-1 antibodies, PINCH-1-dsRNA, PINCH-1 siRNA, PINCH-I-hairpin (sh) RNA and PINCH 1-morpholinos (also called Morpholino oligos, phosphorodiamidate morpholino oligos or PMOs).
  • anti-PINCH-1 antibodies are used which recognize and bind the PINCH-I protein in a highly specific manner. After the antibodies have been administered to the tumor cells, the tumor cells are treated with radiation and / or chemotherapy. The binding of the antibodies to the PINCH-I protein blocks its function and leads to an increased sensitivity of the tumor cell Irradiation or chemotherapy. The survival rate of the tumor cells after the treatment with radiation or chemotherapy is thereby significantly reduced.
  • Monoclonal anti-PINCH-1 antibodies in particular humanized anti-PINCH-1 antibodies, are preferably used.
  • a humanized monoclonal antibody comprises the PINCH I-binding hypervariable regions of the monoclonal antibody of the invention and the framework regions of the variable and constant regions of the light and heavy chains of a human antibody.
  • Methods for the production of humanized antibodies are known and u.a. in Morrison et al. (1984), Jones et al. (1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988), Queen et al. (1989) and Tempest (1991).
  • antibodies in the sense of the invention are further various modified forms of antibodies to understand, such as fragments such as the Fv fragment, the Fab fragment, the (Fab) '2 fragment or single-chain antibody (genetically engineered bispecific antibodies, the consist only of two binding domains connected by short linkers).
  • fragments such as the Fv fragment, the Fab fragment, the (Fab) '2 fragment or single-chain antibody (genetically engineered bispecific antibodies, the consist only of two binding domains connected by short linkers).
  • Methods for making F (ab 2 ) or F (ab) fragments are known and described in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, http://www.wiley.com/legacy/cp/cpi/).
  • Antibodies according to the invention are, for example, a monoclonal mouse anti-PINCH-1 antibody of the IgG1 isotype (clone PINCH-C58, Sigma-Aldrich, DE), a mouse monoclonal anti-PINCH-1 antibody of the IgM isotype (clone PINCH Sigma-Aldrich, DE) and a monoclonal mouse anti-PINCH antibody of the IgG2a isotype (clone 49, Becton Dickinson, DE).
  • RNA interference is meant a mechanism in which the expression of a gene is inhibited by the use of targeting RNA molecules.
  • the molecules which suppress expression of the PINCH-I protein by RNA interference are so-called siRNA (small interfering RNA) molecules.
  • siRNA molecules are short single- or double-stranded RNA molecules that encode the Specifically inhibit expression of a target gene.
  • the administration of PINCH-1 siRNA prevents the tumor cell from expressing the PINCH I gene and thus forms PINCH I protein. This also leads to an increased sensitivity of the tumor cell to radiation or chemotherapy.
  • Preferred siRNAs of the invention are oligonucleotides of 18 to 30 nucleotides, preferably 21 to 23 nucleotides, which consist either of a single strand of RNA which belongs to a partial sequence of the human PINCH-1 cDNA (SEQ ID No. 1, Genbank Accession Number NM 004987), or consist of an RNA double strand of which one strand is homologous to a partial sequence of the PINCH-1 cDNA (SEQ ID No. 1), the other is complementary to the first strand.
  • Homologous means an identity between two sequences of at least 80%, preferably more than 90%, particularly preferably more than 95%.
  • the PINCH-1 cDNA is the DNA strand that is obtained when one of the
  • PINCH-I gene transcribed mature mRNA translated by the enzyme reverse transcriptase into a DNA strand complementary to this mRNA.
  • gagttatcaa agccatgaat aacagctggc atccggagtg cttccggtgt gacctctgcc
  • PINCH-1 cDNA is meant all sequences having a sequence of SEQ ID No.1 of 95% or greater, preferably 98% or greater.
  • the preparation of the siRNA is carried out according to a method familiar to the person skilled in the art.
  • PINCH-1 siRNA examples are, for example, the polynucleotides according to SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 5, as well as variants (homologs) thereof which are slight in the sequence but still block the function of the PINCH I protein.
  • homologous variants of the polynucleotides according to SEQ ID No.2 to 5 of these differ in at most 1 to 4 nucleotides, preferably in not more than one or two nucleotides.
  • nucleotide sequences with altered backbone encompasses all other linear polymers in which the bases adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and uracil (U) or thymine (T) are arranged in a corresponding sequence, such as Sequences with a phosphothioate, phosphoramidate or O-methyl derivatized backbone, peptide nucleic acids (PNA), locked nucleic acids (LNA), mixed backbone nucleic acids or morpholinos, and fluorochrome (green / red / etc., Fluororescence proteins) Sequences, and which can inhibit the expression of the PINCH-I gene.
  • the tumor cells are treated in vitro with radiation and / or cytostatics (chemotherapy).
  • a conventional 200 kV X-ray tube 13 mA, ⁇ 1.3 Gy / min
  • a conventional 200 kV X-ray tube 13 mA, ⁇ 1.3 Gy / min
  • cytostatics for example, cisplatin (Platinex®, Bristol-Myers-Squibb, Kunststoff) and mitomycin-C (Mitomycin medac®, Society for clinical special preparations mbH, Wedel) are used.
  • the cells were significantly more sensitive to treatment with X-rays or cytostatics, ie the Survival of these cells after radiation or chemotherapy was significantly reduced in comparison to PINCH-I expressing control cells.
  • Cells were spread in two- or three-dimensional cell culture models and exposed to X-rays (200 kV, 13 mA, ⁇ 1.3 Gy / min, 0-10 Gy) or the cytostatic agents cisplatin (Platinex®) or mitomycin-C (mitomycin medac®) in a concentration of 0 - 10 .mu.mol / 1 (Ih or 24h) treated.
  • Clonogenic cell survival ie the proliferative integrity of the treated cells, was measured. The grown cell colonies were fixed, stained and the colony count was determined microscopically.
  • FIG. 1 shows a Western blot which demonstrates that in mouse cells in which the PINCH-I-coding gene has been switched off, no PINCH-I protein is formed (right), in contrast to control cells in which PINCH-I - Protein is present (left).
  • FIG. 2 shows the clonogenic survival rate of mouse cells in which the PINCH-I-encoding gene has been switched off, as well as of wild-type control cells, after irradiation (FIGS. 2a, d) and after treatment with the cytostatic agent cisplatin (FIG. 2b), FIG. Mitomycin C ( Figure 2c) in two ( Figure 2a, b, c) and three-dimensional ( Figure 2d) cell cultures.
  • Embodiment 2 is a diagrammatic representation of Embodiment 1:
  • 3 ⁇ 10 5 tumor cells were plated on 6-well plates (BD, Heidelberg) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Düsseldorf) with glutamax-I (L-alanyl-L-glutamine), 10% serum (FCS Biochrom, Berlin) and 1% non-essential amino acids (Gibco, Düsseldorf) and cultured at 37 ° C and 7% CO 2 .
  • the cells were washed once with Opti-MEM I (Invitrogen, Düsseldorf) and were transfected serum-free into Opti-MEM I with oligofectamine (0.2%) and 20 nmol / 1 PINCH-1 siRNA for 8 h. Subsequently, 10% serum was added and the cells incubated for a further 16 h at 37 0 C and 7% CO 2 . A total of 24 h after transfection, the cells were washed with phosphate buffered saline (PBS, PAA, Cölbe) and detached with trypsin / EDTA solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Fig. 4 shows that the survival rate after irradiation in the tumor cells after treatment with PINCH-1 siRNA is significantly reduced compared to the cells with control siRNA (co or co siRNA).
  • siRNA was transfected at a concentration of 20 nmol / l and the cells were irradiated 48 h later with 0-6 Gy.
  • the sensitivity of tumor cells to radiation or chemotherapy can be increased.
  • the cells were incubated on 24-well plates (BD, Heidelberg) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Düsseldorf) with glutamax-I (L Alanyl-L-glutamine), 10% serum (FCS; Biochrom, Berlin) and 1% nonessential amino acids (Gibco, Düsseldorf).
  • FIG. 5 shows the cell survival of human colorectal tumor cell lines (HCT-116, DLD-I) with anti-PINCH-1 antibodies (clone PINCH-C58 (Sigma P8896), clone PINCH-N 173 (Sigma P9371), clone 49 (FIG. Beckton-Dickinson Cat # 612711) or non-specific control antibody (co) were treated 24 hours prior to irradiation (0 or 4 Gy) Tumor cells were significantly sensitized by treatment with the specific anti-PINCH-1 antibodies to radiation compared to the control cells.
  • HCT-116, DLD-I anti-PINCH-1 antibodies
  • mice 7 to 14-week-old, male and female immunosuppressed NMRI (genotype nu / nu, absence of thymus and hair) Mice (Experimental Center of the Faculty of Medicine, Dresden University of Technology) were treated 1 to 5 days before tumor transplantation by whole body irradiation ( 1 x 4 Gy, 200 kV X-Rays, 0.5 mm copper filter, 1 Gy / min) are further immunosuppressed.
  • the animal stables had a 12-hour daylight-dark cycle (the light was switched on at 7.00 in the morning), a constant temperature of 26 ° C and a relative humidity of 50 - 60%.
  • the mice were fed on a commercially available diet for laboratory animals and possibly water.
  • the immortalized Pinchl 7 " and Pinchfl / fl mouse fibroblasts were injected subcutaneously into the axillae of recipient mice, after which tactile knots had been formed, the tumors were excised and subcutaneously transplanted into a group of animals Of these, tumors were excised at an average rate of growth, cut into pieces about 1 mm in size, placed in medium and stored in liquid nitrogen for further experiments.
  • the obtained tumor pieces were transplanted on the back of 5 mice (first passage). After tumors having a diameter of 10 to 15 mm were formed, the middle growth tumor was excised and pieces about 1 mm in size were transplanted on the backs of 10 other animals (second and third passage). For the experiments were tumors of the second and third Passage with a medium growth rate was excised and pieces about 1 mm in size were transplanted subcutaneously into the right hind leg.
  • the excised tumors were characterized by being subjected to DNA or protein isolation. The presence of the Pinchl knockout in Pinchr 'tumors or the Pinchl floxed sequence in Pinchl fl / fl tumors was checked by PCR. The expression of PINCHI protein was checked by Western Blot.
  • the local irradiation of the tumors was performed with 200 kV X-rays (0.5 mm copper filter, radiation dose 1 Gy / min, Röntgentechnike Seifert) on the right hind leg. After the tumor reached a volume of 0.10 to 0.32 cm, the animals were randomly distributed in groups of four animals to the different radiation doses. Single doses of 26, 32, 38, 44, 50, 56, or 62 Gy were obtained with local, disconnected blood flow of the thigh of the tumor-bearing leg of anesthetized mice (120 mg / kg body weight of ketamine ip (intraperitoneal) and 16 mg / kg of xylazine ip) 2 Applied minutes later. Pinchl fl / fl - and Pinchr 'tumors were evenly distributed across the different dose groups.
  • the diameter of the tumors was determined twice weekly with a vernier caliper.
  • the tumor volume was calculated by the formula for an ellipsoid of revolution ( ⁇ / 6 • a • b 2 ), where a is the longest, and b is the shorter, perpendicular tumor axis.
  • the tumor growth time (TGT) of unirradiated and irradiated Pinchl fl / fl and Pinchr 'tumors was determined directly from the growth curves of individual tumors as the time required after the start of the experiment to assess the 2- (TGTy 2 ) or 5 times (TGT vs) of the initial volume.
  • FIG. 6a shows a plot of tumor volume versus time after irradiation, figure 6b, the Kaplan-Meier analysis, that the survival without recurrence of new tumors subcutaneously growing Pinchl fl / fl - and Pinchr '-Allograft tumors in immunosuppressed mice.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Stoffen zur Erhöhung der Sensibilität von Tumorzellen gegen eine Behandlung mit Bestrahlung und/oder Chemotherapie. Dies wird erreicht durch die Verwendung von Substanzen, die die Funktion des PINCH-1-Proteins blockieren oder einschränken, zur Sensibilisierung von Tumorzellen gegen Bestrahlung und/oder Chemotherapie.

Description

Verwendung von Substanzen zur Sensibilisierung von Tumorzellen gegen Bestrahlung und/oder Chemotherapie
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Stoffen zur Erhöhung der Sensibilität von Tumorzellen gegen eine Behandlung mit Bestrahlung und/oder Chemotherapie.
Die Abtötung von menschlichen Krebszellen durch Bestrahlung und/oder Zytostatika (Chemotherapie) gehört zu den wichtigsten Behandlungsmethoden bei der Bekämpfung von Krebs. Allerdings ist es bis heute nicht möglich, ganz spezifisch das Tumorgewebe zu schädigen, sodass bei der Behandlung auch gesundes Gewebe in Mitleidenschaft gezogen wird und dadurch schwerwiegende Nebenwirkungen der Behandlung auftreten und die Heilungschancen vermindern. Es besteht daher Bedarf an Behandlungsstrategien, die es ermöglichen, die Behandlung des Patienten so individuell und kurz wie möglich durchzuführen, um die Nebenwirkungen so gering wie möglich zu halten. Dies wird insbesondere durch die moderne Strahlentherapie ermöglicht, die effizient die wichtigste Zellpopulation innerhalb eines Tumors, die Tumorstammzellen, abtötet und somit ein Wiederwachsen nach Behandlung (Tumorrezidiv) verhindert. Unter bestimmten klinischen Gegebenheiten ist jedoch die Applikation einer derartigen Strahlendosis nicht möglich, so dass gleichzeitig Chemotherapie und/oder neue molekulare Therapien eingesetzt werden, um die Tumorstammzellen zu eradizieren. Präklinische in-vitro und in-vivo Untersuchungen, wie weiter unten dargestellt, zeigen, ob eine molekulare Therapie gegen ein spezifisches Molekül alleine und/oder in Kombination mit Strahlentherapie die Tumorstammzellen beseitigt. Ist dies der Fall, ist der Patient geheilt und es entsteht kein Tumorrezidiv. Ein weiteres entscheidendes Kriterium für den Einsatz einer spezifischen molekularen Therapie ist die Kenntnis über das Vorhandensein des Zielmoleküls im Tumorgewebe. Diese Untersuchungen werden an humanen Tumorbiopsien durchgeführt und zeigen, ob das betreffende Molekül exprimiert bzw. überexprimiert wird.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Tumorzellen für die Behandlung durch Bestrahlung und/oder Chemotherapie sensibler zu machen, um die Dauer und Stärke der Bestrahlung und/oder Chemotherapie und damit auch die mit der Bestrahlung und/oder Chemotherapie verbundenen Nebenwirkungen zu verringern. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verabreichung von Substanzen gelöst, die die Funktion des PINCH-I -Proteins blockieren oder einschränken. Das PINCH-I -Protein wird in der Literatur manchmal auch mit dem Namen LIMSl oder „L/M and senescent cell antigen- like domains 1 " bezeichnet. Erfindungsgemäß werden Tumorzellen die erfindungsgemäßen Substanzen verabreicht. Mit Tumorzellen sind im Rahmen dieser Erfindung alle Tumorzellen gemeint, die bei jeglicher Art von maligner Tumorerkrankung sowohl in hämato logischen als auch soliden Tumoren auftreten können. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Blockierung des PINCH-I -Proteins (funktionell bzw. auf Expressionsebene) in Tumorzellen zu einer Erhöhung der Sensibilität gegenüber Strahlung bzw. Chemotherapie führt. Nach der Behandlung mit Strahlung und/oder Zytostatika (Chemotherapie) zeigen die Tumorzellen eine deutlich verringerte Überlebensrate gegenüber solchen Tumorzellen, in denen das PINCH-I -Protein nicht blockiert worden war.
Zur Chemotherapie können beispielsweise die Substanzen Cisplatin oder Mitomycin-C, aber auch alle anderen konventionellen Chemotherapien, entsprechend der zu behandelnden Tumorentität, verwendet werden. Chemotherapeutika werden bevorzugt ausgewählt aus 5'- Deoxy-5-fluorouridin, 5 -Fluorouracil, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, 9- Aminocamptothecin, Abarelix, Azacitidin, Actinomycin D, Aldesleukin, Alemtuzumab (MabCampath®), Alitretinoin, Altretamin, Ametantron, Amifostin, Aminoglutethimid, Amsacrin, Anagrelide, Anastrozol, Arsen(III)-oxid, Asparaginase, Atrasentan (Xinlay®), Azathioprin, BCG live (Theracys), Bendamustin, Bevaceizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Biolimus A9, Bleomycin, Bortezomib, Buserelin, Busulfan, Calicheamicin, Calusteron, Camptothecin, Capecitabin, Carboplatin, Carmustin, Cetuximab, Chlorambucil, Chlorethamin, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Cyclophosphamid, Cyproteronacetat, Cytarabin, Cytosinarabinosid, Dacarbazin, Dactinomycin, Darbepoetin alpha, Dasatinib (Sprycel®), Daunorubicin, Denileukin diftitox, Dexrazoxan, Docetaxel, Doxorubicin (Adriamycin), Dromostanolon, Elliott's B Solution, Epirubicin (4-EpiAdriamycin), Erlotinib (Tarceva®), Erythropoietin, Estramustin, Etoposid, Everolimus (Certicane®), Exemestan, Filgrastim, Floxuridin, Fludarabin, Fluorouracil, Flutamid, Formestan, Fosfestrol, Fulvestrant, G-CSF, Gefitinib (Iressa®), Gemcitabin, Gemtuzumab ozogamicin, Goserelin, Hydroxy Carbamid (Hydroxyurea), Ibritumomab (Zevalin®), Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Interferon-alpha, Irinotecan, Ixabepilon, Lanreotid, Lapatinib (Tykerb®), Lenalidomid (Revlimid®), Letrozol, Leucovorin, Leuprorelin, Levamisol, Lonafarnib (Sarasar®), lnterleukin-2, Lomustin, Maytansinoid, Meclorethamin, Megestrol, Melphalan, Mercaptopurin, Mesna, Methotrexat, Methoxsalen, Methylprednisolon, Miltefosin, Mitomycin C, Mitopodozid, Mitotan, Mitoxantron, Nandrolon, Nelarabin, Nilotinib (Tasigna®), Nimustin, Nofetumomab, Oblimersen, Octreotid, Oprelvekin, Oxaliplatin, Oxazaphosphorin, Paclitaxel und Paclitaxelderivate, Pamidronat, Panitumumab, Pegademase, Pegaspargase, Pegfϊlgrastim, Pemetrexed, Pentostatin, Pipobroman, Plicamycin, Podophyllotoxinderivate, Polifeprosan, Porfimer, Prednison, Procarbazin, Quinacrine, Raltitrexed, Rapamycin (Sirolimus), Rasburicase, Retinol, Rhodomycin D, Rituximab (MabThera®), Sargramostim, Sorafenib (Nexavar®), Streptozocin, Sunitinib (Sutent®), Tamoxifen, Tegafur, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testolacton, Thalidomid, Thioguanin, Thiotepa, Tipifarnid (Zarnestra®), Topotecan (Topoisomerase-I-Inhibitor), Toremifen, Tositumomab, Trabectedin, Trastuzumab (Herceptin®), Treosulfan, Tretinoin, Triptorelin, Trofosfamid, Uramustin, Valrubicin, Venorelbin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinorelbin und Zoledronat.
Als Bestrahlungsart wird bevorzugt die Bestrahlung mit Photonen (Röntgenstrahlen, γ-
Strahlung), Elektronen, Protonen oder Schwerionen (1-H, 2-He, 7-Li, 9-Be, H-B, 12-C, 14-N oder 16-0) verwendet.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von Substanzen zur Sensibilisierung von
Tumorzellen gegen Strahlung und/oder Chemotherapie, indem die Funktion des PINCH-I-
Proteins auf Ebene der Genexpression oder auf Proteinebene blockiert oder eingeschränkt wird.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines Tumorpatienten, bei dem Tumorzellen zunächst durch die Verabreichung von Substanzen, die die Funktion des PINCH-I -Proteins auf Ebene der Genexpression oder auf Proteinebene blockieren oder einschränken, gegen Bestrahlung und/oder Chemotherapie sensibilisiert und anschließend durch Bestrahlung und/oder Chemotherapie behandelt werden. Das Verfahren zur Behandlung eines benignen oder malignen Tumors in einem Lebewesen umfasst die folgenden Schritte: a) Eine oder mehrere Substanzen, die die Funktion des PINCH-I -Proteins auf Ebene der Genexpression oder auf Proteinebene blockieren oder einschränken, werden einem Lebewesen mit einem Tumor topisch oder systemisch verabreicht, wodurch der Tumor gegen die in Schritt b) erfolgende Strahlen- und/oder Chemotherapie sensibilisiert wird. b) Der Tumor wird anschließend durch Bestrahlung und/oder Chemotherapie behandelt. Das Lebewesen kann dabei ein Tier oder ein Mensch sein. Bevorzugt ist das erfϊndungsgemäße Verfahren für die Anwendung am Menschen geeignet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Substanzen, die die Funktion des PINCH-I- Proteins blockieren oder einschränken, im weitestmöglichen Sinn verstanden. Davon sind sowohl Substanzen eingeschlossen, die das PINCH-I -Protein auf Proteinebene durch direkte Bindung inhibieren, wie zum Beispiel Antikörper oder natürliche oder modifizierte Liganden, als auch Substanzen, die die Expression des Gens auf transkriptioneller oder posttranskriptioneller Ebene verhindern oder signifikant reduzieren und dadurch bewirken, dass gar kein oder nicht ausreichend PINCH-I -Protein gebildet wird, wie zum Beispiel RNA- Interferenz oder Transkriptionsfaktoren.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen eignet sich vorzugsweise für alle Arten von Tumoren, in denen das PINCH-I -Protein vorhanden ist, bevorzugt für solche Tumoren, in denen das PINCH-I -Protein überexprimiert wird.
Als Substanzen, die die Funktion des PINCH-I -Proteins blockieren, werden erfindungsgemäß Wirkstoffe verstanden, die geeignet sind, die Funktion des PINCH-I -Proteins auf Ebene der Genexpression oder auf Proteinebene zu reduzieren, zu unterdrücken oder zu verhindern. Sie umfassen unter anderem organisch-chemische Verbindungen, Peptidanaloga, Peptidmimetika, Nukleinsäuren, Oligo- und Polynukleotide, Antikörper usw.. Die Substanzen können entweder direkt als Wirkstoff appliziert oder als sogenannte „Prodrugs" durch den körpereigenen Stoffwechsel gebildet werden.
Als erfindungsgemäße Substanzen, die die Funktion des PINCH-I -Proteins blockieren oder einschränken, werden bevorzugt anti-PINCH-1 -Antikörper, PINCH- 1-dsRNA, PINCH-I- siRNA, PINCH-I -short hairpin (sh)RNA und PINCH- 1-Morpholinos (auch als Morpholino Oligos, phosphorodiamidate morpholino oligos oder PMOs bezeichnet) verwendet.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden anti-PINCH-1 -Antikörper verwendet, die das PINCH-I -Protein in hochspezifischer Weise erkennen und binden. Nachdem die Antikörper den Tumorzellen verabreicht worden sind, werden die Tumorzellen mit Strahlung und/oder Chemotherapie behandelt. Die Bindung der Antikörper an das PINCH-I -Protein blockiert seine Funktion und führt zu einer erhöhten Sensibilität der Tumorzelle gegenüber Bestrahlung bzw. Chemotherapie. Die Überlebensrate der Tumorzellen nach der Behandlung mit Bestrahlung bzw. Chemotherapie ist dadurch signifikant reduziert.
Dabei werden bevorzugt monoklonale anti-PINCH-1 -Antikörper, im Besonderen humanisierte anti-PINCH-1 -Antikörper, verwendet. Ein humanisierter monoklonaler Antikörper umfasst die PINCH-I -bindenden hypervariablen Regionen des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers und die Framework-Regionen der variablen und konstanten Regionen der leichten und schweren Ketten eines humanen Antikörpers. Verfahren zur Herstellung von humanisierten Antikörpern sind bekannt und u.a. in Morrison et al. (1984), Jones et al. (1986), Verhoeyen et al. (1988), Riechmann et al. (1988), Queen et al. (1989) und Tempest (1991) beschrieben.
Als Antikörper im erfindungsgemäßen Sinn sind weiterhin verschiedene modifizierte Formen von Antikörpern zu verstehen, wie z.B. Fragmente wie das Fv- Fragment, das Fab-Fragment, das (Fab)'2-Fragment oder single-chain- Antikörper (gentechnisch hergestellte bispezifische Antikörper, die nur noch aus zwei Bindedomänen bestehen, welche über kurze Linker verbunden sind). Verfahren zur Herstellung von F(ab2) oder F(ab)-Fragmenten sind bekannt und in Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, http://www.wiley.com/legacy/cp/cpi/) beschrieben.
Erfindungsgemäße Antikörper sind zum Beispiel ein monoklonaler Maus-anti-PINCH-1- Antikörper des IgGl Isotyps (Klon PINCH-C58; Sigma-Aldrich, DE), ein monoklonaler Maus-anti-PINCH-1 -Antikörper des IgM-Isotyps (Klon PINCH-N 173; Sigma-Aldrich, DE) und ein monoklonaler Maus-anti-PINCH-Antikörper des IgG2a Isotyps (Klon 49; Becton Dickinson, DE).
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die Expression des PINCH-I -kodierenden Gens durch die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi) unterdrückt. Unter RNA- Interferenz versteht man einen Mechanismus, bei dem durch die Verwendung von zielerkennenden RNA-Mo lekülen die Expression eines Gens gehemmt wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung sind die Moleküle, die die Expression des PINCH-I- Proteins durch RNA-Interferenz unterdrücken, sogenannte siRNA-(small interfering RNA)- Moleküle. siRNA-Moleküle sind kurze einzel- oder doppelsträngige RNA-Moleküle, die die Expression eines Zielgens spezifisch hemmen können. Durch die Verabreichung von PINCH- 1-siRNA wird verhindert, dass die Tumorzelle das PINCH-I -Gen exprimiert und somit PINCH-I -Protein bildet. Auch dies fuhrt zu einer erhöhten Sensibilität der Tumorzelle gegenüber Bestrahlung bzw. Chemotherapie.
Bevorzugte siRNAs der Erfindung sind Oligonukleotide von 18 bis 30 Nukleotiden, bevorzugt von 21 bis 23 Nukleotiden, die entweder aus einem RNA-Einzelstrang bestehen, der zu einer Teilsequenz des humanen PINCH- 1-cDNA (SEQ ID No. 1, Genbank Accession Number NM 004987) homolog ist, oder aus einem RNA-Doppelstrang bestehen, von dem ein Strang zu einer Teilsequenz der PINCH- 1-cDNA (SEQ ID No. 1) homolog, der andere zu dem ersten Strang komplementär ist. Homolog bedeutet hier eine Identität zwischen zwei Sequenzen von mindestens 80 %, bevorzugt mehr als 90 %, besonders bevorzugt mehr als 95 %.
Die PINCH- 1-cDNA ist derjenige DNA-Strang, den man erhält, wenn man die von dem
PINCH-I -Gen transkribierte reife mRNA durch das Enzym Reverse Transkriptase in einen zu dieser mRNA komplementären DNA-Strang übersetzt.
Bevorzugt werden an das 3 '-Ende der siRNA zusätzlich noch zwei Desoxythymidinreste angehängt.
humane PINCH-1-cDNA (SEQ ID No.1)
1 tagttcaaga caacagagac aaagctaaga tgaggaagtt ctgtacagtt taggaaatag
61 aggctttcaa agataattcg cagtgatgtg aaactggcct cccaagccct gataacaaca
121 tggccaacgc cctggccagc gccacttgcg agcgctgcaa gggcggcttt gcgcccgctg
181 agaagatcgt gaacagtaat ggggagctgt accatgagca gtgtttcgtg tgcgctcagt
241 gcttccagca gttcccagaa ggactcttct atgagtttga aggaagaaag tactgtgaac
301 atgactttca gatgctcttt gccccttgct gtcatcagtg tggtgaattc atcattggcc
361 gagttatcaa agccatgaat aacagctggc atccggagtg cttccgctgt gacctctgcc
421 aggaagttct ggcagatatc gggtttgtca agaatgctgg gagacacctg tgtcgcccct
481 gtcataatcg tgagaaagcc agaggccttg ggaaatacat ctgccagaaa tgccatgcta
541 tcatcgatga gcagcctctg atattcaaga acgaccccta ccatccagac catttcaact
601 gcgccaactg cgggaaggag ctgactgccg atgcacggga gctgaaaggg gagetatact
661 gcctcccatg ccatgataaa atgggggtcc ccatctgtgg tgettgeega cggcccatcg
721 aagggcgcgt ggtgaacgct atgggcaagc agtggcatgt ggagcatttt gtttgtgcca
781 agtgtgagaa accctttctt ggacatcgcc attatgagag gaaaggcctg gcatattgtg
841 aaacteaeta taaccageta tttggtgatg tttgetteca ctgeaategt gttatagaag
901 gtgatgtggt ctctgctctt aataaggeet ggtgcgtgaa ctgctttgcc tgttctacct
961 geaacaetaa attaacaetc aagaataagt ttgtggagtt tgacatgaag ccagtctgta
1021 agaagtgeta tgagaaattt ccattggagc tgaagaaaag aettaagaaa etagetgaga
1081 cettaggaag gaaataagtt cetttatttt ttetttteta tgcaagataa gagattacca
1141 aeattaettg tettgateta cecatattta aagetatate teaaagcagt tgagagaaga
1201 ggacetatat gaatggtttt atgteatttt tttaattaaa aaagaaaaat teatataate
1261 gtgtttaaaa cacaaatgaa gteagtattt geetttgtta acccttatcc atttgttgac
1321 atgtagactg tttacaaaaa aaaaacacat ggttaaatgt taaattttaa ttaaggcccc
1381 caaaaattaa atataaettt ttaaaatgaa aggagteaec ttttacatga ctcaggtgaa
1441 aaaacagtat aaacattaat ttactttgtg ttcaaaagaa aatteeaaet gctgttgggg
1501 aaggacacag aaaagaaaaa taaccaccca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
Mit PINCH-1-cDNA sind alle Sequenzen gemeint, die mit der Sequenz SEQ ID No.1 eine Übereinstimmung von 95 % oder mehr, bevorzugt 98 % oder mehr, aufweisen. Die Herstellung der siRNA erfolgt nach einem dem Fachmann geläufigen Verfahren.
Erfindungsgemäße Beispiele für PINCH-1-siRNA sind beispielsweise die Polynukleotide gemäß SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4 und SEQ ID No.5, sowie Varianten (Homologe) davon, die sich in der Sequenz geringfügig unterscheiden, aber dennoch die Funktion des PINCH-I-Proteins blockieren. Vorzugsweise unterscheiden sich homologe Varianten der Polynukleotide gemäß SEQ ID No.2 bis 5 von diesen in höchstens 1 bis 4 Nukleotiden, bevorzugt in nicht mehr als einem oder zwei Nukleotiden.
1) GGACCUAUAUGAAUGGUUUtt (SEQ ID No. 2)
2) GGACUCUUCUAUGAGUUUGtt (SEQ ID No. 3)
3) GGAAGAAAGUACUGUGAACtt (SEQ ID No. 4)
4) GCUAUAUCUCAAAGCAGUUtt (SEQ ID No. 5) Die Erfindung umfasst dabei auch komplementäre Sequenzen mit modifiziertem Rückgrat. Der Begriff Nukleotidsequenzen mit verändertem Rückgrat umfasst dabei alle anderen linearen Polymere, in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Uracil (U) bzw. Thymin (T) in entsprechender Abfolge angeordnet sind, wie z.B. Sequenzen mit einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten Rückgrat, Peptid- Nukleinsäuren (PNA), locked nucleic acids (LNA), Nukleinsäuren mit gemischtem Rückgrat oder Morpholinos sowie Fluorochrom(green/red/etc. fluororescence proteins)-markierte Sequenzen, und die die Expression des PINCH-I -Gens hemmen können.
Nach Transfektion der siRNA (d.h. das Einbringen von spezifischen RNA-Mo lekülen in eukaryotische Zellen) werden die Tumorzellen in vitro mit Strahlung und/oder Zytostatika (Chemotherapie) behandelt. Als Bestrahlungsquelle kann vorteilhaft eine konventionelle 200 kV-Röntgenröhre (13 mA, ~1,3 Gy/min) verwendet werden.
Als Zytostatika werden beispielsweise Cisplatin (Platinex®, Bristol-Myers-Squibb, München) und Mitomycin-C (Mitomycin medac®, Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbH, Wedel) angewandt.
Anhand beigefügter Abbildungen werden Ausführungsbeispiele der Erfindung näher erläutert.
Fig. 1 Westernblot
Fig. 2 Behandlungsdiagramme
Fig. 3 Westernblot
Fig. 4 Behandlungsdiagramm
Fig. 5 Behandlungsdiagramm
Fig. 6 Tumorwachstum und Wiederauftreten von Tumoren nach der Bestrahlung
Ausführungsbeispiel 1:
In immortalisierten embryonalen Mausfibroblasten wurde das für PINCH-I kodierende Gen ausgeschaltet. Eine Standardmethode zur Herstellung von transgenen Mäusen ist zum Beispiel in WO/1999/036528 offenbart.
Durch das genetische Ausschalten des PINCH-I Gens wurden die Zellen deutlich empfindlicher gegen Behandlung mit Röntgenstrahlen bzw. Zytostatika, d.h. die Überlebensrate dieser Zellen nach Bestrahlung bzw. Chemotherapie war gegenüber PINCH-I exprimierenden Kontrollzellen signifikant herabgesetzt. Zellen wurden in zwei- oder dreidimensionalen Zellkulturmodellen ausgebracht und mit Röntgenstrahlung (200 kV, 13 mA, ~1,3 Gy/min, 0-10 Gy) oder den Zytostatika Cisplatin (Platinex®) oder Mitomycin-C (Mitomycin medac®) in einer Konzentration von 0 - 10 μmol/1 (Ih oder 24h) behandelt. Das klonogene Zellüberleben, d.h. die proliferative Integrität der behandelten Zellen, wurde gemessen. Die gewachsenen Zellkolonien wurden fixiert, gefärbt und die Koloniezahl mikroskopisch ermittelt.
Fig. 1 zeigt einen Western Blot, der belegt, dass in Mauszellen, in denen das PINCH-I- kodierende Gen ausgeschaltet worden ist, kein PINCH-I Protein gebildet wird (rechts), im Gegensatz zu Kontrollzellen, in denen PINCH-I -Protein vorhanden ist (links).
Fig. 2 zeigt die klonogene Überlebensrate von Mauszellen, in denen das PINCH-I -kodierende Gen ausgeschaltet worden ist, sowie von wildtypischen Kontrollzellen, nach Bestrahlung (Fig. 2a, d) sowie nach Behandlung mit den Zytostatika Cisplatin (Fig. 2b), Mitomycin-C (Fig. 2c) in zwei- (Fig. 2a, b, c) und dreidimensionalen (Fig. 2d) Zellkulturen.
Ausführungsbeispiel 2:
Es wurden humane kolorektale Tumorzelllinien des Typs HCT-116 (ATCC-Nr. CCL-247) und DLD-I (ATCC-Nr. CCL-221) mit PINCH-1-siRNA der SEQ ID No. 5 transfiziert. Dafür wurden jeweils 3 x 105 Tumorzellen auf 6-well-Platten (BD, Heidelberg) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Karlsruhe) mit Glutamax-I (L-Alanyl-L-Glutamin), 10 % Serum (FCS; Biochrom, Berlin) und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (Gibco, Karlsruhe) ausgesät und bei 37°C und 7 % CO2 kultiviert. Nach 24 h wurden die Zellen einmal mit Opti-MEM I (Invitrogen, Karlsruhe) gewaschen und mit Oligofectamine (0,2 %) und 20 nmol/1 PINCH- 1-siRNA für 8 h serumfrei in Opti-MEM I transfiziert. Anschließend wurde 10 % Serum zugefügt und die Zellen weitere 16 h bei 37 0C und 7 % CO2 inkubiert. Insgesamt 24 h nach Transfektion wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS; PAA, Cölbe) gewaschen und mit Trypsin/EDTA-Lösung abgelöst. Ein Teil der Zellen wurde für die Bestimmung des klonogenen Überlebens nach Bestrahlung (Koloniebildungsassay) eingesetzt, während ein anderer Teil für weitere 24 h kultiviert wurde. Aus dieser Fraktion wurden zur Überprüfung des knock-downs im Western Blot Proteinlysate hergestellt, die Proteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und mit einem Maus-anti-PINCH-1 -Antikörper (Klon 49; BD Heidelberg) sowie einem Peroxidase-gekoppeltem Ziege-anti-Maus-Zweitantikörper und dem ECL-System (GE Healthcare, München) detektiert. Wie in Fig. 3 zu sehen, wird durch den Western Blot gezeigt, dass es tatsächlich gelungen ist, die Bildung von PINCH-I -Protein durch die o.g. spezifische siRNA Sequenz zu verhindern. Behandlung der Zellen mit nicht spezifischen Kontroll-siRNA (Co) bzw. nur mit dem Transfektionsreagenz (Oligo, Oligofectamin) alleine zeigte keine Veränderung der PINCH-I Expression. Fig. 4 zeigt, dass die Überlebensrate nach der Bestrahlung bei den Tumorzellen nach Behandlung mit PINCH- 1-siRNA im Vergleich zu den Zellen mit Kontroll-siRNA (co bzw. co siRNA) signifikant herabgesetzt ist. siRNA wurde in einer Konzentration von 20 nmol/1 transfiziert und die Zellen 48 h später mit 0-6 Gy bestrahlt.
Ausführungsbeispiel 3:
Durch die Blockierung des PINCH-I -Proteins durch Bindung eines spezifischen anti-PINCH- 1 -Antikörpers kann die Empfindlichkeit von Tumorzellen gegenüber Strahlung oder Chemotherapie erhöht werden. Dazu wurden für die Bestimmung des Monogenen Überlebens nach Behandlung mit einem anti-PINCH-1 -Antikörper die Zellen auf 24-well-Platten (BD, Heidelberg) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Karlsruhe) mit Glutamax-I (L-Alanyl-L-Glutamin), 10 % Serum (FCS; Biochrom, Berlin) und 1 % Nichtessentiellen Aminosäuren (Gibco, Karlsruhe) ausgesät. Nach Kultivierung bei 37 0C und 7 % CO2 für 24 h wurde 50 μg/ml anti-PINCH-1 -Antikörper bzw. nicht spezifischer Kontrollantikörper (Santa Cruz, Heidelberg) zugegeben und für weitere 24 h inkubiert. Danach erfolgte eine Bestrahlung mit 200 kV Röntgenstrahlung (Yxlon Y.TU 320, Yxlon, Kopenhagen, Dänemark; 20 mA, ~1,3 Gy/min). Acht Tage nach Aussaat wurden die Zellen mit 80 % Ethanol für 30 min fixiert, mit Coomassie Blau Lösung gefärbt und Kolonien mit mehr als 50 Zellen gezählt.
Fig. 5 zeigt das Zellüberleben humaner kolorektale Tumorzelllinien (HCT-116, DLD-I) die mit anti-PINCH-1 -Antikörpern (Klon PINCH-C58 (Sigma P8896), Klon PINCH-N 173 (Sigma P9371), Klon 49 (Beckton-Dickinson Katalog-Nr. 612711) oder nicht spezifischem Kontroll-Antikörper (co) 24 h vor Bestrahlung (0 oder 4 Gy) behandelt wurden. Die Tumorzellen wurden durch die Behandlung mit den spezifischen anti-PINCH-1 Antikörpern gegenüber Bestrahlung im Vergleich mit den Kontrollzellen signifikant sensibilisiert.
Ausführungsbeispiel 4:
Um die Strahlensensitivität von Pinchlfl/fl (Pinchlfloxed/floxed)- gegenüber Pinchl ' -Tumorzellen in vivo zu verifizieren, wurden Allograft-Tumoren in immunsupprimierten NMRI (nu/nu) Nacktmäusen erzeugt. Die Tumoren wurden durch ihre Antwort auf Bestrahlung, ihre Wachstumsrate, ihre Proliferation, ihre Sauerstoffversorgung (Hypoxie), ihre Versorgung durch Blutgefäße und ihre Durchblutung charakterisiert. Die Antwort der Tumoren auf Bestrahlung wurde durch das Tumorvolumen sowie die Zeit bis zum lokalen Wiederauftreten von Tumoren bestimmt.
7- bis 14-Wochen alte, männliche und weibliche immunsupprimierte NMRI (Genotyp nu/nu; Abwesenheit des Thymus und des Haares) Mäuse (Experimentelles Zentrum der Medizinischen Fakultät, Technische Universität Dresden) wurden dazu 1 bis 5 Tage vor der Tumortransplantation durch Ganzkörperbestrahlung (1 x 4 Gy, 200 kV X-Rays, 0.5 mm Kupferfilter, 1 Gy/min) weiter immunsupprimiert. Die Tierställe verfügten über einen 12- stündigen Tageslicht-Dunkel-Zyklus (das Licht wurde jeweils um 7.00 h morgens angeschaltet), eine konstante Temperatur von 26°C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 50 - 60 %. Die Mäuse wurden mit einer kommerziell erhältlichen Diät für Labortiere und ggf. Wasser ernährt. Für die Erzeugung der Allograft-Tumore in vivo wurden die immortalisierten Pinchl7"- und Pinchlfl/fl-Mausfibroblasten subkutan in die Achseln von Empfängermäusen injiziert. Nachdem sich ertastbare Knoten gebildet hatten, wurden die Tumoren herausgeschnitten und subkutan in eine Gruppe von Tieren transplantiert. Von diesen wurden Tumoren mit einer durchschnittlichen Wachstumsrate herausgeschnitten, in etwa 1 mm große Stücke zerteilt, in Medium gegeben und für weitere Experimente in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Für die Experimente wurden die erhaltenen Tumorstücke auf den Rücken von 5 Mäusen transplantiert (erste Passage). Nachdem sich Tumoren mit einem Durchmesser von 10 bis 15 mm gebildet hatten, wurde der Tumor mit der mittleren Wachstumsrate herausgeschnitten und Stücke von etwa 1 mm Größe wurden auf die Rücken von 10 weiteren Tieren transplantiert (zweite und dritte Passage). Für die Experimente wurden Tumoren der zweiten und dritten Passage mit einer mittleren Wachstumsrate herausgeschnitten und Stücke von etwa 1 mm Größe wurden subkutan in das rechte Hinterbein transplantiert. Die herausgeschnittenen Tumoren wurden charakterisiert, indem sie einer DNA- oder Protein-Isolierung unterzogen wurden. Das Vorhandensein des Pinchl -Knockout in Pinchr' -Tumoren bzw. der Pinchl floxed- Sequenz in Pinchl fl/fl-Tumoren wurden durch PCR überprüft. Die Expression von PINCHl- Protein wurde durch Western Blot überprüft.
Die lokale Bestrahlung der Tumoren wurde mit 200 kV Röntgenstrahlen (0.5 mm Kupferfilter, Strahlendosis 1 Gy/min, Röntgenwerke Seifert) auf das rechte Hinterbein durchgeführt. Nachdem der Tumor ein Volumen von 0,10 bis 0,32 cm erreicht hatte, wurden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier Tieren auf die verschiedenen Strahlungsdosen verteilt. Einzeldosen von 26, 32, 38, 44, 50, 56 oder 62 Gy wurden unter lokalem, abgeklemmtem Blutfluss des Oberschenkels des tumortragenden Beins von betäubten Mäusen (120 mg/kg Körpergewicht Ketamin i.p. (intraperitoneal) und 16 mg/kg Xylazin i.p.) 2 Minuten später appliziert. Pinchl fl/fl- und Pinchr' -Tumoren waren gleichmäßig über die verschiedenen Dosisgruppen verteilt.
Der Durchmesser der Tumoren wurde zweimal wöchentlich mit einem Messschieber bestimmt. Das Tumorvolumen wurde durch die Formel für ein Rotationsellipsoid (π/6 • a • b2) berechnet, wobei a die längste und b die kürzere, rechtwinklig dazu verlaufende Tumorachse ist. Die Wachstumsdauer (tumour growth time, TGT) von unbestrahlten und bestrahlten Pinchl fl/fl- und Pinchr' -Tumoren wurde direkt aus den Wachstumskurven individueller Tumoren als diejenige Zeit bestimmt, die nach dem Start des Experiments benötigt wurde, um das 2- (TGTy2) bzw. 5 -fache (TGT vs) des Anfangsvolumens zu erreichen. Mittelwerte für die Wachstumsdauer von Pinchl fl/fl- und Pinchr' -Tumoren wurden mittels des Mann-Whitney- U-Tests (GraphPad Prism Software 4.03) verglichen. Das Tumorvolumen wurde solange gemessen, bis die Tumoren ein Volumen von ca. 1,5 cm3 erreichten. Die Häufigkeit des Wiederauftretens von Tumoren nach der Bestrahlung wurde bestimmt, wenn das Tumorvolumen bei drei aufeinanderfolgenden Messungen nach Erreichen eines Tiefstpunkts wieder anstieg.
Insgesamt wurde die lokale Tumorkontrolle (ist reziprok zur Rate an wieder gewachsenen Tumoren) von 85 Pinchl fl/fl- und 99 Pinchr' -Tumoren evaluiert. In den Tieren mit Pinchl fl/fl- und Pinchr' -Tumoren wurden alle wieder auftretenden Tumoren bis zum Tag 210 nach Bestrahlung erfasst. Es zeigte sich, dass alle Pinchr' -Tumoren bei einer Einzeldosis von 38 Gy lokal kontrolliert waren. Für Pinchlfl/fl-Tumoren ergab sich bei keiner der applizierten Bestrahlungsdosen eine lokale Kontrolle. Mathematische Abschätzungen für die Zeit bis zum lokalen Wiederauftreten von Tumoren wurden mittels der Kaplan-Meier-Methode erhalten und mittels des Log rank Tests (GraphPad Prism Software 4.03) verglichen.
Die Tumoren wurden mit steigenden Einzeldosen von Röntgenstrahlung (26 - 62 Gy) bestrahlt und bis zu 210 Tagen danach beobachtet. In Übereinstimmung mit den in vitro Ergebnissen wiesen Pinchr' -Allografte im Vergleich zu Pinchlfl/fl-Allograften eine wesentlich höhere Strahlungssensitivität auf, sowohl was die Verzögerung des Tumorwachstums als auch das Überleben ohne Wiederauftreten von neuen Tumoren betraf. Figur 6a zeigt die Auftragung des Tumorvolumens gegen die Zeit nach der Bestrahlung, Figur 6b die Kaplan-Meier- Analyse, d. h. das Überleben ohne Wiederauftreten von neuen Tumoren bei subkutan wachsenden Pinchlfl/fl- und Pinchr' -Allograft-Tumoren in immunsupprimierten Mäusen. Im Falle des Tumorvolumens (Fig. 6a) steht jeder Datenpunkt für den Mittelwert ± Standardfehler von 10 bis 18 Mäusen. Bezüglich des S-Phasen-Markers BrdU, der Vaskularisierung, der Sauerstoffversorgung und der Nekrose (getestet durch immunohistochemische Methoden; Daten nicht gezeigt) konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Pinchlfl/fl und Pinchl"7" Tumoren ermittelt werden. PINCH-I spielt also eine entscheidende Rolle für das Zellüberleben bei Bestrahlung und wirkt unabhängig von der extrazellulären Matrix, von in vitro und in vivo Wachstumsbedingungen und vom Mikromilieu des Tumors.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Substanzen, die die Funktion des PINCH-I -Proteins blockieren oder einschränken, zur Sensibilisierung von Tumorzellen gegen Bestrahlung und/oder Chemotherapie.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz ein anti- PINCH-I -Antikörper ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der anti-PINCH-1- Antikörper ein monoklonaler Maus-anti-PINCH-1 -Antikörper des IgGl Subtyps mit der Bezeichnung Klon PINCH-C58 (Sigma-Aldrich, DE), ein monoklonaler Maus- anti-PINCH-1 -Antikörper des IgM-Subtyps mit der Bezeichnung Klon PINCH-N 173 (Sigma-Aldrich, DE) oder ein monoklonaler Maus-anti-PINCH- Antikörper des IgG2a Subtyps, mit der Bezeichnung Klon 49 (Becton Dickinson, DE) ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz die Expression des PINCH-I -Gens hemmt.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz die Expression des PINCH-I -Gens posttranskriptionell hemmt.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz PINCH-I- siRNA ist und dass die siRNA entweder a. aus einem RNA-Einzelstrang besteht, der zu einer Teilsequenz des humanen PINCH-1-Gens (SEQ ID No. 1) homolog ist, oder b. aus einem RNA-Doppelstrang besteht, von dem ein Strang zu einer Teilsequenz des PINCH-I -Gens (SEQ ID No. 1) homolog, der andere Strang zu dem ersten Strang komplementär ist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die PINCH- 1-siRNA ausgewählt ist aus Sequenz SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4 und/oder SEQ ID No. 5.
EP09712515A 2008-02-20 2009-02-20 Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie Withdrawn EP2254910A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008011838 2008-02-20
PCT/EP2009/052058 WO2009103796A1 (de) 2008-02-20 2009-02-20 Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2254910A1 true EP2254910A1 (de) 2010-12-01

Family

ID=40673177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP09712515A Withdrawn EP2254910A1 (de) 2008-02-20 2009-02-20 Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20110097338A1 (de)
EP (1) EP2254910A1 (de)
CN (1) CN101970495A (de)
DE (1) DE112009000372A5 (de)
WO (1) WO2009103796A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2384069B1 (es) * 2012-03-29 2013-07-04 Hospital Sant Joan De Déu Cinacalcet y tumores neuroblásticos

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004048938A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004017991A1 (en) * 2002-08-13 2004-03-04 Cell Center Cologne Gmbh Use of iap for the diagnosis and of iap-inhibitors for the treatment of hodgkin’s lymphomas
AU2003295600A1 (en) * 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004048938A2 (en) * 2002-11-26 2004-06-10 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOCH, U. ET AL: "A ROLE FORTHE LIM-ONLY FOCAL ADHESION PROTEIN PINCH1 IN RADIATION SENSITIVITY", RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY, vol. 81, no. 1, October 2006 (2006-10-01), pages S1 - S553 *
See also references of WO2009103796A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE112009000372A5 (de) 2011-01-27
US20110097338A1 (en) 2011-04-28
WO2009103796A1 (de) 2009-08-27
CN101970495A (zh) 2011-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baughn et al. Mechanism of STMN2 cryptic splice-polyadenylation and its correction for TDP-43 proteinopathies
EP3199633B1 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virus-ähnlicher partikel
EP2684955B1 (de) Verfahren zur Förderung der Angiogenese, Vaskularisierung oder Gefäßreparatur oder zur Hemmung der Tumorangiogenese
DE60113511T2 (de) Mischung enthaltend einen inhibitor oder suppressor eines gens und ein molekül,dass an ein expressionprodukt dieses gens bindet
Ruangsri et al. Relationship of axonal voltage-gated sodium channel 1.8 (NaV1. 8) mRNA accumulation to sciatic nerve injury-induced painful neuropathy in rats
DE69433520T2 (de) Antisense-nukleinsäure enthaltende pharmazeutische zusammensetzung zur vorbeugung und/oder behandlung von neuronalen verletzungen, entartungen und zelltod, und zur behandlung von neoplasmen
DE10316701A1 (de) Humane Nukleinsäuresequenzen aus Bronchialkarzinomen
DE4216949A1 (de) Verfahren zur Präparierung und Hybridisierung von spezifischen Proben
EP0655926B1 (de) Neue sonde zur tumordiagnostik oder tumortherapie
He et al. Bone marrow stromal cells promote neuroplasticity of cerebral ischemic rats via a phosphorylated CRMP2-mediated mechanism
CN109563510A (zh) 使用mir-302前驱体作为抗癌药物用于治疗人类肺癌的组合物及方法
DE102018215551A1 (de) Verfahren zur Herstellung eines antitumoralen Arenavirus sowie Arenavirusmutanten
EP2254910A1 (de) Verwendung von substanzen zur sensibilisierung von tumorzellen gegen bestrahlung und/oder chemotherapie
WO2018019341A1 (de) Transfektionsverfahren mit nicht-viralen genliefersystemen
DE112018002302B4 (de) Chimärer Antigenrezeptor von Anti-Human-CD19-Antigen und dessen Anwendung
Shimakawa et al. Neuropilin-2 is overexpressed in the rat brain after limbic seizures
DE602004006509T2 (de) Zu einem für den menschlichen cd40-rezeptor codierenden cdna-bereich homologe oligoribonukleotidsequenz sowie damit zusammenhängende duplex-oligoribonukleotide, vektoren, pharmazeutische zusammensetzungen und verwendungen
Vazey et al. Differential fate and functional outcome of lithium chloride primed adult neural progenitor cell transplants in a rat model of Huntington disease
Wang et al. Case report: Successful treatment of a patient with relapsed/refractory primary central nervous system lymphoma with thiotepa-based induction, autologous stem cell transplantation and maintenance
EP2393504A2 (de) Ein l-ribozym enthaltende pharmazeutische zusammensetzung zur behandlung von nebenwirkungen durch gabe von spiegelmeren
CN113368243A (zh) 髓母细胞瘤的治疗靶点及其应用
DE102021133531A1 (de) Verfahren zur sensibilisierung für chemotherapie-medikamente, wirkstoffzusammensetzung und verwendung davon
EP1841461A1 (de) Iniizierbares mittel zur zielgerichteten behandlung von retinalen ganglienzellen
Ryner Cortical Inhibitory Interneuron Development is Disrupted in the APC cKO Mouse Model of Infantile Spasms
Huynh et al. KSRP Reduces the Migration and Invasion of Glioblastoma Cells and Restricts Angiogenesis of Human Brain Microvascular Endothelial Cells

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20100916

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL BA RS

RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: SANDFORT, VEIT

Inventor name: KOCH, ULRIKE

Inventor name: EKE, IRIS

Inventor name: BAUMANN, MICHAEL

Inventor name: CORDES, NILS

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
17Q First examination report despatched

Effective date: 20141106

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20150317