EP2250122A1 - Procede de fonctionnalisation de la paroi d'un pore. - Google Patents

Procede de fonctionnalisation de la paroi d'un pore.

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Publication number
EP2250122A1
EP2250122A1 EP09718040A EP09718040A EP2250122A1 EP 2250122 A1 EP2250122 A1 EP 2250122A1 EP 09718040 A EP09718040 A EP 09718040A EP 09718040 A EP09718040 A EP 09718040A EP 2250122 A1 EP2250122 A1 EP 2250122A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pore
activatable
electro
entities
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09718040A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Aurélie BOUCHET
Emeline Descamps
Pascal Mailley
Thierry Livache
Vincent Haguet
Francois Chatelain
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2250122A1 publication Critical patent/EP2250122A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81C—PROCESSES OR APPARATUS SPECIALLY ADAPTED FOR THE MANUFACTURE OR TREATMENT OF MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS
    • B81C1/00—Manufacture or treatment of devices or systems in or on a substrate
    • B81C1/00015—Manufacture or treatment of devices or systems in or on a substrate for manufacturing microsystems
    • B81C1/00206—Processes for functionalising a surface, e.g. provide the surface with specific mechanical, chemical or biological properties
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48721—Investigating individual macromolecules, e.g. by translocation through nanopores
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B81—MICROSTRUCTURAL TECHNOLOGY
    • B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
    • B81B2203/00—Basic microelectromechanical structures
    • B81B2203/03—Static structures
    • B81B2203/0353—Holes

Definitions

  • the present invention relates to a method of functionalization and more particularly to bio-functionalization of at least a portion of the wall of a pore.
  • pore or channel or capillary denotes any cavity emerging from a material or not.
  • Silanization firstly, performs the covalent grafting of organosilanes to the surface of materials such as glass or silicon. This process most often consists in first carrying out functionalization with a reactive group which will then allow the immobilization of the molecule of interest (Iqbal, S. et al., "Solid state nanopore channels with DNA selectivity", Nature Nanotechnology , 2007, 2: 243 and following, Karnik et al., Nano-Letters, 2007, 7 (3): 547 et seq .; Kim, Y.-R. et al., Biosensors & Bioelectronics, 2007. 22: 2926 and following, Wanunu, M.
  • a recent article by Joakim Nilsson et al., Entitled “Localized Functionalization of Single Nanopores” discloses the use of a focused nano-beam or nanoFIB (FIB: " Focused Ion Beam ”) for the creation of a pore in a silicon nitride surface.
  • FIB Focused Ion Beam
  • this process is multi-step and requires prior silanization of the support.
  • the application of these structures is most often connected to the connectors, which leads most authors, if necessary, to dissolve the matrix after creation of the polymer tubes.
  • the pore is here only a "mold", creator of the cylindrical form of the generated polymers, and is not intended to be used as an active support.
  • two different processes are known and used: chemical polymerization and electropolymerization.
  • Patent Applications FR 2 787 582 and FR 2 784 466 relate to a conventional technique of electropolymerization in which an electrode is disposed at the bottom of a non-emergent frustoconical microcuvette and another electrode in an electrolyte, in an unspecified position. .
  • this known technique makes it possible to deposit only one of the electrodes.
  • the invention relates to a method for performing a functionalization of a pore located on its surface, while simplifying the process.
  • the basic idea of the invention is to generate in the pore a voltage gradient of electrical apt to allow a deposit on the walls of the pore.
  • the invention thus relates to a process for functionalizing at least part of the wall of at least one pore of a support material, characterized in that it comprises: a) bringing the pore into contact with a solution of entities electro-activatable and position two electrodes in said solution, on either side of the pore, so as to create inside the pore and when an electrical signal is applied between the two electrodes, a voltage drop, in particular greater than 1000 V / m, capable of generating a deposit located on said wall. b) applying an electrical signal, potential difference or current, between the two electrodes to perform said functionalization.
  • an electrode is disposed at the bottom of a non-emergent cavity or at the bottom of the pore.
  • the field can reach 10 6 V / m or more.
  • the electrical signal can be constant or modulated as a function of time (periodic or not, pulsed, modulated in amplitude or in frequency, in staircase, in ramp, etc.).
  • the support is not necessarily conductive. There is no need to line the inside of the pores with a conductive layer as described for electropolymerization, which greatly simplifies the experimental procedure.
  • the support consisting of organic or inorganic material, may be of insulating, semiconductive or conductive nature.
  • Remote electropolymerization does not require the presence of an oxidizing chemical agent.
  • the remote electropolymerization process is feasible in a single handling step.
  • the preferential formation of the polymer on all or part of the wall of the pore can be explained by the fact that, an electric signal being applied on either side of the pore, the voltage drop that it produces is mainly localized to the pore. interior of the pore resulting in a strong potential gradient inducing a preferential formation of the polymer.
  • the method may include at least one iteration of a and b with a second solution of electro-activatable entities.
  • These entities may be the same or advantageously different entities, which allows in particular to have layers deposited on each other or side by side.
  • the pore is open at both ends and a solution is placed in two compartments in each of which opens an end of the pore, at least one of the two compartments containing said electro-activatable entities.
  • the pore has a single emergent end and one of the two electrodes is placed at the bottom of the pore, the other electrode being placed in a compartment in communication with the open end of the pore. After b, it can be provided a rinse.
  • the support material may be silicon-based.
  • the electro-activatable entities may be electropolymerizable monomers, especially pi-conjugated conducting monomers, preferably a pyrrole, or else carry electrograftable functions, in particular diazonium groups, or else be chosen from metals, metal oxides, catalytic particles, salts and metal complexes or consist of an electrophoretic paint.
  • the electro-activatable entity solution may include ligands.
  • the electro-activatable entity solution may comprise a mixture of electro-activatable entities, in particular an electropolymerizable monomer and said electro-activatable entities coupled to ligands, for example grafted with an oligonucleotide.
  • the solution may have an oligonucleotide probe (pyrrole-oligonucleotide), or more generally pyrrole coupled to a biomolecule.
  • the solution of electro-activatable entities may include doping ions of interest, in particular heparin and / or chondroitin.
  • the support material may be based on silicon.
  • the electrical signal may be a voltage of between 10 mV and 500 V and preferably between 100 mV and 10 V.
  • the criterion to be respected is that the field inside the pore is sufficient to generate a deposit on its wall.
  • the voltage difference can be applied for a duration of between 10 ⁇ s and 100 s and more particularly between 10 ms and 100 s, for example in the form of a pulse. The time of application of the voltage determines the thickness of the deposit.
  • the concentration of electro-activatable entities can be broadly ranging from 1 nM to 500 mM.
  • the method may have a step of detaching the electro-activatable entities from the support, for example by destroying this last or under the action of ultrasound.
  • the support may have at least one flared functionalization region (with or without bearings) which extends the wall of a pore.
  • the electro-activatable entities may comprise probe molecules, and the method may comprise a step of association by recognition in particular of hybridization with complementary target molecules.
  • the method may then include a step of denaturing said association by recognition, possibly followed by a step of new association by recognition, including rehybridization.
  • the method thus allows the affinity association of an entity of interest and allows the manufacture of molecular assemblies.
  • FIG. 1 is a block diagram illustrating the method according to the invention
  • FIGS. 2a to 2c represent a cell intended to receive a chip having a pore (assembly a), FIGS. 3 and 4 illustrate a mounting adopted on a multi-pores chip, FIG. 4 being a detail relating to the pore Pi. in the conditions of experience,
  • FIG. 5 illustrates the format of the fluorescence test used to validate the functionalization of the pores
  • FIGS. 6, 7, 8a and 8b represent different pore profiles used in the examples.
  • FIGS. 9a and 9b show two examples of non-emerging pore profiles.
  • the present invention relates to a process for functionalizing the surface of a pore by an organic or inorganic entity, in particular by a polymer, which has been generated electrically by the application of an electrical signal, in particular a difference of electrical potential on both sides of the pore. It makes it possible to carry out functionalization of pores or channels regardless of their size (for example of diameter between 1 nm and 5 mm), in particular pores or channels of micrometric and / or nanometric size, by: active groups allowing low energy interactions, for example:
  • molecular or biomolecular recognition groups such as, for example, biomolecules, reactive chemical groups or ion chelators.
  • organic or inorganic entities in particular for the purpose of reducing the pore opening diameter.
  • pore or "channel” or “capillary” means any cavity, open or not, located in a material. Their spatial distribution on the support can be defined (case of a machined membrane for example) or statistical (typical case of a frit). The invention relates to any pore size.
  • a pore 1 (FIG. 1) is placed between two sealed compartments 3 and 4 containing a solution 2 of electro-activatable entities which also bathes the pore 1.
  • a potential difference for example 2 V, is applied by a voltage source 5 between two electrodes. 6 and 7 disposed on either side of the pore 1, at a distance of a few millimeters from one another.
  • the electro-activatable entity may be chosen in particular from:
  • Electropolymerizable monomers such as pyrroles, thiophenes, indoles, anilines, azines, phenylenevinylenes, phenylenes, pyrenes, furans, selenophenes, pyrridazines, carbazoles, acrylates, methacrylates and their derivatives.
  • the electropolymerizable pattern is a pyrrole.
  • This monomer is easily functionalizable by an entity of interest.
  • polypyrrole is a biocompatible polymer, stable in air and in solution at physiological pH, which is an asset in the context of an application in the field of biosensors. Derivatives carrying electrograftable functions such as groups diazonium
  • Metals and metal oxides for example iridium oxide, catalytic particles, salts and metal complexes
  • the porous support may be of organic and / or inorganic nature and indifferently conductive, semiconducting or insulating electric. Semiconductor materials such as silicon or its oxide and nitride derivatives are preferably used.
  • Example I the monomer used is pyrrole.
  • polypyrrole is a polymer which has the advantage of being biocompatible and is therefore very interesting for developing biosensors. It also has the advantage of being stable in the handling conditions of biochemical tests (physiological pH, aqueous buffers, presence of oxygen, etc.). It is also a conductive polymer that has a hydrophilic character allowing its use in biological systems. Moreover, the synthesis of pyrrole-biomolecule conjugates is very well controlled and is done with a good yield.
  • Polypyrrole, polycarbazole, polyaniline, PEDOT 1 , polyindole, and polythiophene belong to the group of pi-conjugated conductive polymers. It is known that the corresponding monomers are electropolymerizable, that is to say that they lead to the formation of a polymer under the effect of the application of anodic potential on the surface of an electrode. These entities therefore behave in the same way taking into account solvent and oxidation conditions that are not identical from one entity to another.
  • the pyrrole is aliquoted at a concentration of 1 M in acetonitrile solvent and then stored at -20 ° C.
  • the pyrrole bearing an oligonucleotide was prepared according to the protocol described in Patent Application FR 2 703 359.
  • the DNA sequences used are the following: Py-probeZip6: Py 5 ' - (T) 10 - GAC CGG TAT GCG ACC TGG TAT GCG 3 ' (Py-SEQ ID NO.1)
  • Target-Zip6-bio biotin- 5 ' CGC ATA CCA GGT CGC ATA CCG GTC 3' (biotin-SEQ ID NO: 2)
  • the chips used are membranes of silicon oxide or silicon nitride. They comprise nine pores of micrometric size distributed over a surface of 2x2 cm 2 .
  • Buffers used (given as an indication):
  • Hybridization Buffer 0.02M Na 2 HPO 4 ZNaH 2 PO 41 I 1 IM NaCl 1 5.4mM KCl, 4% v / v 5OX Denhardt, 0.2% v / v Salmon sperm DNA, 0 , 3% v / v Tween 20 at pH 7.4
  • Rinse buffer PBS 5 tablets / L, NaCl 23,375 g / L, Tween 20 0.15% v / v.
  • Electropolvmerisation cell see FIGS. 2a to 2c:
  • the material of this cell C is "DeIMn" (registered trademark) polyoxymethylene said “DeIMn POM”.
  • the cell is split into two sealed compartments 3 and 4 by introducing into its rectangular receptacle 34 a support part 8 comprising one or more pores 1.
  • Platinum wires for example can be introduced into each of the compartments 3 and 4 through the openings 9i. and 9 2 of the cover 9 to form the electrodes.
  • 9 2 and 9 4 denote the cover mounting openings 9 of the cell C, and 5 and 9 9 6 screw mounting holes on the cell C.
  • mounting chip "multipore"
  • the chip 10 has 9 pores P 1 Pg. Each pore is isolated between two watertight compartments (3i, 4i, 3 2 , 4 2 , .... 3 9l 4 9 ). In other words, it is possible to put each of the nine pores Pi, P 2 Pg which have the same diameter or not in contact with a different solution Si, S 2 S 9 of electro-activatable entities.
  • Each of these compartments is equipped with electrodes to which is applied a given electrical potential difference and which are arranged at a distance d from the end of each pore.
  • the distance d may or may not be the same for the two electrodes of the same pore. It can be different from one pore to another depending on the requirements of functionalization.
  • the solutions Si, S 2 , Sg may or may not be the same.
  • a PT "multi-channel" potentiostat makes it possible to apply these voltages simultaneously (even if the values are different).
  • Each pore (P 1 , ... P 9 ) of a chip 10 is positioned between two sealed compartments 3i, 4i, ...; 3g, 4 9 which here have a volume of 10 .mu.l.
  • the assembly comprises one or two printed circuits 21, 22 (FIG 4) having an integrated circular electrode 23, 28 connectable to an external potentiostat.
  • In at least one of the electrodes are drilled two holes 26, 27 for introducing and discharging liquid via polytetrafluoroethylene capillaries.
  • Two sealed compartments 3 1 and 4 1 are created between the chip 10 and the printed circuits 21 and 22 by means of O-rings 24 and 25 (FIG. 4).
  • the electrodes integrated in the printed circuits or electrodes (not shown metal wires) introduced into capillaries on either side of the pore, or electrodes dipping directly into a compartment.
  • a plastic card (not shown) is used in place of the printed circuit.
  • the chip is cleaned (67% sulfuric acid, 33% hydrogen peroxide v / v) in a clean room to remove any organic contaminants.
  • the chip is soaked for 10 min in the solution and then rinsed through a water circulation until a resistivity of 9 M ⁇ .m.
  • the chip is then dried in an oven at 180 0 C for 10 min. It can then be stored at room temperature.
  • a polymerization solution containing 20 mM pyrrole and 5 ⁇ M py-Zip6 probe in electropolymerization buffer was used to make polymer deposits in the pores.
  • the chip comprising through pores is introduced so as to be between two compartments.
  • the polymerization solution is introduced into the two compartments.
  • An electrode is inserted in each compartment and a potential difference equal to 2 V is applied.
  • a voltage of between 10 mV and 500 V and preferably between 100 mV and 10V can be used depending on the pore size, the aim being to obtain a sufficiently high field inside. pore so that the deposit takes place on its wall.
  • the tracking of the deposition process is done by drawing the curve of the evolution of the intensity of the current as a function of time: the shape of this curve (presence or absence of an electrical signal) makes it possible to see if the liquid has penetrated to inside the pore (electrical contact) or not (no electrical signal).
  • the chip is then removed from the assembly and rinsed with water, dried with compressed air and kept dry at 4 ° C. d) Verification of functionalisation by fluorescence microscopy
  • fluorescence microscopy is used.
  • the format of the test used is shown in Figure 5. It is performed by depositing drops of 15 .mu.l of liquid on a pore.
  • the pore is first saturated with Hybridization Buffer (5 min at room temperature). Then a drop of biotinylated target at 100 nM hybridization buffer is added (15 min, room temperature). The chip is then thoroughly rinsed with the Rinse Buffer. Each pore is then incubated in a 10% streptavidin-phycoerythrin (SAPE) solution
  • the first is connected to the counter electrode coupled to the reference electrode of the potentiostat and the second to the working electrode.
  • a potential of 2 V is applied for a given time (between 100 ms and 1 s) between the two electrodes (working electrode and counter-electrode).
  • the chip is then removed from the cell, thoroughly rinsed with water and then dried with compressed air and stored at 4 ° C.
  • R f 35: pore 70 ⁇ m in diameter in a membrane of 2 microns thick and 500 microns side (see Figure 6).
  • a fluorescence emission is observed in the form of a luminous circle present on each side of the chip. Its dimensions correspond to those of the pore contour, which allows to deduce that the functionalization technique is effective and allows a polymer deposit located on the walls of a pore of micrometer size.
  • Scanning electron micrographs show a thin deposition layer - on the order of 30 nm - on the contour of a pore. This deposit is absent from an unfunctional pore.
  • R f 1 with a circular pore 18 ⁇ m in diameter in a membrane 20 ⁇ m thick: case of a pore pierced in a square membrane of 50 ⁇ m side and 20 ⁇ m thick.
  • the deposition is carried out at a voltage of 2 V applied for 100 milliseconds (FIG. 7).
  • R f 0.25 pore diameter 2 microns in a membrane of 8 microns thick.
  • the pore with a size of 2 ⁇ m is at the bottom of a cone with a larger diameter equal to 10 ⁇ m.
  • the environment of the pore is said to be of the "funnel" type (FIGS. 8a and 8b).
  • Fluorescence microscopy photographs show that the pore wall has been functionalized in a localized manner, as well as the contour of the top of the cone (10 ⁇ m in size).
  • a multi-pores chip having pores of variable form R f form and O 2 plasma-processed is placed within the assembly b described above ( Figures 3 and 4).
  • the polymerization solution is introduced successively into the two compartments. It consists of 20 mM pyrrole and 5 ⁇ M pyrrole-probe-Zip ⁇ in electropolymerization buffer. Then, two electrodes are positioned on each side of the chip. The first is connected to the auxiliary and reference electrodes of the potentiostat and the second to the working electrode. A potential of 2V is applied for 100 ms between the two electrodes. The chip is then removed from the cell, thoroughly rinsed with water and then dried with compressed air and stored at 4 ° C. ii) Results
  • iridium oxalate solution is prepared according to the following protocol (described in the article by A. M. Marsouk, Analytical Chemistry,
  • the iridium oxalate solution is introduced successively into the two compartments. Then, two electrodes are positioned on each side of the chip. The first is connected to the auxiliary and reference electrodes of the potentiostat and the other to the working electrode. A potential of
  • 0.80 V or 0.85 V or 0.90 V is applied for a duration of 5 s or 10 s.
  • the monitoring of the deposit is done by chronoamperometry to check the good electrical contact through the pore.
  • EXAMPLE IV OBTAINING STRUCTURED OBJECTS BY REMOTE ELECTRQDEPT TECHNOLOGY: i) Creation of a polypyrrole deposit: A polycarbonate membrane, comprising pores of nanometric size, can be inserted indifferently in assemblies a or b. Deposits of pyrrole / pyrrole-coupled copolymer with an oligonucleotide can then be obtained inside these pores following the previously described protocol.
  • FIGS. 9a and 9b are two variants of non-emerging pore shapes with an electrode 61 which covers all or part of the bottom of the cavity 60.
  • the zone of the pore where the deposit takes place corresponds at the narrow region 62, 62 'which concentrates the field.
  • the shape of the pore makes it possible to specifically locate the deposit on only a part of its wall.
  • the polarization of the electrode 61 at the bottom of the cavity 60 may be anodic or cathodic to respectively form a deposit of the same polymer on the surface of the electrode 61, in addition to the deposit on the necking region 62, 62 '. CONCLUSION:
  • the technical method of functionalization according to the invention is effective and relatively easy to put into practice.
  • This new technique makes it possible to effectively control the location of the functionalization of the surface of a pore by reactive groups. Indeed, the latter is essentially related to the organization of electric field lines within the pore, itself dependent on the structure of the pore environment (ie its geometry).
  • the method according to the invention has the advantage of being inexpensive: in financial terms because only reduced equipment is needed: potentiostats, electrodes ... in terms of time because the filing procedure only takes a few minutes.
  • the experimental device is more compact and easily transportable.
  • the strategy is adaptable to any type of porous support, organic or inorganic, conductive, semiconductor or insulating, regardless of the pore size.
  • the chronoamperogram measured during the deposition for example of polypyrrole
  • the chronoamperogram measured during the deposition has a non-intensity signal. no.
  • Electro-activatable entities in particular electropolymerizable (pyrroles, thiophenes ...), which can be functionalized, this technique is perfectly transferable to the immobilization within pores of active groups involved in low energy interactions such as ionic groups, peptides , antibodies, enzymes, ion chelators for example.
  • the polymer may also serve as a "starting layer" for localized deposition, in particular by using doping anions of interest, such as polysaccharides (heparin for example promoting cell adhesion (Zhou et al., Reactive & Functional Polymers, 1999). 39: 19 and following)) or surfactants.
  • doping anions of interest such as polysaccharides (heparin for example promoting cell adhesion (Zhou et al., Reactive & Functional Polymers, 1999). 39: 19 and following)
  • surfactants such as polysaccharides (heparin for example promoting cell adhesion (Zhou et al., Reactive & Functional Polymers, 1999). 39: 19 and following)
  • Multi-layer type stacks can be envisaged from the deposits obtained by "remote electrodeposit". It is thus possible to prepare a localized deposit (first layer) having for example a certain surface charge or a reactive chemical group which favors the fixing of a second layer of organic or inorganic entities given relative to the blank support.
  • the technique has experimentally allowed the implementation of a DNA immobilization, the latter being a biomolecule having a modular aspect, that is to say that can be used as a biomolecular recognition element for immobilization via hybridization of d a molecule of interest functionalized by complementary DNA targets.
  • the method has also made it possible to immobilize an entity of biological interest, biotin, by hybridization with immobilized DNA probes with a biotinylated complementary target, which underlines the modular aspect of the technique.
  • the experimental device can further integrate thermal and optical devices allowing for example crosslinking experiments or a visualization of the organization of deposits made.
  • Biofunctionalized porous membranes can find applications in the field of health, in particular for the detection of (bio) molecules present in small quantities in biological samples. Many research teams have thus oriented their work towards the design of systems for the detection of single molecules. These molecular Coulter counters have provided encouraging results with proteinaceous pores (Vercoutere, W. et al., Nature Biotechnology, 2001. 19: 248, Bayley and Cremer, Nature, 2001. 413: 226 et seq.).
  • the method is also suitable for applications in the field of micro- or nano-chromatography (ion exchange, steric exclusion, affinity or adsorption chromatography) for the purification of (bio) molecules.
  • micro- or nano-chromatography ion exchange, steric exclusion, affinity or adsorption chromatography
  • Functionalized pores may also be useful for capturing bacteria or cells, including immobilizing heparin or chondroitin within a pore.
  • Functionalised porous membranes also typically find applications in purification and filtration systems (water, effluents, etc.), the presence of chelators or ion exchangers on the surface of the pores being capable of selectively separating certain components of the liquid passing through the membrane.
  • the immobilization of catalytic particles, for example containing metals such as palladium or platinum in pores, via the process described, could allow the creation of micro- or nano-reactors for carrying out chemical reactions such as hydrogenations. for example.
  • the fact of being able to parallelize these reactions by using pore networks distributed in a membrane makes it possible to make combinatorial micro / nano-chemistry. Electrodeposition of metals by this technique can also find applications in the fields of catalytic converters (gas phase catalysis).
  • the method is finally compatible with the implementation of molecular imprinting techniques, which opens up interesting applications in the field of capillary electrophoresis, for example.
  • electro-activatable entities for which the possible presence of DNA probes has been mentioned above, may more generally optionally include ligands, namely: molecular and / or biomolecular recognition elements including nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, DNA, RNA, PNA, peptides, polypeptides, antibodies, antigens, enzymes, proteins, amino acids, glycopeptides, biotins, haptens, sugars, oligosaccharides, polysaccharides , lipids, glycolipids, steroids, hormones, receptors.
  • ligands namely: molecular and / or biomolecular recognition elements including nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, DNA, RNA, PNA, peptides, polypeptides, antibodies, antigens, enzymes, proteins, amino acids, glycopeptides, biotins, haptens, sugars, oligosacchari
  • affinity groups in particular ion chelators and ion exchangers.
  • the particles may be and / or contain biological cells and / or components and / or cellular products, including cell lines and / or globules and / or liposomes and / or cell nuclei and / or chromosomes and / or or strands of DNA or RNA and / or nucleotides and / or ribosomes and / or enzymes and / or antibodies and / or proteins and / or proteins and / or peptides and / or principles active agents and / or parasites and / or bacteria and / or viruses and / or pollens and / or polymers and / or biological factors and / or stimulants and / or growth inhibitors and / or suspension in a liquid, and / or bioparticles suspended in a solution, and / or molecules.
  • biological cells and / or components and / or cellular products including cell lines and / or globules and / or liposomes and / or cell nuclei and /
  • the manipulated particles may be and / or contain insoluble solid particles such as magnetic particles and / or dielectric particles, or conductive particles, or functionalized particles, or pigments, or dyes, or protein crystals, or powders, or polymer structures, or insoluble pharmaceutical substances, or carbon fibers, or yarns, or nanotubes, or small aggregates (clusters) formed by agglomeration of colloids of o-groups having surface features • in terms of pH, especially weak acid / base pairs and amphoteric compounds and / or in terms of hydrophilicity and / or hydrophobicity and / or amphiphilism, and / or in terms of polarity,
  • insoluble solid particles such as magnetic particles and / or dielectric particles, or conductive particles, or functionalized particles, or pigments, or dyes, or protein crystals, or powders, or polymer structures, or insoluble pharmaceutical substances, or carbon fibers, or yarns, or nanotubes, or small aggregates (clusters) formed by agglomeration of colloids
  • the functionalization layer deposited on the walls of the pore comprises, for example, interaction or reaction means with molecules and / or biomolecules.
  • These include modular groups such as DNA, photoactivatable such as benzophenone, electroactivables such as the electro-activatable entities mentioned above, or even thermoactivables such as thermosetting polymers.
  • the ligand must be coupled to an electro-activatable entity to enable functionalization by the method of the present invention. It is not necessary that there be in the solution both electro-activatable entities and electro-activatable entities coupled to a ligand: there can also be only electro-activatable entities coupled to a ligand, or else only electro-activatable entities.

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Abstract

L'Invention est relative à un procédé de fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution de manière à créer à l'intérieur du pore et lorsqu'un signal électrique est appliqué entre les deux électrodes, une chute de tension apte à générer un dépôt localisé sur ladite paroi. b) appliquer un signal électrique entre les deux électrodes pour activer les entités électroactivables et réaliser ladite fonctionnalisation.

Description

PROCEDE DE FONCTIONNALISATION DE LA PAROI D1UN PORE.
La présente invention a pour objet un procédé de fonctionnalisation et plus particulièrement de bio-fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'un pore. Le terme pore (ou canal ou capillaire) désigne toute cavité débouchante ou non d'un matériau.
La structure en trois dimensions d'un pore ou d'un canal ou d'un capillaire rend difficile sa fonctionnalisation. En effet, des techniques couramment utilisées pour la fonctionnalisation de surfaces planes, comme la pulvérisation ou bien le "spotting" par exemple, deviennent difficiles, voire impossibles à mettre en pratique pour des pores, canaux ou capillaires, cela étant d'ailleurs d'autant plus vrai que leur dimension diminue.
D'une manière générale, les procédés de fabrication connus ne permettent pas ou permettent très difficilement de fonctionnaliser des pores de manière localisée.
Afin de fonctionnaliser un pore, il est courant d'utiliser des techniques classiques de fonctionnalisation de surface. Les plus courantes utilisent des propriétés d'auto-assemblage des molécules sur support.
La silanisation, tout d'abord, réalise le greffage covalent d'organosilanes à la surface de matériaux comme le verre ou le silicium. Ce procédé consiste le plus souvent à réaliser d'abord une fonctionnalisation par un groupement réactif qui permettra ensuite l'immobilisation de la molécule d'intérêt (Iqbal, S. et collaborateurs, "Solid-State nanopore channels with DNA selectivity", Nature Nanotechnology, 2007, 2: p. 243 et suivantes ; Karnik et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(3) : p. 547 et suivantes; Kim, Y. - R. et collaborateurs, Biosensors & Bioelectronics, 2007. 22: p. 2926 et suivantes; Wanunu, M. et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7(6) : p. 1580 et suivantes). Malgré son usage courant, le processus de silanisation reste encore mal maîtrisé et réclame un contrôle des paramètres du matériau qui est critique pour la fiabilité de la modification de surface et la stabilité du dépôt (nature des fonctions de surface, absence de contamination, rugosité de la surface...).
La formation de monocouches auto-assemblées d'alcanes- thiols (Lee S. B. and Martin C. R., Chemistry of Materials, 2001 , 13 (10) : p. 3236 et suivantes; Smuleac V. et collaborateurs, Chemistry of Materials, 2004, 16 (14) : p. 2762 et suivantes; Jagerski et collaborateurs, Nano-Letters, 2007, 7 (6) : p. 1609 et suivantes) se base sur la chimisorption des groupements thiol sur différentes surfaces métalliques comme l'or (le plus utilisé), l'argent, le platine, le cuivre ... Cette stratégie a été mise en pratique afin de réaliser la fonctionnalisation des nanopores par des brins d'ADN thiolés (Harrell, C. C. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 2004, 126, p. 15646 et suivantes).
Un des inconvénients majeurs des techniques énoncées précédemment est le fait que la fonctionnalisation concerne le plus souvent non seulement le pore mais également la surface plane réactive qui l'entoure, partout où il y a un dépôt de solution contenant l'organosilane ou l'alcane- thiol, sans localisation. Dans le cas des alcanes-thiol, le support est nécessairement métallique.
Un article récent de Joakim Nilsson et collaborateurs, intitulé "Localized Functionalization of Single Nanopores" (Advanced Materials, 2006, 18, p. 427 à 431) décrit l'utilisation d'un nano faisceau d'ions focalisé ou nanoFIB (FIB : "Focused Ion Beam") pour la création d'un pore dans une surface de nitrure de silicium. La gravure du pore, le dépôt d'une couche de dioxyde de silicium sous le faisceau du faisceau FIB et une silanisation conduisent à la création de fonctions réactives en surface permettant l'accrochage localisé de brins d'ADN. Cependant, ce procédé est multi-étapes et nécessite une silanisation préalable du support.
D'autres auteurs ont décrit l'immobilisation de polymères conducteurs sur des surfaces diélectriques par le biais d'une silanisation du support par un organosilane fonctionnalisé par un pyrrole. Des monomères pyrrole sont ensuite ajoutés dans le milieu et la polymérisation est amorcée grâce à un agent oxydant (Simon et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 1982, 104 : p. 2031 et suivantes; Faverolle et collaborateurs, Chemistry of Materials, 1998. 10 : p. 740 et suivantes).
Il a également été décrit dans la littérature qu'il est possible de fonctionnaliser des pores, dans des membranes de polycarbonate par exemple, en faisant intervenir des entités polymérisables. Il est ainsi possible d'obtenir des tubes de polymère conducteur en réalisant la polymérisation dans un cadre confiné, délimité par des barrières physiques (pore, canal...) (Martin, C. R. et collaborateurs, Journal of the American Chemical Society, 1990, 112, p. 8976 et suivantes, Martin, C. R., Science, 1994, 266 (5193) : p. 1961 et suivantes) ou en présence d'agents externes qui structurent le milieu de polymérisation de manière à ce qu'elle se fasse de façon orientée (Carswell et collaborateurs Journal of the American Chemical Society, 2003, 125 : p. 14793 et suivantes; Qu et collaborateurs, Journal of Polymer Science : Part A : Polymer Chemistry, 2004, 42: p. 3170 et suivantes). L'application de ces structures est le plus souvent reliée à la connectique, ce qui conduit la plupart des auteurs, le cas échéant, à dissoudre la matrice après création des tubes de polymère. Le pore est ici seulement un "moule", créateur de la forme cylindrique des polymères générés, et n'a pas vocation à être utilisé comme support actif. Schématiquement, deux procédés différents sont connus et utilisés : la polymérisation chimique et l'électropolymérisation.
1) Polymérisation chimique (article précité de Martin, C. R., Science, 1994, 266 (5193) : p. 1961 et suivantes; Martin C.R., Advanced Materials, 1991 , 3 : p. 457 et suivantes). Un moyen d'obtenir des nanotubes de polymères est de réaliser une polymérisation dite "chimique" d'un monomère tel que le pyrrole couramment cité. La technique expérimentale consiste à placer une membrane poreuse (polycarbonate ....) entre deux solutions aqueuses : une solution contenant le monomère pyrrole et l'autre solution contenant un agent oxydant (comme FeCI3 par exemple) qui induit la polymérisation aux points de rencontre des deux solutions, c'est-à-dire dans les pores de la membrane.
2) Electropolymérisation (Menon, V. P. et collaborateurs, chemistry of Matériel, 1996, 8: p. 2382 et suivantes; Demoustier-Champagne et collaborateurs, European Polymer Journal, 1998, 34 (12) : p; 1767 et suivantes).
Il s'agit dans ce cas de déposer premièrement sur un côté d'une membrane une couche d'adhésion (du chrome par exemple) et de déposer ensuite par-dessus une couche métallique (or). On peut alors procéder à l'électropolymérisation du pyrrole sur cette surface grâce à une cellule électrolytique à trois électrodes.
Ces procédés permettent d'obtenir, lors d'une des étapes, des pores fonctionnalisés par un polymère pour obtenir des structures organisées utilisant le pore comme "moule". Des fonctionnalisations par des biotines ont ainsi été réalisées par Sapp et Collaborateurs (Chemistry of Materials, 1999, 11: p. 1183 et suivantes) en réalisant la polymérisation électrochimique des monomères thiophène et pyrrole porteurs d'une fonction aminé permettant le greffage d'un dérivé de la biotine.
On notera par ailleurs que des monomères pyrrole porteurs de biomolécules sont connus en tant que tels (notamment Demandes de brevet français FR 2 703 359 et FR 2 720 832).
Les Demandes de Brevet FR 2 787 582 et FR 2 784 466 concernent une technique classique d'électro-polymérisation selon laquelle une électrode est disposée au fond d'une microcuvette tronconique non débouchante et une autre électrode dans un électrolyte, dans une position non spécifiée. Il n'y a pas dans ce cas de fonctionnalisation de la surface de la microcuvette, mais seulement de l'électrode située au fond de celle-ci. En d'autres termes, cette technique connue ne permet de réaliser de dépôt que sur une des électrodes.
L'invention concerne un procédé permettant de réaliser une fonctionnalisation d'un pore localisée à sa surface, tout en simplifiant le procédé. L'idée de base de l'invention est de générer dans le pore un gradient de tension électrique apte à permettre un dépôt sur les parois du pore.
L'invention concerne ainsi un procédé de fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution, de part et d'autre du pore, de manière à créer à l'intérieur du pore et lorsqu'un signal électrique est appliqué entre les deux électrodes, une chute de tension, notamment supérieure à 1000 V/m, apte à générer un dépôt localisé sur ladite paroi. b) appliquer un signal électrique, différence de potentiel ou courant, entre les deux électrodes pour réaliser ladite fonctionnalisation.
En générant un gradient de tension élevé entre les électrodes à l'intérieur du pore, on obtient un dépôt sur la paroi du ou des pores, et aussi de manière concommitante un dépôt sur l'électrode de polarisation anodique comme observé lors d'un dépôt par électro-polymérisation classique.
Dans le cas d'un pore non débouchant, une électrode est disposée au fond d'une cavité non débouchante ou au fond du pore. L'autre électrode est disposée à l'extrémité du pore (d = 0) ou à distance de l'extrémité du pore (d > O)1 la chute de tension dans le pore étant suffisante pour permettre un dépôt sur les parois.
Dans le cas d'un pore débouchant, les électrodes sont disposées aux extrémités du pore (d = 0) et/ou à distance de cette extrémité (d > 0), la chute de tension dans le pore étant suffisante pour permettre un dépôt sur sa paroi.
Par exemple, le champ peut atteindre 106 V/m, voire plus.
Le signal électrique peut être constant ou bien modulé en fonction du temps (périodique ou non, puisé, modulé en amplitude ou en fréquence, en escalier, en rampe, etc.).
Le support n'est pas nécessairement conducteur. Nul besoin de tapisser l'intérieur des pores d'une couche conductrice comme décrit pour l'électropolymérisation, ce qui simplifie grandement la démarche expérimentale. L'électropolymérisation est réalisée "à distance" avec des électrodes situées de part et d'autre de la surface à fonctionnaliser. On comprendra que l'expression "de part et d'autre du pore" inclut le cas où d = 0. Le support, constitué de matériau organique ou inorganique, peut être de nature isolante, semi-conductrice ou conductrice.
L'électropolymérisation à distance ne nécessite pas la présence d'un agent chimique oxydant.
Le procédé d'électropolymérisation à distance est réalisable en une seule étape de manipulation.
La formation préférentielle du polymère sur tout ou partie de la paroi du pore peut s'expliquer par le fait que, un signal électrique étant appliqué de part et d'autre du pore, la chute de tension qu'il produit est principalement localisée à l'intérieur du pore d'où un fort gradient de potentiel induisant une formation préférentielle du polymère.
Le procédé peut comporter au moins une itération de a et de b avec une deuxième solution d'entités électroactivables. Ces entités peuvent être les mêmes ou avantageusement des entités différentes, ce qui permet notamment de disposer des couches déposées les unes sur les autres ou côte à côte.
Selon une première variante, le pore est ouvert à ses deux extrémités et une solution est placée dans deux compartiments dans chacun desquels débouche une extrémité du pore, au moins un des deux compartiments contenant lesdites entités électroactivables. Selon une deuxième variante, le pore présente une seule extrémité débouchante et une des deux électrodes est placée au fond du pore, l'autre électrode étant placée dans un compartiment en communication avec l'extrémité débouchante du pore. Après b, il peut être prévu un rinçage.
Le matériau support peut être à base de silicium.
Les entités électroactivables peuvent être des monomères électropolymérisables, notamment des monomères conducteurs pi- conjugués, de préférence un pyrrole, ou bien être porteuses de fonctions électrogreffables, notamment les groupements de diazonium, ou bien encore être choisies parmi les métaux, les oxydes métalliques, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques ou être constituées par une peinture électrophorétique.
La solution d'entités électroactivables peut comporter des ligands.
La solution d'entités électroactivables peut comporter un mélange d'entités électroactivables, notamment un monomère électropolymérisable et desdites entités électroactivables couplées à des ligands, par exemple greffées avec un oligonucléotide. En particulier, la solution peut présenter une sonde oligonucléotidique (pyrrole-oligonucléotide), ou plus généralement du pyrrole couplé à une biomolécule.
La solution d'entités électroactivables peut inclure des ions dopants d'intérêt, notamment l'héparine et/ou la chondroitine.. Le matériau support peut être à base de silicium.
Le signal électrique peut être une tension comprise entre 10 mV et 500 V et de préférence entre 100 mV et 10 V. Le critère à respecter est que le champ à l'intérieur du pore soit suffisant pour générer un dépôt sur sa paroi. La différence de tension peut être appliquée pendant une durée comprise entre 10 μs et 100 s et plus particulièrement entre 10 ms et 100 s, par exemple sous forme d'une d'impulsion. Le temps d'application de la tension détermine l'épaisseur du dépôt.
La concentration en entités électroactivables peut s'étendre dans une large gamme, à savoir entre 1 nM et 500 mM. Le procédé peut présenter une étape de détachement des entités électroactivables du support, par exemple par destruction de ce dernier ou sous l'action d'ultrasons. Le support peut présenter au moins une région de fonctionnalisation évasée (comportant ou non des paliers) qui prolonge la paroi d'un pore.
Les entités électroactivables peuvent comporter des molécules sondes, et le procédé peut comporter une étape d'association par reconnaissance notamment d'hybridation avec des molécules cibles complémentaires.
Le procédé peut ensuite comporter une étape de dénaturation de ladite association par reconnaissance, éventuellement suivie d'une étape de nouvelle association par reconnaissance, notamment de réhybridation.
Le procédé permet ainsi l'association par affinité d'une entité d'intérêt et permet la fabrication d'assemblages moléculaires.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description ci-après, en liaison avec les dessins dans lesquels :
- la figure 1 est un schéma de principe illustrant le procédé selon l'invention,
- les figures 2a à 2c représentent une cellule destinée à recevoir une puce présentant un pore (montage a), - les figures 3 et 4 illustrent un montage adopté à une puce multi-pores, la figure 4 en étant un détail relatif au pore Pi dans les conditions d'expérience,
- la figure 5 illustre le format du test de fluorescence utilisé pour valider la fonctionnalisation des pores - les figures 6, 7, 8a et 8b représentent différents profils de pores mis en œuvre dans les exemples.
- et les figures 9a et 9b représentent deux exemples de profils de pores non débouchants.
La présente invention est relative à un procédé de fonctionnalisation de la surface d'un pore par une entité organique ou inorganique, en particulier par un polymère, qui a été générée électriquement grâce à l'application d'un signal électrique, notamment une différence de potentiel électrique de part et d'autre du pore. Il permet de réaliser une fonctionnalisation de pores ou de canaux quelle que soit leur taille (par exemple de diamètre compris entre 1 nm et 5 mm), en particulier des pores ou des canaux de dimension micrométrique et/ou nanométrique, par : - des groupements actifs permettant des interactions de faible énergie comme par exemple :
. des charges de surface
.des groupements de reconnaissance moléculaire ou biomoléculaire, tels que par exemple des biomolécules, des groupements chimiques réactifs ou encore des chélateurs d'ions.
- des entités organiques ou inorganiques notamment dans le but de réduire le diamètre d'ouverture du pore.
On entend par le terme "pore" ou "canal" ou "capillaire" toute cavité, débouchante ou non, se trouvant dans un matériau. Leur distribution spatiale sur le support peut être définie (cas d'une membrane usinée par exemple) ou statistique (cas typique d'un fritte). L'invention concerne toute taille de pore.
Un pore 1 (figure 1) est placé entre deux compartiments 3 et 4 étanches contenant une solution 2 d'entités électroactivables qui baigne également le pore 1. Une différence de potentiel par exemple 2 V est appliquée par une source de tension 5 entre deux électrodes 6 et 7 disposées de part et d'autre du pore 1 , à une distance de quelques millimètres l'une de l'autre. L'entité électroactivable peut être choisie notamment parmi :
- Des monomères électropolymérisables tels les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les phénylènevinylènes, les phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés. De préférence, le motif électropolymérisable est un pyrrole. Ce monomère est facilement fonctionnalisable par une entité d'intérêt. De plus, le polypyrrole est un polymère biocompatible, stable à l'air et en solution à pH physiologique, ce qui constitue un atout dans le cadre d'une application dans le domaine des biocapteurs, - Des dérivés porteurs de fonctions électrogreffables telles les groupements diazonium,
- Les métaux et oxydes métalliques, par exemple l'oxyde d'iridium, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques
- Les peintures électrophorétiques. Le support poreux peut être de nature organique et/ou inorganique et indifféremment conducteur, semi-conducteur ou isolant électrique. On utilise de préférence des matériaux semi-conducteurs comme le silicium ou ses dérivés oxyde et nitrure.
Dans l'exemple I ci-après, le monomère utilisé est le pyrrole.
En effet, le polypyrrole est un polymère qui présente l'avantage d'être biocompatible et est donc très intéressant pour élaborer des biocapteurs. Il possède également l'atout d'être stable dans les conditions de manipulation des tests biochimiques (pH physiologique, tampons aqueux, présence d'oxygène ...). Il s'agit également d'un polymère conducteur qui présente un caractère hydrophile permettant son utilisation dans des systèmes biologiques. De plus chimiquement, la synthèse de conjugués pyrrole- biomolécule est très bien maîtrisée et se fait avec un bon rendement.
Le polypyrrole, le polycarbazole, la polyaniline, le PEDOT1 le polyindole, et le polythiophène appartiennent au groupe des polymères conducteurs pi-conjugués. II est connu que les monomères correspondants sont électropolymérisables, à savoir qu'ils conduisent à la formation d'un polymère sous l'effet de l'application d'un potentiel anodique à la surface d'une électrode. Ces entités se comportent donc de la même manière en tenant compte de conditions de solvant et d'oxydation qui ne sont pas identiques d'une entité à une autre.
POLYPYRROLE - MISE EN ŒUVRE DES EXEMPLES I. - Matériel
A) Réactifs et consommables :
Le pyrrole est aliquoté à une concentration de 1 M en solvant acétonitrile puis conservé à -200C. Le pyrrole porteur d'un oligonucléotide a été préparé selon le protocole décrit dans la Demande de Brevet FR 2 703 359.
Les séquences ADN utilisées sont les suivantes : . Py-sondeZip6 : Py5'-(T)10- GAC CGG TAT GCG ACC TGG TAT GCG3' (Py-SEQ ID NO. 1)
. Cible-Zip6-bio : biotine-5' CGC ATA CCA GGT CGC ATA CCG GTC3' (biotine-SEQ ID NO. 2)
Les puces utilisées sont des membranes d'oxyde de silicium ou de nitrure de silicium. Elles comportent neuf pores de taille micrométrique répartis sur une surface de 2x2 cm2. B) Tampons utilisés (donnés à titre indicatif) :
. Tampon d'électropolymérisation : 6g/L Na2HPθ4/NaH2PO4, 2,9 g/L NaCI, 10 % v/v glycérol, 2% v/v acétonitrile (v/v = en volume).
. Tampon d'hybridation: 0,02 M Na2HPO4ZNaH2PO41I 1IM NaCI1 5,4 mM KCI, 4% v/v 5OX Denhardt , 0,2% v/v ADN de sperme de saumon, 0,3% v/v Tween 20 à pH 7,4
. Tampon de rinçage : PBS 5 comprimés/L, NaCI 23.375 g/L, Tween 20 0.15% v/v.
C) Montages expérimentaux pour l'électropolymérisation à distance :
Deux montages expérimentaux ont été validés. a) Cellule d'électropolvmérisation (voir figure 2a à 2c) :
Le matériau de cette cellule C est du "DeIMn" (marque déposée) polyoxyméthylène dit "DeIMn POM". La cellule est scindée en deux compartiments étanches 3 et 4 en introduisant dans son réceptacle rectangulaire 34 une pièce support 8 comportant un ou plusieurs pores 1. Des fils de platine par exemple peuvent être introduits dans chacun des compartiments 3 et 4 à travers les ouvertures 9i et 92 du couvercle 9 pour former les électrodes. 92 et 94 désignent les ouvertures de fixation du couvercle 9 sur la cellule C, et 95 et 96 les trous de fixation des vis sur la cellule C. b) Montage sur puce "multipores" :
Si on souhaite fonctionnaliser de manière différente chacun des pores d'une puce, il convient de travailler en parallèle avec une source de tension multivoies ou plusieurs sources de tension monovoie, par exemple un potentiostat multi-voies, ou plusieurs potentiostats mono-voie.
Dans le montage décrit en relation avec la figure 3, la puce 10 présente 9 pores P1 Pg. Chaque pore est isolé entre deux compartiments étanches (3i, 4i ; 32, 42 ; .... 39l 49). Autrement dit, il est possible de mettre chacun des neuf pores Pi, P2 Pg qui ont ou non le même diamètre en contact avec une solution différente Si, S2 S9 d'entités électroactivables.
Chacun de ces compartiments est équipé d'électrodes auxquelles est appliquée une différence de potentiel électrique donnée et qui sont disposées à une distance d de l'extrémité de chaque pore. La distance d peut être ou non la même pour les deux électrodes d'un même pore. Elle peut être différente d'un pore à l'autre selon les nécessités de la fonctionnalisation. Il y a ainsi neuf électrodes de travail En, Et2,... E13... Et9 qui sont reliées ou non au même potentiostat (ou plus généralement à la même source de tension) et neuf contre-électrodes qui peuvent être couplés à des électrodes de référence Eai, Ea2, Eag. Les solutions Si, S2, Sg peuvent être ou non les mêmes. Un potentiostat PT "multi-voies"permet d'appliquer ces tensions simultanément (même si les valeurs en sont différentes).
Chaque pore (P1, ... P9) d'une puce 10 est positionné entre deux compartiments étanches 3i, 4i,... ; 3g, 49 qui ont ici un volume de 10 μl.
Le montage comporte un ou deux circuits imprimés 21 , 22 (Fig. 4) ayant une électrode circulaire intégrée 23, 28 reliable à un potentiostat extérieur. Dans au moins une des électrodes sont percés deux trous 26, 27 permettant d'introduire et d'évacuer du liquide via des capillaires en polytétrafluoroéthylène. Deux compartiments étanches 3i et 4\ sont créés entre la puce 10 et les circuits imprimés 21 et 22 grâce à des joints toriques 24 et 25 (Figure 4). Afin de réaliser l'électropolymérisation de manière à obtenir un dépôt localisé 30 sur les parois des pores, on utilise :
- soit les électrodes intégrées aux circuits imprimés soit des électrodes (fils métalliques non représentés) introduites dans des capillaires de part et d'autre du pore, - soit des électrodes trempant directement dans un compartiment. Dans ce cas, une carte plastique (non représentée) est utilisée à la place du circuit imprimé.
Il) MISE EN OEUVRE A) Préparation du substrat : a) Nettoyage :
Dans un premier temps, la puce subit un nettoyage (67% acide sulfurique, 33% peroxyde d'hydrogène v/v) en salle blanche afin d'éliminer tout contaminant d'origine organique. La puce est trempée 10 min dans la solution puis rincée grâce à une circulation d'eau jusqu'à obtenir une résistivité de 9 MΩ.m. La puce est ensuite séchée dans une étuve à 1800C pendant 10 min. Elle peut ensuite être stockée à température ambiante. b) Augmentation de l'hydrophilie de la surface grâce à l'application d'un plasma oxygène :
Cette étape permet de rendre la surface hydrophile, ce qui est avantageux dans l'objectif de remplir le pore, quel que soit sa taille, par une solution majoritairement aqueuse. La puce est ainsi placée pendant 45 secondes dans un plasma 02 a une puissance de 100 W. c) Dépôt de polypyrrole :
Une solution de polymérisation contenant 20 mM de pyrrole et 5 μM de py-sondeZip6 en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée pour réaliser des dépôts de polymère dans les pores.
Les deux montages (a et b ci-dessus) ont été utilisés.
Dans chaque cas, la puce comprenant des pores débouchants est introduite de manière à se trouver entre deux compartiments. La solution de polymérisation est introduite dans les deux compartiments. Une électrode est insérée dans chaque compartiment et une différence de potentiel égale à 2 V est appliquée. On notera qu'en pratique, on peut utiliser une tension comprise entre 10 mV et 500 V et de préférence entre 100 mV et 10V selon la dimension des pores, le but poursuivi étant l'obtention d'un champ suffisamment élevé à l'intérieur du pore pour que le dépôt ait lieu sur sa paroi. Le suivi du déroulement du dépôt se fait en traçant la courbe de l'évolution de l'intensité du courant en fonction du temps : l'allure de cette courbe (présence ou absence de signal électrique) permet de voir si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore (contact électrique) ou non (absence de signal électrique). La puce est ensuite retirée du montage puis rincée à l'eau, séchée à l'air comprimé et conservée sèche à 4°C. d) Vérification de la fonctionnalisation par microscopie de fluorescence
Afin de vérifier la formation d'un dépôt de polypyrrole, on utilise la microscopie de fluorescence. Le format du test utilisé est illustré à la figure 5. Il est réalisé en déposant des gouttes de 15 μl de liquide sur un pore.
Le pore est tout d'abord saturé en Tampon d'hybridation (5 min à température ambiante). Puis une goutte de cible biotinylée à 100 nM en Tampon d'hybridation est ajoutée (15 min, température ambiante). La puce est ensuite rincée abondamment avec le Tampon de rinçage. Chaque pore est ensuite incubé dans une solution de streptavidine-phycoérythrine (SAPE) à 10%
(v/v = en volume) en Tampon de rinçage (15 min. à température ambiante).
La puce est ensuite placée entre lame et lamelle pour être observée en microscopie de fluorescence à 530 nm, longueur d'onde d'émission de la phycoérythrine. BIP FONCTIONNALISATION D'UN PORE PAR DES ACIDES NUCLEIQUES
EXEMPLE I - (Montage a) i) Création d'un dépôt de polypyrrole Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de forme variables (rapport de forme Rf = diamètre du pore / épaisseur de la membrane dans laquelle il est percé) et ayant subi un traitement plasma est introduite dans la cellule bi-compartiments "Delrin POM" décrite ci-dessus. La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux compartiments de la cellule. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 μM de pyrrole-sonde Zip6 (py-sonde Zip 6) en tampon d'électropolymérisation. Puis, deux fils de platine sont introduits, un de chaque côté de la puce. Le premier est relié à la contre-électrode couplée à l'électrode de référence du potentiostat et le second à l'électrode de travail. Un potentiel de 2 V est appliqué pendant une durée donnée (entre 100 ms et 1 s) entre les deux électrodes (électrode de travail et contre-électrode). La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4°C.
L'efficacité de la fonctionnalisation est vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus. ii) Résultats
La manipulation a été réalisée avec des pores présentant différents rapports de forme :
. Rf = 35 : pore de 70 μm de diamètre dans une membrane de 2 μm d'épaisseur et de 500 μm de côté (voir figure 6).
On observe une émission de fluorescence sous la forme d'un cercle lumineux présent de chaque côté de la puce. Ses dimensions correspondent à celles du contour du pore, ce qui permet de déduire que la technique de fonctionnalisation est efficace et permet un dépôt de polymère localisé sur les parois d'un pore de taille micrométrique.
Les clichés de microscopie électronique à balayage montrent une fine couche de dépôt - de l'ordre de 30 nm - sur le contour d'un pore. Ce dépôt est absent d'un pore non fonctionnalisé.
. Rf = 1 avec un pore circulaire de 18 μm de diamètre dans une membrane de 20 μm d'épaisseur : cas d'un pore percé dans une membrane carrée de 50 μm de côté et de 20 μm d'épaisseur. Le dépôt est réalisé à une tension de 2 V appliquée pendant 100 millisecondes (figure 7).
La réalisation du test de fluorescence exposé ci-dessus conduit à la présence d'anneaux lumineux de chaque côté du pore qui certifie de la fonctionnalisation efficace et localisée du pore par un polymère porteur d'oligonucléotides.
. Rf = 0,25 pore de diamètre 2 μm dans une membrane de 8 μm d'épaisseur. Le pore d'une taille de 2 μm se trouve au fond d'un cône de plus grand diamètre égal à 10 μm. L'environnement du pore est dit de type « entonnoir » (figures 8a et 8b).
Les clichés de microscopie de fluorescence montrent que la paroi du pore a été fonctionnalisée de manière localisée, ainsi que le contour du haut du cône (de dimension 10 μm).
Cela constitue un résultat qui laisse la possibilité de contrôler le lieu de la fonctionnalisation selon la morphologie de l'environnement du pore.
EXEMPLE II (montage b) : i) Création d'un dépôt de polypyrrole
Une puce multi-pores comportant des pores de rapports de forme Rf variables et ayant subi un traitement plasma O2 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4). La solution de polymérisation est introduite successivement dans les deux compartiments. Elle est constituée de 20 mM de pyrrole et 5 μM de pyrrole-sonde-Zipδ en Tampon d'électropolymérisation. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaires et de référence du potentiostat et la seconde à l'électrode de travail. Un potentiel de 2V est appliqué pendant 100 ms entre les deux électrodes. La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4°C. ii) Résultats
L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie de fluorescence selon le procédé décrit ci-dessus. Chacun des 9 pores de la puce multi-pores peut être étudié indépendamment, éventuellement avec une fonctionnalisation spécifique pour chaque pore. . Rf = 1 pore de 18 μm de diamètre dans une membrane de
18 μm d'épaisseur. La microscopie à fluorescence confirme que le procédé de fonctionnalisation de surface fonctionne également pour toutes les valeurs précitées de Rf en utilisant ce montage (présence d'un anneau fluorescent).
Des témoins ont été réalisés pour établir la spécificité de l'interaction biochimique aboutissant à la fonctionnalisation caractérisée par l'émission de fluorescence. Ces contrôles ont été réalisés sur les pores de 18 μm de diamètre (Rf = 1) d'une puce multi-pores : a) Potentiel électrique
Pour ce faire, 15 μl d'une solution de polymérisation composée de 20 mM de pyrrole et 5 μM de pyrrole-sonde-Zipθ en tampon d'électropolymérisation sont déposés sur un pore et laissés en contact avec la surface pendant 5 min. La puce est ensuite rincée à l'eau et séchée à l'air comprimé (procédure identique à celle réalisée après une électropolymérisation à distance). La puce est conservée à 4°C puis elle subit la procédure du test de fluorescence décrit précédemment. Aucune fluorescence n'a pu être observée, preuve que l'application d'un potentiel électrique est nécessaire pour la fonctionnalisation du pore. b) Adsorption de conjugué pyrrole-oligonucléotide
Un autre contrôle a été réalisé dans le but d'étudier si l'application d'un potentiel favorise l'adsorption d'ADN à la surface du support.
Pour ce faire, une solution de py-SondeZip6 à 5 μM en Tampon d'électropolymérisation a été utilisée (pas de pyrrole dans ce cas), puis une différence de potentiel électrique a été appliquée selon le même protocole que celui utilisé pour le copolymère pyrrole/py-SondeZip6. L'absence de fluorescence montre que dans les conditions de travail, l'adsorption non spécifique de conjugué pyrrole-oligonucléotide est négligeable. c) Adsorption non spécifique lors de la procédure de révélation i) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure d'hybridation et de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en Tampon d'hybridation. Il n'y a pas, dans les conditions opératoires, de fluorescence parasite liée à l'adsorption non spécifique de la cible ADN biotinylée. ii) Sur un pore non fonctionnalisé et n'ayant pas été en contact avec la solution de polymérisation, on réalise la procédure de révélation décrite précédemment, la première étape étant la saturation du pore en tampon d'hybridation suivie par une incubation de 15 minutes en tampon d'hybridation seul (sans la cible correspondante). La SAPE diluée en tampon de rinçage est ensuite ajoutée selon le protocole décrit ci-dessus (II. A, d). Le cliché de microscopie de fluorescence confirme que dans les conditions opératoires testées, la SAPE ne s'adsorbe pas sur la surface du support. d) Dénaturation de l'hybridation
Sur un pore fonctionnalisé et ayant subi la procédure de révélation en fluorescence décrite précédemment, on effectue un rinçage avec une solution de NaOH à 0,2 M pendant 2 s puis un rinçage abondant à l'eau et un séchage à l'air comprimé. On observe ensuite le pore en microscopie de fluorescence à la longueur d'onde habituelle et avec les mêmes paramètres de sensibilité de la caméra (luminosité, contraste). On observe la disparition de la fluorescence après dénaturation de l'hybridation.
Cela montre la spécificité de l'émission de fluorescence observée dans le cas d'une hybridation complémentaire. e) Fluorescence après réhvbridation
La fluorescence d'un pore ayant subi une dénaturation via l'ajout de NaOH (d) réapparaît après réhybridation des sondes ADN par leur cible complémentaire. La démarche expérimentale suivie pour cette deuxième hybridation et sa révélation en fluorescence est exactement la même que celle précédemment décrite pour l'hybridation.
EXEMPLE III : FONCTIONNALISATION PAR DE L'OXYDE D'IRIDIUM : i) Création d'un dépôt d'oxyde d'iridium
Une solution d'oxalate d'iridium est préparée selon le protocole suivant (décrit dans l'article de A. M. Marsouk, Analytical Chemistry,
2003, 75 : p.1258 et suivantes) : 75 mg d'IrCU monohydrate sont dissous dans 50 mL d'eau distillée ; sont ajoutés ensuite 0.5 ml de peroxyde d'hydrogène à 30 %, 365 mg d'oxalate de potassium hydraté et du carbonate de potassium anhydre pour ajuster le pH à 10.5. Une agitation de 10 minutes est requise entre chaque ajout de produit. La solution est ensuite chauffée à
90 0C pendant quelques minutes, jusqu'à atteindre une couleur finale bleu nuit caractéristique de la forme complexée de l'Iridium (IV). La solution peut ensuite être stockée plusieurs mois à 4°C. Une puce multi-pores comportant des pores de rapport de forme Rf = 1 et ayant subi un traitement plasma O2 est placée au sein du montage b décrit ci-dessus (figures 3 et 4).
La solution d'oxalate d'iridium est introduite successivement dans les deux compartiments. Puis, deux électrodes sont positionnées de chaque côté de la puce. La première est reliée aux électrodes auxiliaire et de référence du potentiostat et l'autre à l'électrode de travail. Un potentiel de
0.80 V ou 0.85 V ou 0.90 V est appliqué pendant une durée de 5 s ou 10 s.
De la même manière que pour les dépôts de polypyrrole, le suivi du dépôt se fait par chronoampérométrie afin de vérifier le bon contact électrique au travers du pore.
La puce est ensuite retirée de la cellule, abondamment rincée à l'eau puis séchée à l'air comprimé et stockée à 4 0C. ii) Résultats L'efficacité de la fonctionnalisation a été vérifiée par microscopie électronique à balayage (MEB).
Les clichés qui ont été obtenus montrent qu'un dépôt est créé sur les parois du pore et seulement à l'intérieur de celui-ci, la surface alentour restant parfaitement propre. Un pore témoin, n'ayant pas subi de fonctionnalisation, ne présente quant à lui aucun dépôt sur les parois internes du pore. Cela montre que le procédé de fonctionnalisation fonctionne également pour des entités électroactivables tels que ces oxydes métalliques.
La texture des différents dépôts obtenus paraît différente d'un pore à l'autre, ceci pouvant être possiblement expliqué par des degrés d'oxydation de l'iridium variables. Ainsi, les demi-réactions électrochimiques impliquées dans le cas des oxydes d'iridium sont les suivantes: Ir(OH) + H2O <-> Ir(OH)2 + H+ + e' (-0,1V)
Ir(OH)2 + H2O <-> Ir(OH)3 + H+ + e' (0,3 V)
Ir(OH)3 + H2O <-> Ir(OH)4 + H+ + e" (0,8 V) ou IrO2 + 2H2O + H+ + e" (divergence selon les publications)
Etant donné l'aspect visuel hétérogène des dépôts observés en MEB à l'intérieur des pores, il est possible que, selon les conditions expérimentales utilisées, on n'obtienne pas les mêmes degrés d'oxydation moyens de l'iridium dans le (ou les) oxyde(s) formé(s). EXEMPLE IV : OBTENTION D'OBJETS STRUCTURES PAR LA TECHNIQUE DΈLECTRQDEPQT A DISTANCE : i) Création d'un dépôt de polypyrrole : Une membrane de polycarbonate, comportant des pores de taille nanométrique, peut être insérée indifféremment dans les montages a ou b. Des dépôts de copolymère pyrrole/pyrrole-couplé avec un oligonucléotide peuvent ensuite être obtenus à l'intérieur de ces pores en suivant le protocole précédemment décrit. ii) Détachement des dépôts formés de leur support : La membrane est ensuite rincée à l'eau et introduite dans un bain de dichlorométhane afin de dissoudre le polycarbonate et libérer en solution les objets créés à l'intérieur des pores. Les entités électroactivables peuvent être aussi détachées sans dissolution de la membrane, par exemple sous l'action de vibrations créées par des ultrasons. Par filtrations successives, les objets d'intérêt sont ensuite isolés ; il s'agit de nanostructures de pyrrole porteuses de sondes ADN possédant la forme des pores de la membrane.
EXEMPLE V :
Les figures 9a et 9b sont deux variantes de formes de pore non débouchant avec une électrode 61 qui recouvre en tout ou partie le fond de la cavité 60. Dans le cas des figures 9a et 9b, la zone du pore où a lieu le dépôt correspond à la seule région de striction 62, 62' qui concentre le champ. Ainsi, la forme du pore permet de localiser spécifiquement le dépôt sur une partie seulement de sa paroi. Pour le dépôt d'un polymère tel que le polypyrrole ou un dérivé fonctionnel, la polarisation de l'électrode 61 au fond de la cavité 60 peut être anodique ou cathodique pour respectivement former ou non un dépôt du même polymère sur la surface de l'électrode 61 , en plus du dépôt sur la région de striction 62, 62'. CONCLUSION :
Le procédé technique de fonctionnalisation selon l'invention est efficace et relativement facile à mettre en pratique.
La reproductibilité des dépôts est satisfaisante et peut être encore améliorée en contrôlant les paramètres de manipulation plus strictement : distance inter-électrodes figée contrôle de température contrôle de l'hygrométrie
Cette nouvelle technique, permet de contrôler de manière efficace la localisation de la fonctionnalisation de la surface d'un pore par des groupements réactifs. En effet, cette dernière est pour l'essentiel liée à l'organisation des lignes de champ électrique au sein du pore, elle-même dépendante de la structure de l'environnement du pore (à savoir de sa géométrie).
Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être peu coûteux : en termes financiers car seul un équipement réduit est nécessaire : potentiostats, électrodes... en termes de temps car la procédure de dépôt dure seulement quelques minutes. Le dispositif expérimental est de plus peu encombrant et facilement transportable.
La stratégie est adaptable à tout type de support poreux, de nature organique ou inorganique, conducteur, semi-conducteur ou isolant, quelle que soit la dimension des pores. Pour mesurer si le liquide a pénétré à l'intérieur du pore, un moyen est de contrôler si le contact électrique entre les deux électrodes est effectif, auquel cas le chronoampérogramme mesuré lors du dépôt (par exemple de polypyrrole) présente un signal en intensité non nul.
Pour caractériser la formation du dépôt par exemple de polypyrrole, il est possible d'utiliser la microscopie de fluorescence, voire même la microscopie de fluorescence confocale afin d'avoir un aperçu tridimensionnel de la fluorescence à l'intérieur de la cavité. La microscopie électronique à balayage peut également permettre, par exemple dans le cas de dépôt d'oxyde d'iridium, de caractériser le dépôt formé. Les entités électroactivables, en particulier électropolymérisables (pyrroles, thiophènes...), pouvant être fonctionnalisées, cette technique est parfaitement transposable à l'immobilisation au sein de pores de groupements actifs intervenant dans des interactions d'énergie faible comme les groupements ioniques, peptides, anticorps, enzymes, chélateurs d'ions par exemple. Le polymère peut également servir de « couche de départ » pour un dépôt localisé, en particulier en utilisant des anions dopants d'intérêt comme les polysaccharides (héparine par exemple favorisant l'adhésion de cellules (Zhou et al. Reactive & Functional Polymers, 1999. 39 : p. 19 et suivantes)) ou les surfactants.
Des empilements de type « multi-couche » peuvent être envisagés à partir des dépôts obtenus par « électrodépôt à distance ». Il est ainsi possible de préparer un dépôt localisé (première couche) présentant par exemple une certaine charge de surface ou un groupement chimique réactif qui favorise la fixation d'une deuxième couche d'entités organiques ou inorganiques donnée par rapport au support vierge.
La technique a permis expérimentalement la mise en œuvre d'une immobilisation d'ADN, ce dernier étant une biomolécule présentant un aspect modulaire, c'est-à-dire pouvant être utilisée comme élément de reconnaissance biomoléculaire pour l'immobilisation via une hybridation d'une molécule d'intérêt fonctionnalisée par des cibles ADN complémentaires. Le procédé a également permis d'immobiliser une entité d'intérêt biologique, la biotine, par hybridation avec des sondes ADN immobilisées avec une cible complémentaire biotinylée, ce qui souligne l'aspect modulaire de la technique. Le dispositif expérimental peut de plus intégrer des dispositifs thermiques et optiques permettant par exemple des expériences de réticulation ou encore une visualisation de l'organisation des dépôts réalisés.
Plusieurs applications peuvent être envisagées dans le domaine des biocapteurs miniaturisés ultrasensibles. Des membranes poreuses biofonctionnalisées peuvent trouver des applications dans le domaine de la santé, en particulier pour la détection de (bio)molécules présentes en petite quantité dans des échantillons biologiques. De nombreuses équipes de recherche ont ainsi orienté leurs travaux vers la conception de systèmes permettant la détection de molécules uniques. Ces compteurs de Coulter moléculaires ont fourni des résultats encourageants avec des pores protéiques (Vercoutere, W. et collaborateurs, Nature Biotechnology, 2001. 19 : p. 248 ; Bayley and Cremer, Nature, 2001. 413 : p. 226 et suivantes).
L'avantage considérable des pores synthétiques par rapport à ces derniers réside dans la possibilité de : moduler leurs propriétés en créant des charges, des groupements réactifs en surface, contrôler la géométrie (diamètre du pore, épaisseur de la membrane...), - réaliser une intégration plus aisée dans un appareillage microfluidique.
Le procédé convient également à des applications dans le domaine de la micro- ou nano-chromatographie (échange d'ions, exclusion stérique, chromatographie d'affinité ou d'adsorption) pour la purification de (bio)molécules.
Des pores fonctionnalisés peuvent également être utiles pour réaliser la capture de bactéries ou de cellules, notamment en immobilisant de l'héparine ou de la chondoitine à l'intérieur d'un pore.
Les membranes poreuses fonctionnalisées trouvent également classiquement des applications dans les systèmes de purification et de filtration (eau, effluents...), la présence de chélateurs ou d'échangeurs d'ions à la surface des pores étant susceptible de permettre de séparer sélectivement certains composants du liquide passant au travers de la membrane. L'immobilisation de particules catalytiques, contenant par exemple des métaux tels que le palladium ou le platine dans des pores, par l'intermédiaire du procédé décrit, pourrait permettre la création de micro- voire nano-réacteurs pour réaliser des réactions chimiques comme les hydrogénations par exemple. Le fait de pouvoir paralléliser ces réactions en utilisant des réseaux de pores répartis dans une membrane permet de faire de la micro/nano-chimie combinatoire. L'électrodépôt de métaux par cette technique peut trouver également des applications dans les domaines des pots catalytiques (catalyse en phase gazeuse).
Le procédé est enfin compatible avec la mise en œuvre de techniques d'impression moléculaire (« molecular imprint »), ce qui ouvre des applications intéressantes dans le domaine de l'électrophorèse capillaire par exemple.
On comprendra que la solution d'entités électroactivables pour laquelle on a mentionné ci-dessus la présence éventuelle de sondes ADN, peut de manière plus générale comporter optionnellement des ligands, à savoir : - des éléments de reconnaissance moléculaire et/ou biomoléculaire notamment les nucléotides, oligonucléotides, polynucléotides, ADN, ARN, PNA, peptides, polypeptides, anticorps, antigènes, enzymes, protéines, acides aminés, glycopeptides, biotines, haptènes, sucres, oligosaccharides, polysaccharides, lipides, glycolipides, stéroïdes, hormones, récepteurs.
- d'autres groupements affins notamment les chélateurs d'ions et les échangeurs d'ions.
- des fonctions chimiquement actives notamment les fonctions aminé, amide, oxy-amine, ester actif, alcool, acide carboxylique, alcyne, thiol, époxyde, anhydride, chlorure d'acyle, aldéhyde et leurs dérivés.
- des objets uniques (dans le cadre d'une immobilisation individuelle ou collective d'objets) notamment des microparticules et nanoparticules. Les particules peuvent être et/ou contenir des cellules biologiques et/ou des composants et/ou des produits cellulaires, notamment des lignées cellulaires et/ou des globules et/ou des liposomes et/ou des noyaux cellulaires et/ou des chromosomes et/ou des brins d'ADN ou d'ARN et/ou des nucléotides et/ou des ribosomes et/ou des enzymes et/ou des anticorps et/ou des protides et/ou des protéines et/ou des peptides et/ou des principes actifs et/ou des parasites et/ou des bactéries et/ou des virus et/ou des pollens et/ou des polymères et/ou des facteurs biologiques et/ou des stimulants et/ou des inhibiteurs de croissance et/ou des billes en suspension dans un liquide, et/ou des bioparticules en suspension dans une solution, et/ou des molécules. Les particules manipulées peuvent être et/ou contenir des particules solides insolubles telles que des particules magnétiques et/ou des particules diélectriques, ou des particules conductrices, ou des particules fonctionnalisées, ou des pigments, ou des colorants, ou des cristaux de protéines, ou des poudres, ou des structures de polymères, ou des substances pharmaceutiques insolubles, ou des fibres, ou des fils, ou des nanotubes de carbone, ou des agrégats (clusters) de petite taille formés par agglomération de colloïdes des groupements o présentant des particularités surfaciques • en termes de pH, notamment les couples acides/bases faibles et les composés amphotères et/ou en termes d'hydrophilie et/ou d' hydrophobie et/ou d'amphiphilie, et/ou en termes de polarité,
o et/ou présentant des interactions de faible énergie notamment
• liaisons hydrogène,
• interactions de Van der Waals,
• interactions ioniques notamment échange de protons • interactions électrostatiques,
• ponts salins notamment ceux formés par des ions divalents comme les ions calcium et magnésium entre les groupements chargés négativement o et/ou étant des surfactants. - des modifications de surface préparant une modification ultérieure : la couche de fonctionnalisation déposée sur les parois du pore comporte par exemple des moyens d'interaction ou de réaction avec des molécules et/ou biomolécules. Il s'agit notamment de groupements modulaires tels que l'ADN, photoactivables tels que la benzophénone, électroactivables tels que les entités électroactivables mentionnées ci-dessus, ou bien encore thermoactivables tels que les polymères thermodurcissables.
On notera que le ligand doit être couplé à une entité électroactivable pour permettre la fonctionnalisation par le procédé selon la présente invention. II n'est pas nécessaire qu'il y ait dans la solution à la fois des entités électroactivables et des entités électroactivables couplées à un ligand : il peut aussi y avoir seulement des entités électroactivables couplées à un ligand, ou bien seulement des entités électroactivables .

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de fonctionnalisation d'au moins une partie de la paroi d'au moins un pore d'un matériau support caractérisé en ce qu'il comporte : a) mettre en contact le pore avec une solution d'entités électroactivables et positionner deux électrodes dans ladite solution, de manière à créer à l'intérieur du pore et lorsqu'un signal électrique est appliqué entre les deux électrodes, une chute de tension apte à générer un dépôt localisé sur ladite paroi. b) appliquer au moins un signal électrique entre les deux électrodes pour activer les entités électroactivables et réaliser ladite fonctionnalisation.
2) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite chute de tension à l'intérieur du pore est supérieure à 1000 V/m. 3) Procédé selon une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une itération de a) et b) avec une deuxième solution d'entités électroactivables.
4) Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pore est ouvert à ses deux extrémités et en ce qu'une solution est placée dans deux compartiments dans chacun desquels débouche une extrémité du pore, au moins une des deux solutions contenant lesdites entités électroactivables.
5) Procédé selon une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le pore présente une seule extrémité débouchante, en ce qu'une des électrodes est placée au fond d'une cavité ou au fond du pore et en ce que l'autre électrode est placée dans un compartiment en communication avec ladite extrémité débouchante du pore.
6) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'après b, il comporte un rinçage. 7) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont des monomères électropolymérisables, notamment des polymères conducteurs pi-conjugués.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont choisies parmi les pyrroles, les thiophènes, les indoles, les anilines, les azines, les phénylènevinylènes, les phénylènes, les pyrènes, les furanes, les sélénophènes, les pyrridazines, les carbazoles, les acrylates, les méthacrylates et leurs dérivés;
9) Procédé selon une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que les entités électroactivables sont porteuses de fonctions électrogreffables, notamment de groupements diazonium.
10) Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont choisies parmi les métaux, les oxydes métalliques, les particules catalytiques, les sels et les complexes métalliques. 11) Procédé selon une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les entités électroactivables sont constituées par une peinture électrophorétique.
12) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution comporte des entités électroactivables couplées à des ligands.
13) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la solution d'entités électroactivables comporte un mélange d'entités électroactivables notamment un monomère électropolymérisable et desdites entités électroactivables couplées à des ligands. 14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que ladite solution comporte du pyrrole couplé à une biomolécule.
15) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution d'entités électroactivables inclut des ions dopants d'intérêt, notamment l'héparine et/ou la .chondroitine. 16) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le matériau support est à base de silicium.
17) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le signal électrique est une différence de tension électrique, notamment comprise entre 10 mV et 500 V et plus particulièrement entre 100 mV et 10V.
18) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la différence de tension est appliquée pendant une durée comprise entre 10 μs et 100 s et plus particulièrement entre 10 ms et 100 s. 19) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en entités électroactivables est comprise entre 1 nM et 500 mM .
20) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente une étape de détachement des entités électroactivables du support.
21) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support présente au moins une région de fonctionnalisation évasée qui prolonge la paroi d'un pore. 22) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pore comporte une région de striction (62, 62') constituant une région de fonctionnalisation.
23) Procédé selon une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les entités électroactivables comportent des molécules sondes et en ce qu'il comporte une étape d'association par reconnaissance, notamment par hybridation avec des molécules cibles complémentaires.
24) Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de dénaturation de ladite association par reconnaissance, éventuellement suivie d'une étape nouvelle d'association par reconnaissance, notamment de réhybridation.
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