EP2219634A1 - Arzneimittel zur behandlung von phantomphänomenen - Google Patents

Arzneimittel zur behandlung von phantomphänomenen

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EP2219634A1
EP2219634A1 EP08864109A EP08864109A EP2219634A1 EP 2219634 A1 EP2219634 A1 EP 2219634A1 EP 08864109 A EP08864109 A EP 08864109A EP 08864109 A EP08864109 A EP 08864109A EP 2219634 A1 EP2219634 A1 EP 2219634A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
glyrα3
phantom
tinnitus
cochlea
glycine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08864109A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marlies Knipper
Lukas Ruettiger
Bernhard Schick
Julia Dlugaiczyk
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen, Universitaetsklinikum Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP2219634A1 publication Critical patent/EP2219634A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for the treatment of the phantom phenomena of acute tinnitus and / or phantom pain, a process for the preparation of such a medicament and a process for the treatment of these phantom phenomena.
  • tinnitus The phantom phenomenon of tinnitus is understood to be a patient's perceived sounds produced by the ear and the auditory system. Tinnitus, which has been in existence for only a few weeks to three months, is referred to as acute tinnitus. If the tinnitus lasts longer than a year, it is called chronic. According to epidemiological surveys are in Germany about three million adults. At all ages, the numbers of those affected by chronic tinnitus vary between 4.4% and 15% depending on the study. Globally, tinnitus occurs annually in approximately 10 million people, which changes from an acute to a chronic form in about 340,000, so-called new disease rates.
  • tinnitus Among the many causes of tinnitus include chronic noise, acute bang injuries, hearing loss and other disorders associated with hearing loss. Associations with inner ear hearing loss as a chronic progressive form or as noise deafness, followed by Meniere's Disease and sudden hearing loss, are more than two-thirds related to tinnitus according to clinical studies. The development and maintenance of tinnitus also involves diseases of the cervical spine as well as the temporomandibular joint and the musculoskeletal system. Tinnitus also seems to have a psychic component, so in this context psychogenic tinnitus is used. In many cases, however, despite intensive diagnostics, no reliable cause of tinnitus can be detected.
  • WO 02/15907 A1 proposes the treatment of tinnitus by the administration of the potassium channel opener flupirtine.
  • This treatment has the disadvantage that flupirtine is additionally a muscle relaxant analgesic, which would lead to an application with unacceptable side effects.
  • Nimodipine is an inhibitor of the Ca + * channel Cavl.3.
  • WO 2004/022069 A1 describes aberrant NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptors as one of the possible causes of tinnitus. These altered so-called glutamate receptor channels, which i.a. are expressed by auditory nerve cells, lead to increased influx of calcium into the cell.
  • NMDA receptor antagonists for the treatment of tinnitus.
  • DE 101 24 953 A1 proposes a treatment concept for tinnitus that stimulates the expression of brain-derived nerve growth factor (BDNF), based on an animal model that describes chronic tinnitus In the cochlea and inferior colliculus, a reduction in BDNF expression predominates, suggesting that the therapeutic approach is to stimulate BDNF expression, but the authors have specifically and exclusively investigated the situation in chronic tinnitus rats treated with salicylates for three months, as is known to induce chronic tinnitus, see Penner MJ, and Jastreboff PJ (1996), Tinnitus: Psycho-physical observations in humans and animal modeis, Van de Water, Popper AN, Fax , RR (Ed.), Clinical Aspects of Hearing, Springer, New York, Heidelberg, pp.
  • BDNF brain-derived nerve growth factor
  • Phantom pain has so far been treated as part of pain therapies, for example with anticonvulsants, baclofen or calcitonin. Supportive occasionally pain-relieving antidepressants are used. Also, surgical methods are used by means of which, for example, nerves are blocked or stimulated. However, a targeted, causal treatment method does not yet exist, especially not because the underlying molecular mechanisms are not fully understood.
  • Object of the present invention is therefore to provide a new substance or a new therapeutic concept, with the targeted or the phantom phenomena of acute tinnitus and phantom pain can be treated, the disadvantages of the prior art are preferably to be avoided.
  • This object is achieved by the provision of a glycine receptor agonist.
  • glycine receptors which hitherto could be localized predominantly in the central nervous system, are also expressed in the inner tube and transmit inhibitory signals to the auditory nerve upon binding of a glycine receptor agonist.
  • the inventors have also recognized that the application of a glycine receptor agonist and the resulting inhibitory signals can correct the overactivity of the auditory nerve observed in phantom phenomena.
  • Glycine receptor agonists are therefore new substances with which phantom phenomena can be targeted.
  • the object underlying the invention is therefore completely solved by the provision of glycine receptor agonists.
  • glycine receptor agonist a substance is provided which is selected from the group consisting of D-alanine, L-alanine, L-serine, taurine, cannabinoid, tropine, nortropine and derivatives thereof.
  • This measure has the advantage of providing those agonistic substances which bind to the glycine receptor in a highly affine manner, can be synthesized and formulated simply and inexpensively.
  • Preferred tropines and nortropine are described in Maksay et al. (2007), Synthesis of (nor) tropeine (di) esters and allosteric modulaton of glycine receptor binding, Bioorg. Med. Chem., Online publication of 4 November; Maksay et al. (2007), Synthesis of tropic and allosteric modulation of ionotropic glycine receptors, J. Med.
  • the cannabinoid useful as a glycine receptor agonist is preferably selected from the group consisting of anandamide, arachidonylglycerol, tetrahydrocannabinol, WIN 55,212-2.
  • the substance is administered locally on or in the ear, preferably via the round window membrane, or at the site of the amputation.
  • This measure has the advantage that the substance is administered specifically at the site of action, so that only small amounts of active substance are required. As a result, the body of the treated patient is less stressed and side effects are largely reduced.
  • the microdosing system offered by Lehner, R. et al. (1996), A new implantable drug delivery system for local therapy of the middle and inner ear, Ear. Nose Throat 76, pages 567 to 570, is described.
  • the local application may also be via the use of biodegradable hydrogel, which serves as a carrier matrix for the glycine receptor agonist.
  • gel pellets can be used for application via the round window membrane, such as, for example, the products Gelita® tampons, B. Braun, Melsungen AG, Germany.
  • biocompatible nanoparticles come into question, as described, for example, in Durän J.D. et al. (2007), Magnetic colloids as drug vehicles, J. Pharm. Sei, online publication, Mohamed F. and van der Walle CF. (2008), Engineering Biodegradable polyester particles with specific drug targeting and drug release properties, J. Pharm. Sei, 97 (l): 71-87, abstract of December 2007; Gupta S. and Moulik S.P. (2008), Biocompatible microemulsions and their prospective uses in drug delivery, J. Pharm. Sci., 97 (l): 22-45, abstract published online in December 2007.
  • the medicament has a further substance which is active against phantom phenomena and is selected from the group consisting of GABA receptor agonists, in particular benzodiazepines and substances related to these, baclofen, gamma-vinyl-GABA, gamma-acetylene-GABA , Progabide, muscimol, iboten, sodium valproate and tetrahydroisoxazolopyridine (THIP), MAP kinase inhibitors, in particular U 0126 or PD 98058, cam kinase inhibitors, L-type Ca 2+ channel antagonists, in particular nicardipine or nifedipine or isradipine, CREP antagonists, glutamate antagonists, trkB antagonists.
  • GABA receptor agonists in particular benzodiazepines and substances related to these
  • baclofen gamma-vinyl-GABA
  • gamma-acetylene-GABA gamma
  • a further subject matter of the present invention relates to a process for the preparation of a medicament for the treatment of the phantom phenomena of acute tinnitus and / or phantom pain in a human or animal subject, comprising the steps of: (a) providing a glycine receptor agonist, and (b) Formulation of the glycine receptor agonist in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a further subject matter of the present invention relates to a method for the treatment of the phantom phenomena of acute tinnitus and / or phantom pain in a human being, comprising the following steps: (a) providing a drug, (b) applying, possibly locally on or in the ear or at the site of the amputation, of the drug the animal, and if necessary (c) repeating steps (a) and Qo), whereby the medicament of the use according to the invention described above is provided as medicament.
  • Fig. 1 Detection of GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and gephyrin in the rat cochlea.
  • the rat cochlear cDNA was analyzed by RT-PCR in various postnatal stages (P14,> P21).
  • P14 and> P21 amplification of transcripts of GlyR ⁇ 3 (512 ⁇ bp) GlyR ⁇ (732 bp) and gephyrin (573 bp). Noticeable is the double band for GlyR ⁇ 3 (467 bp / 512 bp, indicated by arrows) in adult animals.
  • Transcripts of GlyR ⁇ l and GlyR ⁇ 2 were not detected.
  • sc P21 spinal cord from P21 animals was used as a positive control for GlyR ⁇ l-3, GlyR ⁇ , gephyrin and ⁇ -actin, ⁇ -actin (655 bp) was used as a housekeeping gene;
  • Fig. 2 Detection of GlyR ⁇ 3_K and GlyR ⁇ 3_L splice variants in the adult rat cochlea (> P21).
  • GlyR ⁇ 3 transcripts from the adult rat cochlea were amplified by RT-PCR. Conspicuous is the double band (indicated by double arrows)
  • GlyR ⁇ 3_K- (467 bp) and GlyR ⁇ 3_L (512 bp) splice variants were detected after cloning of PCR fragments into the PCR-II-TOPO vector by insert PCR.
  • Fig. 3 mRNA expression of GlyR ⁇ , GlyR ⁇ and gephyrin in the neurons of the spiral ganglia of the adult rat cochlea (> P21).
  • a) b) expression of the GlyR ⁇ 3 mRNA in spiral ganglion neurons (SG, arrow) at various magnifications using whole-mount in situ hybridization of the adult rat cochlea (> P21).
  • the overview (a) also shows a marking of the outer hair cells ("OHC").
  • c) the expression of the mRNA of GlyR ⁇ in neurons of the spiral ganglia (SG, arrow), e), f) expression of the mRNA of gephyrin in neurons of the spiral ganglia (SG, arrow).
  • FIG. 4 Expression of the mRNA of GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and gephyrin in the adult organ of Corti (> P21).
  • a) GlyR ⁇ 3 transcripts were detected in the outer hair cells (OHC, solid arrows) by whole-mount in situ hybridization. No signal was detected for inner hair cells (IHC), open arrows).
  • OHC solid arrows
  • IHC inner hair cells
  • OHC solid arrows
  • IHC open arrows
  • FIG. 5 GlyR ⁇ / GlyR ⁇ 3 protein expression at the IHC level.
  • a) b) Using the monoclonal antibody mAb4a, which detects all GlyR ⁇ subunits, the GlyR ⁇ protein was detected in rat cochlear cryosections at P8 among the IHC (open arrowheads) shown for the apical as well as the central basal cochlear Bow. At this stage, no GlyR ⁇ - Protein detected.
  • c) to e) Using the polyclonal GlyR ⁇ 3-specific antibody, GlyR ⁇ 3 protein was detected at the level of IHC (*) in the whole mount in situ hybridization of the adult rat cochlea [> P21) (c) e)].
  • a co-immunolabeling was performed with an antibody to Neurofilament 200, a marker for afferent nerve fibers (NG 200, filled arrowhead).
  • the samples were counterstained with DAPI, which marks the cell nuclei. Scale bars in a), b) 20 ⁇ m, in c) to e) 50 ⁇ m;
  • FIG. 6 GlyR ⁇ 3 protein expression at the level of OHC in the adult organ of Corti (> P21).
  • a) to c) GlyR ⁇ 3 protein (*) was detected in OHC (solid arrows) by whole-mount immunohistochemistry.
  • the samples were co-immunoprecipitated with anti-neurofilament 200 (NF 200, filled arrowhead).
  • NF 200 stained the nerve fibers that terminate at the OHC.
  • the nuclei were counterstained with DAPI, d) to f) Higher magnifications of a) to c).
  • Remarkable is the localization of the GlyR ⁇ 3 protein (*) in the cell membrane of the OHC (filled arrows) towards the ends of the nerve fibers (filled arrowheads).
  • Fig. 7 Hörnerv total action potential measurements [Engl: "Compound action potentials" (CAP)] after local application (LA) of strychnine (glycine receptor inhibitor).
  • LA strychnine
  • CAP Compound action potentials
  • the CAP amplitudes continue to increase monotonically after strychnine application, as the inhibition of the auditory nerve neurons, which usually begins at high volume levels, does not occur. This means overexcitation at high volume levels ( Figure 7a).
  • the CAP amplitudes increase more slowly after taurine application, since the taurine, which is usually inactive at low volume levels, activates inactive glycinergic (inhibitory) neurons Inhibit the auditory nerve. This means an inhibition at low and medium volumes.
  • the glycinergen neurons are soderso activated, so there is an overlap of the CAP amplitude function at least over a limited volume range (Fig. 7b).
  • FIG 9 Schematic representation of the increased expression of BDNF observed in tinnitus and the decreased expression of Arg3.1 / Arc in the periphery of the cochlea (a), and correction by glycine receptor agonists ("glycine”) or GABA receptor agonists (“GABA”) (b).
  • glycine glycine receptor agonists
  • GABA GABA receptor agonists
  • the cochlea was chopped and immediately frozen in liquid nitrogen.
  • the cochlea was isolated and prepared as previously described; see. Knipper et al (2000), Thyroid hormone deficiency before the onset of hearing causes irreversible damage to peripheral and central auditory systems, J. Neurophysiol. 83: 3101-3112. Briefly, the cochleas were injected into the round and 2 ml paraformaldehyde / 2% sucrose (all chemicals were from SIGMA-Aldrich, Kunststoff, Germany, unless otherwise stated) in 50 mM phosphate buffered saline (pH 7.4) fixed oval windows.
  • RNA was extracted from the rat cochlea.
  • Reverse transcription (RT) into cDNA was performed using the "Sensiscript Reverse Transcription Kit” (Qiagen, Hilden, Germany) and oligo-dTis primer (Roche, Penzberg, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR was carried out with "PuReTaq Ready-To-Go" PCR beads (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany).
  • the PCR program consisted of an initial denaturation phase of 3 min at 94 0 C, 35-40 cycles of denaturation at 94 0 C (30 sec), attachment at 58 0 C (30 sec), extension at 72 0 C (90 sec ) and a final step of the synthesis of 10 min at 72 0 C.
  • the resulting PCR products were separated on agarose gels and stained with ethidium bromide.
  • GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and gephyrin were sequenced and compared to the corresponding sequence data from GeneBank using BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the names of the GlyR ⁇ 3 exons refer to the automatic gene-naming system Ensembl (www.ensembl.org) and differ from the original description of Nikolic et al. (1998), The human glycine receptor subunit alpha3. Glra3 gene structure, chromosome localization, and functional characterization of alternative transcripts, J. Biol. Chem. 273: 19708-19714. 10759
  • the PCR fragments of GlyR ⁇ 3_L (513 bp) GlyR ⁇ (732 bp) and gephyrin (573 bp) were cloned into the pCR II topo vector (Invitrogen, Düsseldorf, Germany) and used for transcription in vitro .
  • the complementary strands for the sense and antisense probes were transcribed in the presence of digoxigenin-labeled mix (DIG; Roche Diagnostics) from either the SP6 or the T7 promoter site.
  • DIG digoxigenin-labeled mix
  • DIG-labeled antisense or sense samples were diluted in hybridization solution containing 25% microrarray hybridization buffer (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany), 25% nuclease-free water, and 50% formamide. Hybridization was carried out at 55 ° C. overnight. The subsequent washing and detection steps were carried out as described, cf. Knipper et al. (1999), Distinct thyroid hormone-dependent expression of TrKB and p75NGFR in nonneuronal cells during the critical TH-dependent period of the cochlea, J. Neurobiol. 38: 338-356; Knipper et al. (2000, supra). Each hybridization was done in at least three different animals of the indicated age. 1.5 Fluorescent immunohistochemistry
  • the middle ear is surgically opened: A small opening behind the eardrum allows access to the round window of the cochlea, in the massive bone of the bony labyrinth the only non-traumatic access to the inner ear.
  • a silver wire electrode with silver pebbles melted is carefully positioned on the membrane of the round window, secured with tissue adhesive and the opening sealed with dental cement.
  • the silver wire is passed through the skin in the neck of the animal and can be connected directly to the measurements and the electrophysiology amplifier.
  • the direct electrical access through the CAP electrode allows the direct, largely interference-free derivation of the sum responses of the auditory nerves to acoustic stimulation.
  • the arousal formation in the inner hair cells (IHCs) as summation potentials (SP) and the excitation formation in the outer hair cells (COH) as cochlear microphone potentials (CM) can be measured.
  • a gelatinous carrier substance (Geleter, Braun) was carefully inserted into the round window after an initial control measurement in the round window. and soaked with 5-10 ⁇ l of the glycine receptor agonist taurine 10 mM fc and the glycine receptor antagonist strychnine 50 mM fc.
  • the transcripts of GlyR ⁇ 3 (512 bp), GlyR ⁇ (732 bp) and gephyrin (573 bp) from the rat cochlea were amplified at Pl 4 ( Figure 1, P 14).
  • ⁇ -actin (655 bp) was used as a housekeeping gene.
  • the GlyR ⁇ 3 primers were designed to detect potential splice variants according to the isoforms of the subunits GLRA3 short (GlyR ⁇ 3_K) and GLRA3 long (GlyR ⁇ 3_L) in humans.
  • the RT-PCR from the adult cochlea (> P21) gave a double band for the GlyR ⁇ 3 transcripts, indicated by arrows in Fig.
  • Glra3 from rat and GLRA3 from humans with the "ensemble automatic gene annotation" system revealed highly conserved exon-intron boundaries
  • the 45 bp deletion in G / r ⁇ 3_rn_K corresponds to the missing exon 9 (45 bp ) of the human cDNA Sequence of GLRA3_K ( Figure 2c, exon 9).
  • the two G / ra3 transcripts amplified from the rat cochlea showed the features of the previously described human GLRA3 short ( ⁇ 3_K) and long ( ⁇ 3_L) splice variants and are therefore referred to below as GlyR ⁇ 3_K and GlyR ⁇ 3_L.
  • the GlyR ⁇ 3 and gephyrin proteins should be visualized using a monoclonal antibody mAb4a, which recognizes all GlyR ⁇ subunits, a GlyR ⁇ 3-specific polyclonal antibody and a monoclonal antibody to hairpin cell anchor protein gephyrin.
  • mAb4a directed against a common N-terminal epitope of the GlyR ⁇ l-4 subunits detected weak punctate signals below the inner hair cells as shown for the apical and central basilar arch of the cochlea in rat sections at P8 (FIG. Fig. 5a, b).
  • P8 no protein could be detected for the GlyR ⁇ protein at the level of the outer hair cells.
  • gephyrin polypeptides could not be detected, neither in decalcified nor in undecalcified tissue.
  • whole-heat immunochemistry was used to circumvent the decalcification of the samples and to improve protein detection. Only positive results were obtained for the GlyR ⁇ 3-specific antibody.
  • GlyR ⁇ 3 protein on rat OHC> P21 The expression of GlyR ⁇ 3 protein on rat OHC> P21 is shown in FIG.
  • a signal was detected in the three levels of OHC ( Figure 6a, d, solid arrows).
  • the nuclei of the OHC were labeled with DAPI ( Figure 6b, c, e, f) and the nerve fibers terminating at the OHC were stained with an antibody against NF200 ( Figure 6a-f, filled arrowhead).
  • Typical clusters of GIy R ⁇ 3 protein were located at the cell membrane of OHC in close proximity to NF200-positive nerve endings ( Figures 6c, d, f). Elimination of the primary antibodies did not give any signals (data not shown).
  • the glycine receptor agonist taurine inhibits the characteristic tinnitus upregulation of the activity of the auditory nerve
  • the CAP amplitudes continue to increase monotonically after local application (LA) of strychnine, as the inhibition of the auditory nerve neurons, which usually begins at high volume levels, does not occur. This means overexcitation at high volume levels; Fig. 7a.
  • the CAP amplitudes increase more slowly after taurine local application (LA), as the inactive glycinerergic (inhibitory) neurons usually at low levels are activated by taurine and inhibit the auditory nerve. This means an inhibition at low and medium volumes.
  • the glycinergen neurons are activated in any case, so there is an overlap of the CAP amplitude function here, at least over a limited volume range.
  • glycine receptors and the anchor protein gephyrin were detected in the rat cochlea and their distribution was analyzed by whole-mount in situ hybridization and fluorescence immunohistochemistry. It has been demonstrated that glycine receptor agonists can be used to treat phantom phenomena such as acute tinnitus.
  • transcripts of GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and gephyrin were detected neither in the analyzed postnatal nor in mature stages (see FIG. 1).
  • GlyR ⁇ 3 transcripts were detected in the olfactory bulb and cerebellum, the auditory brainstem, and the dorsal horn of the spinal cord of adult rodents.
  • GlyR ⁇ 3 transcripts were detected in the olfactory bulb and cerebellum, the auditory brainstem, and the dorsal horn of the spinal cord of adult rodents.
  • Increasing evidence for expression of GlyR ⁇ 3 in brain regions associated with sensory processing suggests a crucial role for GlyR ⁇ 3 in sensory integration. This understanding is supported by the detection of GlyR ⁇ 3 in the dorsal horn of the spinal cord, where it has been identified as a key factor in the transmission of pain signals from the periphery to the brain.
  • GlyR ⁇ 3 At the level of the auditory brainstem, glycine receptors in the central sensory see processing of acoustic signals, including lateral inhibition and localization of noise sources a crucial role.
  • the identification of GlyR ⁇ 3 in the rat cochlea further supports the concept of GlyR ⁇ 3 as the "sensory" variant of the GlyR ⁇ subunit. To date, it is not understood how the specific kinetics of GlyR ⁇ 3 are related to this role. Recombinant GlyR ⁇ 3 channels show fast kinetics, but have a lower affinity for glycine than GlyR ⁇ l channels.
  • the inventors detected GlyR ⁇ 3 splice variants in the rat cochlea corresponding to the human isoforms GlyR ⁇ 3_K and GlyR ⁇ 3_L (see Figure 2). So far, alterant splicing of GlyR ⁇ 3 mRNA has been described only for humans and mice.
  • the short GlyR ⁇ 3_K isoform lacks the 45 bp stretch of exon 9, corresponding to a loss of 15 amino acids in the channel protein. Recombinant ion channels of the two splice variants show different channel kinetics.
  • the long GlyR ⁇ 3_L isoform shows a higher affinity for glycine and desensitizes much more slowly and to a lesser extent than GlyR ⁇ 3_K.
  • the screening of cells of the cochlea for a possible differential subcellular distribution of the GlyR ⁇ 3 isoforms might be useful to further elucidate the role of these splice variants.
  • electrophysiological recordings of native glycine receptors in isolated hair cells and of recombinant cochlear GlyR ⁇ 3_K and GlyR ⁇ 3_L channels may be useful for characterizing the channel properties of glycine receptor isoforms in the cochlea and for understanding their specific roles in hearing.
  • GlyR ⁇ transcripts were detected in the rat cochlea by RT-PCR and in situ hybridization. To date, it is unclear whether native GlyR ⁇ 3 channels form ⁇ 3 homopentamers or ⁇ 3 ⁇ heteropentamers. Further investigations are needed to assess the molecular composition of glycine receptors in the cochineal enlighten lea. Presumably, by binding to the ß-subunit, gephyrin anchors the cochlear glycine receptors in the cytoskeleton and is critical for the postsynaptic clustering of glycine receptors, as previously described for the central nervous system and retina.
  • gephyrin in areas that have largely no glycinergen synapses, is already described for the CNS and the retina of rodents. There is increasing evidence that gephyrin is involved in these areas in postsynaptic clustering of GABAA receptors. While it is necessary to examine in more detail the expression of gephyrin transcripts in IHC, it is of considerable interest to consider a role of gephyrin as an anchor protein for an IHC-specific ion channel.
  • transcripts of GlyR ⁇ l-4, GlyR ⁇ , and gephyrin were detected in specific retinal cell types at both the mRNA and protein level, suggesting that glycine-rich currents may be involved in the processing of visual information in the outer retina play.
  • the detection of glycine receptors in the cochlea supports the concept of a modulatory role of glycergic neurotransmission in the peripheral sensory organs.
  • GlyR mRNA and protein in the cochlea leads to the conclusion that the inhibitory glycine receptors and gephyrin are target molecules of the efferent oliviocochlear bundle.
  • Lateral oliviocochlear (LOC) bundle The efferent system LOC modulates auditory nerve excitability and balances interaural sensitivity.
  • ACh, GABA, dopamine and CGRP were identified as transmitters of the LOC system.
  • IHC are initially contacted by oliviocochlear efferent fibers prior to onset of hearing. In the adult cochlea, these efferent fibers directly contact OHC and form axosomatic synapses with the afferent dendrites below the IHC. Therefore, it is believed that the putative inhibitory receptors are localized by efferent transmitters at the time of axosomatic synapse formation.
  • GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and gephyrin in adult cochlear SG neurons (see Figure 3) and detected GlyR ⁇ 3 protein at the level of IHC of neurofilament positive putative afferent fibers (see Figure 5).
  • GIy R ⁇ 3 protein was localized at the base of IHC prior to onset of hearing.
  • the dot-like staining pattern not only indicated the characteristic GlyR clusters in the cell membrane, it also reminds the localization of the SK2 channel protein in IHC at the same time.
  • SK2 proteins it is believed that these efferent controls, mediated by nicotinic cholinergic receptors (ACh ⁇ , ⁇ 10), pass on to IHC at this early stage of development.
  • the inventors have recognized that the glycine receptor in the cochlea is of great clinical and scientific interest. Specifically, it has been found that phantom phenomena such as acute tinnitus and phantom pain are treatable by glycine receptor agonist stimulation of the glycine receptors in the cochlea.
  • Medial oliviocochlear (MOC) bundle It is possible that inhibitory GIyR in OHC is involved in efferent signaling of the MOC bundle. After the onset of hearing, nerve fibers of the MOC system contact the basolateral end of OHC with axosomatic synapses.
  • the MOC bundle works as a noise-evoked feedback loop that reduces the OHC's contribution to cochlear amplification and protects the inner tube from acoustic trauma. So far, ACh and GABA have been identified as inhibitory transmitters of the MOC system.
  • WO 2006/079476 showed a direct correlation of the altered increased expression of BDNF in the periphery of the cochlea with the induction of tinnitus.
  • the increased expression of BDNF in the periphery of the cochlea is accompanied by down-regulation of the cortical plasticity gene Arg3.1 / Arc; see. Tan et al. (2007), Tinnitus behavior and hearing function correlate with the reciprocal expression patterns of BDNF and Arg3.1 / arc in auditory neurons following acoustic trauma, Neuroscience 145 (2): 715-726.
  • the inventors have now discovered a completely new inhibitory transmitter, glycine, in the inner ear.
  • the glycine receptors GlyR ⁇ 3, GlyR ⁇ and the anchor protein gephyrin could be detected in the adult cochlea below the IHC and in OHCs.
  • the expression locus of the glycine receptors below the inner hair cells (IHC) shows that, analogous to the GABAergic feedback loop, glycine is released from the medial upper oligo complex (MOC) in the brain stem ( Figure 9b) and is typically inhibitory to the afferents of the IHCs acts.
  • MOC medial upper oligo complex
  • An excitocytosis caused by a tinnitus-inducing trauma (too much glutamate) or a dislocation of the inhibiting "balancing" efferent input leads to the already described hyperpolarization of the auditory nerve or to an increase of the BDNF level in spiral ganglia.
  • the increase in BDNF expression represents the primary trigger for the induction of tinnitus, which bridges the pathophysiological change in nerve activity in the central auditory system via the pathological transport of the BDNF protein in the auditory nerve to the first synapse in the brain stem ,
  • BDNF acts on the first postsynapses of the first central auditory switching station in the brain stem, the synapses in the ventral and dorsal nucleus of the cochlear nerve.
  • the tinnitus-associated increase in BDNF in the spiral ganglia may be directly involved in the increase in activity in the dorsal and ventral nucleus of the cochlear and inferior colliculus, apparently via a detectable increase in inhibitory transmitters, such as GABA, the subsequent reduction of Arg3.1 / Arc in the auditory cortex.
  • inhibitory transmitters such as GABA
  • This is accompanied by a reduction of field potentials in the auditory cortex, an indication of a reduced thalamo-cortical input; see. Fig. 9a.
  • a reduction of Arg3.1 / Arc in the auditory cortex could directly explain the hyperpolarization or excitocytosis of cortical neurons already proven in various studies with tinnitus in humans and animals.
  • GABA receptor agonists would be effective in this model as glycine receptor agonists.
  • glycine receptor agonists like GABA receptor agonists, correct for a pathological increase in BDNF levels.
  • glycine receptor agonists just like GABA agonists, correct the reduction in cortical expression of Arg3.1 / Arc and thus counteract pathophysiological reorganization of cortical projections and tinnitus; see. Fig. 9b.
  • a tinnitus-associated acute increase in BDNF levels in the cochlea can be counteracted directly and locally by agonists of an inhibitory factor, such as GABA receptor agonists and glycine receptor agonists, on the auditory nerves.
  • an inhibitory factor such as GABA receptor agonists and glycine receptor agonists
  • a curative avoidance of an increase of BDNF in the auditory nerve leads according to findings of the inventors to avoid a pathophysiological reorganization of cortical projections, which in the animal model by a reduction Arg3.1 / Are expression in cortical neurons is reflected with increased EPSP.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder des Phantomschmerzes, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur Behandlung dieser Phantomphänomene.

Description

GLYCINREZEPTOR-AGONISTEN ZUR BEHANDLUNG VON PHANTOMPHÄNOMENEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder des Phantomschmerzes, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Arzneimittels sowie ein Verfahren zur Behandlung dieser Phantomphänomene.
Unter dem Phantomphänomen des Tinnitus werden von einem Patienten wahrgenommene Geräusche verstanden, die durch das Ohr und das auditorische System erzeugt werden. Tinnitus, der erst seit wenigen Wochen bis drei Monaten besteht, wird als akuter Tinnitus bezeichnet. Besteht der Tinnitus länger als ein Jahr, wird er als chronisch bezeichnet. Nach epidemiologischen Erhebungen sind in Deutschland ca. drei Millionen Erwachsene. In allen Altersstufen schwanken die Zahlen der von chronischem Tinnitus Betroffenen je nach Studie zwischen 4,4 % und 15 %. Global betrachtet kommt es jährlich bei ca. zehn Millionen Menschen zu Tinnitus, der bei ca. 340.000 von einer akuten in eine chronische Form übergeht, sog. Neuerkrankungsrate.
Zu den vielfältigen Ursachen des Tinnitus gehören chronische Lärmschädigungen, akute Knallverletzungen des Gehörs, Hörsturz und anderweitige Erkrankungen, die mit einem Hörverlust einhergehen. Zusammenhänge mit Innenohrschwerhörigkeit als chronisch-fortschreitende Form oder als Lärmschwerhörigkeit, gefolgt von Morbus Meniere und Hörsturz stehen gemäß klinischen Studien bei mehr als zwei Drittel im Zusammenhang mit Tinnitus. An der Entstehung und Aufrechterhaltung des Tinnitus sind auch Erkrankungen der Halswirbelsäule sowie des Kiefergelenks und Kaumuskelsystems beteiligt. Tinnitus scheint auch eine psychische Komponente aufzuweisen, so dass in diesem Zusammenhang von psychogenem Tinnitus gesprochen wird. In vielen Fällen lässt sich jedoch trotz intensiver Diagnostik keine sichere Ursache des Tinnitus erkennen.
Derzeit wird Tinnitus mit psychosomatischer Behandlung, Relaxationstherapie, Biofeedback, Hypnotherapie, elektrischer Stimulation, Lidocain, Iontophorese oder Maskierung therapiert. Hierbei handelt es sich jedoch um ausschließlich symptomatische Therapiekonzepte.
Die WO 02/15907 Al schlägt die Behandlung von Tinnitus durch die Verabreichung des Kalium-Kanal-Öffners Flupirtin vor. Diese Behandlung hat den Nachteil, dass es sich bei Flupirtin zusätzlich um ein müskelrelaxierendes Analgetikum handelt, wodurch eine Applikation mit nicht zu tolerierenden Nebenwirkungen verbunden wäre.
Wang et al. (2000), Evaluating effects of some medicine on tinnitus with animal behavioral model in rats, Zhonghua Er. Bi. Yan. Hou. Ke. Za. Zhi. 35 (5), abstract, schlagen die Verabreichung von Nimodipin zur Behandlung von Tinnitus vor. Bei Nimodipin handelt es sich um einen Inhibitor des Ca+*- Kanals Cavl.3. Dabei hat sich allerdings ergeben, dass die Blockade des Cavl.3-Kanals im auditorischen System unmittelbar zur Taubheit führen würde, so dass Nimodipin für die Behandlung von Tinnitus gänzlich ungeeignet ist.
In der WO 2004/022069 Al werden als eine der möglichen Ursachen von Tinnitus aberrante NMDA(N-Methyl-D-Aspartat)-Rezeptoren beschrieben. Diese veränderten sog. Glutamatrezeptorkanäle, die u.a. von auditorischen Nervenzellen exprimiert werden, führen zu verstärktem Einstrom von Calcium in die Zelle. In diesem Dokument wird vorgeschlagen, zur Behandlung von Tinnitus NMDA-Rezeptor- Antagonisten einzusetzen. Völlig unklar bleibt allerdings, ob mit diesen Substanzen die akute oder chronische Situation des Tinnitus zu behandeln ist. Ferner finden sich keinerlei Hinweise, wie die Applikation der Substanzen zu erfolgen hat.
In der DE 101 24 953 Al wird ein Behandlungskonzept bei Tinnitus vorgeschlagen, das in der Stimulation der Expression des „Brain-derived Nerve Growth Factors" (BDNF) liegt. Die dortigen Autoren beschreiben auf der Grundlage eines Tiermodel- les, dass bei chronischem Tinnitus in der Cochlea und im Inferioren Colliculus eine Erniedrigung der BDNF-Expression vorherrscht, weshalb als therapeutischer Ansatz die Stimulation der BDNF-Expression vorgeschlagen wird. Die dortigen Autoren haben jedoch ganz konkret und ausschließlich die Situation bei chronischem Tinnitus untersucht. So wurden die in dem Tiermodell verwendeten Ratten über drei Monate mit Salicylaten behandelt, wodurch bekanntermaßen chronischer Tinnitus induziert wird; vgl. Penner M. J., und Jastreboff P. J. (1996), Tinnitus: Psycho-physical observations in humans and animal modeis, in: Van de Water, Popper A. N., Fax, R. R. (Ed.), Clinical aspects of hearing, Springer, New York, Heidelberg, Seiten 208 bis 304; und Bauer, C. A., et al. (1999), A behavioral model of chronic Tinnitus in rats. Otolaryngol. Head Neck Surg. 121, Seiten 457 bis 462. Nicht erkannt wurde von den Autoren der DE 101 24 953 Al jedoch, dass es signifikante Unterschiede zwischen der Behandlung von chronischem und akutem Tinnitus geben muss. In der WO 2006/079476 wird vorgeschlagen, dass die Phantomphänomene des akuten Tinnitus als auch des Phantomschmerzes durch die Verwendung einer mit der BDNF-Signaltransduktionskaskade interagierenden Substanz, wie bspw. einem GABA- Rezeptor-Agonisten, behandelt werden könnten.
Ein Überblick über das Krankheitsbild des Tinnitus findet sich bspw. in Waddell, A., Canter, R. (2004), Tinnitus, Am. Farn. Physician 69, Seiten 591 bis 592.
Unter dem Phantomphänomen des Phantomschmerzes wird die Projektion von Empfindungen in ein amputiertes oder z.B. durch Plexusschädigung oder Querschnittslähmung denerviertes Körperteil, eine Extremität, die Mamma, das Rektum, ein Zahn u.a. verstanden. Dieses Körperteil wird als vorhanden erlebt und nach Extremitätenamputation bspw. als direkt am Stumpf aufsitzende geschwollene Hand bzw. Fuß empfunden.
Zahlenangaben, in wie vielen Fällen es nach einer Amputation zu einem Phantomschmerz kommt, sind uneinheitlich und reichen von 5 bis 100 %.
Phantomschmerzen werden bislang im Rahmen von Schmerztherapien bspw. mit Antikonvulsiva, Baclofen oder Calcitonin, behandelt. Unterstützend werden gelegentlich schmerzdistanzierende Antidepressiva verwendet. Auch werden operative Methoden angewendet, mittels derer bspw. Nerven blockiert oder stimuliert werden. Eine gezielte, ursächliche Behandlungsmethode existiert bislang jedoch nicht, insbesondere deshalb nicht, da die molekularen zugrundeliegenden Mechanismen nicht voll verstanden werden.
Einen Überblick über das Krankheitsbild des Phantomschmerzes findet sich in Middleton, C. (2003), The causes and treatments of phantom limb pain, Nurs. Times 99, Seiten 30 bis 33. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine neue Substanz bzw. ein neues Therapiekonzept bereitzustellen, mit der bzw. dem gezielt die Phantomphänomene des akuten Tinnitus sowie des Phantomschmerzes behandelt werden können, wobei die Nachteile aus dem Stand der Technik vorzugsweise vermieden werden sollen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Glycinrezeptor-Agonisten gelöst.
Die Erfinder haben völlig überraschend festgestellt, dass Glycinrezeptoren, die bislang vorwiegend im zentralen Nervensystem lokalisiert werden konnten, auch im Innenrohr exprimiert werden und bei der Bindung eines Glycinrezeptor-Agonisten inhibitorische Signale an den Hörnerv weiterleiten. Die Erfinder haben ferner erkannt, dass durch die Applikation eines Glycinrezeptor-Agonisten und die resultierenden inhibitorischen Signale die bei Phantomphänomenen beobachtete Überaktivität des Hörnervs korrigiert werden kann. Glycinrezeptor-Agonisten stellen deshalb neue Substanzen dar, mit denen Phantomphänomene zielgerichtet therapiert werden können.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird deshalb mit der Bereitstellung von Gycinrezeptor-Agonisten vollkommen gelöst.
Dabei ist es bevorzugt, wenn als Glycinrezeptor-Agonist eine Substanz vorgesehen wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D-Alanin, L-Alanin, L-Serin, Taurin, Cannabinoid, Tropin, Nortropin und Derivate hiervon.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche agonistischen Substanzen vorgesehen werden, die hochaffin an den Glycinrezeptor binden, einfach und kostengünstig zu synthetisieren und zu formulieren sind. Bevorzugte Tropine und Nortropin werden beschrieben in Maksay et al. (2007), Synthesis of (nor)tropeine (di)esters and allos- teric modulaton of glycine receptor binding, Bioorg. Med. Chem., Online- Veröffentlichung vom 4. November; Maksay et al. (2007), Synthesis of tropeines and allosteric modulation of ionotropic glycine receptors, J. Med. Chem., 47(25):6384-6391, in der Ester von 3 Alpha- und 3 Beta-hydroxy(nor)tropanen und Amide von 3 Alpha-aminotropanen veröffentlicht warden; Bϊrό T. und Maksay G. (2004), Allosteric modulaton of glycine receptors is more efficacious for partial rather than füll agonists, Neurochem. Int., 44(7):521-527. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Das als Glycinrezeptor-Agonist verwendbare Cannabinoid ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anandamid, Arachidonylglycerol, Tetrahydro- cannabinol, WIN 55,212-2.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits solche Cannabinoide bereitgestellt werden, die sich als besonders geeignet erwiesen haben. Iatsenko et al. (2007), The synthetic cannabinoid analog WIN 55,212-2 potentiates the amplitudes of glycine- activated currents, Article in Ukrainian, Fiziol Zh., 53(3):31-37, beschreiben ein Cannabinoid mit der Bezeichnung WIN 55,212-2, der einen besonders wirksamen Glycinrezeptor-Agonisten darstellt. Der Inhalt der vorstehend genannten Publikation ist Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.
Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der erfindungsgemäßen Verwendung wird die Substanz lokal am oder im Ohr, vorzugsweise über die Rundfenstermembran, bzw. an der Stelle der Amputation appliziert.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Substanz gezielt am Wirkort verabreicht wird, so dass nur geringe Mengen an Wirksubstanz erforderlich sind. Dadurch wird der Körper des behandelten Patienten im Übrigen weniger belastet und Nebenwirkungen werden weit gehend reduziert. Im Falle einer Behandlung von akutem Tinnitus bietet sich das Mikrodosiersystem an, das von Lehner, R. et al. (1996), A new implantable drug delivery System for local therapy of the middle and inner ear, Ear. Nose Throat 76, Seiten 567 bis 570, beschrieben wird. Die lokale Applikation kann alternativ auch über die Verwendung von bioabbauba- rem Hydrogel erfolgen, das als Trägermatrix für den Glycinrezeptor-Agonisten dient. Derartiges bioabbaubares Hydrogel wurde bereits erfolgreich im Tiermodell zur lokalen Applikation von BDNF an das runde Fenster des Innenohres angewandt; Ito et al. (2005), A new method for drug application to the inner ear, J. Otorhinolaryn- gol. Relat. Spec, Seiten 272-275.
Alternativ können zur Applikation über die Rundfenstermembran Gel-Pellets verwendet werden, wie bspw. die Produkte Gelita®-Tampons, B. Braun, Melsungen AG, Deutschland. Alternativ kommen biokompatible Nanopartikel in Frage, wie diese bspw. beschrieben werden in Durän J. D. et al. (2007), Magnetic colloids as drug vehicles, J. Pharm. Sei, Online-Publikation, Mohamed F. und van der Walle CF. (2008), Engineering biodegradable polyester particles with speeifie drug targeting and drug release properties, J. Pharm. Sei, 97(l):71-87, Abstract vom Dezember 2007; Gupta S. und Moulik S.P. (2008), Biocompatible microemulsions and their prospec- tive uses in drug delivery, J. Pharm. Sei., 97(l):22-45, Abstract online veröffentlicht im Dezember 2007.
Nach einer erfindungsgemäßen Weiterentwicklung weist das Arzneimittel eine weitere gegen Phantomphänomene wirksame Substanz auf, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GABA-Rezeptor-Agonisten, insbesondere Benzodiazepine und mit diesen verwandte Substanzen, Baclofen, Gamma- Vinyl-GABA, Gamma-Acetylen- GABA, Progabid, Muscimol, Iboten, Natriumvalproat und Tetrahydroisoxazolopyri- din (THIP), MAP-Kinase-Inhibitoren, insbesondere U 0126 oder PD 98058, Cam- Kinase-Inhibitoren, L-Typ-Ca^-Kanal-Antagonisten, insbesondere Nicardipin oder Nifedipin oder Isradipin, CREP-Antagonisten, Glutamat-Antagonisten, trkB-Antago- nisten.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass ein besonders gegen Phantomphänomene potentes Arzneimittel bereitgestellt wird. Konkret wird hierbei Nutzen gezogen aus den Erkenntnissen der Autoren der WO 2006/079476, die beschrieben haben, dass die vorstehende Substanzen geeignet sind, um Phantomphänomene ursächlich zu behandeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder des Phantomschmerzes bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen eines Glycinrezeptor- Agonisten, und (b) Formulierung des Glycinrezeptor-Agonisten in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutisch akzeptable Träger und pharmazeutische Hilfsstoffe sind im Stand der Technik hinreichend bekannt, vgl. bspw. Kibbe A. H. (2000), Handbook of Pharma- ceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association and Pharma- ceutical Press, der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder Phantomschmerzes bei einem menschlichen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen eines Arzneimittels, (b) Applizieren, ggf. lokal am oder im Ohr bzw. an der Stelle der Amputation, des Arzneimittels dem Lebewesen, und ggf. (c) Wiederholen der Schritte (a) und Qo), wobei als Arzneimittel das Arzneimittel der eingangs beschriebenen erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehen ist.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, die rein illustrativ sind und aus denen sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben.
In den beiliegenden Figuren ist Folgendes dargestellt:
Fig. 1 Detektion von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in der Rattencochlea. Die cDNA aus der Rattencochlea wurde durch RT-PCR in verschiedenen postnatalen Stadien (P14, > P21) analysiert. P14 und > P21, Amplifikation von Transkripten von GlyRα3 (512 < bp) GlyRß (732 bp) und Gephyrin (573 bp). Auffällig ist die Doppelbande für GlyRα3 (467 bp/512 bp, durch Pfeile angedeutet) in adulten Tieren. Transkripte von GlyRαl und GlyRα2 wurden nicht detektiert. sc P21, Rückenmark aus P21 -Tieren wurde als Positivkontrolle für GlyRαl-3, GlyRß, Gephyrin und ß-Actin verwendet, ß- Actin (655 bp) wurde als ein Haushaltsgen verwendet;
Fig. 2 Detektion von GlyRα3_K- und GlyRα3_L-Splicevarianten in der adulten Rattencochlea (> P21). a) GlyRα3-Transkripte aus der adulten Rattencochlea wurden durch RT-PCR amplifiziert. Auffällig ist die Doppelbande (angedeutet durch Doppelpfeile), b) GlyRα3_K- (467 bp) und GlyRα3_L- (512 bp) Splicevarianten wurden nach der Klonierung von PCR- Fragmenten in den PCR-II-TOPO-Vektor durch Insert-PCR detektiert. c) "Alignments" von langen und kurzen cDNA-Sequenzen (Exon 8 - 10) von humanem GlyRα3 [GLRA3_L (SEQ ID Nr. 13), GLRA_K (SEQ ID Nr. 14)] und Ratten- GlyRα3 [Glra3_rn-L (SEQ ID Nr. 15), Glra3_rn_K (SEQ ID Nr. 16)]. Identische Nucleotide in allen vier Sequenzen sind durch einen Stern gekennzeichnet. Der 45 bp-Stretch von Exon 9 (fettgedruckt und kursiv) fehlt in den cDNA-Sequenzen von GLRA_K und Glra3_rn_K;
Fig. 3 mRNA-Expression von GlyRα, GlyRß und Gephyrin in den Neuronen der Spiralganglien der Cochlea der adulten Ratte (>P21). a), b) Expression der mRNA von GlyRα3 in Neuronen der Spiralganglien (SG, Pfeil) bei verschiedenen Vergrößerungen unter Verwendung der "whole-mount"-in- situ-Hybridisierung der Cochlea der adulten Ratte (>P21). Der Überblick (a) zeigt auch eine Markierung der äußeren Haarzellen ["outer hair cells" (OHC)]. c), d) die Expression der mRNA von GlyRß in Neuronen der Spiralganglien (SG, Pfeil), e), f) Expression der mRNA von Gephyrin in Neuronen der Spiralganglien (SG, Pfeil). Höhere Vergrößerungen zeigen die cytoplasmatische Färbung der mRNA von GlyRα3 (b), der mRNA von GlyRß (d), und der mRNA von Gephyrin (f) in SG. Keine Signale wurden bei der Hybridisierung mit den entsprechenden "Sinn"-Molekülen detek- tiert (eingefügte Aufnahmen a bis f). Maßstabsbalken in a), c), e) 200 μm, in b), d), f) 20 μm;
Fig. 4 Die Expression der mRNA von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in dem adulten Organ von Corti (>P21). a) GlyRα3-Transkripte wurden in den äußeren Haarzellen (OHC, ausgefüllte Pfeile) durch "whole-mount"-in- situ-Hybridisierung detektiert. Für die inneren Haarzellen ["inner hair cells" (IHC), nicht ausgefüllte Pfeile] wurde kein Signal detektiert. b) OHC (ausgefüllte Pfeile), nicht aber IHC (nicht ausgefüllte Pfeile), zeigten ein Signal für GlyRß-Transkripte in der Cochlea der adulten Ratte, c) In IHC (nicht ausgefüllte Pfeile) und OHC (ausgefüllte Pfeile) zeigte sich für Gephyrin ein starkes Hybridisierungssignal. Kein Signal wurde nach der Hybridisierung mit den entsprechenden "Sinn"-Molekülen detektiert (eingefügte Aufnahmen). Maßstabsbalken 20 μm;
Fig. 5 GlyRα/GlyRα3-Proteinexpression auf der Ebene der IHC. a), b) Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers mAb4a, der sämtliche GlyRα- Untereinheiten detektiert, wurde das GlyRα-Protein in Cryoschnitten der Rattencochlea bei P8 unter den IHC (nicht ausgefüllte Pfeilspitzen) detektiert, gezeigt für den apikalen als auch für den mittelbasalen cochlearen Bogen. In diesem Stadium wurde auf der Ebene der OHC kein GlyRα- Protein detektiert. c) bis e) Unter Verwendung des polyklonalen GlyRα3- spezifischen Antikörpers wurde auf der Ebene der IHC (*) in der "whole mount"-in-situ-Hybridisierung der Cochlea der adulten Ratte GlyRα3- Protein detektiert [>P21) (c) e)]. Mit einem Antikörper gegen das Neurofilament 200, einem Marker für afferente Nervenfasern, wurde eine Coim- munmarkierung durchgeführt (NG 200, ausgefüllte Pfeilspitze). Die Proben wurden mit DAPI gegengefärbt, womit die Zellkerne markiert werden. Maßstabsbalken in a), b) 20 μm, in c) bis e) 50 μm;
Fig. 6 GlyRα3 -Proteinexpression auf der Ebene der OHC in dem adulten Organ von Corti (>P21). a) bis c) GlyRα3-Protein (*) wurde in OHC (ausgefüllte Pfeile) durch "whole-mount"-Immunhistochemie detektiert. Die Proben wurden mit Anti-Neurofilament 200 (NF 200, ausgefüllte Pfeilspitze) co- immunmarkiert. NF 200 färbte die Nervenfasern, die an den OHC enden. Die Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt, d) bis f) Höhere Vergrößerungen von a) bis c). Auffällig ist die Lokalisierung des GlyRα3-Proteins (*) in der Zellmembran der OHC (ausgefüllte Pfeile) gegenüber den Enden der Nervenfasern (ausgefüllte Pfeilspitzen). Maßstabsbalken in a) bis c) 50 μm, in d) bis f) 20 μm;
Fig. 7 Hörnerv-Summenaktionspotential-Messungen [Engl: "Compound action Potentials" (CAP)] nach lokaler Applikation (LA) von Strychnin (Glycinre- zeptor-Inhibitor). Bei hohen Lautstärkepegeln (nach links) steigen die CAP-Amplituden nach Strychnin-Applikation weiter monoton an, da die üblicherweise bei hohen Lautstärkepegeln einsetzende Hemmung der Hörnerv-Neurone ausbleibt. Dies bedeutet eine Übererregung bei hohen Lautstärkepegeln (Fig. 7a). CAP-Messung nach lokaler Applikation von Taurin (Glycinrezeptor-Agonist). Bei niedrigen bis mittleren Lautstärkepegeln (rechts) steigen die CAP-Amplituden nach Taurin-Applikation langsamer, da die üblicherweise bei niedrigen Lautstärkepegeln inaktiven gly- cinergen (hemmenden) Neurone durch Taurin aktiviert wurden und den Hörnerv hemmen. Dies bedeutet eine Hemmung bei niedrigen und mittleren Lautstärken. Bei hohen Lautstärken werden die glycinergen Neurone soderso aktiviert, daher findet sich hier ein zumindest über einen begrenzten Lautstärkebereich eine Überlappung der CAP-Amplitudenfunktion (Fig. 7b).
Fig. 8 Schematische Darstellung der postulierten glycinergen Innervation der inneren (IHC) und äußeren Haarzellen (OHC) nach dem Beginn des Hörens. Die afferenten Dendriten (AF) der Neuronen der Spiralen Ganglien (SG) unterhalb der IHC werden von efferenten Fasern des lateralen olivio- cochlearen Bündels (EF-LOCF) kontaktiert, welche axodendritische Synapsen bilden. GlyRα3 (Punkte) wird von den SG in die afferenten Dentri- ten unterhalb der IHC transportiert, wo das Protein detektiert wurde (vgl. Fig. 5). GlyRα3-Protein wurde in den OHC detektiert (vgl. Fig. 6), welche axosomatische Synapsen mit den afferenten Fasern des medialen olivio- cochlearen (MOC) Bündels (ES-MOC) bilden;
Fig. 9 Schematische Darstellung der bei Tinnitus beobachteten erhöhten Expression von BDNF und der erniedrigten Expression von Arg3.1/Arc in der Peripherie der Cochlea (a), und der Korrektur durch Glycinrezeptor- Agonisten ("Glycin") oder GABA-Rezeptor-Agonisten ("GABA") (b).
1. Material und Methoden
1.1 Tiere
In den Untersuchungen wurden adulte, weibliche Wistar-Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) im Alter von 2 bis 4 Monaten verwendet. Der Umgang mit und die Verwendung der Tiere und das experimentelle Protokoll wurden von dem Tierschutzbeauftragten und dem regionalen Komitee für Wissenschaftliche Tierversuche in Tübingen begutachtet und genehmigt. 1.2 Gewebepräparation
Für die RNA-Isolierung wurde die Cochlea kleingeschnitten und unmittelbar anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für die Hybridisierung in situ und die Immunhistochmie wurde die Cochlea isoliert und präpariert, wie zuvor beschrieben; vgl. Knipper et al (2000), Thyroid hormone deficiency before the onset of hearing causes irreversible damage to peripheral and central audi- tory Systems, J. Neurophysiol. 83:3101-3112. Kurz zusammengefasst, die Cochlea wurden durch die Injektion von 2 % Paraformaldehyd/2 % Saccharose (alle Chemikalien stammten von SIGMA-Aldrich, München, Deutschland, wenn nicht anders angegeben) in 50 mM phosphatgepufferter Saline (pH 7,4) in das runde und ovale Fenster fixiert. Die Cochlea der Tiere, die älter waren als PlO, wurden nach der Fixierung für zehn Minuten bis zwei Stunden in RBD ("rap- pid bone decalcifier", Eurobio, Les Ulis Cedex, Frankreich) decalcifiziert. Nach der Injektion von 25 %iger Saccharose und 1 mM Proteaseinhibitor (Pefabloc; Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in HEPES-Hanks-Lösung, wurde die Cochlea in O.C.T.-Verbindung (Miles Laboratories, Elkhart, IN, USA) eingebettet, mit 10 mM cryogeschnitten, auf SuperFrost/plus-Objekträger "ge- mounted", für eine Stunde getrocknet und vor der Verwendung bei -2O0C gelagert. Für jedes Experiment wurden zumindest drei Tiere des angegebenen Alters verwendet (n=3).
1.3 RT-PCR
Mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) wurde die Gesamt- RNA aus der Rattencochlea extrahiert. Die reverse Transkription (RT) in cDNA wurde unter Verwendung des "Sensiscript Reverse Transcription Kits" (Qiagen, Hilden, Deutschland) und oligo-dTis-Primem (Roche, Penzberg, Deutschland) gemäß der Anweisungen der Herstellers durchgeführt. Für die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) wurden die folgenden Primer verwendet (die Größe des PCR-Produktes ist in Klammern angegeben). GIr al, vorwärts: 5' CCTTCTGGATCAACATGGATGCTG 3' (SEQ ID Nr. 1), rückwärts: 5' CGCCTCTTCCTCTAAATCGAAGCAGT 3' (SEQ ID Nr. 2), (243 bp); Glra2, vorwärts: 5' ATCCCTCGCAGACCCTATCT 3' (SEQ ID Nr. 3), rückwärts: 5' TAAACTGGGGCAAGGTGAGT 3' (SEQ ID Nr. 4), (553 bp); Glra3, vorwärts: 5' GGCTGAAGGACTCACTTTGC 3' (SEQ ID Nr. 5), rückwärts; 5' TGAATCGACTCTCCCTCACC 3' (SEQ ID Nr. 6) (G/rα3-Primer wurden de- signed, um mögliche Splicevarianten entsprechend den humanen GLRA3- Splicevarianten α3_L und α3_K; α3_L: 513 bp, α3_K: 468 bp zu detektieren); Glrb, vorwärts: 5' CGGGATCCATTCAAGAGACA 3' (SEQ ID Nr. 7), rückwärts: 5' GCTCGAGCCACAC-ATCCAGTGCCTT 3' (SEQ ID Nr. 8) (732 bp); Gephyrin, vorwärts: 5' CAAGGTGGCTAGAAGACATC 3' (SEQ ID Nr. 9), rückwärts: 5' ACCACTGGAAACTTATTAACTTC 3' (SEQ ID Nr. 10) (573 bp); ß-Actin, vorwärts: 5' TGAGACCTTCAACACCCCAG 3' (SEQ ID Nr. 11), rückwärts: 5' CATCTGCTGGAAGGTGGACA 3' (SEQ ID Nr. 12) (655 bp). Destilliertes Wasser diente als Negativkontrolle.
Die PCR wurde mit "PuReTaq Ready-To-Go" PCR-Beads (Amersham Bioscien- ces, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Das PCR-Programm bestand aus einer anfänglichen Denaturierungsphase von 3 min bei 94 0C, 35-40 Zyklen der Denaturierung bei 94 0C (30 sec), Anlagerung bei 58 0C (30 sec), Extension bei 72 0C (90 sec) und einem finalen Syntheseschritt von 10 min bei 72 0C. Die resultierenden PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen separiert und mit Ethidi- umbromid gefärbt. Die PCR-Produkte von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin wurden sequenziert und mit den entsprechenden Sequenzdaten aus GeneBank mittels BLAST verglichen (www.ncbi.nlm.nih.gov). Die Bezeichnungen der GlyRα3-Exons beziehen sich auf das automatische Gen-Bezeichnungssystem Ensembl (www.ensembl.org) und unterscheiden sich von der ursprünglichen Beschreibung von Nikolic et al. (1998), The human glycine receptor subunit alpha3. Glra3 gene structure, chromosoal localization, and functional charac- terization of alternative transcripts, J. Biol. Chem. 273:19708-19714. 10759
15
1.4 Synthese der Ribosonde und Hybridisierung in situ
Für die spezifischen Ribosonden wurden die PCR-Fragmente von GlyRα3_L (513 bp) GlyRß (732 bp) und Gephyrin (573 bp) in den pCR-II-Topo-Vektor (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) kloniert und für die Transkription in vitro verwendet. Die komplementären Stränge für die Sinn- und Gegensinnsonden wurden in Gegenwart von Digoxigenin-markiertem Mix (DIG; Roche Diagnostics) entweder von der SP6- oder der T7-Promotorstelle transkribiert.
"Whole-mount"-in-situ-Hybridisierungen mit GlyRα3L-, GlyRß- und Gephy- rin-Ribosonden erfolgte, wie beschrieben; vgl. Engel et al. (2006), Two classes of outer hair cells along the tonotopic axis of the Cochlea, Neuroscience 143:837:849. Kurz, die Cochlea aus Ratten mit dem angegebenem Alter wurden mit 2 % Paraformaldehyd für 30 min fixiert, gefolgt von einer Dehydrierung in 100 % Methanol über Nacht bei - 20 0C. Nach der Rehydrierung und dem Verdau mit Proteinase K (2 μg/ml) bei 37 0C für 3 min, wurden die Cochlea in 2 % Paraformaldehyd für 15 min post-fixiert. DIG-markierte Gegensinnoder Sinn-Proben wurden in Hybridisierungslösung verdünnt, die 25 % Mic- roarray-Hybridisierungspuffer (Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland), 25 % nucleasefreies Wasser und 50 % Formamid enthielten. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 55 0C durchgeführt. Die nachfolgenden Wasch- und Detektionsschritte wurden durchgeführt, wie beschrieben, vgl. Knipper et al. (1999), Distinct thyroid hormone-dependent expression of TrKB and p75NGFR in nonneuronal cells during the critical TH-dependent period of the Cochlea, J. Neurobiol. 38:338-356; Knipper et al. (2000, a.a.O.). Jede Hybridisierung erfolgte in zumindest drei verschiedenen Tieren des angegebenen Alters. 1.5 Fluoreszenz-Immunhistochemie
Für die Immunhistochemie wurden die Schnitte der Rattencochlea gefärbt, und dargestellt, wie beschrieben; vgl. Knipper et al. (2000 a.a.O.) und Knipper et al. (1998), Thyroid hormone affects Schwann cell and oligodendrocyte gene expression at the glial transition zone of the VHIth nerve prior to Cochlea function, Development 125:3709-3718. Der Maus-monoklonale Antikörper mAb4a, der gegen ein gemeinsames N-terminales Epitop der GlyRαl-4- Untereinheiten gerichtet war, wurde als Hybridomüberstand erhalten. Für die spezifische Detektion der GIy Rα3 -Untereinheit wurde ein polyklonaler Rattenantikörper (SIGMA-Aldrich) verwendet. Es wurden Maus-monoklonale Antikörper gegen Gephyrin (BD Transduction Laboratories, Heidelberg, Deutschland) und Neurofilament 200 (NF200; The Binding Site, Heidelberg, Deutschland) verwendet. Primäre Antiseren wurden mit Cy3- (Jackson ImmunoRe- search Laboratories, West Grove, PA, USA) oder Alexa488-konjugierten Sekundärantikörpern (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) visualisiert. Die Schnitte wurden in Vectashield-Mounting-Medium, enthaltend DAPI- Zellkernfärbemittel (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), fixiert. Die Proben wurden unter Verwendung eines Olympus AX70 Mikroskops fotografiert, das mit einer Epifluoreszenz-Illumination und 4Ox (numerische Apertur 1.0) oder 100x Ölimmersionsobjektiven (numerische Apertur 1.35) ausgestattet war. Die Bilder wurden unter Verwendung einer CCD Color View 12 Kamera und einem Imaging-System Analysis (SIS, Münster, Deutschland) aufgenommen. Jede Färbung wurde zumindest im Dreifachansatz in drei Tieren des jeweiligen Alters und Genotyps durchgeführt. Die immunhistochemischen Analysen erfolgten am postnatalen Tag 8 (P8) oder in der adulten (>P21) Rattencochlea. Für die "Whole-mounf'-Immunhistochemie wurde die Präparation und Fixierung der Cochlea durchgeführt, wie beschrieben in Engel et al. (2006; a.a.O.), und es wurden die wie oben beschriebenen Immunhistoche- mieprotokolle befolgt. 1.6 Hörnerv-Summenaktionspotential-Messungen [Engl: "Compound action Potentials" (CAP)]
Um einen Zugang zum Innenohr (Cochlea) zu erhalten, wird das Mittelohr chirurgisch eröffnet: Eine kleine Öffnung hinter dem Trommelfell ermöglicht den Zugang zum runden Fenster der Cochlea, im massiven Knochen des knö- cheren Labyrinths der einzige nichtraumatische Zugang zum Innenohr. Durch die Öffnung hindurch wird eine Silberdrahtelektrode mit angeschmolzener Silberperle vorsichtig auf die Membran des Runden Fenster positioniert, mit Gewebekleber gesichert und die Öffnung mit Zahnzement verschlossen. Der Silberdraht wird im Nacken des Tiers durch die Haut nach aussen geführt und kann direkt für die Messungen and die Elektrophysiologieverstärker angeschlossen werden. Der direkte elektrische Zugang durch die CAP-Elektrode ermöglich die direkte, weitgehend störungsfreie Ableitung der Summenantworten der Hörnerven auf akustische Stimulation. In der Signalantwort können neben den Summenaktionspotenzialen des Hörnerven (CAP) auch die Erregungsbildung in den Inneren Haarsinneszellen (IHZs) als Summationspoten- ziale (SP) und die Erregungsbildung in den äußeren Haarsinneszellen (ÄHZ) als Cochlea-Mikrophonpotenziale (CM) abgegriffen werden. Diese drei Potenziale geben bei in vivo-Messungen Auskunft über: 1) die Aktivität des Hörnervs schwellennah bis zu hohen Schalldruckpegeln und damit auch über die Modulation der Übertragung, die durch Glycinerge efferente Rückkoppelung auf die Afferenzen der IHCs vermittelt wird, 2) die Integrität der IHZs (durch den Verlauf des SPs bei aufsteigenden Schalldruckpegeln), 3) die Verstärkung durch die ÄHZ (durch die Phasensynchronizität der CM-Signale mit dem auditorischen Reiz).
1.7 Lokale Applikation von Glycinrezeptor-Agonisten und Antagonisten
Durch den bereits für die CAP-Elektrode gelegten retroaurikulären Zugang wurde nach einer ersten Kontrollmessung in die Rundfensternische eine gela- tine Träger Substanz (Geleter, Braun) vorsichtig in die Rundfensternische ein- gebracht und mit 5-10 μl des Glycinrezeptor-Agonisten Taurine 10 mM f.c. und des Glycinrezeptor-Antagonisten Strychnin 50 mM f.c. getränkt.
2. Ergebnisse
2.1 Amplifizierung der cDNA der Glycinrezeptoren und des Ankerproteins Gephy- rin in der Säugetiercochlea
Unter der Verwendung von RT-PCR wurden die Transkripte von GlyRα3 (512 bp), GlyRß (732 bp) und Gephyrin (573 bp) aus der Rattencochlea bei Pl 4 amplifiziert (Fig. 1, P 14). ß-Actin (655 bp) wurde als Haushaltsgen verwendet. Die GlyRα3 -Primer wurden so designed, dass diese mögliche Spliceva- rianten entsprechend den Isoformen der Untereinheiten GLRA3 short (GlyRα3_K) und GLRA3 long (GlyRα3_L) beim Menschen detektieren. Die RT- PCR aus der adulten Cochlea (>P21) ergab eine Doppelbande für die GlyRα3- Transkripte, angezeigt durch Pfeile in Fig. 1 (>P21). Die Transkripte von GlyRαl und GlyRα2 konnten in keinem der analysierten Stadien amplifiziert werden. Rückenmarks-cDNA (Fig. 1, sc P21) wurde als Positivkontrolle für GlyRαl-3, GlyRß, Gephyrin und ß-Actin verwendet.
Die zwei PCR-Produkte der GlyRα3-Doppelbande (Fig. 2a) wurden in den pCRII-TOPO-Vektor kloniert. Die Sequenzierung der Insert-PCR-Produkte ergab zwei GlyRα3-Transkriptvarianten (Fig. 2b). Das längere Transkript, das aus 512 bp bestand (G/rα3_rn_L), zeigte 99 % Identität mit der cDNA-Sequenz Glra3 der Ratte aus GeneBank (Zugriffsnummer: NMJ353724). Das kürzere Transkript, das aus 467 bp bestand (G/rα3_rn_K), trug eine 45 bp-Deletion zwischen den Nucleotiden 1120 und 1164 der Codierungssequenz (Fig. 2c, fettgedruckt und kursiv). Die Analyse der Nucleotidsequenzen Glra3 aus der Ratte und GLRA3 aus dem Menschen mit dem „Ensembl automatic gene annotati- on"-System ergab hochkonservierte Exon-Intron-Grenzen. Die 45 bp-Deletion in G/rα3_rn_K entspricht dem fehlenden Exon 9 (45 bp) der humanen cDNA- Sequenz von GLRA3_K (Fig. 2c, Exon 9). Die beiden aus der Rattencochlea amplifizierten G/ra3-Transkripte zeigten die Merkmale der zuvor beschriebenen humanen GLRA3 kurzen (α3_K) und langen (α3_L) Splicevarianten und werden deshalb im folgenden Text als GlyRα3_K und GlyRα3_L bezeichnet. Sequenzdaten aus dem GlyRß- und Gephyrin-PCR-Fragmenten bestätigten die Identität der amplifizierten Transkripte mit den entsprechenden Sequenzen aus dem Ratten-ZNS in GeneBank (Glrb: NM_053296; Gephyrin: NM_022865, Daten nicht gezeigt). Zusammenfassend ergeben die Ergebnisse aus der RT- PCR, dass GlyRα3-, GlyRß- und Gephyrin-Transkripte in der Cochlea der adul- ten Ratte mit Beginn des Hörens (~P12) exprimiert werden.
2.2 Lokalisierung der mRNA von Glycinrezeptoren und Gephyrin durch In-situ- Hybridisierung
Um die Lokalisierung der mRNA der GlyR-Untereinheit in der Rattencochlea zu identifizieren, wurden Ribosonden hergestellt, die gegen GlyRα3_L-, GlyRß- und Gephyrin-Transkripte gerichtet waren, und es wurde eine In-situ- Hybridisierung auf der adulten (>P21) Rattencochlea durchgeführt. Da nach der Decalzifizierung auf Cryoschnitten keine ausreichenden Signale erhalten wurden (Daten nicht gezeigt), wurden "Whole-mount"-In-situ-Hybridisie- rungen durchgeführt. In Fig. 3 wird ein Überblick über einen einzelnen Coch- lea-Bogen Signale von GlyRα3- (Fig. 3a), GlyRß- (Fig. 3c) und Gephyrin- Transkripten (Fig. 3e) in Neuronen der Spiralganglien (SG) gegeben. Eine höhere Vergrößerung des Bereiches der SG zeigt eine cytoplasmatische Lokalisierung der mRNA von GlyRα3 (Fig. 3b), GlyRß (Fig. 3d) und Gephyrin (Fig. 3f). Die entsprechenden "Sinn"-Proben (Fig. 3a-f, eingesetzte Aufnahmen) zeigten kein Signal.
In Fig. 4 wurde der Bereich der Haarzellen in der Cochlea der adulten Ratte bei stärkerer Vergrößerung untersucht. Transkripte von GlyRα3 (Fig. 4a), GlyRß (Fig. 4b) und Gephyrin (Fig. 4c) wurden in den OHC identifiziert (ausgefüllte Pfeile). Während zusätzlich auf der Ebene der IHC die mRNA von Gephyrin detektiert wurde (Fig. 4c, nicht ausgefüllte Pfeile), wurde in den IHC für die mRNA von GlyRα3 und GlyRß kein Hybridisierungssignal erhalten (Fig. 4a, b, nicht ausgefüllte Pfeile). Die entsprechenden "Sinn"-Sonden ergaben kein Signal (eingefügte Aufnahmen in Fig. 4a-c). Vor dem Beginn des Hörens wurde die mRNA von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in den inneren (ICH) nicht aber äußeren Haarzellen (OHC) exprimiert (Daten nicht gezeigt).
2.3 Proteindetektion und -lokalisierung der Glycinrezeptoren und von Gephyrin in der Cochlea der Ratte
In dem nächsten Schritt sollten die GlyRα3- und Gephyrin-Proteine unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mAb4a, der alle GlyRα- Untereinheiten erkennt, eines für GlyRα3-spezifischen polyklonalen Antikörpers und eines monoklonalen Antikörpers gegen das Ankerprotein Gephyrin auf Haarzellebene visualisiert werden.
Vor dem Beginn des Hörens detektierte mAb4a, der gegen ein gemeinsames N-terminales Epitop der GlyRαl-4-Untereinheiten gerichtet ist, schwache punktartige Signale unter den inneren Haarzellen, wie gezeigt für den apikalen und mittelbasalen Bogen der Cochlea in Schnitten der Ratte bei P8 (Fig. 5a, b). Bei P8 konnte für das GlyRα-Protein auf der Ebene der äußeren Haarzellen kein Protein detektiert werden. Im Gegensatz zu GlyRα konnten in Cryo- schnitten Gephyrin-Polypeptide nicht detektiert werden, weder in decalcifi- ziertem noch in nicht-decalcifiziertem Gewebe. Parallel hierzu wurde zur Umgehung der Decalcifizierung der Proben und zur Verbesserung der Proteindetektion "Whole-mount"-Immunhistochemie verwendet. Dabei wurden lediglich für den GlyRα3-spezifischen Antikörper positive Ergebnisse erhalten. Für das GIy Rα3 -Protein wurde auf der Ebene der IHC (Fig. 5c, Stern), in der Nähe der NF200-immunpositiven Nervenprojektionen (Fig. 5c, ausgefüllte Pfeilspitze) ein punktähnliches Färbemuster beobachtet, gezeigt für die Cochlea der Ratte >P21. Die Position der GlyRα3-Färbung ist im Vergleich zu den IHC- Kernen dargestellt, gefärbt mit DAPI (Fig. 5d) oder im Vergleich zur Färbung der Kerne und NF200 als Dreifachfärbung (Fig. 5e).
Die Expression von GlyRα3-Protein auf OHC der Ratte >P21 ist in Fig. 6 dargestellt. Für das GlyRα3-Polypeotid (Stern) wurde in den drei Ebenen der OHC ein Signal detektiert (Fig. 6a, d, ausgefüllte Pfeile). Die Kerne der OHC wurden mit DAPI markiert (Fig. 6b, c, e, f) und die Nervenfasern, die an den OHC enden, wurden mit einem Antikörper gegen NF200 gefärbt (Fig. 6a-f, ausgefüllte Pfeilspitze). Typische Cluster von GIy Rα3 -Protein waren an der Zellmemb ran von OHC in direkter Nähe zu NF200-positiven Nervenenden lokalisiert (Fig. 6c, d, f). Bei einem Weglassen der primären Antikörper ergaben sich keine Signale (Daten nicht gezeigt).
2.4 Der Glycinrezeptor-Agonist Taurin inhibiert die für Tinnitus charakteristische Hochregulation der Aktivität des Hörnerven
Da eine Erhöhung der Hörnervaktivität nach Trauma kausal mit der Induktion von (akutem) Tinnitus einhergeht, wurde in einem weiteren Experiment untersucht, ob die lokale Applikation eines Glycinrezeptor-Agonisten die Erhöhung der Hörnervaktivität inhibiert und damit zur Behandlung von (akutem) Tinnitus geeignet ist.
Mit Hilfe von Hörnerv-Summenaktionspotential-Messungen [Engl: Compound action potentials CAP)] wurde der Effekt des lokal applizierten Glycinrezeptor- Agonisten Taurin (5 μl einer 50 μM-Lösung) und Antagonisten Strychnin (5 μl einer 10 mM-Lösung) auf die Aktivität des Hörnerven gemessen. Hierzu wurden die Summenaktionspotentiale durch unterschiedliche Tonreize (breitban- dige Klickreize, Reintöne der Frequenzen zwischen 4 und 32 kHz, Lautstärkepegel von 0 bis 100 dB SPL) aktiviert. Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt:
Bei hohen Lautstärkepegeln (nach links) steigen die CAP-Amplituden nach lokaler Applikation (LA) von Strychnin weiter monoton an, da die üblicherweise bei hohen Lautstärkepegeln einsetzende Hemmung der Hörnerv-Neurone ausbleibt. Dies bedeutet eine Übererregung bei hohen Lautstärkepegeln; Fig. 7a.
Bei niedrigen bis mittleren Lautstärkepegeln (rechts) steigen die CAP- Amplituden nach lokaler Applikation (LA) von Taurin langsamer, da die üblicherweise bei niedrigen Lautstärkepegeln inaktiven glycinergen (hemmenden) Neurone durch Taurin aktiviert wurden und den Hörnerv hemmen. Dies bedeutet eine Hemmung bei niedrigen und mittleren Lautstärken. Bei hohen Lautstärken werden die glycinergen Neurone in jedem Fall aktiviert, daher findet sich hier ein zumindest über einen begrenzten Lautstärkebereich eine Überlappung der CAP- Amplitudenfunktion.
Wie in Fig. 7 sichtbar, zeigt sich innerhalb von 1-3 h nach lokaler Applikation des Glycinrezeptor-Antagonisten Strychnin eine Erhöhung der Amplitude des CAP-Signals mit dem größeren Reizschalldruck (Fig 7a, exemplarisch gezeigt für Messungen bei 8 kHz), während sich durch Taurin eine Reduktion der Amplitude des CAP-Signale zeigt (Fig 7b), die auch 2 Tage nach lokaler Applikation bei hohen und niedrigen Lautstärken noch gegenüber der unbehandelten Kondition reduziert war (Fig 7b, "2 Tage nach LA").
Mit der Methode der CAP-Messung lässt sich die Stimulation der glycinergen Efferenzen durch Taurine, die zur Dämpfung der Reizantwort bei moderaten Lautstärken führt und die Inhibition der glycinergen Efferenzen die zur erhöhten Reizantworten bei hohen Lautstärkepegeln sehr gut beschreiben. Die Reduktion der Hörnervaktivität durch die lokale Applikation des Glycinre- zeptor-Agonisten Taurin zeigt, dass die Gruppe der Glycinrezeptor-Agonisten geeignet sind, um (akuten) Tinnitus zu behandeln bzw. diesem vorzubeugen.
Fazit
In der vorliegenden Untersuchung wurden Glycinrezeptoren und das Ankerprotein Gephyrin in der Cochlea der Ratte detektiert und deren Verteilung durch "Whole-mount"-In-situ-Hybridisierung und Fluoreszenz-Immunhisto- chemie analysiert. Es wurde demonstriert, dass mittels Glycinrezeptor- Agonisten Phantomphänomene, wie akuter Tinnitus, ursächlich behandelt werden können.
3.1 Glycinrezeptor-Isoformen, die in der Cochlea detektiert wurden
Die durchgeführten Untersuchungen zeigten eine Expression von Transkripten von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in der Cochlea der Ratte. Hierzu im Gegensatz wurden Transkripte von GlyRαl und GlyRα2 weder in den analysierten postnatalen noch in reifen Stadien detektiert (siehe Fig. 1).
Unter den speziellen Varianten der GlyRα-Untereinheiten war die Funktion der GlyRα3-Untereinheit lange Zeit unklar. GlyRα3-Transkripte wurden in dem Riechkolben und Cerebellum, dem auditorischen Hirnstamm und dem dorsalen Hörn des Rückenmarks von adulten Nagetieren detektiert. Zunehmende Hinweise für eine Expression von GlyRα3 in Gehirnregionen, die mit der sensorischen Verarbeitung assoziiert sind, deuten auf eine entscheidende Rolle von GlyRα3 bei der sensorischen Integration hin. Dieses Verständnis wird unterstützt durch die Detektion von GlyRα3 im dorsalen Hörn des Rückenmarks, wo es als ein Schlüsselfaktor in der Transmission von Schmerzsignalen aus der Peripherie in das Gehirn identifiziert wurde. Auf der Ebene des auditorischen Hirnstammes spielen Glycinrezeptoren in der zentralen sensori- sehen Verarbeitung von akustischen Signalen, einschließlich der lateralen Inhibition und Lokalisierung von Geräuschquellen eine entscheidende Rolle. Die Identifizierung von GlyRα3 in der Cochlea der Ratte unterstützt zusätzlich das Konzept von GlyRα3 als die "sensorische" Variante der GlyRα- Untereinheit. Bis heute wird nicht verstanden, wie die spezifischen Kinetiken von GlyRα3 mit dieser Rolle in Zusammenhang stehen. Rekombinante GlyRα3-Kanäle zeigen schnelle Kinetiken, haben jedoch eine niedrigere Affinität für Glycin als GlyRαl-Kanäle.
Die Erfinder detektierten GlyRα3-Splicevarianten in der Cochlea der Ratte, die den humanen Isoformen GlyRα3_K und GlyRα3_L entsprachen (siehe Fig. 2). Bislang wurde alterantives Splicing der mRNA von GlyRα3 nur für den Menschen und die Maus beschrieben. Bei der kurzen GlyRα3_K-Isoform fehlt der 45 bp-Stretch von Exon 9, was einem Verlust von 15 Aminosäuren in dem Kanalprotein entspricht. Rekombinante Ionenkanäle der beiden Splicevarianten zeigen unterschiedliche Kanalkinetiken. Die lange GlyRα3_L-Isoform zeigt eine höhere Affinität für Glycin und desensitiviert wesentlich langsamer und in einem geringeren Ausmaß als GlyRα3_K. Das Screening von Zellen der Cochlea nach einer möglichen differentiellen subzellulären Verteilung der GlyRα3- Isoformen könnte nützlich sein, um die Rolle dieser Splicevarianten weiter aufzuklären. Außerdem könnten elektrophysiologische Aufnahmen von nati- ven Glycinrezeptoren in isolierten Haarzellen und von rekombinanten coch- learen GlyRα3_K und GlyRα3_L-Kanälen zur Charakterisierung der Kanaleigenschaften von Glycinrezeptor-Isoformen in der Cochlea und für das Verständnis von deren spezifischen Rollen beim Hören hilfreich sein.
Zusätzlich zu der Liganden-bindenden GlyRα3-Untereinheit wurden GlyRß- Transkripte in der Cochlea der Ratte durch RT-PCR und In-situ-Hybridisierung detektiert. Bis heute ist unklar, ob native GlyRα3-Kanäle α3-Homopentamere oder α3ß-Heteropentamere ausbilden. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die molekulare Zusammensetzung der Glycinrezeptoren in der Coch- lea aufzuklären. Vermutlich verankert Gephyrin über eine Bindung an die ß- Untereinheit die Glycinrezeptoren der Cochlea in dem Cytoskelett und ist entscheidend für die postsynaptische Clusterung von Glycinrezeptoren, wie dies für das zentrale Nervensystem und die Retina bereits beschrieben wurde. Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass GlyRα3-Protein in immun- histochemischen Färbungen der unreifen Cochlea der Ratte Cluster bildet. Die gleiche Verteilung der mRNA von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in OHC und SG-Neuronen, die die Erfinder dokumentieren (Fig. 3, 4), stützt die Möglichkeit von α3ß-Heteropentameren in der Cochlea der Ratte (siehe auch weiter unten).
In den inneren Haarzellen des reifen Innenohrs wurde jedoch nur die mRNA von Gephyrin durch "Whole-mount"-In-situ-Hybridisierung detektiert, wohingegen kein Signal für die mRNA von GlyRα3 und GlyRß detektiert wurde (siehe Fig. 4c). Die Expression von Gephyrin in Bereichen, die weitgehend keine glycinergen Synapsen aufweisen, wird bereits für das ZNS und die Retina von Nagetieren beschrieben. Es gibt zunehmende Hinweise darauf, dass Gephyrin diesen Bereichen in die postsynaptische Clusterbildung von GABAA- Rezeptoren in involviert ist. Während es notwendig ist, die Expression von Gephyrin-Transkripten in IHC in größerem Detail zu untersuchen, ist es von erheblichem Interesse, eine Rolle von Gephyrin als ein Ankerprotein für einen IHC-spezifischen Ionenkanal in Betracht zu ziehen.
3.2 Glycinrezeptoren in den peripheren sensorischen Organen: Retina und Cochlea
In den letzten Jahren gab es zunehmend Hinweise darauf, dass Glycinrezeptoren in die sensorische Integration in dem zentralen Nervensystem (ZNS) involviert sind. Außerdem stärkt die Detektion und Charakterisierung von Glycinrezeptoren in der Retina die Hypothese, dass glycinerge Neurotransmission auch in die periphere sensorische Informationsverarbeitung involviert sein könnte.
In der Retina von Nagetieren wurden Transkripte von GlyRαl-4, GlyRß und Gephyrin in spezifischen retinalen Zelltypen sowohl auf der Ebene der mRNA als auch der Proteinebene detektiert, was darauf hindeutet, dass glycinerge Ströme bei der Verarbeitung von visueller Information in der äußeren Retina eine Rolle spielen. Die Detektion von Glycinrezeptoren in der Cochlea stützt das Konzept einer modulatorischen Rolle von glycinerger Neurotransmission in den peripheren sensorischen Organen.
3.3 Glycinrezeptoren in der Cochlea: Zielmoleküle für efferente Innervation
Die Verteilung von GlyR-mRNA und -Protein in der Cochlea lassen die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei den inhibitorischen Glycinrezeptoren und Gephyrin um Zielmoleküle des efferenten oliviocochlearen Bündels handelt.
Laterales oliviocochleares (LOC) Bündel: Das efferente System LOC moduliert auditorische Nervenerregbarkeit und balanciert interaurale Sensitivität. ACh, GABA, Dopamin und CGRP wurden als Transmitter des LOC-Systems identifiziert. Vor dem Beginn des Hörens werden IHC anfänglich von oliviocochlearen efferenten Fasern kontaktiert. In der adulten Cochlea kontaktieren diese efferenten Fasern direkt OHC und bilden unterhalb der IHC axosomatische Synapsen mit den afferenten Dendriten. Deshalb wird angenommen, dass die mutmaßlichen inhibitorischen Rezeptoren von efferenten Transmittern zum Zeitpunkt der Bildung von axosomatischen Synapsen lokalisiert werden. Es wird vermutet, dass diese Rezeptoren nach dem Beginn des Hörens in den Neuronen der Spiralganglien und afferenten Dendriten lokalisiert sind. Entsprechend identifizierten die Erfinder Transkripte von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin in SG-Neuronen der adulten Cochlea (siehe Fig. 3) und detektierten GlyRα3-Protein auf der Ebene der IHC von Neurofilament-positiven mutmaßlichen afferenten Fasern (siehe Fig. 5). Des Weiteren wurde vor dem Beginn des Hörens GIy Rα3 -Protein an der Basis der IHC lokalisiert. Das punktähnliche Färbemuster deutete nicht nur auf die charakteristischen GlyR-Cluster in der Zellmembran hin, es erinnert auch die Lokalisierung des SK2-Kanalproteins in IHC zum gleichen Zeitpunkt. Für SK2-Proteine wird angenommen, dass diese efferente Kontrollen, die durch nicotinische, cholinerge Rezeptoren (AChα, αlO) vermittelt werden, in diesem frühen Entwicklungsstadium an IHC weiterleiten.
Die Erfinder haben erkannt, dass der Glycinrezeptor in der Cochlea von großem klinischen und wissenschaftlichen Interesse ist. Konkret wurde herausgefunden, dass Phantomphänomene, wie akuter Tinnitus und Phantomschmerz, durch die Stimulierung der Glycinrezeptoren in der Cochlea mittels Glycinrezeptor-Agonisten behandelbar sind.
Mediales oliviocochleares (MOC-) Bündel: Es ist möglich, dass inhibitorische GIyR in OHC in die efferente Signalgebung des MOC-Bündels involviert sind. Nach dem Beginn des Hörens kontaktieren Nervenfasern des MOC-Systems das basolaterale Ende von OHC mit axosomatischen Synapsen. Das MOC- Bündel arbeitet als Geräusche-evozierte Rückkopplungsschleife, die den Beitrag der OHC zur cochlearen Amplifizierung reduziert und das Innenrohr gegenüber einem akustischen Trauma schützt. Bislang wurden ACh und GABA als inhibitorische Transmitter des MOC-Systems identifiziert. Die Bindung von ACh an den nicotinischen α9-ACh-Rezeptor (nAChR) der basolateralen Enden von OHC führt zu einem Einstrom von Ca+Monen, wodurch Ca^-aktivierte SK2-K+-Kanäle geöffnet werden. Der hyperpolarisierende K+-Ausstrom verursacht einen inhibitorischen postsynaptischen Strom (IPSC), der die OHC- Elektromotilität reduziert. In den letzten Jahren gab es zunehmend Hinweise darauf, dass GABA ein weiterer Transmitter des MOC-Systems ist. α- und ß-Untereinheiten des GABAA-Rezeptors wurden an dem basolateralen Ende von isolierten OHC detektiert. Gesamtzellaufnahmen von isolierten OHC zeigten eine Hyperpolarisierung und Elongation von OHC nach der Verabreichung von GABA. Diese Effekte konnten durch den GABAA-Rezeptor- Antagonist Picrotoxin blockiert werden.
In den Untersuchungen konnten die Erfinder Transkripte von GlyRα3, GlyRß und Gephyrin an OHC durch "Whole mount"-In-situ-Hybridisierung detektie- ren (siehe Fig. 4). Außerdem konnte GIy Rα3 -Protein in allen drei Ebenen der OHC detektiert werden (siehe Fig. 6). Diese Befunde zeigen, dass inhibitorische Glycinrezeptoren in OHC Zielmoleküle des efferenten MOC-Systems darstellen (Fig. 8, EF-MOC) und eine Protektion des Innenohrs gegenüber akustischer Überexponierung bewirken. Dies wird unterstützt durch die Effekte von Strychnin, dem kompetitiven Agonisten des inhibitorischen Glycinrezeptors. Eines der prodromalen Symptome einer Strychninvergiftung ist Hyperacusis. Es war bislang jedoch nicht bekannt, ob dieses Phänomen auf eine zentrale oder periphere Enthemmung oder aus beides zurückzuführen ist. Die Beobachtungen der Erfinder zeigen, dass der inhibitorische Glycinrezeptor für eine Protektion gegenüber akustischer Überexposition (mit-)verantwortlich ist. Eine chronische lokale Verabreichung von Strychnin in das Innenohr von Meerschweinchen unterbricht die efferente Aktivität und führt zu einer permanenten Verschiebung des Schwellenwertes für hohe Frequenzen nach einem akustischen Trauma. Gegenwärtig werden diese Beobachtungen dem Strychnin zugerechnet, das als ein Antagonist auf den α9-nAChR wirkt. Außerdem weisen kürzliche Befunde auf eine neue AChRα9-vermittelte Strychnin-sensitive Komponente der efferenten Aktivität auf der Ebene der OHC infolge von hochfrequenten akustischen Stimuli hin. Die Detektion von GIyR im Innenohr liefert jedoch einen neuen Baustein für die Interpretation der Strychnin- Intoxikation und weist darauf hin, dass auch Glycinrezeptoren zu den beo- bachteten Effekten von Strychnin zusätzlich zu α9-nAChR in der Cochlea beitragen.
3.4 Behandlung von Phantomphänomenen durch Glycinrezeptor-Agonisten und GABA-Rezeptor-Agonisten
Die Autoren der WO 2006/079476 zeigten eine direkte Korrelation der veränderten erhöhten Expression von BDNF in der Peripherie der Cochlea mit der Induktion von Tinnitus. Mit der erhöhten Expression von BDNF in der Peripherie der Cochlea geht eine Herunterregulation des cortikalen Plastizitätsgens Arg3.1/Arc einher; vgl. Tan et al. (2007), Tinnitus behavior and hearing func- tion correlate with the reciprocal expression patterns of BDNF and Arg3.1/arc in auditory neurons following acoustic trauma, Neuroscience 145(2):715-726.
Sowohl die Heraufregulation von BDNF in der Cochlea, als auch die Herunterregulation von Arg3.1/Arc im auditorischen Cortex sind direkt mit im Tiermodell induziertem Tinnitus korrelierbar; vgl. Panford-Walsh et al. (2007), eingereicht.
Beide Phänomene der Expressionsverschiebung der Gene BDNF und Arg3.1/Arc in der Cochlea und dem auditorischen Cortex, wie auch das Tinni- tusverhalten selbst sind durch die Aktivierung einer inhibitorisch wirkenden efferenten Projektion, die axodendritisch auf den afferenten Hörnerven der inneren Haarzelle projiziert, blockierbar; vgl. WO 2006/079476.
Die Erfinder konnten nun einen völlig neuen inhibitorischen Transmitter, nämlich Glycin, im Innenohr entdecken. So konnten konkret die Glycinrezep- toren GlyRα3, GlyRß und das Ankerprotein Gephyrin in der adulten Cochlea unterhalb der IHC und in OHCs detektiert werden. Der Expressionslokus der Glycinrezeptoren unterhalb der inneren Haarzellen (IHC) zeigt, dass ganz analog zum GABAergen Feedback-Loop Glycin von Effe- renzen des medialen oberen Olivenkomplexes (MOC) im Stammhirn ausgeschüttet wird (Fig. 9b) und typischerweise inhibitorisch auf die Afferenzen der IHCs wirkt. Zum gleichen Rezeptortyp der "Gruppe I"- oder "Cys-Loop"-Familie wie die GABA Rezeptoren gehörend, führt die Aktivierung des Glycinrezeptors über den Einstrom von Cl- Anionen zur Hypopolarisierung des Neuriten. Dies führt zur einer konstanten tonischen Inhibition des afferenten Hörnerven, ein offenbar wesentlicher Parameter für die Balance der Nervaktivität zentraler auditorischer Projektionen.
Eine durch ein tinnitusinduzierendes Trauma bedingte Exzitocytose (zuviel Glutamat) oder eine Dislokation des inhibierenden "balancierenden" efferen- ten Inputs, führt zu der bereits beschriebenen Hyperpolarisierung des Hörnerven bzw. zur Erhöhung des BDNF-Spiegels in Spiralganglien.
Die Erhöhung der BDNF-Expression stellt nach Erkenntnissen der Erfinder den primären Trigger zur Induktion von Tinnitus dar, der über den pathologischen Transport des BDNF-Proteins im Hörnerven zur ersten Synapse im Stammhirn die Brücke zur pathophysiologischen Veränderung der Nerv-Aktivität im zentralen auditorischen System schlägt. BDNF wirkt in Abhängigkeit von der Zeit und Dauer und Menge des freigesetzten Peptids auf die ersten Postsynapsen der ersten zentralen auditorischen Schaltstation im Stammhirn, die Synapsen im ventralen und dorsalen Nucleus Cochlearis. Hier kann die Tinnitus- begleitende Erhöhung von BDNF in den Spiralganglien direkt an der Erhöhung der Aktivität im dorsalen und ventralen Nucleus Cochlearis und im inferioren Colliculus beteiligt sein, die offenbar über eine nachweisbare Erhöhung inhibitorischer Transmitter, wie GABA, die nachfolgende Reduktion von Arg3.1/Arc im auditorischen Cortex bedingt. Damit einher geht eine Reduktion von Feldpotentialen im auditorischen Cortex, ein Hinweis auf einen reduzierten thalamo-cortikalen Input; vgl. Fig. 9a. Eine Reduktion von Arg3.1/Arc im auditorischen Cortex könnte unmittelbar die bereits in verschiedenen Studien mit Tinnitus im Mensch und Tier nachgewiesene Hyperpolarisierung - oder Exzitocytose cortikaler Neurone erklären. Exzitocytose cortikaler Neurone ist seit langer Zeit als die Ursache für cortika- len Reorganisatiosprozesse postuliert werden, die letztlich zu Phantomwahrnehmungen führen. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass eine Hochregulation von Arg3.1 /Are-Proteinen in neuronalen Postsynapsen zu einem reduzierten exzitatorischen postsynaptischen Potential (EPSP), eine Herunterregulation umgekehrt zur einem erhöhten EPSP führt. D.h. das Gesamtmodel einer Erhöhung von BDNF im Hörnerven nach der Tinnitusinduktion kann direkt Phänomene erklären, die seit langer Zeit bekanntermaßen in Mensch und Tier korreliert mit Tinnitus auftreten.
Danach sollte jegliche Korrektur einer pathologischen Erhöhung von BDNF in Spiralganglien therapeutisch wirksam sein. GABA-Rezeptor-Agonisten würden in diesem Modell wirksam sein wie Glycin-Rezeptor Agonisten.
Glycinrezeptor-Agonisten korrigieren tatsächlich wie GABA-Rezeptor- Agonisten eine pathologischen Erhöhung des BDNF Spiegel. Wie in Fig. 8B skizziert, korrigieren Glycinrezeptor-Agonisten genau wie GABA-Agonisten die Reduktion der cortikalen Expression von Arg3.1/Arc und wirken damit einer pathophysiologischen Reorganisation cortikaler Projektionen und Tinnitus entgegen; vgl. Fig. 9b.
Zusammenfassend: Einer Tinnitus begleitenden akuten Erhöhung der BDNF- Spiegel in der Cochlea kann über Agonisten eines inhibitorisch wirkenden In- puts, wie GABA-Rezeptor-Agonisten und Glycinrezeptor-Agonisten, auf den Hörnerven direkt und lokal appliziert, begegnet werden. Eine kurative Vermeidung einer Erhöhung von BDNF in dem Hörnerven führt nach Erkenntnissen der Erfinder zu einer Vermeidung einer pathophysiologischen Reorganisation cortikaler Projektionen, die sich im Tiermodell durch eine Reduktion der Arg3.1 /Are-Expression in cortikalen Neuronen mit erhöhtem EPSP wiederspiegelt.

Claims

37Patentansprüche
1. Verwendung eines Glycinrezeptor-Agonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder des Phantomschmerzes bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Glycin- rezeptor-Agonist eine Substanz vorgesehen wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: D-Alanin, L-Alanin, L-Serin, Taurin, Cannabinoid, Tropin, Nortropin und Derivate hiervon.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Cannabinoid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Anandamid, Ara- chidonylglycerol, Tetrahydrocannabinol, WIN 55,212-2.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz zur lokalen Applikation am oder im Ohr bzw. an der Stelle der Amputation ausgebildet ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die lokale Applikation im Ohr über die Rundfenstermembran erfolgt.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel eine weitere gegen Phantomphänomene wirksame Substanz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: GABA- Rezeptor-Agonisten, insbesondere Benzodiazepine und mit diesen verwandte Substanzen, Baclofen, Gamma-Vinyl-GABA, Gamma-Acetylen-GABA, Proga- bid, Muscimol, Iboten, Natriumvalproat und Tetrahydroisoxazolopyridin (THIP), MAP-Kinase-Inhibitoren, insbesondere U 0126 oder PD 98058, Cam- Kinase-Inhibitoren, L-Typ-Ca^-Kanal-Antagonisten, insbesondere Nicardipin 38
oder Nifedipin oder Isradipin, CREP-Antagonisten, Glutamat-Antagonisten, trkB-Antagonisten.
7. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder des Phantomschmerzes bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(a) Bereitstellen eines Glycinrezeptor-Agonisten, und
(b) Formulierung des Glycinrezeptor-Agonisten in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
8. Verfahren zur Behandlung der Phantomphänomene des akuten Tinnitus und/oder Phantomschmerzes bei einem menschlichen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist:
(a) Bereitstellen eines Arzneimittels,
(b) Applizieren, ggf. lokal am oder im Ohr bzw. an der Stelle der Amputation, des Arzneimittels dem Lebewesen, und ggf.
(c) Wiederholen der Schritte (a) und (b),
dadurch gekennzeichnet, dass als Arzneimittel das Arzneimittel der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 vorgesehen ist.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2862673T3 (es) 2011-12-12 2021-10-07 Zilentin AG Tratamiento del tinnitus mediante la modulación del cotransportador de cloruro NKCC1 en el sistema auditivo
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US10071083B2 (en) 2017-02-03 2018-09-11 Ovid Therapeutics Inc Use of gaboxadol in the treatment of tinnitus
GB2571696B (en) 2017-10-09 2020-05-27 Compass Pathways Ltd Large scale method for the preparation of Psilocybin and formulations of Psilocybin so produced
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Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001163778A (ja) * 1999-12-09 2001-06-19 Taisho Pharmaceut Co Ltd 生体リズム障害疾患の治療薬
US6524619B2 (en) * 2000-01-27 2003-02-25 Chronorx, Inc. Dosage forms useful for modifying conditions and functions associated with hearing loss and/or tinnitus
WO2001085158A2 (en) * 2000-05-08 2001-11-15 Forskarpatent I Syd Ab Anandamide and structurally related lipids as vanilloid receptor modulators
DE10048969A1 (de) 2000-08-23 2002-03-14 Mueller Schwefe Gerhard Verwendung von Flupirtin zur Tinnitusbehandlung
DE10124953A1 (de) 2001-05-21 2002-12-12 Marlies Knipper Substanz für die therapeutische Behandlung von Tinnitus
US20050079136A1 (en) * 2001-07-10 2005-04-14 Woolfe Austen John Aerosol formulations of delta tetrahydrocannabinol
EP1545551A4 (de) 2002-09-06 2008-10-22 Durect Corp Abgabe von modulatoren der glutamat-vermittelten neurotransmission an das innenohr
US20080103209A1 (en) * 2004-04-23 2008-05-01 The Regents Of The University Of California Compounds And Methods For Treating Non-Inflammatory Pain Using Ppar Alpha Agonists
DE102005004343A1 (de) * 2005-01-25 2006-08-10 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Behandlung von Phantomphänomenen
EP1869033A1 (de) * 2005-04-08 2007-12-26 Neurosearch A/S Neuartige enantiomere und deren verwendung als monoamin-neurotransmitter-wiederaufnahmehemmer
TW200804367A (en) * 2005-11-11 2008-01-16 Neurosearch As Novel compounds
US7754700B2 (en) * 2006-04-24 2010-07-13 Trager Seymour F Composition and methods for alleviating symptoms of neurotoxicity
US20100184848A1 (en) * 2006-07-14 2010-07-22 William Abraham Wine Transdermal formulations of synthetic cannabinoids and nano colloidal silica

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2009080268A1 *

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WO2009080268A1 (de) 2009-07-02
DE102007063210A1 (de) 2009-06-25
US20110077239A1 (en) 2011-03-31

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