EP2205747A1 - Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique - Google Patents
Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutiqueInfo
- Publication number
- EP2205747A1 EP2205747A1 EP08836217A EP08836217A EP2205747A1 EP 2205747 A1 EP2205747 A1 EP 2205747A1 EP 08836217 A EP08836217 A EP 08836217A EP 08836217 A EP08836217 A EP 08836217A EP 2205747 A1 EP2205747 A1 EP 2205747A1
- Authority
- EP
- European Patent Office
- Prior art keywords
- gene
- coli
- vector system
- pathogenic
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 127
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 95
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 58
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 230000035515 penetration Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 25
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 16
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 claims description 13
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 13
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 claims description 12
- 101150073654 dapB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 101150024289 hly gene Proteins 0.000 claims description 11
- 230000009545 invasion Effects 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 11
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims description 9
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 claims description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 101100021843 Shigella flexneri lpxM1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 7
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 101100021844 Shigella flexneri lpxM2 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 claims description 6
- 101150060640 lpxM gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 101100316841 Escherichia phage lambda bet gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100226347 Escherichia phage lambda exo gene Proteins 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101710198693 Invasin Proteins 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150090396 aphA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008952 bacterial invasion Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 229940076522 listerine Drugs 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 1
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
- C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
Definitions
- the present invention relates to a vector system capable of delivering, in eukaryotic target cells, a nucleic acid of interest, or which encodes a protein, this vector system comprising a non-pathogenic recombinant Escherichia coli (E. coli) bacterium which has integrated in a targeted manner and without antibiotic marker in its chromosome one or more genes conferring this bacterium E. coli the ability to enter the cytoplasm of these eukaryotic target cells.
- the present invention also includes the use of such E. coli bacteria to deliver therapeutic compositions for the prevention or treatment of disease by vaccination or gene therapy.
- E. coli bacterium for the purpose of penetrating and reaching the cytoplasm of specific target eukaryotic cells, preventing its multiplication and survival in target cells upon entry into the cytoplasm. of these target eukaryotic cells.
- This bacterium is further transformed by a plasmid coding for a gene, which it is desired to transfer into the target cell, which is a prokaryotic-eukaryotic shuttle vector that can be replicative in said E. coli bacterium, or else integrative in said cells.
- eukaryotic target hosts are examples of a prokaryotic-eukaryotic shuttle vector that can be replicative in said E. coli bacterium, or else integrative in said cells.
- E. coli bacteria in which the genes conferring on E. coli bacteria its ability to penetrate and reach the cytoplasm of target eukaryotic cells, such as the inv invasion gene of Yersinia pseudotuberculosis (Y pseudotuberculosis), and the hly gene coding for the hemolysin of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) are provided by plasmids (type ⁇ pGB2 ⁇ .inv-hly).
- plasmids type ⁇ pGB2 ⁇ .inv-hly
- coli strain BM2710 / pGB2 ⁇ mv- / z / y is particularly described (see also Courvalin et al., CR Acad ScL, 1995, 318, pages 1207-1212).
- This strain BM2710 was deposited at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, Pasteur Institute, 25 Rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), October 27, 1995 under the number 1-1635.
- pseudotuberculosis This gene directs the synthesis of invasin that binds with high affinity to cell membrane receptors, ⁇ 1-integrins.
- the release of the phagocytosis vacuole is controlled by the acquisition by E. coli BM2710 of the hly gene of L. monocytogenes which directs the synthesis of listeria O.
- Listeria lysine O allows E. coli, or its plasmid content in case of lysis of the bacterium, to leave the vacuole of phagocytosis thanks to the formation of membrane pores.
- the inv and hly genes were cloned into the low copy number plasmid pGB2 which confers resistance to spectinomycin and streptomycin. It has been shown that this bacterial vector makes it possible, by abortive invasion, to transfer and to express by mammalian cells integrative or replicative vectors with good efficacy (5 to 20% of the cells depending on the cell type transfected in vitro: HeLa cells, CHO or COS-I).
- the transfer efficiency of the plasmid of interest is evaluated using a reporter gene coding for the "green fluorescent protein" (GFP) placed under the control of a eukaryotic promoter.
- GFP green fluorescent protein
- the transfer is also observed, but with a lower efficiency, in the absence of cell division or when the invasion is carried out at cell confluence (Grillot-Courvalin et al, 1998).
- the advantages of gene transfer by abortive bacterial invasion lie in the low toxicity to the recipient cells, the rarity of the rearrangements in the delivered DNA, the good efficiency of transfection and also in the fact that the donor bacterium, non-pathogenic and well-defined genetically, is unable to multiply and even survive in the receptor cell and in the environment due to auxotrophy for diaminopimelic acid.
- the inventors have demonstrated that it is possible to obtain such improvements by integrating in the bacterial chromosome the genes conferring on the bacterium E. coli its ability to penetrate and reach the cytoplasm of the target eukaryotic cells, such as the genes inv and hly.
- the inventors have thus generated an E. coli strain which hosts these two genes in the chromosome.
- this chromosomal integration makes it possible to stabilize the genes inv and hly in progeny.
- the subject of the present invention is therefore a vector system capable of delivering, in eukaryotic target cells, a nucleic acid of interest or encoding a protein of interest, a vector system comprising a non-pathogenic recombinant E. coli bacterium, said E. coli bacterium. non-pathogenic being furthermore:
- vector system and "target cell” reflect that the E. coli strain is used here as a means of transferring the nucleic acid of interest into said eukaryotic cells and not as a host bacterium for the expression of said fragment of E. coli. DNA, which can take place where appropriate in said target cells after penetration of the bacterium into the cytoplasm.
- This vector system also covers recombinant E. coli strains as defined as a vector system and defined in the present invention.
- nucleic acid of interest is meant here any nucleotide sequence, DNA or RNA, with or without enzymatic restriction sites. Since most gene transfer systems do not allow the transfer of large DNA fragments, viral vectors can not accommodate fragments larger than 150 kb; by lipofection it is first necessary to produce large quantities of these large fragments from cultures of bacteria that replicate these artificial bacterial chromosomes, then purify the DNA and introduce it into the cells by lipofection, all these steps often result in denaturation genetic material and result in low transfection efficiency.
- the bacterial vector makes it possible to propagate and transfer directly into the cytoplasm of the cells these artificial bacterial chromosomes of all sizes without prior purification and thus maintaining their physical integrity.
- the nucleic acid of interest may be of any size up to 100 kb, or 100 to 150 kb but also greater than 150 kb the upper limit not being defined.
- the nucleic acid comprises at least 150 kb.
- nucleic acid of interest is meant here any nucleotide sequence hetero logue to the target cell or any nucleotide sequence present in the target cell but whose expression is desired to modify or regulate. Preferably, it may be an exogenous nucleic acid.
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic E. coli bacterium is transformed by chromosomal integration of two genes, originating from one or two other bacteria, conferring on it the ability to enter the cytoplasm of said target cells.
- the vector system according to the invention is characterized in that the gene or genes integrated into the chromosome of the non-pathogenic E.
- Said eukaryotic target cells may be animal cells, in particular mammalian cells, in particular human cells, or yeast cells or even plant cells.
- L. monocytogenes gene for transferring DNA into epithelial cells of the central nervous system
- a gene of the bacterium of the genus Yersinia, in particular Y. pseudotuberculosis or Y. enterocolitica for transferring DNA into epithelial cells and
- bacterium gene of the genus Mycobacterium in particular Mycobacterium tuberculosis, Avilum complex, scrofulaceum for transferring DNA into macrophages.
- the E. coli bacterium according to the invention it is preferred to transform the E. coli bacterium according to the invention by two exogenous genes from different bacteria.
- the invading gene of Y. pseudotuberculosis bacteria can be used to confer the ability to enter the cells.
- the L. monocytogenes hemolysin gene, an approximately 2kb gene that confers intracellular release capacity by lysing the vacuole membranes, can also be used.
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic E. coli bacterium is transformed by chromosomal integration by the bacterium invasion gene or Y. pseudotuberculosis which confers the property of penetrating in the cytoplasm of epithelial cells.
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic E. coli bacterium is transformed by chromosomal integration by the gene coding for hemolysin of L. monocytogenes or of another E. pathogenic E. coli which confers the property of lysing the membranes of the vacuoles of said target cells.
- the function of recognition and penetration of the cell membrane and the function of lysis of the membranes of vacuoles or phagosomes, the latter making it possible to reach the cytoplasm may be conferred by one or more distinct genes, in particular two distinct genes.
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic E. coli bacterium is transformed by chromosomal integration at the same time by the invasion gene of the bacterium Y. pseudotuberculosis which confers the property of penetrating the cytoplasm of the epithelial cells. And by the gene encoding L. monocytogenes hemolysin which confers the property of lysing the membranes of the vacuoles of said target cells.
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic E. coli bacterium is transformed by chromosomal integration both by:
- the vector system according to the invention is characterized in that:
- the inv invasion gene of Yersinia pseudotuberculosis is under the control of the Ptrc promoter;
- the hly gene coding for Listeria monocytogenes hemolysin is under the control of the Ftet promoter.
- the vector system according to the invention is characterized in that said E. coli strain has been rendered incapable of surviving in said cells as soon as it enters the cytoplasm of eukaryotic cells.
- the E. coli strain can be rendered incapable of multiplying and surviving in eukaryotic cells in multiple ways, particularly by rendering it auxotrophic for a factor necessary for its survival and absent from eukaryotic cells.
- the E. coli bacterium is rendered incapable of multiplying and thus of surviving as soon as it enters the cytoplasm of eukaryotic cells.
- said E. coli bacterium has been modified so as to be made auxotrophic for diaminopimelic acid which is an essential compound for the synthesis of the bacterial wall and whose pathway biosynthesis is well known.
- the E. coli bacterium is rendered dap " following a double homologous recombination event in two diaminopimelic acid synthesis genes that is prokaryotic specific and absent in the cyptoplasm of the cells. The first two steps in the synthesis of diaminopimelate, which is not present in mammalian cells, are catalyzed by the enzymes encoded by the dap A and dapB genes.
- the gene can be doubly inactivated by deletion and insertion-inactivation in the dap A and dapB genes. Inactivation of the metabolic chain in the first step avoids the accumulation in cells of a metabolic intermediate that can be metabolized by another enzyme in the cell.
- the vector system according to the invention is characterized in that one of the genes conferring on said non-pathogenic recombinant E. coli bacterium the ability to enter the cytoplasm of said eukaryotic target cells is integrated into the chromosome. of said E. coli by homologous recombination at the level of the dapA or dapB gene of said non-pathogenic E. coli bacterium, resulting in at least a partial deletion of this gene and its inactivation.
- the vector system according to the invention is characterized in that one of the genes or the two genes conferring on said non-pathogenic recombinant E. coli bacterium the ability to enter the cytoplasm of said eukaryotic target cells are integrated into the chromosome of said E. coli by:
- the vector system according to the invention is characterized in that the selection of non-pathogenic recombinant E.
- coli bacteria having integrated the penetration gene is carried out by means of a tetracycline resistance cassette flanked by FRT sites permitting its excision of the bacterial chromosome by the yeast FIp recombinase, preferably by the introduction of a plasmid into said E. coli bacterium capable of producing the transient form FIp recombinase.
- the vector system according to the invention is characterized in that the chromosomal integration of the gene (s) conferring on said non-pathogenic recombinant E. coli bacterium the ability to enter the cytoplasm of said eukaryotic target cells, is performed by homologous recombination in the presence of red ⁇ (exo) and red ⁇ (bet) proteins of bacteriophage ⁇ expressed by a plasmid.
- the vector system according to the invention is characterized in that it is a non-pathogenic recombinant E. coli bacterium of genotype:
- the subject of the present invention is a vector system according to the invention, characterized in that the msbB structural gene of said non-pathogenic recombinant E. coli bacterium has been mutated in order to generate a strain whose lipid A LPS is devoid of myristoylated fatty acids.
- the vector system according to the invention is characterized in that it is a non-pathogenic recombinant E. coli bacterium of genotype: [thi-1, endAl, hsdR17 (r ⁇ ⁇ , m ⁇ + ), supE44, ⁇ (lac) X74, ⁇ msbB, ⁇ dapA ⁇ inv, ⁇ dapB ⁇ hly, recAl]; or
- E. coli strain BM4657 deposited on January 17, 2008 under number 1-3893 at the CNCM (National Collection of Microorganism Cultures), Institut Pasteur, 25 Rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
- the present invention also allows the generation of an invasive E coli strain allowing the production in large amounts by the vector of hetero log proteins and short hairpin RNA (sh RNA, interfering RNA molecules synthesized by the bacterium) under control. of the T7 promoter, the gene coding for T7
- RNA polymerase is integrated into the bacterial chromosome.
- the present invention comprises an in vitro, ex vivo or in vivo method of producing heterologous proteins or nucleic acids, in particular RNAs, in particular short hairpin RNA (for short hairpin RNA) RNAs.
- RNAs in particular short hairpin RNA (for short hairpin RNA) RNAs.
- a eukaryotic cell characterized in that it implements a vector system according to the invention wherein said nucleic acid is under the control of the T7 promoter and the gene coding for the T7 RNA polymerase is integrated into the bacterial chromosome of said recombinant E. coli bacterium.
- the vector system according to the invention is characterized in that the T7 RNA polymerase gene has been integrated, preferably under the control of the lacUV5 promoter, into the chromosome said non-pathogenic recombinant E. coli bacterium. .
- the vector system according to the invention is characterized in that it is a non-pathogenic recombinant E. coli bacterium of genotype:
- the vector system according to the invention is characterized in that said non-pathogenic recombinant E coli strain is transformed by a replicative or non-replicative vector into E coli carrying said nucleic acid of interest or coding for said protein. interest, and, where appropriate, placed under the control of regulatory elements in said eukaryotic target cells.
- said nucleic acid of interest comprises a DNA fragment coding for a protein of interest, this latter fragment being placed under the control of regulatory elements in said eukaryotic target cells.
- regulatory elements means regulatory sequences suitable for transcription then translation such as promoter, including codons "start” and “stop", “enhancer” and “operator”. The means and methods for identifying and selecting these elements are well known to those skilled in the art.
- said strain is transformed by a replicative or non-replicative vector in E. coli carrying said nucleic acid of interest and optionally said regulatory elements.
- the vector system according to the invention is characterized in that said vector carrying said nucleic acid of interest further comprises elements allowing integration into the genome of the target eukaryotic cells.
- the vector system according to the invention is characterized in that said vector carrying said nucleic acid of interest further comprises an origin of replication allowing the vector to replicate extra chromosomally in said target eukaryotic cells. .
- said nucleic acid of interest is carried by a replicative and non-integrative plasmid in the bacterium.
- the foreign DNA fragment is placed under the control of functional expression elements in the target eukaryotic cells.
- Said carrier vector may be replicative or integrative in the target eukaryotic cells, that is to say that it may comprise elements allowing integration into the genome of the target eukaryotic cells, or may include an origin of replication allowing the vector to to replicate extra chromosomally in the target eukaryotic cells.
- the vector system according to the invention is characterized in that said eukaryotic cells are mammalian cells, yeast or plant cells, preferably mammalian cells.
- the present invention relates to a vector system according to the invention for the preparation of a therapeutic composition.
- the present invention provides a method for in vivo or in vitro transfer of DNA into eukaryotic cells other than animal cells. or human, characterized in that it implements a vector system according to the invention.
- the present invention relates to an in vitro or ex vivo method for transferring DNA into human or animal eukaryotic cells from a biological sample of human or animal origin, characterized in that it implements a vector system according to the invention.
- the present invention relates to the use of a vector system according to the invention, for the preparation of a vaccine composition, characterized in that the nucleic acid of interest encodes an antigen of an infectious agent whose infection can be prevented by means of an antibody directed against this antigen.
- the subject of the present invention is the use of a vector system according to the invention, the preparation of an anti-tumor vaccine composition, characterized in that the nucleic acid of interest codes for an antigen tumor whose tumor or cancer can be prevented by means of an antibody directed against this antigen.
- the present invention relates to the use of a vector system according to the invention, for the preparation of a therapeutic composition for the treatment or prevention of diseases by gene therapy.
- Figure 1 shows a construction scheme of the bacterial vectors.
- Figure 2 shows a diagram showing the different building steps to lead to different vector systems BM4570, BM4573 and BM4570 (DE3).
- FIGS. 3A-3C FIGS. 3A to 3C represent the comparative results obtained by FACS analysis for the various vector systems derived from the BM2710 strain, expression of the inv gene on the surface of the E. coli bacterium.
- Figure 4 Figure 4 shows the quantification of the hemolityc activity in the three vectors.
- Figure 5 shows the ability of pEGFP-C1 gene transfer by BM4570 compared with that of BM2710pGB2 ⁇ mv- / z / y.
- EXAMPLE 1 Construction of E. coli BM4570 by Integration of Inv and My Genes in the Chromosome of E. coli BM2710
- the Red ⁇ functions of the phage ⁇ are carried by the plasmid pKOBEGA which has a heat-sensitive origin of replication and are expressed under the control of the promoter inducible by arabinose pBAD (Chaveroche et al, 2000).
- the E. coli strain harboring pKOBEGA was electrotransformed by fragments which include the inv gene or the hly gene flanked, respectively, by the 5 'and 3' portions of the dapA gene or the dapB gene.
- Tetracycline resistance cassette that could be excised secondarily from the chromosome.
- the Tet cassette R (D. Mazel, unpublished) is flanked by short direct repetitions (FRT sites) which allow its excision by the yeast FIp recombinase (MM Cox, 1983) thus generating a stable bacterial vector and devoid of resistance.
- Tetracycline resistance was deleted from the chromosome by introducing into the strain the plasmid pCP20 (Cherepanov and Wackernagel, 1995) which allows transient production of the FIp recombinase in trans ( Figure 1).
- plasmid pCP20 Choerepanov and Wackernagel, 1995
- Ptrc is a hybrid promoter composed of the sequence -35 of the trp promoter and the -10 sequence of / ⁇ cUV5; in the E. coli BM2710 dapB gene, the hly gene lacks a signal sequence under the control of the Vtet promoter of pACYC184 (Higgins et al, 1999).
- EXAMPLE 2 Construction of E. coli BM4573 Derived from E. coli BM2710 Invasive with Modified LPS
- Plasmid pCVD442 msbB1 a suicide vector that only replicates in strains producing the Pir protein, was used (d'Hauteville et al., 2002). Insertion into this plasmid comprises the 5 'portion and the upstream region of the msbB gene, the kafamycin resistance determinant aphA of pUC4K and the 3' portion and the region downstream of the msbB gene. The aphA gene of this construct was replaced by the tet R cassette flanked by the FRT sites. E. coli strain BM4573 (AmsbB) was constructed using the same approach as previously described.
- EXAMPLE 3 Construction of E. coli BM4570 (DE3) by Integration of the T7 RNA Polymerase Gene into the Chromosome of E. coli BM4570
- the ⁇ DE3 lysogenization kit (Novagen) was used to integrate the T7 RNA polymerase gene under the control of the laclIV5 promoter.
- the FLP protein of the yeast 2- ⁇ m plasmid Expression of a eukaryotic genetic recombination system in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4223-4227.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un système vectoriel capable de délivrer dans des cellules cibles eucaryotes un acide nucléique d'intérêt, ce système vectoriel comprenant une bactérie Escherichia coli (E. coli) recombinante non pathogène et non réplicative ayant intégré de façon ciblée et sans marqueur antibiotique, dans son chromosome un ou plusieurs gènes conférant cette bactérie E. coli la capacité de pénétrer dans le cytoplasme de ces cellules cibles eucaryotes et de lyser la vacuole de pénétration. La présente invention comprend également l'utilisation de telles bactéries E. coli pour la production de compositions thérapeutiques et leur délivrance sans étape de purification destinées à la prévention ou au traitement de maladie par vaccination ou par thérapie génique.
Description
Souches E. coli atténuées invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molécule thérapeutique
La présente invention concerne un système vectoriel capable de délivrer dans des cellules cibles eucaryotes un acide nucléique d'intérêt, ou codant pour une protéine ce système vectoriel comprenant une bactérie Escherichia coli (E. colî) recombinante non pathogène ayant intégré de façon ciblée et sans marqueur antibiotique dans son chromosome un ou plusieurs gènes conférant cette bactérie E. coli la capacité de pénétrer dans le cytoplasme de ces cellules cibles eucaryotes. La présente invention comprend également l'utilisation de telles bactéries E. coli pour délivrer des compositions thérapeutiques destinées à la prévention ou au traitement de maladie par vaccination ou par thérapie génique.
Le transfert de matériel génétique dans des cellules de mammifères au moyen de bactérie E. coli invasive non pathogène a déjà fait l'objet de publications (demande de brevet français FR 95 15556 publiée sous le numéro 2 743 086 ; Grillot-Courvalin C, Goussard S., Huetz F., Ojcius D.M., and Courvalin P. (1998), Nature Biotechnol., 16:862-866).
Les techniques décrites dans ces documents concernent une bactérie E. coli modifiée génétiquement dans le but de pénétrer et d'atteindre le cytoplasme de cellules eucaryotes cibles déterminées, d'empêcher sa multiplication et sa survie dans les cellules cibles, dès son entrée dans le cytoplasme de ces cellules eucaryotes cibles. Cette bactérie est en outre transformée par un plasmide codant pour un gène, que l'on souhaite transférer dans la cellule cible, qui est un vecteur navette procaryote-eucaryote qui peut être réplicatif dans ladite bactérie E. coli, ou encore intégratif dans lesdites cellules eucaryotes hôtes cibles.
Plus précisément, ces documents décrivent de telles bactéries E. coli dans lesquelles les gènes conférant à la bactérie E. coli sa capacité à pénétrer et à atteindre le cytoplasme des cellules eucaryotes cibles, tels que le gène d'invasion inv de Yersinia pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis), et le gène hly codant pour l'hémolysine de Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) sont apportés par des plasmides (type τpGB2Ω.inv-hly). Parmi les bactéries E. coli recombinantes, non pathogènes et invasives
ainsi transformées, la souche E. coli BM2710/pGB2Ωmv-/z/y est particulièrement décrite (voir également Courvalin et al., CR Acad. ScL, 1995, 318, pages 1207-1212). Cette souche BM2710 a été déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France), le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635.
Ces travaux initiaux ont permis de montrer que la souche de E. coli BM2710 auxotrophe pour l'acide diaminopimélique (qui se lyse sans se diviser par défaut de synthèse de sa paroi dans un environnement déficient en dap comme c'est le cas dans les cellules eucaryotes) et rendue invasive était capable de délivrer de l'ADN plasmidique à différents types cellulaires chez lesquels l'expression du transgène a pu être détectée (Courvalin et al., 1995). Pour un transfert efficace, deux étapes sont apparues nécessaires : l'entrée de la bactérie dans la cellule et sa sortie (ou celle de l'ADN plasmidique) de la vacuole de phagocytose induite. L'internalisation du vecteur bactérien dans de nombreux types cellulaires a été rendue possible par l'introduction dans E. coli BM2710 dap du gène inv de Y. pseudotuberculosis. Ce gène dirige la synthèse de l'invasine qui se lie avec une haute affinité à des récepteurs de la membrane cellulaire, les βl-intégrines. La sortie de la vacuole de phagocytose est contrôlée par l'acquisition par E. coli BM2710 du gène hly de L. monocytogenes qui dirige la synthèse de la listério lysine O. La listério lysine O permet à E. coli, ou à son contenu plasmidique en cas de lyse de la bactérie, de sortir de la vacuole de phagocytose grâce à la formation de pores membranaires. Dans cette première génération du vecteur bactérien, les gènes inv et hly ont été clones dans le plasmide à bas nombre de copies pGB2 qui confère la résistance à la spectinomycine et à la streptomycine. Il a été montré que ce vecteur bactérien permet, par invasion abortive, de transférer et de faire exprimer par des cellules de mammifères des vecteurs intégratifs ou réplicatifs avec une bonne efficacité (5 à 20 % des cellules en fonction du type cellulaire transfecté in vitro : cellules HeLa, CHO ou COS-I). L'efficacité de transfert du plasmide d'intérêt est évaluée à l'aide d'un gène rapporteur codant pour la « green fluorescent protein » (GFP) placé sous le contrôle d'un promoteur eucaryote. Le transfert s'observe également, mais avec une efficacité plus faible, en l'absence de division cellulaire ou lorsque l'invasion est réalisée à confluence cellulaire (Grillot-Courvalin et al, 1998).
Les avantages du transfert de gène par invasion bactérienne abortive résident dans la faible toxicité pour les cellules réceptrices, la rareté des remaniements dans l'ADN délivré, la bonne efficacité de transfection et également dans le fait que la bactérie donatrice, non pathogène et bien définie génétiquement, est incapable de se multiplier et même de survivre dans la cellule réceptrice et dans l'environnement du fait de l'auxotrophie pour l'acide diaminopimélique.
Parmi les améliorations à apporter, on peut citer notamment la possibilité d'introduire n'importe quel vecteur plasmidique d'expression sans avoir à respecter les règles de compatibilité des origines de réplication et également la possibilité de diminuer voire de supprimer les gènes de résistance aux antibiotiques présents dans la bactérie vectrice.
Les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible d'obtenir de telles améliorations en intégrant dans le chromosome bactérien les gènes conférant à la bactérie E. coli sa capacité à pénétrer et à atteindre le cytoplasme des cellules eucaryotes cibles, tels que les gènes inv et hly.
Les inventeurs ont ainsi généré une souche E. coli qui héberge ces deux gènes dans le chromosome.
En dehors des avantages précités, cette intégration chromosomique permet de stabiliser les gènes inv et hly dans la progénie.
La présente invention a donc pour objet un système vectoriel capable de délivrer dans des cellules cibles eucaryotes un acide nucléique d'intérêt ou codant pour une protéine d'intérêt, système vectoriel comprenant une bactérie E. coli recombinante non pathogène, ladite bactérie E. coli non pathogène étant en outre :
- modifiée par introduction (par échange allélique) d'un ou plusieurs gènes conférant à cette bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes ;
- incapable de survivre dans le cytoplasme de ladite cellule cible ; et - modifiée par les fragments d'ADN étrangers,
caractérisé en ce que le ou les gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes sont intégrés dans le chromosome de ladite E. coli non pathogène.
Les expressions « système vectoriel » et « cellule cibles » reflètent que la souche E. coli est utilisée ici comme moyen de transfert de l'acide nucléique d'intérêt dans lesdites cellules eucaryotes et non comme bactérie hôte pour l'expression dudit fragment d'ADN, celle-ci pouvant avoir lieu le cas échéant dans lesdites cellules cibles après pénétration de la bactérie dans le cytoplasme. Ce système vectoriel couvre également les souches recombinantes de E. coli telles que définies en tant que système vectoriel et défini dans la présente invention.
Par « acide nucléique d'intérêt » on entend désigner ici toute séquence nucléotidique, ADN ou ARN, comportant ou non des sites de restriction enzymatique. La plupart des systèmes de transfert de matériel génétique ne permettant pas de transférer de grands fragments d'ADN, les vecteurs viraux ne peuvent s'accommoder de fragments de plus de 150 kb ; par lipofection il faut d'abord produire de grandes quantités de ces grands fragments à partir de cultures des bactéries qui répliquent ces chromosomes artificiels bactériens, puis purifier l'ADN et l'introduire dans les cellules par lipofection, toutes ces étapes entraînent souvent une dénaturation du matériel génétique et résultent en une faible efficacité de transfection. De manière préférentielle, le vecteur bactérien permet de propager et de transférer directement dans le cytoplasme des cellules ces chromosomes artificiels bactériens de toutes tailles sans purification préalable et donc en conservant leur intégrité physique.
Ainsi, dans un mode de réalisation également préféré, l'acide nucléique d'intérêt peut-être de toute taille jusqu'à 100 kb, ou de 100 à 150kb mais aussi plus grand que 150kb la limite supérieure n'étant pas définie.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'acide nucléique comprend au moins 150 kb.
Par « acide nucléique d'intérêt » on entend préférer ici toute séquence nucléotidique hétéro logue à la cellule cible ou toute séquence nucléotidique présente dans la cellule cible mais dont on souhaite modifier ou réguler l'expression. De préférence ainsi, il peut s'agir d'un acide nucléique exogène.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique de deux gènes, provenant d'une ou de deux autres bactéries, lui conférant la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles. Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que le ou les gènes intégrés dans le chromosome de la bactérie E. coli non pathogène et lui conférant sa capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles, lui permettent de lyser la membrane des vacuoles desdites cellules cibles. Lorsque la spécificité de pilotage vers lesdites cellules cibles particulières est conférée par un gène provenant d'une autre bactérie codant pour la faculté de pénétrer spécifiquement lesdites cellules cibles, c'est le choix du gène responsable de la reconnaissance et pénétration de la membrane cellulaire qui confère la spécificité du pilotage. Lesdites cellules eucaryotes cibles peuvent être des cellules animales, notamment des cellules de mammifères, en particulier des cellules humaines, ou des cellules de levures ou encore des cellules de plantes.
La nature de la bactérie d'origine du gène responsable de la reconnaissance et pénétration spécifique dans les cellules cibles déterminées, utilisé selon la présente invention, confère au système vectoriel de l'invention, une spécificité de pilotage vers un type de cellules eucaryotes cibles, en particulier des cellules de mammifères notamment humaines, correspondant au spectre d'hôte cellulaire de ladite bactérie.
Parmi les gènes conférant aux bactéries capacité de pénétrer dans certaines cellules cibles, on peut citer :
- un gène ou un ensemble de gènes de la bactérie Salmonella typhimurium pour transférer de l'ADN dans des cellules de tissus lymphoïdes et des cellules hépatiques ;
- un gène ou un ensemble de gènes de la bactérie Shigella flexneri pour transférer de l'ADN dans des cellules épithéliales de mammifères ;
- un gène de la bactérie du genre Légionella, notamment Legionella pneumophila, notamment pour transférer de l'ADN plus spécifiquement dans des cellules épithéliales du poumon ;
- un gène de la bactérie L. monocytogenes pour transférer de l'ADN dans des cellules épithéliales du système nerveux central ;
- un gène de la bactérie du genre Yersinia, notamment Y. pseudotuberculosis ou Y. enterocolitica pour transférer de l' ADN dans des cellules épithéliales ; et
- un gène de bactérie du genre Mycobactérium, notamment Mycobactérium tuberculosis, Avilum complex, scrofulaceum pour transférer de l'ADN dans des macrophages.
Dans un mode de réalisation illustrant cet aspect de l'invention, on préfère transformer la bactérie E. coli selon l'invention par deux gènes exogènes provenant de bactéries différentes. On peut utiliser en particulier le gène d'invasion de la bactérie Y. pseudotuberculosis pour conférer la capacité d'entrer dans les cellules. On peut également utiliser le gène de l'hémolysine de L. monocytogenes, gène d'environ 2kb qui confère la capacité de dissémination intracellulaire en lysant les membranes des vacuoles.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique par le gène d'invasion de la bactérie ou Y. pseudotuberculosis qui confère la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique par le gène codant pour l'hémolysine de L. monocytogenes ou d'une autre E. coli pathogène qui confère la propriété de lyser les membranes des vacuoles desdites cellules cibles. La fonction de reconnaissance et de pénétration de la membrane cellulaire et la fonction de lyse des membranes des vacuoles ou phagosomes, cette dernière permettant d'atteindre le cytoplasme, peuvent être conférées par un ou plusieurs gènes distincts notamment deux gènes distincts.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique à la fois par le gène d'invasion de la bactérie Y.
pseudotuberculosis qui confère la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales. Et par le gène codant pour Phémolysine de L. monocytogenes qui confère la propriété de lyser les membranes des vacuoles desdites cellules cibles.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique à la fois par :
1. par le gène d'invasion inv de Yersinia pseudotuberculosis, de préférence de séquence SEQ ID NO: 10 ou de séquence identique à au moins 80 % et capable de conférer la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales ; 2. le gène hly codant pour l'hémo lysine de Listeria monocytogenes, de préférence de séquence SEQ ID NO: 4 ou de séquence identique à au moins 80 % et capable de conférer la propriété de lyser les membranes des vacuoles.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que :
1. le gène d'invasion inv de Yersinia pseudotuberculosis est sous le contrôle du promoteur Ptrc ; et/ou
2. le gène hly codant pour l'hémolysine de Listeria monocytogenes est sous le contrôle du promoteur Ftet. Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite souche E. coli a été rendue incapable de survivre dans lesdites cellules dès son entrée dans le cytoplasme de cellules eucaryotes.
La souche de E. coli peut être rendue incapable de se multiplier et de survivre dans les cellules eucaryotes de multiples façons, en particulier en la rendant auxotrophe pour un facteur nécessaire à sa survie et absent des cellules eucaryotes.
Dans le mode de réalisation préféré selon l'invention, la bactérie E. coli est rendue incapable de se multiplier et donc de survivre dès son entrée dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Pour ce faire, dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, ladite bactérie E. coli a été modifiée de manière a être rendue auxotrophe pour l'acide diaminopimélique qui est un composé essentiel de la synthèse de la paroi bactérienne et dont la voie de biosynthèse est bien connue.
Dans un mode de réalisation encore préféré, la bactérie E. coli est rendue dap" à la suite d'un double événement de recombinaison homologue dans deux gènes de synthèse de l'acide diaminopimélique qui est spécifique des procaryotes et absent dans le cyptoplasme des cellules eucaryotes. Les deux premières étapes de la synthèse du diaminopimélate qui n'est pas présent dans les cellules de mammifères, sont catalysées par les enzymes codées par les gènes dap A et dapB.
Le gène peut être doublement inactivé par délétion et insertion-inactivation dans les gènes dap A et dapB. L'inactivation de la chaîne métabolique au niveau de la première étape évite l'accumulation dans les cellules d'un intermédiaire métabolique qui peut être métabolisé par une autre enzyme de la cellule.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que l'un des gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes est intégré dans le chromosome de ladite E. coli par recombinaison homologue au niveau du gène dapA ou dapB de ladite bactérie E. coli non pathogène, aboutissant à une délétion au moins partielle de ce gène et à son inactivation.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que l'un des gènes ou les deux gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes sont intégrés dans le chromosome de ladite E. coli par :
- insertion du gène de pénétration et délétion du gène dap A entre son fragment 5 ' de séquence SEQ ID NO: 3 et son fragment 3' de séquence SEQ ID NO: 5, ou entre un fragment 5' et 3' du gène dapA résultant en la délétion d'un fragment du gène dapA suffisant pour inactiver ce gène et/ou rendre auxotrophe ladite bactérie E. coli non pathogène pour l'acide diaminopimélique ;
- insertion du gène de lyse et délétion du gène dapB entre son fragment 5' de séquence SEQ ID NO: 9 et son fragment 3' de séquence SEQ ID NO: 11, ou entre un fragment 5' et 3' du gène dapB résultant en la délétion d'un fragment du gène dapB suffisant pour inactiver ce gène et/ou rendre auxotrophe ladite bactérie E. coli non pathogène pour l'acide diaminopimélique.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que la sélection des bactéries E. coli recombinantes non pathogènes ayant intégré le gène de pénétration est effectuée au moyen d'une cassette de résistance à la tétracycline flanquée de sites FRT permettant son excision du chromosome bactérien par la recombinase FIp de levure, de préférence par l'introduction d'un plasmide dans ladite bactérie E. coli capable de produire la recombinase FIp sous forme transitoire.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que l'intégration chromosomique du ou des gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes, est réalisée par recombinaison homologue en présence de protéines Red α(exo) et Red β (bet) du bactériophage λ exprimées par un plasmide.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype :
- [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl] ; ou
- [BM2710, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly] ou [BM2710, ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet- hly], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM ; ou
- la souche E. coli BM4570 déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro 1-3788 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou - la souche E. coli BM4569 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3877 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4658 déposée le 17 janvier 2008 sous le numéro 1-3894 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
Un des problèmes lors de l'utilisation in vivo de E. coli est sa toxicité potentielle liée au LPS. Il a été montré récemment que l'on pouvait réduire le potentiel pro-
inflammatoire du LPS en atténuant l'immunogénicité du lipide A par modification génétique (Somerville et al., 1996, d'Hauteville et al., 2002).
Ainsi sous un aspect particulier, la présente invention a pour objet un système vectoriel selon l'invention, caractérisé en ce que le gène de structure msbB de ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène a été muté afin de générer une souche dont le lipide A du LPS est dépourvu d'acides gras myristoylés.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype : - [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~, mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl] ; ou
- [BM2710, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly] ou [BM2710, ΔmsbB ,ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet-hly], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM ; ou - la souche E. coli BM4573 déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro 1-3790 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France; ou
- la souche E. coli BM4571 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3878 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4572 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3879 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4657déposée le 17 janvier 2008 sous le numéro 1-3893 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
La présente invention permet également la génération d'une souche de E coli invasive permettant la production en grande quantité par le vecteur de protéines hétéro logues et de « short hairpin » RNA (sh RNA, molécules de RNA interférant synthétisés par la bactérie) sous contrôle du promoteur T7, le gène codant pour la T7
RNA polymérase est intégré dans le chromosome bactérien.
Ainsi, la présente invention comprend un procédé in vitro, ex vivo ou in vivo de production de protéines hétérologues ou d'acide nucléique, notamment des ARN, notamment des ARN de type « short hairpin RNA » (pour ARN court en épingle à cheveux), dans une cellule eucaryote, caractérisé en ce qu'il met en œuvre un système vectoriel selon l'invention dans lequel ledit acide nucléique est sous le contrôle du promoteur T7 et le gène codant pour la T7 RNA polymérase est intégré dans le chromosome bactérien de ladite bactérie E. coli recombinante.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que le gène de la T7 RNA polymérase a été intégré, de préférence sous le contrôle du promoteur lacUV5, dans le chromosome ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype :
- [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl, (DE3)] ; ou
- [BM2710, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, (DE3)] ou [BM2710, ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet-hly, (DE3)], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM ; ou
- la souche E. coli BM4570 (DE3) déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro I- 3789 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ladite souche E coli recombinante non pathogène est transformée par un vecteur réplicatif ou non dans E coli portant ledit acide nucléique d'intérêt ou codant pour ladite protéine d'intérêt, et, le cas échéant, placé sous le contrôle d'éléments de régulation dans lesdites cellules cibles eucaryotes. Avantageusement, ledit acide nucléique d'intérêt comporte un fragment d'ADN codant pour une protéine d'intérêt, ce dernier fragment étant placé sous le contrôle d'éléments de régulation dans lesdites cellules cibles eucaryotes.
On entend par « éléments de régulation » les séquences régulatrices appropriées pour la transcription puis la traduction telles que promoteur, y compris codons « start » et « stop », « enhancer » et « opérateur ». Les moyens et méthodes pour identifier et sélectionner ces éléments sont bien connus de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation avantageux, ladite souche est transformée par un vecteur réplicatif ou non réplicatif dans E. coli portant ledit acide nucléique d'intérêt et éventuellement lesdits éléments de régulation.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ledit vecteur portant ledit acide nucléique d'intérêt comporte en outre des éléments permettant l'intégration dans le génome des cellules eucaryotes cibles.
Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que ledit vecteur portant ledit acide nucléique d'intérêt comporte en outre une origine de réplication permettant au vecteur de se répliquer de façon extra chromosomique dans lesdites cellules eucaryotes cibles.
Selon la présente invention, ledit acide nucléique d'intérêt est porté par un plasmide réplicatif et non intégratif dans la bactérie. En outre, le fragment d'ADN étranger est placé sous le contrôle d'éléments d'expression fonctionnelle dans les cellules eucaryotes cibles. Ledit vecteur portant peut être réplicatif ou intégratif dans les cellules eucaryotes cibles, c'est-à-dire qu'il peut comporter des éléments permettant l'intégration dans le génome des cellules eucaryotes cibles, ou comporter une origine de réplication permettant au vecteur de se répliquer de façon extra chromosomique dans les cellules eucaryotes cibles. Dans un mode de réalisation préféré, le système vectoriel selon l'invention est caractérisé en ce que lesdites cellules eucaryotes sont des cellules de mammifère, des cellules de levure ou de plante, de préférence des cellules de mammifère.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un système vectoriel selon l'invention pour la préparation d'une composition thérapeutique. Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode de transfert in vivo ou in vitro d'ADN dans des cellules eucaryotes autres que des cellules animales
ou humaines, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un système vectoriel selon l'invention.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode in vitro ou ex vivo de transfert d'ADN dans des cellules eucaryotes humaines ou animales à partir d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un système vectoriel selon l'invention.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un système vectoriel selon l'invention, pour la préparation d'une composition vaccinale, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un antigène d'un agent infectieux dont l'infection peut être prévenue au moyen d'un anticorps dirigé contre cet antigène.
Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un système vectoriel selon l'invention, la préparation d'une composition vaccinale anti-tumorale, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un antigène tumoral dont la tumeur ou le cancer peut être prévenu au moyen d'un anticorps dirigé contre cet antigène.
Sous un dernier aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un système vectoriel selon l'invention, pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au traitement ou à la prévention de maladies par thérapie génique.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples et des figures ci-après.
Légendes des figures
Figure 1 : la figure 1 représente un schéma de construction des vecteurs bactériens. Figure 2 : la figure 2 représente un schéma montrant les différentes étapes de constructions pour aboutir aux différents systèmes vectoriels BM4570, BM4573 et BM4570(DE3). Figures 3A-3C : les figures 3 A à 3 C représentent les résultats comparatifs obtenus par analyse FACS pour les différents systèmes vectoriels dérivés de la souche BM2710, expression du gène inv à la surface de la bactérie E. coli.
Figure 4 : la figure 4 représente la quantification de l'activité hémolityque dans les trois vecteurs.
Figure 5 : la figure 5 représente la capacité de transfert du gène pEGFP-Cl par BM4570 par comparaison avec celle de BM2710pGB2Ωmv-/z/y.
EXEMPLE 1 : Construction de E. coli BM4570 par intégration des gènes inv et My dans le chromosome de E. coli BM2710
II a été montré que l'expression des protéines Red α(exo) et Red β(bet) du bactériophage λ, ainsi que la protéine Red γ (gam) pouvait promouvoir de façon efficace la recombinaison homologue chez une souche de E. coli recA dépourvue de recombinaison homologue. En utilisant ce système il est donc possible d'effectuer l'échange allélique de gènes situés dans le chromosome à la suite d'un double événement de recombinaison en électroporant dans la souche à modifier un fragment d'ADN contenant des séquences terminales homologues à la cible (J.P.P. Muyrers, 2001). Les fonctions Red αβγ du phage λ sont portées par le plasmide pKOBEGA qui possède une origine de réplication thermosensible et sont exprimées sous le contrôle du promoteur inductible par l'arabinose pBAD (Chaveroche et al, 2000).
La souche de E. coli hébergeant pKOBEGA a été électrotransformée par des fragments qui incluent le gène inv ou le gène hly flanqué, respectivement, par les portions 5 ' et 3 ' du gène dapA ou du gène dapB.
Pour sélectionner les souches recombinantes, nous avons utilisé une cassette de résistance à la tétracycline qu'il a été possible d'exciser secondairement du chromosome. La cassette tetR (D. Mazel, non publié) est flanquée par de courtes répétitions directes (sites FRT) qui permettent son excision par la recombinase FIp de levure (M.M. Cox, 1983) générant ainsi un vecteur bactérien stable et dépourvu de caractère de résistance. La résistance à la tétracycline a été délétée du chromosome en introduisant dans la souche le plasmide pCP20 (Cherepanov et Wackernagel, 1995) qui permet la production transitoire de la recombinase FIp en trans (figure 1). Nous avons intégré avec ce système : - dans le gène dapA de E. coli BM2710, le gène inv sous le contrôle du promoteur fort Ptrc. Ptrc est un promoteur hybride composé de la séquence -35 du promoteur trp et de la séquence -10 de /αcUV5 ;
- dans le gène dapB de E. coli BM2710, le gène hly dépourvu de séquence signal sous le contrôle du promoteur Vtet de pACYC184 (Higgins et al, 1999).
EXEMPLE 2 : Construction de E. coli BM4573 dérivé de E. coli BM2710 invasive avec LPS modifié
Des mutations dans le gène de structure msbB de E. coli générant des souches dont le lipide A du LPS est dépourvu d'acides gras myristoylés ce qui diminue ainsi leur activité proinflammatoire (Somerville et al., 1996).
Le plasmide pCVD442 msbBl::km, vecteur suicide qui ne réplique que dans des souches produisant la protéine Pir, a été utilisé (d'Hauteville et al., 2002). L'insertion dans ce plasmide comprend la partie 5' et la région en amont du gène msbB, le déterminant de résistance à la kanamycine aphA de pUC4K et la partie 3 ' et la région en aval du gène msbB. Le gène aphA de cette construction a été remplacé par la cassette tetR flanquée des sites FRT. La souche de E. coli BM4573 (AmsbB) a été construite en utilisant la même approche que celle précédemment décrite.
EXEMPLE 3 : Construction de E. coli BM4570 (DE3) par intégration du gène de la T7 RNA polymérase dans le chromosome de E. coli BM4570
Le λDE3 lysogenization kit (Novagen) a été utilisé pour intégrer le gène de la T7 RNA polymérase sous le contrôle du promoteur laclIV5.
Les principales étapes de la construction des souches sont représentées dans la figure 2.
Pour chacune des souches construites, l'expression de l'invasine à la surface de la bactérie et la production de listério lysine ont été étudiées et comparées à celles de la souche originale qui héberge le plasmide pGB2Ω.inv-hly (figure 3).
De même, la capacité de ces souches à transférer le gène EGFP a été étudiée de façon comparative (fîgure5).
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
- Chaveroche MK, Ghigo JM, and d'Enfert C (2000) A rapid method for efficient gène replacement in the fïlamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res., 28(22) e97.
- Courvalin P, Goussard S and Grillot-Courvalin C (1995) Gène transfer from bacteria to mammalian cells. CR. Acad. Sci. Ser.IIL, 318:1207-1212.
- Cox MM. (1983) The FLP protein of the yeast 2-μm plasmid: Expression of a eukaryotic genetic recombination System in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4223-4227.
- d'Hauteville H, Khan S, Maskell DJ, Kussak A, Weintraub A, Mathison J, Ulevitch RJ, Wuscher N, Parsot C, and Sansonetti PJ (2002) Two msbB gènes encoding maximal acylation of lipid A are required for invasive Shigella flexneri to médiate inflammatory rupture and destruction of the intestinal epithelium. J. Immunol., 168:5240-5251. - Grillot-Courvalin C, Goussard S, Huetz F, Ojcius DM, and Courvalin P (1998) Functional gène transfer from intracellular bacteria to mammalian cells. Nature Biotechnol, 16:862-866.
- Robbens J, Raeymaekers A, Steidler L, Fiers W, and Remaut E (1995) Production of soluble and active recombinant murine interleukin-2 in Escherichia coli: high level expression, Kil-induced release, and purification. Protein Expr. Purif, 6:481-486.
- Somerville Jr. JE, Cassiano L, Bainbridge B, Cunningham MD, and Darveau RP (1996) A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an antiinflammatory lipopolysaccharide. J. Clin. Invest., 97(2):359-365.
Claims
1. Système vectoriel capable de délivrer dans des cellules cibles eucaryotes un acide nucléique d'intérêt ou codant pour une protéine d'intérêt, ce système vectoriel comprenant une bactérie E. coli recombinante non pathogène, ladite bactérie E. coli non pathogène étant en outre :
- modifiée par introduction (par échange allélique) d'un ou plusieurs gènes conférant à cette bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes ; - incapable de survivre dans le cytoplasme de ladite cellule cible ; et
- modifiée par les fragments d'ADN étrangers, caractérisé en ce que le ou les gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes sont intégrés dans le chromosome de ladite E. coli non pathogène.
2. Système vectoriel selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique de deux gènes, provenant d'une ou de deux autres bactéries, lui conférant la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles.
3. Système vectoriel selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le ou les gènes intégrés dans le chromosome de la bactérie E. coli non pathogène et lui conférant sa capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles, lui permettent de lyser la membrane des vacuoles desdites cellules cibles pour atteindre la cytoplasme.
4. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique par le gène d'invasion de la bactérie Y. pseudotuberculosis qui confère la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales.
5. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique par le gène codant pour l'hémolysine de L. monocytogenes qui confère la propriété de lyser les membranes des vacuoles desdites cellules cibles.
6. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique à
la fois par le gène d'invasion de la bactérie Y. pseudotuberculosis qui confère la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales et par le gène codant pour l'hémolysine de L. monocytogenes qui confère la propriété de lyser les membranes des vacuoles desdites cellules cibles et par le gène.
7. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli non pathogène est transformée par intégration chromosomique à la fois par :
1. par le gène d'invasion inv de Y. pseudotuberculosis, de préférence de séquence SEQ ID NO: 10 ou de séquence identique à au moins 80 % et capable de conférer la propriété de pénétrer dans le cytoplasme des cellules épithéliales; et
2. le gène hly codant pour l'hémolysine de L. monocytogenes, de préférence de séquence SEQ ID NO: 4 ou de séquence identique à au moins 80 % et capable de conférer la propriété de lyser les membranes des vacuoles.
8. Système vectoriel selon la revendication 7, caractérisé en ce que : 1. le gène d'invasion inv de Yersinia pseudotuberculosis est sous le contrôle du promoteur Ptet ;
2. le gène hly codant pour l'hémolysine de L. monocytogenes est sous le contrôle du promoteur Ptrc.
9. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite souche E. coli a été rendue incapable de survie dans lesdites cellules dès son entrée dans le cytoplasme de cellules eucaryotes.
10. Système vectoriel selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène a été modifiée de manière à être rendue auxotrophe pour l'acide diaminopimélique.
11. Système vectoriel selon la revendication 10, caractérisé en ce que le gène conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes est intégré dans le chromosome de ladite bactérie E. coli par recombinaison homologue au niveau du gène dapA de ladite bactérie E. coli non pathogène, aboutissant à une délétion au moins partielle de ce gène et à son inactivation, de préférence que le gène dapA codant pour l'enzyme dihydrodipicolinate synthase est inactivée.
12. Système vectoriel selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que le gène conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes est intégré dans le chromosome de ladite bactérie E. coli par recombinaison homologue au niveau du gène dapB de ladite bactérie E. coli non pathogène, aboutissant à une délétion au moins partielle de ce gène et à son inactivation.
13. Système vectoriel selon l'une des revendications 9 à 12, caractérisé en ce que le gène conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme desdites cellules cibles eucaryotes et de lyser la vacuole de pénétration est intégré dans le chromosome de ladite bactérie E. coli par :
- insertion du gène de pénétration et délétion du gène dapA entre son fragment 5 ' de séquence SEQ ID NO: 3 et son fragment 3' de séquence SEQ ID NO: 5, ou entre un fragment 5' et 3' du gène dapA résultant en la délétion d'un fragment du gène dapA suffisant pour inactiver ce gène et/ou rendre auxotrophe ladite bactérie E. coli non pathogène pour l'acide diaminopimélique ;
- insertion du gène de lyse et délétion du gène dapB entre son fragment 5' de séquence SEQ ID NO: 9 et son fragment 3' de séquence SEQ ID NO: 11, ou entre un fragment 5' et 3' du gène dapB résultant en la délétion d'un fragment du gène dapB suffisant pour inactiver ce gène et/ou rendre auxotrophe ladite bactérie E. coli non pathogène pour l'acide diaminopimélique.
14. Système vectoriel selon l'une des revendications 9 à 13, caractérisé en ce que la sélection des bactéries E. coli recombinantes non pathogènes ayant intégré le gène de pénétration et le gène de lyse est effectuée au moyen d'une cassette de résistance à la tétracycline flanquée de sites FRT permettant son excision du chromosome bactérien par la recombinase FIp de levure, de préférence par l'introduction d'un plasmide dans ladite bactérie E. coli capable de produire la recombinase FIp sous forme transitoire.
15. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que l'intégration chromosomique du ou des gènes conférant à ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène la capacité de pénétrer dans le cytoplasme et de lyser la vacuole de pénétration desdites cellules cibles eucaryotes, est réalisée par recombinaison homologue en présence de protéines Red α(exo) et Red β (bet) du bactériophage λ exprimées par un plasmide.
16. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype :
- [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl] ; ou - [BM2710, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly] ou [BM2710, ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet- hly], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM de génotype [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔdapAΩ, recAl] ; ou
- la souche E. coli BM4570 déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro 1-3788 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4569 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3877 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou - la souche E. coli BM4658 déposée le 17 janvier 2008 sous le numéro 1-3894 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
17. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce que le gène de structure msbB de ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène a été muté afin de générer une souche dont le lipide A du LPS est dépourvu d'acides gras myristoylés.
18. Système vectoriel selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype :
- [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~, mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl] ; ou
- [BM2710, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly] ou [BM2710, ΔmsbB ,ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet-hly], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM de génotype [thi-1, endAl, hsdR17 (pC mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔdapAΩ, recAl] ; ou - la souche E. coli BM4573 déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro 1-3790 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4571 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3878 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4572 déposée le 13 décembre 2007 sous le numéro 1-3879 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France ; ou
- la souche E. coli BM4657déposée le 17 janvier 2008 sous le numéro 1-3893 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
19. Système vectoriel selon lune des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que ledit acide nucléique d'intérêt est de toutes tailles jusqu'à 100 kb ou de 100 à 150 kb ou plus grand que 150 kb.
20. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que l'acide nucléique d'intérêt, de préférence codant pour une protéine hétérologue ou un ARN de type shRNA, est sous le contrôle du promoteur T7, le gène codant pour la T7 RNA polymérase étant intégré dans le chromosome bactérien.
21. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que le gène de la T7 RNA polymérase a été intégré, de préférence sous le contrôle du promoteur lacUV5, dans le chromosome de ladite bactérie E. coli recombinante non pathogène.
22. Système vectoriel selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une bactérie E. coli recombinante non pathogène de génotype :
- [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔmsbB, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, recAl, (DE3)] ; ou - [BM2710, ΔdapAΩinv, ΔdapBΩhly, (DE3)] ou [BM2710, ΔdapAΩPtrc-inv, ΔdapBΩPtet-hly, (DE3)], la souche BM2710 ayant été déposée le 27 octobre 1995 sous le numéro 1-1635 à la CNCM de génotype [thi-1, endAl, hsdR17 (rκ~ mκ+), supE44, Δ(lac)X74, ΔdapAΩ, recAl] ; ou
- la souche E. coli BM4570 (DE3) déposée le 18 juillet 2007 sous le numéro 1-3789 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.
23. Système vectoriel selon lune des revendications 1 à 22, caractérisé en ce que ladite souche E. coli recombinante non pathogène est transformée par un vecteur réplicatif ou non dans E. coli portant ledit acide nucléique d'intérêt ou codant pour ladite protéine d'intérêt, et, le cas échéant, placé sous le contrôle d'éléments de régulation dans lesdites cellules cibles eucaryotes.
24. Système vectoriel selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que ledit vecteur portant ledit acide nucléique d'intérêt comporte en outre des éléments permettant l'intégration dans le génome des cellules eucaryotes cibles.
25. Système vectoriel selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que ledit vecteur portant ledit acide nucléique d'intérêt comporte en outre une origine de réplication permettant au vecteur de se répliquer de façon extra chromosomique dans lesdites cellules eucaryotes cibles.
26. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 25, caractérisé en ce que lesdites cellules eucaryotes sont des cellules de mammifère, des cellules de levure ou de plante, de préférence des cellules de mammifère.
27. Système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 26, pour la préparation d'une composition thérapeutique.
28. Méthode de transfert in vivo ou in vitro d'ADN dans des cellules eucaryotes autres que des cellules animales ou humaines, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 26.
29. Méthode in vitro ou ex vivo de transfert d'ADN et d'ARN dans des cellules eucaryotes humaines ou animales à partir d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 26.
30. Utilisation d'un système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 27, pour la préparation d'une composition vaccinale, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un ou plusieurs antigènes d'un agent infectieux ou pour des fragments antigéniques.
31. Utilisation d'un système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 27, pour la préparation d'une composition vaccinale anti-tumorale, caractérisée en ce que l'acide nucléique d'intérêt code pour un antigène tumoral.
32. Utilisation d'un système vectoriel selon l'une des revendications 1 à 27, pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée au traitement ou à la prévention de maladies par thérapie génique.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08836217A EP2205747A1 (fr) | 2007-10-02 | 2008-10-02 | Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP07301425A EP2045331A1 (fr) | 2007-10-02 | 2007-10-02 | Souches E. COLI attenuées invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molécule thérapeutique |
| EP08836217A EP2205747A1 (fr) | 2007-10-02 | 2008-10-02 | Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique |
| PCT/EP2008/063262 WO2009043921A1 (fr) | 2007-10-02 | 2008-10-02 | Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EP2205747A1 true EP2205747A1 (fr) | 2010-07-14 |
Family
ID=39326737
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP07301425A Withdrawn EP2045331A1 (fr) | 2007-10-02 | 2007-10-02 | Souches E. COLI attenuées invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molécule thérapeutique |
| EP08836217A Withdrawn EP2205747A1 (fr) | 2007-10-02 | 2008-10-02 | Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EP07301425A Withdrawn EP2045331A1 (fr) | 2007-10-02 | 2007-10-02 | Souches E. COLI attenuées invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molécule thérapeutique |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100216233A1 (fr) |
| EP (2) | EP2045331A1 (fr) |
| CA (1) | CA2701542A1 (fr) |
| WO (1) | WO2009043921A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110124019B (zh) * | 2019-04-22 | 2022-09-23 | 海南医学院 | 细菌化肿瘤细胞疫苗及其制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2743086B1 (fr) * | 1995-12-27 | 1998-03-27 | Pasteur Institut | Transfert de genes dans des cellules eucaryotes a partir de bacteries e. coli |
-
2007
- 2007-10-02 EP EP07301425A patent/EP2045331A1/fr not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-10-02 CA CA2701542A patent/CA2701542A1/fr not_active Abandoned
- 2008-10-02 WO PCT/EP2008/063262 patent/WO2009043921A1/fr active Application Filing
- 2008-10-02 EP EP08836217A patent/EP2205747A1/fr not_active Withdrawn
- 2008-10-02 US US12/681,085 patent/US20100216233A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See references of WO2009043921A1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2045331A1 (fr) | 2009-04-08 |
| CA2701542A1 (fr) | 2009-04-09 |
| US20100216233A1 (en) | 2010-08-26 |
| WO2009043921A1 (fr) | 2009-04-09 |
| WO2009043921A9 (fr) | 2010-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8093025B2 (en) | Bacterial vector | |
| Grillot-Courvalin et al. | Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells | |
| US11634720B2 (en) | Yeast producing tyrosol or hydroxytyrosol, and construction methods thereof | |
| WO2002072846A9 (fr) | Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg | |
| WO1992001801A1 (fr) | Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus | |
| WO1993015212A1 (fr) | Mutant attenue de listeria monocytogenes; souche recombinante de listeria monocytogenes, utilisation comme vecteurs heterologues d'antigene vaccinal et utilisation comme vaccin ou composition diagnostique | |
| FR3081881A1 (fr) | Outil genetique optimise pour modifier les bacteries du genre clostridium | |
| JP2022512695A (ja) | 産物、使用及び方法 | |
| FR2738842A1 (fr) | Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique | |
| CN109609427B (zh) | 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法 | |
| FR2920158A1 (fr) | Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques | |
| FR2500847A1 (fr) | Marqueurs genetiques selectifs pour cellules eucaryotes, procede de mise en oeuvre de tels marqueurs et application des cellules contenant un tel marqueur a la fabrication de proteines determinees apres leur transformation par un adn correspondant | |
| EP1404847B1 (fr) | Methode de stabilisation d'un plasmide en deletant in vivo la resistance a l'antibiotique et en selectionnant avec un gene essentiel | |
| EP2205747A1 (fr) | Souches e. coli attenuees invasives et leurs applications comme vecteur intracellulaire de molecule therapeutique | |
| EP1124983B1 (fr) | Procede de production in vivo de proteines chimiquement diversifiees par incorporation d'acides amines non conventionnels | |
| EP1315822A2 (fr) | Vecteurs d'expression comprenant un fragment modifie de l'operon tryptophane | |
| EP3601545B1 (fr) | Production d'arn par des levures a particules pseudo-virales recombinantes | |
| EP3898970A1 (fr) | Bacteries clostridium genetiquement modifiees, preparation et utilisations de celles-ci | |
| WO1995032296A1 (fr) | Vecteurs navettes pour l'introduction d'adn dans des mycobacteries et utilisation de ces bacteries comme vaccins | |
| FR2743086A1 (fr) | Transfert de genes dans des cellules eucaryotes a partir de bacteries e. coli | |
| EP1280890B1 (fr) | Souches mutantes capables de produire des proteines chimiquement diversifiees par incorporation d'acides amines non conventionnels | |
| WO1990010071A1 (fr) | Expression de sequences de nucleotides codant pour des vesicules a gaz | |
| Lim | Towards delivery of DNA into mammalian mitochondria by bacterial conjugation | |
| CN117305340A (zh) | 一种基于内源I-C型CRISPR-Cas系统的短双歧杆菌基因编辑系统及其应用 | |
| Marchand | Etude des déterminants génétiques de l'antibiose de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUAI | Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase |
Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012 |
|
| 17P | Request for examination filed |
Effective date: 20100430 |
|
| AK | Designated contracting states |
Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR |
|
| AX | Request for extension of the european patent |
Extension state: AL BA MK RS |
|
| DAX | Request for extension of the european patent (deleted) | ||
| 17Q | First examination report despatched |
Effective date: 20130129 |
|
| STAA | Information on the status of an ep patent application or granted ep patent |
Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN |
|
| 18D | Application deemed to be withdrawn |
Effective date: 20130503 |