EP2162532A2 - Cellules fixatrices de cellules tumorales - Google Patents

Cellules fixatrices de cellules tumorales

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Publication number
EP2162532A2
EP2162532A2 EP08806116A EP08806116A EP2162532A2 EP 2162532 A2 EP2162532 A2 EP 2162532A2 EP 08806116 A EP08806116 A EP 08806116A EP 08806116 A EP08806116 A EP 08806116A EP 2162532 A2 EP2162532 A2 EP 2162532A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
tumor
cell
protein
compounds
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08806116A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Massoud Mirshahi
Loic Vincent
Pezhman Mirshahi
Jeannette Soria
Jean-Pierre Marie
Arash Rafii Tabrizi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Pierre et Marie Curie
Original Assignee
Universite Pierre et Marie Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre et Marie Curie filed Critical Universite Pierre et Marie Curie
Publication of EP2162532A2 publication Critical patent/EP2162532A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a new type of cells that bind tumor cells in vivo and in vitro, and to the use of these cells for the screening of anti-tumor compounds.
  • resistance factors include efflux mechanisms (eg via MDR channels; Multi Drug Resistance), inactivation of antitumor agents (eg, resistance to antipyrimidine, anti-metabolic agents, etc.), mutation of anti-tumor agents (for example a mutation of topoisomerase), resistance to apoptosis (for example due to p53 mutation, overexpression of bcl-2, etc.).
  • efflux mechanisms eg via MDR channels; Multi Drug Resistance
  • inactivation of antitumor agents eg, resistance to antipyrimidine, anti-metabolic agents, etc.
  • mutation of anti-tumor agents for example a mutation of topoisomerase
  • resistance to apoptosis for example due to p53 mutation, overexpression of bcl-2, etc.
  • tumor stem cells would be present in solid tumors. These tumor stem cells are thought to be more resistant to anti-cancer treatments and to cause resistance and recurrence (Dean et al., (2005) Nature Rev. Cancer 5: 275-284).
  • the present invention relates to an isolated cell capable of binding tumor cells and expressing the CD10 protein.
  • This cell which is capable of fixing the tumor cells has been named “Hospicell” by the inventors and is also referred to as “fixing cell” or “protective cell” in the present description.
  • an isolated cell of the invention to bind tumor cells can be demonstrated by many techniques well known to those skilled in the art. It is thus possible to cite a method in which (i) cells of the invention are fixed on the walls of a container, (ii) tumor cells expressing a fluorescent protein are added to the container, (iii) washing is performed. container, and (iv) the fluorescence emitted by the container is measured, which is compared with that emitted by a control container on the walls of which cells of the invention have been fixed but to which no tumor cell has been added. The ability to bind tumor cells is proven when the measured fluorescence value for the cells tested is greater than that of the cells of the control container.
  • Such a method is illustrated in the following Examples. It is also possible to use methods using direct observations by optical or electron microscopy, as illustrated in Example 4 and in FIGS. 1 to 3, in which tumor cells are observed to be in membrane contact with cells. of the invention.
  • the cells of the invention are capable of binding tumor cells, such as, for example, leukemic cells, breast cancer cells or ovarian cancer cells.
  • tumor cells such as, for example, leukemic cells, breast cancer cells or ovarian cancer cells.
  • these cells are generally large (ie about fifty times the size of a tumor cell) and are preferably capable of binding up to 200 tumor cells simultaneously.
  • the "CD10 protein” (reference in the International Classification of Enzymes: EC 3.4.24.11) is also known as Neprilysin, Neutral endopeptidase 24.11, or Common Acute Lymphocytic Leukemia Antigen (CALLA). It is a membrane metallo-peptidase that preferentially cleaves polypeptides having less than 30 amino acids between basic residues. It has been described as being present on the surface of a limited number of normal or malignant lymphoid progenitors and on certain epithelial cells, mainly in the kidney. It is described in particular in Shipp et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4819-4823 and under the reference P08473 in the UniProtKB database. By way of example, the CD10 protein is represented by SEQ ID NO: 1.
  • CD10 protein can be determined either by detection of its mRNA, or RNA precursors thereof, or by detection of the protein itself.
  • the detection of CD10 mRNA, or of its precursors can be carried out by various techniques well known to those skilled in the art, such as RT-PCR for example.
  • the detection of the protein itself can also be achieved by various techniques well known to those skilled in the art.
  • the detection of the protein itself involves specific CD10 ligands, such as antibodies, which can be implemented in techniques such as flow cytometry, immunohistochemistry or immunocytochemistry.
  • the level of expression of the CD10 protein is such that it is considered to be strong by the pathologist of the art when it is evaluated, according to standard pathology techniques, on samples included in paraffin. using anti-CD10 antibodies labeled with peroxidase.
  • the cell as defined above expresses an MDR protein.
  • MDR protein refers to a membrane protein carrying active transport of at least one drug and thus capable of conferring multiple drug resistance (Multi-Drug Resistance) to the cell that expresses it.
  • MDR proteins are in particular described in Stavrovskaya (1999) Biochemistry (Moscow) 65: 95-106.
  • the MDR protein is an ABC-like protein that transports drugs from the cytoplasm of the cell that expresses it to the extracellular medium.
  • the ABC proteins are characterized in that they comprise at least one adenosine triphosphate (ATP) binding moiety known as ATP Binding Cassette (ABC) and are well known to those skilled in the art.
  • ATP adenosine triphosphate
  • ABSC ATP Binding Cassette
  • the ABC-type MDR proteins are selected from the proteins of the ABCB, ABCC and ABCG subfamilies.
  • the MDR protein is chosen from the group consisting of the LRP protein (Lung Resistance Protein, also called Major Vault Protein (MVP)), the MDR1 protein (MultiDrug Resistance 1, also called ABCB1, or P-glycoprotein (Pgp)).
  • MRP1 also called ABCC2 protein
  • MRP2 protein also called ABCC3
  • MRP5 protein Resistance protein also named ABCG2 or Breast Cancer Resistance Protein (BCRP)).
  • the MDR protein is selected from the group consisting of LRP protein, MDR1 protein, MRP1 protein, and MXR protein.
  • the cell as defined above expresses both the LRP protein and the MDR1 protein. Even more preferably, the cell as defined above expresses both the LRP protein, the MDR1 protein, the MRP1 protein, and the MXR protein.
  • the LRP protein is especially represented by SEQ ID NO: 2.
  • the MDR1 protein is especially represented by SEQ ID NO: 3.
  • the MXR protein is especially represented by SEQ ID NO: 4.
  • the MRP1 protein is especially represented by SEQ ID NO: 5.
  • the expression of the MDR protein can be determined either by detecting its mRNA, or RNA precursors thereof, either by detecting the protein itself.
  • the detection of 1 mRNA of the MDR protein, or its precursors can be carried out by various techniques well known to those skilled in the art, such as RT-PCR for example. Detection of the protein itself may also be accomplished by various techniques well known to those skilled in the art.
  • the detection of the protein itself uses ligands specific for the MDR protein, such as antibodies, which can be used in techniques such as flow cytometry, immunohistochemistry or immunocytochemistry.
  • an MDR protein When measured in flow cytometry, the level of expression of an MDR protein can be evaluated as follows:
  • Legrand et al. (2001) Blood 97: 502-508 describe the application of the Kolmorogov-Smirnov test to the evaluation of Pgp protein expression.
  • the expression level of the MDR proteins by the cells of the invention is preferably greater than 0.15, more preferably greater than 0.15. 0.2.
  • the average level of expression, by the cells of the invention, given as indicated above by means of the Kolmorogov-Smirnov test is:
  • the level of expression of the MDR protein is such that it effectively confers on the cell that expresses it the resistance to a drug that this protein is capable of conferring, when this cell is placed in the presence of a amount of normally toxic drug for a cell of same type not expressing the MDR protein. This will be referred to here as an effective level of expression to confer resistance.
  • the isolated cell as defined above is capable of transferring one or more copies of the MDR protein that it expresses to the tumor cells that it fixes, in particular by trogocytosis.
  • thyroidocytosis refers to the phenomenon of transfer of molecules from one cell to another, in particular described by JoIy & Hudrisier (2003) Nature Immunol. 4: 815.
  • MDR protein transfer from an isolated cell of the invention to a tumor cell can be demonstrated in various ways well known to those skilled in the art. For example, it is possible in particular to carry out an immunodetection of MDR protein expressed by tumor cells before and after bringing into contact with cells of the invention.
  • the isolated cell as defined above does not express the following markers: cytokeratin and EMA (Epithelial Membrane Antigen)
  • CD20 hematopoietic cell marker, such as granulocytes, monocytes, and B and T lymphocytes
  • CD20 hematopoietic cell marker, such as granulocytes, monocytes, and B and T lymphocytes
  • CD3 T cell specific
  • CD68 specific for macrophages and histiocytes
  • CD34 specific for bone marrow stem cells
  • S100 protein specific for melanocytes
  • myeloperoxidase specific for lineages polynuclear
  • the isolated cell as defined above is capable of having pseudopodia and / or filopodia.
  • pseudopodia refers to evaginations of the plasma membrane of the cell.
  • the pseudopodia can for example be visualized by optical microscopy, confocal, or electronic.
  • the isolated cell as defined above comes from:
  • bone marrow stem cells are characterized by expression of the CD34 + marker and / or CD133 + marker.
  • effusion is meant a biological fluid that accumulates in a cavity or tissue that normally does not contain it.
  • an ascites fluid for example a patient with ovarian or pancreatic cancer
  • a pleural fluid for example a patient with breast cancer
  • the isolated cell as defined above does not derive from cancer cells extracted from an individual.
  • the isolated cell as defined above has been immortalized.
  • the isolated cell as defined above can be immortalized by any technique known to those skilled in the art. Examples include, but are not limited to, the use of SV 40 T antigen, the use of the EIA region of the genome of adenovirus 2, the use of oncogenes as c- myc or Ha-ras, or the use of human telomerase reverse transcriptase (hTRT) or a sequence that activates the endogenous hTRT gene.
  • hTRT human telomerase reverse transcriptase
  • the immortalization is performed using the SV40 virus T antigen.
  • the isolated cell as defined above comes from a cell culture deposited on June 20, 2006 under the Budapest Treaty to the CNCM under number 1-3627.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a cell capable of binding tumor cells, said method comprising the steps of: a) culturing bone marrow mononuclear cells or bone marrow stem cells for a period of time and a medium suitable for cell differentiation; b) optionally removing the monocytes from the cells obtained in step a) when the cultured cells are mononuclear bone marrow cells; c) incubating the cells obtained in step a) and optionally in step b) with tumor cells, removing non-fixed tumor cells, and recovering the cells to which the tumor cells are attached.
  • Mononucleated bone marrow cells can in particular be isolated from bone marrow by centrifugation gradient on Ficoll. Prior to their culture in step a) it is possible to remove monocytes from bone marrow mononuclear cells.
  • bone marrow stem cells in particular CD34 + and / or CD133 +, it is possible, for example, to isolate them by immunofixation using anti-CD34 or anti-CD133 antibodies.
  • a stain cell or bone marrow mononuclear cell culture medium can be used in step a).
  • This culture is preferably carried out in bottles previously coated with 0.2% gelatin.
  • examples include, but are not limited to, MV2 media, HEM (HEPES buffered Eagles medium), DMEM (Dulbecco's modified Eagles medium), GMEM (Glasgow modification of medium Eagles), F-12 etc.
  • MV2 medium ECBM MV2, Promocell, Heidelberg, Germany
  • MV2 medium ECBM MV2, Promocell, Heidelberg, Germany
  • Growth factors can be selected, but not limited to, fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), endothelial vascular cell growth (VEGF), transforming growth factor (TGF- ⁇ ), stem cell growth factor (SCGF), platelet derived growth factor (PDGF) or their derivatives, combinations of these factors being preferably used.
  • FGF fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • VEGF insulin-like growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • SCGF stem cell growth factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • the culture medium may contain fetal calf serum, chicken serum or equine serum.
  • the culture medium may also contain antibiotics to prevent the contamination with yeasts, bacteria or fungi such as penicillin, streptomycin, gentamicin and their derivatives.
  • antibiotics such as penicillin, streptomycin, gentamicin and their derivatives.
  • the non-adherent cells are removed and the cells reincubated in the same medium.
  • the cells are then cultured for a preferential duration of approximately 4 weeks, until the cells are differentiated into endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts and other cells, including those desired.
  • step c) the cells cultured in step a) are incubated with tumor cells.
  • this step is carried out by recovering the adherent cells cultured in step a), and incubating them with tumor cells suspended in a suitable medium, such as RPMI or DMEM medium.
  • the tumor cells used may be any type of tumor cells.
  • the tumor cells are HL60 cells (human leukemia line).
  • the incubation time of cultured cells and tumor cells varies from 30 minutes to about 4 hours, preferably about 2 hours.
  • the incubation temperature is preferably 37O.
  • step c) the non-fixed tumor cells are removed generally by rinsing with culture medium (optionally the same, such as RPMI medium) or with any type of washing solution well known to those skilled in the art.
  • culture medium optionally the same, such as RPMI medium
  • washing solution any type of washing solution well known to those skilled in the art.
  • the cells to which the tumor cells are attached are then recovered, preferably by very short-term centrifugation from 3000 rpm to 6000 rpm.
  • the tumor cells are detached from the agglomerate formed by said cell on which residual tumor cells are fixed, by an enzymatic or non-enzymatic treatment (trypsin, Accutase ®, or 2 mM EDTA followed by stirring very vigorous and several washes with a buffer such as PBS).
  • an enzymatic or non-enzymatic treatment trypsin, Accutase ®, or 2 mM EDTA followed by stirring very vigorous and several washes with a buffer such as PBS).
  • the mononuclear cells are placed on a solid support, such as Petri dishes, or cultured on a solid support (for example). gelatin-coated plates) in a suitable medium as defined previously. After about 15 to 30 minutes of incubation, the monocytes adhere to the support and cells that have not yet adhered are collected.
  • tumor cells preferably HL60 cells (10 6 HL60 cells / 2 ⁇ 10 5 adherent cells) and the binding capacity is observed. tumor cells on the fixing cells.
  • the present invention also relates to a method for obtaining a cell capable of binding tumor cells, said method comprising the steps of: a) culturing cells from an effusion of a patient with cancer; b) optionally removing the monocytes from the cells obtained in step a); c) incubating the cells obtained in step a) or b) with tumor cells, removing non-fixed tumor cells, and recovering the cells to which the tumor cells are attached; or d) depositing the cells obtained in step a) or b) on a solid support and recovering the cells which adhere more rapidly to said support.
  • cells from an effusion are isolated prior to culturing in step a. More preferably, these cells from an effusion are freed of monocytes prior to their culture in step a).
  • the culture medium used may be any cell culture medium known to those skilled in the art.
  • the culture medium may contain growth factors, such as those mentioned above, supplements required for the metabolism of the cell, such as amino acids, vitamins such as ascorbic acid, minerals and proteins such as transferrin and their derivatives.
  • the culture medium may contain fetal calf serum, chicken serum or equine serum.
  • the culture medium may also contain antibiotics to prevent contamination with yeasts, bacteria or fungi such as penicillin, streptomycin, gentamicin and their derivatives. In these conditions, the fixing cells are highlighted from the first days of culture (1 to 4 days).
  • Steps b) and c), as well as removal of monocytes prior to step a), may be performed as described above for bone marrow mononuclear cells or bone marrow stem cells.
  • the cells are deposited on a solid support.
  • the cells which have attached to said support are preferably treated with Accutase® and the cells which detach themselves from the support are recovered as quickly as possible.
  • the cells that come off in 5 min are recovered.
  • the support, on which the cells are fixed can be any type of solid support well known to those skilled in the art.
  • a solid support there may be mentioned glass, plastic, metals, resins or other suitable solid supports on which cells may be attached.
  • the term "solid support” also includes materials considered as semi-solid carriers.
  • the solid support can take any suitable form, such as a ball or a microparticle, a tube, a petri dish, a microscope slide, etc.
  • tumor cells preferably HL60 cells (10 6 HL60 cells / 2 ⁇ 10 5 adherent cells) and the binding capacity is observed. tumor cells on the fixing cells.
  • the cells obtained can be immortalized, in particular as described above.
  • the invention also relates to a cell that can be obtained by one of the processes described above.
  • the present invention relates to the use of isolated cells as defined above or of cells that can be obtained by one of the methods described above, for screening anti-tumor compounds.
  • anti-tumor compounds is meant here any compound for preventing and / or slowing tumor progression.
  • anti-tumor compounds are compounds inducing or facilitating, directly or indirectly, the death of tumor cells. More particularly, the anti-tumor compounds according to the invention can induce or facilitate the death of cells protecting tumor cells in vivo.
  • the present invention thus relates to a method for screening anti-tumor compounds, in which:
  • the compounds inducing a decrease in cell growth or an increase in the cell death of the cells placed in contact with respect to identical cells which have not been brought into contact with the compounds to be screened are selected.
  • the compounds screened by this method specifically target the cells according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for screening anti-tumor compounds, wherein:
  • a co-culture of isolated cells as defined above or of cells which can be obtained by one of the processes described above and of tumor cells are brought into contact with compounds to be screened; the cell growth and the cell death of the tumor cells of the co-culture contacted with the compounds to be screened are determined;
  • the compounds inducing a decrease in cell growth or an increase in cell death of the tumor cells are selected co-culture with respect to tumor cells in co-culture with isolated cells as defined above or cells that can be obtained by one of the methods described above which have not been used. in contact with the compounds to be screened.
  • this method makes it possible to select compounds with an anti-tumor action which is not impeded by the antitumor resistance provided by the cells of the invention.
  • the present invention also relates to a method for screening anti-tumor compounds, in which: compounds to be screened are contacted with isolated cells as defined above or cells obtainable by one methods described above and tumor cells;
  • the quantity of tumor cells that have been fixed by the isolated cells as defined above or the cells that can be obtained by one of the processes described above is determined;
  • the compounds inducing a decrease in the quantity of tumor cells that have been fixed by the isolated cells as defined above or the cells that can be obtained by one of the processes described above, with respect to quantity of tumor cells that have been fixed by the isolated cells as defined above or the cells that can be obtained by one of the processes described above in the absence of the compounds to be screened.
  • This method advantageously makes it possible to select compounds that inhibit the binding of tumor cells by the cells of the invention and thus the protection that the cells of the invention confer on the tumor cells. These compounds thus increase the sensitivity of tumor cells to anti-tumor compounds.
  • cell death is meant apoptosis, necrosis or any other mechanism inducing cell death.
  • the ability of the candidate compound to induce cell death by apoptosis is determined.
  • any techniques well known to those skilled in the art can be employed. Examples include, but are not limited to, the following techniques: annexin V labeling, use of blue trypan, propidium iodide use, TUNEL (Nick End Labeling Transferase) assay, evaluation of DNA degradation products, caspase measurement (quantitative and activity-based assessment), etc.
  • the tumor cells used may be any tumor cell.
  • the tumor cells are HL60 cells (human leukemia line) or MDA-MB 231 cells (human breast cancer line) or the patient's own cells (for example ovarian cancer).
  • the compound to be screened can be any compound of natural or synthetic origin, whether it is already marketed as a chemotherapeutic agent, or in the course of development or characterization. It may be a mixture of several molecules identified or not, such as an animal or vegetable extract.
  • the cells according to the invention can be easily implemented in high throughput screening (HTS) protocols in order to optimize the current methods of searching candidate compounds effective for antitumor therapy in general.
  • HTS high throughput screening
  • the cells of the invention are also useful for testing the efficacy of candidate compounds for anti-tumor therapy for a given individual, in order to provide the most appropriate therapy for each individual suffering from cancer.
  • the fixing cells used in the screening test come from the patient himself.
  • the present invention also relates to an in vitro method for diagnosing cancer, in which the presence of isolated cells as defined above is determined in a sample from a tissue suspected to contain a tumor, the presence of isolated cells as defined above being indicative of the presence of a tumor.
  • the presence of cells according to the invention in the tissue generally involves the presence of tumor cells nearby.
  • FIGS. 1 and 2 are optical microscopy photographs (objective 20) of hospicells (obtained by differentiation of CD34 + bone marrow stem cells), brought into contact with HL60 cells, after 4 hours of incubation (FIG. after 36 h of incubation ( Figure 2).
  • Figure 3 is an optical micrograph (objective 20) of hospicells of the ascites fluid of a patient with ovarian cancer, after addition of HL60 cells in the fluid.
  • Figure 4 is an electron micrograph of an MDA cell adhering to a hospicell.
  • Figures 5 and 6 are graphs showing the influence of fixative cells on the sensitivity of HL60 cells to aracytin (AraC) or daunorubicin (DNR) ( Figure 5) and fixative cells ("hospicells”) to these drugs ( Figure 6).
  • Figure 7 is a graph showing the sensitivity of the fixative cells to different known agents used in antitumor therapy.
  • Figure 8 represents the amount of fluorescence emitted by OVCAR3 cells (Y axis, arbitrary units) expressing GFP, grown with hospicells (first column), alone (second column), with OVCAR3 cells not expressing GFP (third column), with fibroblasts (fourth column), or with HBMEC (fifth column), in the absence or presence of carboplatin and / or paclitaxel.
  • Figure 9 represents the amount of fluorescence emitted by OVCAR3 cells (Y axis, arbitrary units) expressing GFP, grown with hospicells (first column), alone (second column), with hospicells in a transwell system (third column ), in the absence or presence of carboplatin and / or paclitaxel.
  • Example 1 Obtaining hospicells from bone marrow stem cells.
  • CD34 + cells were isolated from normal (or pathological) bone marrow sample by density gradient centrifugation in Ficoll-400.
  • the cells thus isolated were distributed in a culture flask covered with 0.2% gelatin and were cultured in MV2 medium (ECBM MV2, Promocell, Heidelberg, Germany) supplemented with Amphotericin B 50 ng / ml, Gentamicin 50 ⁇ g / ml, ascorbic acid 1 ⁇ g / ml, human fibroblast growth factor (h-FGF) 10 ng / ml, human epidermal growth factor (h-EGF) 5 ng / ml , Long R3 IGF-1 (Insulin Growth Factor Analog) 20 ng / ml, human vascular endothelial cell growth factor (h-VEGF) 10 ng / ml and fetal calf serum 5%. After 6 days of culture, the non-adherent cells were removed and the adherent cells were cultured for 3
  • the adherent cells thus obtained were washed with RPMI and then detached by rapid incubation with Accutase®.
  • the cells thus detached were washed with RPMI then
  • HL60 cells were resuspended in RPMI containing glutamine and antibiotics and then incubated with immortalized HL60 cells of leukemic origin. After incubation for 120 min at 4 ° C under With gentle agitation, the cell suspension was centrifuged at 6000 rpm for a few seconds ("centrifugation point"), the hospicells having fixed the HL60 cells in the centrifugation pellet. The cells having sedimented in the bottom of the tube were resuspended in a culture medium (RPMI + fetal calf serum + Glutamine + antibiotics) and distributed in plates coated with 0.2% gelatin.
  • RPMI + fetal calf serum + Glutamine + antibiotics fetal calf serum + Glutamine + antibiotics
  • the cells detaching in 5 min are cells that fix the HL60 cells, while the cells detaching in 10 min and 15 min are cells that do not fix the HL60 cells.
  • the cells detaching in 5 min were recovered and were distributed on another plate 6 wells covered with gelatin. In one of the wells, HL60 cells were added and after incubation, the cells were washed and the operation of fixing the HL60 cells was renewed. Finally, Accutase ® was added to the wells and the stalling cells within 5 min were recovered and cultured in complete RPMI medium.
  • the cells obtained under these conditions are cells of the invention or "Hospicells".
  • Example 2 Obtaining hospicells from the ascites fluid of a patient with ovarian cancer.
  • the ascites fluid of a patient with ovarian cancer was removed using a biopsy trocar.
  • Mononuclear cells of ascites were isolated by centrifugation gradient on Ficoll. Mononuclear cells thus isolated were distributed in the wells of a culture plate. After 30 minutes of incubation, the monocytes adhere to the plastic and the cells that have not yet adhered were collected and placed in a culture plate coated with gelatin. The hospicells were then isolated as described in Example 1.
  • the hospicells could also be obtained directly from ascites by placing in a gelatin-coated culture plate a small cluster of cells present in ascites suspended in RPMI enriched in fetal calf serum, glutamine and antibiotics. .
  • hospicells were obtained from cell aggregates in the ascites fluid from patients with stage III ovarian cancer. Briefly, the ascites fluid was centrifuged to obtain a cell pellet. The cell pellet was cleared of lymphocytes and erythrocytes by centrifugation gradient on Ficoll, and aggregates of hospicells and ovarian cancer cells were separated by dilution. The hospicells were then detached from the ovarian cancer cells by tryptic digestion.
  • cytokeratin KL1 antibody, Beckman Coulter
  • EMA E29 antibody, Dako
  • vimentin V9 antibody, Beckman Coulter
  • CD45 Antibodies 2b11 and PD7 / 26, Dako
  • CD20 Antibody L26, Dako
  • CD3 Antibody SP7, Neomarkers
  • CD68 KP1 and PG-M1 antibody, Dako) (specific for macrophages and histiocytes)
  • CD34 OBendiO antibody, Dako) (specific for blood stem cells), protein S100 (polyclonal antibody, Dako) (specific for melanocytes), myeloperoxidase (polyclonal antibody, Dako) (specific for polynuclear line
  • the immunohistochemistry was performed on paraffin sections of 4 microns thick.
  • a technique for the preliminary recovery of the antigen based on heating in EDTA buffer (pH 8) was carried out before incubation with the antibody.
  • the antibody at the appropriate dilution was incubated for 30 min and then revealed using a streptavidin-biotin complex.
  • the sections were then counter-stained with hematoxylin.
  • the whole technique was implemented automatically on an Autostainer system (Dako).
  • Example 4 Demonstration of the attachment of cancer cells to hospicells.
  • HL60 cells adhere to hospicells and form cell clusters in the culture medium. After 4 hours fixation of 4-8 cells was observed on the fixative cells ( Figure 1). After 36 h, nodules of malignant cells formed around the hospicells ( Figure 2).
  • Ascites fluid from a patient with ovarian cancer was collected using a biopsy trocar.
  • the hospicells could also be obtained directly from ascites by placing in a gelatin-coated culture plate a small cluster of cells present in ascites suspended in RPMI enriched in fetal calf serum, glutamine and antibiotics. .
  • the cell clusters of fixative cells already present in the ascites fluid having fixed tumor cells were observed by light microscopy. Part of this liquid was cultured in RPMI medium enriched in fetal calf serum, glutamine and in the presence of HL60 cells for 1 day.
  • Figure 3 shows the joint attachment of ovarian cancer cells and added HL60 cells to the fixative cells.
  • hospicells obtained from ascitic fluid cell aggregates showed particular structures in light microscopy. These cells develop long pseudopods that form a sort of "cell net”.
  • an interaction of hospicells with ovarian cancer cells is visible in confocal microscopy.
  • hospicells appear as large cells that can interact with multiple cancer cells at the same time, providing a kind of hammock for cancer cells.
  • an immunohistochemistry experiment performed on peritoneal biopsies of patients with ovarian cancer using the CD10 marker demonstrates the presence of hospicells around aggregates of cancer cells, the hospicells forming a net around aggregates.
  • the inventors have sought to highlight the mechanisms of action underlying the interaction between hospicells and tumor cells.
  • HL60 cells were separately deposited and in the same amount in 6 different wells containing RPMI complete medium and fixative cells adhered to the support.
  • the ratio between tumor cells and hospicells was 5: 1.
  • the non adhered HL60 cells were recovered and counted.
  • the percentage of HL60 cells adhering to hospicells was then calculated for each condition.
  • MDA-MB231 cells previously labeled with rhodamine were incubated in RPMI complete medium under 3 different conditions:
  • MDA cells of each condition were separately deposited and in identical amount (5 cancer cells per hospicell) in 3 different wells containing RPMI medium and hospicells adhered to the support. After incubation for 2 hours at 4 ° C, the non-adhered MDA cells were removed and the amount of cells adhered to the hospicells was determined for each condition by measuring the fluorescence using a plate fluorimeter (Victor fluorometer).
  • CXCR4 modulates the expression of integrins on the surface of MDA tumor cells, integrins that are likely to play a role in the attachment of tumor cells to the cells of the invention.
  • HL60 cells cultured with hospicells in RPMI medium were treated for 5 days with either aracytin (AraC) or daunorubicin (DNR). After 5 days of treatment, the drug was removed and the cells were replated in fresh medium.
  • AraC aracytin
  • DNR daunorubicin
  • the number of live HL60 cells was measured evaluated throughout the experiment using the image analysis system.
  • Free HL60s do not grow while it is noted that on hospicells, live HL60 cells are identifiable. This effect of "repels" cells is more important with aracytin than with daunorubicin, difference related to the toxicity of daunorubicin for hospicells.
  • Immortalized hospicells were incubated in RPMI medium with Adriblastine, Bleomycin, Deticene, Fluorouracil, Navelbine, Taxotere or Leustatin for 1 to 3 days.
  • the cells were then detached by Accutase ® and the number of apoptotic cells detected by annexin V. We then determined the percentage of apoptotic cells by flow cytometry (Figure 7). The results show that hospicells are not very sensitive to the action of many drugs.
  • OVCAR3 cells expressing GFP were obtained by transfection from an RRV virus (Ross River Virus) carrying the VSV-G protein and containing the GFP coding sequence obtained essentially as described in De Vos et al. (2003) Human Gene Ther. 10: 1727-1739.
  • OVCAR3 cells were plated in 35 mm diameter culture dishes 24 h before transfection. The cells were then transfected with the viruses with a multiplicity of infection of 100: 1, the titre of the viral solution having been determined on NIH 3T3 cells as described by Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037. 48 hours after transfection the expression of GFP was monitored by flow cytometry on a FACScan device (Becton Dickinson).
  • the adhesion tests were conducted as follows. 96-well cell culture dishes containing 0.2% gelatin were coated with hospicells at 70% confluency. OVCAR3 cells expressing GFP were then seeded at 5.10 4 cells per well in 200 ⁇ L of serum-free medium and allowed to adhere for 2 hours at 37 ° C. The non-adherent cells were removed by gentle washing with PBS, followed by The amount of adherent cells was determined by measuring the fluorescence of each well using a Wallac Flite fluorometer (reading at 560 nm) For each condition, the average cell density and the standard deviation were calculated at from the data obtained for 6 wells The experiments were repeated 4 times.
  • the inventors examined the extent to which hospicells can confer chemo-resistance to the cells to which they bind. Briefly, hospicells were grown to 60% confluency. 2.10 4 OVCAR3 cells expressing GFP were then co-cultured with the hospicells for 24 hours before being placed in contact with a chemotherapeutic agent (carboplatin 22.2 ⁇ M and paclitaxel 1.4 ⁇ M). The chemotherapeutic effect was determined using the quantitative colorimetric sulphorhodamine B (SRB) assay as described by Skehan et al. (1990) J. Natl. Cancer
  • SRB quantitative colorimetric sulphorhodamine B
  • MDR1 protein has been implicated in the acquisition, among others, of paclitaxel chemoresistance in tumor cells. Therefore, the expression of MDR proteins by hospicells was then examined.
  • the hospicells were deposited on glass slides in 6-well plates (Nunc) at a density of 8 ⁇ 10 4 cells / well in RPMI medium at 10% FCS. 48 hours later the cells were deprived of serum for 48 hours. The hospicells were then fixed with 3% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS. The hospicells were then incubated overnight at 4 ° C in 1% PBS-BSA-Triton with primary antibodies to the MDR proteins followed by a biotinylated secondary antibody and fluorescein-associated streptavidin (Molecular Probes).
  • MRP1, MRP2, MRP3, MXR, and LRP were provided by Alexis, and antibodies to MDR1 were provided by Immunotech, and the hospicells were then observed on a microscope.
  • MDR protein expression was determined with the same antibodies as above, using the Intraprep permeabilization kit (Beckman-Coulter) according to the supplier's instructions, on a cytometry machine. Altra EPICS stream (Beckman Coulter).
  • the immunofluorescence results indicate the expression of MDR1, LRP and MXR by hospicells.
  • the flow cytometry data show that the MDR1, MRP1, MRP2, MRP3, MXR and LRP proteins are expressed by the hospicells (Table 1), with a particularly high level of expression of the MDR1 and LRP proteins, which are both known to be involved in resistance to carboplatin and paclitaxel.
  • the level of expression is determined by relating the mean fluorescence intensity measured using the anti-MDR antibody to that measured in the presence of an antibody of the same isotype as the anti-MDR but not exhibiting specificity with regard to hospicells, then applying the Kolmorogov-Smirnov test (Legrand et al (2001) Blood 97: 502-508). Protein MDR Level of protein expression (Kolmorogov-Smirnov)
  • MDR proteins The role of MDR proteins in the chemoresistance conferred by hospicells was confirmed by repeating the above experiments of co-cultures of hospicells and OVCAR3 cells in the presence of carboplatin and paclitaxel, and adding Verapamil to the culture medium. (1.4 ⁇ M), an inhibitor of the MDR1 protein.
  • the results obtained indicate the presence of the MDR1 protein by the OVCAR3 cells. Therefore, the transfer of MDR proteins between hospicells and tumor cells is possible. Moreover, this transfer also occurs in the presence of a protein translation inhibitor (cycloheximidine A) suggesting active transfer from hospicells rather than activation of translation of these proteins into tumor cells. Finally, the inventors have been able to demonstrate that hospicells could transfer membrane fragments to the tumor cells with which they interact. For this, the inventors have modified the evaluation test for trogocytosis
  • the hospicells or OVCAR3 cells were stained with the green PKH67 lipophilic fluorophore according to the manufacturer's instructions.
  • the stained cells were then co-cultured with unstained cells for 0 min, 3 min, and 3 h, respectively.
  • the co-cultures were conducted in 96 well U-bottom culture plates with a final concentration of 6 ⁇ 10 5 cells in 120 ⁇ l of complete RPMI 1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • the culture plates were then centrifuged for 1 minute at 700 rpm to promote contact between cells and then maintained for 1 hour at 37 ° C. in a humid atmosphere at 5% CO 2.
  • the cells were washed twice in 0.5 PBS. mM EDTA and analyzed by flow cytometry using a LSRII device and DIVA software (BD Biosciences).

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Abstract

La présente invention concerne une cellule isolée capable de fixer des cellules tumorales, exprimant la protéine CD10 et exprimant au moins une protéine MDR, et l'utilisation de cette cellule pour le criblage de composés antitumoraux.

Description

Cellules fixatrices de cellules tumorales
La présente invention se rapporte à un nouveau type de cellules qui fixent les cellules tumorales in vivo et in vitro, et à l'utilisation de ces cellules pour le criblage de composés à visée anti-tumorale.
De nombreuses molécules cytotoxiques capables de tuer les cellules tumorales ont été identifiées par l'industrie pharmaceutique.
Néanmoins il s'est avéré qu'en thérapie oncologique, l'efficacité des molécules est réduite par un phénomène de résistance. Cette résistance aux agents anti-tumoraux demeure un obstacle majeur dans la réussite des traitements anti-cancéreux.
Plusieurs événements cellulaires ont été proposés comme facteurs de résistance. Ceux-ci incluent des mécanismes d'efflux (par exemple via les canaux MDR ; Multi Drug Résistance), une inactivation des agents anti-tumoraux (par exemple par une résistance aux agents antipyrimidique, anti métabolique etc.), une mutation des cibles des agents anti-tumoraux (par exemple une mutation de la topoisomérase), une résistance à l'apoptose (par exemple due à une mutation de p53, une surexpression de bcl-2, etc.).
Il a également été suggéré que des cellules souches tumorales seraient présentes dans les tumeurs solides. Ces cellules souches tumorales seraient plus résistantes aux traitements anti-cancéreux et seraient à l'origine de phénomènes de résistance et de récidive (Dean et al. (2005) Nature Rev. Cancer 5:275-284).
Aucun autre facteur de résistance extrinsèque à la cellule tumorale n'a été identifié jusqu'à présent. Les inventeurs sont maintenant parvenus à isoler un nouveau type de cellules qui fixent et protègent les cellules tumorales et qui constituent l'une des causes de la résistance des tumeurs face aux traitements.
Cellule fixatrice de cellules tumorales
La présente invention concerne une cellule isolée capable de fixer des cellules tumorales et exprimant la protéine CD10. Cette cellule qui est capable de fixer les cellules tumorales a été baptisée " Hospicell " par les inventeurs et est aussi désignée " cellule fixatrice " ou " cellule protectrice " dans la présente description.
La capacité d'une cellule isolée de l'invention à fixer des cellules tumorales peut être mise évidence par de nombreuses techniques bien connues de l'homme du métier. On peut ainsi citer une méthode dans laquelle (i) on fixe des cellules de l'invention sur les parois d'un récipient, (ii) on ajoute des cellules tumorales exprimant une protéine fluorescente au récipient, (iii) on effectue un lavage du récipient, et (iv) on mesure la fluorescence émise par le récipient, qui est comparée à celle émise par un récipient témoin sur les parois duquel ont été fixées des cellules de l'invention mais auquel aucune cellule tumorale n'a été ajoutée. La capacité à fixer des cellules tumorales est avérée lorsque la valeur de fluorescence mesurée pour les cellules testées est supérieure à celle des cellules du récipient témoin. Une telle méthode est illustrée dans les Exemples suivants. On peut également citer des méthodes faisant appel à des observations directes en microscopie optique ou électronique, comme cela est illustré dans l'Exemple 4 et dans les Figures 1 à 3, dans lesquelles on observe des amas des cellules tumorales en contact membranaire avec des cellules de l'invention.
Les cellules de l'invention sont capables de fixer les cellules tumorales, telles que par exemple des cellules leucémiques, des cellules du cancer du sein ou des cellules du cancer de l'ovaire. En général de grande taille (à savoir environ une cinquantaine de fois la taille d'une cellule tumorale), ces cellules sont de préférence capables de fixer jusqu'à 200 cellules tumorales simultanément.
La « protéine CD10 » (référence dans la classification internationale des enzymes : E. C. 3.4.24.11 ) est également connue sous les noms de Néprilysine, Neutral endopeptidase 24.11, ou Common Acute Lymphocytic Leukemia Antigen (CALLA). Il s'agit d'une metallo-peptidase membranaire qui clive préférentiellement des polypeptides présentant moins de 30 acides aminés entre des résidus basiques. Elle a été décrite comme étant présente à la surface d'un nombre restreint de progéniteurs lymphoides normaux ou malins et sur certaines cellules épithéliales, principalement au niveau du rein. Elle est notamment décrite dans Shipp et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 85:4819-4823 et sous la référence P08473 dans la base de donnée UniProtKB. A titre d'exemple, la protéine CD10 est représentée par SEQ ID NO : 1.
L'expression de la protéine CD10 peut être déterminée soit par détection de son ARNm, ou des précurseurs ARN de celui-ci, soit par détection de la protéine en elle-même. La détection de l'ARNm de CD10, ou de ses précurseurs, peut être réalisée par diverses techniques bien connues de l'homme du métier, comme la RT-PCR par exemple. La détection de la protéine en elle-même peut également être réalisée par diverses techniques bien connues de l'homme du métier. De préférence, la détection de la protéine en elle-même fait appel à des ligands spécifiques de CD10, tels que des anticorps, qui peuvent être mis en œuvre dans des techniques telles que la cytométrie de flux, l'immunohistochimie ou l'immunocytochimie.
De préférence le niveau d'expression de la protéine CD10 est tel qu'il est considéré comme fort par l'anatomo-pathologiste du métier lorsqu'il est évalué, selon les techniques classiques d'anatomo-pathologie, sur des échantillons inclus en paraffine à l'aide d'anticorps anti-CD10 marqués à la peroxydase.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la cellule telle que définie ci-dessus exprime une protéine MDR.
L'expression « protéine MDR » désigne une protéine membranaire réalisant un transport actif d'au moins une drogue et susceptible de conférer ainsi une résistance multiple aux drogues (Multi-Drug Résistance) à la cellule qui l'exprime. Les protéines MDR sont notamment décrite dans Stavrovskaya (1999) Biochemistry (Moscow) 65:95-106. De préférence, la protéine MDR est une protéine de type ABC qui transporte les drogues depuis le cytoplasme de la cellule qui l'exprime vers le milieu extracellulaire. Les protéines ABC sont caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un motif de liaison à l'adénosine triphosphate (ATP) nommé ATP Binding Cassette (ABC) et sont bien connues de l'homme du métier. Les protéines de type ABC sont notamment décrites dans Dean et al. (2001 ) J. Lipid Res. 42:1007-1017 et Szakacs et al. (2006) Nature Reviews Drug Discovery 5:219-234. Plus préférablement, les protéines MDR de type ABC sont choisies parmi les protéines des sous-familles ABCB, ABCC et ABCG. De préférence, la protéine MDR est choisie dans le groupe constitué par la protéine LRP (Lung Résistance Protein, également nommé Major Vault Protein (MVP)), la protéine MDR1 (MultiDrug Résistance 1, également nommé ABCB1 , ou glycoprotéine P (Pgp)), la protéine MRP1 (Multidrug Resistance-associated Protein 1, également nommée ABCC1 ), la protéine MRP2 (également nommée ABCC2), la protéine MRP3 (également nommée ABCC3), la protéine MRP5 (également nommée ABCC5), et la protéine MXR (MitoXantrone Résistance protein, également nommée ABCG2 ou Breast Cancer Résistance Protein (BCRP)). Plus préférablement, la protéine MDR est choisie dans le groupe constitué de la protéine LRP, de la protéine MDR1 , de la protéine MRP1 , et de la protéine MXR. De manière particulièrement préférée la cellule telle que définie ci- dessus exprime à la fois la protéine LRP et la protéine MDR1. De manière encore plus préférée la cellule telle que définie ci-dessus exprime à la fois la protéine LRP, la protéine MDR1 , la protéine MRP1 , et la protéine MXR. La protéine LRP est notamment représentée par SEQ ID NO : 2.
La protéine MDR1 est notamment représentée par SEQ ID NO : 3. La protéine MXR est notamment représentée par SEQ ID NO : 4. La protéine MRP1 est notamment représentée par SEQ ID NO : 5. L'expression de la protéine MDR peut être déterminée soit par détection de son ARNm, ou des précurseurs ARN de celui-ci, soit par détection de la protéine en elle-même. La détection de I1ARNm de la protéine MDR, ou de ses précurseurs, peut être réalisée par diverses techniques bien connues de l'homme du métier, comme la RT-PCR par exemple. La détection de la protéine en elle- même peut également être réalisées par diverses techniques bien connues de l'homme du métier. De préférence, la détection de la protéine en elle-même fait appel à des ligands spécifiques de la protéine MDR, tels que des anticorps, qui peuvent être mis en œuvre dans des techniques telles que la cytométrie de flux, l'immunohistochimie ou l'immunocytochimie.
Lorsqu'il est mesuré en cytométrie de flux, le niveau d'expression d'une protéine MDR peut être évalué comme suit :
(i) déterminer l'intensité moyenne de fluorescence mesurée pour les cellules de l'invention à l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine MDR ; (ii) déterminer dans les mêmes conditions qu'en (i) l'intensité moyenne de fluorescence et l'écart type de fluorescence, mesurés pour les cellules de l'invention à l'aide d'un anticorps témoin de même isotype que l'anticorps dirigé contre la protéine MDR mais ne reconnaissant pas d'antigène des cellules de l'invention ;
(iii) rapporter l'intensité moyenne de fluorescence déterminée en (i) à celle déterminée en (ii) ;
(iv) appliquer au rapport déterminé en (iii) le test de Kolmorogov-Smirnov.
Le test de Kolmorogov-Smirnov, bien connu de l'homme du métier, donne une valeur, habituellement notée D, variant de 0 à 1 , et permet de mesurer une différence entre deux distributions (ici l'intensité moyenne de fluorescence mesurée en (i) et celle mesurée en (ii)). Si D = 0, les deux distributions se superposent, si D = 1 les deux distributions sont complètement séparées. On considère que deux distributions sont significativement distinctes lorsque la valeur de D est supérieure ou égale à 0.15, de préférence supérieure ou égale à 0,2. A titre d'exemple, Legrand et al. (2001 ) Blood 97:502-508 décrivent l'application du test de Kolmorogov-Smirnov à l'évaluation de l'expression de la protéine Pgp.
Ainsi, lorsqu'elle est mesurée comme indiqué au-dessus à l'aide du test de Kolmorogov-Smirnov le niveau d'expression des protéines MDR par les cellules de l'invention est de préférence supérieure à 0,15, plus préférablement supérieure à 0,2.
De préférence, le niveau moyen d'expression, par les cellules de l'invention, donné comme indiqué au-dessus à l'aide du test de Kolmorogov-Smirnov est de :
- 0,34 pour MDRI ; - 0,57 pour MRP1 ;
- 0,28 pour MRP2 ;
- 0,41 pour MRP3 ;
- 0,70 pour MXR ; et/ou
- 0,78 pour LRP. De préférence encore, le niveau d'expression de la protéine MDR est tel qu'il confère effectivement à la cellule qui l'exprime la résistance à une drogue que cette protéine est susceptible de conférer, lorsque cette cellule est mise en présence d'une quantité de drogue normalement toxique pour une cellule de même type n'exprimant pas la protéine MDR. On parlera ainsi ici de niveau d'expression efficace pour conférer une résistance.
De préférence, la cellule isolée telle que définie ci-dessus est capable de transférer un ou plusieurs exemplaires de la protéine MDR qu'elle exprime aux cellules tumorales qu'elle fixe, notamment par trogocytose.
On désigne par « trogocytose » le phénomène de transfert de molécules d'une cellule à une autre notamment décrit par JoIy & Hudrisier (2003) Nature Immunol. 4:815.
Le transfert de protéine MDR depuis une cellule isolée de l'invention vers une cellule tumorale peut être mis en évidence de diverses manières bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, il est notamment possible de réaliser une immunodétection de protéine MDR exprimée par des cellules tumorales avant et après mise en présence de cellules de l'invention.
De préférence, la cellule isolée telle que définie ci-dessus n'exprime pas les marqueurs suivants : cytokératine et EMA (Epithelial Membrane Antigen)
(spécifiques des lignées cellulaires épithéliales), vimentine (spécifique des lignées cellulaires mésenchymateuses), CD45 (marqueur des cellules hématopoïétiques, telles que les granulocytes, les monocytes, et les lymphocytes B et T), CD20
(spécifique des lymphocytes B), CD3 (spécifique des lymphocytes T), CD68 (spécifique des macrophages et des histiocytes), CD34 (spécifique des cellules souches de la moelle osseuse), protéine S100 (spécifique des mélanocytes), myélopéroxydase (spécifique des lignées polynucléaires).
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention la cellule isolée telle que définie ci-dessus est susceptible de présenter des pseudopodes et/ou des filopodes.
On désigne par « pseudopodes » ou « filopodes » des évaginations de la membrane plasmique de la cellule. Les pseudopodes peuvent par exemple être visualisés en microscopie optique, confocale, ou électronique.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention la cellule isolée telle que définie ci-dessus provient :
- de la différenciation de cellules souches ou de cellules mononucléées de la moelle osseuse ; ou
- de cellules d'un épanchement d'un patient atteint d'un cancer. De préférence, comme on l'entend ici, les cellules souches de la moelle osseuse sont caractérisées par l'expression du marqueur CD34+ et/ou du marqueur CD133+.
Par " épanchement " on entend un liquide biologique qui s'accumule dans une cavité ou un tissu qui, normalement, n'en contient pas. On peut citer comme exemple un liquide d'ascite, par exemple d'un patient atteint d'un cancer de l'ovaire ou du pancréas, ou un liquide pleural, par exemple d'une patiente atteinte d'un cancer du sein.
De préférence, la cellule isolée telle que définie ci-dessus ne dérive pas de cellules cancéreuses extraites d'un individu.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la cellule isolée telle que définie ci-dessus a été immortalisée.
La cellule isolée telle que définie ci-dessus peut être immortalisée par toutes techniques connues de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple sans s'y limiter, l'utilisation de l'antigène T du virus SV 40, l'utilisation de la région EIA du génome de l'adénovirus 2, l'utilisation des oncogènes comme c-myc ou Ha-ras, ou l'utilisation de la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTRT) ou d'une séquence qui active le gène de l'hTRT endogène.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'immortalisation est effectuée en utilisant l'antigène T du virus SV 40.
De préférence, la cellule isolée telle que définie ci-dessus, provient d'une culture cellulaire déposée le 20 juin 2006 sous le traité de Budapest auprès de la CNCM sous le numéro 1-3627.
Obtention de cellules fixatrices de cellules tumorales
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une cellule capable de fixer des cellules tumorales, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules mononucléées de moelle osseuse ou des cellules souches de moelle osseuse pendant une durée et dans un milieu appropriés à la différenciation cellulaire ; b) éventuellement éliminer les monocytes des cellules obtenues à l'étape a) lorsque les cellules cultivées sont des cellules mononucléées de moelle osseuse ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape a) et éventuellement à l'étape b) avec des cellules tumorales, éliminer les cellules tumorales non fixées, et récupérer les cellules auxquelles les cellules tumorales se sont fixées.
Les cellules mononucléées de moelle osseuse peuvent notamment être isolées à partir de moelle osseuse par gradient de centrifugation sur Ficoll. Avant leur culture dans l'étape a) il est éventuellement possible d'éliminer les monocytes des cellules mononucléées de moelle osseuse. S'agissant des cellules souches de moelle osseuse, notamment CD34+ et/ou CD133+, il est, par exemple, possible de les isoler par immunofixation à l'aide d'anticorps anti-CD34 ou anti- CD133.
On peut utiliser dans l'étape a) un milieu de culture de cellules souches ou de cellules mononucléées de moelle osseuse, bien connu de l'homme du métier, contenant des facteurs de croissance et de différenciation. Cette culture est effectuée de préférence dans des flacons préalablement recouverts de gélatine à 0,2%. On peut citer comme exemples, sans s'y limiter, les milieux MV2, HEM (HEPES buffered Eagles médium), DMEM (Dulbecco's modified Eagles médium), GMEM (Glasgow modification of Eagles médium), F-12 etc. De manière préférentielle, on peut utiliser le milieu MV2 (ECBM MV2, Promocell, Heidelberg, Germany). Les facteurs de croissance peuvent être choisis, sans s'y limiter, parmi le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), le facteur de croissance des cellules vasculaires endothéliales (VEGF), le facteur de croissance transformant (TGF-β), le facteur de croissance des cellules souches (SCGF), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) ou leurs dérivés, des combinaisons de ces facteurs étant de préférence utilisées. Eventuellement, on rajoute au milieu de culture des suppléments requis pour le métabolisme de la cellule, comme des acides aminés, des vitamines comme l'acide ascorbique, des minéraux et des protéines comme la transferrine et leurs dérivés. Le milieu de culture peut contenir du sérum de veau fœtal, du sérum de poulet ou du sérum équin. Le milieu de culture peut aussi contenir des antibiotiques pour éviter la contamination avec des levures, des bactéries ou des champignons comme la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine et leurs dérivés. De préférence, après environ 6 jours de culture, les cellules non adhérentes sont enlevées et les cellules réincubées dans le même milieu. Les cellules sont ensuite cultivées pendant une durée préférentielle de 4 semaines environ, jusqu'à différenciation des cellules en cellules endothéliales, cellules de muscle lisse, fibroblastes et autres cellules, dont celles recherchées.
Dans l'étape c), les cellules cultivées à l'étape a) sont incubées avec des cellules tumorales. En général, cette étape est réalisée en récupérant les cellules adhérentes cultivées à l'étape a), et en les incubant avec des cellules tumorales en suspension dans un milieu approprié, tel que le milieu RPMI ou DMEM. Les cellules tumorales utilisées peuvent être tout type de cellules tumorales. Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, les cellules tumorales sont des cellules HL60 (lignée leucémique humaine). Le temps d'incubation des cellules cultivées et des cellules tumorales varie de 30 min à 4h environ, de préférence environ 2 heures. La température d'incubation est de préférence 37O.
Dans l'étape c), les cellules tumorales non fixées sont éliminées généralement en rinçant avec du milieu de culture (éventuellement le même, tel que du milieu RPMI) ou avec tout type de solution de lavage bien connu de l'homme du métier.
Les cellules auxquelles les cellules tumorales se sont fixées sont ensuite récupérées, préférentiellement par centrifugation de très courte durée de 3000 tours/min à 6000 tours/min.
Dans une étape ultérieure optionnelle, les cellules tumorales sont détachées de l'agglomérat formé par ladite cellule sur laquelle des cellules tumorales résiduelles sont fixées, par un traitement enzymatique ou non enzymatique (trypsine, Accutase®, ou EDTA 2 mM suivi d'une agitation très vigoureuse et de plusieurs lavages avec un tampon tel que du PBS).
A titre d'exemple pour éliminer les monocytes dans l'étape b) ou avant l'étape a), les cellules mononucléées sont disposées sur un support solide, tel que des boites de Pétri, ou mises en culture sur un support solide (par exemple des plaques recouvertes de gélatine) dans un milieu approprié tel que défini précédemment. Après environ 15 à 30 minutes d'incubation, les monocytes adhèrent au support et les cellules qui n'ont pas encore adhéré sont recueillies.
Eventuellement, pour confirmer que les cellules récupérées sont bien les cellules fixatrices d'intérêt, on incube celles-ci avec des cellules tumorales, de préférence des cellules HL60 (106 cellules HL60 / 2x105 cellules adhérentes) et on observe la capacité de fixation des cellules tumorales sur les cellules fixatrices.
La présente invention concerne également un procédé d'obtention d'une cellule capable de fixer des cellules tumorales, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules provenant d'un épanchement d'un patient atteint d'un cancer ; b) éventuellement éliminer les monocytes des cellules obtenues à l'étape a) ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape a) ou b) avec des cellules tumorales, éliminer les cellules tumorales non fixées, et récupérer les cellules auxquelles les cellules tumorales se sont fixées ; ou d) déposer les cellules obtenues à l'étape a) ou b) sur un support solide et récupérer les cellules qui adhèrent le plus rapidement sur ledit support.
De préférence, avant leur culture dans l'étape a), les cellules provenant d'un épanchement sont isolées. De préférence encore, ces cellules provenant d'un épanchement sont débarrassées des monocytes préalablement à leur culture dans l'étape a).
Par ailleurs, dans l'étape a), le milieu de culture utilisé peut être tout milieu de culture cellulaire connu de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer le MV2, RPMI, Nscove's MDM ou le DMEM. Eventuellement, le milieu de culture peut contenir des facteurs de croissance, comme ceux cités précédemment, des suppléments requis pour le métabolisme de la cellule, comme des acides aminés, des vitamines comme l'acide ascorbique, des minéraux et des protéines comme la transferrine et leurs dérivés. Eventuellement, le milieu de culture peut contenir du sérum de veau fœtal, du sérum de poulet ou du sérum équin. Le milieu de culture peut aussi contenir des antibiotiques pour éviter la contamination avec des levures, des bactéries ou des champignons comme la pénicilline, la streptomycine, la gentamicine et leurs dérivés. Dans ces conditions, les cellules fixatrices sont mises en évidence dès les premiers jours de culture (1 à 4 jours).
Les étapes b) et c), ainsi que l'élimination des monocytes préalablement à l'étape a), peuvent être effectuées comme décrit ci-dessus pour les cellules mononucléées de moelle osseuse ou les cellules souches de moelle osseuse.
De préférence, dans l'étape d), on dépose les cellules, préalablement débarassées des monocytes sur un support solide. Ensuite, on traite les cellules qui se sont fixées audit support de préférence avec de l'Accutase® et on récupère les cellules qui se détachent le plus rapidement du support. De préférence, on récupère les cellules qui se détachent en 5 min.
Le support, sur lequel les cellules se fixent, peut être tout type de support solide bien connu de l'homme du métier. A titre d'exemple de support solide, on peut citer le verre, le plastique, les métaux, les résines ou d'autres supports solides appropriés sur lesquels des cellules peuvent être fixées. Le terme " support solide " inclut également les matériaux considérés comme des supports semi solides. Le support solide peut prendre toutes formes adaptées, comme une bille ou une microparticule, un tube, un boite de pétri, une lame de microscope etc.
Eventuellement, pour confirmer que les cellules récupérées sont bien les cellules fixatrices d'intérêt, on incube celles-ci avec des cellules tumorales, de préférence des cellules HL60 (106 cellules HL60 / 2x105 cellules adhérentes) et on observe la capacité de fixation des cellules tumorales sur les cellules fixatrices.
Eventuellement à l'issu des procédés ci-dessus les cellules obtenues peuvent être immortalisées, notamment comme décrit ci-dessus.
L'invention a également pour objet une cellule susceptible d'être obtenue par l'un des procédés décrits ci-dessus.
Les cultures cellulaires produites à partir de la cellule isolée telle que définie précédemment ou de la cellule susceptible d'être obtenue par l'un des procédés décrits ci-dessus , font également partie de l'invention. Criblage
La présente invention concerne l'utilisation de cellules isolées telles que définies ci-dessus ou de cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus, pour cribler des composés anti-tumoraux.
Par "composés anti-tumoraux", on entend ici tout composé permettant d'empêcher et/ou de ralentir la progression tumorale. En particulier, les composés anti-tumoraux sont des composés induisant ou facilitant, directement ou indirectement, la mort des cellules tumorales. Plus particulièrement, les composés anti-tumoraux selon l'invention peuvent induire ou faciliter la mort des cellules protégeant les cellules tumorales in vivo.
La présente invention concerne ainsi un procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel :
- on met en contact des cellules isolées telles que définies ci-dessus ou de cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci- dessus avec des composés à cribler ;
- on détermine la croissance cellulaire et la mort cellulaire des cellules mises en contacts avec les composés à cribler ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la croissance cellulaire ou une augmentation de la mort cellulaire des cellules mises en contact par rapport à des cellules identiques qui n'ont pas été mises en contact avec les composés à cribler.
Avantageusement, les composés criblés par ce procédé ciblent spécifiquement les cellules selon l'invention. La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel :
- on met en contact une co-culture de cellules isolées telles que définies ci- dessus ou de cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus et de cellules tumorales, avec des composés à cribler ; - on détermine la croissance cellulaire et la mort cellulaire des cellules tumorales de la co-culture mise en contact avec les composés à cribler ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la croissance cellulaire ou une augmentation de la mort cellulaire des cellules tumorales de la co-culture par rapport à des cellules tumorales en co-culture avec des cellules isolées telles que définies ci-dessus ou des cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus qui n'ont pas été mises en contact avec les composés à cribler. Avantageusement, ce procédé permet de sélectionner des composés avec une action anti-tumorale qui n'est pas entravée par la résistance aux antitumoraux procurée par les cellules de l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel : - on met en contact des composés à cribler, avec des cellules isolées telles que définies ci-dessus ou des cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus et des cellules tumorales ;
- on détermine la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules isolées telles que définies ci-dessus ou les cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules isolées telles que définies ci-dessus ou les cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci-dessus, par rapport à la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules isolées telles que définies ci-dessus ou les cellules susceptibles d'être obtenues par l'un des procédés décrits ci- dessus en l'absence des composés à cribler.
Ce procédé permet avantageusement de sélectionner des composés qui inhibent la fixation des cellules tumorales par les cellules de l'invention et donc la protection que confèrent les cellules de l'invention aux cellules tumorales. Ces composés augmentent ainsi la sensibilité des cellules tumorales aux composés anti-tumoraux.
Par " mort cellulaire " on entend l'apoptose, la nécrose ou tout autre mécanisme induisant la mort de la cellule. Selon un mode de réalisation préféré, on détermine la capacité du composé candidat à induire une mort cellulaire par apoptose. Pour mesurer la mort cellulaire, on peut employer toutes techniques bien connues de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemple et sans s'y limiter les techniques suivantes : marquage à l'annexine V, utilisation du bleu trypan, utilisation d'iodure de propidium, le test TUNEL (Transferase dUTP Nick End Labeling), évaluation des produits de dégradation de l'ADN, mesure des caspases (évaluation quantitative et par activité), etc.
Dans les procédés de criblage ci-dessus, les cellules tumorales utilisées peuvent être n'importe quelle cellule tumorale. Selon un mode de réalisation préféré, les cellules tumorales sont des cellules HL60 (lignée leucémique humaine) ou des cellules MDA-MB 231 (lignée humaine du cancer du sein) ou les propres cellules du malade ( par exemple cancer de l'ovaire).
Le composé à cribler peut être n'importe quel composé d'origine naturelle ou synthétique, qu'il soit déjà commercialisé en tant qu'agent chimiothérapeutique, ou en cours de développement ou de caractérisation. Il peut s'agir d'un mélange de plusieurs molécules identifiées ou non, comme par exemple un extrait d'origine animale ou végétale.
Les cellules selon l'invention peuvent être aisément mises en œuvre dans des protocoles de criblage à haut débit (HTS) afin d'optimiser les méthodes actuelles de recherche de composés candidats efficaces pour une thérapie antitumorale en général.
Par ailleurs, les cellules de l'invention sont également utiles pour tester l'efficacité de composés candidats pour une thérapie anti-tumorale pour un individu donné, afin de proposer la thérapie la mieux adaptée en fonction de chaque individu atteint d'un cancer. Dans ce cadre, il est avantageux de tester un panel d'agents chimiothérapeutiques en tant que composés candidats, avec des cellules tumorales qui proviennent du patient lui-même, en présence des cellules fixatrices de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules fixatrices utilisées dans le test de criblage proviennent du patient lui-même.
Diagnostic
La présente invention concerne également un procédé in vitro de diagnostic d'un cancer, dans lequel on détermine la présence de cellules isolées telles que définies ci-dessus dans un échantillon provenant d'un tissu suspecté de contenir une tumeur, la présence de cellules isolées telles que définies ci-dessus étant indicatrice de la présence d'une tumeur.
En effet, comme l'ont montré les inventeurs, la présence de cellules selon l'invention dans le tissu implique généralement la présence de cellules tumorales à proximité.
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDE DES FIGURES
Les Figures 1 et 2 sont des photographies en microscopie optique (objectif 20) d'hospicells (obtenues par différenciation de cellules souches de moelle osseuse CD34+), mises en contact avec des cellules HL60, après 4 h d'incubation (Figure 1 ) et après 36 h d'incubation (Figure 2).
La Figure 3 est une photographie en microscopie optique (objectif 20) d'hospicells du liquide d'ascite d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire, après ajout de cellules HL60 dans le liquide.
La Figure 4 est une photographie en microscopie électronique d'une cellule MDA adhérant à une hospicell.
Les Figures 5 et 6 sont des graphes montrant l'influence des cellules fixatrices sur la sensibilité des cellules HL60 à l'aracytine (AraC) ou à la daunorubicine (DNR) (Figure 5) et des cellules fixatrices (" hospicells ") à ces drogues (Figure 6).
La Figure 7 est un graphe montrant la sensibilité des cellules fixatrices à différents agents connus utilisés en thérapie anti-tumorale.
La Figure 8 représente la quantité de fluorescence émise par les cellules OVCAR3 (axe des ordonnées, unités arbitraires) exprimant la GFP, cultivées avec des hospicells (première colonne), seules (deuxième colonne), avec des cellules OVCAR3 n'exprimant pas la GFP (troisième colonne), avec des fibroblastes (quatrième colonne), ou avec des HBMEC (cinquième colonne), en l'absence ou en présence de carboplatine et/ou de paclitaxel.
La Figure 9 représente la quantité de fluorescence émise par les cellules OVCAR3 (axe des ordonnées, unités arbitraires) exprimant la GFP, cultivées avec des hospicells (première colonne), seules (deuxième colonne), avec des hospicells dans un système transwell (troisième colonne), en l'absence ou en présence de carboplatine et/ou de paclitaxel.
EXEMPLES :
Exemple 1 : Obtention des hospicells à partir de cellules souches de moelle osseuse.
Des cellules CD34+ ont été isolées à partir d'échantillon de moelle osseuse normale (ou pathologique) par centrifugation sur gradient de densité dans du Ficoll-400. Les cellules ainsi isolées ont été réparties dans un flacon de culture recouvert de gélatine à 0,2% et ont été cultivées dans un milieu MV2 (ECBM MV2, Promocell, Heidelberg, Germany) complété avec de l'Amphotericin B 50 ng/ml, de la Gentamicin 50 μg/ml, de l'acide ascorbique 1 μg/ml, du facteur de croissance des fibroblastes humain (h-FGF) 10 ng/ml, du facteur de croissance épidermique humain (h-EGF) 5 ng/ml, du Long R3 IGF-1 (analogue du Facteur de croissance à l'insuline) 20 ng/ml, du facteur de croissance des cellules vasculaires endothéliales humain (h-VEGF) 10 ng/ml et du sérum de veau fœtal 5%. Après 6 jours de culture, les cellules non adhérentes ont été éliminées et les cellules adhérentes ont été remises en culture pendant 3 semaines dans du milieu sélectif frais de même composition (détaillée ci-dessus).
Les cellules adhérentes ainsi obtenues ont été lavées avec du RPMI puis ont été détachées par une incubation rapide avec de l'Accutase®. Les cellules ainsi détachées ont été lavées avec du RPMI puis
- soit ont été resuspendues dans du RPMI renfermant de la glutamine et des antibiotiques puis incubées avec des cellules HL60 immortalisées d'origine leucémique. Après une incubation de 120 min à 4"C sous agitation douce, la suspension cellulaire a été centrifugée à 6000 tours/min pendant quelques secondes ("puise de centrifugation"), les hospicells ayant fixé les cellules HL60 se trouvant dans le culot de centrifugation. Les cellules ayant sédimenté dans le fond du tube ont été resuspendues dans un milieu de culture (RPMI + sérum de veau foetal + Glutamine + antibiotiques) et réparties dans des plaques recouvertes par de la gélatine à 0,2%.
- soit ont été placées sur une plaque à 6 puits recouverts de gélatine et contenant du milieu RPMI contenant du sérum de veau fœtal, de la glutamine et des antibiotiques. Après une incubation dans l'étuve pour culture cellulaire, des cellules tumorales HL60 immortalisées d'origine leucémique ont été ajoutées dans les puits.
Après l'incubation dans l'étuve de culture cellulaire, les cellules ont été lavées avec du RPMI puis de l'Accutase® a été ajouté. Les cellules se détachant en 5 min sont des cellules qui fixent les cellules HL60, tandis que les cellules se détachant en 10 min et 15 min sont des cellules qui ne fixent pas les cellules HL60. Les cellules se détachant en 5 min ont été récupérées et ont été réparties sur une autre plaque 6 puits recouverts de gélatine. Dans l'un des puits, des cellules HL60 ont été ajoutées et après incubation, les cellules ont été lavées et l'opération consistant à fixer les cellules HL60 a été renouvelée. Enfin, de l'Accutase® a été ajouté dans les puits et les cellules se détachant en 5 min ont été récupérées et cultivées dans du milieu RPMI complet. Les cellules obtenues dans ces conditions sont des cellules de l'invention ou " Hospicells ".
Exemple 2 : Obtention des hospicells à partir du liquide d'ascite d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire.
Le liquide d'ascite d'une patiente atteinte d'un cancer de l'ovaire a été prélevé à l'aide d'un trocart à biopsie. Les cellules mononucléees de l'ascite ont été isolées par gradient de centrifugation sur Ficoll. Les cellules mononuclées ainsi isolées ont été réparties dans les puits d'une plaque de culture. Après 30 minutes d'incubation, les monocytes adhèrent au plastique et les cellules qui n'ont pas encore adhéré ont été recueillies et placées dans une plaque de culture recouverte de gélatine. Les hospicells ont été ensuite isolées comme décrit dans l'Exemple 1.
Les hospicells ont pu être également obtenues directement à partir de l'ascite en mettant dans une plaque de culture recouverte de gélatine un petit amas de cellules présent dans l'ascite mis en suspension dans du RPMI enrichi en sérum de veau fœtal, glutamine et antibiotiques. Alternativement, les hospicells ont été obtenues à partir d'agrégats cellulaires présents dans le liquide d'ascite provenant de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire de stade III. Brièvement, le liquide d'ascite a été centrifugé pour obtenir un culot cellulaire. Le culot cellulaire a été débarrassé des lymphocytes et des érythrocytes par gradient de centrifugation sur Ficoll, puis les agrégats d'hospicells et de cellules de cancer de l'ovaire ont été séparés par dilution. Les hospicells ont ensuite été détachées des cellules de cancer de l'ovaire par digestion trypsique.
Exemple 3 : Caractérisation phénotypiques des hospicells
Aucune expression par les hospicells des marqueurs membranaires classiques suivants n'a pu être mise en évidence par immunohistochimie : cytokératine (Anticorps KL1 , Beckman Coulter) EMA (Anticorps E29, Dako) (spécifiques des lignées cellulaires épithéliales), vimentine (Anticorps V9, Beckman Coulter) (spécifique des lignées cellulaires mésenchymateuses), CD45 (Anticorps 2b11 et PD7/26, Dako) (spécifique des cellules hématopoïétiques), CD20 (Anticorps L26, Dako) (spécifique des lymphocytes B), CD3 (Anticorps SP7, Neomarkers) (spécifique des lymphocytes T), CD68 (Anticorps KP1 et PG-M1 , Dako) (spécifique des macrophages et des histiocytes), CD34 (Anticorps OBendiO, Dako) (spécifique des cellules souches sanguines), protéine S100 (Anticorps polyclonal, Dako) (spécifique des mélanocytes), myélopéroxydase (Anticorps polyclonal, Dako) (spécifique des lignées polynucléaires). Toutefois, le marquage des protéines CD9 (Anticorps 56C6, Novocastra) et CD10 (Novocastra) s'est révélé positif.
Brièvement, l'immunohistochimie a été réalisée sur des sections de paraffine de 4 μm d'épaisseur. Une technique de récupération préliminaire de l'antigène à base de chauffage dans un tampon EDTA (pH 8) a été mise en œuvre avant l'incubation avec l'anticorps. L'anticorps à la dilution appropriée a été incubé 30 min puis révélé à l'aide d'un complexe streptavidine-biotine. Les sections ont ensuite été contre-colorées à l'hématoxyline. L'ensemble de la technique a été mise en oeuvre de manière automatique sur un système Autostainer (Dako).
Exemple 4 : Mise en évidence de la fixation des cellules cancéreuses sur les hospicells.
a) Sur des hospicells obtenues à partir de cellules souches de moelle osseuse.
Des hospicells obtenues selon le protocole de l'Exemple 1 , ont été mises en culture dans du milieu RPMI en présence de cellules leucémiques HL60.
Les cellules HL60 adhèrent aux hospicells et forment des amas cellulaires dans le milieu de culture. Au bout de 4 h, on a observé la fixation de 4 à 8 cellules sur les cellules fixatrices (Figure 1 ). Après 36 h, des nodules de cellules malignes se sont formés autour des hospicells (Figure 2).
b) Sur les hospicells présentes dans le liquide d'ascite d'une patiente atteinte du cancer de l'ovaire.
Du liquide d'ascite d'une patiente atteint d'un cancer de l'ovaire a été prélevé à l'aide d'un trocart à biopsie. Les hospicells ont pu être également obtenues directement à partir de l'ascite en mettant dans une plaque de culture recouverte de gélatine un petit amas de cellules présent dans l'ascite mis en suspension dans du RPMI enrichi en sérum de veau fœtal, glutamine et antibiotiques. Les amas cellulaires de cellules fixatrices déjà présentes dans le liquide d'ascite ayant fixé des cellules tumorales ont été observés par microscopie optique. Une partie de ce liquide a été mis en culture dans du milieu RPMI enrichi en sérum de veau fœtal, glutamine et en présence de cellules HL60 pendant 1 jour. La Figure 3 montre la fixation conjointe des cellules de cancer de l'ovaire et des cellules HL60 ajoutées sur les cellules fixatrices. Par ailleurs, les hospicells obtenues à partir d'agrégats cellulaires de fluide ascitique présentaient des structures particulières en microscopie optique. Ces cellules développent en effet de longs pseudopodes qui forment une sorte de « filet cellulaire ». En outre, une interaction des hospicells avec des cellules de cancer de l'ovaire est visible en microscopie confocale. Les hospicells y apparaissent comme des cellules de grande taille qui peuvent établir des interactions avec plusieurs cellules cancéreuses en même temps, fournissant ainsi une sorte de hamac pour les cellules cancéreuses.
De plus, une expérience d'immunohistochimie réalisée sur des biopsies péritonéales de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire à l'aide du marqueur CD10 démontre la présence d'hospicells autour d'agrégats de cellules cancéreuses, les hospicells formant un filet autour des agrégats.
Enfin, une analyse en microscopie électronique des agrégats cellulaires de fluide ascitique démontre qu'ils sont formés d'hospicells interagissant avec des cellules cancéreuses (Figure 4). On peut également observer que les hospicells développent des pseudopodes, ce qui augmente leur potentiel d'interaction avec des cellules cancéreuses. Des observations plus précises, réalisées sur des primo-cultures d'hospicells et de cellules cancéreuses a permis de mettre en évidence des zones ponctuelles de fusion membranaire entre les deux types cellulaires.
Exemple 5 : Interaction entre les hospicells et les cellules HL60 ou les cellules MDA-MB 231
Les inventeurs ont cherché à mettre en évidence les mécanismes d'action sous-tendant l'interaction entre les hospicells et les cellules tumorales.
a) Protéines impliquées dans la fixation de HL60 Des cellules HL60 ont été incubées dans du milieu RPMI dans 6 conditions différentes :
- cellules HL60 seules (contrôle)
- cellules HL60 + anticorps anti arrestine (anticorps contrôle) - cellules HL60 + RGD (Arg-Gly-Asp, séquence consensus des intégrines qui empêche partiellement l'adhésion intégrine dépendante)
- cellules HL60 + anticorps anti CD11a
- cellules HL60 + anticorps anti CD49d
- cellules HL60 + anticorps anti CD11a + anticorps anti CD49d - cellules HL60 + anticorps anti CD11a + anticorps anti CD49d + RGD
Pour chaque condition, des cellules HL60 ont été déposées séparément et en quantité identique dans 6 puits différents contenant du milieu complet RPMI et des cellules fixatrices ayant adhéré au support. Le rapport entre cellules tumorales et hospicells était de 5 / 1. Après 24 heures d'incubation à 37O, les cellules HL60 n'ayant pas adhéré ont été récupérées et comptées. On a alors calculé le pourcentage de cellules HL60 adhérant aux hospicells pour chaque condition.
Les résultats montrent que l'incubation préalable des cellules HL60 avec des anticorps anti-CD11a ou anti-CD49d ou avec le RGD bloque partiellement l'adhésion des cellules HL60 aux hospicells. Ce blocage est plus important lorsque les cellules HL60 ont été incubées avec l'anticorps anti-CD11a et l'anticorps anti- CD49d simultanément. Ces résultats suggèrent que les intégrines CD11a et CD49d participent à l'adhésion entre la cellule HL60 et l'hospicell.
b) Protéines impliquées dans la fixation de MDA
Des cellules MDA-MB231 préalablement marquées à la rhodamine ont été incubées dans du milieu complet RPMI dans 3 conditions différentes :
- cellules MDA seules (contrôle) - cellules MDA + anticorps anti SDF1 qui est le ligand de CXCR4 et qui est une cytokine favorisant la formation des métastases de cancer du sein dans la moelle osseuse
- cellules MDA + anticorps anti CXCR4 Des cellules MDA de chaque condition ont été déposées séparément et en quantité identique (5 cellules cancéreuses par hospicell) dans 3 puits différents contenant du milieu RPMI et des hospicells ayant adhéré au support. Après une incubation de 2 heures à 4"C, les cellules MDA n'ay ant pas adhéré ont été éliminées et la quantité de cellules ayant adhéré aux hospicells a été déterminée pour chaque condition par mesure de la fluorescence à l'aide d'un fluorimètre pour plaque (fluorimètre Victor).
Les résultats montrent que l'incubation préalable des cellules MDA avec des anticorps anti CXCR4 induit une diminution nette de l'adhésion par rapport au contrôle.
Ces résultats suggèrent que le CXCR4 module l'expression des intégrines à la surface des cellules tumorales MDA, intégrines qui sont susceptibles de jouer un rôle dans la fixation des cellules tumorales aux cellules de l'invention.
Exemple 6 : Effet protecteur des hospicells sur les cellules HL60 contre des agents utilisés en chimiothérapie
Prolifération des cellules HL60 fixées aux hospicells après une exposition à l'aracytine (AraC) ou à la daunorubicine (DNR)
Des cellules HL60 mises en culture avec des hospicells dans du milieu RPMI ont été traitées pendant 5 jours avec soit de l'aracytine (AraC), soit de la daunorubicine (DNR). Après 5 jours de traitement, la drogue a été éliminée et les cellules ont été remises en culture dans du milieu frais.
Le nombre de cellules HL60 vivantes a été mesuré évalué tout au long de l'expérience en utilisant le système d'analyse d'image.
Les résultats montrent que les cellules HL60 libres meurent lorsqu'elles sont traitées à l'AraC ou à la DNR et qu'elles ne sont plus détectables lorsqu'elles sont fixées sur les hospicells. Toutefois, après arrêt du traitement, les cellules
HL60 libres ne poussent pas tandis que l'on note que sur les hospicells, des cellules HL60 vivantes sont identifiables. Cet effet de "repousse" des cellules est plus important avec l'aracytine qu'avec la daunorubicine, différence liée à la toxicité de la daunorubicine pour les hospicells.
Ces résultats montrent bien que, suite au traitement à l'AraC et à la DNR, les cellules HL60 libres meurent tandis que parmi celles liées aux cellules fixatrices, quelques unes restent vivantes, et prolifèrent après l'arrêt du traitement.
Un exemple d'évaluation des cellules vivantes est présenté dans les Figures 5 et 6.
Exemple 7 : Sensibilité des hospicells à différents agents connus utilisés en chimiothérapie anti-tumorale
Des hospicells immortalisées (M16) ont été incubées dans du milieu RPMI avec de l'Adriblastine, de la Bléomycine, du Deticene, du Fluorouracile, de la Navelbine, du Taxotere ou de la Leustatine pendant 1 à 3 jours.
Les cellules ont ensuite été détachées par l'Accutase® et le nombre de cellules en apoptose détecté par l'annexine V. On a alors déterminé le pourcentage de cellules apoptotiques par cytométrie de flux (Figure 7). Les résultats montrent que les hospicells sont peu sensibles à l'action de nombreuses drogues.
Exemple 8 : Interaction entre les hospicells et les cellules OVCAR3
La spécificité d'interaction des hospicells avec les cellules cancéreuses a ensuite été mise en évidence à l'aide de cellules de la lignée cellulaire ovarienne OVCAR3 (Manetta et al. (1988) Eur. J. Gynaecol. Oncol. 9:222-7). Un test d'adhésion a été réalisé entre des hospicells issues de primocultures et des cellules OVCAR3 exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein). Les témoins négatifs choisis représentent des types cellulaires décrits dans la littérature comme étant des cellules microenvironnementales, à savoir des fibroblastes et des cellules endothéliales de la moelle osseuse (HBMEC). Afin de pouvoir différencier l'adhésion spécifique hospicells-cellules OVCAR3 de l'adhésion des cellules OVCAR3 entre elles, des cellules OVCAR3 n'exprimant pas la GFP ont également été utilisées.
Les cellules OVCAR3 exprimant la GFP ont été obtenues par transfection à partir d'un virus RRV (Ross River Virus) portant la protéine VSV-G et contenant la séquence codant la GFP obtenu essentiellement comme décrit dans De Vos et al. (2003) Human Gène Ther. 10:1727-1739. Les cellules OVCAR3 ont été étalées dans des boites de culture de 35 mm de diamètre 24 h avant la transfection. Les cellules ont ensuite été transfectées avec les virus avec une multiplicité d'infection de 100:1 , le titre de la solution virale ayant été déterminé sur des cellules NIH 3T3 comme décrit par Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037. 48 heures après transfection l'expression de la GFP a été contrôlée par cytométrie de flux sur un appareil FACScan (Becton Dickinson).
Les tests d'adhésion ont été conduits comme suit. Des boites de culture de cellules de 96 puits contenant 0,2% de gélatine ont été recouvertes d'hospicells à 70% de confluence. Les cellules OVCAR3 exprimant la GFP ont ensuite été ensemencées à 5.104 cellules par puits dans 200 μL de milieu sans sérum et laissées adhérer pendant 2 heures à 37"C. Les cellu les non adhérentes ont été retirées par lavage doux au PBS, puis la quantité de cellules adhérentes a été déterminée en mesurant la fluorescence de chaque puits à l'aide d'un fluorimètre Wallac Flite (lecture à 560 nm). Pour chaque condition, la densité moyenne de cellules ainsi que l'écart type ont été calculés à partir des données obtenues pour 6 puits. Les expériences ont été répétées 4 fois.
Les résultats obtenus montrent que l'adhésion des hospicells est spécifique des cellules cancéreuses. Par ailleurs, on note que les cellules OVCAR3 ne présentent pas d'adhésion significatives entre elles, ce qui renforce le rôle des hospicells dans la formation des agrégats ascitiques. Enfin, l'adhésion des hospicells aux cellules OVCAR3 est inhibée par la wortmanine, ce qui suggère une adhésion active impliquant le cytosquelette.
Dans un deuxième temps, les Inventeurs ont examiné dans quelle mesure les hospicells pouvaient conférer une chimio-résistance aux cellules auxquelles elles se lient. Brièvement, les hospicells ont été cultivées jusqu'à atteindre 60% de confluence. 2.104 cellules OVCAR3 exprimant la GFP ont ensuite été co-cultivées avec les hospicells durant 24 heures avant la mise en présence avec un agent chimio-thérapeutique (carboplatine 22,2 μM et paclitaxel 1 ,4 μM). L'effet chimio- thérapeutique a été déterminé à l'aide du dosage colorimétrique quantitatif à la sulphorhodamine B (SRB) comme décrit par Skehan et al. (1990) J. Natl. Cancer
Inst. 82:1 107-1 1 12. La couleur rosé de la SRB a été quantifiée par mesure de l'absorbance à 540 nm. Pour chaque condition, la densité moyenne de cellules ainsi que l'écart type ont été calculés à partir des données obtenues pour 6 puits. Les expériences ont été répétées 3 fois.
La co-culture des hospicells et des cellules OVCAR3 induit une chimiorésistance avec des différences de 2,2 à 2,5 fois, en fonction de l'agent chimiothérapeutique utilisé, dans le profil de résistance par rapport aux cellules OVCAR3 seules (Figure 8). Par ailleurs, des co-cultures avec d'autres types cellulaires témoins
(fibroblastes, HBMEC) n'induit aucune protection (Figure 8).
Enfin, des expériences de co-cultures dans lesquelles les milieux de culture des hospicells et des cellules OVCAR3 peut circuler librement mais les contacts entre hospicells et cellules OVCAR3 sont exclus (système Transwell) montrent que les contacts directs entre ces cellules sont nécessaires à l'acquisition de la chimiorésistance et que cette chimiorésistance ne passe pas par un quelconque facteur soluble (Figure 9).
Exemple 9 : Expression de protéines MDR par les hospicells
II est connu que la protéine MDR1 a été impliquée dans l'acquisition, entre autres, de la chimiorésistance au paclitaxel dans les cellules tumorales. Par conséquent, l'expression de protéines MDR par les hospicells a ensuite été examinée.
L'expression d'ARNm codant des protéines MDR au sein des hospicells a tout d'abord été confirmée par RT-PCR. Dans un deuxième temps, le niveau d'expression des protéines a été analysé par immunofluorescence et cytométrie de flux.
Pour l'immunofluorescence, les hospicells ont été déposées sur des lamelles de verre dans des plaques à 6 puits (Nunc) à une densité de 8.104 cellules/puits dans du milieu RPMI à 10% SVF. 48 heures plus tard les cellules ont été privées de sérum pendant 48 heures. Les hospicells ont ensuite été fixées par 3% de paraformaldéhyde et perméabilisées par 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS. Les hospicells ont alors été incubées pendant la nuit à 4"C dans un mélange PBS-SAB-Triton 1 % avec des anticorps primaires dirigés contre les protéines MDR. Ensuite, un anticorps secondaire biotinylé et de la streptavidine associée à la fluorescéine (Molecular Probes) ont été utilisés pour marquer les anticorps primaires. Les anticorps dirigés contre MRP1 , MRP2, MRP3, MXR et LRP ont été fournis par Alexis. Les anticorps dirigés contre MDR1 ont été fournis par Immunotech. Les hospicells ont ensuite été observées sur un microscope à fluorescence Axiophot (Zeiss) et les photos ont été prises à l'aide d'une caméra Princeton.
Pour la cytométrie de flux, l'expression des protéines MDR a été déterminée avec les mêmes anticorps que ci-dessus, à l'aide du kit de perméabilisation Intraprep (Beckman-Coulter) selon les instructions du fournisseur, sur un appareil de cytométrie de flux EPICS Altra (Beckman Coulter).
Les résultats d'immunofluorescence indiquent l'expression de MDR1 , LRP et MXR par les hospicells. En outre, les données de cytométrie de flux montrent que les protéines MDR1 , MRP1 , MRP2, MRP3, MXR et LRP sont exprimées par les hospicells (Tableau 1 ), avec un niveau particulièrement élevé d'expression des protéines MDR1 et LRP, qui sont toutes deux connues pour être impliquées dans la résistance au carboplatine et au paclitaxel. Le niveau d'expression est déterminé en rapportant l'intensité moyenne de fluorescence mesurée à l'aide de l'anticorps anti-MDR à celle mesurée en présence d'un anticorps de même isotype que l'anti-MDR mais ne présentant pas de spécificité vis-à-vis des hospicells, puis en appliquant le test de Kolmorogov-Smirnov (Legrand et al. (2001 ) Blood 97:502- 508). Protéine MDR Niveau d'expression des protéines (Kolmorogov-Smirnov)
MDR1 0,34
MRP1 0,57
MRP2 0,28
MRP3 0,41
MXR 0,70
LRP 0J8
Tableau 1 : Expression de protéines MDR par les hospicells
Ces observations ont été complétées en déterminant la fonctionnalité des protéines MDR exprimées par les hospicells par cytométrie de flux.
Cette fonctionnalité a pu être établie pour la protéine MDR1 en utilisant la rhodamine comme sonde. Par ailleurs, le transport de la sonde a été inhibé par la cyclosporine (un inhibiteur de la protéine MDR1 ). La fonctionnalité des protéines LRP et MXR a également pu être confirmée.
Le rôle des protéines MDR dans la chimiorésistance conférée par les hospicells a été confirmée en répétant les expériences ci-dessus de co-cultures d'hospicells et de cellules OVCAR3 en présence de carboplatine et de paclitaxel, et en ajoutant au milieu de culture du Vérapamil (1 ,4 μM), un inhibiteur de la protéine MDR1.
L'ajout de cet inhibiteur diminue de manière importante la chimiorésistance que confèrent les hospicells aux cellules OVCAR3, démontrant ainsi l'implication des protéines MDR dans cette résistance.
Par ailleurs, l'expression de la protéine MDR1 par les cellules OVCAR3, cultivées en présence ou en l'absence d'hospicells a été déterminée par cytométrie de flux.
Les résultats obtenus indiquent la présence de la protéine MDR1 par les cellules OVCAR3. Par conséquent, le transfert de protéines MDR entre les hospicells et les cellules tumorales est possible. Par ailleurs, ce transfert se produit également en présence d'un inhibiteur de la traduction des protéines (cycloheximidine A) ce qui suggère un transfert actif depuis les hospicells plutôt qu'une activation de la traduction de ces protéines dans les cellules tumorales. Enfin, les inventeurs ont pu démontrer que les hospicells pouvaient transférer des fragments de membranes aux cellules tumorales avec lesquelles elles entrent en interaction. Pour ceci, les inventeurs ont modifié le test d'évaluation de la trogocytose
(transfert actif de portions de membranes entre deux cellules en contact rapproché) décrit par Poupot et al. (2003) J. Immunol. 171 :2517-2523.
Brièvement, les hospicells ou les cellules OVCAR3 ont été colorées par le fluorophore lipophile PKH67 de couleur verte selon les instructions du fabricant. Les cellules colorées ont ensuite été mises en co-culture avec des cellules non colorées pendant respectivement 0 min, 3 min, et 3 heures. Les co-cultures ont été conduites dans des plaques de culture à 96 puits à fond en U avec une concentration finale de 6 x 105 cellules dans 120 μl de milieu RPMI 1640 complet supplémenté à 10% de SVF. Les plaques de culture ont ensuite été centrifugées 1 min à 700 rpm pour favoriser les contacts entre cellules puis maintenues 1 heure à 37O dans une atmosphère humide à 5% de CO 2- Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS à 0,5 mM EDTA et analysées par cytométrie de flux à l'aide d'un appareil LSRII et du logiciel DIVA (BD Biosciences).
La comparaison de l'intensité moyenne de fluorescence (mfi) de PKH67 des cellules non marquées à 0, 3 min ou 3 heures d'incubation montre une augmentation consécutive à la co-culture. Ainsi, les cellules cancéreuses présentent une augmentation de la fluorescence après la co-culture (mfi de 211 à 3660) suggérant une acquisition de fragments de membrane par les cellules cancéreuses à partir des hospicells.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule isolée capable de fixer des cellules tumorales, exprimant la protéine CD10 et exprimant au moins une protéine MDR.
2. Cellule isolée selon la revendication 1 , dans laquelle la protéine MDR est choisie parmi le groupe constitué par la protéine LRP (Lung Résistance Protein), la protéine MDR1 , la protéine MRP1 , la protéine MRP2, la protéine MRP3, la protéine MRP5, et la protéine MXR.
3. Cellule isolée selon la revendication 1 ou 2, susceptible de présenter ou présentant des pseudopodes.
4. Cellule isolée selon l'une des revendications 1 à 3, provenant : - de la différenciation de cellules souches ou de cellules mononucléées de la moelle osseuse ; ou - de cellules d'un épanchement d'un patient atteint d'un cancer.
5. Cellule isolée selon l'une des revendications 1 à 4, laquelle cellule a été immortalisée.
6. Cellule isolée selon l'une des revendications 1 à 5, provenant d'une culture cellulaire déposée le 20 juin 2006 sous le traité de Budapest auprès de la CNCM sous le numéro I-3627.
7. Procédé d'obtention d'une cellule capable de fixer des cellules tumorales, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules mononucléées de moelle osseuse ou des cellules souches de moelle osseuse pendant une durée et dans un milieu appropriés à la différenciation cellulaire ; b) éventuellement éliminer les monocytes des cellules cultivées à l'étape a) lorsque les cellules cultivées sont des cellules mononucléées de moelle osseuse ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape a) et éventuellement à l'étape b) avec des cellules tumorales, éliminer les cellules tumorales non fixées, et récupérer les cellules auxquelles les cellules tumorales se sont fixées.
8. Procédé d'obtention d'une cellule capable de fixer des cellules tumorales, ledit procédé comprenant les étapes consistant à : a) cultiver des cellules provenant d'un liquide d'ascite ou d'un liquide pleural d'un patient atteint d'un cancer ; b) éventuellement éliminer les monocytes des cellules cultivées à l'étape a) ; c) incuber les cellules obtenues à l'étape b) avec des cellules tumorales, éliminer les cellules tumorales non fixées, et récupérer les cellules auxquelles les cellules tumorales se sont fixées ; ou d) déposer les cellules obtenues à l'étape b) sur un support solide et récupérer les cellules qui adhèrent le plus rapidement sur ledit support.
9. Cellule susceptible d'être obtenue par un procédé tel que défini dans la revendication 7 ou 8.
10. Utilisation de cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 ou 9, pour cribler des composés anti-tumoraux.
11. Procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel :
- on met en contact des cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 ou 9 avec des composés à cribler ; - on détermine la croissance cellulaire et la mort cellulaire des cellules mises en contacts avec les composés à cribler ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la croissance cellulaire ou une augmentation de la mort cellulaire des cellules mises en contact par rapport à des cellules identiques qui n'ont pas été mises en contact avec les composés à cribler.
12. Procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel : - on met en contact une co-culture de cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9 et de cellules tumorales, avec des composés à cribler ;
- on détermine la croissance cellulaire et la mort cellulaire des cellules tumorales de la co-culture mise en contact avec les composés à cribler ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la croissance cellulaire ou une augmentation de la mort cellulaire des cellules tumorales de la co-culture par rapport à des cellules tumorales en co-culture avec des cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9 qui n'ont pas été mises en contact avec les composés à cribler.
13. Procédé de criblage de composés anti-tumoraux, dans lequel :
- on met en contact des composés à cribler, avec des cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9 et des cellules tumorales ;
- on détermine la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9 ;
- on sélectionne les composés induisant une diminution de la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9, par rapport à la quantité de cellules tumorales ayant été fixées par les cellules telles que définies dans l'une des revendications 1 à 6 et 9 en l'absence des composés à cribler.
14. Procédé in vitro de diagnostic d'un cancer, dans lequel on détermine la présence de cellules isolées telles que définie dans l'une des revendications 1 à 6 dans un échantillon provenant d'un tissu suspecté de contenir une tumeur, la présence desdites cellules isolées étant indicatrice de la présence d'une tumeur.
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