EP2155176A2 - Angiogenese förderndes substrat - Google Patents

Angiogenese förderndes substrat

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EP2155176A2
EP2155176A2 EP08758535A EP08758535A EP2155176A2 EP 2155176 A2 EP2155176 A2 EP 2155176A2 EP 08758535 A EP08758535 A EP 08758535A EP 08758535 A EP08758535 A EP 08758535A EP 2155176 A2 EP2155176 A2 EP 2155176A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gelatin
substrate
containing material
angiogenesis
substrate according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08758535A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Ahlers
Burkhard Schlosshauer
Lars Dreesmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gelita AG
Original Assignee
Gelita AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Gelita AG filed Critical Gelita AG
Publication of EP2155176A2 publication Critical patent/EP2155176A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis-promoting substrate.
  • endothelial cells that line existing blood vessels form new capillaries wherever they are needed.
  • the endothelial cells have the remarkable ability to adapt their number and arrangement to local requirements. Tissues are dependent on the blood supply that occurs through the blood vessel system.
  • the vascular system in turn depends on the endothelial cells.
  • the endothelial cells create an adaptive life assurance system that ramifies into almost all parts of the body.
  • angiogenesis Cells in tissues release oxygen deficient angiogenesis factors that stimulate the growth of new capillaries.
  • Local (mechanical) irritation and infection also causes the proliferation of new capillaries, most of which retract and disappear as soon as the inflammation subsides.
  • the newly developing blood vessels always arise first as capillaries, which sprout on existing small vessels. This process is called angiogenesis.
  • Angiogenesis-stimulating factors are well known and include e.g. the factors HGF, FGF, VEGF and others more.
  • the object of the present invention is to provide an angiogenesis-promoting substrate which can be produced simply and inexpensively.
  • angiogenesis-promoting substrate which comprises a non-porous shaped body which is formed from a physiologically-insoluble, absorbable, gelatin-containing material.
  • Gelatin-based materials have long been used for medical applications because of their good biocompatibility, for example, as a matrix material for the release of pharmaceutical agents or as a carrier material for colonization with cells.
  • collagen In contrast to collagen, gelatine can be produced in reproducible quality and high purity. Furthermore, it is essentially completely absorbable in the body.
  • the gelatin-containing material as such exhibits an angiogenesis-promoting effect, i. stimulates the formation of new blood vessels in its immediate vicinity, without any further angiogenesis-promoting factors, such as e.g. the signal molecules VEGF, FGF or HGV mentioned above are needed.
  • angiogenesis-promoting factors such as e.g. the signal molecules VEGF, FGF or HGV mentioned above are needed.
  • angiogenesis-promoting effect of the present invention is observed in a non-porous shaped body formed of the gelatin-containing material.
  • an angiogenesis-promoting effect on porous shaped articles of gelatin-containing material had first been found, with angiogenesis taking place primarily within the shaped articles, i. ingrowth of blood vessels into the pores, cavities or spaces of the molding has been observed.
  • the pro-angiogenic effect was therefore attributed primarily to the porous structure of the molded article (see German Patent Application No. 10 2005 054 937). Examples of such structures are sponges, fabrics or nonwovens.
  • a non-porous shaped body as angiogenesis promoting substrate can be used, wherein the blood vessel formation is not in the molding, but in its spatial environment.
  • this effect is caused by a release of soluble components of the gelatin and therefore is largely independent of the structure of the shaped body.
  • Non-porous shaped articles made of a gelatin-containing material are generally easier to produce than those having a porous structure.
  • the use of a shaped body of an insoluble material, which is absorbed or degraded only after a certain time, compared to the use of soluble or dissolved gelatin has the advantage that the targeted angiogenesis at a certain place, namely the environment inserted molding, can be stimulated.
  • the gelatin-containing material is a gelatin-based material and consists predominantly of gelatin. This means that the gelatin makes the largest contribution to any other components of the material used.
  • a gelatin-based material is used which consists essentially completely of gelatin.
  • Particularly suitable gelatin types are pork rind gelatin, which is preferably of high molecular weight and has a bloom value of about 160 to about 320 g.
  • an angiogenesis-stimulating effect is also observed with low molecular weight, water-soluble gelatin having an average molecular weight of less than 6 kDa, but such an effect is comparatively nonspecific when compared to other also less stimulatory agents.
  • the gelatin used therefore preferably has an average molecular weight of more than about 6 kDa.
  • a gelatin with a particularly low content of endotoxins is preferably used as starting material. Endotoxins are metabolic products or fragments of microorganisms found in the animal raw material. The endotoxin content of gelatin is expressed in international units per gram (IU / g) and determined according to the LAL test described in the fourth edition of the European Pharmacopoeia (Ph. Eur. 4).
  • the endotoxin content of gelatin can be drastically reduced by certain measures in the manufacturing process.
  • measures include, first and foremost, the use of fresh raw materials (e.g., pork rind) to avoid storage times, the thorough cleaning of the entire production line just prior to the start of gelatine production, and, if necessary, the replacement of ion exchangers and filtration systems at the production line.
  • the gelatin used in the present invention preferably has an endotoxin content of about 1,200 I.U./g or less, more preferably about 200 I.U./g or less. Optimally, the endotoxin content is about 50 I.U./g or less, each determined according to the LAL test. In comparison, some commercially available gelatins have endotoxin levels of more than 20,000 I.U./g.
  • the non-porous shaped body of the angiogenesis-promoting substrate is formed from a material that is insoluble under physiological conditions, so that it has a certain period of time maintains its structural integrity and angiogenesis can be localized to the desired target area.
  • the gelatin-containing material is preferably crosslinked.
  • rapid dissolution can be counteracted by using the gelatin together with other slower dissolving components (examples of such resorbable biopolymers are chitosan and hyaluronic acid).
  • Such components may be used for the purpose of temporarily immobilizing the gelatin moieties.
  • the crosslinking is selected to stabilize the material, in particular the gelatin portion of the gelatin-containing material may be crosslinked, it being possible to resort to chemical crosslinking as well as enzymatic crosslinking.
  • Preferred chemical crosslinking agents are aldehydes, dialdehydes, isocyanates, carbodiimides and alkyl dihalides. Particularly preferred is formaldehyde, which simultaneously causes a sterilization of the molding.
  • the enzymatic crosslinking agent used is preferably the enzyme transglutaminase, which brings about linkage of the glutamine and lysine side chains of proteins, in particular also of gelatin.
  • the stability to resorption under the aforementioned physiological conditions to which the material is exposed when used can be reconstituted in vitro under standard physiological conditions.
  • a PBS buffer (pH 7.2) at 37 0 C is used and under these conditions, the substrates can be tested for their time-dependent stability behavior and compare.
  • the gelatin-containing material has a predetermined degree of crosslinking. By specifying the degree of crosslinking, in particular the absorption stability of the shaped body can be adjusted, ie the time during which it receives its structural integrity under physiological conditions.
  • non-porous moldings can be used as angiogenesis-promoting substrates, which are stable depending on the degree of crosslinking of the gelatin-containing material, for example, one, three, six or twelve weeks under physiological standard conditions, depending on the period over which an angiogenic effect of attending physician is desired.
  • the non-porous shaped body is preferably stabilized in its structure by means of a two-stage cross-linking, wherein in a first stage the gelatin-containing material is subjected in solution to a first cross-linking reaction, and then a molded article produced from this material is further cross-linked in a second cross-linking step.
  • crosslinking in the gas phase is particularly suitable for the second crosslinking stage, for example using formaldehyde.
  • the two-stage cross-linking has the particular advantage that overall a higher degree of cross-linking can be achieved, which then also moreover can be realized substantially uniform over the entire cross section of the molded body. This has the consequence that the degradation properties of the shaped body during absorption are homogeneous, so that it retains substantially its structural integrity for the intended time dependent on the degree of crosslinking and then completely absorbed in a relatively short time with loss of structural integrity.
  • the degree of cross-linking should be such that, during 7 days, about 20% by weight or less of the gelatin-containing material degrades under the standard physiological conditions mentioned above.
  • the non-porous shaped body can be realized in very different forms, about which has not yet been spoken.
  • the shaped body is a sheet material.
  • Sheet materials can be used in a variety of ways as medical substrates in or on the body.
  • the shaped body is a film.
  • films can be readily prepared by casting a solution of a gelatin-containing material, which method can be combined with the two-step crosslinking process described above.
  • plasticizers are selected from glycerol, oligoglycerols, oligoglycols, sorbitol and mannitol.
  • the film preferably has a thickness in the range from about 20 to about 500 ⁇ m, more preferably from about 50 to about 100 ⁇ m.
  • the non-porous shaped body is in the form of particles.
  • the particles may be, for example, beads, granules or powders of a gelatin-containing material.
  • Preferred particles have an average diameter of about 0.1 mm to about 5 mm.
  • the non-porous shaped body comprises one or more non-gelatin-based pharmaceutical active substances. These may be, for example, anti-inflammatory or antibiotic agents.
  • the non-porous shaped body is populated with cells.
  • the substrate according to the invention can be used for cell transplantations in which angiogenesis in the area of the implanted cells is desired.
  • the present invention also relates to the use of a non-porous shaped article formed from a physiologically-insoluble, resorbable, gelatin-containing material for the preparation of an angiogenesis-promoting substrate intended for use in or on the human or animal body.
  • a non-porous shaped article formed from a physiologically-insoluble, resorbable, gelatin-containing material for the preparation of an angiogenesis-promoting substrate intended for use in or on the human or animal body.
  • Advantages and preferred embodiment of this use are apparent in particular from the above description of the angiogenesis-promoting substrate according to the invention.
  • the substrate is used as a wound dressing or cover. By applying the substrate to injuries or burns, especially to the skin, the angiogenic effect can contribute to faster wound healing.
  • the angiogenesis-promoting substrate is intended for implantation in the body.
  • the substrate can be used intracorporally at the most diverse points of the body, wherever targeted promotion of angiogenesis is necessary or desirable.
  • Preferred areas of application of the angiogenesis-promoting substrate according to the invention are e.g. Transplants, the treatment of diabetes or infarction.
  • a non-porous shaped body is provided in the respectively required shape and size or tailored accordingly by the attending physician, and subsequently introduced into or onto the corresponding area of the human or animal body to become.
  • FIG. 1 Photograph of blood vessel formation without an angiogenesis-promoting substrate
  • FIGS. 2a to 2c are photographic representations of blood vessel formation in various angiogenesis-promoting substrates according to the invention.
  • FIG. 3 Photograph of blood vessel formation after resorption of the angiogenesis-promoting substrate.
  • gelatin films having three different degrees of crosslinking were prepared by a two-step crosslinking process.
  • the mixtures were homogenized and knife-coated at about 60 0 C in a thickness of approximately 250 microns onto a polyethylene backing.
  • the films were stripped off from the PE base and after-dried for about 12 hours under the same conditions.
  • the dried films (thickness about 50 microns) were exposed to the equilibrium vapor pressure of a 17 wt .-% aqueous formaldehyde solution at room temperature to perform the second crosslinking step in a desiccator.
  • the exposure time of Formaidehyddampfs 2 h in the case of the film C 17 h.
  • the film A has a total of the lowest and the film C in total the highest degree of crosslinking, the film B is in between. This is reflected in the different degradation behavior of the films, wherein the absorption times of the described Foils under physiological conditions in animal experiments (see below) between about 14 days (slide A) and about 21 days (slide C) are.
  • the films Due to the use of glycerol as plasticizer, the films show sufficient flexibility, in particular in the hydrated state, to ensure good handling in the medical application, without fear of breakage or tearing of the films.
  • the efficacy of the gelatin films A, B and C as angiogenesis promoting substrates in vivo was investigated in animal experiments. Ten weeks old mice of the strain Balb / C from Charles River (Sulzfeld) with a body weight of 20 g were used as test animals.
  • the substrates used were 5 ⁇ 5 mm 2 pieces of the gelatin films described above.
  • the mice were each implanted two pieces of film of a certain degree of crosslinking subcutaneously in the neck area. For this purpose, the animals were anesthetized and shaved the coat in the neck area. With a pair of tweezers, a piece of the neck skin was lifted and an incision of about 1 cm length was made. About this incision, a subcutaneous pocket was created with blunt scissors, in each of which two of the pieces of foil were inserted with tweezers. The wound closure took place by means of two single button booklets.
  • FIG. 1 shows, as a negative control, the corresponding region of the subcutaneous tissue of a mouse in which no implantation of the angiogenesis-promoting substrate was carried out. There is very little blood vessel penetration seen as normal for the subcutaneous skin tissue of the mouse.
  • Figures 2a to 2c show photographs of the subcutaneous skin tissue in the region of the implanted pieces of foil A, B and C, respectively, after the corresponding mice were killed 12 days after implantation. The position of the pieces of film is indicated by black squares (reference numbers A, B and C, respectively, for the corresponding film) because the films themselves are poorly visible in the photograph. The films were partly dyed with Coomassie Brilliant Blue, as is visible in FIG. 2a.
  • FIG. 3 The result is shown in FIG. 3.
  • the relatively thin gelatin films B are already largely absorbed after 21 days and have lost their structural integrity.
  • the photographic representation shows that the newly formed blood vessels, which were observed in the corresponding films after 12 days (see Figure 2b), have regressed again.
  • angiogenesis in the human or animal body can be specifically stimulated both spatially and temporally.

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Abstract

Um ein Angiogenese förderndes Substrat bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig herstellbar ist, wird vorgeschlagen, dass das Substrat einen nicht-porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.

Description

Angiogenese förderndes Substrat
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Angiogenese förderndes Substrat.
In lebenden Säugetieren bilden Endothelzellen, die existierende Blutgefäße auskleiden, neue Kapillaren, wo auch immer diese benötigt werden. Die Endothelzellen haben die bemerkenswerte Fähigkeit, ihre Anzahl und Anordnung den örtlichen Erfordernissen anzupassen. Gewebe sind von der Blutversorgung abhängig, die durch das Blutgefäßsystem erfolgt. Das Gefäßsystem wiederum hängt von den Endothelzellen ab. Die Endothelzellen schaffen ein anpassungsfähiges Lebenssicherungssystem, das sich in fast alle Körperregionen verästelt.
Während die größten Blutgefäße, die Arterien und Venen, eine dicke, starke Wand aus Bindegewebe und teilweise glatter Muskulatur aufweisen und im Innern nur mit einer äußerst dünnen, einfachen Lage von Endothelzellen ausgekleidet sind, findet man in den feinsten Verästelungen des Gefäßsystems, den Kapillaren, Wände, die lediglich aus Endothelzellen und einer so genannten Ba- sallamina bestehen. Endothelzellen kleiden so das gesamte System der Blutgefäße aus, das vom Herzen bis in die kleinste Kapillare reicht und sie kontrollieren den Durchgang von Faktoren und Zellen in die und aus der Blutbahn.
Zellen in Geweben setzen bei Sauerstoffmangel Angiogenesefaktoren frei, die das Wachstum neuer Kapillaren anregen. Örtliche (mechanische) Reizungen und Infektionen verursachen ebenfalls die Proliferation neuer Kapillaren, von denen sich die meisten zurückziehen und verschwinden sobald die Entzündung abklingt. Die neu entstehenden Blutgefäße entstehen immer zuerst als Kapillaren, die an bestehenden kleinen Gefäßen aussprießen. Dieser Vorgang wird Angioge- nese genannt.
Das Aussprießen der Kapillaren setzt sich fort bis der jeweilige Spross auf eine andere Kapillare trifft und sich mit ihr verbinden kann, sodass Blut darin zirkulieren kann (vgl. z.B. B. Alberts et al., Molekularbiologie der Zelle, VCH Weinheim, 3. Auflage 1995, Seiten 1360 - 1364).
Angiogenese stimulierende Faktoren sind vielfältig bekannt und umfassen z.B. die Faktoren HGF, FGF, VEGF und andere mehr.
Es wurde in der Literatur (vgl. z.B. EP 1 415 663 Al und EP 1 555 030 Al) vorgeschlagen, solche Angiogenese stimulierenden Faktoren in einer Matrix mit Depotwirkung zu applizieren, wobei als Depotmatrix ein Gelatinehydrogel aus einer Gelatine mit einem mittleren Molekulargewicht von 100.000 bis 200.000 Dalton (Da) empfohlen wurde.
Für unterschiedliche Typen von Kollagen werden deren Eignung als Stützstruktur bei der Bildung neuer Gefäße beschrieben, ebenso wie deren anti-an- giogenetischen Effekte. Als Beispiele für diese Literatur darf auf S. M. Sweeney et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 278, No. 33, Seiten 30516 bis 30524 (2003) sowie R. Xu et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications 289, Seiten 264 bis 268 (2001) verwiesen werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Angiogenese förderndes Substrat bereit zu stellen, welches einfach und kostengünstig herstellbar ist.
Diese Aufgabe wird durch ein Angiogenese förderndes Substrat gelöst, welches einen nicht-porösen Formkörper umfasst, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist. Materialien auf der Basis von Gelatine werden aufgrund ihrer guten Bioverträglichkeit bereits seit Längerem für medizinische Anwendungen eingesetzt, beispielsweise als Matrixmaterial für die Freisetzung pharmazeutischer Wirkstoffe oder als Trägermaterial für die Besiedlung mit Zellen. Im Gegensatz etwa zu Kollagen ist Gelatine in reproduzierbarer Qualität und hoher Reinheit herstellbar. Weiterhin ist sie im Körper im Wesentlichen vollständig resorbierbar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass das Gelatine enthaltende Material als solches einen Angiogenese fördernden Effekt zeigt, d.h. in seiner unmittelbaren Umgebung die Ausbildung neuer Blutgefäße stimuliert, ohne dass es hierzu weiterer Angiogenese fördernder Faktoren, wie z.B. die oben genannten Signalmoleküle VEGF, FGF oder HGV, bedarf.
Besonders bemerkenswert ist dabei, dass der erfindungsgemäße Angiogenese fördernde Effekt bei einem nicht-porösen Formkörper, der aus dem Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, beobachtet wird. Bei früheren Untersuchungen der Erfinder war zunächst ein Angiogenese fördernder Effekt bei porösen Formkörpern aus Gelatine enthaltendem Material gefunden worden, wobei die Angiogenese in erster Linie innerhalb der Formkörper stattfand, d.h. ein Einwachsen von Blutgefäßen in die Poren, Hohlräume oder Zwischenräume des Formkörpers beobachtet wurde. Der pro-angiogenetische Effekt wurde daher in erster Linie der porösen Struktur des Formkörpers zugeschrieben (siehe die deutsche Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 10 2005 054 937). Beispiele für solche Strukturen sind Schwämme, Gewebe oder Vliese.
Demgegenüber konnte nun gezeigt werden, dass gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein nicht-poröser Formkörper als Angiogenese förderndes Substrat verwendet werden kann, wobei die Blutgefäßbildung nicht in dem Formkörper, sondern in seiner räumlichen Umgebung erfolgt. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass dieser Effekt durch eine Freisetzung löslicher Komponenten der Gelatine hervorgerufen wird und daher von der Struktur des Formkörpers weitgehend unabhängig ist.
Nicht-poröse Formkörper aus einem Gelatine enthaltendem Material sind in der Regel einfacher herzustellen als solche mit einer porösen Struktur. Auf der anderen Seite hat der Einsatz eines Formkörpers aus einem unlöslichen Material, welcher erst nach einer bestimmten Zeit resorbiert bzw. abgebaut wird, gegenüber dem Einsatz löslicher bzw. gelöster Gelatine den Vorteil, dass die Angiogenese gezielt an einem bestimmten Ort, nämlich der Umgebung des eingesetzten Formkörpers, stimuliert werden kann.
Vorzugsweise ist das Gelatine enthaltende Material ein Gelatine basierendes Material und besteht zu überwiegenden Anteilen aus Gelatine. Dies bedeutet, dass die Gelatine den größten Anteil bei eventuell weiteren verwendeten Komponenten des Materials stellt.
Weiter bevorzugt wird ein Gelatine basierendes Material verwendet, welches im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
Besonders geeignete Gelatinetypen sind Schweineschwartengelatine, die vorzugsweise hochmolekular ist und einen Bloomwert von ca. 160 bis ca. 320 g aufweist.
In einem erheblich geringeren Umfang beobachtet man einen Angiogenese anregenden Effekt auch bei niedermolekularer, wasserlöslicher Gelatine mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 6 kDa, jedoch ist ein solcher Effekt verglichen mit anderen ebenfalls in geringerem Umfang stimulierenden Agenzien vergleichsweise unspezifisch.
Die verwendete Gelatine hat deshalb bevorzugt ein mittleres Molekulargewicht von mehr als ca. 6 kDa. Um eine optimale Bioverträglichkeit des erfindungsgemäßen Substrates bei der medizinischen Anwendung zu gewährleisten, wird als Ausgangsmaterial bevorzugt eine Gelatine mit einem besonders geringen Gehalt an Endotoxinen eingesetzt. Bei Endotoxinen handelt sich um Stoffwechselprodukte oder Bruchstücke von Mikroorganismen, welche in dem tierischen Rohmaterial vorkommen. Der Endotoxingehalt von Gelatine wird in internationalen Einheiten pro Gramm (I.E./g) angegeben und gemäß dem LAL-Test bestimmt, dessen Durchführung in der vierten Ausgabe des Europäischen Arzneibuches (Ph. Eur. 4) beschrieben ist.
Um den Gehalt an Endotoxinen möglichst gering zu halten, ist es vorteilhaft, die Mikroorganismen möglichst frühzeitig im Zuge der Gelatineherstellung abzutöten. Ferner sollten entsprechende Hygienestandards beim Herstellungs- prozess eingehalten werden.
Somit kann der Endotoxingehalt von Gelatine durch bestimmte Maßnahmen beim Herstellungsprozess drastisch gesenkt werden. Zu diesen Maßnahmen zählen in erster Linie die Verwendung frischer Rohmaterialien (z.B. Schweineschwarte) unter Vermeidung von Lagerzeiten, die sorgfältige Reinigung der gesamten Produktionsanlage unmittelbar vor Beginn der Gelatineherstellung sowie gegebenenfalls das Auswechseln von Ionenaustauschern und Filtersystemen in der Produktionsanlage.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Gelatine weist bevorzugt einen Endotoxingehalt von ca. 1.200 I.E./g oder weniger, noch mehr bevorzugt von ca. 200 I. E/g oder weniger auf. Optimalerweise liegt der Endotoxingehalt bei ca. 50 I.E./g oder weniger, jeweils gemäß dem LAL-Test bestimmt. Im Vergleich hierzu weisen manche handelsübliche Gelatinen Endoto- xingehalte von über 20.000 I.E./g auf.
Wie bereits oben angesprochen, ist der nicht-poröse Formkörpers des Angio- genese fördernden Substrats erfindungsgemäß aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen Material gebildet, sodass er über einen be- stimmten Zeitraum seine strukturelle Integrität erhält und die Angiogenese auf den gewünschten Zielbereich lokalisiert werden kann. Da jedoch Gelatine unter physiologischen Bedingungen schnell aufgelöst wird, ist das Gelatine enthaltende Material vorzugsweise vernetzt.
Entsprechend einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann einer schnellen Auflösung entgegengewirkt werden, indem man die Gelatine zusammen mit anderen, langsamer in Lösung gehender Komponenten verwendet (Beispiele für solche resorbierbaren Biopolymere sind Chitosan und Hyaluronsäure). Solche Komponenten können zum Zweck einer zeitweisen Immobilisierung der Gelatineanteile verwendet werden.
Wählt man die Vernetzung zur Stabilisierung des Materials, kann insbesondere der Gelatineanteil des Gelatine enthaltenden Materials vernetzt sein, wobei zum einen auf eine chemische Vernetzung, aber auch auf eine enzymatische Vernetzung zurückgegriffen werden kann.
Bevorzugte chemische Vernetzungsmittel sind Aldehyde, Dialdehyde, Isocya- nate, Carbodiimide und Alkyldihalogenide. Besonders bevorzugt ist dabei Formaldehyd, welches gleichzeitig eine Sterilisierung des Formkörpers bewirkt.
Als enzymatisches Vernetzungsmittel wird bevorzugt das Enzym Transglutami- nase eingesetzt, welches eine Verknüpfung der Glutamin- und Lysinseiten- ketten von Proteinen, insbesondere auch von Gelatine, bewirkt.
Die Stabilität gegenüber Resorption unter den zuvor angesprochenen physiologischen Bedingungen, denen das Material bei seiner Verwendung ausgesetzt ist, kann unter entsprechenden physiologischen Standardbedingungen in vitro nachgestellt werden. Hierbei wird ein PBS-Puffer (pH 7,2) bei 37 0C verwendet und unter diesen Bedingungen lassen sich die Substrate auf ihr zeitabhängiges Stabilitätsverhalten testen und vergleichen. Bevorzugt weist das Gelatine enthaltende Material einen vorgegebenen Vernetzungsgrad auf. Durch die Vorgabe des Vernetzungsgrades kann insbesondere die Resorptionsstabilität des Formkörpers eingestellt werden, d.h. die Zeit, während der er unter physiologischen Bedingungen seine strukturelle Integrität erhält. So können beispielsweise nicht-poröse Formkörper als Angio- genese fördernde Substrate eingesetzt werden, die in Abhängigkeit vom Vernetzungsgrad des Gelatine enthaltenden Materials z.B. ein, drei, sechs oder zwölf Wochen unter physiologischen Standardbedingungen stabil sind, je nachdem, über welchen Zeitraum eine angiogenetische Wirkung vom behandelnden Arzt gewünscht wird.
Überraschenderweise hat sich auch gezeigt, dass die Angiogenese fördernde Wirkung des Formkörpers umso höher ist, je höher der Vernetzungsgrad des Gelatine enthaltenden Materials ist, insbesondere im Fall einer chemischen Vernetzung der Gelatine. Dieser öffnet weitere Möglichkeiten, die Angiogenese auch quantitativ gezielt zu stimulieren.
Der nicht-poröse Formkörper wird vorzugsweise mittels einer zweistufigen Vernetzung in seiner Struktur stabilisiert, wobei in einer ersten Stufe das Gelatine enthaltende Material in Lösung einer ersten Vernetzungsreaktion unterworfen wird, und dann ein aus diesem Material hergestellter Formkörper in einer zweiten Vernetzungsstufe weiter vernetzt wird.
Während bei der ersten Vernetzungsstufe die Vernetzung in Lösung geschieht, bietet sich für die zweite Vernetzungsstufe insbesondere eine Vernetzung in der Gasphase an, beispielsweise unter Verwendung von Formaldehyd.
Die Herstellung von Formkörpern aus einem Gelatine enthaltenden Material mittels eines zweistufigen Vernetzungsverfahrens ist in der Offenlegungsschrift DE 10 2004 024 635 Al im Detail beschrieben.
Die zweistufige Vernetzung hat insbesondere den Vorteil, dass insgesamt ein höherer Vernetzungsgrad erzielbar ist, der dann darüber hinaus auch noch über den gesamten Querschnitt des Formkörpers im Wesentlichen gleichmäßig realisiert werden kann. Dies hat zur Folge, dass die Abbaueigenschaften des Formkörpers bei der Resorption homogen sind, sodass dieser für die vom Vernetzungsgrad abhängige vorgesehene Zeitdauer im Wesentlichen seine strukturelle Integrität behält und dann in relativ kurzer Zeit unter Verlust der strukturellen Integrität vollends resorbiert wird.
Durch den vorgegebenen Vernetzungsgrad und das oben beschriebene homogene Abbauverhalten lässt sich somit der Angiogenese fördernde Effekt des erfindungsgemäßen Substrates sowohl zeitlich als auch räumlich sehr gezielt einsetzen.
Für viele Anwendungsfälle sollte der Vernetzungsgrad so gewählt werden, dass während 7 Tagen ca. 20 Gew.-% oder weniger des Gelatine enthaltenden Materials unter den oben genannten physiologischen Standardbedingungen abgebaut werden.
Der nicht-poröse Formkörper kann in sehr unterschiedlichen Ausprägungen realisiert werden, über die bisher noch nicht gesprochen wurde.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Formkörper ein Flächenmaterial. Flächenmaterialien können in vielfältiger Weise als medizinische Substrate im oder am Körper eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Formkörper um eine Folie. Derartige Folien können auf einfache Weise durch Gießen einer Lösung eines Gelatine enthaltenden Materials hergestellt werden, wobei dieses Verfahren mit dem oben beschriebenen zweistufigen Vernetzungsverfahren kombiniert werden kann.
Folien aus einem Gelatine enthaltenden Material sind gut handhabbar und können vom behandelnden Arzt jeweils auf die benötigte Größe zugeschnitten werden. Um die Flexibilität der Folie zu erhöhen, kann das Gelatine enthal- tende Material zusätzlich einen oder mehrere Weichmacher enthalten. Bevorzugte Weichmacher sind ausgewählt aus Glycerin, Oligoglycerinen, Oligogly- kolen, Sorbit und Mannit.
Die Folie weist bevorzugt eine Dicke im Bereich von ca. 20 bis ca. 500 μm, weiter bevorzugt von ca. 50 bis ca. 100 μm, auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt der nicht-poröse Formkörper in Form von Partikeln vor. Bei den Partikeln kann es sich beispielsweise um Kügelchen, Granulat oder Pulver aus einem Gelatine enthaltenden Material handeln.
Bevorzugte Partikel weisen einen mittleren Durchmesser von ca. 0,1 mm bis ca. 5 mm auf.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst der nichtporöse Formkörper ein oder mehrere nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe. Hierbei kann es sich beispielsweise um entzündungshemmende oder antibiotische Wirkstoffe handeln.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist der nicht-poröse Formkörper mit Zellen besiedelt. In diesem Fall kann das erfindungsgemäße Substrat für Zelltransplantationen eingesetzt werden, bei denen eine Angiogenese im Bereich der implantierten Zellen erwünscht ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines nicht-porösen Formkörpers, der aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, zur Herstellung eines Angiogenese fördernden Substrats, welches zum Einsatz im oder am menschlichen oder tierischem Körper bestimmt ist. Vorteile und bevorzugte Ausführungsform dieser Verwendung ergeben sich insbesondere aus der obigen Beschreibung des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrats. Bei einer bevorzugten Verwendung wird das Substrat als Wundauflage oder -abdeckung eingesetzt. Durch das Aufbringen des Substrates auf Verletzungen oder Verbrennungen insbesondere der Haut kann die angiogenetische Wirkung zur schnelleren Wundheilung beitragen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Angiogenese fördernde Substrat zur Implantation in den Körper bestimmt. Das Substrat kann hierbei an den verschiedensten Stellen des Körpers intracorporal eingesetzt werden, wo immer eine gezielte Förderung der Angiogenese erforderlich oder wünschenswert ist.
Bevorzugte Anwendungsbereiche des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrats sind z.B. Transplantationen, die Behandlung von Diabetes oder von Infarkten.
Bei der Durchführung von therapeutischen Verfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substrates wird ein nicht-poröser Formkörper in der jeweils erforderlichen Gestalt und Größe zur Verfügung gestellt oder vom behandelnden Arzt entsprechend zugeschnitten, um anschließend in oder an den entsprechenden Bereich des menschlichen oder tierischen Körpers eingebracht zu werden.
Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden im Folgenden anhand der Zeichnung sowie der Beispiele im Einzelnen erläutert. Es zeigen im Einzelnen:
Figur 1 : Fotografische Darstellung der Blutgefäßbildung ohne ein Angiogenese förderndes Substrat;
Figuren 2a bis 2c: fotografische Darstellungen der Blutgefäßbildung bei verschiedenen erfindungsgemäßen Angiogenese fördernden Substraten; Figur 3: fotografische Darstellung der Blutgefäßbildung nach Resorption des Angiogenese fördernden Substrats.
Herstellung von Folien aus einem Gelatine enthaltenden Material
Als Beispiele für nicht-poröse Formkörper wurden Gelatinefolien mit drei unterschiedlichen Vernetzungsgraden (Folien A, B und C) mittels eines zweistufigen Vernetzungsverfahrens hergestellt.
Für jeden der drei Ansätze wurden 25 g Schweineschwartengelatine (300 g Bloom), 9 g einer 85 Gew.-%igen Glycerinlösung sowie 66 g destilliertes Wasser gemischt und die Gelatine bei einer Temperatur von 60 0C gelöst. Nach dem Entgasen der Lösungen durch Ultraschall wurde zur Durchführung des ersten Vernetzungsschrittes eine wässrige Formaldehydlösung (2,0 Gew.-%ig, Raumtemperatur) zugegeben, und zwar 3,75 g dieser Lösung beim Ansatz A und jeweils 6,25 g der Lösung bei den Ansätzen B und C.
Die Mischungen wurden homogenisiert und bei ca. 60 0C in einer Dicke von ca. 250 μm auf eine Polyethylenunterlage geräkelt.
Nach dem Trocknen bei 30 0C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 30 % für etwa einen Tag wurden die Folien von der PE-Unterlage abgezogen und ca. 12 h unter denselben Bedingungen nachgetrocknet. Die getrockneten Folien (Dicke ca. 50 μm) wurden zur Durchführung des zweiten Vernetzungsschrittes in einem Exsikkator dem Gleichgewichtsdampfdruck einer 17 Gew.-%igen wässrigen Formaldehydlösung bei Raumtemperatur ausgesetzt. Im Falle der Folien A und B betrug die Einwirkzeit des Formaidehyddampfs 2 h, im Falle der Folie C 17 h.
Von den auf diese Weise hergestellten Formkörpern weist die Folie A insgesamt den geringsten und die Folie C insgesamt den höchsten Vernetzungsgrad auf, die Folie B liegt dazwischen. Dies spiegelt sich im unterschiedlichen Abbauverhalten der Folien wider, wobei die Resorptionszeiten der beschriebenen Folien unter physiologischen Bedingungen im Tierversuch (siehe unten) zwischen ca. 14 Tagen (Folie A) und ca. 21 Tagen (Folie C) liegen.
Aufgrund des Einsatzes von Glycerin als Weichmacher zeigen die Folien eine ausreichende Flexibilität, insbesondere in hydratisiertem Zustand, um eine gute Handhabbarkeit bei der medizinischen Anwendung zu gewährleisten, ohne dass ein Brechen oder Reißen der Folien zu befürchten ist.
Nachweis der Angiogenese fördernden Wirkung im Tierversuch
Die Wirksamkeit der Gelatinefolien A, B und C als Angiogenese fördernde Substrate in vivo wurde im Tierversuch untersucht. Als Versuchstiere wurden zehn Wochen alte Mäuse des Stammes Balb/C der Firma Charles River (Sulzfeld) mit einem Körpergewicht von 20 g verwendet.
Als Substrate wurden jeweils 5 x 5 mm2 große Stücke der oben beschriebenen Gelatinefolien eingesetzt. Den Mäusen wurden jeweils zwei Folienstücke eines bestimmten Vernetzungsgrades subkutan im Nackenbereich implantiert. Hierzu wurden die Tiere narkotisiert und das Fell im Nackenbereich abrasiert. Mit einer Pinzette wurde ein Stück der Nackenhaut angehoben und ein Einschnitt von ca. 1 cm Länge durchgeführt. Über diesen Einschnitt wurde mit einer stumpfen Schere eine subkutane Tasche geschaffen, in die je zwei der Folienstücke mit einer Pinzette eingelegt wurden. Der Wundverschluss erfolgte mittels zweier Einzelknopfhefte.
Nach 12 Tagen wurden die Tiere getötet und die angiogenetische Wirkung der implantierten Substrate optisch ausgewertet.
Die Figur 1 zeigt als Negativkontrolle den entsprechenden Bereich des subkutanen Gewebes einer Maus, bei der keine Implantation des Angiogenese fördernden Substrats durchgeführt wurde. Es ist eine nur sehr geringe Durchsetzung mit Blutgefäßen zu beobachten, wie es für das subkutane Hautgewebe der Maus normal ist. Die Figuren 2a bis 2c zeigen fotografische Aufnahmen des subkutanen Hautgewebes im Bereich der implantierten Folienstücke A, B bzw. C, nachdem die entsprechenden Mäuse 12 Tage nach der Implantation getötet wurden. Die Lage der Folienstücke ist durch schwarze Quadrate gekennzeichnet (Bezugszeichen A, B bzw. C für die entsprechende Folie), da die Folien selbst in der Fotografie schlecht sichtbar sind. Versuchsweise wurden die Folien z.T. mit Coomassie Brilliant Blue eingefärbt, wie dies in der Figur 2a sichtbar ist.
In allen drei Abbildungen ist eine deutlich verstärkte Blutgefäßbildung in der Umgebung der implantierten Folienstücke zu erkennen. Sowohl die Anzahl als auch die Größe der Blutgefäße sind jeweils deutlich höher als bei der Negativkontrolle in Figur 1. Dieses Ergebnis belegt, dass durch nicht-poröse Formkörper, die aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet sind, die Angiogenese lokal stimuliert werden kann.
Um den zeitlichen Rahmen der Angiogenese fördernden Wirkung zu untersuchen, wurden bei einer weiteren Maus zwei Folienstücke der Folie B (mittlerer Vernetzungsgrad) implantiert (wie oben beschrieben). Diese Maus wurde nach 21 Tagen getötet und das subkutane Gewebe im Bereich der Implantate wiederum optisch ausgewertet.
Das Ergebnis zeigt die Figur 3. Die relativ dünnen Gelatinefolien B sind nach 21 Tagen bereits weitgehend resorbiert und haben ihre strukturelle Integrität verloren. Gleichzeitig zeigt die fotografische Darstellung, dass die neu gebildeten Blutgefäße, die bei den entsprechenden Folien nach 12 Tagen beobachtet wurden (vgl. Figur 2b), sich wieder zurückgebildet haben.
Dieses Ergebnis zeigt, dass der angiogenetische Effekt des nicht-porösen Formkörpers zeitlich begrenzt ist. Mit der fortschreitenden Resorption des Angiogenese fördernden Substrats bilden sich auch die Blutgefäße wieder zurück. Über die Wahl des vorgegebenen Vernetzungsgrades kann jedoch die Resorp- tionsgeschwindigkeit und damit auch der zeitliche Rahmen der Angiogenese beeinflusst werden.
Insgesamt bestätigen diese Versuche, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Substrates gezielt, sowohl räumlich als auch zeitlich, die Angiogenese im menschlichen oder tierischen Körper stimuliert werden kann.

Claims

Ansprüche
1. Angiogenese förderndes Substrat, umfassend einen nicht-porösen Formkörper, welcher aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist.
2. Substrat nach Anspruch 1, wobei das Gelatine enthaltende Material zu einem überwiegenden Anteil aus Gelatine besteht.
3. Substrat nach Anspruch 2, wobei das Gelatine enthaltende Material im Wesentlichen vollständig aus Gelatine besteht.
4. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine einen Bloom-Wert im Bereich von ca. 160 bis ca. 320 g aufweist.
5. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine ein Molekulargewicht von mehr als ca. 6 kDa aufweist.
6. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Gelatine einen gemäß dem LAL-Test bestimmten Endotoxingehalt von ca. 1.200 I.E./g oder weniger, insbesondere von ca. 200 I.E./g oder weniger, aufweist.
7. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gelatine enthaltende Material vernetzt ist.
8. Substrat nach Anspruch 7, wobei die Gelatine vernetzt ist.
9. Substrat nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Gelatine enthaltende Material unter Verwendung von Formaldehyd vernetzt ist.
10. Substrat nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Gelatine enthaltende Material einen vorgegebenen Vernetzungsgrad aufweist.
11. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper ein Flächenmaterial ist.
12. Substrat nach Anspruch 11, wobei das Flächenmaterial eine Folie ist.
13. Substrat nach Anspruch 12, wobei die Folie eine Dicke im Bereich von ca. 20 bis ca. 500 μm, bevorzugt von ca. 50 bis ca. 100 μm, aufweist.
14. Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der nicht-poröse Formkörper in Form von Partikeln vorliegt.
15. Substrat nach Anspruch 14, wobei die Partikel einen mittleren Durchmesser von ca. 0,1 mm bis ca. 5 mm aufweisen.
16. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper ein oder mehrere nicht Gelatine basierende pharmazeutische Wirkstoffe umfasst.
17. Substrat nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der nichtporöse Formkörper mit Zellen besiedelt ist.
18. Verwendung eines nicht-porösen Formkörpers, der aus einem unter physiologischen Bedingungen unlöslichen, resorbierbaren, Gelatine enthaltenden Material gebildet ist, zur Herstellung eines Angiogenese fördernden Substrats, welches zum Einsatz im oder am menschlichen oder tierischen Körper bestimmt ist.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Substrat als Wundauflage oder -abdeckung eingesetzt wird.
20. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Substrat zur Implantation in den Körper bestimmt ist.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat bei Transplantationen eingesetzt wird.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat zur Behandlung von Infarkten bestimmt ist.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das Substrat zur Behandlung von Diabetes bestimmt ist.
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