EP1991516A2 - Derive de resveratrol a longue chaine hydroxylee utiles comme neurotrophiques - Google Patents

Derive de resveratrol a longue chaine hydroxylee utiles comme neurotrophiques

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Publication number
EP1991516A2
EP1991516A2 EP07712425A EP07712425A EP1991516A2 EP 1991516 A2 EP1991516 A2 EP 1991516A2 EP 07712425 A EP07712425 A EP 07712425A EP 07712425 A EP07712425 A EP 07712425A EP 1991516 A2 EP1991516 A2 EP 1991516A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
general formula
represent
formula
cells
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07712425A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Bang Luu
Frédérique HAUSS
Djalil Coowar
Jiawei Liu
Paul Heuschling
Eleonora Morga
Luc Grandbarbe
Alessandro Michelucci
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Luxembourg
Universite du Luxembourg
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Luxembourg
Universite du Luxembourg
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Luxembourg, Universite du Luxembourg filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1991516A2 publication Critical patent/EP1991516A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C39/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C39/205—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring polycyclic, containing only six-membered aromatic rings as cyclic parts with unsaturation outside the rings
    • C07C39/21—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring polycyclic, containing only six-membered aromatic rings as cyclic parts with unsaturation outside the rings with at least one hydroxy group on a non-condensed ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/23—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups

Definitions

  • the subject of the present invention is a neurotrophic, neuroprotective and / or anti-inflammatory compound, in particular a resveratrol derivative carrying a long ⁇ -alkanol chain of general formula (I) below:
  • R 1, R 2 and R 3 independently of one another a hydrogen atom or an alkyl group Ci-C 6 group, a (C 1 -C 6) alkoxycarbonyl, R 4, Rs, R 6 and R 7 represent a hydrogen atom or an alkoxy group-C 6 alkyl, Ci-C 6, a group (alkyl-C 6) alkoxycarbonyl oxyet n is an integer between 8 and 20, preferably between 10 and 16.
  • the central nervous system consists of two cell populations that can be described as neural cells: neurons, and all other cell types, grouped under the name of glial cells.
  • Astrocytes and oligodendrocytes are the major types of glia in adults. These cells are generated throughout the fetal life and their production continues after birth and into adults in certain areas of the brain.
  • Neurons, astrocytes and oligodendrocytes derive from a common precursor, a multipotent cell with theoretically unlimited proliferation capabilities, which is localized in the neural tube. These precursors can be considered as neural stem cells because they meet the criteria that define stem cells: self-renewal, almost infinite proliferation capacity and capacity to generate the cell types constituting the tissue from which they are derived.
  • the neuron a highly specialized cell, develops within a support and environment tissue, glia. Central glia are glial cells of the central nervous system and peripheral glia are glial cells of the peripheral nervous system.
  • central glia includes astrocytes (astroglia), oligodendrocytes (oligodendroglia) and microglia (microglia).
  • Peripheral glia comprises Schwann cells, equivalent to oligodendrocytes of central glia.
  • Astrocytes are constituents of the blood-brain barrier (BBB). They intervene in the regulation of the cerebral metabolism and serve as interface between the capillaries and the neurons (nutritive role) via prolongations (pseudopods) which wrap around the capillaries. They participate in the reuptake of neurotransmitters and also intervene in healing by producing glial filaments (components of the cytoskeleton).
  • BBB blood-brain barrier
  • Microgliocytes are glial cells originating in the myeloid lineage that invade the central nervous system during the embryonic period. Microglia is specialized in the elimination of macromolecules, phagocytosis of cells in apoptosis or necrosis, recognition and elimination of pathogenic elements, as well as in the regulation of the immune response.
  • Oligodendrocytes provide myelinization of axons in the central nervous system. There is a diversity of progenitors at the origin of oligodendrocytes. These cells are generated in very small ventricular foci throughout the neural tube. In adults oligodendrocytes are scattered throughout the brain parenchyma, with predominance in white matter bundles.
  • the myelin sheath synthesized by oligodendrocytes, is a membrane protein complex that wraps around axons. It has a dual function: it plays a role of electrical insulator and especially it increases the speed of propagation of nerve impulses. Impairment of this sheath will lead to a slowdown, or even a cessation of the action potential, disrupting the nerve transmission of the information and causing neurological disorders.
  • the loss or degeneration of myelin causes the appearance of so-called demyelinating or dysmyelinating diseases.
  • the public health problems posed by neurodegenerative and demyelinating diseases such as Alzheimer's disease and multiple sclerosis are unquestionable, as are their economic stakes. These diseases, today incurable, cause the slow and very progressive death of nerve cells and remain, for the most part, devoid of any effective treatment.
  • Alzheimer's disease in the world is 12 million and will be multiplied by 3 in 50 years in view of the increase in life expectancy in developed countries.
  • MS Multiple Sclerosis
  • Multiple sclerosis affects around 2.5 million people worldwide, including many young adults (between the ages of 20 and 40).
  • oligodendrocytes and their precursors can survive the inflammatory phenomena of the first phase, but that their number and their effectiveness are considerably reduced during the chronic phase.
  • Two therapeutic possibilities were previously considered: transplantation of oligodendrocyte precursors (graft) or stimulation of myelination by chemicals from surviving oligodendrocytes and endogenous oligodendrocyte precursors (endogenous remyelination).
  • transplantation transplantation of oligodendrocyte precursors (graft) or stimulation of myelination by chemicals from surviving oligodendrocytes and endogenous oligodendrocyte precursors (endogenous remyelination).
  • endogenous oligodendrocyte precursors endogenous oligodendrocyte precursors
  • oligodendrocytes are very young (embryonic) human nervous tissue, which raises ethical and practical problems. We do not know what their migratory properties will be. However, the problem is that, in most patients, the lesions are multiple and it is illusory to "graft" each individually. It is furthermore not known whether these oligodendrocytes are able to migrate by themselves or whether the intervention of specific chemical factors is essential, just as the longevity of these cells is unknown.
  • the mechanisms by which a neural stem cell gives rise to the three major CNS cell types are still poorly understood. However, it is known that this development proceeds in successive stages during which the developmental potentialities of the neural stem cell are progressively restricted. There is thus production of intermediate precursors with increasingly limited potentialities that will lead to highly differentiated cells. Initially, the stem cells are of embryonic origin. They are thus mainly present in fetuses and young children. They are able to multiply almost to infinity. Under the action of these neurotrophic factors, they are transformed into mature and functional cells of different types (Y. Chang, H. Son, Y. S. Lee & S.H. Lee, Molecular and Cellular Neuroscience 2003, 23N 3, 414-426).
  • the neural stem cells that is to say the stem cells present in the brain, can be transformed into neurons, astrocytes or oligodendrocytes, i.e. say the main types of nerve cells.
  • these natural protein growth factors can not cross various biological barriers, in particular the blood-brain barrier. They can not penetrate the brain in sufficient quantities to exercise their beneficial actions. In addition, they have a very poor bioavailability, thus limiting their effectiveness and their use.
  • stem cells when used for the treatment of degenerative neuropathies, the latter are introduced into the brain using a surgical procedure that is a risky invasive step (CN Svendsen and MA Caldwell, Progress in Brain Research, 2000, vol 127,13-34) as can precursors of oligodendrocytes.
  • the invention now provides an advantageous alternative to transplantation. Indeed, the inventors have discovered, surprisingly and unexpectedly, that if an alkanol chain is grafted onto a resveratrol nucleus, molecules capable of crossing the blood-brain barrier and of promoting endogenous remyelination by modulating the cellular specification of the stem cells are obtained.
  • the compounds of the present invention are particularly suitable for use in the treatment of Alzeimer's disease. More particularly, the compounds according to the invention promote neuronal survival and neurite growth. The compounds according to the invention are also capable of reducing the inflammatory component during diseases affecting the nervous system.
  • microglia and / or astrocytes can thus, in particular, reduce the activation of microglia and / or astrocytes.
  • These compounds are also capable of reducing reaction gliosis, ie, glial scarring, more particularly by modulating the expression of certain compounds of the astrocyte cytoskeleton.
  • the suppression of microglial cell activation and the transformation of neural stem cells into mature oligodendrocyte cells are essential characteristics for the treatment of neurodegenerative or demyelinating / dysmyelinating diseases such as, in particular, multiple sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, but also vascular dementia, amyotrophic lateral sclerosis, infantile spinal muscular atrophy and stroke neuropathy.
  • the antioxidant power of resveratrol is due to the presence of hydroxyl groups and more particularly to that at the 4 'position:
  • Resveratrol Hydroxyl radicals are very reactive electrophilic species, so they will easily react by substitution with aromatic compounds.
  • the hydroxyl radical will preferentially add to the activated position 3 'of the aromatic ring, due to the electro-donor effect of the OH group in the 4' para position.
  • Resveratrol is a polyphenol found in wine, tea and various fruits. Since the last ten years a growing interest for this compound can be observed. It is partly related to a study undertaken in the south of France revealing a correlation of inverse correlation between wine consumption and cardiovascular diseases; this phenomenon is called the French Paradox [l].
  • resveratrol is found in the plant extract Pofygonum cuspidatum used for a long time by traditional Chinese medicine for its anti-inflammatory properties and the treatment of certain skin allergies.
  • the subject of the present invention is the long-chain hydrocarbon alcohols substituted with a Resveratrol-type nucleus, called Resveratrol Fatty Alcohols (RFA), and also their analogues, and in particular the compounds of the following general formula (I):
  • RFA Resveratrol Fatty Alcohols
  • R 1, R 2 and R 3 independently of one another a hydrogen atom or an alkyl group C 1 -C 6 (alkyl Ci-C 6) carbonyl
  • R 4, R 5 , R 6 and R 7 represent a hydrogen atom or a C 1 -C 6 alkoxy group, a C 1 -C 6 alkylcarbonyloxy group
  • n is an integer of between 8 and 20, preferably between 10 and 16 or its pharmaceutically acceptable addition salts, isomers, enantiomers, diastereoisomers, and mixtures thereof.
  • any non-toxic acid including organic and inorganic acids.
  • Such acids include acetic, benzenesulphonic, benzoic, citric, ethanesulfonic, fumaric, gluconic, glutamic, hydrobromic, hydrochloric, lactic, maleic, malic, mandelic, methanesulfonic, mucic, nitric, pamoic, pantothenic, phosphoric, succinic, sulfuric acids. , tartaric and para-toluenesulfonic.
  • C 1 -C 6 alkyl group in the sense of the present invention any alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, linear or branched, in particular, methyl, ethyl, n-propyl, iso, propyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, t-butyl, n-pentyl, n-hexyl.
  • it is a methyl group.
  • C 1 -C 6 alkoxy group is meant in the sense of the present invention any alkoxy group of 1 to 6 carbon atoms, linear or branched, in particular, the methoxy group.
  • C 1 -C 6 alkylcarbonyl group is meant in the sense of the
  • RC - II present invention any group in which R represents a C 1 -C 6 alkyl radical as defined above.
  • radicals (alkyl Ci-C 6) carbonyl include, but are not limited to acetyl, propionyl, n-butyryl, sec- butyryl, t-butyryl, iso-propionyl and the like. In particular we mean the acetyl group.
  • (C 1 -C 6 ) alkylcarbonyloxy group is meant as used herein.
  • R represents a C 1 -C 6 alkyl radical as defined above.
  • R represents a C 1 -C 6 alkyl radical as defined above.
  • acetate group any group in which R represents a C 1 -C 6 alkyl radical as defined above.
  • the compounds of general formula (I) correspond to those for which R 1 , R 2 and R 3 represent a methyl group (Me) or a hydrogen atom.
  • the compounds of formula (I) correspond to those for which R 1 , R 2 and R 3 represent a methyl group and R 4 , R 5 , R 6 and R 7 an atom of hydrogen or a methoxy group (OMe).
  • R 5 , R 6 and R 7 represent a hydrogen atom.
  • the side chain of the compound of formula (I) corresponds to an ⁇ -alkanol in which n is between 10 and 18.
  • RFA-12 of following formula:
  • the compound is RFA-12.
  • An object of the invention thus relates to a pharmaceutical composition comprising as active substance at least one long-chain hydrocarbon alcohol compound, substituted with a Resveratrol-type nucleus. , in particular a compound of general formula (I) according to the invention as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions according to the invention are in a form favorable to the optimal protection and assimilation of the active principle.
  • the compounds or compositions according to the invention can be administered in different ways and in different forms.
  • they can be administered systemically, orally, by inhalation or by injection, for example intravenously, intramuscularly, subcutaneously, trans-dermally, intra-arterially, etc.
  • the intravenous routes, intramuscular, subcutaneous, oral and inhalation are advantageous.
  • the compounds are generally packaged as liquid suspensions, which can be injected by means of syringes or infusions, for example.
  • the compounds are generally dissolved in saline, physiological, isotonic, buffered, etc. solutions compatible with pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions may contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Agents or vehicles that can be used in liquid and / or injectable formulations include methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, polysorbate 80, mannitol, gelatin, lactose, vegetable oils, acacia, etc.
  • the compounds can also be administered in the form of gels, oils, tablets, suppositories, powders, capsules, aerosols, etc., possibly by means of dosage forms or devices providing sustained and / or delayed release.
  • an agent such as cellulose, carbonates or starches is advantageously used.
  • the compounds according to the invention may in particular modulate the activation of microglial and astrocytic cells at concentrations of 10 ⁇ 5 to 10 ⁇ 9 , preferably 10-6 to 10-8 M, even more preferably 10-6 M. These compounds allow, under the same advantageous conditions of concentrations, to induce the differentiation of neural stem cells into neurons as well as the survival of neurons under these conditions.
  • the inventors having demonstrated an activity of the compounds according to the invention at the concentrations indicated above, it is understood that the flow rate and / or the dose injected can be adapted by those skilled in the art as a function of the patient, of the pathology concerned, of the embodiment, etc. In addition, repeated injections can be performed, if necessary. On the other hand, for chronic treatments, delayed or extended systems may be advantageous.
  • the invention furthermore relates to the compounds and pharmaceutical compositions according to the present invention for their use as medicaments.
  • the compounds and compositions according to the invention are used as a medicament having a neurotrophic and / or neuroprotective and / or anti-inflammatory effect, and / or intended for the prevention or treatment of diseases or disorders of the nervous system that alter oligodendrocytes or other cells of the nervous system and / or diseases or disorders of nervous system inflammation, and / or degenerative neuropathies, and / or demyelinating or dysmyelinating diseases and / or cerebrovascular accidents or any other lesions of the system nervous.
  • the compounds or the pharmaceutical composition according to the present invention prevents or treats multiple sclerosis, Alzheimer's disease, the disease Parkinson's disease Creutzfeldt-Jakob.
  • Other diseases that can be treated are vascular dementia, amyotrophic lateral sclerosis, infantile spinal amyotrophy.
  • the lesions derived from cerebrovascular accidents and all other lesions of the nervous system may be treated by the compounds and compositions of the invention.
  • the term treatment designates both preventive and curative treatment, which can be used alone or in combination with other agents or treatments. In addition, it may be a treatment for chronic or acute disorders.
  • Another subject of the invention relates to the compounds according to the present invention for its use as a medicament for modulating the cellular specification of neural stem cells, to promote the differentiation then the survival of neurons and glial cells in differentiation, to promote the differentiation of oligodendrocyte precursor cells to mature oligodendrocytes, and / or decrease microglial activation and / or astrocyte activation and / or reaction gliosis.
  • the invention thus relates to the in vitro use of at least one compound according to the present invention for obtaining neurons and / or differentiated glial cells from stem cells.
  • the compounds of the invention may be prepared from commercial products, by implementing a combination of chemical reactions known to those skilled in the art, possibly in the light of the process for preparing the compounds of general formula (I) such as defined below [2].
  • the compounds of general formula (I) in which R 1 , R 2 and R 3 represent a hydrogen atom may in particular be obtained by a preparation process comprising the reaction step (a) of the compound of general formula (I) in which R 1 , R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group with boron tribromide in dichloromethane at -78 ° C [3]. Other solvents and other temperatures may be used.
  • R 1 , R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group
  • R 1 , R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group
  • R 4 , R 5, R 6 and R 7 are as defined above and the compound of the following general formula (III) [4]:
  • R 2 and R 3 are C 1 -C 6 alkyl
  • TBDMS is tert-butyl-dimethylsilyl
  • n is as defined above, preferably in the presence of sodium methoxide in refluxing dimethylformamide.
  • TBDMS is of particular interest as a protecting group because it can be cleaved in situ in the presence of 2M HCl.
  • the compound of general formula (III) can be obtained by the preparation process comprising the following steps (c), (d) and (e): (e) catalytic hydrogenation, advantageously with palladium on carbon at
  • R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group and n is as defined above to obtain the compound of general formula (V) below: wherein R 2 and R 3 are C 1 -C 6 alkyl and n is as defined above;
  • R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group and n is as defined above, advantageously using mixed hydride of aluminum and lithium; (c) oxidation of the alcohol of formula (VI) to the aldehyde of formula (III), advantageously using tetra-n-propylammonium perruthenate and N-methylmorpholine.
  • the compound of general formula (IV) can be obtained by the preparation process comprising the Sonogashira coupling reaction step (f) between the compound of general formula (VII) below:
  • R 2 and R 3 represent a C 1 -C 6 alkyl group and the compound of the following general formula (VIII) [6]
  • R 1 , R 2 and R 3 represent a methyl group and R 4 , R 5 , R 6 and R 7 represent a hydrogen atom or a methoxy group.
  • the synthesis of RFA is mainly based on two key steps.
  • the second step involves a Wadsworth-Emmons reaction between an aldehyde and the phosphonate formed in situ from the benzyl bromide obtained by bromination of the corresponding benzyl alcohol (Scheme 1).
  • the corresponding diols 2 are obtained.
  • the diols are commercial.
  • the monobromation reaction is carried out in a heterogeneous mixture of hydrobromic acid and cyclohexane in order to obtain the bromoalcohols 3 with good yields.
  • te / t-butyldimethylsilyl as a protective group for the alcohol function since it is easily deprotected using TBAF.
  • acetyl derivatives are obtained by the action of lithium acetylide in DMSO on the corresponding silylated bromoalcohols 4.
  • Methyl 4-iodo-3,5-dimethoxybenzoate 7 is obtained in two stages with a very acceptable yield of 87%. Initially, the inventors treated 3,5-dihydroxybenzoic acid with a methanolic solution of TV-iodosuccinimide (NIS) to form the iodinated derivative 6 and the inventors then methylated the hydroxyl functions to form the desired compound 7 necessary to the coupling of Sonogashira.
  • NIS TV-iodosuccinimide
  • the iodinated derivatives have a higher reactivity, therefore the inventors have decided to carry out the Sonogashira reaction with an iodine on the benzyl ester 7 (scheme 3), although the latter is not commercial.
  • the coupling reaction is therefore carried out according to the following reaction path:
  • the next step is the synthesis of the aldehyde required to couple Wadsworth-Emmons to form the trans-CC double bond between the two aromatic rings (Scheme 5).
  • the compound with the saturated chain 9 is obtained by catalytic hydrogenation with 5% palladium on carbon.
  • the inventors reduced the ester 9 to 10-alcohol using mixed lithium aluminum hydride.
  • the inventors then oxidized the alcohol to aldehyde 11 using tetra-n-propylammonium perruthenate TPAP [(n-Pr 4 N) RuO 4 ] and ⁇ -methylmorpholine.
  • this reaction is based on the coupling between an aldehyde and a phosphonate.
  • the benzyl alcohol 12 is brominated with phosphorus tribromide (PBr 3 ) to form the corresponding benzyl bromide IJ which in the presence of triethylphosphite (POEt 3 ) at reflux makes it possible to form the desired phosphonate 14.
  • PBr 3 phosphorus tribromide
  • POEt 3 triethylphosphite
  • the inventors were able to react the phosphonate and the aldehyde previously formed in the presence of sodium methoxide in dimethylformamide at reflux.
  • an intermediate, betaine is formed which upon removal of the triethyl phosphite oxide results in the formation of the desired coupling product.
  • the inventors have thus formed the various methoxylates of the FRG which will also be tested.
  • N-iodosuccinimide (5 g, 22.2 mmol, 1.05 eq) in methanol (15 mL) is added dropwise to a cooled solution at 0 ° C. of 3,5-dihydroxybenzoic acid ( 3.26 g, 21.2 mmol, 1 eq.) In methanol (13 mL).
  • the reaction mixture is allowed to stir at room temperature for 3h.
  • the mixture is poured into cold water (13 mL) and then into a 5% aqueous solution of Na 2 SO 3 (20 mL).
  • the aqueous phase is extracted with ether (3x100 mL).
  • reaction mixture is left to stir at room temperature for 2 h and then filtered through celite. .
  • reaction crude is purified by chromatography on silica gel (eluent heptane-AcOEt: 7-3) to give 855 mg of a colorless oil. Yield: 85%
  • Phosphorus tribromide (6.2 g, 25.0 mmol, 1.15 eq) was added to a solution of 4-methoxybenzyl alcohol (3 g, 21.7 mmol, 1 eq), cooled to 0.degree. In dichloromethane (35 mL). After 5h at room temperature, the reaction mixture is poured into ice water (100 mL) and then extracted with ether (3x100 mL). The organic phase is washed, dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to give 4.1 g of a colorless oil.
  • Triethylphosphite (565 mg, 3.44 mmol, 2 eq) and 4-methoxybenzyl bromide (478 mg, 2.38 mmol, 1.4 eq) are heated at 130 ° C. After 6 h, the reaction mixture is cooled to room temperature and then a solution of sodium methoxide at 5.4M (540 ⁇ L, 2.92 mmol, 1.7 eq.), dimethylformamide (2 mL) and a solution of 4- (14- (b.t. Butyldimethylsilyloxy) tetradecyl) -3,5-dimethoxybenzaldehyde
  • the DPPH test (2,2'-di (4-tert-octylphenyl) -1-picrylhydrazyl was used to determine the antioxidant capacity of our compounds [9] .
  • the DPPH is a stabilized radical that absorbs 517 nm (purple coloration). anti-oxidant molecule, the latter will react with the radical. Thus, a decrease in absorbance can be observed. The antioxidant capacity will therefore result in a decrease in absorbance at 517 nm.
  • the result is given by measuring the optical density at 550 nm using a spectrophotometer.
  • the result is expressed by the ICso which is the concentration at which 50% of the radicals were reduced by the antioxidant molecule.
  • Resveratrol has an IC50 of 10 ⁇ M.
  • Our hybrid molecules for their part have an IC50 of the order of 2.5 ⁇ M after an incubation time of 3 hours. It can be noticed that the antioxidant capacity is independent of the length of the ⁇ -hydroxyl chain. However, with an IC 50 of the order of 2.5 mM, our hybrid molecules retain a good antioxidant capacity.
  • the methoxylated derivatives have also been tested. These compounds have an antioxidant capacity but at concentrations tested the ICso is not reached.
  • the ABTS molecule will react with the OH hydroxyl radicals generated in the medium by the Fenton reaction to form a cation radical, ABTS + (green color), absorbing at 405 nm.
  • ABTS + green color
  • the result is given by measuring the optical density at 405 nm using a spectrophotometer.
  • Resveratrol Since the length of the chain is not critical for the antioxidant capacity, it was decided to perform this test with only one chain length. In order to minimize solubility problems, RFA10 has been tested. Resveratrol is still used as a positive control. The IC 50 values are those obtained after a 2 hour incubation. Resveratrol has an IC50 of 30 ⁇ M and RFA-10 an IC50 of 45 ⁇ M.
  • Example 14 Biological Part Inhibition of microglial activation by RFA and MRFA (Resveratrol Fatty Alcohols and Methoxylated Resveratrol Fatty Alcohols). Neuronal production by neural stem cells.
  • RFA and MRFA Resveratrol Fatty Alcohols and Methoxylated Resveratrol Fatty Alcohols.
  • the immune system is represented by a population of monocyte-macrophage-type cells, the microglial cells.
  • the various tests implemented will evaluate the ability of our compounds to modulate the activation of microglia and their anti-inflammatory activity.
  • cytokines such as TNF- ⁇ , or inducible enzymes, NOS-II and COX-II, are synthesized.
  • nitric oxide nitric oxide
  • NO and Tumor Necrosis Factor- ⁇ are indicators of microglial activation.
  • the experiments carried out thus concern the ability of the RFA, MRFA and DMRFA molecules to inhibit, in activated microglia, the release of nitrites and TNF- ⁇ .
  • NOS II NO-synthase type II
  • This enzyme is responsible for the synthesis of the nitrogen monoxide radical under inflammatory activation conditions. Microglia at rest only express levels at the limit of immunoblot detection. Activation of 24 to 48 hours leads to a sharp increase in this expression.
  • the product of this enzyme, NO degrades rapidly in culture to form nitrites.
  • An assay by colorimetry demonstrates that the levels of NO 2 "following the same trend.
  • the concentrations of NO 2 - were measured after 24 hours and 48 hours of activation in cultures of microglial cells treated with 0.01 ⁇ g / ml of LPS, in the presence of the products RFA-12, MRFA-10 , MRFA-12, MRFA-14, MRFA-16, MRFA-18, DMRFAlO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16, DMRFA- 18 MResvératrol, DMResvératrol and resveratrol at concentrations of 5.10 "6, 10 "6 and 10 " 7 M.
  • the RFA-12 induces a 50% reduction in nitrite levels in the cells at the concentration of 5.10 "6 M.
  • TNF- ⁇ represents a parameter of microglial activation often analyzed in the literature. Resting microglia do not express this cytokine. A 24 hour activation by LPS causes a strong increase in expression, detectable by Elisa test. In the experiments carried out, the concentrations of TNF- ⁇ were measured after 24 hours of activation, in cultures of microglial cells treated with 0.01 ⁇ g / ml of LPS in the presence of MRFA10, MRFA-12, MRFA-14, MRFA- 16, MRFA-18, DMRFAlO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16, DMRFA-18, MResvératrol, DMResvératrol and resveratrol at concentrations of 5.10 "6, 10" 6 and 10 "7 M.
  • RFA-12 induced a decrease in TNF- ⁇ level at the concentration of 5.10 ⁇ 6 M by 40% compared to the control values.
  • Resveratrol meanwhile, induces a decrease of only 30% under the same conditions.
  • CNS central nervous system
  • RFAs small molecules such as RFAs to control or induce the endogenous differentiation of neural stem cells into different nerve cells.
  • the neurospheres are obtained from telencephalon-derived mouse embryo cells containing 20 ng / ml EGF. After dissociation, the spheres proliferate for 3 days in the presence of EGF (20 ng / mL) during the phase called the proliferation phase.
  • Anti-MAP2ab Microtubule Associated Protein
  • TUJ1 antibody anti beta (III) tubulin
  • marker of neurons post-mitotic
  • anti-GFAP antibody Glial Fibrillary Acidic Protein
  • the anti-MAP2ab and TUJ1 antibodies are revealed by secondary antibodies coupled to a cyanine fluorochrome, Cy-3 (red).
  • a secondary antibody coupled to a fluorochrome derivative of rhodamine, the Alexa488 (green) was used.
  • the nuclei are marked by an intercalating agent, the TO-PRO (blue).
  • the cultures are then observed under a confocal microscope.
  • RFA12 induces the differentiation of neural stem cells into neurons.
  • the effect of RFA 12 on the differentiation of neural stem cells into neurons or glial cells was tested at concentrations ranging from 10 -5 to 10 -9 M. At the concentration of 10 -5 M, it should be noted that the FRG 12 does not induce differentiation by toxicity at this concentration. Meanwhile, 10 "9 M RFA-12 shows little activity. However, if the neurospheres were treated with RFAL 2 with concentrations ranging from 10 "6 M to 10" 8 M an increase in the number of neurons compared to the control (untreated cells) was observed. At concentrations of 10 "6 , 10 " 7 and 10 "8 M we can observe an increase in the neuronal population of 120%, 90% and 80% respectively compared to the control set at 100%. RFA-12 effect on the differentiation of neural stem cells into neurons is dose-dependent with a maximal effect at a concentration of 10 "6 M.
  • RFA and these analogues also act on the proliferation of neural stem cells, the latter are dissociated and then cultured in the presence of RFA (10 "6 and 10 " 8 M) for 5 days, then the number of living cells is counted as well as cell size and morphology.
  • the FRG12 makes it possible to induce the differentiation of neural stem cells into neurons while inhibiting the proliferation of these neurons at a concentration of 10 -6 M.

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Abstract

La présente invention concerne un composé de formule générale (I) suivante dans laquelle R<SUB>1</SUB>, R<SUB>2</SUB> et R<SUB>3</SUB> représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>, un groupe (alkyle en C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>) carbonyle. R<SUB>4</SUB> ,R<SUB>5</SUB>, R<SUB>6 </SUB>et R<SUB>7</SUB> représentent un hydrogène ou un groupe alkyle en C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>, un groupe alcoxy en C1-C6, un groupe (alkyle en C<SUB>1</SUB>-C<SUB>6</SUB>) carbonyle oxy, n est un nombre entier compris entre 8 et 20, ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoisomères, ainsi que leurs mélanges. Elle concerne également une composition pharmaceutique le comprenant et leur utilisation en tant que neurotrophique.

Description

Dérivé de Resveratrol à longue chaîne hydroxylée utiles comme neurotrophiques
La présente invention a pour objet un composé neurotrophique, neuroprotecteur et/ou anti-inflammatoire, en particulier un dérivé de resveratrol portant une longue chaîne ω-alcanol de formule générale (I) suivante :
dans laquelle R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6 , un groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle , R4, Rs, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alcoxy en Ci-C6, un groupe alkyle en Ci-C6, un groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyle oxyet n est un nombre entier compris entre 8 et 20, de préférence entre 10 et 16.
Le système nerveux central (SNC) est constitué de deux populations cellulaires que l'on peut qualifier de cellules neurales : les neurones, et tous les autres types cellulaires, regroupés sous le nom de cellules gliales. Les astrocytes et les oligodendrocytes représentent les types majeurs des cellules gliales chez l'adulte. Ces cellules sont générées tout au long de la vie foetale et leur production se poursuit après la naissance et jusque chez l'adulte dans certaines régions du cerveau.
Neurones, astrocytes et oligodendrocytes dérivent d'un précurseur commun, une cellule multipotente aux capacités de prolifération théoriquement illimitées, qui est localisée dans le tube neural. Ces précurseurs peuvent être considérés comme des cellules souches neurales car ils répondent aux critères qui définissent les cellules souches : auto -renouvellement, capacité de prolifération quasi infinie et capacité de générer les types cellulaires constituant le tissu dont elles sont issues. Le neurone, cellule hyper spécialisée, se développe au sein d'un tissu de soutien et d'environnement, la glie. La glie centrale est composée des cellules gliales du système nerveux central et, la glie périphérique, des cellules gliales du système nerveux périphérique. Plus précisément, la glie centrale comprend les astrocytes (astroglie), les oligodendrocytes (oligodendroglie) et les microgliocytes (microglie). La glie périphérique comprend quant à elle les cellules de Schwann, équivalant des oligodendrocytes de la glie centrale.
Les astrocytes sont des constituants de la barrière hématoencéphalique (BHE). Ils interviennent dans la régulation du métabolisme cérébral et servent d'interface entre les capillaires et les neurones (rôle nutritif) par l'intermédiaire de prolongements (pseudopodes) qui s'enroulent autour des capillaires. Ils participent à la recapture des neurotransmetteurs et interviennent également dans la cicatrisation en produisant des filaments gliaux (constituants du cytosquelette).
Les microgliocytes sont des cellules gliales originaires de la lignée myéloide envahissant le système nerveux central pendant la période embryonnaire. La microglie est spécialisée dans l'élimination des macromolécules, la phagocytose des cellules en apoptose ou en nécrose, la reconnaissance et l'élimination d'éléments pathogènes, ainsi que dans la régulation de la réponse immunitaire.
Les oligodendrocytes assurent la myélinisation des axones dans le système nerveux central. Il existe une diversité de progéniteurs à l'origine des oligodendrocytes. Ces cellules sont générées dans des foyers ventriculaires très restreints tout au long du tube neural. Chez l'adulte les oligodendrocytes sont dispersés dans tout le parenchyme cérébral, avec une prédominance dans les faisceaux de substance blanche.
La gaine de myéline, synthétisée par les oligodendrocytes, est un complexe protéique membranaire qui s'enroule autour des axones. Elle possède une double fonction : elle joue un rôle d'isolant électrique et surtout elle permet d'augmenter la vitesse de propagation de l'influx nerveux. Une atteinte de cette gaine conduira à un ralentissement, voire un arrêt du potentiel d'action, perturbant la transmission nerveuse de l'information et provoquant des troubles neurologiques. La perte ou la dégénérescence de la myéline entraîne l'apparition de maladies dites démyélinisantes ou dysmyélinisantes. Les problèmes de santé publique que posent les maladies neurodégénératives et démyélinisantes telles que la maladie d'Alzheimer et la sclérose en plaques sont incontestables, de même que leurs enjeux économiques. Ces maladies, aujourd'hui incurables, provoquent la mort lente et très progressive des cellules nerveuses et demeurent, pour la plupart, dépourvues de tout traitement efficace.
La prévalence de la maladie d'Alzheimer dans le monde est de 12 millions et sera multipliée par 3 en 50 ans au vu de l'augmentation de l'espérance de vie dans les pays développés.
Les traitements actuels ne sont que symptomatiques et il existe une forte demande pour de nouveaux médicaments à forte efficacité et d'un mode d'administration périphérique. Les médicaments symptomatiques pour la maladie d'Alzheimer sont en majorité des anti-cholinestérasiques (Aricept®, Exelon , Reminyl®). Le dernier venu sur ce marché est le Namenda® qui est un inhibiteur du récepteur du N-methyl-D- Aspartate(NMDA). En outre, une des plus répandues et des plus dévastatrices des maladies démyélinisantes est la sclérose en plaques (SEP) qui est une maladie inflammatoire évolutive du système nerveux caractérisée par une dégénérescence de la gaine de myéline, des oligodendrocytes et des neurones.
La sclérose en plaques touche environ 2,5 millions de personnes dans le monde, parmi lesquelles un grand nombre de jeunes adultes (entre 20 et 40 ans).
Les traitements pour la sclérose en plaques sont répartis entre quatre médicaments immonomodulateurs (Rebif®, Avonex , Betaseron® et le Copaxone ). Les traitements actuels prennent relativement bien en compte la composante inflammatoire. Cependant ils s'avèrent inactifs sur la composante démyélinisation, cause du handicap permanent et cumulatif. Contrairement à ce que l'on pensait autrefois, il s'avère que, même au début de la maladie, les oligodendrocytes gardent la potentialité de fabriquer de la nouvelle myéline (remyélinistation). Par contre, au stade chronique, cette capacité de remyélinisation semble bien perdue. On sait ainsi que chez la plupart des malades, la SEP évolue d'abord sous la forme de "poussées et rémissions", ensuite sous la forme "progressive". Il semble bien que les oligodendrocytes et leurs précurseurs peuvent survivre aux phénomènes inflammatoires de la première phase, mais que par contre leur nombre et leur efficacité sont considérablement réduits pendant la phase chronique. Deux possibilités thérapeutiques étaient jusque là envisagées : la transplantation de précurseurs d'oligodendrocytes (greffe) ou une stimulation de la myélinisation par des substances chimiques à partir des oligodendrocytes survivants et des précurseurs d'oligodendrocytes endogènes (remyélinisation endogène). En ce qui concerne la transplantation, l'utilisation des précurseurs des oligodendrocytes (cellules jeunes peu différenciées) considérés comme ayant de plus grandes possibilités de synthèse de myéline et de migration que les oligodendrocytes adultes, est envisagée dans l'art antérieur pour permettre la réparation d'un volume maximum de zones démyélinisées. La source idéale d'oligodendrocytes serait du tissu nerveux humain très jeune (embryonnaire) ce qui soulève des problèmes éthiques et pratiques. On ignore d'autre part quelles seront leurs propriétés migratoires. Or, le problème est que, chez la plupart des patients, les lésions sont multiples et qu'il est illusoire de les "greffer" chacune individuellement. On ne sait en outre toujours pas si ces oligodendrocytes sont capables de migrer par eux-mêmes ou si l'intervention de facteurs chimiques spécifiques est indispensable, de même que l'on ignore la longévité de ces cellules.
On a par ailleurs décrit, dans l'art antérieur, différents facteurs neurotrophiques (L. Shen, A. Figurov & B. Luu, Journal of Molecular Medicine, 1997, vol. 75,637-644) qui régulent la survie, la croissance et la différenciation des neurones et sont donc des facteurs de croissance spécifiques du cerveau. Ils protègent les cellules nerveuses contre diverses agressions, en particulier contre les substances libérées par les cellules microgliales activées et responsables de l'inflammation au sein du cerveau ainsi que vis- à-vis de diverses maladies dues au mauvais fonctionnement du système nerveux.
Cependant, ces macromolécules, neuroprotectrices, traversent difficilement la barrière hémato-encéphalique, d'où la nécessité de bénéficier des molécules lipophiles neurotrophiques avec une administration par voie systémique pour le traitement des maladies du système nerveux central et pour cela de synthétiser des molécules trophiques capables d'induire la différenciation des cellules souches neurales et d'autres précurseurs cellulaires. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs se sont penchés sur les actions possibles de nouveaux composés sur les cellules dites souches (M.Brehm, T. Zeus & B. E. Strauer, Herz, 2002, vol. 27, 611-620).
Les mécanismes par lesquels une cellule souche neurale donne naissance aux trois types cellulaires majeurs du SNC, sont encore mal connus. On sait cependant que ce développement procède par étapes successives au cours desquelles les potentialités développementales de la cellule souche neurale sont progressivement restreintes. Il y a ainsi production de précurseurs intermédiaires aux potentialités de plus en plus limitées qui aboutiront à des cellules hautement différenciées. Initialement, les cellules souches sont d'origine embryonnaire. Elles sont ainsi essentiellement présentes chez les foetus et les enfants en bas âge. Elles sont capables de se multiplier quasiment à l'infini. Sous l'action de ces facteurs neurotrophiques, elles se transforment en cellules matures et fonctionnelles de différents types (M. Y. Chang, H. Son, Y. S. Lee & S. H. Lee, Molecular and CellularNeuroscience 2003, vol. 23N 3, 414-426). Très récemment, il a été démontré que les cellules souches sont aussi présentes dans des organes de stades plus développés, en particulier dans le cerveau (Ph. Taupin & F. H. Gage, Journal of Neuroscience Research, 2002, vol. 69,745-749) et la moelle épinière des adultes. Ainsi, sous l'action de différents facteurs de croissance, les cellules souches neurales, c'est-à- dire les cellules souches présentes dans le cerveau, peuvent se transformer en neurones, en astrocytes ou en oligodendrocytes, c'est-à-dire les principaux types de cellules nerveuses.
Cependant à cause de leur taille moléculaire et de leurs propriétés physicochimiques, ces facteurs de croissance naturels protéiques ne peuvent traverser diverses barrières biologiques, en particulier la barrière hématoencéphalique. Ils ne peuvent donc pas pénétrer dans le cerveau en quantités suffisantes pour exercer leurs actions bénéfiques. En outre, ils présentent une très mauvaise biodisponibilité, limitant ainsi leur efficacité et leur utilisation.
De plus, lorsque des cellules souches sont utilisées pour le traitement des neuropathies dégénératives, ces dernières sont introduites dans le cerveau à l'aide d'une opération chirurgicale qui est une étape invasive risquée (C. N. Svendsen & M. A. Caldwell, Progress in Brain Research, 2000, vol. 127,13-34) tout comme peuvent l'être les précurseurs des oligodendrocytes. L'invention propose à présent une alternative avantageuse à la transplantation. En effet, les inventeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue que si l'on greffe une chaîne alcanol sur un noyau resvératrol, on obtient des molécules capables de franchir la barrière hématoencéphalique et de favoriser une remyélinisation endogène en modulant la spécification cellulaire des cellules souches neurales, i. e., d'influencer le choix pour une cellule souche neurale de s'orienter vers la voie neuronale ou gliale (modulation du ratio neurone/cellules gliales). D'autre part, ces composés sont capables de mimer l'action de certains facteurs neurotrophiques. Ces mimes sont en mesure de transformer des cellules souches neurales en cellules nerveuses différenciées et en particulier d'induire préférentiellement la formation de neurones et ceci, in situ, dans le cerveau. Cette formation préférentielle de neurone est particulièrement intéressante pour le traitement de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, les composés selon la présente invention sont particulièrement adaptés pour être utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzeimer. Plus particulièrement, les composés selon l'invention favorisent la survie neuronale et la croissance des neurites. Les composés selon l'invention sont aussi capables de diminuer la composante inflammatoire lors de maladies affectant le système nerveux. Ils peuvent ainsi, en particulier, diminuer l'activation de la microglie et/ou des astrocytes. Ces composés sont par ailleurs capables de diminuer la gliose réactionnelle, i. e., la cicatrisation gliale, plus particulièrement en modulant l'expression de certains composés du cytosquelette des astrocytes. La répression de l'activation des cellules microgliales et la transformation des cellules souches neurales en cellules oligodendrocytaires matures sont des caractéristiques essentielles pour le traitement des maladies neurodégénératives ou de type démyélinisante/dysmyélinisante telles que notamment la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, mais également les démences vasculaires, la sclérose latérale amyotrophiques, les amyotrophies spinales infantiles et les neuropathies liées aux accidents vasculaires cérébraux.
Le pouvoir anti-oxydant du resvératrol est dû à la présence des groupements hydroxyles et plus particulièrement à celui en position 4' :
Structure du resvératrol Les radicaux hydroxyles sont des espèces électrophiles très réactives, ils vont donc aisément réagir par substitution avec des composés aromatiques.
Le radical hydroxyle va préférentiellement s'additionner sur la position activée 3' du cycle aromatique, de par l'effet électro-donneur du groupement OH en position para 4'. Le resvératrol est un polyphénol présent dans le vin, le thé et divers fruits. Depuis ces dix dernières années un intérêt grandissant pour ce composé peut être observé. Il est en partie relié à une étude entreprise dans le sud de la France révélant une relation de corrélation inverse entre la consommation de vin et les maladies cardiovasculaires; ce phénomène est appelé le French Paradox[l]. Par ailleurs, le resvératrol est retrouvé dans l'extrait de plante Pofygonum cuspidatum utilisé depuis très longtemps par la médecine traditionnelle chinoise pour ses propriétés anti-inflammatoires et le traitement de certaines allergies cutanées.
Ainsi, la présente invention a pour objet les alcools hydrocarbonés à longue chaîne, substitués par un noyau de type Resvératrol, nommés Resvératrol Fatty Alcohols (RFA) ainsi que leurs analogues, et en particulier les composés de formule générale (I) suivante :
dans laquelle R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6, un groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyl, R4, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe alcoxy en Ci-C6, un groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyle oxy et n est un nombre entier compris entre 8 et 20, de préférence entre 10 et 16 ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoisomères, ainsi que leurs mélanges.
Par le terme « acide pharmaceutiquement acceptable » on entend au sens de la présente invention tout acide non toxique, y compris les acides organiques et inorganiques. De tels acides incluent l'acide acétique, benzènesulfonique, benzoïque, citrique, éthanesulfonique, fumarique, gluconique, glutamique, bromhydrique, chlorhydrique, lactique, maléique, malique, mandélique, méthanesulfonique, mucique, nitrique, pamoique, pantothénique, phosphorique, succinique, sulfurique, tartarique et paratoluènesulfonique.
Par le terme « groupe alkyle en Ci-C6 », on entend au sens de la présente invention tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou ramifiés, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, iso-butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s'agit d'un groupe méthyle.
Par le terme « groupe alkoxy en Ci-C6 », on entend au sens de la présente invention tout groupe alkoxy de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou ramifiés, en particulier, le groupe méthoxy. Par le terme « groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyle», on entend au sens de la
R-C - II présente invention tout groupe ° dans lequel R représente un radical alkyle en Ci-C6 tel que défini ci-dessus. Les exemples de radicaux (alkyle en Ci-C6) carbonyle comprennent, mais ne sont pas limités aux groupes acétyle, propionyle, n-butyryle, sec- butyryle, t-butyryle, iso-propionyle, et similaires. En particulier on entend le groupe acétyle. Par le terme « groupe (alkyle en C1-C6) carbonyle oxy, on entend au sens de la présente
R-C -O-
Il invention tout groupe ® dans lequel R représente un radical alkyle en Ci-C6 tel que défini ci-dessus. En particulier on entend le groupe acétate.
Selon un aspect particulier de l'invention, les composés de formule générale (I) correspondent à ceux pour lesquels R1, R2 et R3 représentent un groupe méthyle (Me) ou un atome d'hydrogène.
Selon un autre aspect particulier de l'invention, les composés de formule (I) correspondent à ceux pour lesquels R1, R2 et R3 représentent un groupe méthyle et R4, R5, R6 et R7 un atome d'hydrogène ou un groupe méthoxy (OMe). De manière avantageuse, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène.
La chaîne latérale du composé de formule (I) correspond à un ω-alcanol dans lequel n est compris entre 10 et 18. Les composés de formule (I) dans lesquels n est un nombre entier égal à 10, 12, 14,
16 ou 18 sont des composés particulièrement efficaces dans le cadre de la présente invention.
Les composés comprenant une chaîne latérale de 10 ou 12 atomes de carbones sont particulièrement avantageux. Les composés encore plus particulièrement avantageux sont :
Le RFA- 12, de formule suivante :
le MRFA- 12, de formule suivante OMe
le DMRFA- 12, de formule suivante
OMe
le MRFA-IO de formule suivante :
OMe
et le DMRFA-10 de formule suivante : OMe
De manière avantageuse selon la présente invention, le composé est le RFA- 12. Un objet de l'invention concerne ainsi une composition pharmaceutique comprenant à titre de substance active au moins un composé alcools hydrocarbonés à longue chaîne, substitués par un noyau de type Resvératrol, en particulier un composé de formule générale (I) selon l'invention telle que définie précédemment, en association avec un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Quelle que soit la voie d'administration choisie, des compositions avantageuses selon l'invention se présentent sous une forme favorable à la protection et à l'assimilation optimale du principe actif.
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de différentes manières et sous différentes formes. Ainsi, ils peuvent être administrés de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, comme par exemple par voie intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, trans-dermique, intra-artérielle, etc., les voies intraveineuse, intra-musculaire, sous-cutanée, orale et par inhalation étant avantageuses.
Pour les injections, les composés sont généralement conditionnés sous forme de suspensions liquides, qui peuvent être injectées au moyen de seringues ou de perfusions, par exemple. A cet égard, les composés sont généralement dissous dans des solutions salines, physiologiques, isotoniques, tamponnées, etc., compatibles avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Ainsi, les compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, conservateurs, etc. Des agents ou véhicules utilisables dans des formulations liquides et/ou injectables sont notamment la méthylcellulose, l'hydroxyméthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, le polysorbate 80, le mannitol, la gélatine, le lactose, des huiles végétales, l'acacia, etc.
Les composés peuvent également être administrés sous forme de gels, huiles, comprimés, suppositoires, poudres, gélules, capsules, aérosols, etc., éventuellement au moyen de formes galéniques ou de dispositifs assurant une libération prolongée et/ou retardée. Pour ce type de formulation, on utilise avantageusement un agent tel que la cellulose, des carbonates ou des amidons.
Les composés selon l'invention peuvent en particulier moduler l'activation des cellules microgliales et astrocytaires aux concentrations de 10~5 à 10~9, de préférence 10"6 à 10"8M, encore plus préférentiellement 10"6M. Ces composés permettent, dans les mêmes conditions avantageuses de concentrations, d'induire la différenciation des cellules souches neurales en neurones ainsi que la survie des neurones dans ces conditions.
Les inventeurs ayant démontré une activité des composés selon l'invention aux concentrations indiquées ci-dessus, il est entendu que le débit et/ou la dose injectée peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du patient, de la pathologie concernée, du mode de réalisation, etc. En outre, des injections répétées peuvent être réalisée, le cas échéant. D'autre part, pour des traitements chroniques, des systèmes retard ou prolongés peuvent être avantageux. L'invention concerne par ailleurs les composés et compositions pharmaceutiques selon la présente invention pour leur utilisation comme médicament.
Les composés et compositions selon l'invention sont utilisés en tant que médicament ayant un effet neurotrophique et/ou neuroprotecteur et/ou anti- inflammatoire, et/ou destiné à la prévention ou au traitement des maladies ou désordres du système nerveux altérant les oligodendrocytes ou les autres cellules du système nerveux et/ou des maladies ou désordres de l'inflammation du système nerveux, et/ou des neuropathies dégénératives, et/ou des maladies démyélinisantes ou dysmyélinisantes et/ou des accidents vasculaires cérébraux ou toutes autres atteintes lésionnelles du système nerveux.
En particulier, les composés ou la composition pharmaceutique selon la présente invention prévient ou traite la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Creutzfeldt-Jakob. D'autres maladies susceptibles d'être traitées sont les démences vasculaires, la sclérose latérale amyotrophique, les amyotrophies spinales infantiles. De même les lésions dérivées d'accidents vasculaires cérébraux et toutes autres atteintes lésionnelles du système nerveux sont susceptibles d'être traitées par les composés et compositions de l'invention.
Au sens de l'invention, le terme traitement désigne aussi bien un traitement préventif que curatif, qui peut être utilisé seul ou en combinaison avec d'autres agents ou traitements. En outre, il peut s'agir d'un traitement de troubles chroniques ou aiguës. Un autre objet de l'invention concerne les composés selon la présente invention pour son utilisation en tant que médicament destiné à moduler la spécification cellulaire des cellules souches neurales, favoriser la différenciation puis la survie des neurones et cellules gliales en différenciation, favoriser la différenciation de cellules précurseurs d'oligodendrocytes en oligodendrocytes matures, et/ou diminuer l'activation de la microglie et/ou l'activation des astrocytes et/ou la gliose réactionnelle. L'invention concerne ainsi l'utilisation in vitro d'au moins un composé selon la présente invention pour l'obtention de neurones et/ou cellules gliales différenciées à partir de cellules souches.
Les composés de l'invention peuvent être préparés à partir de produits du commerce, en mettant en œuvre une combinaison de réactions chimiques connues de l'homme du métier, éventuellement à la lueur du procédé de préparation des composés de formule générale (I) telle que définie ci-dessous [2].
Les composés de formule générale (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène peuvent être notamment obtenus par un procédé de préparation comprenant l'étape (a) de réaction du composé de formule générale (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 avec le tribromure de bore dans du dichlorométhane à -78°C [3]. D'autres solvants et d'autres températures peuvent être utilisées.
Les composés de formule générale (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 peuvent être notamment obtenus par un procédé de préparation comprenant l'étape (b) de couplage de Wadsworth-Emmons entre le composé de formule générale (II) suivante : dans laquelle Ri représente un groupe alkyle en Ci-C6 et R4, R5, R6 et R7 sont tels que définis ci-dessus et le composé de formule générale (III) suivante [4] :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6, TBDMS représente le ter^-butyl-diméthylsilyle et n est tel que défini ci-dessus, avantageusement en présence de méthylate de sodium dans du diméthylformamide à reflux.
Le TBDMS présente un intérêt particulier comme groupement protecteur car il peut être clivé in-situ en présence de HCl à 2M
Toutefois, il est également possible d'utiliser un autre groupement protecteur du groupe OH.
En particulier, le composé de formule générale (III) peut être obtenu par le procédé de préparation comprenant les étapes (c), (d) et (e) suivantes : -(e) hydrogénation catalytique, avantageusement avec du palladium sur charbon à
5%, du composé de formule générale (IV) suivante [5] :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini ci- dessus pour obtenir la composé de formule générale (V) suivante : dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini ci- dessus;
-(d) réduction de l'ester de formule (V) en alcool de formule générale (VI) suivante
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini ci- dessus , avantageusement à l'aide d'hydrure mixte d'aluminium et de lithium ; -(c) oxydation de l'alcool de formule (VI) en aldéhyde de formule (III), avantageusement en utilisant le tétra-n-propylammonium perruthénate et de la N- méthylmorpho line .
En particulier, le composé de formule générale (IV) peut être obtenu par le procédé de préparation comprenant l'étape (f) de réaction de couplage de Sonogashira entre le composé de formule générale (VII) suivante :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et le composé de formule générale (VIII) suivante [6]
^£θTBDMS (vm) dans laquelle n est tel que défini ci-dessus, avantageusement à l'aide de PdCl2(PPh3)2, en présence de CuI dans la triéthylamine à reflux. Avantageusement dans le cadre du procédé selon la présente invention, R1, R2 et R3 représentent un groupe méthyle et R4, R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthoxy.
Ainsi, la synthèse des RFA repose principalement sur deux étapes clé. La première étape est une réaction de Sonogashira permettant le couplage entre un iodure aromatique et les différentes longueurs de chaîne (n = 10, 12, 14, 16, 18) sous forme d'alcynes vrais. La seconde étapes met en œuvre une réaction de Wadsworth-Emmons entre un aldéhyde et le phosphonate formé in-situ à partir du bromure de benzyle obtenu par bromation de l'alcool benzylique correspondant (Schéma 1).
Schéma 1 : Schéma rétrosynthétique
Synthèse de la chaîne latérale
Afin de synthétiser les différentes longueurs de chaînes nécessaires au couplage de Sonogashira, les inventeurs ont suivi le chemin réactionnel suivant (Schéma 2) : la Ib
TBDMSCI u, ≡— Li, H2NCH2CH2NH2 , DMSO Br"^ OTBDMS
Imidazole, CH2CI2, t.a. "-2 0 <> c — ^ t.a., 80 - 90% ^ n pTBDMS
85 - 95%
4
Schéma 2 : Synthèse des différentes chaînes latérales.
Après réduction du diacide _l£ °u de la lactone IJ) à l'aide de l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium, on obtient les diols correspondants 2. Pour les autres longueurs de chaîne, les diols sont commerciaux. La réaction de monobromation est réalisée dans un mélange hétérogène d'acide bromhydrique et de cyclohexane afin d'obtenir les bromoalcools 3 avec de bon rendements.
Les Inventeurs ont choisi le te/t-butyl-diméthylsilyle comme groupement protecteur de la fonction alcool car celui-ci est facilement déprotégé à l'aide de TBAF. Finalement, les dérivés acétylènes 5 sont obtenus par action de l'acétylure de lithium dans le DMSO sur les bromoalcools silylés 4 correspondants.
Synthèse de l'iodure aromatique
Le 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle 7 est obtenu en deux étapes avec un rendement tout à fait acceptable de 87%. Dans un premier temps, les inventeurs on traité l'acide 3,5-dihydroxybenzoïque avec une solution méthanolique de TV-iodosuccinimide (NIS) afin de former le dérivé iodé 6 puis les inventeurs ont méthylés les fonctions hydroxyles pour former le composé 7 souhaité nécessaire au couplage de Sonogashira.
Schéma 3 : Synthèse de l'iodure aromatique.
Couplage de Sonogashira
Cette réaction va donc permettre de greffer les différentes chaînes ω-hydroxylées 5 sur le cycle aromatique 7 (schéma 4).
De manière générale les dérivés iodés ont une réactivité plus élevée, de ce fait les inventeurs ont décidé d'effectuer la réaction de Sonogashira avec un iode sur l'ester benzylique 7 (schéma 3) bien que ce dernier ne soit pas commercial.
La réaction de couplage se fait donc selon le chemin réactionnel suivant :
J 5 8
Schéma 4 : Réaction de Sonogashira.
Maintenant que la chaîne ω-alcanol est greffée, l'étape suivante est la synthèse de l'aldéhyde nécessaire au couplage de Wadsworth-Emmons pour former la double liaison C-C trans entre les deux cycles aromatiques (Schéma 5).
8 9 10 11
Schéma 5 : Synthèse de l'aldéhyde 11 nécessaire au couplage de Wadsworth- Emmons.
Le composé avec la chaîne saturée 9 est obtenu par hydrogénation catalytique au palladium sur charbon 5%. Afin de former l'aldéhyde 11 pour la réaction de Wadsworth-Emmons, les inventeurs ont réduit l'ester 9 en alcool _10 à l'aide de l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium. Les inventeurs ont ensuite oxydé l'alcool en aldéhyde 11 en utilisant le tétra-n-propylammonium perruthénate TPAP [(n-Pr4N) RuO4] et de la Λ/-méthylmorpholine.
Couplage de Wadsworth-Emmons
Le but étant, dans un premier temps, de synthétiser des dérivés du trans- resvératrol, les inventeurs ont opté pour une des variantes de la réaction de Wittig qui permet de former exclusivement la double liaison carbone-carbone avec la configuration trans à savoir le couplage de Wadsworth-Emmons ( Schéma 6).
12 13 14
Schéma 6 : Synthèse des hybrides resvératrol/ω-alcanols : couplage de Wadsworth-Emmons .
De manière générale, cette réaction est basée sur le couplage entre un aldéhyde et un phosphonate. L'alcool benzylique 12 est brome à l'aide de tribromure de phosphore (PBr3) pour former le bromure de benzyle correspondant IJ qui en présence de triéthylphosphite (POEt3) à reflux permet de former le phosphonate souhaité 14. Ainsi, les inventeurs ont pu faire réagir le phosphonate et l'aldéhyde précédemment formé en présence de méthylate de sodium dans du diméthylformamide à reflux. Au cours de cette réaction il y a formation d'un intermédiaire, une bétaïne, qui par élimination de l'oxyde de triéthylphosphite conduit à la formation du produit de couplage désiré .15. Les inventeurs ont ainsi formés les différents méthoxylés des RFA qui seront également testés.
Les RFA IJj sont finalement obtenus par action de tribromure de bore dans le dichlorométhane à - 78°C (Schéma 7).
Schéma 7 : Déméthylation des dérivés méthoxylés, MRFA.
Les exemples suivants sont donnés à titre indicatif et ne doivent pas être considérés comme limitant la présente invention.
EXEMPLES Exemple 1. Préparation du 12-bromododécan-l-ol (3)
HBr à 48% dans l'eau (77 mL ; 0,46 mol ; 15 éq.) est ajouté à une solution de 1,12-dodécan-ol (6,15 g ; 30,4 mmol ; 1 éq.) dans du cyclohexane (140 mL). Le mélange hétérogène est chauffé à reflux. Après 6h, la phase aqueuse est extraite avec de l'éther (3x100 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une solution saturée de Na2CO3, séchées sur MgSO4, filtrées et évaporées. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant : hexane- AcOEt : 6-4) pour donner 7,06 g d'un solide blanc.
Rendement : 85% Formule brute : Ci2H25BrO
PM : 265,23
CCM : (hexane- AcOEt : 6-4) Rf= 0,4
Les composés où n = 8, 10, 14 et 16 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 1,26 (s large, 16H, H-3 à H-IO) ; 1,56 (m, 2H, H- 2) ; 1,85 (q, 2H, J = 7,0 Hz, H-I l) ; 3,40 (t, 2H, J = 6,8 Hz, H- 12) ; 3,63 (t, 2H, J = 6,4 Hz, H-I).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 25,5 (C-3) ; 28,2 (C-I l) ; 28,7 (C-9) ; 29,4 (C-4 à C-8) ; 32,8 (C-2) ; 33,8 (C- 12) ; 63, (C-I).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H à 1,26 ppm et +/- 2C à 29,4 ppm.
Exemple 2. Préparation du (12-bromododécyloxy)(terf- butyl)diméthylsilane (4)
Le chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (5,61 g ; 37,3 mmol ; 1,5 éq.) et l'imidazole (2,54 g ; 37,3 mmol ; 1,5 éq.) sont ajoutés à une solution de 12- bromododécan-1-ol (6,6 g ; 24,9 mmol ; 1 éq.) dans du dichlorométhane (60 mL) à température ambiante. Après 4h, le mélange réactionnel est versé dans une solution saturée de NH4Cl (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant hexane- AcOEt : 95-5) pour donner 9,17 g d'une huile incolore. Rendement : 99% Formule brute : Ci8H39BrOSi PM : 379,49
CCM : (hexane-CH2Cl2 : 8-2) Rf = 0,5
Les composés où n = 8, 10, 14 et 16 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s large, 16H, H-3 à H-IO) ; 1,39 à 1,53 (m, 2H, H-2) ; 1,85 (q, 2H, J = 6,9 Hz, H-I l) ; 3,40 (t, 2H, J = 6,9 Hz, H- 12) ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-I).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 26,0 (CH3C) ; 28,2- 29,6 (C-2 à C-IO) ; 32,9 (C-I l) ; 34,0 (C- 12) ; 63,4 (C-I).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H à 1,27 ppm et +/- 2C à 28,2-29,6 ppm.
Exemple 3. Préparation du tert-butyl(tétradéc-13-ynyloxy)diméthylsilane
(5)
Une solution de (12-bromododécyloxy)(ferZ'-butyl)diméthylsilane (9,2 g ; 24,2 mmol ; 1 éq.) dans le DMSO (5 mL) est ajoutée goutte à goutte à une solution refroidie à 00C d'acétylure de lithium (3,35 g ; 36,4 mmol ; 1,5 éq.) dans le DMSO (15 mL). Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 16h. Le mélange réactionnel est versé dans une solution saturée de KCl (100 mL) puis extrait à l'hexane (3x100 mL). La phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant hexane-CH2Cl2 : 8-2) pour donner 6,38 g d'une huile incolore. Rendement : 81% Formule brute : C2OH40OSi PM : 324,62 CCM : (heptane-CH2Cl2 : 8-2) Rf= 0,4
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés par le même mode opératoire que décrit ci-dessus. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,90 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s large, 16H, H-3 à H-IO) ; 1,38 à 1,59 (m, 4H, H-2 et H-I l) ; 1,93 (t, IH, J = 2,6 Hz, H- 14) ; 2,18 (td, 2H, J = 2,5 Hz et J = 6,9 Hz, H- 12) ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-I).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi et C- 12) ; 26,0 (CH3C) ; 25,8-29,9 (C-3 à C-I l) ; 32,9 (C-2) ; 63,4 (C-I) ; 68,0 (C- 14) ; 84,8 (C-13).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,27 ppm et +/- 2C à 25,8-29,9 ppm.
Exemple 4. Préparation de l'acide 3,5-dihydroxy-4-iodobenzoïque (6)
Une solution de iV-iodosuccinimide (5 g ; 22,2 mmol ; 1,05 éq.) dans le méthanol (15 mL) est ajoutée goutte à goutte à une solution refroidie à 00C d'acide 3,5- dihydroxybenzoïque (3,26 g ; 21,2 mmol ; 1 éq.) dans le méthanol (13 mL). Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 3h. Le mélange est versé dans de l'eau froide (13 mL) puis dans une solution aqueuse de Na2SO3 à 5% (20 mL). La phase aqueuse est extraite avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est lavée avec NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour donner 5,37 g d'un solide blanc. Rendement : 90% Formule brute : C7H5IO4 PM : 280,02 CCM : (AcOEt) Rf = 0,1
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 2,67 (s, IH, Hacide) ; 4,91 (s, 2H, OH) ; 6,98 (s, 2H, H-3 et H-5).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 80,3 (C-I) ; 106,2 (C-3 et C-5) ; 131,8 (C-4) ; 158,0 (C-2 et C-6) ; 168,1 (C-7).
Exemple 5. Préparation du 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (7)
Du carbonate de potassium (12 g ; 85,8 mmol ; 5,6 éq.) et du diméthylsulfate (12,6 g ; 99,6 mmol ; 6,5 éq.) sont ajoutés à une solution d'acide 3,5-dihydroxy-4- iodobenzoïque (4,3 g ; 15,3 mmol ; 1 éq.) dans l'acétone (48 mL). Le mélange réactionnel est chauffé à reflux pendant 4h. Du méthanol (26 mL) est ajouté et le reflux est maintenu pendant Ih supplémentaire. Le mélange est versé dans une solution saturée de NH4Cl (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 6-4) pour donner 4,66 g d'un solide blanc.
Rendement : 95% Formule brute : Ci0Hi ilθ4
PM : 322,10 CCM : (heptane- AcOEt : 7-3) Rf= 0,4
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 3,93 (s, 3H, H-8) ; 3,94 (s, 6H, H-9 et H-IO) ; 7,16 (s, 2H, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 52,4 (OMe) ; 56,8 (OMe) ; 84,3 (C-I) ; 104,7 (C- 3 et C-5) ; 131, 8 (C-4) ; 159,5 (C-2 et C-6) ; 166,6 (C-7).
Exemple 6. Préparation du 4-(l4-(tert- butyldiméthylsilyloxy)tétradéc-l-ynyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle
(8)
Le complexe de palladium PdCl2(PPh3)2 (200 mg ; 0,28 mmol ; 0,07 éq.) et l'iodure de cuivre (55 mg ; 0,28 mmol ; 0,07 éq.) sont respectivement ajoutés à une solution de 4-iodo-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (1,3 g ; 4,04 mmol ; 1 éq.) dans la triéthylamine (11 mL). Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 10 minutes, puis du te/t-butyl(dodécan-13-ynyloxy)diméthylsilane
(1,97 g ; 6,05 mmol ; 1,5 éq.) est ajouté. Après 48h de chauffage à reflux, le mélange est versé dans une solution saturée de NH4CI (100 mL) puis extrait avec de l'acétate d'éthyle (3x100 mL). La phase organique est lavée avec une solution saturée de NaCl, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est adsorbé sur silice (200 μm) puis purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant hep tane- AcOEt : 9-1) pour donner 1,31 g d'une huile jaune. Rendement : 63%
Formule brute : C30HSoOsSi
PM : 518,80
CCM : (éluant heptane- AcOEt : 8-2) Rf= 0,4
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus.
RMN 1U (300 MHz, CDCl3) δ : 0,04 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,27 (s large, 16H, H-5' à H-13') ; 1,47 à 1,68 (m, 2H, H-4') ; 2,55 (t, 2H, J = 7,0 Hz, H-3') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,92 (s, 9H, OMe) ; 7,21 (s, 2H, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,3 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 20,3 (C-3') ; 26,0 (CH3C) ; 28,8 à 29,5 (C-4' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 52,3 (OMe) ; 56,3 (OMe) ; 63,3 (C- 14') ; 72,2 (C-I ') ; 102,5 (C-2') ; 104,6 (C-2 et C-6) ; 107,0 (C-4) ; 129,9 (C-I) ; 161,0 (C-3 et C-5) ; 166,7 (C-7).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,27 ppm et +/- 2C à 28,8-29,5 ppm.
Exemple 7. Préparation du 4-(14-(tert- butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (9)
Du palladium sur charbon 10% (256 mg ; 0,24 mmol ; 0,01 éq.) est ajouté à une solution de 4-(14-(ter/-butyldiméthylsilyloxy)tétradéc-l-ynyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (1,28 g ; 2,47 mmol ; 1 éq.) dans l'éthanol (5 mL). Le mélange réactionnel est laissé agiter sous atmosphère d'hydrogène à température ambiante. Après 24h, le mélange est filtré sur célite. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane- AcOEt : 7-3) pour donner 1,23 g d'une huile jaune. Rendement : 95%
Formule brute : C30H54OsSi
PM : 522,83
CCM : (éluant heptane- AcOEt : 7-3) Rf= 0,6
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus.
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,25 (s large, 2OH, H-3' à H- 12') ; 1,43 à 1,53 (m, 4H, H-2' et H- 13') ; 2,65 (t, 2H, J = 7,2 Hz, H-I ') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,85 (s, 6H, OMe) ; 3,91 (s, 3H, OMe) ; 7,22 (s, 2H, H-2 et H-6). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 23,2 (C-I ') ; 25,9 (CH3C) ; 28,9 à 29,8 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 52,1 (OMe) ; 55,8 (OMe) ; 63,4 (C- 14') ; 104,9 (C-2 et C-6) ; 125,4 (C-4) ; 128,4 (C-I) ; 158,0 (C-3 et C-5) ; 167,7 (C-7).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,25 ppm et +/- 2C à 28,9-29,8 ppm.
Exemple 8. Préparation du (4-(14-(tert-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-
3,5-diméthoxyphényl)méthanol (10)
De l'hydrure mixte d'aluminium et de lithium (87 mg ; 2,3 mmol ; 1 éq.) est ajouté par petites portions à une solution de 4-(\4-(tert- butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5-diméthoxybenzoate de méthyle (1,2 g ; 2,3 mmol ; 1 éq.) dans le THF (9 mL) refroidie à 00C. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante. Après 2h30, le mélange est versé dans une solution aqueuse de tartrate de sodium à 10% (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3) pour donner 1,05 g d'une huile incolore. Rendement : 92% Formule brute : C2^54O4Si PM : 494,82 CCM : (éluant heptane- AcOEt : 7-3) Rf= 0,3
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus. RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,26 (s large, 2OH, H-3' à H-12') ; 1,29 à 1,52 (m, 4H, H-2' et H-13') ; 2,60 (t, 2H, J = 7,2 Hz, H-I ') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,81 (s, 6H, OMe) ; 4,65 (s, 2H, H-7) ; 5,30 (s, OH) ; 6,55 (s, 2H, H-2 et H-6).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 22,8 (C-I ') ; 26,0 (CH3C) ; 25,8 à 29,8 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 55,7 (OMe) ; 63,4 (C-14') ; 65,9 (C-7) ; 102,4 (C-2 et C-6) ; 119,0 (C-4) ; 139,5 (C-I) ; 158,4 (C-3 et C-5).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,26 ppm et +/- 2C à 25,8-29,8 ppm.
Exemple 9. Préparation du 4-(14-(ter*-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)- 3,5-diméthoxybenzaldéhyde (11)
De la Λ/-méthylmorpholine (422 mg ; 3,12 mmol ; 1,5 éq.) est ajoutée à une solution de (4-(14-(feftf-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3,5- diméthoxyphényl)méthanol (1,03 g ; 2,08 mmol ; 1 éq.) dans le dichlorométhane (5 mL) en présence de tamis moléculaires 4Â (500 mg/mmol). Du tétra-n-propylammonium perruthénate (37 mg ; 0,10 mmol ; 0,05 éq.) est ajouté par petites portions au mélange refroidi à 00C. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant 2h puis filtré sur célite. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 7-3) pour donner 855 mg d'une huile incolore. Rendement : 85%
Formule brute : C2^52O4Si
PM : 492,81
CCM : (éluant heptane- AcOEt : 6-4) Rf= 0,6 Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus.
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 0,05 (s, 6H, CH3Si) ; 0,89 (s, 9H, CH3C) ; 1,25 (s large, 2OH, H-3' à H-12') ; 1,29 à 1,52 (m, 4H, H-2' et H-13') ; 2,67 (t, 2H, J = 7,2 Hz, H-I ') ; 3,59 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14') ; 3,88 (s, 6H, OMe) ; 7,05 (s, 2H, H-2 et H-6) ; 9,90 (s, IH, H-7).
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : -5,2 (CH3Si) ; 18,4 (CSi) ; 23,5 (C-I ') ; 26,0 (CH3C) ; 25,8 à 31,6 (C-2' à C-12') ; 32,9 (C-13') ; 55,8 (OMe) ; 63,3 (C-14') ; 104,9 (C-2 et C-6) ; 127,5 (C-4) ; 135,1 (C-I) ; 158,6 (C-3 et C-5) ; 191,9 (C-7).
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,25 ppm et +/- 2C à 25,8-31,6 ppm.
Exemple 10. Préparation du bromure 4-méthoxybeπzylique (13)
Du tribromure de phosphore (6,2 g ; 25,0 mmol ; 1,15 éq.) est ajouté à une solution d'alcool 4-méthoxybenzylique (3 g ; 21,7 mmol ; 1 éq.), refroidie à 00C, dans le dichlorométhane (35 mL). Après 5h à température ambiante, le mélange réactionnel est versé dans de l'eau glacée (100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée pour obtenir 4,1 g d'une huile incolore.
Rendement : 94% Formule brute : C8H9BrO PM : 201,06 CCM : (éluant heptane- AcOEt : 7-3) Rf= 0,6
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 3,81 (s, 3H, OMe) ; 4,51 (s, 2H, CH2Ph) ; 6,87 (d, 2H, J = 8,8 Hz, H-3 et H-5) ; 7,32 (d, 2H, J = 8,8 Hz, H-2 et H-6). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 34,0 (CH2Ph) ; 55,3 (OMe) ; 114,2 (C-3 et C-5) ;
130,0 (C-I) ; 130,5 (C-2 et C-6) ; 159,7 (C-4).
Exemple 11. Préparation du (Ε)-14-(4-(4-méthoxystyryl)-2,6 diméthoxyphényl)tétradécan-l-ol (I')
De la triéthylphosphite (565 mg ; 3,44 mmol ; 2 éq.) et du bromure 4- méthoxybenzylique (478 mg ; 2,38 mmol ; 1,4 éq.) sont chauffés à 1300C. Après 6h, le mélange réactionnel est ramené à température ambiante puis une solution de méthylate de sodium à 5,4M (540 μL ; 2,92 mmol ; 1,7 éq.), le diméthylformamide (2 mL) et une solution de 4-( 14-(ter?-butyldiméthylsilyloxy)tétradécyl)-3 ,5-diméthoxybenzaldéhyde
(845 mg ; 1,72 mmol ; 1 éq.) dans le diméthylformamide (2 mL) sont respectivement ajoutés. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante pendant Ih, puis chauffé à 1000C pendant Ih supplémentaire. Le mélange est finalement laissé agiter à température ambiante une nuit. Au mélange réactionnel est ajoutée une solution de HCl à 2M (6 mL). Après 3h, le mélange est versé dans une solution saturée de KCl
(100 mL) puis extrait avec de l'éther (3x100 mL). La phase organique est lavée, séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane- AcOEt : 7-3) pour donner 568 mg d'un solide blanc.
Rendement : 69%
Formule brute : C3IH46O4
PM : 482,69
CCM : (éluant heptane- AcOEt : 7-3) Rf= 0,2 Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés selon le même mode opératoire que décrit ci-dessus.
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 1,26 (s large, 2OH, H-3" à H-12") ; 1,30 à 1,59 (m, 4H, H-2" et H-13") ; 2,61 (m, 2H, H-I ") ; 3,64 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14") ; 3,83 (s, 3H, OMe) ; 3,86 (s, 6H, OMe) ; 6,67 (s, 2H, H-2 et H-6) ; 6,90 (d, 2H, J = 8,8 Hz, H-3' et H-5') ; 6,98 (d, IH, J = 16,1 Hz, H-8) ; 7,02 (d, IH, J = 16,1 Hz, H-7) ; 7,45 (d, 2H, J = 8,8 Hz, H-2' et H-6').
RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 23,0 (C-I ") ; 25,7 à 29,8 (C-2" à C-I l") ; 32,8 (C-13") ; 55,3 (OMe) ; 55,7 (OMe) ; 63,1 (C-14") ; 101,9 (C-2 et C-6) ; 114,1 (C-3' et C-5') ; 119,4 (C-4) ; 127,2 (C-8) ; 127,4 (C-7) ; 127,6 (C-2' et C-6') ; 130,0 (C-I') ; 136 (C-I) ; 158,4 (C-3 et C-5) ; 159,2 (C-4').
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,26 ppm et +/- 2C à 29,3-29,8 ppm.
Exemple 12. Préparation du (ïζ)-5-(4-hydroxystyryl)-2-(14- hydroxytétradécyl)benzène-l,3-diol (I)
Du tribromure de bore (230 μL ; 2,42 mmol ; 15 éq.) est ajouté à une solution de (^-14-(4-(4-méthoxystyryl)-2,6-diméthoxyphényl)tétradécan-l-ol (78 mg ; 0,16 mmol ; 1 éq.) dans le dichlorométhane (5 mL) à -78°C. Le mélange réactionnel est laissé agiter à température ambiante. Après 2h, de l'eau (15 mL) est ajoutée à -78°C puis à nouveau de l'eau est rajoutée au mélange (50 mL). La phase aqueuse est extraite avec de 1'AcOEt (3x50 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une solution saturée de NaCl, séchées sur MgSO4, filtrées puis évaporées. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant heptane-AcOEt : 45-55) pour donner 53 mg d'un solide blanc.
Rendement : 75%
Formule brute : C28H40O4 PM : 440,61
CCM : (éluant heptane- AcOEt : 4-6) Rf= 0,3
Les composés où n = 10, 12, 16 et 18 ont été synthétisés par le même mode opératoire que décrit ci-dessus.
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 1,28 (s large, 2OH, H-3" à H-12") ; 1,40 à 1,52 (m, 4H, H-2" et H-13") ; 2,57 (m, 2H, H-I ") ; 3,53 (t, 2H, J = 6,6 Hz, H-14") ; 6,45 (s, 2H, H-2 et H-6) ; 6,74 (d, IH, J = 15,9 Hz, H-8) ; 6,75 (d, 2H, J = 8,6 Hz, H-3' et H- 5') ; 6,89 (d, IH, J = 15,9 Hz, H-7) ; 7, 32 (d, 2H, J = 8,6 Hz, H-2' et H-6'). RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 22,9 (C-I ") ; 25,7 à 29,8 (C-2" à C-12") ; 29,7
(C-13") ; 64,3 (C-14") ; 104,6 (C-2 et C-6) ; 115,4 (C-4) ; 115,9 (C-3' et C-5') ; 126,3 (C-8) ; 127,1 (C-7) ; 128,1 (C-2' et C-6') ; 128,6 (C-I ') ; 135,7 (C-I) ; 156,7 (C-3 et C- 5) ; 156,8 (C-4').
Les spectres RMN 1H et RMN 13C pour les autres longueurs de chaîne sont identiques avec à chaque fois +/- 4H en plus à 1,28 ppm et +/- 2C à 25,7-29,8 ppm.
Exemple 13 : Partie physico-chimique
Le test au DPPH (2,2'-di(4-te/t-octylphenyl)l-picrylhydrazyl a été utilisé afin de déterminer la capacité anti-oxydante de nos composés [9]. Le DPPH est un radical stabilisé qui absorbe à 517 nm (coloration violette). Si l'on met en présence une molécule anti-oxydante, cette dernière va réagir avec le radical. Ainsi, une diminution de l'absorbance pourra être observée. La capacité anti-oxydante se traduira donc par une diminution de l'absorbance à 517 nm.
a) Mise en œuvre du test DPPH
Sur une plaque Elisa à 96 puits, on introduit :
• 100 μL des différentes solutions aux concentrations (10 mM, 5 mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,01 mM et 0,001 mM) • 100 μL d'une solution éthanolique de DPPH à 400 μM
Après une incubation de respectivement 45 minutes, 2 heures et 3 heures, le résultat est donné par une mesure de la densité optique à 550 nm à l'aide d'un spectrophotomètre. Le résultat est exprimé part l'ICso qui est la concentration à laquelle 50% des radicaux ont été réduits par la molécule antioxydante.
Les inventeurs ont testé le resvératrol, comme contrôle positif, ainsi que le RFA10, RFA12 et RFA16. Le resvératrol présente une IC50 de 10 μM. Nos molécules hybrides quant à elles ont une IC50 de l'ordre de 2,5 μM après un temps d'incubation de 3 heures. Il peut être remarqué que la capacité antioxydante est indépendante de la longueur de la chaîne ω- hydroxylée. Cependant avec une IC50 de l'ordre de 2,5 mM, nos molécules hybrides conservent une bonne capacité antioxydante. Les dérivés méthoxylés ont également été testés. Ces composés possèdent un pouvoir antioxydant mais aux concentrations testées l'ICso n'est pas atteinte.
b) Principe du test à l'ABTS
Au vu des résultats obtenus avec le test au DPPH l'uilisation du test à l'ABTS
([2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]) a été envisagé [10], [11], [12]. Le test à l'ABTS est plus sensible dans la mesure où ce dernier fait intervenir des radicaux hydroxyles moins encombrés. Par ailleurs, il est plus révélateur de l'activité de composés en tant qu'antioxydant dans la mesure où dans le cerveau le radical prédominant est le radical hydroxyle.
La molécule d'ABTS va réagir avec les radicaux hydroxyles OH générés dans le milieu par la réaction de Fenton pour former un radical cation, ABTS + (coloration verte), absorbant à 405 nm. Ainsi, si l'on met en présence une molécule anti-oxydante, capable de réduire les radicaux hydroxyles, une diminution de l'absorbance à 405 nm pourra être observée.
Sur une plaque Elisa à 96 puits, on introduit :
• 180 μL d'un mélange eau/éthanol : 50/50
• 30 μL d'une solution aqueuse d'ABTS à 1 mM
• 30 μL d'une solution aqueuse de FeSO4 à 1 mM
• 30 μL de produit à tester aux différentes concentrations (10 mM, 5 mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,01 mM et 0,001 mM)
• 30 μL d'une solution aqueuse de H2O2 à 100 mM
Après une incubation de respectivement 45 minutes, 1 heure et 2 heures, le résultat est donné par une mesure de la densité optique à 405 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.
Etant donné que la longueur de la chaîne n'est pas déterminante pour la capacité antioxydante, il a été décidé de n'effectuer ce test qu'avec une seule longueur de chaîne. Afin de réduire au maximum les problèmes de solubilité le RFA10 a été testé. Le resvératrol est toujours utilisé comme contrôle positif. Les valeurs des IC50 sont celles obtenues après une incubation de 2 heures. Le resvératrol présente une IC50 de 30 μM et le RFA-10 une IC50 de 45 μM.
Malgré une capacité antioxydante un peu plus élevée pour le resvératrol, nos composés présentent un potentiel antioxydant important.
Exemple 14 : Partie biologique Inhibition de l'activation de la microglie par les RFA et MRFA (Resveratrol Fatty Alcohols et Methoxylated Resveratrol Fatty Alcohols). Production des neurones par des cellules souches neurales.
Dans le cerveau, le système immunitaire est représenté par une population de cellules de types monocytes-macrophages, les cellules microgliales. Ainsi, les différents tests mis en œuvre permettront d'évaluer la capacité de nos composés à moduler l'activation de la microglie ainsi que leur activité anti-inflammatoire.
Lorsque la microglie est activée suite à différents stimuli (Lipopolysaccharides, Interféron-gamma...), un certain nombre de cytokines, comme le TNF-α, ou encore d'enzymes inductibles, NOS-II et COX-II, sont synthétisées.
Ainsi, le taux de monoxyde d'azote, NO et du Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α, sont des indicateurs de l'activation microgliale.
Les expériences réalisées concernent ainsi la capacité des molécules RFA, MRFA et DMRFA à inhiber, dans la microglie activée, la libération de nitrites et de TNF-α.
RFA MRFA DMRFA
a) Mesures de la libération de nitrites
L'activité de la NO-synthase de type II (NOS II) représente un paramètre de l'activité microgliale souvent analysée dans la littérature. Cette enzyme est responsable de la synthèse du radical monoxyde d'azote en condition d'activation inflammatoire. La microglie au repos n'exprime que des taux à la limite de la détection par immunoempreinte. Une activation de 24 à 48 heures entraîne une forte augmentation de cette expression. Le produit de cette enzyme, le NO, se dégrade rapidement en culture pour former des nitrites. Un dosage, par colorimétrie (méthode de Griess), montre que les niveaux de NO2 " suivent la même tendance.
Dans les expériences réalisées, les concentrations en NO2 " ont été mesurées, après 24 heures et 48 heures d'activation dans des cultures de cellules microgliales traitées avec 0.01 μg/ml de LPS, en présence des produits RFA- 12, MRFA-IO, MRFA-12, MRFA-14, MRFA-16, MRFA-18, DMRFAlO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16, DMRFA- 18, MResvératrol, DMResvératrol et le Resvératrol à des concentrations de 5.10"6, 10"6et l0"7 M.
Les résultats obtenus pour les dérivés méthoxylés et diméthoxylés, provenant de trois expériences indépendantes, montrent que le MRFA-IO, DMRFAlO et le Resvératrol induisent une diminution dans les cellules de la production de nitrites de 20% par rapport aux valeurs contrôles.
Dans la série des RFA, le RFA- 12 induit une diminution du taux de nitrites dans les cellules de 50% à la concentration de 5.10"6 M. Ces résultats montre l'importance de la longueur de la chaîne ainsi que de la présence des groupements hydroxyles. En effet la meilleure activité est observée pour le RFA- 12 qui est plus actif que le Resvératrol lui-même.
b) Mesure de Ia libération de TNF-α
L'expression du TNF-α représente un paramètre de l'activation microgliale souvent analysée dans la littérature. La microglie au repos n'exprime pas cette cytokine. Une activation de 24 heures par le LPS entraîne une forte augmentation de l'expression, détectable par test Elisa. Dans les expériences réalisées, les concentrations en TNF-α ont été mesurées après 24 heures d'activation, dans des cultures de cellules microgliales traitées avec 0.01 μg/ml de LPS en présence de MRFAlO, MRFA-12, MRFA-14, MRFA-16, MRFA-18, DMRFAlO, DMRFA-12, DMRFA-14, DMRFA-16, DMRFA-18, MResvératrol, DMResvératrol et le Resvératrol à des concentrations de 5.10"6, 10"6 et 10"7 M.
Les résultats obtenus concernant la série des MRFA montrent que les MRFA-10, MRFA- 12 et MRFA- 14 entraînent une diminution dans les cellules de la production de TNF-CC de 20 à 40% à la concentration de 5.10"6 M par rapport aux valeurs contrôles.
L'activité de ces produits est concentration dépendante puisqu'elle décroît avec la concentration. L'homologue méthoxylé du resvératrol, le Mresvératrol, induit une baisse du taux de TNF-α de 20% seulement. En ce qui concerne la série des dérivés diméthoxylés, les DMRFA, Le DMRFA-
10 et le DMRFA- 12 induisent une baisse de TNF-α de 40% à 5.10"6 M par rapport au contrôle. Une diminution de 50% est observée à la même concentration pour le
DMResvératrol.
Finalement, le RFA- 12 induit une baisse du taux de TNF-α à la concentration de 5.10~6 M de 40% par rapport aux valeurs contrôles. Le resvératrol, quant à lui, induit une baisse de seulement 30% dans les mêmes conditions.
Ces résultats préliminaires sur la production de TNF-α montrent que de manière générale, les composés hybrides, RFA, MRFA et DMRFA selon la présente invention présentent une meilleure activité que leurs homologues du resvératrol. L'importance de la présence de la chaîne ω-hydroxylée a donc pu être mise en évidence, ainsi que sa longueur. En effet, les composés portant une chaîne latérale de 10 ou 12 atomes de carbones se révèlent avoir la meilleure activité.
MResvératrol DMResvératrol
Effet du RFA12 et de ces analogues sur la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales.
La plupart des maladies du système nerveux central (SNC) sont causées par une dégénérescence ou une agression de différents types cellulaires comme les neurones ou les cellules gliales. Des études sur des modèles animaux suggèrent qu'il serait possible de remédier à ces dommages soit par transplantation de cellules souches neurales ou en activant les cellules souches présentent au sein du système nerveux central. Ces cellules souches neurales permettent de générer des neurones, des oligodendrocytes et des astrocytes.
Une approche thérapeutique intéressante est le développement de petites molécules comme les RFA permettant de contrôler ou d'induire la différenciation endogène de cellules souches neurales en différentes cellules nerveuses.
Protocole expérimental
Les neurosphères sont obtenues à partir de cellules provenant du telencéphale d'embryons de souris cultivées en milieu défini contenant 20 ng/mL d'EGF. Après dissociation, les sphères prolifèrent pendant 3 jours en présence d'EGF (20 ng/mL) durant la phase appelée phase de prolifération.
Ensuite elles sont collectées et déposées sur un support de poly-ornithine dans un milieu défini, en présence d'EGF 2 ng/mL. Dans ces conditions, les sphères adhèrent au support et se différencient. Les composés à tester, le RFA12 et ses analogues, préalablement dissous dans l'éthanol, sont ajoutés immédiatement après le dépôt des neurosphères à différentes concentrations s'échelonnant de 10"5 à 10"9 M. Les cultures témoins sont traitées par un contrôle négatif (éthanol) et un contrôle positif (Acide rétinoïque).
Après 3 jours de culture (phase de différenciation) les cellules sont fixées et les différents types cellulaires sont révélés par immunocytochimie. Pour le criblage de nos composés nous avons effectués un double marquage à savoir celui des neurones et des astrocytes. Les anticorps primaires utilisés sont :
• anticorps anti-MAP2ab (Microtubule Associated Protein), marqueur de neurones précoces (mitotiques)
• anticorps TUJl (anti Béta (III) Tubuline), marqueur de neurones (post- mitotiques) • anticorps anti-GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein), marqueur des astrocytes
Les anticorps anti-MAP2ab et TUJl sont révélés par des anticorps secondaires couplés à un fluorochrome cyanine, le Cy-3 (rouge). Pour la détection des astrocytes, un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, dérivé de la rhodamine, l'Alexa488 (vert) a été utilisé.
Afin de pouvoir quantifier les résultats, les noyaux sont marqués par un agent intercalant, le TO-PRO (bleu). Les cultures sont ensuite observées au microscope confocal.
Résultats
1. Le RFA12 induit la différenciation de cellules souches neurales en neurones. L'effet du RFA 12 sur la différenciation des cellules souches neurales en neurone ou en cellules gliales a été testé à des concentrations allant de 10~5 à 10~9 M. A la concentration de 10 "5 M il est à remarquer que le RFA 12 ne permet pas d'induire une différenciation de par une toxicité à cette concentration. Parallèlement, à 10"9 M le RFA12 ne présente qu'une faible activité. Cependant, si les neurosphères sont traitées avec du RFAl 2 avec des concentrations allant de 10"6 M a 10"8 M une augmentation du nombre de neurones par rapport au contrôle (cellules non traitées) est observée. Aux concentrations de 10"6, 10"7 et 10"8 M nous pouvons observer une augmentation de la population de neurones de 120%, 90% et 80% respectivement par rapport au contrôle fixé à 100%. Ces résultats montre que l'effet du RFA12 sur la différenciation des cellules souches neurales en neurones est dose-dépendante avec un effet maximal à la concentration de 10"6 M.
2. Afin de voir si les RFA et ces analogues permettaient également d'agir sur la prolifération des cellules souches neurales, ces dernières sont dissociées puis cultivées en présence de RFA (10"6 et 10"8 M) pendant 5 jours, puis le nombre de cellules vivantes est comptabilisé ainsi que la taille et la morphologie des cellules.
Les résultats montrent que le RFA12 à la concentration de 10"6 M permet d'inhiber la prolifération des cellules souches neurales.
Conclusion
Le RFA12 permet d'induire la différenciation des cellules souches neurales en neurones tout en inhibant la prolifération de ces dernières à la concentration de 10"6 M. Références bibliographiques
[1] S. Renaud and M. de Lorgeril, Lancet, 1992, 339, 1523-1526
[2] M. Wang, Y. Jm and C-T. Ho, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 3974-3977
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[10] B. Poeggeler, S. Thuermann, A. Dose, M. Schoenke, S. Burkhardt and R. Hardeland, J. Pineal Res., 2002, 33, 20-30 [11].Z. Matuszak, K. J. Reska and C. F. Chignell, Free Radical Biology & Medicine, 1997, 23, 367-372. [12] R. Reiter, L. Tang, J. J. Garcia and A. Muήoz-Hoyos, Life Sciences, 1997, 60, 2255-2271.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé de formule générale (I) suivante :
dans laquelle
R1, R2 et R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, un groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyle.
R4 ,R5, R6 et R7 représentent un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C6, un groupe alcoxy en C1-C6, un groupe (alkyle en Ci-C6) carbonyle oxy, n est un nombre entier compris entre 8 et 20, ou ses sels d'addition pharmaceutiquement acceptables, isomères, énantiomères, diastéréoisomères, ainsi que leurs mélanges.
2. Composé selon la revendication 1 caractérisée en ce que R1, R2, et R3 représentent un groupe méthyle ou un atome hydrogène.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que R4, R5, R6 ou R7 représentent un atome d'hydrogène ou un groupe méthoxy.
4. Composé selon selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que R5, R6 et R7 représentent un atome d'hydrogène.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que n est un nombre entier égal à 10, 12, 14, 16, ou 18.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que n est un nombre entier égal à 10 ou 12.
7. Composés selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisés en ce qu'il est choisi parmi :
le RFA- 12, de formule suivante :
le MRFA- 12, de formule suivante
OMe
le DMRFA- 12, de formule suivante OMe
le MRFA-10 de formule suivante :
OMe
et le DMRFA-10 de formule suivante
OMe
Composé selon la revendication 7 caractérisé en ce que qu'il s'agit du
RFA- 12
9. Composition pharmaceutique caractérisé en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition pharmaceutique selon la revendication 9 pour son utilisation comme médicament.
11. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10 pour son utilisation en tant que médicament ayant un effet neurotrophique et/ou neuroprotecteur et/ou antiinflammatoire, et/ou destiné à la prévention ou au traitement des maladies ou désordres du système nerveux altérant les neurones ou les autres cellules du système nerveux et/ou des maladies ou désordres de l'inflammation du système nerveux, et/ou des neuropathies dégénératives, et/ou des maladies démyélinisantes ou dysmyélinisantes et/ou des accidents vasculaires cérébraux ou toutes autres atteintes lésionnelles du système nerveux.
12. Composé ou composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que les neuropathies dégénératives sont la sclérose en plaques, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, ou la maladie de Creutzfeldt-Jakob.
13. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou composition pharmaceutique selon la revendication 10 pour son utilisation en tant que médicament destiné à moduler la spécification cellulaire des cellules souches neurales, favoriser la différenciation puis la survie des neurones et cellules gliales en différenciation, favoriser la différenciation de cellules précurseurs d'oligodendrocytes en oligodendrocytes matures, et/ou diminuer l'activation de la microglie et/ou l'activation des astrocytes et/ou la gliose réactionnelle.
14. Utilisation in vitro d'au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour l'obtention de neurones et/ou cellules gliales différenciées à partir de cellules souches.
15. Procédé de préparation d'un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 9 dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un atome d'hydrogène caractérisé en ce qu'il comprend l'étape (a) de réaction du composé de formule générale (I) dans laquelle R1, R2 et R3 représentent groupe alkyle en Ci-C6 avec le tribromure de bore dans du dichlorométhane à -78°C.
16. Procédé de préparation d'un composé de formule (I) selon l'une des revendications 1 à 9 dans laquelle R1, R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 caractérisé en ce qu'il comprend l'étape (b) de couplage de Wadsworth-Emmons entre le composé de formule générale (II) suivante :
dans laquelle Ri représente un groupe alkyle en Ci-C6 et R4 est tel que défini dans les revendications 1 à 9 et le composé de formule générale (III) suivante :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6, et n est tel que défini dans les revendications 1 à 9, avantageusement en présence de méthylate de sodium dans du diméthylformamide à reflux.
17. Procédé selon la revendication 16 caractérisée en ce que le composé de formule générale (III) est obtenu par les étapes (c), (d) et (e) suivantes : -(e) hydrogénation catalytique, avantageusement avec du palladium sur charbon à 5%, du composé de formule générale (IV) suivante :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini dans la revendication 17 pour obtenir la composé de formule générale (V) suivante :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini dans la revendication 17, -(d) réduction de l'ester de formule (V) en alcool de formule générale (VI) suivante :
dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et n est tel que défini dans la revendication 17, avantageusement à l'aide d'hydrure mixte d'aluminium et de lithium,
-(c) oxydation de l'alcool de formule (VI) en aldéhyde de formule (III), avantageusement en utilisant le tétra-n-propylammonium perruthénate et de la N- méthylmorpholine.
18. Procédé selon la revendication 17 caractérisée en ce que le composé de formule générale (IV) est obtenu par l'étape (f) de réaction de couplage de Sonogashira entre le composé de formule générale (VII) suivante : dans laquelle R2 et R3 représentent un groupe alkyle en Ci-C6 et le composé de formule générale (VIII) suivante :
^£θTBDMS (vm)
dans laquelle n est tel que défini dans la revendication 18, avantageusement à l'aide de PdCl2(PPhS)2, en présence de CuI dans la triéthylamine à reflux.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 caractérisées en ce que R1, R2 et R3 représentent un groupe méthyle et R4 représente un atome d'hydrogène.
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