EP1943522A2 - Verfahren zur erkennung, markierung und behandlung von epithelialen lungentumorzellen sowie mittel zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur erkennung, markierung und behandlung von epithelialen lungentumorzellen sowie mittel zur durchführung des verfahrens

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EP1943522A2
EP1943522A2 EP06847247A EP06847247A EP1943522A2 EP 1943522 A2 EP1943522 A2 EP 1943522A2 EP 06847247 A EP06847247 A EP 06847247A EP 06847247 A EP06847247 A EP 06847247A EP 1943522 A2 EP1943522 A2 EP 1943522A2
Authority
EP
European Patent Office
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derived therefrom
substance
affinity
mrna
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06847247A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen BORLAK
Gabriela Salinas-Riester
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP1943522A2 publication Critical patent/EP1943522A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection, marking and treatment of epithelial lung tumor cells, in particular from adenocarcinomas, with the aid of new therapy targets, and to a means for carrying out the method.
  • Areas of application of the invention are diagnostic medicine, the pharmaceutical industry and molecular biological research.
  • the cells of malignant tumors are misdirected, i.e. they have lost their specific properties and share uninhibitedly.
  • carcinoma an epithelial tumor originating from the ceiling tissue, whereby approx. 90% of all tumors are of epithelial origin, and sarcoma, a mesenchymal tumor arising from the connective tissue, which affects approx. 10% of all tumors.
  • Lung cancer is generally understood to mean a degeneration of the tissue in various areas of the lungs. This includes not only bronchial carcinoma (cancer of the actual lung tissue), but also very rare cancers such as mesothelioma (cancer of the lung).
  • Bronchial carcinoma most often occurs between the ages of 65 and 70 and is the most common type of cancer in men in Germany. Every year, over 42,000 people develop lung cancer in Germany, around five percent of those affected are under 40 years old. Smoking is the cause of the development of this disease in about 90 percent of cases. Bronchial carcinoma is the most common tumor in humans worldwide. Is lung cancer. a very serious illness, which in most cases is no longer curable.
  • Adenocarcinoma is the most common malignancy in women and men. As with other malignant tumors, the survival of those affected is influenced by many factors, including the formation of Metastases. In order to determine prognostic factors and to prevent metastasis of tumors, new approaches for improved therapy are being developed worldwide. Cell adhesion and extracellular matrix molecules, and metalloproteinases and their inhibitors are pronounced 'interesting targets for tumor therapy. The expression of adhesion molecules on the cell surface is subject to a number of changes. Adhesion-mediated cell-to-cell and extracellular matrix interactions significantly influence tumor formation and metastasis of malignant neoplasms.
  • the invention was based on the object of specifying a simple, sensitive method which is gentle on the ufid for the detection, marking and treatment of epithelial lung cancer cells and of providing and using a means for their detection, marking or treatment.
  • the key point of the invention is the finding that in c-raf and / or c-rhyc-induced adenocarcinomas of the lungs the expression of genes which code for CAM and ECM molecules is changed.
  • the invention is based on the discovery of new therapy targets. These are cell adhesion and extracellular matrix proteins, which are used for antibody therapy of all carcinomas of the lungs, e.g. of adenocarcinomas.
  • new therapy targets are cell adhesion and extracellular matrix proteins, which are used for antibody therapy of all carcinomas of the lungs, e.g. of adenocarcinomas.
  • the completely surprisingly successful identification of new therapy targets enables ..selective and gentle therapy and diagnostics for the first time.
  • lung adenocarcinomas in transgenic mice were examined. It could be shown that basigin, an inducer of extracellular matrix metalloproteinase, is overexpressed while repressing the expression of a basigin inhibitor and tumor suppressor, caveolin.
  • the induction of ADAM-19 could be demonstrated by expression of the coding gene and the translated protein. It is a novel "disintegrin" matrix metalloproteinase. Repression of TIMP3, an inhibitor of ADAM proteins, provides the tumor with significant advantages.
  • ADAM-19 mediates the breakdown of collagen 17alpha1, among other things, and thus promotes tumor integration Process is prevented by TIMP-3, which is repressed in adenocarcinomas of the lungs, and it is also shown within the exemplary embodiments of the invention that; other further cell adhesion molecules are strongly repressed, for example cadherin 2, 5 and 13; procadhrin alpha 4; procollagen 17a1 and 13a1, laminins 2, 4 and 1; integrin alpha 8; ICAM2; vinculin; vitronectin and tetrapsins. In contrast, Ep-CAM was induced.
  • the basis of the invention is therefore the completely surprisingly uncovered regulation of adhesion molecules and MMPs as well as their inhibitors in c-raf and / or c-myc-induced lung adenocarcinomas.
  • c-raf or c-myc was used as an essential component of the mitogen and stress-induced signal transduction pathways. Its directional overexpression in the alveolar epithelium caused adenocarcinoma. Tumor growth was related to changes in expression of extracellular matrix (ECM) and cell adhesion (CAM) molecules.
  • ECM extracellular matrix
  • CAM cell adhesion
  • induction of basigin an inducer for extracellular matrix metalloproteinases, was observed, while its inhibitor and tumor suppressor caveofin-1 was repressed.
  • ADAM-19 a novel disintegrin metalloproteinase, was increased, while that of TIMP-3, an inhibitor of ADAM proteins, was suppressed.
  • CAMs CAMs
  • cadherin 2, 5, 13, procadherin alpha 4, procilages type XIII and XVII, laminins (2.4.1), integrin alpha 8, ICAM2, vinculin, vitronectin and tetrapsins observed, but the expression of Ep-CAM was significantly increased.
  • the biological system essentially means organisms, cell tissues, cells, cell components, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, proteins and / or peptides as well as structures derived from them, the biotechnological system means all possible test arrangements, with whose help properties of epithelial tumor cells of pulmonary adenocarcinomas or structures derived therefrom can be demonstrated.
  • the biological or biotechnological system is brought into contact with at least one substance, the affinity for at least one of the following Component has: to the genes ADAM19, Mmp12, Col18a1, Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, CIdn2, Cldn3, Cldn7, Krti-18, Krt2-8, tacstdi, tacstd2, S100a1, S100a11 and / or their variants and / or parts thereof and / or their mRNA and / or their gene products and / or cleavage products, polypeptides or peptides derived therefrom.
  • the essence of the invention is that the substance is linked to a marker that has a certain property.
  • the method is particularly suitable if the biological or bis-technological system comprises or contains an organism, cell tissue, cells, cell components, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, proteins or peptides or structures derived therefrom, since these are particularly good for recognition , Labeling or treatment of epithelial tumor cells from pulmonary adenocarcinoma with the labeled substance according to the invention are suitable, in particular if they comprise lung tumor cells and / or oligonucleotide libraries.
  • oligonucleotides, proteins, peptides or structures derived therefrom are suitable as an at least partially soluble substance. These have the advantage that they can specifically recognize two- or three-dimensional target structures at the molecular level. In addition, they have the advantageous property that the detection is usually in aqueous ⁇ physiological
  • Monoclonal and / or polyclonal antibodies or antibody fragments are particularly suitable, since they are formed as robust, highly specific structures which can in principle be produced with affinity for all possible molecular target structures.
  • human and / or bispecific antibodies or human and / or bispecific antibody fragments are used because they can reduce the immune response of the human immune system in contact with the substance of the invention at least or the bispecific binding macrophages or other components of DES immune system with a target structure, in particular epithelial lung tumor cells from adenocarcinomas.
  • monoclonal antibodies and / or antibody fragments are suitable because they allow particularly good selectivity, sensitivity and reproducibility of the method according to the invention.
  • the marker according to the invention is formed or composed of an element, isotope, molecule and / or ion, in particular as a dye, contrast agent, chemotherapeutic agent, radionuclide, toxin, lipid, carbohydrate, biotin, Peptide, protein, microparticle, vesicle, polymer, hydrogel, cell organelle, virus and / or whole cell is formed or comprises, whereby the labeled substance is adaptable to a wide variety of needs.
  • biotin is used as a marker, the amount of necessary pharmacon, which is added in a second / subsequent step, can be reduced considerably when the pharmacon. Is examined and / or treated with epithelial lung tumor cells, in particular from adenocarcinomas is bound to streptavidin.
  • the marker is formed or contains a preferably antibody-and / or enzyme-labeled secondary antibody and / or protein A and / or protein G or structure derived therefrom.
  • hyaluronan or derived structures as markers, since it can advantageously be absorbed simultaneously by target structures / receptors of the affine substance.
  • connection between the marker and the substance is advantageously designed chemically, electrostatically and / or via hydrophobic interactions, since this has sufficient binding stability for the use of the marked substance for the detection, marking and treatment of epithelial lung tumor cells, in particular from adenocaricomas, preferably if the compound is covalent.
  • Electrostatic are also particularly suitable and / or hydrophobic interactions which originate from amino acid residues or their side chains, preferably proteins or nitrogen bases of nucleotides or are formed between them.
  • the simultaneous use of several substances is particularly suitable, especially if they comprise three substances with affinity for Bsg and Cldn2 and Tnf.sf9 or their rnRNA sequences or their gene products.
  • molecules, cells and / or tissues are used for the implementation of the method according to the invention, which are immobilized on a planar surface, preferably location-addressed.
  • the immobilization has the advantage that it is particularly easy to identify, mark lung tumor cells because surfaces can be screened particularly easily, in particular if they are used as a membrane, for example made of nitrocellulose or PVDF, as a cavity of a microtiter / ELISA plate or a cell culture vessel or as Glass or plastic chip are formed.
  • substances are used as solid phase-bound molecules which have affinity for at least one of the genes ADAM19, Mmp12, CoI18a1, Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, Cldn2, Cldn3, Cldn7, Krt1-18, Krt2- 8, tacstdi, tacstd2, S100a1, S100a11 and / or their variants and / or parts thereof and / or their mRNA and / or their gene products and / or cleavage products, polypeptides or peptides derived therefrom (hereinafter referred to as “target structure”), since these allow a particularly simple detection or investigation of epithelial lung tumor cells on the surface if at least one of these substances interacts with, and binds to, their target structure, in particular immobilized molecules which are designed as oligonucleotides, antibodies or antibody fragments.
  • target structure polypeptides or peptides derived therefrom
  • target structures e.g. of receptors on an immobilized tissue section or on cells of a cell culture
  • any labeled molecules which are subsequently brought to the surface in solution, advantageously with one of the labeled substances according to the invention, for example a (fluorescence) labeled antibody.
  • oligonucleotide probes or primers are advantageously used.
  • immobilized molecular libraries for example DNA or antibody libraries, which interact with the target structures from a solution, for example with a cDNA library, a PCR product library or with epithelial lung cancer cells, in particular from adenocarcinomas
  • the target structures bound to the molecular libraries can be detected particularly well through the use of (dye) labeled probes added subsequently, preferably oligonucleotides or structures derived therefrom.
  • untagged 'primary antibodies used for detection they are favorably with labeled secondary antibodies, detectable.
  • the use of other proteins, for example enzymes, or streptavidin or parts thereof is also suitable.
  • adenocarcinomas for diagnostic detection of lung epithelial cells, in particular from adenocarcinomas, in the in vitro and in vivo diagnostics by means of the method according to the invention is preferably the use of optical apparatus, for example UV microscopes, scanners or ELISA readers; Photometers, or from scintigraphic devices, for example X-ray devices, are suitable.
  • optical apparatus for example UV microscopes, scanners or ELISA readers
  • Photometers or from scintigraphic devices, for example X-ray devices, are suitable.
  • Another aspect of the invention relates to a means for the detection, labeling and treatment of lung tumor cells, in particular epithelial lung cancer cells, in particular from adenocarcinomas, that it is a substance with an affinity according to claim 1 and possibly claim 14 and the features according to one of claims 4-6 and contains at least one substance which is optionally 'via a compound according to claims 11-12 with a label according to any of claims 7-9 and connected to the labeled substance, if necessary, is at least partially soluble, especially in aqueous and physiological solutions.
  • the corresponding agent is used for the production of a preparation for the particularly easy to implement sensitive and gentle detection, labeling and / or treatment of lung tumor cells, in particular from epithelial lung cancer cells from adenocarcinomas
  • test kit for the implementation of the method according to the invention for the diagnostic detection, marking and / or test-based treatment of epithelial lung tumor cells, preferably adenocarcinomas, the test kit containing at least one agent according to the invention according to claims 26-27, especially if the affine substances of the agent are immobilized on a surface, preferably location-addressed.
  • the raf kinases are proto-oncogenes that occur at the entry point of MAPK / ERK (Mitogen-activated-protein kinase / extracellular-signal-regulated-kinase)
  • raf-1 is activated by a wide range of growth factors, hormones and other external signals. After activation, raf-1 acts on MEK and phosphorylates it and binds to ERK, which is also activated by phosphorylation [1, 2].
  • the Ras / Raf / MEK / ERK cascade is viewed as a linear sequence, with ERK as a functional endpoint [3,4].
  • Activated ERK can be translocated to the core and thus forms a direct link between an extracellular signal, an internal signal sequence and the core response [4].
  • Overexpression of raf is associated with malignant tumors [5,6], and with tumor growth they require altered cell-cell contact and cell-matrix adhesions to allow for expansion, invasion, and tumor spread.
  • the examination of the adhesion molecules can thus provide insights into the basic principles of tumorigenesis and makes it easier to identify targets for new types of therapy.
  • Adhesion molecules are generally divided into cadherins, integrins, immunoglobulin-like receptors, CD44 and catenins [7]. These molecules function in a complex and coordinated manner to keep cells in one place or alternately to support cell movement.
  • Adhesion molecules also act in bidirectional signaling pathways that are required for many cellular functions, including transcription, cytoskeletal organization and proliferation [8,9].
  • integrins are a main group of adhesion receptors on the cell surfaces that support a mechanical transmembrane connection to the cytoskeleton and that activate several signal cascades.
  • integrins influence cell behavior , including shape, motility, differentiation, proliferation and survival [9].
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • ECM extracellular matrix
  • MMPs lyse partially degraded fine-fiber collagens and elastin and show a high affinity for collagens, which are important components of the epithelial base membranes and which are lysed during tumor growth.
  • tumors often show an increase in the expression of MMPs and a decrease in their inhibitors, e.g. of TlMPs, which lead to an increase in proteolytic activity [10-12].
  • cell surface proteoglycans (PGs) are important for the modulation of in cell adhesion and motility.
  • CAMs Cell surface adhesion receptors
  • lung adenocarcinomas were formed from transgenic mice.
  • gene expression profiles in histologically defined adenocarcinomas were determined and the transcription was compared with normal lung tissue from non-transgenic mice.
  • Corresponding work was also carried out with c-myc (overexpression).
  • Table 1 shows the transcripts identified as overexpressed in adenocarcinomas.
  • Claudin 2 was outstanding in lung adenocarcinomas. Its expression is not found in normal lung tissue. Claudin 3 and 7 were also overexpressed in tumor tissue. Therefore, claudin expression in lung adenocarcinomas induced by c-raf 1 had been redesigned.
  • the alveolar epithelial cells of rats express claudin 3, 7 and 5, with claudin 5 being strongly expressed by the entire alveolus.
  • the expression of Claudin 1 and 2 is minimal or completely absent [16, 17].
  • Claudines are components of the so-called tight junctions (TJs) and are epithelial barriers and function through paracellular permeability.
  • Additional molecules have been identified that can be used to classify lung tumors and include Keratin 1-18, a previously described marker for lung adenocarcinoma.
  • S100A1 and S100A11 were equally induced.
  • the S100 family is one of the largest subfamilies of calcium-binding proteins and is characterized by highly conserved helix-loop-helix regions, known as "EF-hand" motifs. S100 proteins are involved in tumorigenesis and transmit calcium signals during the Growth, differentiation and mobility of the cell [19].
  • CD44 was induced as a result of c-Raf overexpression. This receptor is a surface glycoprotein that is involved in cell-cell and cell-matrix interactions.
  • CD44 serves as a recoverable receptor for hyaluronan that is internalized and metabolized by endocytosis.
  • CD44 can anchor epithelial cells to hyaluronan in gene membranes for the maintenance of polar orientation [20]. This receptor can also function by attaching and rotating leukocytes on endothelial cells, which point them to peripheral lymphoid organs and inflammation sites, as well as for leukocyte aggregation. Signaling by CD44 induced cytokine release and T cell activation [21]
  • tumor-associated calcium signal transducers tacstd
  • Ep-CAM Ep-CAM
  • the Ep-CAM immunofluorescence staining is delimited above the background level by a channel tree.
  • Membrane staining is seen in the respiratory epithelial lines and terminal bronchi and bronchipoles. (Fig. 1a). Ep-CAM staining also highlights the tumor centers (Fig. 1b). The answer is homogeneous and membrane bound. The hyperplastic alveolar epithelium in the centers is also stained positively.
  • Ep-CAM Ep-CAM in both colon and other epithelial carcinomas.
  • This is a new type of adhesion molecule that is not structurally related to the members of the four main families of the immunoglobulin superfamily (cadherins, integrins, selectins and CAMs).
  • Ep-CAM extracellular domain of Ep-CAM consists of a cysteine-rich region that is of two types
  • EGF epidermal growth factor
  • Ep-CAM Increased Ep-CAM expression is associated with proliferation, decreased cadherin-mediated adhesion and a less differentiated phenotype, so it is obvious that Ep-CAM regulates the strength of intracellular adhesion and produces epithelial cells with flexible interconnections, which are necessary for the epithelium Morphogenesis and tissue maintenance are.
  • Integrins are important ECM receptors and are also involved in cell-cell interactions. There are several reports suggesting the critical role of integrins in tumorigenesis, invasion and metastasis in pulmonary adenocarcinoma. Expression of genes encoding molecules for cell adhesion and cell cell contacts has been induced, e.g. of integrins (Itgb2 and Itgax), procollagen XV (Col15a1) and laminins (Lamb3 and ⁇ Lamc2).
  • Integrin alpha 8 (Itga ⁇ ) in particular was significantly repressed.
  • the work according to the invention shows that integrin alpha 8 plays an important role in maintaining tissue integrity during an injury or in the regulation of mesangial cell phenotype. Integrin alpha 8 also promotes adhesion and prevents the migration and proliferation of mesangial cells [23]:
  • tetraspanins such as TM4SF 1, 2, V6, 12 and 13, were among the most dramatically reduced gene transcripts in those by c-raf Finding overexpression induced lung adenone carcinoma. The same was found for c-myc (overexpression).
  • TM4SF family also interact with adhesion receptors of the integrin family and regulate integrin-dependent cell migration [25].
  • the work according to the invention shows, for example, the loss of the gene expression of TM4SF from lung adenocarcinomas in comparison to normal lung tissue. It is therefore of paramount importance to understand which properties hold tetraspanins together and how a loss of tetraspanins can affect the functions of its partner molecules.
  • E-cadherin alpha4 The repression of many cadherins (procadherin alpha4, cadherin 2, 5 and 13) was another outstanding result of c-raf-induced and c-myc-induced lung adenocarcinomas.
  • Decreased expression of E-cadherin is considered to be one of the major molecular events that are involved in the dysfunction of the cell cell adhesion system and that enable cancer invasion and metastasis.
  • Research into E-Cadherin has provided insight into embryogenesis and oncogenesis. Control of epithelium-mesenchymal conversion is stated as one of the most important functions of E-cadherin in development [26].
  • Tumor progression is a multi-step process in which cellular motility is associated with controlled proteolysis and involves the interaction between tumor cells and the ECM.
  • Cells transformed during tumor growth migrate from the primary tumor to cross-structured barriers, including base membranes and surrounding stromal collagen ECM. Degradation of stromal ECM is believed to be essential in turn-induced angiognesis. High level expression of MMPs in tumor tissues has been associated with tumor invasion and progression.
  • basigin or EMMPRIN extracellular matrix metalloproteinase inducer
  • Basigin is a cell surface transmembrane glycoprotein that is widely expressed on many different cell types and appears to be particularly high in invasive tumor cells [27-28]. Increased basigin expression correlates well with the tumor progression of " glioma cells [29, 30], hepatoma cells [31], scaly cell carcinomas [32] and melanomas [33, 34]. Basigin stimulates the production of MMPs and promotes hyaluronan Production in breast cancer carcinomas [35].
  • Basigin is, at least partially, regulated by caveolin 1 (cav1), a well-established tumor suppressor and was found in the work according to the invention to be repressed in lung adenocarcinomas of c-raf transgenic mice.
  • Caveolin 1 associated with basigin during of biosynthesis in the Golgi complex and escorts basigin to the cell surface, thereby inhibiting the self-aggregation of basigin and induction of MMPs.
  • the difference in gene expression between basigin and caveolin 1 suggests that basigin inhibits the production of MMPs in c- favored raf- ⁇ induced lung adenocarcinomas, and the same was observed for c-myc.
  • ADAM-19 was found to be overexpressed within the work leading to the invention.
  • ADAM proteins are a family of type I transmembrane glycoproteins that contain a disintegrin and metalloprotease (A disintegrin and metalloprotease) domain and - perform the functions in fertilization, cardiac development, neurogenesis and the so-called protein ectodomain shedding [37].
  • ADAM proteins are known to be expressed in kereatinocytes and are actively involved in keratinocyte motility. KoIIagens therefore appear as a new substrate class for ADAM [38, 39].
  • the extracellular matrix metalloproteinase inducer basigin and AD. ⁇ M-19 were likewise examined using Western blots, and both gene products were increased in lung adenocarcinomas induced by c-raf (FIG. 2). Analogous results were also obtained for c-myc.
  • Collagen transmembrane proteins are widely expressed and are involved in cell adhesion and epithelial / mesenchymal interactions during morphogenesis.
  • the collagens XII and XVII were found to be repressed. They are components of morphologically different cell adhesion structures, for example focal adhesion or hemidesmosomes.
  • Collagen XVII a type II transmembrane protein and epithelial adhesion molecule, can be released proteolytically from the cell surface to produce soluble collagen.
  • the release by so-called shedding is increased, for example, by phorbol esters and inhibited by metalloprotease inhibitors, for example by hydroxamates or TIMP-3, but not by inhibitors of other classes of proteases or by TIMP-2 [40].
  • the release of the ectodomain from collagen XVII (Col17a1) is functionally linked to a change in callagen motility in vitro [41].
  • TIMP-3 tissue inhibitors of metalloproteinase-23
  • TIMP-3 disrupts the outstanding TIMP / MMP balance required for proper focal ECM proteolysis and for the correct morphogenesis of the bronchiolar branch in the Development of the mouse lung leads [43]. Furthermore, T1MP-3 shares only 25% amino acid homology with TIMP-1 and TIMP-2.
  • TIMP-3 Repression of T ⁇ MP-3 has been shown to promote tumor cell invasiveness in vitro and the induction of tumor growth in vivo [44].
  • TIMP-3 has been shown to inhibit endothelial cell migration and tubule / tube formation in vitro, the effect of TIMP-3 overexpression on tumor-induced angiogenesis in vivo has not yet been investigated.
  • ADAM-19 is a Sheddase candidate for Col71a1 in pulmonary adenocarcinoma and TIMP-3 inhibits Col17a1 proteolysis.
  • the biological effects of collagen XVII release are still so far. not fully understood.
  • a first prediction is that the cleavage of the ectodomain promotes the detachment of keratinocytes during morphogenesis, differentiation and regeneration, and participates in the adhesion of basal keratinocytes to the extracellular matrix.
  • TNF tumor necrosis factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • Tnfsf9 is a ligand for TNFRSF9 / 4-1BB, which is a costimulatory molecule in T lymphocytes. This cytokine and its receptor are involved in an antigen presenting process and in the generation of cytotoxic T cells. Tnfsf9 was induced in c-raf lung carcinomas and was also found to be elevated in various carcinoma cell lines. Analogous results were also observed for c-myc.
  • Tnfsf9 is involved in the T cell / tumor cell interaction [46] and was not found in normal mouse lung tissue.
  • Collagens XV and XVIII include the multiplexin subfamily and non-fibrillary collagens. Overexpression of collagens XV and XVIII therefore presumably contributes to the cell migration of lung adenocarcinomas. These differences in migration mechanisms can therefore be helpful in explaining some of the Zeil-specific effects of integrins on cell migration. As shown by the exemplary embodiments, tumor growth and progress is promoted by the restructuring of the surrounding ECM.
  • the degradation of the transmembrane molecules colXVIIai is presumably catalyzed by ADAM-19 in lung adenocarcinomas.
  • Degradation of colXVIIai is controlled by TIMP-3, a specific inhibitor of ADAM17, and also by other members of this family.
  • TlMP-3 is therefore related to the changed ECM and is involved in endothelial cell migration and angiogenesis.
  • the interaction of cells with the ECM is crucial for the normal development and function of an organism. Therefore, the regulation of the composition and completeness of the ECM structure is of crucial importance.
  • Enzymes involved in the restructuring,. play an essential role in the control of signals caused by matrix molecules that control cell proliferation, differentiation and cell death.
  • epithelial and endothelial cells which include the various tissues of the body. They regulate the passage of molecules through these natural barriers.
  • Epithelial transport takes place through transcellular and paracellular pathways, some of which are regulated by ciaudins.
  • ciaudin 2 is selectively expressed in lung adenocarcinomas, whereas claudin 5 expression is repressed in lung tumors.
  • the removal or addition of ciaudins affects the permeability properties of tight junctions because they form paracellular pores or channels that control selective ion permeability (Anderson 2001 and Tsutika et al. 2001).
  • the starting point for the invention is therefore the completely surprisingly found restructuring of ECM and CAM as a result of the c-raf (or c-myc) overexpression in the alveolar epithelium.
  • the invention is based on the knowledge gained for the first time that the expression of ECM and CAM molecules is associated with expansive tumor growth and tumor invasion (FIG. 3).
  • the up-regulation of Ep-CAM is particularly clear, which is now available for the first time as target structures for lung adenocarcinomas, for example for antibody-based forms of therapy.
  • the invention based on the discovery of new therapy targets now enables for the first time a selective, efficient and gentle diagnosis and therapy of lung tumor cells.
  • the invention enables a better effectiveness of preventive examinations.
  • the therapy targets are cell adhesion and extracellular matrix proteins which are suitable for therapy, in particular antibody therapy, of all carcinomas of the lungs, for example adenocarcinomas.
  • the completely surprisingly successful identification of new therapy target structures enables selective and gentle therapy and diagnosis for the first time.
  • the use of substances with an affinity for the repressed genes described (see Table 2a) or geji products or structures derived therefrom is particularly useful, since these provide a further (control) option for the detection, labeling and treatment of Make lung tumor cells realizable.
  • the invention likewise forms a basis for therapy with inhibitory antibodies and bifunctional antibodies (recruitment of cytotoxic CD4 + or CD8 + cells).
  • antibodies with cytotoxic conjugates and active substance molecules can also be specifically developed for the novel therapeutic targets according to the invention and can therefore be used therapeutically.
  • First strand cDNA was generated from 10 ⁇ g total RNA with an oligo (dT) 24 primer (PROLIGO Primers and Probes; SuperScript Il Rääse H-Reverse Transkripase, 5x first strand buffer and 0.1 M DTT (Invitrogen; 18064-014 or 18064 -071), dNTP Mix, 10 mM (Invitrogen; 18427-013)
  • the second-strand synthesis was carried out in 20 ⁇ l of the first-strand reaction mixture at 42 ° C. for 1 h using 5 ⁇ second-strand buffer (Invitrogen; 10812-014), DNA ligase E. coli, 10 U / ⁇ l (Ivitrogen; 18052019), DNA polymerase I E.
  • coli 10 U / ⁇ l. (Invitrogen; 18010-025), RNAse H; 2 U / ⁇ l (Invitrogen; 18021-14; 18021-071); T4-DNA polymerase; 5U / ⁇ l (Invitrogen; 18005-025), EDTA disodium salt, 0.5 M solution (SIGMA; P / N E7889). DNA was cleaned with the GeneChip®Sample Cleanup module according to the Affymetrix Protocol carried out.
  • the biotin-labeled cRNA was generated by an in vitro transcription reaction from the cDNA sample using the BioArray RNA transcript labeling kit (Enzo Diagnosis, Farmingdale, NY) with biotin-labeled CTP and UTP.
  • the labeled cRNA was purified using RNeasy spin columns (Qiagen). 15 ⁇ g of each cRNA sample was fragmented at 94 ° C. for 35 minutes in fragmentation buffer (40 mM Tris acetate, pH 8.1, 100 mM potassium acetate and 30 mM magnesium acetate) and then used to prepare 300 ⁇ l hybridization mixture.
  • a biotinylated Oligonucleotide, B2 which was hybridized with control features (molecules) in the middle and at the four corners of each chip, was used as an orientation aid for sample determination on the chip.
  • the Affymetrix GeneChip MG._U74Av2 was placed in the GeneChip ⁇ Hybridization-Oven 640 (Affymetrix). Hybridizations took place at 45 0 C for 16 hours at 60 ⁇ m. The arrays were removed from the chamber. Washing, drying and dyeing steps were carried out in the washing station 400 (Affymetrix) in accordance with the Affymetrix Array protocol.
  • Microarray screening scanning and data acquisition.
  • the hybridized arrays were scanned with a calibrated GeneArray scanner (Acjilent) at the wavelength 570 nm (pixel 3 ⁇ m). Each array was scanned 3 times.
  • the GeneChip operating software GCOS (Affymetrix) was used as software for data acquisition.
  • the array data was normalized using scaling or per-chip normalization to match the total or average intensity of each array.
  • the scale factor was set according to the Affymetrtrix recommendation and used to generate a micro-array quality control and a data report. Features that showed a different expression with a factor greater than 1.7 were considered significant and were noted in an Excel spreadsheet with gene annotations and ontological data from the NetAffix TM analysis center.
  • a t-test analysis was performed using Affymetrix's DATA Mining Tool (DMT) 3.0.
  • DMT Affymetrix's DATA Mining Tool 3.0.
  • a stringent comparison between normal and tumor tissues was made according to the consistency of changes in gene expression.
  • a t-test and a ranking analysis with up- and down-regulated genes was carried out and only genes that were 100% concordant in the change direction with a p-value ⁇ 0.05 (t-test) and a FC greater than or equal to 1.7 / FC less than or equal to -1.7 were taken into account.
  • amplimer sequences (5 'to 3') forwards (forward) and correspondingly reverse were as follows: ADAM-19: cgatggcggctgcatcatggc; ccaccagcttgcactggtggc; TIMP-3:
  • Lamc2 gctggaaggcaggatcgagca, ttcctgccagactcaggcgca; TM4sf2:
  • gttgattggcatgctgctggc gcagggatagtatgtactgtg
  • CAP-1 cacgctcagcactgtttgcac, cacttgtagatgtaagccacc
  • Vtn aagtggagcaacaggaggaga, caacattgtctggtatgccac
  • Ccr5 gtcagaacggtcaactttggg, gttgtagggagtccagaagag.
  • RT-PCR (thermal cycler): 20 ng DNA were analyzed in 20 ⁇ l reactions (94 ° C, 1 min .; 55-58 ° C, 1 min; 72 ° C, 2 min.) PCR reactions were carried out using Abgene Thermo - Start Taq (Cat No.:AB-1908/B), 10x reaction buffer (15 mM MgC! 2) and 10 mM dNTP from MBI Fermentas (Cat No.:R0181). PCR reactions were performed with 25-40 cycles to determine the linear amplification range of each primer set. The quantitative determination of the bands was carried out using Kodak 1D 3.5 Network Software.
  • the sections were rehydrated in wash buffer (1 mg bovine serum albumin (BSA) / ml phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4), with rat anti-mouse antibody Ep-CAM (BD Biosciences Pharmigen, diluted 1: 1000 in 10 mg BSA / ml PBS) in a humidity chamber at 4 ° C overnight, and, after washing steps with buffer, goat anti-rat Cy-3 conjugated antibody (Chemicon, 1: 200 diluted in 10 mg BSA / ml PBS) at room temperature in the dark , I was incubated for an hour.
  • wash buffer (1 mg bovine serum albumin (BSA) / ml phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
  • Ep-CAM rat anti-mouse antibody Ep-CAM
  • the sections were in water-soluble embedding medium (Glycergel, DAKO) 4 1 , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 1 Serva) for core staining and in bicyclo (2, 2, 2) -1, 4-diazaoctane (DABCO, Sigma) as an anti-bleaching agent.
  • DAPI 1 Serva 6-diamidino-2-phenylindole
  • DABCO 4-diazaoctane
  • Hynes, R.O. Integrins versatility, modulation and signaling in cell adhesion. Cell 69, 11-25 (1992). 10. Kumaki, F. et al. Expression of matrix metal proteinases in invasive pulmonary adenocarcinoma with bronchiolalveolar component and atypical adenomatous hyperplasia. At the. J Pathol. 159, 2125-35 (2001).
  • Tetraspanin CD9 is associated with very late-acting integrins in human vascular smooth muscle cells and m ⁇ dulates collagen matrix reorganization. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18, 1691-97 (1998).
  • TCSF Tumor collagenase stimulatory factor
  • Kanekura, T., Chen, X., Kanzaki, T. Basigin (CD147) is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts. Int. J. Cancer 99, 520-8 (2002).
  • ADAMs a disintegrin and metalloproteinases
  • TIMP-3 a transintegrin and metalloproteinases
  • Table 1 Overexpressed genes related to the ECM remodeling in non-cellular lung cancer
  • Table i Overexpressed genes (> 1.7-fold, P ⁇ 0.1) based on the ECM transformation in induced in lung adenocarcinomas by c-raf in mice. The fold change was determined using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes that were only detected as "present” in lung adenocarcinomas.
  • Table 2a Repressed genes related to the ECM remodeling of adhesion molecules in non-small cell lung cancer
  • Table ⁇ 2a Repressed genes ( ⁇ 1.7-fold, P ⁇ 0.1) based on the reorganization of cell adhesion in adenocarcinomas, induced by c-raf in mice.
  • the change factor (fo / d change) was determined using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes that were detected as "absent" in lung adenocarcinomas ..
  • Table 2b Differently expressed genes related to ⁇ ell-mediated immunity
  • Table 2b Highly regulated genes based on cell-immunity (> 17-fold, P ⁇ 0.1). The change in factor was calculated using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes that were detected as "absent" in normal lung tissue.
  • Table 4 Overexpressed genes (> 1.7-fold, P ⁇ 0.1) based on the ECM redesign in lung adenocarcinomas Induced by c-raf or c-myc in mice. The fold change was determined using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes that were only detected as "present” in lung adenocarcinomas.
  • Table 5 Repressed genes related to the ECM remodeling of adhesion molecules in non-small cell lung cancer
  • Table 5 Repressed genes ( ⁇ 1.7-fold, P ⁇ 0.1) based on the reshaping of cell adhesion in adenocarcinomas, induced by c-raf or c-myc in mice. The fold change was determined using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes that are "absent" in
  • Figure 1 Immunohistochemistry of Ep-Cam in lung adenocarcinoma.
  • Figure 2 Western blots from Basigin and ADAM19.
  • Figure 3 Schematic model with some of the ones modified by c-raf-1
  • Basigin was analyzed using an anti-mouse EMMPRIN monoclonal antibody. All bands show basigin at ⁇ 55 KDa, but basigin is elevated in c-raf-1 lung tumors.
  • L protein ladder. 100 ⁇ g protein extracts from lung controls and lung tumors were used for the individual lanes.
  • Figure 3
  • MMP12 and ADAM19 Table 6, Fig. 4A.
  • CD44 we found basigin induced, an extra-cellular matrix metalloproteinase, whereas its inhibitor caveolin-1 was repressed.
  • Mmp12 and ADAM19 a novel disintegrin metalloproteinase, correlated with the inhibition of Timp-3, an inhibitor of proteins of the ADAM family.
  • CAM molecules including cadherin 2, 5, 13, procadherin alpha 4, procollagen type XIII and XVlI 1 laminins, integrin alpha 8, Icam2, tetrapsins, Ep-CAM and Claudine.
  • CAM molecules including cadherin 2, 5, 13, procadherin alpha 4, procollagen type XIII and XVlI 1 laminins, integrin alpha 8, Icam2, tetrapsins, Ep-CAM and Claudine.
  • basigin and EMMPRIN extracellular matrix metalloproteinase inducer
  • EMMPRIN extracellular matrix metalloproteinase inducer
  • the extracellular matrix metalloproteinase inducer Bsg, ADAM19 and MMP12 were further examined at the protein level and we have confirmed all gene products as significantly increased in lung tumors, as shown in Figure 4B.
  • the degree of MMP-12 and ADAM-19 expression increases with the progressive stage of tumor growth and appears to be associated with epithelial dedifferentiation in lung tumors.
  • Claudins claudins
  • CD44 is induced by lung tumors from the 1-month, early, intermediate and advanced stages.
  • genes for cell adhesion and cell / cell / interaction molecules was also induced, e.g. of integrins (Itgb2 and Itgax), procollagen XV (Col15a1) and laminins (Lamb3 and Lamc2).
  • tumor-associated calcium signal transducer tacstd
  • Ep-CAM tumor-associated calcium signal transducer
  • RNA extractions and purifications were carried out using the RNeasy Midi Kit (Qiagen, Cat.N: 75144) according to the manufacturer's instructions.
  • RNA was used as the starting material to prepare cDNA.
  • the synthesis of double-stranded cDNA was carried out with the GeneChip® one-cycle cDNA kit (Affymetrix). Double-stranded cDNA was purified by using the GeneChip® Sample Cleanup Module (Affymetrix).
  • the in vitro transcription was carried out with the GeneChip® IVT marker kit (Affymetrix).
  • the total amount of the reaction product was with the GeneChip® Sample Cleanup Module (Affymetrix) cleaned.
  • Purified cRNA was quantified and checked for quality using the NanoDrop ND-1000 and the Agilent 2100 bioanalizer.
  • cRNA was cleaved into fragments of 35-200 bases by metal-induced hydrolysis. The degree of fragmentation and the length distribution of the fragmented biotinylated cRNA was checked by capillary electrophoresis using the Agilent 2100 bioanalyzer. 10 ⁇ g of the fragmented biotinylated cRNA were hybridized on the GeneChip® genome array according to the manufacturer's recommendation. The hybridization was carried out for 16 hours at 60 rpm and 45 ° C. in the GeneChip® Hybridization Oven 640 (Affymetrix). The washing and staining of the arrays was carried out on the Gen Chip® Fluidics Station 450 (Affymetrix) in accordance with the manufacturer's recommendations.
  • Antibody signal amplification, washing and staining protocol were used to stain arrays with streptavidin R-phykoerythrin (SAPE; Invitrogen).
  • SAPE streptavidin R-phykoerythrin
  • SAPE solution containing a biotinylated anti-streptavidin antibody Vector Laboratories, CA was added twice between the staining step.
  • the arrays were scanned using a GeneChip® Scanner 3000. Scanned image files were visually checked for artifacts and then analyzed, with each image scaled to the same target value for comparison between the chips.
  • GeneChip® Operating Software GCOS was used to control the fluidic station and scanner, collect data from test arrays and analyze data on hybridization intensity. Standard parameters provided in the Affymetrix data analysis software package were used for the analysis.
  • Array data was normalized using scaling or per-chip normalization to set the overall or average intensity of each array approximately the same.
  • a t-test analysis was performed using Affymetrix's Data Mining Tool (DMT) 3.0.
  • DMT Data Mining Tool
  • a stringent comparison between normal and tumor tissues was made according to the consistency of changes in gene expression.
  • a t-test and a classification analysis with up-regulated or down-regulated genes were carried out, and only genes that showed 100% agreement in the change direction with a P-value ⁇ 0.05 (t-test) were taken into account.
  • Ciuster analysis The hierarchical cluster analysis was carried out using the cluster tool, which is part of the ArrayTrack 3. ⁇ 1.5 software. (http: //www,fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/ArrayTrack/). The hierarchical clustering was calculated using the Pearson correlation as a metric distance and the Ward's method for building the cluster tree. qRT-PCR.
  • amplimers for each gene were obtained from Invitrogen Life Technologies: the amplimer sequences (5 'to 3') forward and reverse were as follows: ADAM-19: cgatggcggctgcatcatggc; ccaccagcttgcactggtggc; TIMP-3: gatgccccacgtgcagtacat, tgctgatgctcttgtctgggg; col17a1: ggctgagctggacggctacag, gggttcaccacgaggtcccat; Cav1: gcatcaagagcttcctgattg, ccagactgtcaaacatagatg; Ex: aaccgggcaccatccaaacct, attgcctcttctccccagtg; CD44: cggctccaccatcgagaagag, gttgtgggctcctgagtctga;
  • RT-PCR (thermal cycler) (. 94 0 C, 1 min .; 55-58 0 C, 1 min .; 72 ° C, 2 min) 20 ng cDNA in 20 ul reaction mixtures analyzed Reaktio ⁇ en PCR were performed using ABgene Thermo-Start Taq (Cat-No .: AB-1908 / B) 1Ox reaction buffer (15 mM MgCl 2 ) and 10 mM dNTP from MBI Fermentas (Cat-No .: R0181). PCR reactions were performed at 25-40 cycles to determine the linear range of amplification for each set of primers. Quantitative determination of the bands was carried out with the Kodak 1D 3.5 network software. Western blot.
  • Mouse / rabbit IgG secondary antibodies (Chemicon, Cat #: AP 160P and AP132P) were used at a 1: 5000 dilution. Protein detection was performed using a chemiluminescent reagent (NEN, Cat #: NEN 104) and highlighted using Kodak IST software 440CF.
  • Table 6 Elevated genes related to ECM remodeling in non-small cell lung cancer. FoId Change (P ⁇ 0.1) was calculated using Affymetrix software (DMT 3.0). * Genes identified as "present” only in pulmonary adenocarcinoma.
  • Table 7 Validation of microarray data using qRT-PCR. FC (fold change) determined by qRT-PCR. Semiquantification of the bands was performed using the Kodak 1D 3.5 Network Software.
  • Figure 4 Expression of key genes associated with proteolytic activity in lung cancer.
  • A Increased Bsg, MMP12 and ADAM19 in tumor lung tissue. Controls are represented by striped rectangles.
  • L protein ladder. 100 ⁇ g of protein extracts from lung controls and from lung tumors were used for each lane.
  • FIG. 5 Expression of Ep-Cam in lung adenocarcinoma
  • FIG. 6 Validation of microarray data using qRT-PCR.
  • FC fold change
  • Semiquantification of the bands was performed using the Kodak 1D 3.5 Network Software.
  • FIG. 4A Expression of key genes associated with proteolytic activity in lung cancer
  • FIG. 4B Induction of basigin, ADAM19 and MMP12 in lung adenocarcinoma

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Abstract

Das Bronchialkarzinom ist weltweit der häufigste Tumor beim Menschen und ist in den meisten Fällen nicht mehr heilbar. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung, Markierung und Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen, insbesondere aus Adenokarzinomen, mit Hilfe neuer Therapietargets, sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Grundlage der Erfindung ist die Erkenntnis, dass in c-raf und/oder c-myc induzierten Adenokarzinomen der Lunge die Expression von Genen verändert ist, die für CAM- und ECM-Moleküle kodieren. Es handelt sich dabei um Zelladhäsions- und extrazelluläre Matrixproteine, Erfindungsgemäß wird ein biologisches oder biotechnologisches System mit einer gelösten Substanz in Kontakt gebracht, die Affinität zu mindestens einem der Gene ADAM19, Mmp12, Col18a1 , Col15a1 , CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, Cldn2, Cldn3, Cldn7, Krfl-18, Krt2-8, Tacstd1 , tacstd2, S100a1, S100a11 , ihren Varianten, Teilen davon, ihrer mRNA oder ihren Genprodukten, davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden hat, wobei die Substanz mit einem geeigneten Marker verbunden ist.

Description

Verfahren zur Erkennung, Markierung und Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen sowie Mittel zur Durchführung des Verfahrens.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung, Markierung und Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen, insbesondere aus Adenokarzinomen, mit Hilfe neuer Therapietargets, sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Einsatzgebiete der Erfindung sind die diagnostische Medizin, die pharmazeutische Industrie und die molekularbiologische Forschung.
Die Zellen von malignen Tumoren sind fehlgesteuert, d.h. sie haben ihre spezifischen Eigenschaften verloren und teilen sich ungehemmt.
Bei bösartigen Tumoren unterscheidet man zwischen dem Karzinom, einem aus dem Deckengewebe hervorgehenden epithelialen Tumor, wobei ca. 90 % aller Tumore epithelialen Ursprungs sind, und dem Sarkom, einem aus dem Bindegewebe hervorgehenden mesenchymalen Tumor, der ca. 10 % aller Tumore betrifft.
Unter Lungenkrebs versteht man im Allgemeinen eine Entartung des Gewebes in verschiedenen Bereichen der Lunge. Dazu gehören nicht nur das Bronchialkarzinom (Krebs des eigentlichen Lungengewebes), sondern auch .sehr seltene Krebserkrankungen wie das Mesotheliom {Krebs des Lungenfells).
Das Bronchialkarzinom tritt am häufigsten zwischen dem 65. und 70. Lebensjahr auf und ist in Deutschland die häufigste Krebsart bei Männern. Pro Jahr erkranken in Deutschland über 42.000 Menschen an Lungenkrebs, rund fünf Prozent der Betroffenen sind unter 40 Jahre alt. Rauchen ist in etwa 90 Prozent der Fälle die Ursache für die Entstehung dieser Erkrankung. Weltweit ist das Bronchialkarzinom der häufigste Tumor beim Menschen. Lungenkrebs ist. eine sehr schwere Erkrankung, die in den meisten Fällen bislang nicht mehr heilbar ist.
Das Adenokarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung bei Frauen und Männern. Wie auch bei anderen malignen Tumoren wird die Überlebensdauer der Betroffenen durch viele Faktoren beeinflusst, unter anderem durch die Ausbildung von Metastasen. Um prognostische Faktoren zu ermitteln und um eine Metastasierung von Tumoren zu verhindern, werden weltweit neue Ansätze für eine verbesserte Therapie entwickelt. Zelladhäsions- und extrazelluläre Matrixmoleküle sowie Metalloproteinasen und deren Inhibitoren sind ausgesprochen' interessante Targets für die Tumortherapie. Die Expression von Adhäsionsmolekülen an der Zelloberfläche unterliegt einer Reihe von Veränderungen. Durch Adhäsionsmoleküle vermittelte Zeil-Zeil- und extrazelluläre Matrix-Interaktion wird die Tumorbildung und Metastasierung bösartiger Neubildungen maßgeblich beeinflusst.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, sensitives ufid schonendes Verfahren zur Erkennung, Markierung, und Behandlung von epithelialen Lungenkrebszellen anzugeben sowie ein Mittel zur ihrer Erkennung, Markierung oder Behandlung bereitzustellen und zu verwenden.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen von Anspruch 1 und Mittel gemäß Anspruch 26 für das erfindungsgemäße Verfahren sowie einen Testkit gemäß Anspruch 28 gelöst. Unteransprüche sind Weiterbildungen der Erfindung.
Kernpunkt der Erfindung ist die Erkenntnis, dass in c-raf und/oder c-rhyc induzierten Adenokarzinomen der Lunge die Expression von Genen, die für CAM- und ECM- Moleküle kodieren, verändert ist.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung neuer Therapfetargets. Es handelt sich um Zelladhäsions- und extrazelluläre Matrixproteine, die für eine Antikörpertherapie sämtlicher Karzinome der Lunge, z.B. von Adenokarzinomen, geeignet sind. Im Gegensatz zur herkömmlichen polychemischen Therapie mit minimaler Erfolgsquote (da ca. 80 % der Patienten innerhalb des ersten Jahres nach der. Diagnose der Lungentumorerkrankungen versterben), ermöglicht die vollkommen überraschend gelungene Identifizierung neuer Therapietargets erstmalig eine ..selektive und schonende Therapie und Diagnostik.
In den Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, wurden Adenokarzinome der Lunge in transgenen Mäusen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Basigin, ein Induktor der extrazellulären Matrix-Metalloproteinase überexprimiert wird, während die Expression eines Basigin-inhibitors und Tumor-Suppressors, Caveolin, reprimiert wird. So konnte die Induktion von ADAM-19 durch Expression des kodierenden Gens und des translatierten Proteins belegt werden. Es handelt sich dabei um eine neuartige„Disintegrin" Matrix-Metalloproteinase. Durch Repression von TIMP3, einem Inhibitor von ADAM-Proteinen verschafft sich der Tumor wesentliche Vorteile. So vermittelt ADAM-19 den Abbau von u.a. Collagen 17alpha1 und fördert damit die Tumorintegration. Dieser Prozess wird durch TIMP-3 verhindert, welches in Adenokarzinomen der Lunge reprimiert ist. Außerdem wird innerhalb der Ausführungsbeispiele der Erfindung gezeigt, dass; andere weitere Zelladhäsionsmoleküle stark reprimiert sind, so bspw. Cadherin 2, 5, und 13; Procadhrin alpha 4; Procollagen 17a1 und 13a1, Laminine 2, 4 und 1; Integrin alpha 8; ICAM2; Vinculin; Vitronectin und Tetrapsine. Hingegen war Ep-CAM induziert. Die selektive Expression von Zeiladhäsionsmolekülen führt zu veränderten Signalübertragungen, die die Zellmigration und Proliferation von Tunϊörzellen fördert. Weiterhin konnte innerhalb der erfinderischen Arbeiten durch immunhistochemische Untersuchungen an menschlichen Tumorgeweben der Lunge gezeigt werden, dass die nun erstmalig beschriebenen Therapietargets auch in Karzinomen der menschlichen Lunge stark exprimiert bzw. tumorspezifisch reguliert werden (sowohl in Nichtkleinzellem wie in Kleinzellern mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad). Deshalb können die aus dem Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse direkt auf den Menschen übertragen werden. So gibt es bereits erste klinische Studien für das Adhäsionsmolekül EpCAM für die Behandlung von Mamma- und Kolonkarzinomen. Die Erfindung ist gleichermaßen für die Therapie mit inhibitorischen Antikörpern sowie bifunktionellen Antikörpern (Rekrutierung von cytotoxischen CD4+ oder CD8+ Zellen) geeignet. Aber auch Antikörper mit cytotoxischen Konjugaten sowie Wirkstoffmolekülen können für die neuartigen erfindungsgemäßen Therapietargets gezielt entwickelt und deshalb therapeutisch genutzt werden.
Einige Prinzipien eines solchen möglichen Tumormodells sind bereits beschrieben worden.
Die Basis der Erfindung ist daher die vollkommen überraschend aufgedeckte Regulierung von Adhäsionsmolekülen und MMPs sowie ihrer Inhibitoren in c-raf und/oder c-myc induzierten Lungenadenokarzinomen. Dazu wurde c-raf (bzw. c-myc) als ein wesentlicher Bestandteil der Mitogen- und Stress-induzierten Signaltransduktionswege genutzt. Seine gerichtete Überexpression im alveolaren Epithel verursachte Adenokarzinome. Tumorwachstum wurde mit geänderter Expression von Molekülen der extrazellulären Matrix (ECM) und der Zelladhäsion (CAM) in Beziehung gesetzt. Im Rahmen der Erfindung wurde die Induktion von Basigin, einem inducer für extrazelluläre Matrix-Metalloproteinasen beobachtet, während sein Inhibitor und Tumor-Suppressor Caveofin-1 reprimiert wurde. Ausserdem wurde die Expression von ADAM-19, einer neuartigen Disintegrin- Metalloproteinase erhöht, während die von TIMP-3, einem Inhibitor von ADAM Proteinen, unterdrückt wurde.
Dies erleichtert den Abbau von Collagen17a1 und folglich von Zellmigäation.
Es wurde weiterhin eine drastische Repression von zahlreichen CAM-Molekülen (CAMs) einschließlich Cadherin 2, 5, 13, Procadherin alpha 4, Procόilagen Typ XIII und XVII, Lamininen (2.4.1), Integrin alpha 8, ICAM2, Vinculin, Vitronectin und Tetrapsinen beobachtet, jedoch wurde die Expression von Ep-CAM deutlich erhöht. Vor allem selektive Expression von CAMs ändert die zelluläre Signalgebung, und die neugestalteten CAM- und ECM-Moleküle ermöglichen neuartige Mechanismusbasierte Therapien von Lungenkrebs.
Dadurch wird erstmalig ein Verfahren ermöglicht, mit dessen Hilfe sich und sensitiv epitheliale Lungenkrebszellen von Adenokarzinomen in einem biologischen oder biotechnologischen System einfach erkennen, markieren oder behandeln lassen. Unter dem biologischen System sind im wesentlichen Organismen, Zellgewebe, Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, Proteine und/oder Peptide sowie davon abgeleitete Strukturen zu verstehen, unter dem biotechnologischen System sind alle mögliche Untersuchungsanordnungen zu verstehen,- mit deren Hilfe Eigenschaften von epithelialien Tumorzelien von Lungenadenokarzinomen oder davon abgeleitete Strukturen nachgewiesen werden können.
Dazu wird das biologische oder biotechnologische System mit wenigstens einer Substanz in Kontakt gebracht wird, die Affinität zu mindestens einer der folgenden Komponenten hat: zu den Genen ADAM19, Mmp12, Col18a1, Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, CIdn2, Cldn3, Cldn7, Krti-18, Krt2-8, tacstdi, tacstd2, S100a1 , S100a11 und/oder ihren Varianten und/oder Teilen davon und/oder ihrer mRNA und/oder ihren Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden. Kernpunkt der Erfindung ist dabei, dass die Substanz mit einem Marker verbunden ist, der über eine bestimmte Eigenschaft verfügt.
Besonders geeignet ist das Verfahren, wenn das biologische oder bistechnologische System einen Organismus, Zellgewebe, Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, Proteine oder Peptide oder davon abgeleitete Strukturen umfasst bzw. beinhaltet, da diese besonders gut für die Erkennung, Markierung oder Behandlung von epithelialen Tumorzellen aus Lungenadenokarzinometπ mit der erfindungsgemäßen markierten Substanz geeignet sind, insbesondere wenn sie Lungentumorzellen und/oder Oligonukleotidbibliotheken umfassen.
Als zumindest teilweise lösliche Substanz sind insbesondere Öligonukleotide, Proteine, Peptide oder davon abgeleitete Strukturen geeignet. Diese haben den Vorteil, dass sie spezifisch zwei- oder dreidimensionale Zielstrukturen auf molekularer Ebene erkennen können. Darüber hinaus haben sie die vorteilhafte Eigenschaft, dass die Erkennung in der Regel in wässerigen■ physiologisch
*
gepufferten Lösungen erfolgt und zu einer spezifischen Asso∑iation/Bjndung mit der Zielstruktur führt.
Besonders geeignet sind dabei monoklonale und/oder polyklonale Antikörper bzw. Antikörperfragmente, da sie als robuste hochspezifische Strukturen gebildet sind, die im Prinzip mit Affinität gegen alle möglichen molekularen Zielstrukturen herstellbar sind.
In vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung werden humane und/oder bispezifische Antikörper oder humane und/oder bispezifische Antikörperfragmente" verwendet, da sie die Immunantwort des humanen Immunsystems bei Kontakt mit der erfindungsgemäßen Substanz zumindestens verringern können oder durch die bispezifische Bindung Makrophagen oder andere Komponenten des- Immunsystems mit einer Zielstruktur, insbesondere epithelialen Lungenturnorzellen aus Adenokarzinomen verknüpfen können.
Insbesondere monoklonale Antikörper und/oder Antikörperfragmente sind dabei geeignet, da sie eine besonders gute Selektivität, Sensitivität und Reproduzierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gestatten.
Besonders günstig für die Umsetzung der Erfindung ist es, wenn der erfindungsgemäße Marker als ein Element, Isotop, Molekül und/oder Ion gebildet oder aus diesen zusammengesetzt ist, insbesondere als Farbstoff, Kontrastmittel, Chemotherapeutikum, Radionuklid, Toxin, Lipid, Kohlenhydrat, Biotin, Peptid, Protein, Mikropartikel, Vesikel, Polymer, Hydrogel, Zellorganelle, Virus und/oder ganze Zelle gebildet ist oder diese umfasst, wodurch die markierte Substanz an die verschiedensten Bedürfnisse anpassbar ist. Wird beispielsweise Biotin als Marker verwendet, so kann bei einer Untersuchung und/oder einer Therapie von epithelialen Lungentumorzellen, insbesondere aus Adenokarzinomen, die Menge an notwendigem Pharmakon, das in einem zweiten/nachfolgenden Schritt zugegeben wird, in erheblichem Maße reduziert werden, wenn das Pharmakon an Streptavidin gebunden ist.
Besonders geeignet ist dabei insbesondere auch, wenn der Marker als vorzugsweise Farbstoff- und/oder Enzym-markierter Sekundärantikörper und/oder Protein A und/oder Protein G oder davon abgeleitete Struktur gebildet ist oder diese enthält.
Möglich ist es beispielsweise auch, Hyaluronan oder abgeleitete Strukturen als Marker zu verwenden, da es günstigerweise von Zielstrukturen/Rezeptoren der affinen Substanz gleichzeitig aufgenommen werden kann.
Die Verbindung zwischen dem Marker und der Substanz ist vorteilhafterweise chemisch, elektrostatisch und/oder über hydrophobe Wechselwirkungen ausgestaltet, da diese eine ausreichende Bindungsstabilität für die Verwendung der markierten Substanz zu Erkennung, Markierung und Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen, insbesondere aus Adenokarizinomen, vorzugsweise wenn die Verbindung kovalent ist. Geeignet sind dabei insbesondere auch die elektrostatisch und/oder hydrophoben Wechselwirkungen, die von Aminosäureresten bzw. ihren Seitenketten, vorzugsweise von Proteinen, bzw. Stickstoff-Basen von Nukleotiden ausgehen bzw. zwischen diesen ausgebildet werden.
Zur Erhöhung der Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ist insbesondere auch die gleichzeitige Verwendung mehrerer Substanzen geeignet, insbesondere wenn sie drei Substanzen mit Affinität zu Bsg und Cldn2 und Tnf.sf9 oder ihren rnRNA-Sequenzen oder ihren Genprodukten umfassen.
Für eine besonders spezifische Erkennung sind insbesondere Substanzen geeignet, die mit einer Affinität oberhalb der Assoziationskonstante Ka = 1000 M'1 an die Zielstruktur binden.
Für verschiedenste Verwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorteilhaft, eine der folgenden Methoden zu verwenden - PCR, in vitro Translation, RT-PCR, Gelelektrophorese, Western-BIot, Northern-Blot, Southern-Blot, ELISA, FACS-Messung, chromatographische Auftrennung, UV-Mikroskopie,
Immunohistochemie, Screening von festphasengebundenen Molekülen oder Geweben und/oder biosensorische Untersuchung - wobei durch Vervielfältigung, Auftrennung, Immobilisierung und/oder Detektion der untersuchten Probe bzw. von Teilen davon eine besonders einfache Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht wird, insbesondere auch wenn eine statistische Analyse durchgeführt wird.
Nach einer anderen Weiterbildung der Erfindung werden für die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens Moleküle, Zellen und/oder Gewebe verwendet, die auf einer planaren Oberfläche, vorzugsweise ortsadressiert, immobilisiert sind. Die Immobilisierung hat dabei den Vorteil, dass sie eine besonders einfache Erkennung, Markierung von Lungentumorzellen da Oberflächen besonders einfach gescreent werden können, insbesondere wenn sie als Membran, z.B. aus Nitrocellulose oder PVDF, als Kavität einer Mikrotiter/ELISA-Platte oder eines Zellkulturgefäßes oder als Glas- oder Kunststoffchip gebildet sind. Vorteilhafterweisθ werden dazu als festphasengebundenen Moleküle Substanzen verwendet, die Affinität zu mindestens einem der Gene ADAM19, Mmp12, CoI18a1, Col15a1 , CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, Cldn2, Cldn3, Cldn7, Krt1- 18, Krt2-8, tacstdi, tacstd2, S100a1, S100a11 und/oder ihren Varianten und/oder Teilen davon und/oder ihrer mRNA und/oder ihren Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden (im folgenden als „Zielstruktur" genannt) haben, da diese eine besonders einfache Erkennung oder Untersuchung von epithelialen Lungentumorzellen auf der Oberfläche erlauben, wenn wenigstens eine dieser Substanzen mit ihrer Zielstruktur wechselwirkt, insbesondere an diese bindet. Geeignet sind dafür insbesondere immobilisierte Moleküle, die als Oligonukleotid, Antikörper oder Antikörperfragment ausgestaltet sind.
Der Nachweis von Zielstrukturen, z.B. von Rezeptoren auf einem immobilisierten Gewebeschnitt oder auf Zellen einer Zellkultur, kann dabei mit beliebigen markierten Molekülen erfolgen, die nachfolgend in Lösung auf die Oberfläche gebracht werden, vorteilhafterweise mit einer der erfindungsgemäßen markierten Substanzen, bspw. einem (Fluoreszenz) markierten Antikörper.
Wird eine RT-PCR durchgeführt, so finden vorteilhafterweise entsprechende Oligonukleotidsonden bzw. Primer Anwendung.
Werden für die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisierte Molekülbibliotheken, bspw. DNA- oder Antikörperbibliotheken verwendet, die mit den Zieistrukturen aus einer Lösung wechselwirken, bspw. mit einer cDNA-Bibliothek, einer PCR-Produkt-Bibliothek oder mit epithelialen Lungenkrebszellen, insbesondere aus Adenokarzinomen, sind die an die Molekülbibliotheken gebundenen Zielstrukturen besonders gut durch die Verwendung von nachfolgend zugegebenen (Farbstoff-)markierten Sonden, vorzugsweise Oligonukleotiden oder davon abgeleiteten Strukturen nachweisbar. Werden unmarkierte 'Primärantikörper zum Nachweis verwendet, sind diese günstigerweise mit markierten Sekundärantikörpern, nachweisbar. Aber auch die Verwendung von anderen Proteinen, bspw. Enzymen, oder Streptavidin oder Teilen davon ist geeignet. Für den diagnostischen Nachweis von epithelialen Lungenkrebszellen, insbesondere aus Adenokarzinomen, in der in vitro- und in vivo-Diagnostik mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorzugsweise die Verwendung, von optischen Apparaturen, z.B. UV-Mikroskopen, Scannern oder ELISA-Readern; Photometern, oder von szintigrafischen Apparaturen, bspw. Röntgengeräten, geeignet.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Mittel zur Erkennung, Markierung und Behandlung von Lungentumorzellen, insbesondere epithelialen Lungenkrebszelien, insbesondere aus Adenokarzinomen, dass es eine Substanz mit einer Affinität gemäß Anspruch 1 und ggf. Anspruch 14 und den Merkmalen gemäß einem der Ansprüche 4-6 enthält und die wenigstens eine Substanz ggf.' über eine Verbindung gemäß den Ansprüchen 11-12 mit einem Marker gemäß einem der Ansprüchen 7-9 verbunden ist und die ggf. markierte Substanz zumindest teilweise löslich ist, insbesondere in wässerigen bzw. physiologischen Lösungen.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das entsprechende Mittel für die Herstellung eines Präparats zur besonders einfach umzusetzenden sensitiven und schonenden Erkennung, Markierung und/oder Behandlung von Lungentumorzellen, insbesondere aus epithelialen Lungenkrebszellen von Adenokarzinomen verwendet
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Testkit für die Umsetzung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur diagnostischen Erkennung, Markierung und/oder testweisen Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen, vorzugsweise von Adenokarzinomen, wobei der Testkit wenigstens ein erfindungsgemäßes Mittel gemäß den Ansprüchen 26-27 enthält, insbesondere wenn die affinen Substanzen des Mittels an einer Oberfläche, vorzugsweise ortsadressiert, immobilisiert sind.
Einige der besonders günstigen Merkmale und weitere vorteilhaften Eigenschaften der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung und näheren Erläuterung offenkundig.
Die raf-Kinasen sind proto-Onkogene, die am Eingangspunkt der MAPK/ERK (Mitogen-aktivierte-Proteinkinase/extrazelluläre-Signal-regulierte-Kinase)
Signalkaskade arbeiten und die Molekülen signalisieren, Zeiloberflächenproteine und ras-Proteine mit dem Zellkern zu verbinden. Insbesondere wird raf-1 durch eine breite Anzahl an Wachstumsfaktoren, Hormonen und anderer externer Signale aktiviert. Nach Aktivierung wirkt raf-1 auf MEK und phosphoryliert dieses und bindet an ERK, das auch durch Phosphorylierung aktiviert wird [1 ,2]. Die Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade wird als eine lineare Abfolge angesehen, mit ERK als funktionellem Endpunkt [3,4]. Aktiviertes ERK kann zum Kern transloziert werden und bildet damit eine direkte Vermittlung zwischen einem extrazellularen Signal, einer internen Signalabfolge und der Kernantwort [4]. Überexpression von raf wird mit bösartigen Tumoren [5,6] assoziiert und mit dem Tumorwachstum benötigen sie einen geänderten Zell-Zell-Kontakt und Zelle-Matrix-Adhäsiori, um die Expansion, Invasion und Tumorverbreitung zu ermöglichen.
Die Untersuchung der Adhäsionsmoleküle kann damit Einblicke in die Grundprinzipien der Tumorgenese ermöglichen und erleichtert die Identifizierung von Targets für neuartige Therapieformen.
Im allgemeinen werden Adhäsionsmoleküle in Cadherine, in Integrine, Immunoglobulin-artige Rezeptoren, CD44 und in Catenine unterteilt [7]. Diese Moleküle fungieren in komplexer und koordinierter Weise, um Zellen an einem Ort zu halten oder wechselweise die Zellbewegung zu unterstützen.
Weiterhin agieren Adhäsionsmoleküle in bidirektionalen Signalwegen, die für viele zelluläre Funktionen, einschließlich Transkription, cytoskelettale Organisation und Proliferation benötigt werden [8,9].
Insbesondere sind Integrine eine Hauptgruppe von Adhäsionsrezeptoren der Zelloberflächen, die eine mechanische Transmembranverbindung zum Cytoskelett unterstützen und die mehrere Signalkaskaden aktivieren.
Auf diese Art und Weise beeinflussen Integrine das Zellverhalten' einschließlich Form, Motilität, Differentiation, Proliferation und Überleben [9].
Darüber hinaus stellen Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) eine Familie von sekretierten, Zink-abhängigen Endopeptidasen dar, die gemeinsam zur Degradation der Bestandteile der extrazellularen Matrix (ECM) fähig sind, und es gibt überzeugende Hinweise darauf, dass MMPs eine wichtige Rolle an den unterschiedlichen Schritten des Tumorwachstums spielen.
In der Tat lysieren MMPs teilweise abgebaute feinfaserige Collagene sowie Elastin und zeigen hohe Affinität zu Collagenen, die wichtige Bestandteile der Epithelgrundmembranen sind und die während des Tumorwachstums lysiert werden. Zusätzlich zeigen Tumore häufig eine Zunahme der Expression von MMPs und eine Abnahme an ihren Inhibitoren, z.B. von TlMPs an, die zu einer Zunahme proteolytischer Aktivität führen [10-12]. Außerdem sind Zelloberflächenproteoglykane (PGs) wichtig für die Modulation von in Zelladhäsion und -motilität.
Viele adhäsionsfördemde Bestandteile innerhalb der ECM■ beinhaltenden Strukturproteine (Laminine und Collagene) sowie der
Zelloberflächenadhäsionsrezeptoren (CAMs) unterstützen Zelladhäsion über Interaktionen mit PGs.
Die Tatsache, dass PG Bindungsstellen in direkter Nachbarschaft zu Integrin, zu ZeII- bindenen Domänen innerhalb der ECM-Moleküle und auf anderen Zelloberflächenadhäsionsmolekülen existieren legt nahe, dass zelluläre Erkennung der ECM an der Bildung von Rezeptorkomplexen beteiligt ist und dass sie unterschiedliche, aber überlappende Signaltransduktionswege innerhalb der Zelle modulieren [13, 14, 15].
Als ein Ergebnis der c-raf Überexpression wurden von transgenen Mäusen Lungenadenokarzinome gebildet. Innerhalb der für die Erfindung relevanten Arbeiten wurden Genexpressionsprofile in histologisch definierten Adenokarzinomen bestimmt und die Transkription mit normalen Lungengeweben von nicht-transgenen Mäusen verglichen. Entsprechende Arbeiten wurden auch mit c-myc (Überexpression) durchgeführt.
Es wurden 428 Transkripte in Lungenadenokarzinomen als unterschiedlich exprimiert festgestellt (P-Wert t-test < 0,05). 72 Gene kodierten für Komponenten der ECM, davon waren 20 überexprimiert (Tabelle 1), wohingegen 52 Transkripte reprimiert waren (Tabelle 2a).
Tabelle 1 zeigt die Transkripte, die in Adenokarzinomen als überexprimiert identifiziert wurden.
Bemerkenswerterweise war in Lungenadenokarzinomen die selektive Expression von Claudin 2 herausragend. Seine Expression wird in normalem Lungengewebe nicht gefunden. Weiterhin waren Claudin 3 und 7 in Tumorgewebe überexprimiert. Daher war die Claudin-Expression in Lungenadenokarzinomen, induziert durch c-raf 1, umgestaltet worden. Bemerkenswerterweise exprimieren die alveolaren Epithelzellen von Ratten Claudin 3, 7 und 5, wobei Claudin 5 durch..den gesamten Alveolus stark exprimiert ist. Im Gegensatz dazu ist die Expression- von Claudin 1 und 2 minimal oder vollkommen abwesend [16, 17]. Claudine sind Komponenten der sogenannten Tight Junctions (TJs) und sind epitheliale Barrieren und funktionieren durch parazelluläre Permeabilität. Vorausgegangene Studien über die Claudin- Verteilung legen verschiedene Barrierenfunktionen in verschiedenen Epithelzellen und Endothelgewebe nahe und dass Claudine selektiv für Änderungen der Permeabilität exprimiert werden. Veränderung der Kommunikation innerhalb der TJs ist ein wichtiger molekularer Mechanismus in dem Fortschreiten von Lungentumoren. Dieses wird durch jüngere Studien gestützt, die nahe legen, dass Claudin 1 und 2 die Aktivierung durch alle Membrantyp-MMPs hinweg während der. Krebsinvasion vorantreiben [18].
Weitere Moleküle wurden festgestellt, die für die Klassifizierung von Lungen- Tumoren verwendet werden können und diese umfassen Keratin 1-18, einen zuvor beschriebenen Marker für Lungenadenokarzinome.
Calcium-bindende Proteine (S100A1 und S100A11) wurden gleichermaßen induziert. Die S100 Familie ist eine der größten Unterfamilien von Calcium-bindenden Proteinen und ist durch hochkonservierte helix-loop-helix-Regionen, bekannt als„EF- hand" Motive, charakterisiert. S100 Proteine sind in die Tumorgenese eingebunden und vermitteln Calcium-Signale während des Wachstums, der Differenzierung und der Beweglichkeit der Zelle [19]. Zusätzlich war CD44 als ein Ergebnis der c-Raf Überexpression induziert. Dieser Rezeptor ist ein Oberflächenglykoprotein das an Zeil-Zeil- und Zell-Matrix- lnteraktionen beteiligt ist.
Überexpression von CD44 war mit dem Wachstum und der Ausbreitung einer Reihe verschiedener Zelltypen in der Tumorentwicklung verbunden. CD44 dient als ein wiederherstellbarer Rezeptor für Hyaluronan, das durch Endocytose internalisiert und verstoffwechselt wird. CD44 kann Epithelzellen an Hyaluronan in Gπjndmembranen für die Erhaltung der polaren Orientierung verankern [20]. Dieser Rezeptor kann auch durch Leukozyten-Anheftung und -Drehung auf Endothelzellen funktionieren, die diese zu peripheren lymphoiden Organen und Entzündungsstellen weisen sowie zur Leukozytenaggregation. Die Signalisierung durch CD44 induzierte Cytokinfreisetzung und T-Zell-Aktivierung [21]
Überexpression von Ep-Cam in Lungenadenokarzinomen
Die Entdeckung der Überexpression von Tumor-assoziiertem Calcium Signal Tranduktor (tacstd) oder von Ep-CAM war ein wichtiges Ergebnis, für beide bezüglich ihrer Eigenschaft als Adhäsionsmoleküle und Funktion als Therapie-Target.
Wie in Figur 1 gezeigt ist, ist die Ep-CAM Immunfluoreszenzfärbung oberhalb des Hintergrundlevels durch einen Kanal-Baum eingegrenzt. Membranfärbung wird in den respiratorischen Epithellinien und terminalen Bronchien und Bronchipolen gesehen. (Fig. 1a). Weiterhin hebt Ep-CAM-Färbung die Tumor-Zentren hervor (Fig. 1b). Die Antwort ist homogen und membrangebunden;. Das hyperplastische alveolare Epithel in den Zentren wird gleichermaßen positiv angefärbt.
Die hohe Expression von Ep-CAM in sowohl Kolon- als auch anderen Epithelkarzinomen ist wichtig, und es kann angenommen werden, dass dies ein neuer Typ von Adhäsionsmolekül ist, der nicht strukturell den Mitgliedern der vier Hauptfamilien der Immunglobulin Superfamilie (Cadherine, Integrine, Selektine und CAMs) ähnelt.
Kürzlich veröffentlichte Hinweise deuten darauf hin, dass die extrazelluläre Domäne von Ep-CAM aus einer Cystein-reichen Region besteht, die zwei Typ || EGF (epidermal growth factor)-artige Wiederholungen beinhaltet, denen eine Cystein- arme Regionen folgt [22].
Gesteigerte Ep-CAM Expression ist mit Proliferation, verminderter Cadherin- vermittelter Adhäsion und einem weniger differenzierten Phänotyp verbunden, so dass nahe liegt, dass Ep-CAM die Stärke der intrazellulären Adhäsion reguliert und Epithelzellen mit flexiblen Zwischenverbindungen erzeugt,, die notwendig für die Epithel-Morphogenese und Gewebeerhaltung sind.
Die kürzlich erhobenen Daten betreffend die Organisation von Ep-CAM-vermittelten Adhäsionen deuten an, dass es mehr einem typischen Adhäsionsmolekül ähnelt, das mit Aktin-Mikrofilamenten verbunden ist [22].
Umverteilte Adhäsionsmoleküle in Lungenadenokarzinomen.
Integrine sind wichtige ECM Rezeptoren und sind auch an .Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Es gibt mehrere Berichte, die die kritische Rolle von Integrinen in der Tumorentstehung, -invasion und -metastasierung in Lungenadenokarzinomen andeuten. Die Expression von Genen, die für Moleküle für die Zeliadhäsion- und ZeII- Zell-Kontakte kodieren, wurde induziert, z.B. von Integrinen (Itgb2 und Itgax), Procollagen XV (Col15a1) und Lamininen (Lamb3 und■ Lamc2). " Mehr als 30 Transkripte kodierend für Zeiladhäsionsmoleküle, beinhaltend Vitrönectin (Vtn), Vinculin (VcI) und das intrazelluläre Adhäsionsmolekül 2 (Icam2), Integrin-vermittelte Zelladhäsion und ECM Rezeptoren werden in Lungenadenokarzinomen reprimiert.
Insbesondere Integrin alpha 8 (Itgaδ) war signifikant reprimiert. Die erfindungsgemäßen Arbeiten zeigen, dass Integrin alpha 8 eine wichtige Rolle zur Erhaltung der Gewebeintegrität während einer Verletzung oder der Regulierung von mesangialem Zellphänotyp spielt. Integrin alpha 8 fördert auch die Adhäsion und verhindert die Migration und Proliferation von mesangialen Zellen [23]:
Weiterhin waren mehrere Moleküle, die mit Integrinen wechselwirken, selektiv verändert. Tatsächlich waren auch Tetraspanine, z.B. TM4SF 1, 2,V6, 12 und 13, unter den am dramatischsten reduzierten Gentranskripten in den durch c-raf Überexpression induzierten Lungenadenonkarzinomen zu finden. Entsprechendes wurde auch für c-myc (Überexpression) festgestellt.
Diese Zelloberflächenproteine durchspannen die Membran viermal ü.nd werden auf vielen verschiedenen Zelltypen von vielen Organismen gefunden. Sie zeigen zahlreiche Eigenschaften in der Zelladhäsion, -beweglichkeit und -pfoliferation, und sind an der Metastasierung oder viralen Infektion beteiligt [24].
Mitglieder der TM4SF-Familie wechselwirken auch mit Adhäsionsrezeptoren der Integrin-Familie und regulieren die Integrin-abhängige Zellmigraiion [25]. Die erfindungsgemäßen Arbeiten zeigen beispielsweise den Verlust der Genexpression von TM4SF von Lungenadenokarzinomen im Vergleich zu normalem Lungengewebe. Daher ist die Erkenntnis von größter Bedeutung, welche Eigenschaften Tetraspanine zusammenhalten und wie ein Verlust eines Tetraspanins die Funktionen seiner Partnermoleküle beeinflussen kann.
Die Repression vieler Cadherine (Procadherin alpha4, Cadherin 2, 5 und 13) war eine weiteres herausragendes Ergebnis von c-raf-induzierten bzw. c-myc-induzierten Lungenadenokarzinomen. Verminderte Expression von E-Cadherin wird als eines der hauptsächlichen molekularen Ereignisse angesehen, die an der Dysfunktion des ZeII- Zell-Adhäsionssystems beteiligt sind und die die Krebsinvasion und Metastasierung ermöglichen. Forschungsarbeiten über E-Cadherin haben Einblick in die Embryogenese und Onkogenese gegeben. Als eine der wichtigsten Funktionen von E-Cadherin in der Entwicklung wird die Kontrolle von Epithel-mesenchymaler Konversion angegeben [26].
Selektive Regulierung von Basigin, ADAM-19 und TIMP-3 in Lungenkarzinomen
Tumorprogression ist ein mehrstufiger Prozess, in dem zelluläre Motilität mit kontrollierter Proteolyse assoziiert ist, und der Interaktionen zwischen Tumorzellen und der ECM beinhaltet. Während des Tumorwachstums transformierte Zellen migrieren vom Primärtumor zu kreuzstrukturierten Barrieren, beinhaltend Grundmembranen und umgebende stromale collagene ECM. Abbau von stromaler ECM wird als essentiell in der Turnor-induzierten Angiognese angenommen. Hochgradige Expression von MMPs in Tumorgeweben wird mit Tumorinvasion und - progression in Verbindung gebracht.
Innerhalb der erfindungsgemäßen Arbeiten waren Basigin oder EMMPRIN (extracellular matrix metalloproteinase inducer) hochreguliert sowohl auf Gen- wie auf Proteinebene (Fig. 2). Basigin ist ein Zelloberflächen-Transmembranglykoprotein, das weit verbreitet auf vielen unterschiedlichen Zelltypen exprimiert wird und besonders erhöht in invasiven Tumorzellen zu sein scheint [27-28]. Erhöhte Basigin- Expression korreliert gut mit der Tumorprogression von "Glioma-Zelien [29, 30], Hepatoma-Zellen [31], schuppenartigen Zellkarzinomen [32] und Melanomen [33, 34]. Basigin stimuliert die Produktion von MMPs und befördert die Hyaluronan Produktion in Brustkrebskarzinomen [35]. Basigin wird, zumindest teilweise, durch Caveolin 1(cav1) reguliert, einem gut-etablierten Tumorsuppressor und wurde bei den erfindungsgemäßen Arbeiten als in Lungenadenokarzinomen von c-raf transgenen Mäusen reprimiert gefunden. Caveolin 1 assoziiert mit Basigin während der Biosynthese im Golgi-Komplex und eskortiert Basigin zur Zelloberfläche, wodurch die Selbstaggregation von Basigin und Induktion von MMPs inhibiert wird [36]. Der Unterschied in der Genexpression zwischen Basigin und Caveolin 1 deutet darauf hin, dass Basigin die Produktion von MMPs in c-raf-Λ induzierten Lungenadenokarzinomen begünstigt. Entsprechendes wurde auch für c-myc beobachtet.
Weiterhin wurde ADAM-19 innerhalb der Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, als überexprimiert festgestellt. ADAM Proteine sind eine Familie von Typ I Transmembran Glykoproteinen, die eine Disintegrin und Metalloprotease (A Disintegrin And Metalloprotease) Domäne enthalten und -die Funktionen in der Befruchtung, der Herzentwicklung, Neurogenese und dem sogenannten protein ectodomain shedding erfüllen [37].
ADAM Proteine werden bekanntermaßen in Kereatinocyten exprimiert und sind aktiv an der Keratinocytenmotilität beteiligt. KoIIagene erscheinen deshalb als neuartige Substratklasse für ADAM [38, 39]. Der extrazelluläre Matrix Metalloproteinase inducer Basigin und AD.ÄM-19 wurden gleichermaßen mit Hilfe von Western Blots untersucht, und beide Genprodukte waren in durch c-raf induzierte Lungenadenokarzinome erhöht (Figur 2). Analoge Ergebnisse wurden auch für c-myc erhalten.
Kollagene Transmembranproteine werden weithin exprimiert und sind an der Zelladhäsion und epithelia!en-/mesenchymalen Wechselwirkungen während der Morphogenese beteiligt. Die Kollagene XlII und XVII wurden erfindungsgemäß als reprimiert festgestellt. Sie sind Komponenten von morphologisch unterschiedlichen Zelladhäsionsstrukturen, zum Beispiel von fokalen Adhäsionen- oder beispielsweise Hemidesmosomen.
Kollagen XVII, ein Typ Il Transmembranprotein und epitheliales Adhäsionsmolekül, kann proteolytisch von der Zelloberfläche abgegeben werden, um lösliches Kollagen zu erzeugen.
Die Abgabe durch sogenanntes shedding wird beispielsweise durch Phorbolester gesteigert und durch Metalloprotease-Inhibitoren inhibiert, beispielsweise durch Hydroxamate oder TIMP-3, aber nicht durch Inhibitoren anderer Proteaseklassen oder durch TIMP-2 [40]. Funktionell ist die Ausschüttung der Ektodomäne von Kollagen XVII (Col17a1) mit einer veränderten Kallagenmotilität in vitro verbunden [41].
Zusätzlich war die Identifizierung einer verminderten Expression .von Gewebe- Inhibitoren der Metalloproteinase-23 (TiMP-3) ein wichtiges Ergebnis innerhalb der Arbeiten zur Erfindung. Jüngere Studien haben TIMP-3 als einen endogenen Inhibitor von ADAM-17 beschrieben, und gerade erst kürzlich wurde über ein inverses Expressionsmuster von ADAMs und TIMP-3 in der Pathogenese von Prostata-Krebs berichtet [42].
Bemerkenswerterweise unterbrechen Deletionen von TIMP-3 die .herausragende TIMP/MMP-Balance, die für eine ordnungsgemäße fokale ECM Proteolyse benötigt wird und zu der korrekten Morphogenese der Bronchiolenverzweigung in der Entwicklung der Mauslunge führt [43]. Weiterhin teilt T1MP-3 lediglich eine 25%ige Aminosäurehomologie mit TIMP-1 und TIMP-2.
Wie gezeigt wurde, fördert die Repression von TΪMP-3 die Tumor-Zellinvasivität in vitro und die Induktion von Tumorwachstum in vivo [44]. Obwohl gezeigt wurde, dass TIMP-3 die endotheliale Zellmigration und Tubulus/Röhren-Ausbildung in vitro inhibiert, ist der Effekt von TIMP-3 Überexpression auf die Tumor-iήduzierte Angiogenese in vivo bislang noch nicht untersucht worden.
Zusammengefasst ist ADAM-19 ein Sheddase-Kandidat für Col71a1 im Lungenadenokarzinom und TIMP-3 inhibiert die Proteolyse von Col17a1. Die biologischen Auswirkungen der Kollagen XVII-Abgabe sind bislang noch . nicht vollständig aufgeklärt. Eine erste Vorhersage ist, dass die Abspaltung der Ectodomäne die Loslösung von Keratinocyten während der Morphogenese, Differentiation und Regeneration begünstigt, sowie an der Adhäsion von basalen Keratinocyten an die extrazelluläre Matrix teilnimmt.
Darüber hinaus wurden mehrere Moleküle, die mit Zell-vermittelten Immun- und Entzündungsprozessen in Lungenadenokarzinomen assoziiert sind, abweichend exprimiert (Tabelle 2b). So wurden eine Überexpression von ifi30, Ccr5, Ccl6, Ccl21b, colony stimulating factor receptor (Csf2ra, Csfrbl and Csf2rb2) und von tnsf9 beobachtet. Die gesteigerte Produktion von IFN-gamma induced protein 30 (ifi30) stimuliert die Synthese von MHC Klasse Il Molekülen, darunter H2-Qma, H2-DMb1, H2-Ab1 und H2-Aa, und unterstützt selektiv die Transmigration von Th1, aber nicht von Th2, in Endothelzellen. Diese Feststellung im Rahmen der Erfindung ist höchst interessant für Th 1 -Typ selektive Transmigration entlang der Epithelzellen über CCR5 [45].
Es wurde auch eine Regulation des TNF(Ligand) superfamily member 9 (TNFsf9) beobachtet, ein Cytokin, das zu der Tumomekrose Faktor (TNF) Liganden-Familie gehört. Tnfsf9 ist ein Ligand für TNFRSF9/4-1BB, das ein costimulatorisches Molekül in T-Lymphozyten ist. Dieses Cytokin und sein Rezeptor sind an einem Antigen präsentierenden Prozess und an der Generierung von cytotoxischen T-Zellen beteiligt. Tnfsf9 wurde in c-raf Lungenkarzinomen induziert und wurde auch in verschiedenen Karzinom-Zelllinien erhöht vorgefunden. Analoge Ergebnisse wurden auch für c-myc beobachtet.
Tnfsf9 ist in der T-Zell/Tumorzellen-Interaktion beteiligt [46] und wurde in normalen Maus-Lungengewebe nicht vorgefunden.
Innerhalb der erfindungsgemäßen Arbeiten wurden die mit Hilfe der GeneChip Microarrays erhaltenen Ergebnisse durch die Verwendung von RT-PCR bestätigt. Die verwendeten Primersequenzen sind den Ausführungsbeispielen der Erfindung zu entnehmen. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse für 12 der Gene, die in der Umgestaltung der extrazellulären Matrix und Zell-vermittelten Immunität in Lungenadenokarzinomen beschrieben sind, wohingegen die Figuren 1 und 2 die Expression von ausgewählten Proteinen darstellen.
Diskussion
Innerhalb der Arbeiten, die zu der Erfindung geführt haben, wurde die Umbildung der ECM- und Zelladhäsionsmoleküle in Lungenadenonkarzinomen mit Hilfe von Microarray, qRT-PCR, Immunhistochemie und Western Blots untersucht. Als Teil dieser Studie wurde die Expression von Integrinen analysiert, die eine große Familie von heterodimeren Zelloberflächen-Rezeptoren bilden und an der Zell-/extrazelluläre Matrix- und Zell-/Zell-Adhäsionskommunikation beteiligt sind. . Von den 24 unterschiedlichen Integrin-Rezeptoren, die derzeit bekannt sind (jeder mit bestimmter Liganden-Bindung und Signaleigenschaften) fungieren fünf als Koϊlagenrezeptor. Itgax ist eines der Integrine, das an Kollagene binden kann. In Lungenadenokarzinomen wurde die Repression von Transmembran-Kollagenen (colXlllai und colXVIIai) und die Überexpression von Kpllagenen, die mit der Membranbefestigung assoziiert sind, wie etwa colXVIIIai und colXVal gefunden. Die Kollagene XV und XVIII umfassen die Multiplexin Unterfamilie und nicht-fibrilläre Kollagene. Die Überexpression der Kollagene XV und XVIII trägt daher mutmaßlich zur Zellmigration von Lungenadenokarzinomen bei. Diese Unterschiede in den Migratonsmechanismen können daher hilfreich sein, einige, der Zeil-spezifischen Effekte von Integrinen auf die Zellmigration zu erklären. Wie durch die Ausführungsbeispiele gezeigt ist, wird Tumor-Wachstum und - Fortgang durch die Umstrukturierung der umgebenden ECM gefördert. Der Abbau der Transmembranmoleküle colXVIIai wird mutmaßlich von ADAM-19 in Lungenadenokarzinomen katalysiert. Der Abbau von von colXVIIai wird von TIMP-3 kontrolliert, einem spezifischen Inhibitor von ADAM17 und auch, von anderen Mitgliedern dieser Familie. TlMP-3 steht daher mit der umgeänderten ECM in Verbindung und ist an der Endothelzellen-Migration und Angiogenese beteiligt. Die Wechselwirkungen von Zellen mit der ECM ist entscheidend für die normale Entwicklung und Funktion eines Organismus. Daher ist die Regulation der Zusammensetzung und Vollständigkeit der ECM-Struktur von entscheidender Bedeutung. Enzyme, die an der Umstrukturierung beteiligt sind, . spielen eine essentielle Rolle in der Kontrolle von Signalen, die durch Matrix-Moleküle bewirkt werden, welche die Σell-Proiiferation, Differenzierung und derr Zelltod steuern.
Darüber hinaus stellen tight junctions die Verbindung zwischen epithelialen und endothelialen Zellen her, die die verschiedenen Gewebe des Körpers einschließen. Sie regulieren den Durchgang von Molekülen durch diese natürlichen Barrieren. Der epitheliale Transport findet durch transzelluläre und parazelluläre Wege statt, die zum Teil von Ciaudinen reguliert sind.
Insbesondere gibt es mindestens 20 Gene, die für Ciaudiή-Proteine mit unterschiedlicher Gewebe-abhängiger Expression und Barrierefunktion kodieren, innerhalb der erfinderischen Arbeiten wurde eine Überexpression von Claudin 2, 3 und 7 in Lungenadenokarzinomen festgestellt. Beispielsweise wird Ciaudin 2 selektiv in Lungenadenokarzinomen exprimiert, wohingegen die Claudin 5 Expression in Lungen-Tumoren reprimiert ist. Allgemein beeinflusst die Entfernung oder Zufügung von Ciaudinen die Permeabilitätseigenschaften der tight junctions, da sie parazelluläre Poren oder Kanäle ausbilden, die die selektive lonenpermeabilität steuern (Anderson 2001 und Tsutika et al. 2001). Unter Berücksichtigung, dass die Art des Kanai-bildenden Claudins die Spezifität und Selektivität für Ionen bestimmt, wird nun erstmals die Expressionsverschiebung von Claudin 5 zu Claudin 2 gezeigt, ein höchst bemerkenswert geändertes Muster von Ciaudinen, welche für die Änderungen der parazellulären Wege und Erhaltung von Zellpolarität in Lungenadenokarzinomen verantwortlich sind.
Ausgangspunkt für die Erfindung ist daher die vollkommen überraschend festgestellte Umstrukturierung von ECM und CAM als ein Ergebnis der c-raf (bzw. c-myc) Überexpression im alveolaren Epithel.
Der Erfindung liegt die erstmalig gewonnene Erkenntnis zugrunde, dass die Expression von ECM- und CAM-Molekülen mit expansivem Tumorwachstum und Tumorinvasion assoziiert ist (Fig. 3). Unter diesen ist insbesondere die Hochregulation von Ep-CAM überdeutlich, die damit erstmals als Zieistrukturen bei Lungenadenokarzinomen, beispielsweise für Antikörper-basierte Therapieformen, zur Verfügung stehen.
Auswirkung der Erfindung
Die auf der Feststellung von neuen Therapietargets beruhende Erfindung ermöglicht nun erstmals eine selektive, effiziente und schonende Diagnostik und Therapie von Lungentumorzellen. Darüber hinaus ermöglicht die Erfindung eine bessere Effektivität von Vorsorgeuntersuchungen zur . Früherkennung von Lungengewebeveränderungen, die auch auf einfache Weise in der Röutinediagnostik anwendbar sind. Bei den Therapietargets handelt es sich um Zelladhäsions- und extrazelluläre Matrixproteine, die für eine Therapie, insbesondere Antikörpertherapie, sämtlicher Karzinome der Lunge, z.B. von Adenokarzinomen, geeignet sind. Im Gegensatz zur herkömmlichen polychemischen Therapie mit minimaler Erfolgsquote (da ca. 80 % der Patienten innerhalb des ersten Jahres nach der Diagnose der Lungentumorerkrankungen versterben), ermöglicht die vollkommen überraschend gelungene Identifizierung von neuen Therapie-Zielstrukturen- erstmalig eine selektive und schonende Therapie und Diagnostik. Neben den neuen Therapietargets ist insbesondere auch die Verwendung von Substanzen mit Affinität zu den beschriebenen reprimierten Genen (s. Tabelle 2a) bzw. Gejiprodukten oder davon abgeleitete Strukturen sinnvoll, da diese eine weitere (Kontroll-)Möglichkeit für die Erkennung, Markierung und Behandlung von Lungentumorzellen realisierbar machen. Die Erfindung bildet gleichermaßen eine Basis für die Therapie mit inhibitorischen Antikörpern sowie bifunktionellen Antikörpern (Rekrutierung von cytotoxischen CD4+ oder CD8+ Zellen). Aber auch Antikörper mit cytotoxischen Konjugaten sowie Wirkstoffmolekülen können für die neuartigen erfindungsgemäßen Therapietargets gezielt entwickelt und deshalb therapeutisch genutzt werden.
Weitere Details und Methoden zur Umsetzung der Erfindung werden aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher ersichtlich.
Extraktion von Gesamt-RNA. Für die RNA-Präparationen wurde normales Lungengewebe (n - 6) und tumorales Lungengewebe von raf-1-BxB-23 transgenen Mäusen (n=8) verwendet. Die RNA-Extraktionen und Aufreinigungen wurden mit einem Rneasy midi kit (Qiagen, Cat.N:75144) nach Herstellerangaben- durchgeführt. cDNA Synthese. Erststrang-cDNA wurde aus 10 μg Gesamt-RNA mit einem oligo(dT)24 Primer (PROLIGO Primers and Probes; SuperScript Il Rnäse H-Reverse Transkripase, 5x Erststrang-Puffer und 0,1 M DTT (lnvitrogen;18064-014 oder 18064-071), dNTP Mix, 10 mM (Invitrogen; 18427-013). Die Zweitstrang-Synthese wurde in 20 μl des Erststrang-Reaktionsgemischs bei 42°C für 1 h unter Verwendung von 5xZweitstrang-Puffer (Invitrogen; 10812-014), DNA Ligase E.coli, 10 U/μl (Ivitrogen; 18052019), DNA Polymerase I E.coli, 10 U/μl . (Invitrogen; 18010-025), RNAse H; 2 U/μl (lnvitrogen;18021-14;18021-071);T4-DNA Polymerase; 5U/μl (Invitrogen; 18005- 025), EDTA Dinatriumsalz, 0.5 M Lösung (SIGMA; P/N E7889). Reinigung von DNA wurde mit dem GeneChip®Sample Cleanup Modul entsprechend dem Affymetrix Protokoll durchgeführt.
In-vitro Transkriptionsreaktion. Nach der Zweitstrang-Synthese wurde die Biotin- markierte cRNA durch eine in vitro Transkriptionsreaktion aus der cDNA-Probe unter Verwendung des BioArray RNA transcript labeling Kit (Enzo Diagnose, Farmingdale, N.Y.) mit Biotin-markiertem CTP und UTP erzeugt . Die markierte cRNA wurde mit Hilfe von RNeasy spin columns (Qiagen) gereinigt. 15 μg jeder cRNA-Probe wurde bei 94°C für 35 Minuten in Fragmentierungspuffer (40 mM Tris-Acetat, pH 8.1, 100 mM Kaliumacetat und 30 mM Magnesiumacetat) fragmentiert und anschließend zur Herstellung von 300 μl Hybridisierungsgemisch verwendet. Ein biotinyliertes Oligonukleotid, B2, das mit Kontroll-Features (Molekülen) in der Mitte und an den vier Ecken jedes Chips hybridisiert wurde, wurde als Orientierungshilfe zur Probenbestimmung auf dem Chip verwendet.
Microarray Hybridisierung. Der Affymetrix GeneChip MG._U74Av2 wurde in den GeneChip© Hybridization-Oven 640 (Affymetrix) verbracht. Hybridisierungen erfolgten bei 450C für 16 Stunden bei 60 φm. Die Arrays wurden aus der Kammer genommen. Wasch-, Trocknungs- und Färbungsschritte wurden in der Wasch Station 400 (Affymetrix) entsprechend dem Affymetrix Array Protokoll durchgeführt.
Microarray Durchmusterung (Scannen) und Datenerfassung. Di.e hybridisierten Arrays wurden mit einem kalibrierten GeneArray Scanner (Acjilent) bei der Wellenlänge 570 nm gescannt (Pixel 3 μm). Jedes Array wurde 3 x gescannt. Als Software zur Datenerfassung wurde die GeneChip operating Software GCOS (Affymetrix) verwendet.
Statistische Analyse. Die Array-Daten wurden unter Verwendung von scaling oder per-chip Normalisierung normalisiert um die totale oder mittlere Intensität von jedem Array anzugleichen. Der Scale Faktor wurde entsprechend der Affymetrtrix Empfehlung eingestellt und zur Generierung einer Micro-Array Qualitätskontrolle und eines Daten-Reports verwendet. Features, die eine abweichende Expression mit einem Faktor größer 1 ,7 aufwiesen, wurden als signifikant erachtet- und in einem Excel Spreadsheet mit Gen-Anmerkungen und ontologischen Daten des NetAffix TM Analyses center vermerkt.
Eine t-Test Analyse wurde unter der Verwendung des DATA Mining Tool (DMT) 3.0 von Affymetrix durchgeführt. Ein stringenter Vergleich zwischen normalen und tumoralen Geweben wurde entsprechend der Konsistenz der Änderungen der Genexpression durchgeführt. Ein t-Test und eine Ranking Analyse mit hoch- und herunter-regulierten Genen wurde durchgeführt und nur Gene, die in 100 % Konkordanz in der Änderungsrichtung mit einem p-Wert < 0.05 (t-Test) und einem FC größer/gleich 1.7 / FC kleiner/gleich -1 ,7 wurden berücksichtigt.
RT-PCR. Spezifische Amplimere für jedes Gen wurden von Invitrogen life technologies erhalten: Amplimer Sequenzen (5 ' nach 3') vorwärts (forward) und entsprechend rückwärts (reverse) waren wie folgt: ADAM-19: cgatggcggctgcatcatggc; ccaccagcttgcactggtggc; TIMP-3:
gatgccccacgtgcagtacat, tgctgatgctcttgtctgggg; coI17a1: ggctgagctggacggctacag, gggttcaccacgaggtcccat; Cav1 : gcatcaagagcttcctgattg, ccagactgtcaaacatagatg; Bsg: aaccgggcaccatccaaacct, attgcctcttcttccccagtg; CD44: cggctccäccatcgagaagag, gttgtgggctcctgagtctga; ItgaX: ccctcaaatatgagacccacc, ggattcctgggtaaagatgac;
Lamc2:gctggaaggcaggatcgagca, ttcctgccagactcaggcgca; TM4sf2:
gttgattggcatgctgctggc, gcagggatagtatgtactgtg; CAP-1: cacgctcagcactgtttgcac, cacttgtagatgtaagccacc; Vtn:aagtggagcaacaggaggaga, caacattgtctggtatgccac; Ccr5: gtcagaacggtcaactttggg, gttgtagggagtccagaagag.
Quantitative RT-PCR mit dem LightCycler (Roche Diagnosticse): 10 ng des Templats wurden in 10 μl Reaktionen mit Taq-Polymerase (ABgene Art-. Nr. AB Ö301); 10x PCR-Puffer; 1M KCI-Lösung; 1M Tris-HCI; pH 8.3 (RT); 6OmM MgCI2; Roth Tris (Cat-Nr.: 4855.2); Merck MgCI2 (Cat-Nr.: 8.14733.0500); Merck NaCI 37% (Cat-Nr.: 1.00317); Sigma-KCI (Cat-Nr.: P5405); 1OmM sNTP-Lösung, MBI Fermentas (Cat- Nr.: R0181); BSA Fraktion V (Nr. G 16112-207) von PAA. SYBR Green I. (Nr.S-7567) Molecular Probes, USA. Die Zyklus-Bedingungen waren 95°C für 45 s, gefolgt von 40 Zyklen 95°C für 1 s, 57°C für 12 s und 720C für 6 s, mit Beobachtung der Fluoreszenz während der Annealing-Phase; diese wiederum folgte ein Schmelz Programm von 40 zu 75°C mit 0.2°C/s mit kontinuierlicher Überwachung der Fluoreszenz. Die Fluoreszenz Quantifizierung wurde mit Hilfe einer eingebauten LightCycler Software 3.01 (Roche) berechnet. RT-PCR (Thermocycler): 20 ng DNA wurden in 20 μl Reaktionen analysiert (94°C, 1 Min.; 55-58°C, 1 Min.; 72°C, 2 Min.) PCR-Reaktionen wurden mittels Abgene Thermo- Start Taq (Cat-Nr.:AB-1908/B), 10x Reaktionspuffer (15 mM MgC!2) und 10 mM dNTP von MBI Fermentas (Cat-Nr.: R0181) durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden mit 25-40 Zyklen zur Bestimmung des linearen Amplifikationsbereichs jedes Primer Sets durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der Banden wurde mittels Kodak 1D 3.5 Network Software durchgeführt.
Western Blot. 100 μg Proteine wurden mit einem SDS-PAGE Gel (12% Gradient) aufgetrennt und auf eine PVDF Membrane (NEN, Cat-Nr: NEF1002) bei 40 V für 1 h transferiert . Die Membran wurde mit 1xRoti-Block blockiert (Roth, Cat-Nr: A151.1) in IxTBS Buffer über Nacht bei 40C. Proteine wurden unter Verwendung von EMMPRIN (Basigin) detektiert: 2μg/ml (R&D Systems, Cat-Nr: MAB772) und ADAM- 19: 1 mg/ml (Cerdarlane® laboratories). ADAM-19 wurde 1:5000. verdünnt. Sekundärantikörper mouse/rabbit IgG (Chemicon, Cat-Nr: AP 160P und AP132P) wurden mit einer 1:5000 Verdünnung verwendet. Die Detektion der Proteine wurde mit einem Chemilumineszenz Reagens durchgeführt (NEN, Cat-Nr: NEN 104) und unter Verwendung der Kodak IST Software 440CF belichtet.
[mmunhistochemie. Immun-Färbung für die Ep-Cam Expression in Lungen Cryostat Sektionen (Gewebeschnitte). Zur indirekten Immunofluoreszenzlokalisation von Ep- CAM positiven Zellen in Lungenproben wurden 10 μm dicke Cryostatsektionen auf Papierkleber beschichtete Glas Objektträger aufgebracht, iuftgetrocknet und danach mit eiskaltem Methanol : Aceton (1:1) fixiert. Die Sektionen wurden in Waschpuffer rehydriert (1mg Rinderserum-Albumin (BSA) /ml Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS), pH 7.4), mit Ratte anti-Maus-Antikörper Ep-CAM (BD Biosciences Pharmigen, 1: 1000 verdünnt in 10mg BSA/ml PBS) in einem Feuchtigkeitskammer bei 4°C über Nacht inkubiert , und, nach Waschschritten mit Puffer, mit Ziege anti- Ratte Cy-3 konjugiertem Antikörper (Chemicon, 1: 200 verdünnt in 10mg BSA/ ml PBS) bei Raumtemperatur, im Dunklen, eine Stunde lang irikubiert. Nach abschließenden Waschschritten, wurden die Sektionen in wasserlösliches einbettendes Medium (Glycergel, DAKO) 41, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI1 Serva) für die Kemfärbung und in Bicyclo(2, 2, 2)-1, 4-diazaoctan (DABCO, Sigma) als AntiBleichmittel eingebracht. Stellen des Ep-CAM Vorkommens wurden mit einem UV Fluoreszenz Mikroskop sichtbar gemacht und mit einer digitalen Kamera dokumentiert. Unspezifische Färbungen wurden durch Auslassen des Primärantikörpers bestätigt.
Immunohistochemie mit humanen Geweben. In gleicher Weise wurden immunhistologische Untersuchungen an verschiedenen menschlichen Lungentumoren durchgeführt. Dadurch konnte beispielhaft . die tumorspezifische Expression der Epitope EpCAM, Claudin-2, CD44, CD 147 und ADAM 19 sowohl in großzelligen Karzinomen, Plattenepithelkarzinomen und Adenokarzinomen (Bronchiolo-alveoläres Karzinom, azinäres and papilläres Adenokarzinom sowie Adenokarzinomen mit Einzellverschleimung) der Lunge nachgewiesen werden. Die Untersuchungen mit c-myc (Überexprimierten)-Zellen/Geweben wurden in entsprechender Weise durchgeführt, ausgewertet sowie mit den Ergebnissen von c-raf induzierten Zellen/Geweben verglichen. Die Tabellen 4 und 5 zeigen einige Ergebnisse im Vergleich zwischen c-raf and c-myc (ECM Umgestaltung). Ein Unterschied wurde für überraschenderweise für 1CAM1 gefunden, ein Oberflächen- Adhäsionsmolekül, das nur in c-myc Zellen/Geweben hochreguliert (FC = 2,8) ist.
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Legende zu den Tabellen
Tabelle 1 : Überexprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung
(Remodelling) in nicht-zellulären Lungenkarzinomen
Tabelle 2a: Reprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung von
Adhäsionsmolekülen in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen
Tabelle 2b: Differentiell exprimierte Gene bezogen auf die Zell-vermittelte
Immunität und Entzündung in nicht-zellulären Lungenkarzinomen.
Tabelle 3: Bestätigung der differentiell exprimierten Gene mittels qRT-PCR.
Tabelle 4: induzierte Gene bezogen auf die ECM Umgestaltung in nicht-zellulären
Lungenkarzinomen
Tabelle 5: Reprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung von
Adhäsionsmolekülen in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen
Tabelle 1: Überexprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung (Remodelling) in nicht- zellulären Lungenkarzinomen
Affymetnx Gen-Symbol Genbeschreibung Änderungsfaktor P-Wert
Probe set ID
103554_at ADAM19 a Disintegrin and metalloproteinase 19 3,17 < 0,01
95338_s_at Mmp12 Metalloproteinase 12 2,37 < 0,01
101881_g_at Coli 8a1 Procollagen, type XVIII alphal 2,5 < 0,01
99637_at Coli 5a1 Procollagen, type XV alphal 4,95 < 0,01
103005_s__at CD44 CD 44 3,97 < 0,01
101078_at Bsg Basigin 2,8 < 0,01
102353 jat Itgb2 Integrin beta 2 3,99 < 0,01
104308_at Itgax Integrin alpha 10 3,25 < 0,01
100428_at Lamc2 Laminin gamma 2 4,21 < 0,01
92759_at Lamb3 Laminln beta 3 3,28 < 0,01
104407_at Alcatri activated leukocyte cell adhesion molecule 1,81 < 0,01
93934_at Cldn2 Claudin 2* . 20,26 0,02
94493_at Cldn3 Claudiπ 3 2,41 < 0,01
99561_f_at Cldn7 Claudin 7 2,07 < 0,01
94270_at Kttl-18 Keratin complex 1, acldlc gene 18 2,67 < 0,01
101009_at Krt2-8 Keratin complex 2, basic gene 8 1,71 < 0,01
99582_at tacstdi tumor associated calcium signal transducer 1 1,77 < O,O1
160651_at tacstd2 tumor associated calcium signal transducer 2 2,37 < 0,01
95453_f_at S100 a1 S 100 calcium biπding protein A1 1,99 < 0,01
98600 at S100 a11 S100 calcium binding protein A11 1,76 < 0,01
Tabellei: Überexprimierte Gene (> 1.7-fach, P < 0,1) bezogen auf die ECM Umgestaltung in in Lungenadenokarzinomen induziert durch c-raf In Mäusen. Der Änderungsfaktor (fold change) wurde mittlels Affymetrix Software (DMT 3.0) bestimmt. * Gene, die ausschließlich in Lungenadenokarzinomen als "anwesend" detekiert wurden.
Tabelle 2a: Reprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung von Adhäsionsmolekülen in nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen
Affymetrix Gen-Symbol Genbeschreibung Änderungsfaktor P-Wert
Probe set ID
94963_at VcI VincUlin -1,75 < 0,01
98549_at Vtn Vitronectin* -4,24 0,02
160280_at Cav1 Caveolin 1 -2,49 < 0,01
160610_at Pcdha4 Procadherin alpha 4* -9,85 < 0,01
104083_at Cdh5 Cadherin 5 -3,54 < 0,01
102852_at Cdh2 Cadherin 2# -2,58 < 0,01
104743_at Cdh13 Cadherin 13* -4,38 0,03
101948_at Lamb1-1 Laminin beta 1, subunit 1 -2,95 < 0,01
92366_at Lama2 Laminin alpha 2 -2,33 < 0,01
104587_at Lama4 Laminin alpha 4 -2,4 < 0,01
100313_at ltgaβ Integrin aipha 8* -5,9 < 0,01
1OO134_at Eng Endoglin -3,6 < 0,01
161907_s_at Tnxb Tenascin XB -2,7 0,02
103721_at Npnt Nephronectin -1,9 < 0,01
96742_at Dpt Dermatoponin -4,15 < 0,01
101499_at Hk Integrin iinked kinase -1,71
< 0,01
102261_f_at Coli 3a1 Procollagen, type XIII alphal* -6,74
0,02
160594 at Col17a1 Procoilagen, type XVIl alphal* -4,6
0,04 94085_at Prg Proteoglycan, secretory granule -2,36 < 0,01
104375_at Spock2 Sparc/osteonectin, owcv and Kazal-Iikβ -2.7B < 0,01
domains, proteoglycan 2
95104_at Sdo2 Syndecan 2 -2,32 < 0,01
94112_at TnfsflO tumor necrosis factor superfamily, member 10 -2,16 < 0,01
97832_at CD97 CD 97 -3,83 < 0,01
103611jat CD47 CD 47 -1,7 < 0,01
99053_at Icam2 lntracellular adheslon molecule 2* -6,69 < 0,01
104516_at Cldn5 Claudin 5 -5 < 0,01
160458_at Mcam Melanoma cell adheston molecule ■1.9 < 0,01
160519_at TIMP3 tlssue Inhibitor metalloproteinase 3 -2,76 < 0,01
100447_at Hyal2 Hyaluronidase 2 -3,16 < 0,01
93887_at Mpdz Multiple PDZ domain protein -3,51 < 0,01
97977_at Ntn1 Netrln -2,3 < 0,01
160583_at Xlkdi Extracellular link domain containing 1 -8,99 < 0,01
103644_at Dpepi Dipeptidasel -5,08 < 0,01
97984_i_at Kns2 Kinesin 2 -1,76 < 0,01
97976_at Ktn1 Kineotin 1 -1,86 < 0,01
97358_at Lphni Latrophllin -1,74 < 0,01
101095_at Mfap2 Microfibrlllar assooiated protein 2 -2,45 < 0,01
161962_f_at Mfap4 Microfibrillar assoclated protein 4 -4,51 < 0,01
93721_at Cap1 CAP adenylate oyclase, associated protein 1* -8,84 < 0,01
104121_at Jup Junction plakogiobin -1,7 < 0,01
96774_at Plekhd Pleckstrin homology domain containing family -2,05 < 0,01
(with FERM domain member 1)
97497_at Notchi Notch 1 -2,21 < 0,01
104188_at Notch2 Notch 2 -1,96 < 0,01
92652_at Notch4 Notoh 4 -5,49 < 0,01
98349_at H6st Interleukine 6 Signal transducer -2,43 < 0,01
101522_at TM4SF1 Transmembrane 4 superfamily 1* -2,35 < 0,01
93326_at TM4SF2 Transmembrane 4 superfamily 2 -4,66 < 0,01
92555_at TM4SF6 Transmembrane 4 superfamily B -2,98 < 0,01
160678_at TM4SF12 Transmembrane 4 superfamily 12 -4,75 < 0,01
95120_at TM4SF13 Transmembrane 4 superfamily 13 -3,43 < 0,01
102720_at TEK endothelial specific receptor tyrosine kinase -6,41 < 0,01
104697 at Rhoj ras homolog gene family, member J -2,49 tr n n-i
Tabelle~2a: Reprimierte Gene (≤ 1.7-fach, P < 0,1) bezogen auf die Umgestaltung der Zelladhäsion in Adenokarzinomen, induziert durch c-raf in Mäusen. Der Änderungsfaktor (fo/d change) wurde mittlels Affymetrix Software (DMT 3.0) bestimmt. * Gene, die als "abwesend" in Lungenadenokarzinomen detektiert wurden..
Tabelle 2b: Differentiell exprimierte Gene bezogen auf die∑ell-vermittelte Immunität und
Entzündung in nicht-zellulären Lungenkarzinomen.
Affymetrix Gen-Symbol Genbeschreibung Änderungsfaktor P-Wert Probe sei ID
97444_at lfl3° Interferon gamma induoible protein 30 4,67 < 0,01
92415_at Tπfsf9 Tumor necrosis factor superfamily 9* 12,52 < 0,01
94747_at Cs{2rb1 Cotony stimulating factor 2, receptor bete 1 4,28 < 0,01
103210 at Csf2rb2 Colony stimulating factor 2, receptor beta 2 2,43 < 0,01
99330_at Csf2ra Colony stimulating factor 2, receptor alpha 3,58 < 0,01 161968_f_at Ccr5 Chemokiπe (C-C motif) receptor 5 4,82 < 0,01
92849_at Ccl6 Chemoklne (C-C motif) ligaπd 6 7,63 < 0,01
103012_at Ccl2-Ib Chemoklne (C-C motif) ligaπd 21b 1 ,92 < 0,01
98088_at CD14 CD 14 2,83 < 0,01
103005_s_at CD44 CD 44 3,97 < 0,01
93092_at H2-DMa Hlstocompatibllity 2, olass II, locus DMa 1,92 < 0,01
98035_g_at H2-DMb1 Histocompatibility 2, class II, locus DMbI 4,54 < 0,01
100998_at H2-Ab1 Histocompatibility 2, class Il artigen A1 beta 3,19 < 0,01
92866 at H2-Aa Hlstocompatibllity 2, class Il artigen A1 alpha 2,66■ < 0,01
Tabelle 2b: Hoch-regulierte Gene bezogen auf die Zell-vermlttelte Immunität (> 17-fach, P < 0,1). Die Änderung des Faktors wurde mittels Affymetrix Software (DMT 3.0) berechnet. * Gene, die als "abwesend" in normalen Luπgengeweben detektlet wurden.
Tabelle 3: Bestätigung der differentiell exprimierten Gene mittels qRT-PCR.
Reprlmierte Gene In Probe Set ID Methode Bestätigt PCR
Lungenadenokarzinomen
Light cycler Thermocyder (bp)
FC Tm FC
•
TIMP-3 160519 at -1,87± 0,42 87° -2,-23± 0,76 + 373
Caveolin-1 160280 at -2,46± 0,71 85° -2,67± 0,98 + 326
CAP-1 93721_at -3,59± 1,57 + 289
TM4 sf 2 93326 at -4,46± 0,61 86° ■4,88± 1,39 + 180
Col17a1 160594jat - -7,59± 2,45 + 295
Vitronectin 98549_at - -4,86± 1,12 + 375
Überexprimierte Gene in
Lungenadenokarzinomen
ADAM-19 103554 at +2,65± 1,01 + 307
Basigin 101078 at +2,34± 0,82 86° +2,84± 1,78 + 391
CD44 103005 s_at -»•2,23 87° +2,61± 1,23 + 230
ItgaX 104308 at +2,82± 0,54 + 154
Lamc2 100428_at - +4,61± 1,53 + 254
Ccr5 161968 f_at +5,10+ 1,76 86° +.4,16± 2,22 + 320
FoId chaπge (FC) mittels RT-PCR bestimm. Vergleich von tumoralen Geweben von c-raf-1 Lungenadenokarzinomen (n =3) mit normalem Lungengeweben, die als Kontrolle verwendet wurden (π=3). Die Quantifizierung dar Banden wurde mit der Kodak 1D 3.5 Network Software (Thermocyder) und Fluoreszenzquantifizierung (LightCycler) mit Hilfe der UghtCycler Software 3.0.1 durchgeführt..
Tabelle 4: Induzierte Gene bezogen auf die ECM Umgestaltung in nicht-zellulären Luhgenkarzinomen
Affymetrix Gen-Symbol Gen-Beschreibung c-raf - c-myc probe set ID
103554_at ADAM19 a Disintegrin and metalloproteinase 19 3,17 2,3
95338_s_at Mmp12 Metalloproteinase 12 2,37 < 0,01
101881_g_at Coli 8a1 Procollagen, type XVIlI alphal 2,5 < 0,01
99S37_at Coli 5a1 Procollagen, type XV alphal 4,95 4,6
103005_s_at CD44 CD 44 3,97 < 0,01
101078_at Bsg Basigln 2,8 < 0,01
102353_at Itgb2 Integrin beta 2 3,99 < 0,01
104308_at Itgax Integrin alpha 10 3,25
< 0,01
100428_at Lamc2 Laminin gamma 2 4,21
< 0,01
92759_at Lamb3 Lamlπin beta 3 3,28
< 0,01
104407 at Alcam activated leukocyte cell adhesion mσlecule 1,81
< 0,01 93934_at Cldn2 Claudin 2* 20,26 43,5
94493_at Cldn3 Claudin 3 2,41 < 0,01
99561_f_at Cldn7 Claudin 7 2,07 < 0,01
94270_at Krt1-18 Keratin complex 1, acidic geπe 18 2,67 3,6
101009_at Krt2-8 Keratin complex 2, basio gene 8 1,71 < O,O1
995B2_at tacstdi tumαr assooiated calcium signal transducer 1 1,77 < 0,01
160651_at tacstd2 tumor associated calcium signal transducer 2 2,37 < O,O1
95453_f_at S100 a1 S100 calcium binding protein A1 1,99 < 0,01
98600_at S100 a11 S100 calcium binding protein A11 1,76 < D,01
Tabelle 4: : Überexprimierte Gene (> 1.7-fach, P < 0,1) bezogen auf die ECM Umgestaltung in Lungenadenokarzinomen Induziert durch c-raf bzw. c-myc in Mäusen. Der Änderungsfaktor (fold change ) wurde mittlels Affymetrix Software (DMT 3.0) bestimmt. * Gene, die ausschließlich in Lungenadenokarzinomen als "anwesend" detekiert wurden.
Tabelle 5: Reprimierte Gene bezogen auf die ECM-Umgestaltung von Adhäsionsmolekülen in nichtkleinzelligen Lungenkarzinomen
Affymetrix Gene symbol Gene Descnption c-raf c-myc probe set ID
94963_at VcI Vinculin -1,75 < 0,01
98549_at Vtn Vitronectin* -4,24 -6,6
160280_at Cav1 Caveolin 1 -2,49 -6,5
160610_at Pcdha4 Protocadherin alpha 4* -9,85 -9,9
104083_at Cdh5 Cadherin 5 -3,54 -10
102852_at Cdh2 Cadherin 2* -2,58 < 0,01
104743_at Cdh13 Cadherin 13* -4,38 0,03
101948_ai Lamb1-1 Laminin beta 1, subunit 1 -2,95 < 0,01
92366_at Lama2 Lamiπin alpha 2 -2,33 < 0,01
104587_at Lama4 Laminin alpha 4 -2,4 -2,91
1003i3_at Itgaδ Iπtegrin alpha 8* -5,9 -8,8
100134_at Eng Endoglin -3,6 -7,6
161907_s_at Tnxb Tenascin XB -2,7 0,02
1O3721_at Npnt Nephronectin -1,9 < 0,01
96742_at Dpt Dermatoponin -4,15 -17
101499_at Hk Integrin linked Kinase -1,71 < 0,01
102261_f_at Col13a1 Procollagen, type XIII alphal* -6,74 -17
160594_at Col17a1 Prαcollagen, type XVlI alphal* -4,6 0,04
94085_at Prg Proteoglycan, secretory granule -2,36 -5
104375_at Spock2 Sparc/osteonectin, owcv and Kazal-like -2,78 -22
domains, proteoglycan 2
95104_at Sdc2 Syndecan 2 -2,32 < 0,01
94112_at TnfsfiO tumor necrosis factorsuperfamlly, member 10 -2,16 < 0,01
97832_at CD97 CD 97 -3,83
-9,7
103611_at CD47 CD 47 -1,7 < 0,01
99053_at Icam2 Intracellular adhesion molecule 2* -6,69 -48
1045i6_at Cldπ5 Claudin 5 -5 -17,8
160458_at Mcam Melanoma cell adhesion molecule -1,9 < 0,01
160519_at TIMP3 tissue Inhibitor metalioproteinase 3 -2,76 < 0,01
Hyaluronidase 2
100447_at Hyal2 -3,16 < 0,01
93887 at Mpdz Multiple PDZ domain protein -3,51
< Q,01 97977_at Ntn1 Netrin -2,3 < 0,01
160583_at Xlkdi Extracellular link domain cσntaining 1 -8,99 -28
103644_at Dpepi Dipsptidasθi -5,08
-4,9
97984J_at Kns2 Klπesln 2 -1,76 < 0,01
97976_at Ktπ1 Kinectin 1 -1,86 < O,O1
97358_at Lphni Latrophllln -1,74 < 0,01
101095_at Mfap2 Microfibrillar assoclated protein 2 -2,45 -5,8
161962J_at Mfap4 Microfibrillar associated protein 4 -4,51 < 0,01
93721_at Cap1 CAP adenylate cyclase, associated protein 1 * -8,84 < 0,01
104121_at Jup Junction plakoglobin -1,7 < 0,01
9B774_at Plekhd Pleckstrin homology domain containing family -2,05 < 0,01
(with FERM domain member 1)
97497_at Notch 1 Notch 1 -2,21 < 0,01
104188_at Notch2 Notch 2 -1,96 < 0,01
92652_at Notch4 Notch 4 -5,49 -5,81
98349_at nβst InterlθUkine 6 signal transducer -2,43
-4,3
101522_at TM4SF1 Transmembraπe 4 superfamily 1* -2,35 < 0,01
93326_at TM4SF2 Transmsmbrane 4 superfamily 2 -4,66
-8,5
92555_at TM4SF6 Transmembrane 4 superfamily 6 -2,98 < 0,01
160678_at TM4SF12 Transmembrane 4 superfamily 12 -4,75 < 0,01
95120_at TM4SF13 Transmembrane 4 superfamily 13 -3,43 -13
1Q2720_at TEK endothelial spedflc reeeptor tyrosine kinase -6,41 -26
104697_at Rhoj ras homolog gene family, member J -2,49 < O,O1
OnIy in c-myc
92559_at Voam Vascular cell adhesion motecule -4,08
97790_S_at LamaS Laminin, alpha 3 -5,2
101650_at PcdhaS Protocadherin alpha 6 - Cyl
98833_at Mmp3 Matrix metalloproteinasβ 3 -6,2
96886_at Stabi Stabilin 1 -3,4
96825_at Tend Tensin like C1 domain containing Phosphatase -6,8
106319 at SparcH SPARC-like 1 -5,4
Tabelle 5: Reprimierte Gene (≤ 1.7-fach, P < 0,1) bezogen auf die Umgestaltung der Zelladhäsion in Adenokarzinomen, induziert durch c-raf bzw. c-myc in Mäusen. Der Änderungsfaktor (fold change) wurde mittlels Affymetrix Software (DMT 3.0) bestimmt. * Gene, die als "abwesend" in
Legende zu den Abbildungen
Figur 1 : Immunhistochemie von Ep-Cam in Lungenadenokarzinomen. Figur 2: Western Blots von Basigin und ADAM19.
Figur 3: Schematisches Modell mit einigen der durch c-raf-1 geänderten
Transkriptionsveränderungen bei der ECM Umstrukturierung und Zelladhäsion.
Erläuterungen zu den Abbildungen
Figur 1 :
Immunhistochemie von Ep-Cam.
(a) Dapi-Färbung von Nuklei und Ep-Cam Färbung von Lungenadenokarzinomen.
(b) Ep-Cam Färbung in Tumor Foci.
Figur 2:
Western Blots von Basigin und ADAM19.
Basigin wurde unter Verwendung eines monoklonalen anti-Maus EMMPRIN Antikörper analysiert. All Banden zeigen Basigin bei ~ 55 KDa, aber in c-raf-1 Lungentumoren ist Basigin erhöht. ADAM-19 wurde durch Verwendung eines Kaninchen anti-humanes ADAM-19 Antikörper gegen den N-Terminus von Furin- aktivierten humanem ADAM-19. Maus ADAM-19 wird bei einer Bande von ~ 60 KDa erkannt, die nur in Lungentumor-Geweben detektiert wird. Die Bahnen 1-3 entsprechen c-raf-1 Lungentumoren (n=3) von transgenen Mäusen; die Bahnen 4-5 sind Kontrollen (nicht-transgene Lungengewebe). L: Protein-Leiter. Für die einzelnen Bahnen wurden 100 μg Protein Extrakte von Lungenkontrollen und Lungentumoren verwendet. Figur 3:
Schematisches Modell, das einige der am stärksten signifikant geänderten Transkriptionsveränderungen bei der ECM Umstrukturierung und Zelladhäsiσn in durch c-raf-1 in Mäusen induzierten darstellt.
Wir haben die Expression von Genen, die für ECM und Zelladhäsionsmoleküle kodieren, in Lungenadenokarzinomen durch Microarray, qRT-PCR, Immunohistochemie und Western Immunoblotting Techniken untersucht.
Wir verwendeten qRT-PCR (Tabelle 7) um die mittels GeneChip® Microarrays erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen. Figur 6 zeigt die Ergebnisse von 12 der beschriebenen Gene, während die Figuren 4B und 5 die Expression ausgewählter Proteine darstellt. Tatsächlich haben wir eine gute Übereinstimmung unter den verwendeten Methoden festgestellt.
Ein äußerst bemerkenswerter Effekt war die Induktion von MMP12 und ADAM19 (Tabelle 6, Fig 4A). Neben CD44 fanden wir Basigin induziert, eine extrazeilulare Matrixmetalloproteinase, wohingegen ihr Inhibitor Caveolin-1 reprimiert war. Außerdem korrelierte die Induktion von Mmp12 und ADAM19, einer neuartigen Disintegrin Metalloproteinase, mit der Inhibierung von Timp-3, einem Inhibitor von Proteinen der ADAM Familie.
Diese trankriptionellen Änderungen trugen zu einem Anstieg der proteolyischen Aktivität in bösartigen Lungentumoren bei.
Wir beobachteten zudem veränderte Expression von CAM-Molekülen einschließlich Cadherin 2, 5, 13, Procadherin alpha 4, Procollagen Typ XIII und XVlI1 Laminine, Integrin alpha 8, Icam2, Tetrapsine, Ep-CAM und Claudine. Wir zeigen umgestaltete CAM- und ECM-Moleküle als Kennzeichen invasiver Lungenadenokarzinome und haben deshalb neue Möglichkeiten für Mechanismus-basierte Therapien für Lungenkrebs identifiziert.
Wir haben die Expression von Zelladhäsions- und ECM kodierenden Genen in histologisch eindeutig definierten Adenokarzinomen der Lunge beobachtet und die Ergebnisse mit normalen nicht-transgenen Lungengeweben verglichen.
Sodann haben wir Microarray-Studien zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung von Lungentumoren durchgeführt. Zunächst haben wir eine hierarchische Clusteranalyse vollzogen und, wie im Methodenteil spezifiziert, nach Genen gesucht, deren Expression als Gruppe zusammen erfolgt. Durch den angewendeten Algorithmus konnte deutlich zwischen den verschiedenen Lungentumoren unterschieden werden. Dies deutete an, dass es uns Expressionsprofiling ermöglichen würde, zwischen den unterschiedlichen Lungentumoren zu unterscheiden und 11 Monate alte Tumoren von jüngeren zu trennen.
Wir identifizierten Basigin bzw. EMMPRIN (Extrazellulären Matrix Metalloproteinase Induktor) als hochgradig erhöht in allen untersuchten Lungenadenokarzinomen. Insbesondere beobachteten wir die Repression von Caveolin (Cav) und die Induktion der Matrixmetalloproteinase-12 (MMP12) und der Disintegrin- und Metalloproteinase 19 (ADAM19) als Folge der Bsg Induktion.
Der extrazelluläre Matrixmetalloproteinaseinduktor Bsg, ADAM19 und MMP12 wurden weiter auf der Proteinebene untersucht und wir haben alle Genpodukte als signifikant erhöht in Lungentumoren bestätigt, wie in Figur 4B gezeigt ist. Darüber hinaus steigt der Grad der MMP-12 und ADAM-19 Expression mit fortschreitendem Stadium des Tumorwachstums an und erscheint mit der epithelialen Dedifferenzierung in Lungentumoren verbunden.
Weiterhin haben wir die selektive Expression von Kollagenen der Basalmembran und kollagenartigen Transmembranproteinen entdeckt, die umfangreich exprimiert werden und die während der Morphogenese an der Zelladhäsion und den epithelialen-mesenchymalen Interaktionen beteiligt sind.
Wir haben die selektive Expression von Claudinen (Cldn) als Kennzeichen von Lungenadenokarzinomen entdeckt. Die Expression von Claudin-2 fehlte vollständig in normalem Lungengewebe, war jedoch stark induziert in intermediären und späteren Stadien des Lungentumorwachstums. Zusätzlich war die Expression von Claudin 3 und 7 erhöht, wohingegen Claudin 5 in Lungentumorgeweben reprimiert war. Weitere Moleküle, die wir identifiziert haben, die zur Klassifizierung eines Lungentumors geeeignet sind, beinhalten Keratin 1-18. Calcium-bindende Proteine (S100A1 und S100A11) waren ebenfalls induziert.
Zusätzlich haben wir entdeckt, dass CD44 ab dem 1 -Monats-, frühem, intermediärem und fortgeschrittenem Stadium von Lungentumoren induziert ist.
Die Expression von Genen für Zelladhäsions- und ZeII-ZeII-I nteraktionsmoleküle war gleichfalls induziert, z.B. von Integrinen (Itgb2 und Itgax), Prokollagen XV (Col15a1) und Lamininen (Lamb3 und Lamc2).
Die Überexpression von tumorassoziertem Calcium-Signaltransduktor (tacstd) bzw. (Ep-CAM) war eine weitere wichtige Entdeckung unserer Untersuchung, sowohl bezüglich seiner Funktion als Adhäsionsmolekül als auch für seine Aktivität als ein therapeutisches Target.
Histologie. Paraffinblöcke wurden in 3 bis 5 Mikrometer dicke Scheiben unterteilt und mit Hematoxylin und Eosin (H und E), Hematoxylin (H) aileine und PAS für Licht mikroskopische Auswertung gefärbt.
Extraktion von Gesamt-RNA. RNA-Extraktionen und -Aufreinigungen wurden mittels RNeasy Midi Kit durchgeführt (Qiagen, Cat.N: 75144) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
Microarray Analyse. 10 μg Gesamt-RNA wurde als Ausgangsmaterial benutzt, um cDNA herzustellen. Die Synthese von doppelsträngiger cDNA wurde mit dem GeneChip® one-cycle cDNA Kit (Affymetrix) durchgeführt. Die Aufreinigung von doppelsträngiger cDNA erfolgte durch Verwenden des GeneChip® Sample Cleanup Moduls (Affymetrix).
Die in-vitro Transkription wurde mit dem GeneChip® IVT Markierungskit (Affymetrix) durchgeführt. Die Gesamtmenge des Reaktionsproduktes wurde mit dem GeneChip® Sample Cleanup Modul (Affymetrix) gereinigt. Gereinigte cRNA wurde quantitativ bestimmt und unter Verwendung des NanoDrop ND-1000 und des Agilent 2100 Bioanalzyer auf ihre Qualität überprüft.
Gereinigte cRNA wurde durch Metall-induzierte Hydrolyse in Fragmente von 35-200 Basen gespalten. Der Grad der Fragmentierung und die Längenverteilung der fragmentierten biotinylierten cRNA wurde durch Kapillarelektrophorese mittels des Agilent 2100 Bioanalyzer überprüft. 10 μg der fragmentierten biotinylierten cRNA wurden auf dem GeneChip® Genom Array entsprechend der Empfehlung des Herstellers hybridisiert. Die Hybridisierung wurde für 16 Stunden bei 60 rpm und 45°C im GeneChip® Hybridization Oven 640 (Affymetrix) durchgeführt Das Waschen und das Färben der Arrays wurde auf der Gen Chip® Fluidics Station 450 (Affymetrix) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.
Die Antikörpersignalverstärkung, Waschen und Färbungsprotokoll (Affymetrix) wurden verwendet, um Arrays mit Streptavidin R-Phykoerythrin (SAPE; Invitrogen) zu färben. Um die Färbung zu verstärken, wurde zweimal SAPE Lösung mit einem biotinyliertem anti-Streptavidin Antikörper (Vector Laboratories, CA) zwischen dem Färbungsschritt zugegeben. Die Arrays wurden unter Verwendung eines GeneChip® Scanner 3000 gescannt. Gescannte Bilddateien wurden visuell auf Artefakte kontrolliert und dann analysiert, wobei jedes Bild zum Vergleich zwischen den Chips auf den gleichen Zielwert skaliert wurde. Es wurde die GeneChip® Operating Software (GCOS) verwendet, um die Fluidikstation und den Scanner zu steuern, um Daten von Testarrays zu erfassen und Daten zur Hybridisierungsintensität zu analysieren. Standardparameter, die im Affymetrix Datenanalyse-Softwarepaket zur Verfügung gestellt werden, wurden für die Analyse verwendet.
Statistische Analyse. Arraydaten wurden unter Verwendung von scaling oder per- chip Normalisierung normalisiert, um die Gesamt- oder Durchschnittsintensität jedes Arrays ungefähr gleich einzustellen. Der Normierungsfaktor (SF) war entsprechend der von Affymetrix empfohlenen Einstellung SF=3 und der TGT Wert war 250 und wurde verwendet, um eine eine Microarray-Qualitätskontrolle und einen Datenreport zu erzeugen. Merkmale, die signifikant unterschiedliche Expression aufweisen, wurden als signifikant erachtet und mit Genvermerk und onotologischen Daten, die vom NetAffx™ Analysis center erhalten wurden, in eine Excel-Tabellenkalkulation übertragen. Eine T-Test Analyse wurde unter Verwendung des Data Mining Tool (DMT) 3.0 von Affymetrix durchgeführt. Ein stringenter Vergleich zwischen den normalen und Tumor-Geweben wurde entsprechend der Konsistenz von Änderungen der Genexpression durchgeführt. Ein T-Test und eine Klassifizierungsanalyse mit hoch- oder herunterregulierten Genen wurde durchgeführt, und lediglich Gene, die eine 100% ige Übereinstimmung in der Änderungsrichtung mit einem P-Wert < 0.05 (T-Test) aufwiesen, wurden berücksichtigt.
Ciusteranalyse. Die hierarchische Clusteranalyse wurde mittels des Cluster- Werkzeugs, das Bestandteil der Software ArrayTrack 3.^1.5 ist, durchgeführt. (http://www,fda.gov/nctr/science/centers/toxicoinformatics/ArrayTrack/). Das hierarchische Clustering wurde unter Verwendung der Pearson Korrelation als metrische Distanz und der Ward's Methode zum Aufbau des Clusterbaums berechnet. qRT-PCR. Spezifische Amplimere für jedes Gen wurden von Invitrogen Life Technologies erhalten: die Amplimer Sequenzen (5 ' bis 3 ') forward bzw. reverse waren wie folgt: ADAM-19: cgatggcggctgcatcatggc; ccaccagcttgcactggtggc; TIMP-3: gatgccccacgtgcagtacat, tgctgatgctcttgtctgggg; col17a1: ggctgagctggacggctacag, gggttcaccacgaggtcccat; Cav1: gcatcaagagcttcctgattg, ccagactgtcaaacatagatg; Bsg: aaccgggcaccatccaaacct, attgcctcttcttccccagtg; CD44: cggctccaccatcgagaagag, gttgtgggctcctgagtctga; ItgaX: ccctcaaatatgagacccacc, ggattcctgggtaaagatgac; Lamc2: gctggaaggcaggatcgagca, ttcctgccagactcaggcgca; TM4sf2: gttgattggcatgctgctggc, gcagggatagtatgtactgtg; CAP-1: cacgctcagcactgtttgcac, cacttgtagatgtaagccacc; Vtn: aagtggagcaacaggaggaga, caacattgtctggtatgccac; Ccr5: gtcagaacggtcaactttggg, gttgtagggagtccagaagag. RT-PCR (Thermocycler): 20 ng cDNA wurden in 20 μl Reaktionsansätzen analysiert (940C, 1 min.; 55 - 580C, 1 min.; 72°C, 2 min.) PCR-Reaktioπen wurden unter Verwendung von ABgene Thermo- Start Taq (Kat-Nr.: AB-1908/B) 1Ox Reaktionspuffer (15 mM MgCI2) und 10 mM dNTP von MBI Fermentas (Kat-Nr.: R0181) durchgeführt. PCR-Reaktionen wurden mit 25-40 Zyklen durchgeführt, um den linearen Bereich der Amplifizierung für jeden Primersatz zu ermitteln. Quantitative Bestimmung der Banden wurde mit der Kodak 1D 3.5 Netzsoftware durchgeführt. Western blot. 100 μg Proteine wurden unter Verwendung eines SDS-PAGE mit einem Gradienten von 12% aufgetrennt und auf eine PVDF Membrane (NEN1 Katze- Nr: NEF1002) bei 40 V für 1 h transferiert. Die Membran wurde mit 1xRoti-Block (Roth, Kat-Nr: A151.1) in 1x TBS-Puffer über Nacht bei 4°C blockiert. Proteine wurden detektiert unter Verwendung von Antikörpern gegen c-raf (Santa Cruz Biotechnologies; Kat-Nr: Sc 133); EMMPRIN oder Basigin (R&D Systems, Kat-Nr: MAB772), ADAM-19 (Cerdarlane® Labors) und MMP12 (Biomol, Kat-Nr: SA-107). Sekundärantikörper Maus/Kaninchen IgG (Chemicon, Kat-Nr: AP 160P und AP132P) wurden mit einer 1 :5000 Verdünnung verwendet. Der Nachweis von Proteinen wurde durch Verwendung eines Chemilumineszenz Reagens (NEN, Kat-Nr: NEN 104) durchgeführt und unter Verwendung der Kodak IST Software 440CF herausgestellt.
Immunohistochemie. 10 μm dicke Kryostatschnitte wurden auf mit Papierkleber beschichteten Objektträger gebracht, an Luft getrocknet und anschließend mit eiskaltem Methanol:Aceton (1:1) fixiert. Schnitte wurden in Waschpuffer rehydriert (1mg Rinderserumalbumin (BSA) / ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), pH 7.4), inkubiert mit Ratten anti Maus Ep-CAM Antikörper (BD Biosciences Pharmigen, 1 :1000 verdünnt in 10mg BSA/ml PBS) in einer feuchten Kammer bei 4°C über Nacht und, nach Waschen mit Puffer, mit Ziegen anti Ratte Cy-3 konjugiertem Antikörper (Chemicon, 1:200 verdünnt in 10mg BSA/ml PBS) in Dunkelheit und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Nach abschließendem Waschen wurden die Schnitte in wasserlösliches Medium (Glycergel, DAKO) eingebracht, enthaltend 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Serva) für die Kernfärbung und Bicyclo (2,2,2)-1, 4-diazaoctan (DABCO, Sigma) zum Entfärben. Orte mit Ep-CAM Vorkommen wurden mit einem UV-Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und mit einer digitalen Kamera dokumentiert. Unspezifische Färbung wurde durch Weglassen des Primärantikörpers festgestellt.
Tabelle 6: Erhöhte Gene mit Beziehung zur ECM-Umgestaltung in nichtkleinzelligem Lungenkarzinom. FoId Change (P < 0.1) wurde mittels Affymetrix Software (DMT 3.0) errechnet. * Gene ermittelt als „anwesend" nur im Lungenadenokarzinom. Tabelle 7: Validierung von Microarray-Daten mittels qRT-PCR. FC (fold change) bestimmt durch qRT-PCR. Semiquantifizierung der Banden wurde mit der Kodak 1D 3.5 Network Software durchgeführt.
Figur 4: Expression von Schlüsselgenen assoziiert mit proteolytischer Aktivität in Lungenkrebs. A. Erhöhtes Bsg, MMP12 und ADAM19 in tumoralem Lungengewebe. Kontrollen sind durch gestreifte Rechtecke dargestellt. B. Induktion von Basigin, von ADAM19 und von MMP12 in Lungenadenokarzinom. Immunoblots zeigen erhöhtes Bsg, MMP12 und ADAM19 in Lungentumoren. L: Proteinieiter. 100 μg der Proteinextrakte von Lungenkontrollen und von Lungentumoren wurden für jede Bahn verwendet.
Figur 5: Expression von Ep-Cam im Lungenadenokarzinom, A. Dapi-Färbung von Nuklei und Ep-Cam Färbung von Lungenadenokarzinom. Membranfärbung wird im respiratorischen Epithel, säumend die terminalen Bronchien und Bronchiolen, beobachtet. B. Ep-CAM Färbung markiert die Tumorherde. Das Epithel von pseudopapillären oder papillären Formationen zeigt eine stark positive Färbung. Das Ansprechen ist homogen und membrangebunden. Das hyperplastische alveolare Epithel in den Herden färbt ebenfalls positiv.
Figur 6: Validierung von Mikroarray-Daten mittels qRT-PCR. FC (fold change) bestimmt durch qRT-PCR. Semiquantifizierung der Banden wurde mit der Kodak 1D 3.5 Network Software durchgeführt.
Figur 4A. Expression von Schlüsselgenen assoziiert mit proteolytischer Aktivität in Lungenkrebs
Figur 4B. Induktion von Basigin, ADAM19 und MMP12 im Lungenadenokarzinom
Figur 5. Expression von Ep-Cam in Lungenadenokarzinom Figur 6. Validierung von Microarray-Daten durch qRT-PCR Tab, 6:
FC (FoId Change)
(Tumorstadium/ Monate
Probe Set ID Gen Symbol Gen Beschreibung
alt)
Früh/4- Mittel/7- Spät/1 "
103554_at ADAM19 eine Disintegriπ- und Metalloproteiπase 19 NC 2,6 2,2 95338_s_at Mmp12 Metalloproteiπase 12 NC 2,1 2,4 101881_g_at CoHSaI Procollagen, iype XVII! alphal 2,21 2,3 2.5 99637jat Coli 5a1 Procoilageπ, type XV alphal -1,5 -1,5 5,0 103005_s_at CD44 CD 44 3,1 3,7 4,0 1O1O78_at Bsg Basigin 1.9 2.2 1 ,8 102353_at Itgb2 Integrin beta 2 2,2 2,6 4,0 104308_at Itgax Integrin alpha 10 1 ,4 2,0 3,3 10042S_at Lamc2 Laminin gamma 2 1,6 3,5 4,2 92759_at Lamb3 Laminin beta 3 1,6 1.6 3,3 93934_at Cldn2 Claudin 2* NC 6,5 20,3 94493_at Cldπ3 Claudin 3 2,0 3,5 2,4 99561_f_at Cldn7 Claudin 7 1.5 2,4 2,1 94270_at Krt1-18 Keratin Komplex 1 , acidic gene 18 NC 3,4 2,7 1O1OO9_at Krt2-8 Keratin Komplex 2, basic gene 8 NC 2,2
1.7 S9582_at tacstdi Tumor assoziierter Calcium Sigπaltransduktor 1 NC 2,4 1,8 160651_at tacstd2 Tumor assoziierter Calcium Sigπaltransduktor 2 NC NC 2,4 95453 J_at S 100 a1 S 100 Calcium bindendes Protein A1 1,8 2,1 2,0 , 98600 at S100 a11 S100 Calcium bindendes Protein A11 2,2 2,5
1,8
Tab. 7

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erkennung, Markierung und Behandlung von Lungentumorzellen dadurch gekennzeichnet, dass ein biologisches oder biotechnologisches System mit wenigstens einer zumindest teilweise gelösten Substanz in Kontakt gebracht wird, die Affinität zu mindestens einem der Gene ADAM19, Mmp12, Col18a1, Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, CIdn2, Cldn3, Cldn7, Krt1-18, Krt2-8, tacstdi , tacstd2, S100a1 , S100a11 und/oder ihren Varianten und/oder Teilen davon und/oder ihrer mRNA und/oder ihren Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden hat und die Substanz mit einem Marker verbunden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das biologische oder biotechnologische System als ein Organismus, Zellgewebe, Zelle, Zellbestandteil, DNA, RNA, cDNA, mRNA, cRNA, Protein und/oder Peptid oder davon abgeleitete Strukturen gebildet ist oder diese enthält.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische oder biotechnologische System Lungentumorzellen und/oder Oligonukleotidbibliotheken umfasst.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Substanz als Oligonukleotid, Protein, Peptid oder davon abgeleitete Struktur gebildet ist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Substanz als monoklonaler Antikörper und/oder polyklonaler Antikörper und/oder Antikörperfragment gebildet ist.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Substanz als humanisierter und/oder- bispezifischer Antikörper oder als humanisiertes und/oder bispezifisches Antikörperfragment gebildet ist.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker als ein Element, Molekül, und/oder Ion gebildet oder aus diesen zusammengesetzt ist.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker als Farbstoff, Kontrastmittel, Chemotherapeutikum, Radionuklid, Toxin, Lipid, Kohlenhydrat, Biotin, Peptid, Protein, Mikropartikel, Vesikel, Zellorganelle, Virus und/oder ganze Zelle gebildet ist oder diese umfasst.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker als markierte Sekundärantikörper oder Protein A oder Protein G oder davon abgeleitete Struktur gebildet ist.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker Hyaluronan oder davon abgeleitete Strukturen umfasst.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker chemisch, elektrostatisch und/oder über hydrophobe Wechselwirkungen mit der wenigstens einen Substanz verbunden ist.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zwischen der wenigstens einen Substanz und dem Marker kovalent ist.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehre Substanzen verwendet werden, die Affinität zu den Genen Bsg, Cldn2,Tnfsf9, ADAM-19 oder ihren mRNA-Sequenzen oder ihren Genprodukten, haben.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinität über eine Assoziationskonstante Ka > 1000 M"1 gestaltet ist.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es eine PCR, in vitro Transkription, RT-PCR, Gelelektrophorese, Westem-Blot, Northern-Blot, Southern-Blot, ELISA, FACS-Messung, chromatographische Auftrennung, UV-Mikrospkopie, Immunhistochemie, Screening von festphasengebundenen Molekülen, Zellen oder Geweben, statistische Auswertung und/oder eine biosensorische Untersuchung beinhaltet.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, die festphasengebundenen Moleküle, Zellen oder Gewebe auf einer planaren Oberfläche immobilisiert sind.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 14-15 dadurch gekennzeichnet, dass die festphasengebundenen Moleküle, Zellen oder Gewebe ortsaddresiert immobilisiert sind.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 14-16, dadurch gekennzeichnet, dass die festphasengebundenen Moleküle als wenigstens eine Substanz gebildet sind, die Affinität zu mindestens einem der Gene ADAM19, Mmp12, CoI18a1, Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lamc2, Lamb3, Alcam, Cidn2, Cldn3, Cldn7, Krti-18, Krt2-8, tacstdi, tacstd2, S100a1, S100a11 und/oder ihren Varianten und/oder Teilen davon und/oder ihrer mRNA und/oder ihren Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden hat.
19. Verfahren nach den Ansprüchen 15-18 dadurch gekennzeichnet, dass die planare Oberfläche als eine Glas-, Kunststoff- oder eine Membranoberfläche gebildet ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranoberfläche im wesentlichen aus Cellulose, Nitrocellulose oder PVDF gebildet ist.
21. Verfahren nach den Ansprüchen 15-20, dadurch gekennzeichnet, dass die ortsadressiert gebundenen Oligonukleotide als eine DNA-Bibliothek gebildet sind.
22. Verfahren nach den Ansprüchen 15-21, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche mit einer Lösung mit einem biologischen oder biotechnologischen System gemäß den Ansprüchen 2-3 in Kontakt gebracht wird und die aus der Lösung assoziierten Komponenten auf der Oberfläche sichtbar gemacht werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Sichtbarmachung Färbungsreagenzien, markierte Oligonukleotidsonden, Proteine und/oder Peptide verwendet werden.
24. Verfahren nach den Ansprüchen 22-23, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine als Antikörper, Enzyme, Streptavidin und/oder als Teile davon gebildet sind.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Signale, die von dem Marker ausgehen mit Hilfe einer optisch oder szintigraphisch sensitiven Apparatur ausgelesen werden.
26. Mittel zur Erkennung, Markierung und Behandlung von Lungentumorzellen gemäß einem Verfahren nach den vorangehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine Substanz mit einer Affinität gemäß Anspruch 1 und ggf. Anspruch 14 und den Merkmalen gemäß einem der Ansprüche 4-6 enthält und die wenigstens eine Substanz ggf. über eine Verbindung gemäß den Ansprüchen 11-12 mit einem Marker gemäß einem der Ansprüchen 7-9 verbunden ist und die markierte Substanz zumindest teilweise löslich ist.
27. Mittel gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es in wässerigen Lösungen löslich ist.
28. Testkit für die Erkennung, Markierung und Behandlung von epithelialen Lungentumorzellen nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1-25 dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens ein Mittel gemäß einem der Ansprüche 26-27 enthält.
29. Testkit nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Träger enthält auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu mindestens einem der Gene ADAM19, Mmp12, Coli 8a1 , Col15a1, CD44, Bsg, Itgb2, Itgax, Lämc2, Lamb3, Alcam, Cldn2, Cldn3, Cldn7, Krt1-18, Krt2-8, tacstdi , tacstd2, S100a1, S100a11 und/oder ihren Varianten und/oder Teilen davon und/oder ihrer mRNA und/oder ihren Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden hat.
30. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu ADAM19 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'-cgatggcggctgcatcatggc-3' und 5'-ccaccagcttgcactggtggc-3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
31. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu TlMP-3 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaitprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- gatgccccaGgtgcagtacat-3' und 5'- tgctgatgctcttgtctgggg -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
32. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu col17a1 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder, seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- ggctgagctggacggctacag -3' und 5'- gggttcaccacgaggtcccat -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
33. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu Cav1 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- gcatcaagagcttcctgattg -3' und 5'- ccagactgtcaaacatagatg -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
34. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu Bsg und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- aaccgggcaccatccaaacct -3' und 5'- attgcctcttcttccccagtg -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
35. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu CD44 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- cggctccaccatcgagaagag -3' und 5'- gttgtgggctcctgagtctga -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
36. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu ItgaX und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- ccctcaaatatgagacccacc -3' und 5'- ggattcctgggtaaagatgac -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
37. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu Lamc2 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- gctggaaggcaggatcgagca -3' und 5'- ttcctgccagactcaggcgca -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
38. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu TM4sf2 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- gttgattggcatgctgctggc -3' und 5'- gcagggatagtatgtactgtg -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
39. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu CAP-1 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder, seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'~ cacgctcagcactgtttgcäc -3' und 5'- cacttgtagatgtaagccacc -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
40. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu Vtn und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- aagtggagcaacaggaggaga -3' und 5'- caacattgtctggtatgccac -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
1. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass er
A) einen Träger, auf dem wenigstens eine Substanz mit Affinität zu Ccr5 und/oder seinen Varianten und/oder Teilen davon und/oder seiner mRNA und/oder seinen Genprodukten und/oder davon abgeleiteten Spaltprodukten, Polypeptiden oder Peptiden immobilisiert ist, und
B) ein Primerpaar mit den Sequenzen 5'- gtcagaacggtcaactttggg -3' und 5'- gttgtagggagtccagaagag -3' oder davon abgeleitete Strukturen
umfasst.
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