EP1904650A1 - Verfahren zur untersuchung von cytosin-methylierungen in dna - Google Patents

Verfahren zur untersuchung von cytosin-methylierungen in dna

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Publication number
EP1904650A1
EP1904650A1 EP06764209A EP06764209A EP1904650A1 EP 1904650 A1 EP1904650 A1 EP 1904650A1 EP 06764209 A EP06764209 A EP 06764209A EP 06764209 A EP06764209 A EP 06764209A EP 1904650 A1 EP1904650 A1 EP 1904650A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
methylation
specific
enrichment
enriched
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06764209A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Philipp Schatz
Matthias Schuster
Kurt Berlin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1904650A1 publication Critical patent/EP1904650A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting 5-methylcytosine in DNA.
  • 5-methylcytosine is the most abundant covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. It plays an important biological role, i.a. in transcriptional regulation, genetic imprinting and tumorigenesis (for review: Miliar et al .: Five not four: History and significance of the fifth base. In: The Epigenome, S. Beck and A. Olek (eds.), Wiley -VCH Verlag Weinheim 2003, pp. 3-20).
  • the identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest.
  • detection of methylation is difficult because cytosine and 5-methylcytosine have the same base pairing behavior. Many of the conventional hybridization-based detection methods are therefore unable to distinguish between cytosine and methylcytosine.
  • the methylation information is completely lost in a PCR amplification.
  • methylation-specific restriction enzymes are used, on the other hand there is a selective chemical conversion of non-methylated cytosines into uracil (so-called: bisulfite treatment, see for example: DE 101 54 317 A1, DE 100 29 915 A1).
  • methylation-specific primers or blockers should then ensure selective amplification of only the methylated (or, in the case of the reverse approach: unmethylated) DNA.
  • the use of methylation-specific primers is known as so-called "methylation-sensitive PCR"("MSP"; Herman et al .: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.) Proc Natl Acad 3; 93 (18): 9821-6).
  • a similarly sensitive method is the so-called “heavy methyl” method, in which specific amplification of only the originally methylated (or unmethylated) DNA is achieved by using methylation-specific blocker oligomers (for review: WO 02/072880) Heavy methyl are applicable as quantifiable real-time variants. It is possible to detect the methylation status of fewer positions directly in the course of PCR without the need for subsequent analysis of the products ("MethyLight" - WO00 / 70090; US 6,331,393) One embodiment is the "Taqman” method. This uses probe molecules that carry a fluorescent dye-quencher pair.
  • the probes hybridize sequence-specifically to the amplicons and are degraded by the exonuclease activity of the polymerase during the next cycle of amplification.
  • the separation of quencher and dye produces a detectable fluorescence signal (see, eg, Eads et al .: MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation, Nucleic Acids Res. 2000 Apr 15; 28 (8): E32).
  • Another MethyLight embodiment is the so-called Lightcycler method. In this case, two different probes are used, which hybridize in close proximity to each other to the amplificate, and then generate a detectable signal via fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the known amplification methods use primer or blocker sequences containing multiple methylation specific positions.
  • these sequence requirements only allow evidence of segregation. sequences in which a large number of CpG positions occur in a narrow sequence range. These sequence requirements limit the applicability of the methods.
  • an enrichment of the DNA to be amplified is carried out before the amplification.
  • the enrichment preferably takes place before the bisulfite conversion, but can also be carried out afterwards.
  • the enrichment leads to the fact that the disease-specific DNA can be detected more easily.
  • the enrichment preferably takes place according to three different principles.
  • the enrichment can be carried out in a methylation-specific manner, that is, the DNA of a specific methylation status is concentrated. This can be done, for example, via methylcytosine-binding proteins (see, for example, Cross et al., Nat Genet., 1994 Mar; 6 (3): 236-44.).
  • a sequence-specific purification takes place.
  • the enrichment is origin specific.
  • the DNA can be specifically isolated from tumor cells and then further isolated.
  • the three principles are combined. After purification, bisulfite conversion and amplification / detection are carried out conventionally. If the enrichment is carried out after the bisulfite conversion, sequence-specific and methylation-specific see purification on the same principle, since the methylation information was converted by the Biuslfit treatment in sequence information. Enrichment of the DNA to be detected reduces the risk of false positive results and thus allows a more specific detection of methylated cytosine positions.
  • Sensitive detection is understood below to mean a detection which allows the detection of 100 or fewer copies of methylated DNA against a backdrop of 1000 copies of unmethylated or less methylated DNA.
  • the method according to the invention is a method for the sensitive detection of cytosine methylations. These are understood to mean in the following processes which are capable of detecting certain methylation positions in the DNA with high sensitivity. Under Sensitive detection is understood below to mean a detection that allows the detection of 100 or fewer copies of methylated DNA against a background of 1000 copies of unmethylated or less methylated DNA.
  • the cytosine positions to be analyzed are already known. It is also already known with which biological state, for example with which disease, the methylation status of these positions correlates. It is different in the case of the so-called “discovery methods”, which are understood in the following to be methods for identifying or characterizing methylation positions, which are assumed to have a specific biological role Term "method for the sensitive detection of Cytosinmethyltechniken" not be included.
  • the enrichment takes place only after the conversion of the DNA. This procedure thus takes place in the following steps:
  • the amplificates are analyzed.
  • a biological sample is taken, from which the DNA is recovered.
  • the biological sample can come from different sources. Tissue samples, but also body fluids, in particular serum, serve as starting material for diagnostic questions. It is also possible to use sputum, stool, urine or cerebrospinal fluid.
  • DNA isolation is preferably carried out by standard methods, for example using blood from the Qiagen UltraSens DNA extraction kit.
  • the DNA to be detected is enriched.
  • the DNA to be detected is understood as meaning the sequence whose methylation status is to be analyzed.
  • Enrichment is understood to mean a process in which the concentration of the DNA to be detected is increased in comparison with the rest of the DNA.
  • the rest of the DNA depending on the enrichment process, is the background DNA (DNA of the same sequence, but of a different methylation status than the DNA to be detected), the DNA of another sequence, or the DNA from another source.
  • the enrichment is methylation-specific.
  • the DNA to be detected is enriched against the background DNA.
  • the methylation-specific enrichment can take place in different ways. Essentially, the DNA is contacted with substances that specifically bind methylated or unmethylated sequences. The binding can be both sequence-specific and sequence-unspecific (only via the methylated cytosines). After binding to the substances, the bound DNA can be separated from the unbound DNA. Depending on whether the DNA to be detected is methylated or unmethylated, the bound or unbound fraction can be further analyzed. As described above, methylation-specific binding of DNA to certain substances and subsequent separation of bound and unbound DNA is essential for methylation-specific enrichment.
  • methylation-specific enrichment should not include any methods in which the background DNA is degraded by means of methylation-specific restriction enzymes. Such a method is already described in the patent application DE 10 2005 011 398.2 and is not intended to be content of this application. Although a methylation-specific binding of the DNA to the restriction enzyme also takes place in this case. However, this binding is only a transitory state on the way to the enzymatic section. In the method according to the invention, however, a separation of the bound (uncut) DNA from the unbound DNA.
  • the enrichment takes place with the aid of proteins which bind to the DNA in a methylation-specific manner.
  • proteins which bind to the DNA in a methylation-specific manner.
  • Several such proteins are known, i.a. MeCP2, MBD1, MBD2, MBD4, and Kaiso (for review: Shiraishi et al., Methyl-CpG binding domain column chromatography to a tool for the analysis of genomic DNA methylation., Anal Biochem., 2004 Jun 1, 329 (1): 1-10.) Incorporated by reference in its entirety; Henrich et Tweedie: The methyl-CpG binding domain and the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet. 2003 May; 19 (5): 269-77; both incorporated by reference in its entirety).
  • proteins which specifically bind methylated DNA As well as proteins which bind specifically unmethylated DNA. Furthermore, it is possible to bind the DNA which is to be detected later. For this purpose, first the unbound DNA is separated, and then the bound DNA is released from the protein. It is also possible to bind the background DNA to the proteins and then remove them from the reaction mixture.
  • the protein binding and the separation of the bound and the unbound DNA can be done in different ways. For example, it is possible to bind the proteins to a solid surface, for example in the form of a column (see: Cross et al 1994, Nature Genetics VoI 6 236-244). The unbound DNA can then be removed by washing. It is also possible to allow the binding to the proteins in solution, and then to separate the DNA-protein complexes from the unbound DNA by conventional methods such as centrifugation or chromatography.
  • biotinylated or histidine-tagged proteins for example, Gretch et al 1987, Anal Biochem Vol 163 270-7 Janknecht et al., 1991, Proc Natl Acad Sei USA Vol 88 8972- 6)
  • the enrichment takes place via the so-called MBD column chromatography, which is described in detail in Shiraishi et al., 2004, supra. Reference is expressly made to this publication.
  • the methyl CpG-binding domain of the MeCP2 protein which specifically binds methylated but not unmethylated or hemimethylated cytosines can be used.
  • the corresponding, in vitro expressed domain can be bound to a modified agarose surface, for example via additional histidine residues.
  • the domain recognizes sequence-unspecific methylated CpG positions.
  • the binding of the methylated DNA to the column is carried out depending on the degree of methylation and the density of the CpG positions.
  • the bound methylated DNA molecules can then be eluted by increasing the salt concentration and then analyzed (see in detail: Shiraishi et al 2004, supra).
  • MDB proteins In addition to the abovementioned MDB proteins, it is also possible in principle to use further proteins which recognize DNA methylation-specifically. These include, for example, restriction enzymes or methyltransferases. It is conceivable that those parts of these enzymes which are responsible for the methylation-specific binding, without the corresponding active center for enrichment are used.
  • the enrichment takes place via methylation-specific antibodies.
  • Anti-5-methylcytosine antibodies have long been known and are commercially available (www.abcam.com, Abcam Ine, One Kendall Square, Bldg. 200, 3rd Floor, Cambridge, MA02139). These antibodies may also be bound to a column or bound to the DNA in solution via the known methods (see Fisher et al., Supra). ].
  • ChIP chromatin immunoprecipitation
  • the enrichment of the DNA to be analyzed is not methylation-specific, but sequence-specific.
  • sequence-specific enrichment preferably takes place via hybridization to complementary sequences. These are preferably bound to a surface, such as a solid phase or to particles.
  • Various variants of the enrichment are known to the person skilled in the art, for example using modified PNA or DNA oligomers which are immobilized, biotinylated or provided with magnetic particles (for example: Riccelli et al., Nucleic Acids Res.
  • the enriched sequences can then be eluted and converted to methylation-specific. However, it is possible to carry out the subsequent conversion, in particular a bisulfite conversion, directly at the surface (see below).
  • enrichment occurs according to the origin of the DNA.
  • this refers in particular to the cellular origin of the DNA.
  • the enrichment of the DNA takes place via the isolation of a specific type of cell. It is particularly preferred to isolate cancer cells from body fluids such as blood, urine or stool. In addition, it is also possible to enrich a specific cell type to later analyze the DNA, such as T cells.
  • FACS fluorescently or magnetically activated or immobilized antibodies
  • MACS for review: FACS Sorting: Immunberg et al., Clin Chem., 2002 Oct; 48 (10): 1819-27; MACS as Positive Selection: Qin et al., World J Gastroenterol 2004 May 15; 10): 1480-1486; MACS as a negative selection: Lara et al., Exp Hematol., 2004 Oct; 32 (10): 891-904).
  • DNA bound to subcellular fragments such as nucleosomes.
  • This is based on the consideration that in destructive pathological processes more DNA is released, which is still bound to cellular structures.
  • This can be enriched by the use of organ part specific cleaning method, z. Nuclei PURE Prep from Sigma Life Science Research (see also: Blobel et al 1966 Science VoI 154 1662-5) or by the enrichment of the nucleosomes (Whitlock et al 1976 Nucleic Acids Res VoI 3 2255 -66). It is also possible to specifically purify transcriptional complexes of individual genes (Pindolia et al 2005 J Mol Biol. VoI 349 922-32).
  • the abovementioned enrichment methods are combined with one another.
  • a methylation-specific enrichment for example with the aid of a methylation-specific antibody
  • the enriched DNA is converted to a methylation-specific manner by a chemical or enzymatic treatment.
  • methylation-specific restriction enzymes can be used for this purpose, for example in such a way that the interface is located within the region which is to be amplified later. An amplicon can only be formed if the DNA has not been cut.
  • the DNA is converted chemically or enzymatically such that unmethylated cytosine is converted into thymine or another base, which differs in the base-pairing behavior of cytosine, while Methyl cytosine remains unchanged.
  • the bisulfite conversion is known to the person skilled in the art in various variations (see for example: Frommer et al .: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands Proc Natl Acad See USA 1992 Mar 1; 89 (5): 1827-31 Olek, A modified and improved method for bisulphite-based cytosine methylation analysis Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24 (24): 5064- DE 100 29 915, DE 100 29 915.
  • the bisulfite conversion takes place in the presence of denaturing solvents, such as dioxane, and of a free-radical scavenger (cf .: DE 100 29 915.) Further preferred embodiments of the bisulfite conversion are described in German DE 103 47 396.3, DE 10347 397.1, DE 103 47 400.5 and DE 10347 399.8 In some cases, the bisulfite conversion is carried out on a solid phase (compare: PCT / DE02 / 04054, EP 03 019 321.3) kbar, if the enrichment was via a solid phase, the bisulfite conversion directly follow without a previous elution of the DNA.
  • the DNA is not converted chemically, but enzymatically.
  • cytidine Deaminases conceivable, the unmethylated cyidine implement faster than methylated cytidine.
  • a corresponding enzyme has recently been identified (Bransteitter et al .: Activation-induced cytidine deaminase deaminate deoxyncytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase.) Proc Natl Acad Be USA 2003 Apr 1; 100 (7): 4102-7, see: German Patent Application: 103 31 107.6).
  • the enrichment takes place after the conversion of the DNA.
  • sequence-specific and methylation-specific purification proceed on the same principle, since the methylation information was converted into sequence information by the bisulfite treatment.
  • sequential-specific purification the methods described above, in particular using modified DNA or PNA-OI oligomers, can be used. The above statements are expressly made.
  • the converted DNA is amplified and subsequently analyzed. Then it is possible to deduce the methylation status of the DNA.
  • ligase chain reactions DNA is amplified via a polymerase reaction.
  • a polymerase reaction Various embodiments are conceivable for this, for example the use of isothermal amplification methods.
  • particularly preferred are polymerase chain reactions (PCR).
  • PCR polymerase chain reactions
  • the PCR is performed using primers that bind specifically only to positions of the transformed sequence that were previously either methylated (or, in the reverse approach, unmethylated). This method is known for bisulfited DNA under the name methylation-sensitive PCR (MSP).
  • MSP methylation-sensitive PCR
  • primers which contain at least one 5'-CpG -3 'dinucleotide; preferred are primers which have at least three 5'- Carry CpG 3 'positions, at least one of which is located at the 3' end. Accordingly, 5'-TG-3 ' or 5 ' -CA-3 ' -dinucleotides are required for the amplification of the unmethylated sequences or of the counterstrands (cf. Herman et al .: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands Proc Natl Acad See USA 1996 Sep 3; 93 (18): 9821-6).
  • Another very particularly preferred embodiment is known for bisulfite-pretreated DNA under the name "heavy-methyl” method, whereby a specific amplification of only the originally methylated (or unmethylated) DNA is achieved by using at least one methylation-specific blocker oligomer .
  • the blocker binds to a 5 '- CG-3' (or 5 'TG-3' dinucleotide or 5 '-CA-3') dinucleotide, thus preventing the amplification of the background DNA, the embodiment can.
  • the selection of the polymerase or via the modification of the blocker oligomers be designed so that a degradation or an extension of the blocker is minimized (for review: WO 02/072880; Cottrell et al., A real-time PCR assay for DNA methylation using methylation -specific blockers, Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13; 32 (1): e10.).
  • the detection of the amplificates can be carried out by conventional methods, for example via length measurement methods such as gel electrophoresis, capillary gel electrophoresis and chromatography (for example HPLC). Mass spectrometry and sequencing methods such as the Sanger method, the Maxam-Gilbert method and sequencing by hybridization (SBH) can also be used.
  • the amplificates are detected by primer extension methods (see: Gonzalgo & Jones: Rapid Quantitation of Methylation Differences at Speeifie Sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res 15, 25 (12): 2529-31, DE 100 10 282, DE 100 10 280).
  • the amplicons are analyzed by hybridization to oligomer arrays (for an overview of ray technology, see the Extra Edition of: Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999).
  • the various oligomers may be disposed on a solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
  • the solid phase surface is preferably composed of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • nitrocellulose and plastics such as nylon, which may exist in the form of pellets or as resin matrices, are also possible.
  • the approximately fluorescently labeled amplicons are hybridized to the bound oligomers and the unbound fragments are removed.
  • the oligomers hybridize over a 12-22 base long section to the DNA to be analyzed and they comprise at least one CG, TG or CA dinucleotide.
  • the fluorescence signals can be scanned and processed with software programs (See, for example: Adorjan et al., Tumor class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis.) Nucleic Acids Res. 2002 Mar 1; 30 (5): e21) ,
  • the amplificates are analyzed using PCR real-time variants (see: Heid et al .: Real time quantitative PCR Genome Res. 1996 Oct; 6 (10): 986-94, US Pat. 6,331, 393 "methyl Light")
  • the amplification is carried out in the presence of a fluorescently labeled Reporteroligonukleotid that at a 5 -CG-3 -.
  • the reporter oligonucleotide preferably binds to the DNA to be examined and indicates its amplification by increasing or decreasing the fluorescence, whereby it is particularly advantageous if the fluorescence change is used directly for the analysis and the methylation state is deduced from the fluorenceenzyme signal
  • a particularly preferred variant is the "Taqman TM" method.
  • an additional fluorescently labeled Oligomer which hybridizes in the immediate vicinity of the first reporter oligonucleotide and which hybridization can be detected by means of fluorescence resonance energy transfer ("Lightcycler TM" method)
  • Lightcycler TM fluorescence resonance energy transfer
  • the person skilled in the art is familiar with further real-time variants, for example by means of lecular Beacons TM or Scorpion TM primers (see: DE 103 38 308)
  • the corresponding variants are also part of this invention.
  • a so-called QM assay is carried out.
  • the QM assay uses two methylation-unspecific primers and two different real-time probes, one of which is specific for the methylated and one specific for the unmethylated state.
  • the QM assay allows a very good quantification of methylation states.
  • the QM assay is described in detail in European Patent Application 04 090 213.2, to which reference is expressly made.
  • Another preferred embodiment of the invention is to amplify multiple fragments simultaneously by multiplex PCR. Care must be taken in their design that not only the primer, but also the other oligonucleotides used are not allowed to be complementary to each other, so that a high degree of multiplexing in this case is more difficult than usual.
  • enzymatically pretreated DNA has the advantage that, due to the different G and C contents of the two DNA strands, a forward primer can never function as a reverse primer, which in turn facilitates multiplexing and essentially obviates the disadvantage described above balances.
  • the detection of the amplificates is again possible via different methods. It is conceivable, for example, the use of real-time variants.
  • the sensitive detection takes place without prior amplification. This is possible, for example, if different purification methods are combined with each other. In this case, the chemical transformation of the DNA may not be required.
  • a sequence-specific capturing can take place, for example via a chip or with the aid of a specific transcription factor to which the sequence to be investigated binds, and subsequently detection of methylated sequences via a (eg fluorescence- or radioactively) labeled methylation-specific antibody.
  • a sequence-specific capturing can take place, for example via a chip or with the aid of a specific transcription factor to which the sequence to be investigated binds, and subsequently detection of methylated sequences via a (eg fluorescence- or radioactively) labeled methylation-specific antibody.
  • a (eg fluorescence- or radioactively) labeled methylation-specific antibody e.g fluorescence- or radioactively
  • a methylation-specific antibody can be coupled with an oligonucleotide.
  • the antibody binds to methylated sequences.
  • a second oligonucleotide binds sequentially and can be linked by a ligation reaction to the oligonucleotide attached to the antibody.
  • the newly formed product can be detected by PCR or LCR.
  • a particularly preferred use of the method of the invention is in the diagnosis of cancers or other diseases associated with a change in methylation status.
  • diseases include CNS malfunctions, aggression symptoms or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunctioning on and damage; Dysfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Dysfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Dysfunction, damage or disease of the body as a deviation in the development process; Dysfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or disease; Headache or sexual dysfunction.
  • the method according to the invention is also suitable for the prediction of undesired drug effects and for the differentiation of cell types or tissues or for the investigation of cell differentiation.
  • kits comprising at least one reagent for enriching the sequence to be analyzed and reagents for a bisulfite conversion, and optionally also a polymerase, primers and probes for amplification and detection is also included.
  • Suitable reagents for enriching the sequence to be analyzed are, in particular, methylation-specific binding proteins, which are preferably column-bound, biotinylated or provided with histidine tag. Furthermore, or modified PNA or DNA oligomers may be used which are preferably immobilized, biotinylated or modified with magnetic particles.

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum sensitiven und spezifischen Nachweis von Cytosinmethylierungen. Dabei wird die zu analysierende DNA zunächst angereichert. Die Anreicherung kann insbesondere methylierungsspezifisch, sequenzspezifisch oder herkunftsspezifisch erfolgen. Anschließend wird die angereicherte DNA methylierungsspezifisch umgewandelt. Die umgewandelte DNA kann über unterschiedliche Verfahren, insbesondere mittels Real-Time-PCR-Verfahren analysiert werden.

Description

Verfahren zur Untersuchung von Cytosin-Methylierungen in DNA
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von 5- Methylcytosin in DNA. 5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt eine wichtige biologische Rolle, u.a. bei der Transkriptionsregulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Miliar et al.: Five not four: History and significance of the fifth base. In: The Epigenome, S. Beck and A. Olek (eds.), Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20). Die Identifizierung von 5- Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichen Interesse. Ein Nachweis der Methylierung ist allerdings schwierig, da Cytosin und 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Viele der herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden Nachweisverfahren vermögen daher nicht zwischen Cytosin und Methylcytosin zu unterscheiden. Zudem geht die Methylierungsinformation bei einer PCR- Amplifikation vollständig verloren.
Die herkömmlichen Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylie- rungsspezifische Restriktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosinen in Uracil (sog.: Bisulfit-Behandlung, siehe etwa: DE 101 54 317 A1 ; DE 100 29 915 A1 ).
Da die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen durch die Sequenzspezifität der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten Anwendungen eine Bisulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht DE 100 29 915 A1 S.2, Zeilen 35-46). Die chemisch vorbehandelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff). Von großem Interesse sind dabei Verfahren, die in der Lage sind, Methylierung sensitiv und quantitativ zu detektieren. Dies gilt aufgrund der wichtigen Rolle der Cytosin-Methylierung in der Krebsentstehung insbesondere in Hinblick auf diagnostische Anwendungen. Von besonderer Bedeutung sind dabei Methoden, die es erlauben, abweichende Methylierungsmuster in Körperflüssigkeiten, etwa in Serum, nachzuweisen. Denn anders als die instabile RNA ist DNA oft in Körperflüssigkeiten anzutreffen. Bei destruktiven pathologischen Prozessen wie Krebserkrankungen ist die DNA-Konzentration im Blut sogar erhöht. Eine Krebsdiagnostik über eine Methylierungsanalyse von in Körperflüssigkeiten befindlicher Tumor-DNA ist also möglich und schon mehrfach beschrieben (siehe etwa: Palmisano et al.: Predicting lung Cancer by detecting aberrant promoter methylation in Sputum. Cancer Res. 2000 Nov 1 ;60(21 ):5954-8). Ein besonderes Problem besteht jedoch darin, dass sich in den Körperflüssigkeiten neben der DNA mit dem krankheitstypischen Methylierungsmuster eine große Menge an DNA der gleichen Sequenz aber eines anderen Methylierungsmusters befindet. Die Diagnoseverfahren müssen daher in der Lage sein, geringe Mengen besonders methylierter DNA vor einem starken Hintergrund an DNA derselben Sequenz aber eines anderen Methylierungsmusters (im folgenden: Hintergrund-DNA) nachzuweisen.
Die herkömmlichen Verfahren zur Methylierungsanalyse lösen dieses Problem nur eingeschränkt. Üblicherweise wird die chemisch vorbehandelte DNA mittels eines PCR-Verfahrens amplifiziert. Über die Verwendung methylie- rungsspezifischer Primer oder Blocker soll dann eine selektive Amplifikation nur der methylierten (bzw. bei umgekehrten Ansatz: unmethylierten) DNA gewährleistet werden. Der Einsatz methylierungsspezifischer Primer ist als sog. „methylierungssensitive PCR" bekannt („MSP"; Herman et al.: Methyla- tion-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6). Ein vergleichbar sensitives Verfahren ist die sogenannte „Heavy Methyl"-Methode. Dabei wird eine spezifische Amplifizierung nur der ursprünglich methylierten (bzw. unmethylierten) DNA durch Einsatz von methylierungsspezifischen Blocker- Oligomeren erreicht (zur Übersicht: WO 02/072880). Sowohl MSP wie Heavy Methyl sind als quantifizierbare Real-Time-Varianten anwendbar. Diese er- möglichen es, den Methylierungsstatus weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, ohne dass eine nachfolgende Analyse der Produkte erforderlich wäre („MethyLight" - WO00/70090; US 6,331 ,393). Eine Ausführungsform ist dabei das „Taqman"-Verfahren. Dieses verwendet Sondenmoleküle, die ein Fluoreszenzfarbstoff-Quencher-Paar tragen. Die Sonden hybridisieren sequenzspezifisch an die Amplifikate und werden im Zuge des nächsten Amplifikationszyklus durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase abgebaut. Durch die Trennung von Quencher und Farbstoff entsteht ein detektierbares Fluoreszenz-Signal (siehe etwa Eads et al.: MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res. 2000 Apr 15;28(8):E32). Eine weitere MethyLight-Ausführungsform ist das sog. Lightcycler-Verfahren. Dabei werden zwei unterschiedliche Sonden eingesetzt, die in unmittelbarer Nähe zueinander an das Amplifikat hybridisieren, und die dann über Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ein detektierbares Signal erzeugen.
Die Anwendbarkeit dieser Verfahren für einen sensitiven und spezifischen Nachweis methylierter DNA vor einem großen Hintergrund an unmethylierter DNA ist allerdings beschränkt. So besteht die Gefahr, dass es über eine unspezifische Amplifikation von Hintergrund-DNA zu falsch-positiven Ergebnissen kommt. Falsch positive Signale stellen jedoch eines der signifikantesten Probleme des Einsatzes der Methylierungstechnologie für die Krebs- Früherkennung dar. Eine Erhöhung der Spezifität des Methylierungsnach- weises bedeutet daher einen bedeutsamen Schritt für die Entwicklung entsprechender Früherkennungstests. Eine zuverlässige, kommerzielle Nutzung der Methylierungsanalyse im Bereich der Tumor-Frühdiagnostik wird so erleichtert.
Um die Spezifität des Methylierungsnachweises zu erhöhen, verwenden die bekannten Verfahren für die Amplifiktion Primer- oder Blockersequenzen, in denen mehrere methylierungsspezifische Positionen enthalten sind. Diese Sequenzanforderungen erlauben allerdings nur einen Nachweis von Se- quenzen, in denen in einem engen Sequenzbereich eine Vielzahl von CpG- Positionen auftreten. Diese Sequenzanforderungen schränken die Anwendbarkeit der Verfahren ein.
Aufgrund der genannten besonderen biologischen und medizinischen Bedeutung der Cytosin-Methylierung und aufgrund der oben erwähnten Nachteile des Standes der Technik besteht ein großes technisches Bedürfnis an der Entwicklung leistungsfähiger Methoden zur sensitiven und spezifischen Me- thylierungsanalyse. Im folgenden ist ein überraschend einfaches Verfahren beschrieben, mit dem die Sensitivität und Spezifität des Methylierungsnach- weises erhöht werden kann.
Erfindungsgemäß wird vor der Amplifikation eine Anreicherung der zu ampli- fizierenden DNA durchgeführt. Die Anreicherung erfolgt bevorzugt vor der Bisulfitumwandlung, kann aber auch danach durchgeführt werden. Die Anreicherung führt dazu, dass die krankheitsspezifische DNA einfacher nachgewiesen werden kann. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Anreicherung nach drei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen kann die Anreicherung methylierungsspezifisch durchgeführt werden, dass heißt, die DNA eines bestimmten Methylierungsstatus wird aufkonzentriert. Dies kann etwa über Me- thylcytosin-bindende Proteine erfolgen (siehe etwa: Cross et al. Nat Genet. 1994 Mar;6(3):236-44.). In einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsart erfolgt eine sequenzspezifische Anreinigung. Dabei werden nur bestimmte Sequenzen aufgereinigt, etwa solche, von denen bekannt ist, dass bei ihnen eine Veränderung des Methylierungsstatus mit einer Krankheit assozziiert ist. In einer dritten erfindungsgemäßen Ausführungsart erfolgt die Anreicherung herkunftsspezifisch. So kann etwa die DNA speziell aus Tumorzellen isoliert und anschließend weiter isoliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die drei Prinzipien kombiniert. Nach der Aufreinigung erfolgen in herkömmlicher Weise Bisulfitumwandlung und Amplifikation/Detektion. Wird die Anreicherung nach der Bisulfitumwandlung durchgeführt, so erfolgen sequenzspezifische und methylierungsspezifi- sehe Aufreinigung nach demselben Prinzip, da die Methylierungsinformation durch die Biuslfitbehandlung in Sequenzinformation umgewandelt wurde. Die Anreicherung der nachzuweisenden DNA verringert die Gefahr falsch positiver Ergebnisse und erlaubt so einen spezifischeren Nachweis von methylier- ten Cytosinpositionen.
Einige der erfindungsgemäßen Anreicherungsmethoden sind schon im Zusammenhang mit einer Methylierungsanalyse beschrieben. So ist es etwa bekannt, die DNA vor einer Methylierungsanalyse mit Methylcytosin- bindenden Antikörper aufzureinigen (etwa über Antikörper-Säule: Fisher et al. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 9;32(1 ):287-97.).
Gleichwohl ist dieses Anreicherungsverfahren bislang nur zur Identifizierung bisher unbekannter Methylierungspositionen eingesetzt worden. Noch nicht bekannt ist dagegen eine Verwendung dieses Verfahren zum sensitiven Nachweis von Cytosinpositionen, deren Assoziation mit einer Krankheit bereit bekannt ist.
Unter sensitivem Nachweis wird im folgenden einen Nachweis verstanden, der die Detektion von 100 oder weniger Kopien methylierter DNA vor einem Hintergrund 1000er Kopien unmethylierter oder geringer methylierter DNA erlaubt .
Aufgrund der besonderen Bedeutung der Methylierungsanalyse für die Tumor-Frühdiagnostik und aufgrund der Nachteile der bekannten Verfahren stellt das Eröffnen dieser vorteilhaften, neuen und überraschend einfachen Technologie einen wichtigen technischen Fortschritt dar.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren zum sensitiven Nachweis von Cytosinmethylierungen. Hierunter werden im folgenden Verfahren verstanden, die in der Lage sind, bestimmte Methylierungspositionen in der DNA mit hoher Empfindlichkeit nachzuweisen. Unter sensitivem Nachweis wird im folgenden ein Nachweis verstanden, der die Detektion von 100 oder weniger Kopien methylierter DNA vor einem Hintergrund 1000er Kopien unmethylierter oder geringer methylierter DNA erlaubt.
Bei den Verfahren zur sensitiven Detektion sind die Cytosinpositionen, die analysiert werden sollen, bereits bekannt. Auch ist bereits bekannt, mit welchem biologischen Zustand, etwa mit welcher Krankheit, der Methylie- rungsstatus dieser Positionen korreliert. Anders ist es dagegen bei den sog. „Discovery-Methoden". Hierunter werden im folgenden Verfahren verstanden, die zur Identifizierung oder zur genaueren Charakterisierung von Methylie- rungspositionen dienen, von denen eine bestimmte biologische Rolle vermutet wird. Diese Discovery-Methoden sollen von dem Begriff der „Verfahren zum sensitiven Nachweis von Cytosinmethylierungen" nicht umfasst sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur sensitiven Methylierungsanalyse verläuft in folgenden Schritten:
1 ) es wird eine biologische Probe entnommen,
2) die nachzuweisende DNA wird angereichert,
3) die DNA wird durch eine chemische oder enzymatische Behandlung methylierungsspezifisch umgewandelt,
4) die umgewandelte DNA wird amplifiziert,
5) die Amplifikate werden analysiert.
In einer alternativen Ausführungsform erfolgt die Anreicherung erst nach der Umwandlung der DNA. Dieses Verfahren erfolgt also in folgenden Schritten:
1 ) es wird eine biologische Probe entnommen,
2) die DNA wird durch eine chemische oder enzymatische Behandlung methylierungsspezifisch umgewandelt,
3) die nachzuweisende DNA wird angereichert,
4) die angereicherte DNA wird amplifiziert,
5) die Amplifikate werden analysiert. Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine biologische Probe entnommen, aus der die DNA gewonnen wird. Dabei kann die biologische Probe je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Fragestellungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben, aber auch Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum. Möglich ist auch, Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit zu verwenden. Zunächst erfolgt bevorzugt die DNA-Isolierung nach Standardverfahren, aus Blut etwa unter Verwendung des Qiagen UltraSens DNA Extraktions-Kits.
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die nachzuweisende DNA angereichert. Unter der nachzuweisenden DNA wird diejenige Sequenz verstanden, deren Methylierungsstatus analysiert werden soll. UnterAnreicherung wird ein Prozess verstanden, bei dem die Konzentration der nachzuweisende DNA im Vergleich zu der übrigen DNA erhöht wird. Bei der übrigen DNA handelt es sich je nach Anreicherungsprozess um die Hintergrund-DNA (DNA derselben Sequenz, aber eines anderen Methylierungsstatus als die nachzuweisende DNA), um die DNA einer anderen Sequenz, oder um die DNA aus einem anderen Ursprung.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Anreicherung methylierungsspezifisch. Dabei wird die nachzuweisende DNA gegenüber der Hintergrund DNA angereichert. Die methylie- rungsspezifische Anreicherung kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Im wesentlichen wird die DNA mit Substanzen in Kontakt gebracht, die spezifisch methylierte oder unmethylierte Sequenzen binden. Dabei kann die Bindung sowohl sequenzspezifisch wie auch sequenzunspezifisch (nur über die methylierten Cytosine) erfolgen. Nach der Bindung an die Substanzen kann die gebundene DNA von der ungebundenen DNA abgetrennt werden. Je nachdem ob die nachzuweisende DNA methyliert oder unmethyliert ist, kann die gebundene oder die ungebundene Fraktion weiter analysiert werden. Wie oben beschrieben ist die methylierungsspezifische Bindung der DNA an bestimmte Substanzen und die anschließende Trennung von gebundener und ungebundener DNA wesentlich für die methylierungsspezifische Anreicherung. Von dem Begriff der methylierungsspezifischen Anreicherung sollen keine Verfahren umfasst sein, in denen die Hintergrund-DNA mittels methy- lierungsspezifischer Restriktionsenzyme abgebaut wird. Ein solches Verfahren ist bereits in der Patentanmeldung DE 10 2005 011 398.2 beschrieben und soll nicht Inhalt dieser Anmeldung sein. Zwar findet auch hierbei eine methylierungsspezifische Bindung der DNA an das Restriktionsenzym statt. Diese Bindung ist allerdings nur ein vorübergehender Zustand auf dem Weg zum enzymatischen Schnitt. Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt dagegen eine Trennung der gebundenen (ungeschnittenen) DNA von der ungebundenen DNA.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen unterschiedliche Substanzen, die methylierungsspezifisch an die DNA binden, in Betracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anreicherung mit Hilfe von Proteinen, die methylierungsspezifisch an die DNA binden. Mehrerer solcher Proteine sind bekannt, u.a. MeCP2, MBD1 , MBD2, MBD4 und Kaiso (zur Übersicht: Shiraishi et al Methyl-CpG binding domain column chroma- tography as a tool for the analysis of genomic DNA methylation. Anal Bio- chem. 2004 Jun 1 ;329(1 ):1-10.) incorporated by reference in its entirety; Henrich et Tweedie: The methyl-CpG binding domain and the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet. 2003 May;19(5):269-77; both incorporated by reference in its entirety).
Mit Hilfe von Proteinen, die methylierungsspezifisch an die DNA binden, kann auf unterschiedliche Weise eine methylierungsspezifische Anreicherung erfolgen. So ist sowohl möglich, Proteine einzusetzen, die spezifisch methylier- te DNA binden, wie auch Proteine, die spezisch unmethylierte DNA binden. Weiterhin ist es möglich, diejenige DNA zu binden, die später nachgewiesen werden soll. Dazu wird zunächst die ungebundene DNA abgetrennt, und anschließend die gebundene DNA von dem Protein gelöst. Auch ist es möglich, die Hintergrund-DNA an die Proteine zu binden und dann aus dem Reaktionsansatz zu entfernen.
Die Protein-Bindung und die Trennung der gebundenen und der ungebundenen DNA kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. So ist es etwa möglich, die Proteine an eine feste Oberfläche, etwa in Form einer Säule zu binden (vgl.: Cross et al 1994, Nature Genetics VoI 6 236-244). Die nicht gebundene DNA kann dann durch Waschschritte entfernt werden. Auch ist es möglich, die Bindung an die Proteine in Lösung erfolgen zu lassen, und anschließend die DNA-Proteine-Komplexe über gängige Methoden wie etwa über eine Zentrifugation oder eine Chromatographie von der ungebundenen DNA zu trennen. Dem Fachmann sind die anzuwendenden biochemischen Methoden vertraut, etwa unter Verwendung biotinylierter oder mit Histidin-tag versehenen Proteinen (etwa. Gretch et al 1987, Anal Biochem VoI 163 270-7 Janknecht et al. 1991 , Proc Natl Acad Sei U S A VoI 88 8972-6)
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anreicherung über die sogenannte MBD-Säulenchromatographie, die im Detail bei Shirais- hi et al, 2004, a.a.o, beschrieben wird. Auf diese Publikation wird ausdrücklich verwiesen.
Dabei kann etwa die Methyl-CpG-bindende Domäne des MeCP2-Proteins verwendet werden, die spezifisch methylierte, aber nicht unmethylierte oder hemimethylierte Cytosine bindet. Die entsprechende, in vitro exprimierte Domäne kann etwa über zusätzliche Histidin-Reste an eine modifizierte Aga- rose-Oberfläche gebunden werden. Die Domäne erkennt sequenzunspezi- fisch methylierte CpG-Positionen. Die Bindung der methylierten DNA an die Säule erfolgt dabei in Abhängigkeit von dem Methylierungsgrad und der Dichte der CpG-Positionen. Die gebundenen methylierten DNA-Moleküle können anschließend über eine Erhöhung der Salzkonzentration eluiert and anschließend analysiert werden (siehe im Detail: Shiraishi et al 2004, a.a.O.).
Daneben ist es auch möglich, die ungebundene, unmethylierte Fraktion zu analysieren.
Nach dem oben genannten Prinzip können auch andere Proteine, die methy- lierungsspezifisch an DNA binden, für die Anreicherung eingesetzt werden, insbesondere Proteine, die sequenzspezifisch an CpG-Positionen binden, etwa mit Hilfe des Kaiso-Proteines, das symmetrisch methylierte CpGpCpG- Positionen erkennt.
Neben den oben genannten MDB-Proteinen können prinzipiell auch weitere Proteine eingesetzt werden, die DNA methylierungsspezifisch erkennen. Hierzu gehören etwa Restriktionsenzyme oder Methyltransferases. Es ist denkbar, dass diejenigen Teile dieser Enzyme, die für die methylierungsspe- zifische Bindung verantwortlich sind, ohne das entsprechende aktive Zentrum für eine Anreicherung eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anreicherung über methylierungsspezifische Antikörper. Anti-5-Methylcytosin-Antikörper sind seit längerem bekannt und kommerziell erhältlich (www.abcam.com; Abcam Ine; One Kendall Square; Bldg. 200, 3rd Floor; Cambridge,MA02139). Diese Antikörper können ebenfalls an eine Säule gebunden werden oder über die bekannten Verfahren in Lösung an die DNA gebunden werden (siehe Fisher et al a.a.O.). ].
Auch ist es denkbar, wenn auch wegen des experimentellen Aufwandes nicht bevorzugt, zur Anreicherung eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) durchzuführen (Details zu dieser Methode sind dem Fachmann bekannt und finden sich etwa in Matarazzo et al: In vivo analysis of DNA methylation pat- tems recognized by specific proteins: coupling CHIP and bisulfite analysis. Biotechniques. Oct;37(4):666-8, 670, 672-3. 2004).
Neben Proteine können erfindungsgemäß auch weitere Substanzen eingesetzt werden, die in der Lage sind, methylierungsspezifisch an die DNA zu binden. Hierzu gehören etwa triplex-bildende PNA- oder DNA-Oligomere. Entsprechende Oliogomere sind ausführlich in der Patentanmeldung PCTVE P04/06534 (Anmelderin: Epigenomics AG) beschrieben. Dort finden sich auch Beschreibungen mit weiteren Literaturhinweisen, wie man Triplex- bindende Moleküle zur Isolierung von methylierter DNA nutzen kann (sog. „Triple Helix-Affinitätschromatographie").
In einer zweiten besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Anreicherung der zu analysierenden DNA nicht methylierungsspezifisch, sondern sequenzspezifisch. So können spezifisch diejenigen Sequenzen angereichert werden, deren Methylierungsstatus mit einer Krankheit oder einer anderen biologischen Fragestellung korreliert ist. Die anderen Sequenzen werden dagegen aus dem Reaktionsansatz entfernt. Die sequenzspezifische Anreicherung erfolgt bevorzugt über eine Hybridisierung an komplementäre Sequenzen. Diese sind bevorzugt an eine Oberfläche, etwa eine Festphase oder an Partikel gebunden. Dem Fachmann sind unterschiedliche Varianten der Anreicherung bekannt, etwa unter Verwendung von modifizierten PNA bzw. DNA-OI igomeren, die etwa immobilisiert, biotinyliert oder mit Magnetpartikeln versehen sind (z. B.: Riccelli et al. Nucleic Acids Res. 2001 Feb 15;29(4):996-1004). Die angereicherten Sequenzen können anschließend eluiert und methylierungsspezifisch umgewandelt werden. Möglich ist es allerdings, die nachfolgende Umwandlung, insbesondere eine Bisulfitumwand- lung, direkt an der Oberfläche durchzuführen (s.u.).
Schließlich erfolgt die Anreicherung in einer dritten besonders bevorzugten Ausführungsform nach dem Ursprung der DNA. Darunter wird im folgenden insbesondere der zelluläre Ursprung der DNA verstanden. In einer bevorzug- ten Ausführungsform erfolgt dabei die Anreicherung der DNA über die Isolierung einer bestimmten Art von Zellen. Dabei ist es besonders bevorzugt, Krebszellen aus Körperflüssigkeiten, etwa aus Blut, Urin oder Stuhl zu isolieren. Daneben ist es auch möglich einen bestimmten Zelltyp anzureichern, um später die DNA zu analysieren, etwa T-Zellen.
Zur Isolierung von Zellen sind dem Fachmann unterschiedliche Verfahren bekannt, etwa unter Verwendung fluoreszens- bzw. magnetisch aktivierte oder immobilisierte antikörper, z. B. FACS oder MACS (zur Übersicht: FACS Sorting: Herzenberg et al. Clin Chem. 2002 Oct;48(10):1819-27.; MACS als positive Selektion: Qin et al. World J Gastroenterol 2004 May 15;10(10):1480-1486; MACS als Negativselektion: Lara et al. Exp Hematol. 2004 Oct;32(10):891 -904).
Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, DNA zu isolieren, die an subzelluläre Fragmente gebunden ist, etwa an Nukleosomen. Dem liegt die Überlegung zugrunde, dass in destruktiven pathologischen Prozessen vermehrt DNA freigesetzt wird, die noch an zelluläre Strukturen gebunden ist. Diese lässt sich durch die Verwendung von Organeil spezifischen Reinigungsverfahren anreichern, z. B. mit einem Nuclei Isolations Kit: Nuclei PURE Prep der Firma Sigma Life Science Research (vgl. auch: Blobel et al 1966 Science VoI 154 1662-5) oder durch die Anreicherung der Nukleosomen (Whitlock et al 1976 Nucleic Acids Res VoI 3 2255-66). Es ist auch möglich Transkriptionskomplexe einzelner Gene gezielt aufzureinigen (Pindolia et al 2005 J Mol Biol. VoI 349 922-32).
In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die oben genannten Anreicherungsmethoden miteinander kombiniert. So ist es etwa möglich, zunächst eine methylierungsspezifische Anreicherung durchzuführen (etwa mit Hilfe eines methylierungsspezifischen Antikörpers), und danach (eventuell nach einem Fragmentierungsschritt) eine sequenzspezifisches Capturing anzuschließen. Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die angereicherte DNA durch eine chemische oder enzymatische Behandlung methylie- rungsspezifisch umgewandelt. Zum einen können hierfür methylierungsspezi- fische Restriktionsenzyme eingesetzt werden, etwa in der Form, dass die Schnittstelle innerhalb des Bereiches lokalisiert ist, der später amplifiziert werden soll. Es kann nur dann ein Amplifikat gebildet werden, wenn die DNA nicht geschnitten wurde. Einzelheiten zu diesem Prinzip sind dem Fachmann bekannt (vgl. etwa DE 1020040297002) In eine bevorzugten Ausführungsform wird die DNA jedoch chemisch oder enzymatisch so umgewandelt, dass unmethyliertes Cytosin in Thymin oder eine andere Base überführt wird, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, während Methylcytosin unverändert bleibt. Bevorzugt wird dabei eine chemische „Bi- sulfitbehandlung" durchgeführt. Die Bisulfitumwandlung ist dem Fachmann in unterschiedlichen Variationen bekannt (siehe etwa: Frommer et al.: A geno- mic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA Strands. Proc Natl Acad Sei U S A. 1992 Mar 1 ;89(5):1827-31 ; Olek, A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24):5064- 6.; DE 100 29 915; DE 100 29 915). Besonders bevorzugt erfolgt die Bisulfitumwandlung in Gegenwart von denaturierenden Lösemitteln, etwa Dioxan, und eines Radikalfängers (vgl.: DE 100 29 915). Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Bisulfitumwandlung sind in den deutschen Patentanmeldungen DE 103 47 396.3; DE 10347 397.1 ; DE 103 47 400.5 und DE 10347 399.8 beschrieben. Teilweise wird die Bisulfitumwandlung an einer festen Phase durchgeführt (vgl.: PCT/DE02/04054; EP 03 019 321.3). Daher ist es denkbar, wenn die Anreicherung über eine Festphase erfolgte, die Bisulfitumwandlung direkt im Anschluß ohne eine vorherige Elution der DNA durchzuführen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die DNA nicht chemisch, sondern enzymatisch umgewandelt. Dies ist etwa durch Einsatz von Cytidin- Deaminasen denkbar, die unmethylierte Cyidine schneller umsetzen als me- thylierte Cytidine. Ein entsprechendes Enzym ist kürzlich identifiziert worden (Bransteitter et al.: Activation-induced cytidine deaminase deaminates deo- xycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 Apr 1 ;100(7):4102-7; vgl.: Deutsche Patentanmeldung: 103 31 107.6).
In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Anreicherung nach der Umwandlung der DNA. In diesem Fall erfolgen sequenzspezifische und methylierungsspezifische Aufreinigung nach demselben Prinzip, da die Methylierungsinformation durch die Bisulfitbehand- lung in Sequenzinformation umgewandelt wurde. Zur sequennzspezifischen Aufreinigung können die oben beschriebenen Verfahren, insbesondere unter Einsatz von modifizierten DNA oder PNA-OI igomeren, verwendet werden. Auf die obigen Ausführungen wird ausdrücklich verwiesen.
Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die umgewandelte DNA amplifiziert und anschließend analysiert. Danach kann auf den Methy- lierungsstatus der DNA geschlossen werden.
Dem Fachmann sind unterschiedliche Verfahren zur Amplifikation von DNA bekannt, etwa Ligasekettenreaktionen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA allerdings über eine Polymerasereaktion amplifiziert. Hierzu sind verschiedene Ausgestaltungen denkbar, etwa die Verwendung isothermer Amplifikationsverfahren. Besonders bevorzugt sind allerdings PoIy- merasekettenreaktionen (PCR). In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die PCR unter Verwendung von Primern, die spezifisch nur an Positionen der umgewandelten Sequenz binden, die vorher entweder methyliert (oder bei umgekehrtem Ansatz: unmethyliert) waren. Dieses Verfahren ist bei bisulfitierter DNA unter dem Namen methylierungssensitive PCR bekannt (MSP). Dabei werden Primer verwendet, die mindestens ein 5'- CpG -3' Dinukleotid enthalten; bevorzugt sind Primer, die mindestens drei 5'- CpG- 3'-Positionen tragen, von denen mindestens eine am 3' Ende lokalisiert ist. Für die Amplifikation der unmethylierten Sequenzen bzw. der Gegenstränge sind dementsprechend 5'-TG-3' oder 5'-CA-3'-Dinukleotide erforderlich (Vgl.: Herman et al.: Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei U S A. 1996 Sep 3;93(18):9821-6).
Eine andere ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist für Bisulfit- vorbehandelte DNA unter dem Namen „Heavy-Methyl"-Methode bekannt. Dabei wird eine spezifische Amplifizierung nur der ursprünglich methylierten (bzw. unmethylierten) DNA durch Einsatz mindestens eines methylie- rungsspezifischen Blocker-Oligomers erreicht. Der Blocker bindet an ein 5'- CG-3' (bzw. 5'-TG-3'-Dinukleotid oder 5'-CA-3')-Dinukleotid und verhindert so die Amplifikation der Hintergrund-DNA. Die Ausführungsform kann über die Auswahl der Polymerase oder über die Modifikation der Blockeroligomere so ausgestaltet sein, dass ein Abbau oder eine Verlängerung der Blocker minimiert wird (zur Übersicht: WO 02/072880; Cottrell et al., A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1 ):e10.).
Die Detektion der Amplifikate kann über herkömmliche Verfahren erfolgen, etwa über Methoden der Längenmessung wie Gelelektrophorese, Kapillargelelektrophorese und Chromatographie (z. B. HPLC). Auch Massenspektro- metrie und Methoden zur Sequenzierung wie die Sanger-Methode, die Ma- xam-Gilbert-Methode und Sequencing by Hybridisation (SBH) können verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Amplifikate durch Primer-Extension-Verfahren nachgewiesen (siehe etwa: Gonzalgo & Jones: Rapid quantitation of methylation differences at speeifie Sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15;25(12):2529-31 ; DE 100 10 282; DE 100 10 280). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die die Amplifikate mittels Hybridisierung an Oligomer-Arrays analysiert (ein Überblick über Ar- ray-Technologie befindet sich in der Extraausgabe von: Nature Genetics Supplement, Volume 21 , January 1999). Auf einem solchen Array können die verschiedenen Oligomere auf einer Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein. Die Festphasenoberfläche ist bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch sind auch Nitrocellulose und Kunststoffe wie Nylon, die in Form von Pellets oder auch als Harz- Matrizes existieren können, möglich. Die etwa fluoreszenzmarkierten Amplifikate werden an die gebundenen Oligomers hybridisiert und die nicht gebundenen Fragmente entfernt. Vorteilhaft ist es dabei, wenn die Oligomere über einen 12-22 Basen langen Abschnitt an die zu analysierende DNA hybridisieren und sie mindestens ein CG, TG oder CA Dinukleotid umfassen. Die Fluoreszenz-Signale können gescannt und mit Software-Programmen verarbeitet werden (Siehe etwa: Adorjan et al., Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res. 2002 Mar 1 ;30(5):e21 ).
Ganz besonders bevorzugt werden die Amplifikate unter Verwendung von PCR-Real-Time-Varianten analysiert (vgl.: Heid et al.: Real time quantitative PCR. Genome Res. 1996 Oct;6(10):986-94, US Patent No. 6,331 ,393 „Methyl-Light"). Dabei wird die Amplifikation in Gegenwart eines fluoreszenzmarkierten Reporteroligonukleotid durchgeführt, das an ein 5 -CG-3 - Dinukleotid (bzw. 5'-TG-3'- oder 5'-CA-3'-Dinukleotid) hybridisiert. Das Reporteroligonukleotid bindet dabei bevorzugt an die zu untersuchende DNA und zeigt deren Amplifikation durch Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenz an. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Fluoreszenzveränderung direkt zur Analyse benutzt wird und aus dem Fluorenzenzsignal auf einen Methylierungszustand geschlossen wird. Eine besonders bevorzugte Variante ist dabei das „Taqman™"-Verfahren. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzliches fluoreszenzmarkiertes Oligomer verwendet, das in unmittelbarer Nähe zu dem ersten Reporteroli- gonukleotid hybridisiert und sich diese Hybridisierung mittels Fluoreszenz- Resonanz-Energietransfer nachweisen lässt („Lightcycler™ "-Verfahren). Dem Fachmann sind weitere Real-Time-Varianten bekannt, etwa mittels Mo- lecular Beacons™ oder Scorpion™ -Primerm (vgl.: DE 103 38 308). Die entsprechenden Varianten sind ebenfalls Teil dieser Erfindung.
In einer andere besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen wird ein sogenannter QM-Assay durchgeführt. Der QM-Assay benutzt zwei methylierungsunpezifische Primer und zwei unterschiedliche Real-Time- Sonden, von denen eine spezifisch für den methylierten und eine spezifisch für den unmethylierten Status ist. Der QM-Assay erlaubt eine sehr gute Quantifizierung von Methylierungszuständen. Der QM-Assay ist ausführlich in der Europäischen Patentanmeldung 04 090 213.2 beschrieben, auf die ausdrücklich verwiesen wird.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist es, mehrere Fragmente gleichzeitig mittels einer Multiplex-PCR zu amplifizieren. Bei deren Design muss darauf geachtet werden, daß nicht nur die Primer, sondern auch die weiteren eingesetzten Oligonukleotide nicht zueinander komplementär sein dürfen, so dass eine hochgradige Multiplexierung in diesem Fall schwieriger ist als in üblich. Jedoch hat man bei der enzymatisch vorbehandelten DNA den Vorteil, dass aufgrund des unterschiedlichen G und C- Gehaltes der beiden DNA-Stränge ein Forward-Primer niemals auch als Reverse-Primer fungieren kann, was die Multiplexierung wiederum erleichtert und den oben beschriebenen Nachteil im wesentlichen ausgleicht. Die Detektion der Amplifikate ist wiederum über unterschiedliche Verfahren möglich. Denkbar ist dabei etwa die Verwendung von Real-Time-Varianten. Für Amplifikationen von mehr als vier Genen empfiehlt es sich aber, die Amplifikate auf andere Weise zu detektieren. Bevorzugt ist dabei eine Analyse über Arrays (s.o.). In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der sensitive Nachweis ohne vorherige Amplifikation. Dies ist etwa möglich, wenn unterschiedliche Aufreinigungsmethoden miteinander kombiniert werden. In diesem Fall kann auch die chemische Umwandlung der DNA nicht erforderlich sein. So kann zunächst ein sequenzspezifisches Capturing erfolgen, etwa über einen Chip oder mit Hilfe eines spezifischen Transkriptionsfaktors an dem die zu untersuchende Sequenz bindet, und anschließend ein Nachweis methylierter Sequenzen über einen (z. B. Fluoreszenz- oder radioaktiv) markierten methylierungsspezifischen Antikörper. In der Regel wird es notwendig sein das Signal zu verstärken. Dies kann durch verzweigte Sonden erfolgen, die in Form einer Baumstruktur sowohl targetspezifische Sequenzabschnitte als auch Sequenzanteile für die Signalerzeugung aufweisen. An diese binden dann Detektionssonden die enzymatisch markiert sind (z. B. Alkalische Phosphatase). Alternativ können mehrere Signalskaskaden miteinander gekoppelt werden (z. B. Alkalische Phosphatase mit Alkoholde- hydrogenase und Diaphorase siehe: Johannsson 1985 Clin Chim Acta VoI 148 119-24)
Alternativ kann ein Methylierungsspezifischer Antikörper mit einem Oligo- nukleotid gekoppelt werden. Der Antikörper bindet an methylierte Sequenzen. Ein zweites Oligonukleotid bindet sequenspezisch und kann mit Hilfe einer Ligationsreaktion mit dem Oligonukleotid, das an dem Antikörper hängt verbunden werden. Das neu entstandene Produkt kann mit Hilfe einer PCR oder LCR nachgewiesen werden.
Eine besonders bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten. Hierzu gehören u.a. CNS-Fehlfunktionen, Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunkti- on und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Erfindungsgemäß ist schließlich auch ein Kit, der aus mindestens einer Reagenz zur Anreicherung der zu analysierende Sequenz und aus Reagenzien für eine Bisulfitumwandlung besteht, sowie optional auch eine Polymerase, Primer und Sonden für eine Amplifkation und Detektion enthält.
Als Reagenzien zur Anreicherung der zu analysierenden Sequenz kommen dabei insbesondere methylierungspezifisch bindende Proteine in Betracht, die bevorzugt Säulengebunden, biotinyliert oder mit Histidintag versehen sind. Weiterhin können oder modifizierte PNA bzw. DNA-Oligomere verwendet werden, die bevorzugt immobilisiert, biotinyliert oder mit Magnetpartikeln modifiziert sind.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur sensitiven Methylierungsanalyse, dadurch gekenn- zeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) es wird eine biologische Probe entnommen, b) die nachzuweisende DNA wird angereichert, c) die angereicherte DNA wird durch eine chemische oder enzymati- sche Behandlung methylierungsspezifisch umgewandelt, d) die umgewandelte DNA wird amplifiziert, e) die Amplifkate werden analysiert.
2. Verfahren zur sensitiven Methylierungsanalyse, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) es wird eine biologische Probe entnommen, b) die DNA wird durch eine chemische oder enzymatische Behandlung methylierungsspezifisch umgewandelt, c) die nachzuweisende DNA wird angereichert, d) die angereicherte DNA wird amplifiziert, e) die Amplifikate werden analysiert.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biologischen Probe um Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung methylierungsspezifisch erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Anrei- cherung mit Hilfe von Proteinen erfolgt, die methylierungsspezifisch an die DNA binden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung mit Hilfe von MeCP2, MBD1 , MBD2, MBD4 oder Kaiso erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung über MBD-Säulenchromatographie erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass methylie- rungsspezifische Antikörper erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anreicherung sequenzspezifisch erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeich- net, dass die Anreicherung nach dem Ursprung der DNA erfolgt.
11. Verfahren nach einem Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass Krebszellen aus Körperflüssigkeiten angereichert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass DNA angereichert wird, die an subzelluläre Fragmente gebunden ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzichnet, dass die DNA an Nukleosomen gebunden ist.
14. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung mittels einer Bisulfitumwand- lung erfolgt.
15. Verfahren nach einem der vorangegangen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels einem der folgenden Verfahren erfolgt: Heavy Methyl™, MSP; MethyLight™ oder QM.
16. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Anreicherungsverfahren miteinander kombiniert werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch kennzeichnet, dass eine Ampli- fikation der angereicherten DNA nicht erfolgt.
18. Verfahren nach Anpruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine che- mische Umwandlung der DNA nicht erforderlich ist
19. Verfahren zur sensitivem Nachweis von Cytosinmethylierungen, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: a) es wird eine biologische Probe entnommen, b) die nachzuweisende DNA wird über ein sequenzspezifisches
Capturing angereichert, c) die angereicherte DNA wird über einen methylierungsspezifi- schen Antikörper nachgewiesen
20. Verwendung der Verfahren nach Ansprüchen 1-19 zur Diagnose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methy- lierungsstatus assoziierten Krankheiten.
21. Verwendung der Verfahren nach Ansprüchen 1-19 zur Vorhersage von unerwünschten Arzneimittelwirkungen, zur Unterscheidung von
Zelltypen und Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
22. Ein Kit, der aus mindestens einer Reagenz zur Anreicherung der zu analysierende Sequenz und aus Reagenzien für eine Bisulfitumwand- lung besteht, sowie optional auch eine Polymerase, Primer und Sonden für eine Amplifkation und Detektion enthält.
23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Reagenzien zur Anreicherung um methylierungspezifisch bindende Proteine handelt, die säulengebunden, biotinyliert oder mit einem Histidintag versehen sind.
24. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass dass es sich bei den Reagenzien zur Anreicherung um modifizierte PNA bzw. DNA- Oligomere handelt, die immobilisiert, biotinyliert oder mit Magnetparti- kein versehen sind.
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