EP1893199A2 - Modulatoren der pdz-domäne - Google Patents
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- EP1893199A2 EP1893199A2 EP06722837A EP06722837A EP1893199A2 EP 1893199 A2 EP1893199 A2 EP 1893199A2 EP 06722837 A EP06722837 A EP 06722837A EP 06722837 A EP06722837 A EP 06722837A EP 1893199 A2 EP1893199 A2 EP 1893199A2
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Classifications
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Definitions
- the invention relates to novel substances which bind to the PDZ domain of proteins, uses of substances,. which bind to the PDZ domain of proteins, as well as means to identify compounds that bind to the PDZ domain of a protein.
- the PDZ domain was originally identified as a common member in three structurally related proteins, PSD-95 / SAP90, DLG and ZO-I (Garner et al., TRENDS IN CELL BIOL., 6: 429-433 (1996)). Craven et al., CELL, 93: 495-498 (1998); Hutter et al., NEURO SCI Res., 32: 1-7 (1998)).
- the PDZ domain is also called DLG Homologieregion
- DHR Downlink Reduction Function
- GLGF Repeat GLGF Repeat
- the latter is due to the presence of a Gly-Leu-Gly-Phe sequence motif.
- the PDZ domain comprises about 90 amino acids, and crystallographic studies on PSD-95, SAP97, and CASK show that it consists of two alpha helixes and six beta sheets
- PDZ domains which occur 785 times in 436 different human genes, belong to one of the most important protein classes in the human genome (Kay et al., Chemistry & Biology, 11: 423- 424 (2004)). PDZ domains control the localization, clustering, recycling and cell membrane expression of many receptor, transport and ion channel proteins (Dev, KK, Nat., Rev. Drug Discov 3: 1047-1056 (2004)).
- PDZ domains By recruiting downstream proteins into signaling pathways, PDZ domains mediate the formation of specific multi-protein complexes. Proteins containing PDZ domains play important roles in many key pathways, including maintenance of polarity and morphology of epithelial cells, organization of postsynaptic density in neural cells, and regulation of membrane protein activity and transport. It follows that substances which bind to the PDZ domain can specifically modulate such proteins or protein complexes and consequently have a particular therapeutic potential.
- blocking of the second PDZ domain of the MAGI3 protein has been shown to be threefold by irreversible small molecule synthetic inhibitors Increasing the activity of a cancer-relevant enzyme in a cell culture model [Fujii et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 12074-12075. (2003)).
- the invention is therefore based on the technical problem of specifying compounds which are capable of binding to the PDZ domain of a protein where, in the absence of a modulator, the interaction with natural protein ligands takes place. Furthermore, the invention is based on the technical problem of specifying means for identifying such compounds.
- the invention teaches the use of a compound according to formula I.
- C1 to C5 includes alkyl, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, tert-pentyl and neopentyl.
- R 1 is -NO 2 or -Hal
- R 2 and R 3 are the same or different and are -H or -Hal
- -Hal is -F, -Cl, -Br, or -J
- free valencies of the rings are bonded to hydrogen , or a physiologically acceptable salt of such a compound for the preparation of a pharmaceutical composition for modulating a PDZ domain-containing protein.
- R 1, R 2 and R 3 are -Hal, especially -Cl, and / or when R 1 is -NO 2, wherein R 2 and R 3 are -H.
- a pharmaceutical composition of the invention is prepared by mixing the compound in a physiologically effective dose with at least one excipient or carrier.
- Suitable counterions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
- Suitable solid or liquid galenic preparation forms are for instance granulates, "powders, dragees, tablets, (micro) capsules,"'suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or solutions for injection (previous ip, im, sc) or Nebulization (aerosols), transdermal systems, as well as preparations with protracted release of active ingredient, in the preparation of conventional auxiliaries such as carriers, blasting, binding, coating, swelling, lubricants or lubricants, flavoring agents, sweeteners and solubilizers, are used.
- As adjuvants may be magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents such as sterile water and monohydric or polyhydric alcohols, for example glycerol.
- animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil
- polyethylene glycols and solvents such as sterile water and monohydric or polyhydric alcohols, for example glycerol.
- Examples of possible indications include cancer, schizophrenia, depression and anxiety, Parkinson's disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, epilepsy, chronic and neuropathic pain, aberrations of hormone-regulated food intake.
- PDZ domains play an important role in the modulation of proteins associated with these diseases (Dev, KK, Nat Rev. Drug Discov 3: 1047-1056 (2004)).
- the above compounds bind to the PDZ domain of proteins and are therefore capable of modulating the relevant proteins or the complexes formed in the cell by these proteins, i.e.. to activate or inhibit. For example, it will be advisable to inhibit those proteins which are differentially expressed as being differentially expressed in a disease such as a cancer, e.g. disease-related upregulated or downregulated, have proven.
- the invention further provides a method for identifying a modulator of a PDZ domain-containing protein, wherein a structural model of a modulator candidate is optionally first compared with a structural model of a reference compound which binds to the PDZ domain and is preselected on overlapping bioisosterer atoms, and wherein the structural model of the optionally preselected modulator candidate is compared with a structural model of the protein or a structural model of a complex of protein and modulator candidate is examined and it is determined whether the modulator candidate binds to the PDZ domain, wherein the Structural model of the protein or the complex derived i) from structural coordinates of the complex with the reference compound, ii) a PDZ-containing fragment of the complex with the reference compound, or a homolog to i) or ii).
- prospective compounds especially compounds with a molecular weight below 5000 to 1000 or less, as it were "tried” to the structural model of the PDZ domain or the protein. If a binding is detected by the comparison, the prospective compound is selected and may then be subjected to further attempts to develop pharmaceutical compositions.
- the protein in the complex takes on a special conformation, which does not occur in all previously published structural models of PDZ domains and has a new hydrophobic binding pocket, which can make a decisive contribution to the binding strength of modulator candidate. Therefore, the structural coordinates of the protein of the invention in complex with compound 1 present the protein in a particular small molecule binding conformation of the present invention which is advantageous for the success of the method of the invention.
- the comparison can thus pattern the structural model of the complex of protein with compound 1 to bring new, unknown test compounds into association with bound compound 1.
- This method is referred to as ligand-based virtual screening. If bioisosteric atoms of a modulator candidate overlap with the atoms of compound 1 without repulsive overlapping with the protein, the modulator candidate can be identified as a new modulator. If a modulator candidate, in addition to the aforementioned conditions, fills one or more other binding pockets of the protein which are not covered by compound 1, then the modulator candidate can be identified as a new modulator having higher affinity and / or higher specificity.
- the comparison may thus comprise connecting the structural model of the candidate candidate, after a pre-comparison of the modulator candidate with compound 1, with the structural model of the protein, based on the structural coordinates of the complex according to the invention, optionally with the free binding energy of the bond between modulator candidate and Protein is determined, and at low free binding energy, a high binding probability is detected.
- the free binding energy can be calculated: a) by summation of the free energies of interatomic contacts between the structural model of the modulator candidate and the structural model of the protein, and / or b) by determining the free binding energy between the force field of the modulator candidate and the Force field of the protein.
- the invention accordingly also relates to the use of the structural coordinates in the small molecule binding conformation with compound 1 i) of the protein AF6, ii) a fragment of AF6 containing a PDZ domain, or iii) a homolog to i) or ii) for the identification of a modulator a PDZ domain-containing protein, preferably in a screening method of the invention.
- the invention further comprises a machine-readable storage medium containing machine-readable data which, when read and processed by a data processing system with a suitable program, provides a representation of the structural model of a protein or a complex according to the invention, a computer program with a program code for carrying out a method according to the invention or a use according to the invention, and a
- Data processing system comprising a computer program according to the invention and a machine-readable storage medium according to the invention.
- Example 1 Substances according to the invention
- FIGS. 1A, 1B, 2A, 2B show the novel compounds 1 - 2, 4 - 7, 16 and 21 according to the invention, which bind to the PDZ domain of the protein AF6.
- FIGS. 1A, 1B, 2A, 2B show the previously known compounds 3, 8, 9-15 and 17-20, which are suitable for the uses according to the invention, since they likewise bind to the PDZ domain of the protein AF ⁇ .
- FIGS. 3A to 3D show compounds which are not compounds according to the invention because they do not bind to the PDZ domain of the protein AF ⁇ .
- Binding to the PDZ domain show the following compounds: 1, 7, 9, 6 and 2.
- Example 2 Substances which can also be used according to the invention
- Figures 4 and 5 show further compounds useful in the invention that bind to the PDZ domain.
- the explanations given in Example 1 apply correspondingly to the markings.
- the compounds in FIG. 2B can be prepared according to Example 3.1 using 2, 4-thiazolidinediones instead of 2, 4-thioxothiazolidines-one.
- Example 3.3 Synthesis of compounds 1-5 in Fig. IA and connections 26 and 28 in FIG. 3A.
- the compounds in FIG. 1B can be prepared according to Example 3.2 followed by the following process steps: A 2.0 molar solution of lithium borohydride (2.2 equivalents) in tetrahydrofuran (THF) is added with stirring to a solution of 5-arylidenes-2,4-thiazolidinedionene in pyridine and THF under nitrogen atmosphere at room temperature. The mixture is heated to reflux until the reduction reaction is complete (about 3 to 5 hours). The mixture is then cooled, carefully added to a dilute hydrochloric acid solution in distilled water at 5 ° C and extracted several times with ethyl acetate. The ethyl acetate extracts are combined, washed with water, dried over MgSO 4 and concentrated on a rotary evaporator. The crude product is purified by silica gel flash chromatography, resulting in the final product.
- THF tetrahydrofuran
- Compounds 31 and 32 in Figure 3B can be prepared as follows: To a mixture of N-methylrhodanine (0.735 g, 5 mmol) and aryl-aldehyde (5 mmol) in a minimum volume of dichloromethane is potassium fluoride on aluminum (2 g). The solvent is removed under reduced pressure and the remaining solids are irradiated with microwave at 150 ° C. for 10 min. The reaction products are extracted with dichloromethane, filtered through Celite and concentrated. The crude product is purified by silica gel flash chromatography, resulting in the final product.
- Compound 16 in Figure 2A can be prepared as follows: A mixture of 2,4-thioxothiazolidines-one (0.66 g, 5 mmol), 4 '- (trifluoromethyl) -acetophenone (0.94, 5 mmol), piperidine (0.40 mL , 4 mmol) and THF is irradiated for 10 min at 100 0 C with microwaves. The crude product is purified by silica gel flash chromatography, resulting in the final product.
- the compound 6 in FIG. 1A can be prepared according to Example 3.7, followed by the further synthesis route according to Example 3.9.
- Compounds 35-37 in Fig. 3C can be prepared as follows: A mixture of 5- (4- Trifluoromethylbenzylidenes) -4-oxo-2-thiazolidinethionene (10 mmol) in aqueous NaOH (2%, 25 mL) is treated with methyl iodide (Compound 35), isopropyl iodide (Compound 36) or p-methoxybenzyl iodide (Compound 37) (11 mmol each). stirred at room temperature overnight. The crude product is purified by silica gel flash chromatography, resulting in the final product.
- Trifluoromethylbenzylidene) -4-oxo-2-thiazolidinethione (1 mmol) and 2-dimethylamino-ethylamine or 3-phenylpropylamine (1 mmol) in THF (1.5 mL) is irradiated for 15 min at 120 0 C with microwaves.
- the crude product is purified by silica gel Fla-sh chromatography, resulting in the final product.
- a complex of the human protein AF6 with compound 1 of Figure IA was examined by NMR spectroscopy for its 3D structure. Specifically, this was done as follows: The 15N and 15N / 13C isotope-labeled protein of the PDZ domain of AF6 was prepared as previously described [Boisguerin, P. et al., Chem. Biol. 11: 449-459 (2004)]. , For NMR protein backbone assignment, a Sample of 1.3 mM 15N / 13C-labeled PDZ domain in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 50 mM NaCl, Complete [R] protease inhibitor and 10% (v / v) D2O.
- NMR spectra were recorded at 300 K on a Bruker DRX600 spectrometer with a Z-gradient inverse triple-resonance probe.
- the NMR raw data were processed with the software XWIN-NMR and analyzed by Sparky software.
- the triple-resonance NMR experiments CBCA (CO) NNH / CBCANNH and HA (CO) NNH / HANNH as well as some side-chain selective experiments as in [Wiedemann, U. et al., J. MoI Biol. , 343 (3): 703-18 (2004)].
- Interproton distances for the 3D structure determination were obtained by recording and evaluating the following NMR experiments: 3D-15N-NOESY-HSQC (80ms) and 3D-13C-NOESY-HMQC (80ms).
- 3D structural models were calculated using the software Cyana [Guntert P., Mol Biol., 278: 353-78 (2004)].
- the 20 lowest-energy 3D structural models were analyzed using the software MOLMOL [Koradi R, et al. , J Mol. Graph., 14 (1): 51-5, 29-32 (1996)] and the PROCHECK-NMR software [Laskowski RA, et al. , J Biomol NMR, 8 (4): 477-8 ⁇ (1996)].
- the protein coordinates of the lowest-energy structural model from the calculation with the software Cyana as well as the protein-ligand-interproton Distances from the NMR experiments were used as input data for computer-assisted docking of the ligand-protein complex.
- a 2 nanoseconds Molecular Dynamics simulation of the input data in an octahedrally limited water box was performed with the help of the software AMBER 8.0.
- the final coordinates of the protein-ligand complex are shown in Table 1.
- Figures 6A, 6B and 6C show the obtained structural models for the complex of Compound 1 and the PDZ domain of AF6.
- the protein backbone ensemble of the 20 lowest energy structural models in Figure 6A shows a small standard deviation of the coordinates in the secondary structural elements, i. a good quality of the structural model in these regions important for ligand binding.
- the protein backbone band model of the averaged structure from the 20 lowest energy structures complexed with compound 1 (Figure 6B) is in the same orientation as shown in Figure 6A.
- Figure 6B The protein backbone band model of the averaged structure from the 20 lowest energy structures complexed with compound 1
- Figure 6A The protein backbone band model of the averaged structure from the 20 lowest energy structures complexed with compound 1
- Figure 6B is in the same orientation as shown in Figure 6A.
- the secondary structural elements folding sheet ß2 and helix ⁇ 2 which are important for the binding of natural peptide ligands, are characterized.
- FIG. 6C The surface representation of the PDZ domain in complex with compound 1 (FIG. 6C), which is likewise shown in the same orientation as in FIGS. 6A and 6B, shows how in particular the trifluoromethylphenyl radical of compound 1 is transformed into a compound Ties binding pocket of the protein. Many atoms of this residue are almost or completely van der Waals to atoms of the protein, suggesting that no substituents with more than two carbon atoms are allowed at these positions. This result is consistent with the non-binding compounds 29 and 30 in Fig. 3A. By looking at the structural model in FIG.
- FIG. 8 shows, for a systematic selection of test compounds, which changes in binding affinity and binding site occupancy are experimentally obtained using the method.
- Each column in Figure 8 shows the amino acid residues of the PDZ Domain of AF6, the backbone amide resonances on addition of the indicated compound in 8 to 10-fold excess ligand in the NMR assay previously described show chemical shift changes.
- amino acid residues are abbreviated by the internationally common 1-letter code.
- the numbering of the amino acid residues is identical to the numbering in the protein-ligand complex in Table 1.
- the chemical shift changes are divided into the 2 categories “large (bold italic font)” and "small. (Normal font)”. From the amino acid residues shown, the binding site of a compound on the protein can be reconstructed by highlighting in detail the backbone amide atoms of these amino acid residues in the 3D protein structure of Table 1 and forming the largest common intersection of all of these atoms on the protein surface.
- Kd values for the PDZ domains of AF ⁇ and syntrophin are shown in Table 2. Given that the two PDZ domains are low drugability proteins, the Kd value of 101 ⁇ M for compound 1
- ATOM 31 HDl2 ILE 2 0.539 -5.667 -6.901 1.00 0.00
- ATOM 38 CA ILE 3 5.204 -5.732 -7.516 1.00 0.00
- ATOM 112 HD21 LEU 7 -7.223 7.570 2. 078 1.00 0.00
- ATOM 181 CA ASN 11 11,076 7,481 6,104 1.00 0.00
- ATOM 182 C ASN 11 -9,560 7,071 5,943 1.00 0.00
- ATOM 238 HD22 LEU 15 2.297 -4.240 2.494 1.00 0.00
- ATOM 241 HD12 LEU 15 4.113 -2.433. 0.845 1.00 0.00
- ATOM 268 HD12 ILE 17 4.613 0.033 5.767 1.00 0.00
- ATOM 362 CD GLN 25 20.919 -8.988 -0.209 1.00 0.00
- ATOM 434 CA ILE 30 7.208 -3.174 0.922 1.00 0.00
- ATOM 442 HB ILE 30 5,579 -1,872 1,174 1.00 0.00
- ATOM 446 HD12 ILE 30 5.201 0.391 -0.454 1.00 0.00
- ATOM 453 CA TYR 31 5.820 -6.773 1.012 1.00 0.00
- ATOM 651 CA GLY 45 10,600 -4,113 -2,949 1.00 0.00
- ATOM 658 CA ARG 46 11.916 -7.465 -1.351 1.00 0.00
- ATOM 673 HD3 ARG 46 16.508 -6.477 -1.054 1.00 0.00
- ATOM 674 HD2 ARG 46 -15.943 -8.015 -1.524 .00 0.00
- ATOM 702 C ALA 48 -5,586 -9,925 600, 00 0.00
- ATOM 721 CA GLY 50 -0.022 -10.861 1. 457 1.00 0.00
- ATOM 740 CA GLN 52.305 -6.576 -2.497 1.00 0.00
- ATOM 768 HD21 LEU 53 1., 246 1.072 -1.860 1.00 0.00
- ATOM 834 CA GLY 58 0.351 6.755 -10.376 00 0.00
- ATOM 841 CA ARG 59 3,493 6,324 -9,836 1.00 0.00 ATOM .842 C ARG 59 4.089 5.377 -8.834 1..00 0.00
- ATOM 892 HD13 LEU 61 6. 111 6,002 -1 857 00 0.00
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verbindungen, welche an die PDZ-Domäne von Proteinen mit PDZ-Domänen binden, Verwendungen solcher Verbindungen sowie Screening Verfahren zur Identifizierung solcher Verbindungen.
Description
Modulatoren der PDZ-Domäne
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Substanzen, welche an die PDZ- Domäne von Proteinen binden, Verwendungen von Substanzen, . welche an die PDZ-Domäne von Proteinen binden, sowie Mittel zur Identifizierung von Verbindungen, welche an die PDZ- Domäne eines Proteins binden.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
Die PDZ-Domäne wurde ursprünglich als .gemeinsames Element in drei strukturell verwandten Proteinen identifiziert, nämlich PSD-95/SAP90, DLG und ZO-I (Garner et al.., TRENDS IN CELL BIOL., 6:429-433 (1996); Craven et al . , CELL, 93:495-498 (1998); Hutter et al . , NEURO SCI. Res., 32:1-7 (1998)). Die PDZ-Domäne wird auch als DLG Homologieregion
(DHR) oder GLGF Repeat bezeichnet. Letzteres beruht auf der Gegenwart eines Gly-Leu-Gly-Phe-Sequenzmotivs . Die PDZ- Domäne umfasst ca. 90 Aminosäuren, und kristallografische Untersuchungen an PSD-95, SAP97 und CASK zeigen, dass sie aus zwei Alpha-Helixen und sechs Beta-Sheets gebildet ist
(Daniels et al., NAT. STRUCT. BIOL. 5:317-325 (1998); Doyle et al., CELL, 85:1067-1076 (1996)).
PDZ Domänen, die 785 mal in 436 verschiedenen humanen Genen vorkommen, gehören zu einer der wichtigsten Proteinklassen im humanen Genom (Kay et al., Chemistry & Biology, 11:423-
424 (2004) ) . PDZ Domänen kontrollieren die Lokalisierung, das Clustering, das Recycling und die Zellmembranexpression von vielen Rezeptor-, Transport- und Ionenkanal-Proteinen (Dev, K. K., Nat. Rev. Drug Discov. 3:1047-1056 (2004)).
Durch Rekrutierung von Downstream-Proteinen in Signalisierungs-Pathways vermitteln PDZ-Domänen die Bildung spezifischer Multi-Proteinkomplexe. Proteine, welche PDZ- Domänen enthalten, spielen wichtige Rollen in vielen Schlüssel-Pathways, einschließlich Erhaltung der Polarität und Morphologie von Epithelzellen, Organisierung der postsynaptischen Dichte in neuralen Zellen, und Regulierung der Aktivität und Transport von Membranproteinen. Hieraus folgt, dass Substanzen,, welche an die PDZ-Domäne binden, solche Proteine bzw. Proteinkomplexe gezielt 'modulieren können und folglich ein besonderes therapeutisches Potenzial haben.
Dieses Prinzip der Modulierung von PDZ-Domänen konnte durch blockierende Peptid-Liganden in verschiedenen Zellkultur- und Tiermodellen gezeigt werden (Dev, K. K., Nat. Rev. Drug Discov. 3:1047-1056 (2004)). So konnten fokale Hirnschädigungen durch Ischämie in einem Ratten-Tiermodell durch Peptid-Liganden reduziert werden, die die Interaktion zwischen der PDZ-Domäne des Protein PSD-95 und N-Methyl-D- aspartatrezeptoren (NMDARs) blockieren, was einen neuen Ansatzpunkt zur Therapie von Schlaganfällen darstellt (Aarts et al., Science 298:846-850 (2002)). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Blockierung der zweiten PDZ-Domäne des Proteins MAGI3 durch irreversible, synthetische Kleinmolekül-Inhibitoren zu einer dreifachen
Steigerung der Aktivität eines Krebs-relevanten Enzyms in einem Zellkulturmodell führt [Fujii et al., J. Am. Chem. Soc. 125:12074-12075. (2003)).
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde Verbindungen anzugeben, welche in der Lage sind, dort an die PDZ-Domäne eines Proteins zu binden, wo in Abwesenheit eines Modulators die Interaktion mit natürlichen Protein- Liganden stattfindet. Des Weiteren liegt der Erfindung das technische Problem zugrunde, Mittel zur Identifizierung solcher Verbindungen anzugeben.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I
Formel I
wobei Rl und R2 =0 oder =S und gleich oder verschieden
sind, wobei R2 alternativ für zwei -H stehen kann, wobei R3 =CHR4, -CH2R4 oder -CHR5R4 ist, wobei R4 Phenyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes Phenyl; 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl, 2- , 3-, 4-, oder 5-Furyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Furyl; oder C1-C5 Alkyl, • linear oder verzweigt, ist, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -I ist, wobei R5 C1-C5 Alkyl, linear oder verzeigt, oder -CH2-CO- N(R6)2 mit R6 = C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, wobei das. Ring -S- ersetzt sein kann durch -0-, -CH2- oder -CO-, oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins.
Generell umfasst der Begriff Cl bis C5 Alkyl Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, tert-Pentyl und Neopentyl.
Bevorzugte Substanzen sind dadurch gekennzeichnet, dass Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist, und/oder dass R4 3-Thienyl, Phenyl, oder mit -HaI, vorzugsweise -Br, in para substituiertes Phenyl ist, und/oder dass Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2R4 oder -CHR5R4 ist, und R4
3-Furyl oder mit -CHalß, vorzugsweise -CF3, in para substituiertes Phenyl ist, wobei R5 Methyl oder -CH2-CO- N (CH3) 2 ist, und/oder dass Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist,
wobei R3 =CH-R4 ist, und/oder R4 Isopropyl oder mit -CHal3, vorzugsweise -CF3, in meta oder para substituiertes Phenyl ist, und/oder Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2-R4 ist, und wobei R4 mit -HaI, insbesondere -Br, oder mit - CHal3, insbesondere -CF3 in para substituiertes Phenyl ist.
Des weiteren lehrt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel II
Formel II
wobei Rl -HaI oder C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei R2 -H ist, und wobei R3 -NO2, -HaI, C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei an Stelle von Rl und R2 ein Ring mit -CH=CHaI-CH=CH- gebildet sein kann, oder wobei an Stelle von R2 und R3 ein Ring mit -CH=CH-CH=CH- gebildet sein kann, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins.
Dann ist bevorzugt, wenn R3 -Br oder tertiär-Butyl ist, und/oder Rl -Cl, -Br, oder tertiär-Butyl ist, und/oder wenn Rl -Br ist, wobei an Stelle von R2 und R3 ein Ring mit - CH=CH-CH=CH- gebildet ist, und/oder wenn R3 -Br ist, wobei an Stelle von Rl und R2 ein Ring mit -CH=CBr-CH=CH- gebildet ist.
Des Weiteren lehrt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel III
Formel III
wobei Rl -NO2 oder -HaI ist, wobei R2 und R3 gleich oder verschieden und -H oder -HaI sind, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei freie Valenzen der Ringe mit Wasserstoff gebunden sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins.
Dann ist es bevorzugt, wenn Rl, R2 und R3 -HaI, insbesondere -Cl sind, und/oder wenn Rl -NO2 ist, wobei R2 und R3 -H sind.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird hergestellt, indem die Verbindung in physiologisch wirksamer Dosis mit zumindest einem Hilfs- oder Trägerstoff gemischt wird.
Diese galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen 1 pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium in Frage. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate," Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln,"' Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.V., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole) , transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat , Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt.
Als Indikationen kommen beispielsweise in Frage: Krebs, Schizophrenie, Depressionen -und Angstzustände, Parkinson' sehe Krankheit, Huntington' sehe Krankheit, Alzheimer' sehe Krankheit, Epilepsie, chronischer und neuropathischer Schmerz, Aberrationen der Hormon regulierten Nahrungsaufnahme. PDZ-Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der Modulierung von Proteinen, die mit diesen Erkrankungen assoziiert sind (Dev, K. K., Nat . Rev. Drug Discov. 3:1047-1056 (2004)).
Eine Mehrzahl der vorstehend genannten und unter die Formel I fallenden Verbindungen sind aus dem Stand der Technik nicht bekannt. Daher lehrt die Erfindung auch eine Verbindung gemäß Formel I
Formel I wobei Rl und R2 =0 oder =S und gleich oder verschieden sind, wobei R2 alternativ für zwei -H stehen kann, wobei R3 =CHR4, -CH2R4 oder -CHR5R4 ist, wobei R4 Phenyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes Phenyl; 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach
oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl, 2- , 3-, 4-, oder 5-Furyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Furyl; oder C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei R5 C1-C5 Alkyl, linear oder verzeigt, oder
-CH2-CO-N (R6) 2 mit Rβ = C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, wobei R4 nicht 2-Furyl oder 2-Thienyl ist, wenn Rl =0 oder =S ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei R4 nicht Phenyl oder mit -CF3 oder -Br in meta oder para substituiertes Phenyl ist, wenn Rl =0 oder =S ist, wenn R2 =0 ist, und wenn R3 =CH-R4 oder -CH2~R4 ist, wobei R4 nicht
Phenyl ist, wenn Rl =0 oder =S ist, wenn R2 =0 ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei R4 nicht mit -Br in para substituiertes Phenyl ist, wenn Rl und R2 =0 sind, und wenn R3 -CH2-R4 ist, wobei R4 nicht Isopropyl ist, wenn Rl =S ist, wenn R2 =0 ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei das Ring -S- ersetzt sein kann durch -0-, -CH2- oder -CO-, oder physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung.
Hierbei ist es bevorzugt, wenn Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist, und/oder wenn R4 3-Thienyl, Phenyl, oder mit -HaI, vorzugsweise -Br, in para substituiertes Phenyl ist und/oder wenn Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2-R4 ist, und R4 3-Furyl oder mit -CHal3, vorzugsweise -CF3, in para substituiertes Phenyl ist und/oder wenn Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist, und/oder wenn R4 Isopropyl oder mit -CHal3, vorzugsweise -CF3, in meta oder para substituiertes Phenyl
ist, und/oder wenn Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 - CH2~R4 ist, und wobei R4 mit -HaI, insbesondere -Br, oder mit -CHal3, insbesondere -CF3 in para substituiertes Phenyl ist, und wobei R5 Methyl oder -CH2-CO-N (CH3) 2 ist, und/oder wenn Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CHR5R4 ist, und wobei R4 mit -HaI, insbesondere -Br, oder mit -CHal3, insbesondere -CF3 in para substituiertes Phenyl ist, und wobei R5 Methyl oder -CH2-CO-N (CH3) 2 ist.
Die vorstehenden Verbindungen binden an die PDZ-Domäne von Proteinen und sind daher geeignet, die betreffenden Proteine bzw. die in der Zelle durch -diese Proteine gebildeten Komplexe zu modulieren, i.e. zu aktivieren oder zu inhibieren. So wird es sich beispielsweise empfehlen, solche Protein zu inhibieren, welche sich als bei einer Erkrankung, beispielsweise einer Krebserkrankung, als differentiell exprimiert, i.e. krankheitskorreliert hoch- oder heruntereguliert, erwiesen haben.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung eines Modulators eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins, wobei ein Strukturmodell eines Modulatorkandidaten optional zunächst mit einem Strukturmodell einer Referenzverbindung, welche an die PDZ- Domäne bindet, verglichen und bei Überlappung bioisosterer Atome vorselektiert wird, und wobei das Strukturmodell des ggf. vorselektierten Modulatorkandidaten mit einem Strukturmodell des Proteins verglichen oder ein Strukturmodell eines Komplexes aus Protein und Modulatorkandidat untersucht und bestimmt wird, ob der Modulatorkandidat an die PDZ Domäne bindet, wobei das
Strukturmodel des Proteins oder des Komplexes hergeleitet ist i) aus Strukturkoordinaten des Komplexes mit der Referenzverbindung, ii) eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Fragmentes des Komplexes mit der Referenzverbindung, oder eines Homologen zu i) oder ii) . Es handelt sich also im Kern um eine Strukturmodelbasiertes Screeningverfahren, wobei prospektive Verbindungen, insbesondere Verbindungen mit einem Molekulargewicht unter 5000 bis zu 1000 oder weniger, gleichsam "anprobiert" werden an das Strukturmodell der PDZ-Domäne bzw. des Proteins. Wird durch den Vergleich eine Bindung festgestellt, so wird die prospektive Verbindung ausgewählt und kann dann weiteren Versuchen zur Entwicklung pharmazeutischer Zusammensetzungen unterworfen werden.
Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass das Strukturmodell des Proteins bzw. des Komplexes mit einer Referenzverbindung erhalten ist, welche Verbindung 1 (Formel I, mit Rl = =S, R2 = =0, R3 = - CH2-R4 und R4 = mit CF3 in para substituiertes Phenyl) ist. Hierbei nimmt das Protein im Komplex eine besondere Konformation ein, die in allen bislang publizierten Strukturmodellen von PDZ-Domänen nicht vorkommt und eine neue hydrophobe Bindetasche aufweist, welche einen entscheidenden Beitrag zur Bindungsstärke von Modulatorkandidaten leisten kann. Daher präsentieren die erfindungsgemäßen Strukturkoordinaten des Proteins im Komplex mit Verbindung 1 das Protein in einer besonderen erfindungsgemäßen Kleinmolekül-Bindungskonformation, die für den Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft ist.
Der Vergleich kann folglich das Strukturmodel des Komplexes des Proteins mit Verbindung 1 als Muster nehmen, um neue, unbekannte Testverbindungen mit der gebundenen Verbindung 1 in Deckung zu bringen. Dieses Verfahren wird als Liganden- basiertes Virtuelles Screening bezeichnet. Überlappen hierbei bioisostere Atome eines Modulatorkandidaten mit den Atomen von Verbindung 1, ohne dass repulsive Überlappungen mit dem Protein stattfinden, kann der Modulatorkandidat als neuer Modulator identifiziert werden. Füllt ein Modulatorkandidat zusätzlich zu den vorgenannten Bedingungen eine oder mehrere weitere Bindetaschen des Proteins aus, die von Verbindung 1 nicht bedeckt werden, so kann der Modulatorkandidat als ein neuer Modulator mit höherer Affinität und/oder höherer Spezifität identifiziert werden.
Der Vergleich kann folglich das Verbinden des Strukturmodells des Modulatorkandidaten, und zwar nach einem Vorvergleich des Modulatorkandidaten mit Verbindung 1, mit dem Strukturmodell des Proteins, und zwar basierend auf den erfindungsgemäßen Strukturkoordinaten des Komplexes, umfassen, wobei optional die freie Bindungsenergie der Bindung zwischen Modulatorkandidat und Protein bestimmt wird, und wobei bei niedriger freier Bindungsenergie eine hohe Bindungswahrscheinlichkeit festgestellt wird. Die freie Bindungsenergie kann berechnet werden: a) durch Summierung der freien Energien interatomarer Kontakte zwischen dem Strukturmodell des Modulatorkandidaten und dem Strukturmodell des Proteins, und/oder b) durch Bestimmung der freien Bindungsenergie zwischen dem Kraftfeld des Modulatorkandidaten und dem
Kraftfeld des Proteins.
Die Erfindung betrifft folglich auch die Verwendung der Strukturkoordinaten in der Kleinmolekül- Bindungskonformation mit Verbindung 1 i) des Proteins AF6, ii) eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Fragments von AF6, oder iii) eines Homologen zu i) oder ii) zur Identifizierung eines Modulators eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins, vorzugsweise in einem erfindungsgemäßen Screening Verfahren. Die Erfindung umfasst des Weiteren ein maschinenlesbares Speichermedium enthaltend maschinenlesbare Daten, welche bei Auslesung und Verarbeitung mittels einer Datenverarbeitungsanlage mit geeignetem Programm eine Darstellung des erfindungsgemäßen Strukturmodells eines Proteins oder eines Komplexes ergeben, ein Computerprogramm mit einem Programmcode zur Ausübung eines erfindungsgemäßen Verfahrens oder einer erfindungsgemäßen Verwendung, und eine
Datenverarbeitungsanlage umfassend ein erfindungsgemäßes Computerprogramm und ein erfindungsgemäßes maschinenlesbares Speichermedium.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Erfindungsgemäße Substanzen
In den Figuren IA, IB, 2A, 2B sind die erfindungsgemäßen, neuen Verbindungen 1 - 2, 4 - 7, 16 und 21 dargestellt,
welche an die PDZ-Domäne des Proteins AF6 binden. In den Figuren IA, IB, 2A, 2B sind die vorbekannten Verbindungen 3, 8, 9 - 15 und 17 - 20 dargestellt, welche für die erfindungsgemäßen Verwendungen geeignet sind, da sie ebenfalls an die PDZ-Domäne des Proteins AFβ binden. In den Figuren 3A bis 3D sind dagegen Verbindungen dargestellt, welche keine erfindungsgemäßen Verbindungen sind, weil sie nicht an die PDZ-Domäne des Proteins AFβ binden.
Ein ,,SXλ markiert neue Substanzen, die synthetisiert wurden. „pλλ, „PλΛ und „Rλλ steht für vorbekannte Substanzen, wobei käuflich erwerbbare Substanzen mit „p" gekennzeichnet sind. Mit „PλΛ gekennzeichnete Substanzen sind - mit Synthesewegen - veröffentlicht worden. Stark bindende Substanzen sind zusätzlich mit einer durchgehenden Li-nie umrahmt. Schwach bindende Substanzen sind mit einer durchbrochenen Linie zusätzlich umrahmt. Nicht bindende Substanzen weisen keinen Zusatzrahmen auf.
Vergleicht man die nicht-bindenden Verbindungen 31 und 32 in Figur 3B mit den bindenden Verbindungen 9 und 14 in Figur 2A, so erkennt man, dass der Ring-Stickstoff im 4- oxo-2-thiazolidinethione Ring keinen Substituenten außer möglicher Weise Wasserstoff tragen darf. Vergleich man die Verbindungen 1 und 2 in Fig. IA mit den Verbindungen 7 und 8 in Fig. IB so stellt man fest, dass der Rest Rl sowohl doppelt gebundener Schwefel als auch Sauerstoff sein kann. Jedoch zeigt der Vergleich zwischen der nicht-bindenden Verbindung 38 in Fig. 3D und der bindenden Verbindung 13 in Fig. 2A, dass Rl nicht eine Aminogruppe sein darf. Auch die
Rl Substituenten Alkyl-imino (Verbindungen 39 und 40 in Fig. 3D) oder Alkyl-thio (Verbindungen 34 - 37 in Fig. 3C) führen zu nicht-bindenden Derivaten.
Ein Vergleich zwischen den Verbindungen in Fig. IA und Fig. 2A zeigt, dass der Rest R3 sowohl einfach als auch doppelt an den Ring gebunden sein kann. Abhängig vom jeweiligen Rest R3 zeigen die Verbindungen mit einfach gebundenem R3 eine stärkere (z.B. Verbindung 1) oder in seltenen Fällen auch schwächere (Verbindung 26 in Fig. 3A) Bindung als die doppelt gebundenen Äquivalente.
Verbindungen mit R3 = -CH2-R4 und R4 gleich isopropyl (Verbindung 21), furanyl (Verbindungen 4), thiophenyl (Verbindung 5) und aromatischen Sechsringen mit kleinen Substituenten von einem oder keinem G-Atom zeigen Bindung (Verbindung 1, 3) , während aromatische Sechsringe mit größeren Substituenten von mehr als zwei C-Atomen (Verbindungen 29, 30) keine Bindung zeigen. Kleine Substituenten am aromatischen Sechsring von R4 können grundsätzlich ortho- (Verbindung 15) , meta- (Verbindung 14) oder auch para- (Verbindung 1) ständig sein, jedoch hängt die zu Bindung führende Substitutionsposition sowohl von der Art des Substituenten als auch von Variationen in anderen Teilen der Verbindung ab.
Besonders starke Aktivität, i.e. Bindung an die PDZ-Domäne, zeigen die folgenden Verbindungen: 1, 7, 9, 6 und 2.
Beispiel 2: Erfindungsgemäß weiterhin verwendbare Substanzen
Die Figuren 4 und 5 zeigen weitere im Rahmen der Erfindung verwendbare Verbindungen, welche an die PDZ-Domäne binden. Zu den Markierungen gelten die in Beispiel 1 getroffenen Erläuterungen entsprechend.
Beispiel 3: Synthesebeispiele
Beispiel 3.1: Synthese der Verbindungen 9 - 15 in Fig. 2A sowie Verbindungen 22 - 25, 27 und 29 - 30 in Fig. 3A
Eine Mischung aus 2, 4-Thioxothiazolidine-one "■ (20 mmol), Aryl- oder Alkyl-Aldehyd (20 mmol) , P-iperidine (16 mmol) und EtOH wird für 18 - 24 h unter Rückfluß gekocht, dann in H2O geschüttet und mit Essigsäure angesäuert. Das Feststoff-Reaktionsprodukt wird aus Methanol, Methanol/Wasser oder Ethanol/Wasser-Solvenz rückkristallisiert .
Beispiel 3.2: Synthese der Verbindungen der Fig. 2B
Die Verbindungen in der Fig. 2B lassen sich gemäß Beispiel 3.1 unter Verwendung von 2, 4-Thiazolidinedione an Stelle von 2, 4-Thioxothiazolidine-one herstellen.
Beispiel 3.3: Synthese der Verbindungen 1 - 5 in Fig. IA
sowie Verbindungen 26 und 28 in Fig. 3A.
Diese Verbindungen lassen sich gemäß Beispiel 3.1, gefolgt von folgenden Verfahrensschritten herstellen: Eine 2.0 molare Lösung aus Lithium-borohydrid (2.2 Equivalente) in Tetrahydrofuran (THF) wird unter Rühren in eine Lösung aus 5-Arylidene-4-oxo-2-thiazolidinethione in Pyridin und THF unter Stickstoff-Atmosphäre bei Raumtemperatur getropft. Die Mischung wird unter Rückfluß erhitzt bis die Reduktionsreaktion abgeschlossen ist (ca. 3 bis 5 h) . Die Mischung wird dann abgekühlt, vorsichtig in eine verdünnte Salzsäure-Lösung in destilliertem Wasser bei 50C gegeben und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat- Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer konzentriert . Das Rohprodukt wird mittels Silica-Gel-Fl-äsh-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 3.4: Synthese der Verbindungen gemäß Fig. IB
Die Verbindungen in Fig. IB lassen sich gemäß Beispiel 3.2 gefolgt von folgenden Verfahrensschritten herstellen: Eine 2.0 molare Lösung aus Lithium-borohydrid (2.2 Equivalente) in Tetrahydrofuran (THF) wird unter Rühren in eine Lösung aus 5-Arylidene-2, 4-thiazolidinedione in Pyridin und THF unter Stickstoff-Atmosphäre bei Raumtemperatur getropft. Die Mischung wird unter Rückfluß erhitzt bis die Reduktionsreaktion abgeschlossen ist (ca. 3 bis 5 h) . Die Mischung wird dann abgekühlt, vorsichtig in eine verdünnte Salzsäure-Lösung in destilliertem Wasser bei 5°C gegeben
und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat- Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über MgS04 getrocknet und am Rotationsverdampfer konzentriert. Das Rohprodukt wird mittels Silica-Gel-Flash-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 3.5: Synthese der Verbindung 33 in Fig. 3B
Verbindung 33 in Fig. 3B läßt sich wie folgt herstellen: Eine 60 %ige Dispersion von Natrium-Hydrid (0.12 g, 3 mmol) in Mineraloil wird mit Hexan gewaschen. Das Natrium-Hydrid wird in THF suspendiert und für 10 min bei 00C gerührt. Eine Lösung von N-Methylrhodanine (0.735g, 3 mmol) in THF wird portionsweise unter Rühren in die Natrium-Hydrid in THF Suspension gegeben. Sodann wird (Ϊ-Bromoethyl) benzene (0.55g, 3 mmol) in einer Portion hinzugegeben, 1 h gerührt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Extrakte werden vereinigt und das Lösemittel unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wird mittels Silica-Säulenchromatographie in einem Ethylacetat/Hexan = 1/9 Gemisch gereinigt, um das Endprodukt zu erhalten.
Beispiel 3.6:' Synthese der Verbindungen 31 und 32 in Fig. 3B
Die Verbindungen 31 und 32 in Fig. 3B lassen sich wie folgt herstellen: Zu einer Mischung aus N-Methylrhodanine (0.735g, 5 mmol) und Aryl-Aldehyd (5 mmol) in einem minimalen Volumen von Dichloromethan wird Kalium-fluorid
auf Aluminium (2 g) gegeben. Das Lösemittel wird unter Vakuum abgezogen und die verbleibenden Feststoffe bei 1500C für 10 min mit Mikrowellen bestrahlt. Die Reaktionsprodukte werden mit Dichloromethan extrahiert, über Celite gefiltert und aufkonzentriert . Das Rohprodukt wird mittels Silica- Gel-Flash-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 3.7: Synthese der Verbindung 16 in Fig. 2A
Die Verbindung 16 in Fig. 2A lässt sich wie folgt herstellen: Eine Mischung aus 2, 4-Thioxothiazolidine-one (0.66 g, 5 mmol), 4 ' - (Trifluoromethyl) -acetophenon (0.94, 5 mmol), Piperidin (0.40 mL, 4 mmol) und THF wird 10 min bei 1000C mit Mikrowellen bestrahlt. Das Rohprodukt wird mittels Silica-Gel-Flash-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 3.8: Synthese der Verbindung 6 in Fig. IA
Die Verbindung 6 in Fig. IA läßt sich gemäß Beispiel 3.7, gefolgt vom weiteren Syntheseweg gemäß Beispiel 3.9 herstellen.
Beispiel 3.9: Synthese der Verbindungen 35 - 37 in Fig. 3C
Die Verbindungen 35 - 37 in Fig. 3C lassen sich wie folgt herstellen: Eine Mischung aus 5- (4-
Trifluoromethylbenzylidene) -4-oxo-2-thiazolidinethione (10 mmol) in wässrigem NaOH (2%, 25 mL) wird mit Methyliodid (Verbindung 35) , Isopropyliodid (Verbindung 36) oder p- Methoxybenzyliodid (Verbindung 37) (je 11 mmol) bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Rohprodukt wird mittels Silica-Gel-Flash-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 3.10: Synthese der Verbindungen 39 und 40 in Fig. 3D
Die Verbindungen 39 - 40 in Fig. 3D lassen sich wie folgt herstellen: Eine Mischung aus 5- (4-
Trifluoromethylbenzylidene) -4-oxo-2-thiazolidinethione (1 mmol) und 2-Dimethylamino-ethylamin oder 3-Phenyl- propylamin (1 mmol) in THF (1.5 mL) wird für 15 min bei 1200C mit Mikrowellen bestrahlt. Das Rohprodukt wird mittels Silica-Gel-Fla-sh-Chromatographie gereinigt, woraus das Endprodukt resultiert.
Beispiel 4: 3D Struktur
Ein Komplex des humanen Proteins AF6 mit Verbindung 1 der Fig. IA wurde mittels der NMR-Spektroskopie in Hinblick auf seine 3D Struktur untersucht. Dies wurde im Einzelnen wie folgt durchgeführt: Das 15N- und 15N/13C-Isotopenmarkierte Protein der PDZ Domäne von AF6 wurde hergestellt wie zuvor beschrieben [Boisguerin, P. et al., Chem. Biol. 11:449-459 (2004)]. Für die NMR-Proteinrückgratzuordnung wurde eine
Probe von 1,3 mM 15N/13C-markierter PDZ Domäne in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0), 50 mM NaCl, Complete [R] -Protease- Inhibitor und 10% (v/v) D2O benutzt. NMR Spektren wurden bei 300 K auf einem Bruker DRX600 Spektrometer mit einem inversen Triple-Resonanz-Probenkop mit Z-Gradienten aufgenommen. Die NMR-Rohdaten wurden mit der Software XWIN- NMR prozessiert und der Software Sparky analysiert. Für die NMR-Proteinrückgratzuordnung wurden die Triple-Resonanz- NMR-Experimente CBCA (CO) NNH/CBCANNH und HA (CO) NNH/HANNH sowie einige Seitenketten-selektive Experimente wie in [Wiedemann, U. et al., J MoI Biol., 343 (3) : 703-18 (2004)] beschrieben aufgenommen. Für die Seitenketten-NMR-Zuordnung wurden folgende NMR-Experimente aufgenommen und ausgewertet: 3D HBHA(CO)NH, H(CCCO)NH-TOCSY, (H) CC (CO) NH- TOCSY mit der Probe für die Rückgratzuordung/ und 3D HCCH- COSY, HCCH-TOCSY und 3D-13C-NOESY-HMQC mit derselben Probe nach Transfer in 100% (v/v) D2O. Die NMR-Experimente wurde durchgeführt wie beschrieben [Kay, L.E. et al . , Biochem Cell Biol., 75(1): 1-15 (1997)]. Interproton-Abstände für die 3D Strukturbestimmung wurden durch Aufnahme und Auswertung von folgenden NMR-Experimenten erhalten: 3D-15N- NOESY-HSQC (80ms) und 3D-13C-NOESY-HMQC (80ms) . 3D Strukturmodelle wurden mit Hilfe der Software Cyana [Guntert P., Mol Biol., 278:353-78 (2004)] errechnet. Die 20 energieärmsten 3D Strukturmodelle (Fig. 6A) wurden mit Hilfe der Software MOLMOL [Koradi R, et al . , J Mol Graph., 14(l):51-5, 29-32 (1996)] und der Software PROCHECK-NMR [Laskowski R. A., et al . , J Biomol NMR, 8(4):477-8β (1996)] analysiert und geprüft. Die Protein-Koordinaten des energieärmsten Strukturmodels aus der Rechnung mit der Software Cyana sowie die Protein-Ligand-Interproton-
Abstände aus den NMR-Experimenten wurden als Eingangsdaten für ein computer-gestütztes Docking des Ligand-Protein- Komplexes verwendet. Hierzu wurde eine 2 Nanosekunden Molecular Dynamics Simulation der Eingangsdaten in einer oktaedrisch limitierten Wasserbox mit Hilfe der Software AMBER 8.0 durchgeführt. Die final erhaltenen Koordinaten des Protein-Ligand-Komplexes sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Figuren 6A, 6B und 6C zeigen die erhaltenen Strukturmodelle für den Komplex aus Verbindung 1 und der PDZ-Domäne von AF6. Das Proteinrückgrat-Ensemble der 20 energieärmsten Strukturmodelle in Figur 6A (Stereo- Ansicht) zeigt eine geringe Standardabweichung der Koordinaten in den Sekundärstrukturelementen, d.h. eine gute Qualität des Strukturmodels in diesen für die Ligandenbindung wichtigen Regionen.
Das Proteinr/ückgrat-Bandmodell der gemittelten Struktur aus den 20 energieärmsten Strukturen im Komplex mit Verbindung 1 (Fig. 6B) ist in -derselben Orientierung wie in Fig. 6A dargestellt. Man erkennt die für PDZ-Domänen charakteristischen 6 beta-Faltblätter und 2 alpha-Helices . Die für die Bindung von natürlichen Peptidliganden wichtigen Sekundärstrukturelemente Faltblatt ß2 und Helix α2 sind gekennzeichnet.
Die Oberflächen-Darstellung der PDZ-Domäne im Komplex mit Verbindung 1 (Fig. 6C), welche gleichfalls in derselben Orientierung wie in Fig. 6A und 6B dargestellt ist, zeigt, wie sich insbesondere der Trifluormethyl-phenyl-Rest von Verbindung 1 in eine Bindetasche des Proteins einpasst.
Viele Atome dieses Rests befinden sich nahezu oder vollständig in van-der-Waals-Abstand zu Atomen des Proteins, woraus sich folgern lässt, dass an diesen Positionen keine Substituenten mit mehr als zwei C-Atomen erlaubt sind. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den nicht-bindenden Verbindungen 29 und 30 in Fig. 3A. Durch Betrachtung des Strukturmodells in Fig. 6C anhand der Atom- Koordinaten in Tabelle 1 mit Hilfe einer geeigneten Software erkennt man, dass an den Atom-Positionen 1, 2, 6, 11 und 12 noch weitere Substituenten, die zum Teil größer als ein C-Atom oder andere Heteroatome sein können, angefügt werden können, um verbesserte Verbindungen im Sinne der Erfindung zu generieren. Dagegen steht das N-Atom in Position 3 in so engem Kontakt mit dem Protein, dass hier keine Substituenten von der Größe eines 'C-Atoms oder größer Platz finden können. Diese Voraussage wird durch die nicht-bindenden Verbindungen 31 - 33 in Fig. 3B bestätigt. In diesem Sinne stellt die Verwendung der dargestellten Komplexstruktur ein Verfahren zur Findung neuer oder/und verbesserter Liganden von PDZ-Domänen dar.
Die ubiquitär 15N-markierten PDZ-Domänen der Proteine AF6 [Boisguerin, P. et al., Chem. Biol. 11:449-459 (2004)] und Syntrophin [Schultz, J. et al . , Nat Struct Biol., 5(1) : 19- 24 (1998)] wurden wie in den Publikationen beschrieben hergestellt. Für den NMR-Assay werden 50 μM 15N-markiertes Protein in einem Puffer aus 20 mM Na-Phosphat pH 6.5, 50 mM NaCl und 10% d6-DMSO mit einem 8- bis 10-fachen molaren Überschuß an Testligand vermischt und ein 15N-HSQC NMR- Spektrum bei einer Temperatur von 300 K auf einem Bruker DRX 600 MHz NMR-Spektrometer aufgenommen. Zweitens wird ein
identisches Vergleichsspektrum von Protein in Abwesenheit von Testligand aufgenommen. Die NMR-Spektren werden mit Hilfe der Software XWIN-NMR prozessiert und der Software Sparky miteinander verglichen. Zeigt der Vergleich chemische Verschiebungsänderungen von mehr als einer Resonanz und weniger als etwa der hälfte aller Resonanzen, so handelt es sich um einen bindenden Liganden. Beispielhaft ist ein solcher Spektrenvergleich für die PDZ- Domäne von AFβ in Fig. 7A und für die PDZ-Domäne von Syntrophin in Fig. 7B dargestellt.
Zur Bestimmung von Dissoziationsgleichgewichtskonstanten (kurz: Kd-Werte) wird ein Testligand stufenweise in zunehmenden Konzentrationen zu 50 μM Proteinlösung gegeben und bei jeder Konzentrationsstufe ein 15N-HSQC NMR-Spektrum unter gleichen Bedingungen wie oben beschrieben aufgenommen. Die mittlere chemische Verschiebungsänderung einer Resonanz, d, wird gemäß folgender Gleichung aus den NMR-Rohdaten errechnet:
wobei ΔH die Verschiebungsänderung in ppm Einheiten entlang der IH Resonanz-Achse und ΔN die Verschiebungsänderung in ppm Einheiten entlang der 15N Resonanz-Achse darstellt. Die mittlere Verschiebungsänderung, d, wird gegen die Konzentration des Testliganden aufgetragen, woraus eine Bindungskurve resultiert, an welche folgende mathematische Gleichung angepasst wird:
y(Lo) = a -(a2-Lo/Po) 0.5
mit
a = (Po+Lo+Kd )/(2*Po)
wobei Lo die Gesamtkonzentration an Liganden, Po die Gesamtkonzentration an Protein und Kd der Kd-Wert ist. Diese Gleichung beschreibt das Massenwirkungsgesetz einer' Reaktion „Protein + Ligand = Komplex". Die Bindungskurve für die Bindung von Verbindung 1 an die PDZ-Domäne von AF6 ist in Figur 9 dargestellt.
Mit Hilfe einer Software wie z.B. „Or'igin 5.0" wird die Anpassung nicht-linear optimiert, wodurch man für jede untersuchte Resonanz einen mikroskopischen Kd"-Wert erhält. Aus dem Mittelwert aller relevanten mikroskopischen Kd- Werte wird ein makroskopischer Kd-Wert errechnet. In Tabelle 2 sind die makroskopischen Kd-Werte inklusive der statistischen Standardabweichung für die Bindung einiger Testliganden an die PDZ-Domänen von AFβ und von Syntrophin dargestellt .
Grundlage des Komplexstruktur-basierten Verfahrens zur Findung .neuer Modulatoren ist eine Korrelation zwischen chemischen Variationen der Verbindung 1, der Bindungsaffinität und der Bindungsplatzbelegung des Proteins. Figur 8 zeigt für eine systematische Auswahl von Testverbindungen, welche Änderungen in der Bindungsaffinität und in der Bindungsplatzbelegung bei Anwendung des Verfahrens experimentell erhalten werden. Jede Spalte in Figur 8 zeigt die Aminosäurereste der PDZ-
Domäne von AF6, der Rückgrat-Amid-Resonanzen bei Zugabe der angegebenen Verbindung in 8- bis 10-fachem Ligandenüberschuß in dem zuvor beschriebenen NMR-Assay chemische Verschiebungsänderungen zeigen. Hierbei sind Aminosäurereste durch den international üblichen 1- Buchstaben-Code abgekürzt. Die Nummerierung der Aminosäurereste ist identisch zur Nummerierung im Protein- Ligand-Komplex in Tabelle 1. Die chemischen Verschiebungsänderungen sind in die 2 Kategorien „groß (fette kursive Schrift)" und „klein .(normale Schrift)" eingeteilt. Aus den dargestellten Aminosäureresten lässt sich der Bindungsort einer Verbindung auf dem Protein rekonstruieren, indem man die Rückgrat-Amid-Atome dieser Aminosäurereste in der 3D Proteinstruktur aus Tabelle 1 farbig hervorhebt und die größte gemeinsame Schnittmenge aller dieser Atome auf der Proteinobe-ffläche bildet.
Darüber hinaus können aus einem Vergleich der angezeigten Aminosäurereste zwischen zwei Verbindungen Informationen über die differentielle Belegung von Teilbindungsplätzen gewonnen. Vergleicht man z.B. Verbindung 1 mit Verbindung 21, so treten die Aminosäurereste L25, S26 und V46 in beiden Verbindungen auf, jedoch fehlen die Reste S75 bis T91 bei Verbindung 21. Betrachtet man den Ort dieser Reste S75 bis T91 im 3D Strukturmodell des' Protein-Verbindungl- Komplexes aus Tabelle 1, so findet man eine Lokalisierung in der Umgebung des Trifluormethylphenyl-Restes von Verbindung 1. Da dieser Trifluormethylphenyl-Rest in Verbindung 21 auf einen wesentlich kleineren Isopropyl-Rest reduziert ist, kann das Fehlen der Aminosäurereste S75 bis T91 bei Verbindung 21 mit einer fehlenden Belegung des
Teilbindungsplatzes des Trifluormethylphenyl-Rests korreliert werden. In analoger Weise folgt aus einem Vergleich der Verbindungen 46 und 1, dass Verbindung 46 die Bindungsplätze L25 bis V28 und S75 bis T91 von Verbindung 1 nicht oder nur ungenügend belegt.
Für eine Auswahl von 3 Verbindungen sind die Kd-Werte für die PDZ-Domänen von AFβ und Syntrophin in Tabelle 2 dargestellt. Angesichts der Tatsache, dass es sich bei den beiden PDZ-Domänen um Proteine mit nur geringem Kleinmolekülbindevermögen (engl. : low drugability) handelt, weist der Kd-Wert von 101 μM für Verbindung 1
(Enaritiomeren-Gemisch bzgl. Atom-Position 5) auf eine unerwartet feste Bindung hin. Im Vergleich hierzu zeigt ein natürlicher Hexa-Peptid-Ligand einen Kd-Wert 'von nur 137 μM
[Wiedemann, U. et al., J. Mol. Biol. -343 (3) : 703-18 (2004)], obgleich das Hexa-Peptid ein 2,3-fach höheres Molekulargewicht als Verbindung 1 hat.
Tabelle 1: Struktur koordinaten des Komplexes AFβ mit Verbindung 1
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SEQRES 1 85 GLU ILE ILE THR VAL THR LEU LYS LYS GLN ASN GLY MET
SEQRES 2 85 GLY LEU SER ILE VAL ALA ALA LYS GLY ALA GLY GLN ASP
SEQRES 3 85 LYS LEU GLY ILE TYR VAL LYS SER VAL VAL LYS GLY GLY
SEQRES 4 85 ALA ALA ASP VAL ASP GLY ARG LEU ALA ALA GLY ASP GLN
SEQRES 5 85 LEU LEU SER VAL ASP GLY ARG SER LEU VAL GLY LEU SER
SEQRES 6 85 GLN GLU ARG ALA ALA GLU LEU MET THR ARG THR SER SER
SEQRES 7 85 VAL VAL THR LEU GLU VAL ALA
SEQRES 1 1 CPX
ATOM N GLU -0.982 -12.028 -7.811 1.00 0.00
ATOM 2 CA GLU 1 1.679 -11.147 -8.810 1.00 0.00
ATOM 3 C GLU 1 2.017 -9.812 -8.256 1.00 0.00
ATOM 4 O GLU 1 2.327 -9.729 -7.074 1.00 0.00
ATOM 5 CB GLU 1 2.928 -11.922 -9.407 1.00 0.00
ATOM 6 CG GLU 1 3.618 -11.246 -10.519 1.00 0.00
ATOM 7 CD GLU 1 2.651 -10.942 -11.683 1.00 0.00
ATOM 8 OEl GLU 1 2.284 -11.843 -12.488 1.00 0.00
ATOM 9 OE2 GLU 1 2.208 -9.755 -11.837 1.00 0.00
ATOM 10 HA GLU 1 0.924 -10.890 -9.553 1.00 0.00
ATOM 11 HB3 GLU 1 3.695 -11.949 -8.632 1.00 0.00
ATOM 12 HB2 GLU 1 2.598 -12.922 -9.689 1.00 0.00
ATOM 13 HG3 GLU 1 3.903 -10.236 -10.221 1.00 0.00
ATOM 14 HG2 GLU 1 4.469 -11.799 -10.917 1.00 0.00
ATOM 15 H3 GLU 1 0.168 -11.525 -7.490 1.00 0.00
ATOM 16 H2 GLU 1 1.618 -12.171 -7.040 1.00 0.00
ATOM 17 Hl GLU 1 0.655 -12.892 -8.219 1.00 0.00
ATOM 18 N ILE 2 1.888 -8.827 -9.134 1.00 0.00
ATOM 19 CA ILE 2 1.972 -7.456 -8.725 1.00 0.00
ATOM 20 C ILE 2 3.379 -6.872 -8.808 1.00 0.00
ATOM 21 O ILE 2 4.052 -6.960 -9.835 1.00 0.00
ATOM 22 CB ILE 2 0.911 -6.543 -9.428 1.00 0.00
ATOM 23 CGI ILE 2 0.773 -5.051 -8.961 1.00 0.00
ATOM 24 CG2 ILE 2 1.013 -6.471 -10.902 1.00 0.00
ATOM 25 CDl ILE 2 0.034 -4.993 -7.593 1.00 0.00
ATOM 26 HA ILE 2 1.734 -7.456 -7.662 1.00 0.00
ATOM 27 HB ILE 2 0.097 -6.857 -9.159, 1.00 0.00
ATOM 28 HGl3 ILE 2 1.776 -4.626 -8.935 1.00 0.00
ATOM 29 HG12 ILE 2 0.139 -4.57-7 -9.709 1.00 0.00
ATOM 30 HDIl ILE 2 0.028 -3.916 -7.429 1.00 0.00
ATOM 31 HDl2 ILE 2 0.539 -5.667 -6.901 1.00 0.00
ATOM 32 HD13 ILE 2 1.002 -5.325 -7.651 1.00 0.00
ATOM 33 HG21 ILE 2 1.618 -5.630 -11.239 1.00 0.00
ATOM 34 HG22 ILE 2 0.038 -6.285 -11.352 1.00 0.00
ATOM 35 HG23 ILE 2 1.358 -7.431 -11.288 1.00 0.00
ATOM 36 H ILE 2 1.781 -8.925 -10.134 1.00 0.00
ATOM 37 N ILE 3 3.840 -6.339 -7.663 1.00 0.00
ATOM 38 CA ILE 3 5.204 -5.732 -7.516 1.00 0.00
ATOM • 39 C ILE 3 5.019 -4.246 -7.287 1.00 0.00
ATOM 40 O ILE 3 3.951 -3.757 -6.877 1.00 0.00
ATOM 41 CB ILE 3 5.883 -6.376 -6.275 1.00 0.00
ATOM 42 CGI ILE 3 5.633 -7.891 -6.085 1.00 0.00
ATOM 43 CG2 ILE 3 7.322 -6.171 -6.442 1.00 0.00
ATOM 44 CDl ILE 3 6.016 -8.858 -7.293 1.00 0.00
ATOM 45 HA ILE 3 5.820 -5.923 -8.395 1.00 0.00
ATOM 46 HB ILE 3 5.403 -5.805 -5.480 1.00 0.00
ATOM 47 HG13 ILE 3 6.141 -8.194 -5.170 1.00 0.00
ATOM 48 HG12 ILE 3 4.559 -7.988 -5.921 1.00 0.00
ATOM 49 HDIl ILE 3 7.088 -9.049 -7.356 1.00 0.00
ATOM 50 HD12 ILE 3 5.651 -8.499 -8.255 1.00 0.00
ATOM 51 HD13 ILE 3 5.587 -9.853 -7.174 1.00 0.00
ATOM 52 HG21 ILE 3 7.575 -5.114 -6.351 1.00 0.00
ATOM 53 HG22 ILE 3 7.575 -6.473 -7.457 1.00 0.00
ATOM 54 HG23 ILE 3 7.861 -6.751 -5.692 1.00 0.00
ATOM 55 H ILE 3 3.218 -6.358 -6.867 1.00 0.00
ATOM 56 N THR 4 6.032 -3.415 -7.545 1.00 0.00
ATOM 57 CA THR 4 6.017 -1.964 -7.336 1.00 0.00
ATOM 58 C THR 4 -7.298 -1.383 -6.650 1, 00 0.00
ATOM 59 O THR 4 -8.390 -1.898 -6.770 1 00 0.00
ATOM 60 CB THR 4 -5.626 -1.234 -8.650 1 00 0.00
ATOM 61 OGl THR 4 -5.528 0.173 -8.392 1, 00 0.00
ATOM 62 CG2 THR 4 -6.553 -1.573 -9.817 1, 00 0.00
ATOM 63 HA THR 4 -5.176 -1, 601 -6.744 1, 00 0.00
ATOM 64 HB THR 4 -4.681 642 -9.008 1, 00 0.00
ATOM 65 HGl THR 4 -4.827 0.288 -7.746 1, 00 0.00
ATOM 66 HG23 THR 4 -6.419 -2.618 -10.094 1 00 0.00
ATOM 67 HG21 THR 4 -7.541 -1.296 -9.450 1 00 0.00
ATOM 68 HG22 THR 4 -6.265 -0.915 -10.637 1 00 0.00
ATOM 69 H THR 4 -6.882 -3.866 -7 854 1 00 0.00
ATOM 70 N VAL 5 -7.078 -0.334 805 1 00 0.00
ATOM 71 CA VAL 5 -8.079 0.272 -4.967 1, 00 0.00
ATOM 72 C VAL 5 -7.915 1.758 -5.037 1, 00 0.00
ATOM 73 O VAL 5 -6.878 2.222 -5.500 1 00 0.00
ATOM 74 CB VAL 5 -8.124 -0.258 -3.525 1 00 0.00
ATOM 75 CGI VAL 5 -9.472 0.069 - -22,. 940 1, 00 0.00
ATOM 76 CG2 VAL 5 -7.981 -1.773 —3 413 1 00 0.00
ATOM 77 HA VAL 5 -9.037 0.143 - -55.. 471 1, 00 0.00
ATOM 78 HB VAL 5 -7.316 0.138 -2. 910 1, 00 0.00
ATOM 79 HGIl VAL 5 -9.843 -0.646 -2. 206 1.00 0.00
ATOM 80 HG12 VAL 5 -9.430 1.031 -2. 431 1 00 0.00
ATOM 81 HG13 VAL 5 -10.278 0.102 674 1 00 0.00
ATOM 82 HG21 VAL 5 -7.041 -2.147 -3. 818 1, 00 0.00
ATOM 83 HG22 VAL 5 -8.043 -2.088 -2. 371 1, 00 0.00
ATOM 84 HG23 VAL 5 -8.842 -2.216 —3 916 1, 00 0.00
ATOM 85 H VAL 5 -6.208 0.172 -5. 885 1, 00 0.00
ATOM 86 N THR -8.903 2.530 -4. 526 1.00 0.00
ATOM 87 CA THR 6 -8.696 3, .963 -4. 281 00 0.00
ATOM 88 C THR 6 -8.796 4, .364 -2. 797 00 0.00
ATOM 89 O THR 6 -9.555 3..757 -2. 003 00 0.00
ATOM 90 CB THR 6 -9.683 4.847 -5. 117 1.00 0.00
ATOM 91 OGl THR 6 -11.027 4.631 -4. 829 1.00 0.00
ATOM 92 CG2 THR 6 -9.490 4.793 -6. 587 1.00 0.00
ATOM 93 HA THR 6 -7.701 4.228 -4. 639 1 00 0.00
ATOM 94 HB THR 6 -9.483 5.874 -4. 812 1 00 0.00
ATOM 95 HGl THR 6 -11.298 4.043 -5. 538 1.00 0.00
ATOM 96 HG23 THR 6 -10.036 5.676 -6. 919 1 00 0.00
ATOM 97 HG21 THR 6 -8.465 4.963 -6. 915 1 00 0.00
ATOM 98 HG22 THR 6 -9.911 3.941 -7. 122 1.00 0.00
ATOM 99 H THR 6 -9.787 2.084 -4. 323 1, 00 0.00
ATOM 100 N LEU 7 -8.208 5.505 -2. 374 1, 00 0.00
ATOM 101 CA LEU 7 -8.300 6.003 -0. 931 1 00 0.00
ATOM 102 C LEU 7 -9.703 6.610 -0. 540 1, 00 0.00
ATOM 103 O LEU 7 -9.785 7.467 0. 322 1, 00 0.00
ATOM 104 CB LEU 7 -7.166 6.934 -0. 676 1.00 0.00
ATOM 105 CG LEU 7 -6.280 6.481 0. 469 1, .00 0.00
ATOM 106 CDl LEU 7 -4.965 7.108 0. 542 1.00 0.00
ATOM 107 CD2 LEU 7 -6.961 6.548 1. 804 1.00 0.00
ATOM 108 HA LEU 7 -8.289 5.097 -0. 324 1..00 0.00
ATOM 109 HB3 LEU 7 -7.532 7.952 -0. 549 1.00 0.00
ATOM 110 HB2 LEU 7 -6.527 6.943 -1. 558 1,.00 0.00
ATOM 111 HG LEU 7 -6.098 5.430 0. 243 1,.00 0.00
ATOM 112 HD21 LEU 7 -7.223 7.570 2. 078 1.00 0.00
ATOM 113 HD22 LEU 7 -7.881 5.964 1. 806 1.00 0.00
ATOM 114 HD23 LEU 7 -6.405 6.003 2.566 1.00 0.00
ATOM 115 HDIl LEU 7 -4.516 6.784 1.481 1.00 0.00
ATOM 116 HD12 LEU 7 -4.366 6.798 -0.314 1.00 0.00
ATOM 117 HD13 LEU 7 -5.017 8.196 0.592 1.00 0.00
ATOM 118 H LEU 7 -7.579 5.958 -3.022 1.00 •o.oo
ATOM 119 N LYS 8 10.798 6.141 -1.206 1.00 0.00
ATOM 120 CA LYS 8 12.067 6.874 -1.289 1.00 0.00
ATOM 121 C LYS 8 13.243 6.315 -0.450 1.00 0.00
ATOM 122 O LYS 8 13.954 7.156 0.165 1.00 0.00
ATOM 123 CB LYS 8 12.535 7.001 -2.796 1.00 0.00
ATOM 124 CG LYS l CT 8 13.900 7.797 -2.939 1.00 0.00
ATOM 125 CD LYS 8 14.236 8.091 -4.386 1.00 0.00
ATOM ' 126 CE LYS 8 15.756 8.231 -4.448 1.00 0.00
ATOM 127 NZ LYS 8 16.222 9.634 -4.287 1.00 0.00
ATOM 128 HA LYS 8 11.960 7.885 -0.893 1.00 0.00
ATOM 129 HB3 LYS 8 12.639 5.974 -3.146 1.00 0.00
ATOM 130 HB2 LYS 8 11.744 7.437 -3.408 1.00 0.00
ATOM 131 HG3 LYS 8 13.713 8.705 -2.366 1.00 0.00
ATOM 132 HG2 LYS 8 14.714 7.328 -2.385 1.00 0.00
ATOM 133 HD3 LYS 8 13.968 7.211 -4.969 1.00 0.00
ATOM 134 HD2 LYS 8 13.740 9.022 -4.666 1.00 0.00
ATOM 135 HE3 LYS 8 16.232 7.544 -3.750 1.00 0.00
ATOM 136 HE2 LYS 8 15.970 7.911 -5.467 1.00 0.00
ATOM 137 HZl LYS 8 17.157 9.880 -4.577 1.00 0.00
ATOM 138 HZ2 LYS 8 16.142 9.901 -3.317 1.00 0.00
ATOM 139 HZ3 LYS 8 15.671 10.336 -4.759, 1.00 0.00
ATOM 140 H LYS 8 10.719 5.455 -1.943 1.00 0.00
ATOM 141 N LYS 9 13.310 4.97~4 -0.365 1.00 0.00
ATOM 142 CA LYS 9 14.492 4.339 0.266 1.00 0.00
ATOM 143 C LYS 9 14.606 4.646 1.880 1.00 0.00
ATOM 144 O LYS 9 15.740 4.611 2.449 1.00 0.00
ATOM 145 CB LYS 9 14.435 2.857 -0.059 1.00 0.00
ATOM 146 CG LYS 9 15.629 2.040 0.457 1.00 0.00
ATOM 147 CD LYS 9 16.910 2.295 -0.392 1.00 0.00
ATOM 148 CE LYS 9 18.056 1.334 0.107 1.00 0.00
ATOM 149 NZ LYS 9 18.513 0.436 -1.014 1.00 0.00
ATOM 150 HA LYS 9 15.432 4.700 -0.153 1.00 0.00
ATOM 151 HB3 LYS 9 13.504 2.433 0.318 1.00 0.00
ATOM 152 HB2 LYS 9 14.470 2.767 -1.145 1.00 0.00
ATOM 153 HG3 LYS 9 15.907 2.225 1.494 1.00 0.00
ATOM 154 HG2 LYS 9 15.382 0.984 0.352 1.00 0.00
ATOM 155 HD3 LYS 9 16.620 2.207 -1.439 1.00 0.00
ATOM 156 HD2 LYS 9 17.149 3.339 -0.190 1.00 0.00
ATOM 157 HE3 LYS 9 18.883 1.856 0.588 1.00 0.00
ATOM 158 HE2 LYS 9 17.514 0.668 0.778 1.00 0.00
ATOM 159 HZl LYS 9 18.874 -0.487 -0.825 1.00 0.00
ATOM 160 HZ2 LYS 19.294 0.896 -1.462 1.00 0.00
ATOM 161 HZ3 LYS 9 17.832 0.280 -1.741 1.00 0.00
ATOM 162 H LYS 9 12.860 4.419 -1.078 1.00 0.00
ATOM 163 N GLN 10 13.466 4.928 2.522 1.00 0.00
ATOM 164 CA GLN 10 13.228 5.051 3.998 1.00 0.00
ATOM 165 C GLN 10 12.127 6.038 4.311 1.00 0.00
ATOM 166 O GLN 10 11.343 6.364 3.373 1.00 0.00
ATOM 167 CB GLN 10 13.057 3.740 4.644 1.00 0.00
ATOM 168 CG GLN 10 14.312 2.899 4.565 1.00 0.00
ATOM 169 CD GLN 10 14.281 1.747 5.513 1.00 0.00
ATOM 170 OEl GLN 10 13.599 0.808 5.369 1.00 0.00
ATOM 171 NE2 GLN 10 15.112 1.616 6.543 1.00 0.00
ATOM 172 HA GLN 10 14.189 5.452 4.319 1.00 0.00
ATOM 173 HB3 GLN 10 12.882 3.913 5.706 1.00 0.00
ATOM 174 HB2 GLN 10 12.241 3.203 4.163 1.00 0.00
ATOM 175 HG3 GLN 10 14.626 2.572 3.574 1.00 0.00
ATOM 176 HG2 GLN 10 15.182 3.505 4.818 1.00 0.00
ATOM 177 HE22 GLN 10 15.827 2.315 6.681 1.00 0.00
ATOM 178 HE21 GLN 10 15.159 0.847 7.197 1.00 0.00
ATOM 179 H GLN 10 12.656 5.052 1.932 1.00 0.00
ATOM 180 N ASN 11 12.087 6.551 5.504 1.00 0.00
ATOM 181 CA ASN 11 11.076 7.481 6.104 1.00 0.00
ATOM 182 C ASN 11 -9.560 7.071 5.943 1.00 0.00
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ATOM 209 HA MET 13 -6.686 2.057 3.027 1.00 0.00
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'ATOM 265 HGl3 ILE 17 4.065 -2.203 6.534 1.00 0.00
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ATOM 288 HG23 VAL 18 5.,405 9.565 8.294 ,00 0.00
ATOM 289 H VAL 18 4.,983 5.973 5, .001 ,00 0.00
ATOM 290 N ALA 19 7.707 5.278 5, .475 ,00 0.00
ATOM 291 CA ALA 19 9.103 5.225 4..957 ,00 0.00
ATOM 292 C ALA 19 9.597 -3.852 '5.013 ,00 0.00
ATOM 293 O ALA 19 8.862 -2.884 5.302 ,00 0.00
ATOM 294 CB ALA 19 9.171 -5.799 3..520 ,00 0.00
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ATOM 311 CA LYS 21 14.202 1.341 2.623 ,00 0.00
ATOM 312 C LYS 21 15.500 1.327 3, .465 ,00 0.00
ATOM 313 O LYS 21 15.695 0.351 4.212 ,00 0.00
ATOM 314 CB LYS . 21 14.132 0.110 1.711 00 0.00
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ATOM 326 HE3 LYS ■ 21 15.397 1.492 -2.286 1.00 0.00
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ATOM 329 HZ2 LYS 21 17.156 2.571 -0.698 00 0.00
ATOM 330 HZ3 LYS 21 17.947 1.164 -0.789 00 0.00.
ATOM 331 H LYS 21 12.211 0.840 3.245 00 0.00
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ATOM 350 CA GLY 24 22.362 -5.411 4.486 1.00 0.00
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ATOM 360 CB GLN 25 21.062 -6.499 0.002 1.00 0.00
ATOM 361 •CG GLN 25 21.723 -7.798 0.384 1.00 0.00
ATOM 362 CD GLN 25 20.919 -8.988 -0.209 1.00 0.00
ATOM 363 OEl GLN 25 20.005 -9.576 0.38Q 1.00 0.00
ATOM 364 NE2 GLN 25 21.227 -9.387 -1.411 1.00 0.00
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ATOM 366 HB3 GLN 25 21.189 -6.474 -1.080 1.00 0.00
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ATOM 370 HE22 GLN 25 21.902 -8.891 -1.974 1.00 0.00
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ATOM 373 N ASP 26 20.704 -3.007 0.749 1.00 0.00
ATOM 374 CA ASP 26 19.911 -1.753 0.375 1.00 0.00
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ATOM 376 O ASP 26 18.229 -1.203 -1.340 1.00 0.00
ATOM 377 CB ASP 26 20.828 -0.618 -0.166 1.00 0.00
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ATOM 518 HB3 SER 34 -3.319 -10.818 6.189 1.00 0.00
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ATOM 526 CB VAL 35 -7.155 -6.303 4.472 1.00 0.00
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ATOM 573 HZ2 LYS 37 14.799 -8.643 ' 4.781 1.00 0.00
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ATOM 628 CG2 VAL 43 16.142 -1.089 2.501 1.00 0.00
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ATOM 637 H VAL 43 12.346 -2.728 2.864 1.00 0.00
ATOM 638 N ASP 44 13.281 -2.048 -0.459 1.00 0.00
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ATOM 641 O ASP 44 12.554 -2.404 -4.033 1.00 0.00
ATOM 642 CB ASP 44 13.129 -0.167 -1.974 1.00 0.00
ATOM 643 CG ASP 44 13.476 0.397 -3.392, 1.00 0.00
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ATOM 645 OD2 ASP 44 12.673 1.123 -3.987 1.00 0.00
ATOM 646 HA ASP 44 14.446 -1.937 -2.170 1.00 0.00
ATOM 647 HB3 ASP 44 12.087 0.125 -1.835 1.00 0.00
ATOM 648 HB2 ASP 44 13.664 0.299 -1.146 1.00 0.00
ATOM 649 H ASP 44 12.369 -1.960 -0.036 1.00 0.00
ATOM 650 N GLY 45 11.487 -3.254 -2.200 1.00 0.00
ATOM 651 CA GLY 45 10.600 -4.113 -2.949 1.00 0.00
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ATOM 653 O GLY 45 10.566 -6.400 -3.757 1.00 0.00
ATOM 654 HA3 GLY 45 -9.619 -3.967 -2.496 1.00 0.00
ATOM 655 HA2 GLY 45 10.627 -3.801 -3.992 1.00 0.00
ATOM 656 H GLY 45 11.357 -3.273 -1.199 1.00 0.00
ATOM 657 N ARG 46 11.476 -6.097 -1.641 1.00 0.00
ATOM 658 CA ARG 46 11.916 -7.465 -1.351 1.00 0.00
ATOM 659 C ARG 46 10.968 -8.598 -1.760 1.00 0.00
ATOM 660 O ARG 46 11.300 -9.688 -2.286 1.00 0.00
ATOM 661 CB ARG 46 13.365 -7.744 -1.813 1.00 0.00
ATOM 662 CG ARG 46 14.381 -6.731 -1.296 1.00 0.00
ATOM 663 CD ARG 46 15.789 -6.953 -1.720 1.00 0.00
ATOM 664 NE ARG 46 15.873 -6.544 -3.064 1.00 0.00
ATOM 665 CZ ARG 46 16.193 -7.219 -4.149 1.00 0.00
ATOM 666 NHl ARG 46 15.952 -6.776 -5.313 1.00 0.00
ATOM 667 NH2 ARG 46 16.662 -8.426 -4.124 1.00 0.00
ATOM 668 HA ARG 46 11.977 -7.591 -0.270 1.00 0.00
ATOM 669 HB3 ARG 46 13.553 -8.788 -1.562 1.00 0.00
ATOM 670 HB2 ARG 46 13.329 -7.728 -2.902 1.00 0.00
ATOM 671 HG3 ARG' 46 14.173 -5.686 -1.526 1.00 0.00
ATOM 672 HG2 ARG 46 14.373 -6.907 -0.220 1.00 0.00
ATOM 673 HD3 ARG 46 16.508 -6.477 -1.054 1.00 0.00
ATOM 674 HD2 ARG 46 -15.943 -8.015 -1.524 .00 0.00
ATOM 675 HE ARG 46 -15.838 -5.550 -3.241 00 0.00
ATOM 676 HH12 ARG 46 -16.023 -7.334 -6.152 ,00 0.00
ATOM 677 HHIl ARG 46 -15.520 -5.866 -5.379 ,00 0.00
ATOM 678 HH22 ARG 46 -16.647 -9.049 -4.919 ,00 0.00
ATOM 679 HH21 ARG 46 -16.826 -8.818 -3 208 ,00 0.00
ATOM 680 H ARG 46 -11.687 -5.440 0.903 ,00 0.00
ATOM 681 N LEU 47 -9.650 -8.384 1.510 ,00 0.00
ATOM 682 CA LEU 47 -8.429 -9.025 2 006 1.00 0.00
ATOM 683 C LEU 47 -7.580 -9.887 1 060 00 0.00
ATOM 684 O LEU 47 -6.598 -10.514 -1 499 00 0.00
ATOM 685 CB LEU 47 -7.667 -7, ,903 2 634 00 0.00
ATOM 686 CG LEU 47 -7.504 -6.584 1 853 00 0.00
ATOM 687 CDl LEU 47 -6.565 -6.657 0.685 00 0.00
ATOM 688 CD2 LEU 47 -7.214 -5.398 2.681 00 0.00
ATOM 689 HA LEU 47 -8.703 -9. 667 2.843 00 0.00
ATOM 690 HB3 LEU 47 -8.208 -7.823 3.577 00 0.00
ATOM 691 HB2 LEU 47 -6.668 -8.291 -2 836 00 0.00
ATOM 692 HG LEU 47 -8.437 -6.325 1.353 00 0.00
ATOM 693 HD21 LEU 47 -7.055 -4.519 2.056 00 0.00
ATOM 694 HD22 LEU 47 -6.296 -5.500 3.259 00 0.00
ATOM 695 HD23 LEU 47 -8.068 -5.2.02 3.329 00 0.00
ATOM 696 HDIl LEU 47 -5.541 -6.740 1.049 1.00 0.00
ATOM 697 HD12 LEU 47 -6.620 -5.717 0.136 ,00 0.00
ATOM 698 HD13 LEU 47 -6.816 -7.407 0.066 ,00 0.00
ATOM 699 H LEU 47 -9.513 -7.481 -1 078 ,00 0.00
ATOM 700 N ALA 48 -7..883 -9.966 0 . 285 ,00 0.00
ATOM 701 • CA ALA 48 -7,.057 -10.48-7 380 ,00 0.00
ATOM 702 C ALA 48 -5.586 -9.925 600 ,00 0.00
ATOM 703 O ALA 48 -5.261 -9.699 2. 753 1.00 0.00
ATOM 704 CB ALA 48 -7 184 -12.014 1. 404 1.00 0.00
ATOM 705 HA ALA 48 -7 601 -10.137 2 . 257 1..00 0.00
ATOM 706 HBl ALA 48 -6.583 -12.503 0. 638 1..00 0.00
ATOM 707 HB2 ALA 48 -6.911 -12.325 2 . 413 1.00 0.00
ATOM 708 HB3 ALA 48 -8.218 -12.297 1. 206 1.00 0.00
ATOM 709 H ALA 48 -8.789 -9.580 0. 506 1.00 0.00
ATOM 710 N ALA 49 -4.759 -9.780 0. 598 00 0.00
ATOM 711 CA ALA 49 -3.426 -9.239 0. 543 00 0.00
ATOM 712 C ALA 49 -2.347 -10.144 1. 262 00 0.00
ATOM 713 O ALA 49 -2.692 -11.044 2 . 076 00 0.00
ATOM 714 CB ALA 49 -3.374 -7.717 0 . 792 00 0.00
ATOM 715 HA ALA 49 -3.132 -9.253 ■0 . 506 00 0.00
ATOM 716 HBl ALA 49 -3.032 -7.567 1. 817 00 0.00
ATOM 717 HB2 ALA 49 -2.633 -7.225 0. 164 00 0.00
ATOM 718 HB3 ALA 49 -4.341 -7.214 0 . 783 1.00 0.00
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ATOM 720 N GLY 50 -1.061 -9.910 1. 012 1.00 0.00
ATOM 721 CA GLY 50 -0.022 -10.861 1 . 457 1.00 0.00
ATOM 722 C GLY 50 1.301 -10.881 0 . 711 1.00 0.00
ATOM 723 O GLY 50 2.157 -11.740 0 . 993 1.00 0.00
ATOM 724 HA3 GLY 50 -0.500 -11.841 1. 468 1.00 0.00
ATOM 725 HA2 GLY 50 0.162 -10.634 2 . 507 1.00 0.00
ATOM 726 H GLY 50 -0.776 -9.199 0. 354 1.00 0.00
ATOM 727 N ASP 51 1. 543 -10.083 - 0. 340 1.00 0.00
ATOM 728 CA ASP 51 2.718 -10.186 - 1. 189 1.00 0.00
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ATOM 731 CB ASP 51 2.441 -10.995 -2.468 r.00 0.00
ATOM 732 CG ASP 51 3. ,646 -11.733 -3.039 1.00 0.00
ATOM 733 ODl ASP 51 3. ,962 -12.877 -2.627 1.00 0.00
ATOM 734 OD2 ASP 51 4. ,222 -11.136 -3.980 1.00 0.00
ATOM 735 HA ASP 51 3. ,560 -10.665 -0.689 1.00 0.00
ATOM 736 HB3 ASP 51 1.970 -10.274 -3.136 1.00 0.00
ATOM 737 HB2 ASP 51 1.679 -11.761 -2.325 1.00 0.00
ATOM 738 H ASP 51 0.827 -9.396 -0.526 1.00 0.00
ATOM 739 N GLN 52 .609 -7.784 -1.904 1.00 0.00
ATOM 740 CA GLN 52 .305 -6.576 -2.497 1.00 0.00
ATOM 741 C GLN 52 .480 -5.336 -2.348 1.00 0.00
ATOM 742 O GLN 52 .226 -5.370 -2.375 1.00 0.00
ATOM 743 CB GLN 52 .734 -6.859 -3.938 1.00 0.00
ATOM 744 CG GLN 52 .187 -6.325 -4.321 1.00 0.00
ATOM 745 CD GLN 52 .433 -6.459 -5.850 1.00 0.00
ATOM 746 OEl GLN 52 4.719 -7.087 -6.610 1.00 0.00
ATOM 747 NE2 GLN 52 6.626 -6.057 -6.295 1.00 0.00
ATOM 748 HA GLN 52 4.215 -6.420 -1.918 1.00 O'.OO
ATOM 749 HB3 GLN 52 3.041 -6.411 -4.651 1.00 0.00
ATOM 750 HB2 GLN 52 3.735 -7.936 -4.106 1.00 0.00
ATOM 751 HG3 GLN 52 5.981 -6.933 -3.890 1.00 0.00
ATOM 752 HG2 GLN 52 5.206 -5.246 -4.169 1.00 0.00
ATOM 753 HE22 GLN 52 7.370 -5.715 -5.705 1.00 0.00
ATOM 754 HE21 GLN 52 6.846 -6.278 -7.256 1.00 0.00
ATOM 755 H GLN 52 1.624 -7.707 -1.698, 1.00 0.00
ATOM 756 N LEU 53 3.142 -4.167 -2.241 1.00 0.00
ATOM 757 CA LEU 53 2.605 -2.80"2 -2.613 1.00 0.00
ATOM 758 C LEU 53 3.511 -2.208 -3.612 1.00 0.00
ATOM 759 O LEU 53 4.748 -2.176 -3.500 1.00 0.00
ATOM 760 CB LEU 53 2.456 -2.014 -1.292 1.00 0.00
ATOM 761 CG LEU 53 1.357 -0.961 -1.452 1.00 0.00
ATOM 762 CDl LEU 53 0.863 -0.639 -0.037 1.00 0.00
ATOM 763 CD2 LEU 53 1.917 0.268 -2.162 1.00 0.00
ATOM 764 HA LEU 53 1.587 -2 .982 -2.959 1.00 0.00
ATOM 765 HB3 LEU 53 3.411 .507 -1.162 1.00 0.00
ATOM 766 HB2 LEU 53 2.234 -2.652 -0.435 1.00 0.00
ATOM 767 HG LEU 53 0.477 -1.371 -1.947 1.00 0.00
ATOM 768 HD21 LEU 53 1. ,246 1.072 -1.860 1.00 0.00
ATOM 769 HD22 LEU 53 2. ,899 0.546 -1.781 1.00 0.00
ATOM 770 HD23 LEU 53 1. ,877 0.181 -3.249 1.00 0.00
ATOM 771 HDIl LEU 53 0.193 0.220 0.012 1.00 0.00
ATOM 772 HD12 LEU 53 0.111 -1.409 0.134 1.00 0.00
ATOM 773 HD13 LEU 53 1.687 -0.593 0.674 1.00 0.00
ATOM 774 H LEU 53 4.147 -4.271 -2.233 1.00 0.00
ATOM IIb N LEU 54 2.867 —1 711 -4.667 1.00 0.00
ATOM 776 CA LEU 54 3.617 -1.492 -5.865 1.00 0.00
ATOM 777 C LEU 54 3.737 0.017 -6.245 1.00 0.00
ATOM 778 O LEU 54 4. ,818 0.501 -6.600 1.00 0.00
ATOM ' 779 CB LEU 54 2. ,966 -2.247 -7.008 1.00 0.00
ATOM 780 CG LEU 54 3.659 -2.305 -8.378 1.00 0.00
ATOM 781 CDl LEU 54 4.942 -3.172 -8.337 1.00 0.00
ATOM 782 CD2 LEU 54 2.704 -2 983 -9.316 1.00 0.00
ATOM 783 HA LEU 54 4.658 -1 793 -5.747 1.00 0.00
ATOM 784 HB3 LEU 54 1.967 -1 826 -7.120 1.00 0.00
ATOM 785 HB2 LEU 54 2.825 -3.279 -6.686 1.00 0.00
ATOM 786 HG LEU 54 3.972 -1.323 -8.735 1.00 0.00
ATOM 787 HD21 LEU 54 1.789 -2.400 -9.424 1, .00 0.00
ATOM 788 HD22 LEU 54 3.171 -3.006 -10.302 1,.00 0.00
ATOM 789 HD23 LEU 54 2.361 -3.978 -9.036 1,.00 0.00
ATOM 790 HDIl LEU 54 5.620 -2.713 -7.618 1,.00 0.00
ATOM 791 HD12 LEU 54 4.711 -4.129 -7.871 1,.00 0.00
ATOM 792 HD13 LEU 54 5, .425 -3.276 -9.309 1,.00 0.00
ATOM 793 H LEU 54 1, .857 -1.708 -4.648 1..00 0.00
ATOM 794 N SER 55 2, .561 0.704 -6.298 1,,00 0.00
ATOM 795 CA SER 55 2..402 2.072 -6.849 1.,00 0.00
ATOM 796 C SER 55 1, .253 2.848 -6.206 1.00 0.00
ATOM 797 O SER 55 0.125 2.400 -6.040 1.00 0.00
ATOM 798 CB SER 55 2.130 1.935 -8.320 1.00 0.00
ATOM 799 OG SER 55 3.120 1. .269 -9.021 1.00 0.00
ATOM 800 HA SER 55 3.385 2, .542 -6.809 1.00 0.00
ATOM 801 HB3 SER 55 2.033 2, .910 -8.799 1.00 0.00
ATOM 802 HB2 SER 55 1..185 1..413 -8.465 1.00 0.00
ATOM 803 HG SER 55 2, ,639 0.700 -9.627 1.00 0.00
ATOM 804 H SER 55 1.739 0.119 -6.257 1.00 0.00
ATOM 805 N VAL 56 1.456 4.171 -6.011 1.00 0.00
ATOM 806 CA VAL 56 0.348 5.049 -5.471 00 0.00
ATOM 807 C VAL 56 0.366 6.394 -6.218 00 0.00
ATOM 808 O VAL 56 1.403 6.743 -6.752 00 0.00
ATOM 809 CB VAL 56 0.430 5.360 -3.964 00 0.00
ATOM 810 CGI VAL 56 0.321 4.114 -3.200 00 0.00
ATOM 811 CG2 VAL 56 1.661 6.163 -3.52Q. 00 0.00
ATOM 812 HA VAL 56 -0.625 4.593 -5.650 00 0.00
ATOM 813 HB VAL 56 -0.480 5..907 -3.716 00 0.00
ATOM 814 HGIl VAL 56 1.180 3, .502 -3.474 00 0.00
ATOM 815 HG12 VAL 56 0.366 4, .258 -2.120 00 0.00
ATOM 816 HG13 VAL 56 -0.670 3..667 -3.275 00 0.00
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ATOM 820 H VAL 56 2.290 4. ,620 -6.362 00 0.00
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ATOM 822 CA ASP 57 0.873 8.401 -6.985 00 , 0.00
ATOM 823 C ASP 57 0.402 8.240 -8.422 00 0.00
ATOM 824 O ASP 57 0.352 9.040 -8.932 00 0.00
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ATOM 832 H ASP 57 -1 673 6.754 -6.014 00 0.00
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ATOM 834 CA GLY 58 0.351 6.755 -10.376 00 0.00
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ATOM 844 CB ARG 59 4.319 7.587 -9.847 1,.00 0.00
ATOM 845 CG ARG 59 3.878 8.510 -10.970 1.00 0.00
ATOM 846 CD ARG 59 4.675 9.885 -10.944 1.00 0.00
ATOM 847 NE ARG 59 4.460 10.684 -9.646 .00 0.00
ATOM 848 CZ ARG 59 293 11.025 -9.161 .00 0.00
ATOM 849 NHl ARG 59 143 11.430 -7.964 .00 0.00
ATOM 850 NH2 ARG 59 227 11.056 -9.900 .00 0.00
ATOM 851 HA ARG 59 612 5.897 -10.832 ,00 0.00
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ATOM 853 HB2 ARG 59 4.076 8.169 -8.958 1.00 0.00
ATOM 854 HG3 ARG 59 2.813 8.659 -10.789 1.00 0.00
ATOM 855 HG2 ARG 59 4.041 7.978 -11.907 1.00 0.00
ATOM 856 HD3 ARG 59 4.237 10.474 -11.749 1.00 0.00
ATOM 857 HD2 ARG 59 5.739 9.765 -11.152 1.00 0.00
ATOM 858 HE ARG 59 5 .238 1 100..669900 -9.003 1.00 0.00
ATOM 859 HH12 ARG 59 2 .214 1111..558844 -7.599 1.00 0.00
ATOM 860 HHIl ARG 59 3 .935 1111..113377 -7.410 1.00 0.00
ATOM 861 HH22 ARG 59 1.341 1111..441100 -9.567 1 00 0.00
ATOM 862 HH21 ARG 59 2.312 1100..771199 -10.848 1 00 0.00
ATOM 863 H ARG 59 1.808 6.6.06 -8.663 1 00 0.00
ATOM 864 N SER 60 5.272 4.786 -9.128 1 00 0.00
ATOM 865 CA SER 60 5.827 3.628 -8.470 1 00 0.00
ATOM 866 C SER 60 6.203 3.942 .060 1 00 0.00
ATOM 867 O SER 60 6.885 4.949 -6.809 1 00 0.00
ATOM 868 CB SER 60 7 , 063 3.190 -9.285 1 00 0.00
ATOM 869 OG ' SER 60 7 .649 2.036 -8.702 1 00 0.00
ATOM 870 HA SER 60 5 , 099 2.818 -8.497 1.00 0.00
ATOM 871 HB3 SER 60 7.842 3.944 -9.390 1.00 0.00
ATOM 872 HB2 SER 60 6.699 2.917 -10.275 1.00 0.00
ATOM 873 HG SER 60 7.185 1.254 -9.009 00 0.00
ATOM 874 H SER 60 5.690 4.981 -10.027 00 0.00
ATOM 875 N LEU 61 5.989 3, .026 -6.108 00 0.00
ATOM 876 CA LEU 61 6.529 3..160 -4.729 00 0.00
ATOM. 877 C LEU 61 7.487 2..026 -4.220 00 0.00
ATOM 878 O LEU 61 8.148 2..160 -3.220 00 0.00
ATOM 879 CB LEU 61 5.293 3.307 -3.797 00 0.00
ATOM 880 CG LEU 61 5.465 4.029 -2.533 00 0.00
ATOM 881 CDl LEU 61 5.648 5.537 -2.726 00 0.00
ATOM 882 CD2 LEU 61 4 . 216 3.758 -1 693 00 0.00
ATOM 883 HA LEU 61 7 . 069 4.104 -4 660 00 0.00
ATOM 884 HB3 LEU 61 5 . 001 2.273 -3.609 00 0.00
ATOM 885 HB2 LEU 61 4 . 398 3.727 -4.256 00 0.00
ATOM 886 HG LEU 61 6 . 348 3,,623 -2.037 00 0.00
ATOM 887 HD21 LEU 61 3 . 987 2,,692 -1.690 00 0.00
ATOM 888 HD22 LEU 61 4 . 272 4.118 -0.666 00 0.00
ATOM 889 HD23 LEU 61 3 . 354 4.114 -2.257 00 0.00
ATOM 890 HDIl LEU 61 6 . 383 5..762 -3.498 1.00 0.00
ATOM 891 HD12 LEU 61 4 . 672 5.997 -2. 881 00 0.00
ATOM 892 HD13 LEU 61 6 . 111 6.002 -1 857 00 0.00
ATOM 893 H LEU 61 5 . 469 2.196 -6.353 00 0.00
ATOM 894 N VAL 62 7 . 477 0.903 -4.949 00 0.00
ATOM 895 CA VAL 62 8 . 144 -0.367 -4.603 00 0.00
ATOM 896 C VAL 62 9 . 518 -0.253 -4.010 00 0.00
ATOM 897 O VAL 62 9 . 842 -1.093 -3.151 1.00 0.00
ATOM 898 CB VAL 62 8.188 -1 150 -5.958 00 0.00
ATOM 899 CGI VAL 62 9.153 0.589 -7.044 00 0.00
ATOM 900 CG2 VAL 62 8.371 2.711 -5.801 00 0.00
ATOM 901 HA VAL 62 7.476 0.812 -3.865 00 0.00
ATOM 902 HB VAL 62 7.203 -1 052 -6.414 00 0.00
ATOM 903 HGIl VAL 62 10.165 0.547 -6.641 00 0.00
ATOM 904 HG12 VAL 62 9.073 1.204 -7.941 00 0.00
ATOM 905 HGl3 VAL 62 8.883 0.453 -7.218 00 0.00
ATOM 906 HG21 VAL 62 9.231 -2 937 -5.171 00 0.00
ATOM 907 HG22 VAL 62 7.424 3.033 -5.367 00 0.00
ATOM 908 HG23 VAL 62 8.551 3.249 -6.731 00 0.00
ATOM 909 H VAL 62 6.876 0.916 -5.759 00 0.00
ATOM 910 N GLY 63 10.288 0.756 -4.394 00 0.00
ATOM 911 CA GLY 63 11.671 0.994 -3.968 1.00 0.00
ATOM 912 C GLY 63 11.887 2.041 -2.923 .00 0.00
ATOM 913 O GLY 63 13.047 2.199 -2.436 .00 0.00
ATOM 914 HA3 GLY 63 12.225 1.316 -4.850 .00 0.00
ATOM 915 HA2 GLY 63 12.165 0.082 -3.632 ,00 0.00
ATOM 916 H GLY 63 9.905 1.480 -4.986 .00 0.00
ATOM 917 N LEU 64 10.805 2.603 -2.445 ,00 0.00
ATOM 918 CA LEU 64 10.796 3.505 -1.268 ,00 0.00
ATOM 919 C LEU 64 10.942 2.742 0.077 ,00 0.00
ATOM 920 O LEU 64 10.473 1.615 0.190 ,00 0.00
ATOM 921 CB LEU 64 9.727 4.625 -1.242 ,00 0.00
ATOM 922 CG LEU 64 9.617 5.501 -2.473 .00 0.00
ATOM 923 CDl LEU 64 8.999 6.839 -2.065 .00 0.00
ATOM 924 CD2 LEU 64 10.942 5.782 -3.213 ,00 0.00
ATOM 925 HA LEU 64 11.756 4.011 -1.233 ,00 0.00
ATOM 926 HB3 LEU 64 9.941 5.259 -0.381 ,00 0.00
ATOM 927 HB2 LEU 64 8.729 4.247 -1, 019 1.00 0.00
ATOM 928 HG LEU 64 8.959 4.974 -3.163 00 0.00
ATOM 929 HD21 LEU 64 11.485 6.503 -2.603 00 0.00
ATOM 930 HD22 LEU 64 11.519 4.875 -3.389 00 0.00
ATOM 931 HD23 LEU 64 10.847 6.249 -4 194 00 0.00
ATOM 932 HDIl LEU 64 9.574 7.492 -1 407 00 0.00
ATOM 933 HD12 LEU 64 8.879 7.378 -3, 004 00 0.00
ATOM 934 HD13 LEU 64 8.045 6.781 -1 .540 00 0.00
ATOM 935 H LEU 64 9.941 2.338 _9 .896 00 0.00
ATOM 936 N SER 65 11.602 3.332 1 .076 00 0.00
ATOM 937 CA SER 65 11.591 2.806 2 .469 00 0.00
ATOM 938 C SER 65 10.165 2.793 3 .049 00 0.00
ATOM 939 O SER 65 9.395 3, .708 2 2. .842 00 0.00
ATOM 940 CB SER 65 12.545 3..603 3 3. .367 00 0.00
ATOM • 941 OG SER 65 13.729 3,.803 2 .733 00 0.00
ATOM 942 HA SER 65 11.952 1,.786 2 .339 00 0.00
ATOM 943 HB3 SER 65 12.823 2.951 4 .194 00 0.00
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ATOM 945 HG SER 65 14.359 4.089 3 .399 00 0.00
ATOM 946 H SER 65 12.037 4.232 0 .933 00 0.00
ATOM 947 N GLN 66 9.817 1,.843 3 3, .964 00 0.00
ATOM 948 CA GLN 66 8.451 1,.920 4 4 .529 00 0.00
ATOM 949 C GLN 66 8.174 3..139 5 5' '.264 00 0.00
ATOM 950 O GLN 66 7.116 3..650 5 5. .193 00 0.00
ATOM 951 CB GLN 66 8.096 0.634 5 5. .312 00 0.00
ATOM 952 CG GLN 66 8.919 0.369 6 6. .600 00 0.00
ATOM 953 CD GLN 66 8.652 1.378 7.745 1.00 0.00
ATOM 954 OEl GLN 66 7.474 1.565 8.157 1.00 0.00
ATOM 955 NE2 GLN 66 9.691 1.985 8.201 1.00 0.00
ATOM 956 HA GLN 66 7.829 1.901 3.634 1.00 0.00
ATOM 957 HB3 GLN 66 8.323 -0.183 4.627 1.00 0.00
ATOM 958 HB2 GLN 66 7.066 0.688 5.668 1.00 0.00
ATOM 959 HG3 GLN 66 9.959 ' 0.265 6.291 1.00 0.00
ATOM 960 HG2 GLN 66 8.653 -0.639 6.922 1.00 0.00
ATOM 961 HE22 GLN 66 10.576 1.942 7.714 1.00 0.00
ATOM 962 HE21 GLN 66 9.532 2.541 9.028 1.00 0.00
ATOM 963 H GLN 66 10.469 1.079 3.860 1.00 0.00
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ATOM 966 C GLU 67 8.828 6.254 5.626 1.00 0.00
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ATOM 1115 O THR 76 3.784 12.413 1.041 1.,00 0.00
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ATOM 1117 OGl THR 76 1.912 10.672 -2.287 1.,00 0.00
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ATOM 1127 CA SER 77 -5.580 12.379 -0 . 911 00 0.00
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ATOM 1130 CB SER 77 -5.696 13.573 1 . 855 ,00 0.00
ATOM 1131 OG SER 77 -5.127 13.350 ■3 . 193 ,00 0.00
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ATOM 1139 C SER 78 -9.550 10.128 2 . 010 1..00 0.00
ATOM 1140 O SER 78 10.708 9.656 2 . 066 1.00 0.00
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ATOM 1150 C VAL 79 -8.007 9.075 -5.274 1. ,00 0.00
ATOM 1151 O VAL 79 -8.249 8.539 -6.343 .00 0.00
ATOM 1152 CB VAL 79 -9.623 10.965 -5 440 .00 0.00
ATOM 1153 CGI VAL 79 10.723 10.523 6.452 ,00 0.00
ATOM 1154 CG2 VAL 79 10.218 12.114 4.613 ,00 0.00
ATOM 1155 HA VAL 79 -9.842 8.978 4.437 ,00 0.00
ATOM 1156 HB VAL 79 -8.771 11.434 -5 935 ,00 0.00
ATOM 1157 HGIl VAL 79 10.338 9.806 7.178 ,00 0.00
ATOM 1158 HG12 VAL 79 11.501 10.019 5.877 1.00 0.00
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ATOM 1161 HG22 VAL 79 -9.503 12.554 -3, 918 00 0.00
ATOM 1162 HG23 VAL 79 10.623 12.867 -5, 290 00 0.00
ATOM 1163 H VAL 79 -7.767 10.564 -3.006 00 0.00
ATOM 1164 N VAL 80 -6.773 9.041 -4.827 00 0.00
ATOM 1165 CA VAL 80 -5.645 8.379 -5.551 00 0.00
ATOM 1166 C VAL 80 -5.787 6.843 -5.617 00 0.00
ATOM 1167 O VAL 80 -6.396 6.292 -4.732 00 0.00
ATOM 1168 CB VAL 80 -4.266 8.763 -4.942 00 0.00
ATOM 1169 CGI VAL 80 -3.957 10.267 -4, 801 00 0.00
ATOM 1170 CG2 VAL 80 -4.051 8.062 -3, 610 00 0.00
ATOM 1171 HA VAL 80 -5.610 8.847 -6.535 00 0.00
ATOM 1172 HB VAL 80 -3.531 8.347 -5.631 00 0.00
ATOM 1173 HGIl VAL 80 -4.321 10.854 -5.644 00 0.00
ATOM 1174 HG12 VAL 80 -4.430 10.573 -3.868 00 0.00
ATOM 1175 HGl3 VAL 80 -2.873 10.375 -4.747 00 0.00
ATOM 1176 HG21 VAL 80 -4.143 6.984 -3.738 00 0.00
ATOM 1177 HG22 VAL 80 -3.007 8.283 -3.387 1.00 0.00
ATOM 1178 HG23 VAL 80 4.727 8.398 -2.824 00 0.00
ATOM 1179 H VAL 80 6.548 9.519 -3.965 00 0.00
ATOM 1180 N THR 81 5.239 6.285 -6.723 00 0.00
ATOM 1181 CA THR 81 5.116 4.803 -6.878 00 0.00
ATOM 1182 C THR 81 4.024 4.311 -5.897 00 0.00
ATOM 1183 O THR 81 2.957 4.942 -5.711 1.00 0.00
ATOM 1184 CB THR 81 4.693 4.453 -8.305 00 0.00
ATOM 1185 OGl THR 81 3.570 5.271 -8.786 00 0.00
ATOM 1186 CG2 THR 81 5.874 4.747 -9.354 1.00 0.00
ATOM 1187 HA THR 81 5.949 4.195 -6.524 00 0.00
ATOM 1188 HB THR 81 4.498 3.392 -8.459 00 0.00
ATOM 1189 HGl THR 81 2.744 4.849 -8.539 1.00 0.00
ATOM 1190 HG23 THR 81 6.727 4.176 -8.987 1. ,00 0.00
ATOM 1191 HG21 THR 81 6.153 5.794 -9.229 1..00 0.00
ATOM 1192 HG22 THR 81 5.442 4.342 -10.268 1.00 0.00
ATOM 1193 H THR 81 4.664 6.736 -7.420 1.00 0.00
ATOM 1194 N LEU 82 4.148 3.054 -5.383 1..00 0.00
ATOM 1195 CA LEU 82 3.139 2.218 -4.693 1,.00 0.00
ATOM 1196 C LEU 82 -3.172 0.766 -5.309 1.,00 0.00
ATOM 1197 O LEU 82 -4.240 0.318 -5.716 1..00 0.00
ATOM 1198 CB LEU 82 -3.300 2.269 -3.168 1..00 0.00
ATOM 1199 CG LEU 82 4.706 1.918 -2.680 1. 00 0.00
ATOM 1200 CDl LEU 82 4.722 0.899 -1.499 1. ,00 0.00
ATOM 1201 CD2 .LEU 82 5.505 3.078 -2.185 1.,00 0.00
ATOM 1202 HA LEU 82 2.209 2.718 -4.968 1. 00 0.00
ATOM 1203 HB3 LEU 82 -3 090 3.267 -2.782. 1. 00 0.00
ATOM 1204 HB2 LEU 82 -2.571 1.622 -2.679 1.00 0.00
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ATOM 1208 HD23 LEU 82 -5.487 3.836 -2.968 1.00 0.00
ATOM 1209 HDIl LEU 82 -4.013 0.131 -1.807 1.00 0.00
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ATOM 1211 HD13 LEU 82 -5, 683 0.458 -1.235 1.00 0.00
ATOM 1212 H LEU 82 -4, 968 2.545 -5.680 1.00 0.00
ATOM 1213 N GLU 83 -1.994 0.189 -5.536 1.00 0.00
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ATOM 1216 O GLU 83 0.149 -2.027 -5.139 1.00 0.00
ATOM 1217 CB GLU 83 ■0.951 -0.763 -7.486 1.00 0.00
ATOM 1218 CG GLU 83 -1 679 0.013 -8.625 1.00 0.00
ATOM 1219 CD GLU 83 ■1.653 -0.606 -10.080 1.00 0.00
ATOM 1220 OEl GLU 83 ■2.669 -0.757 -10.731 1.00 0.00
ATOM 1221 OE2 GLU 83 ■0.598 -1.067 -10.591 1.00 0.00
ATOM 1222 HA GLU 83 ■2.722 -1.542 -6.562 1.00 0.00
ATOM 1223 HB3 GLU 83 ■0.497 -1.693 -7.825 1.00 0.00
ATOM 1224 HB2 GLU 83 •0.215 -0.031 -7.151 1.00 0.00
ATOM 1225 HG3 GLU 83. ■1.281 1.019 -8.762 1.00 0.00
ATOM 1226 HG2 GLU 83 ■2.734 0.044 -8.353 1.00 0.00
ATOM 1227 H GLU 83 -1.221 0.823 -5.397 1.00 0.00
ATOM 1228 N VAL 84 .784 -3.116 -4.899 1.00 0.00
ATOM 1229 CA VAL 84 .440 -4.029 -3.773 1.00 0.00
ATOM 1230 C VAL 84 .723 -5.482 -4.181 1.00 0.00
ATOM 1231 O VAL 84 .443 -5.825 -5.093 1.00 0.00
ATOM 1232 CB VAL 84 .182 -3.466 -2.549 1.00 0.00
ATOM 1233 CGI VAL 84 -3.695 -3.570 -2.635 1.00 0.00
ATOM 1234 CG2 VAL 84 -1.649 -4.104 -1.266 1.00 0.00
ATOM 1235 HA VAL 84 -0.362 -3.945 -3.635 1.00 0.00
ATOM 1236 HB -VAL 84 -1.940 -2.405 -2.485 1.00 0.00
ATOM 1237 HGIl VAL 84 -4.074 -4.571 -2.428 1.00 0.00
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ATOM 1239 HG13 VAL 84 -3.974 -3.181 -3.615 1.00 0.00
ATOM 1240 HG21 VAL 84 -1.999 -5.135 -1.223 1.00 0.00
ATOM 1241 HG22 VAL 84 -0.572 -3.966 -1.176 1.00 0.00
ATOM 1242 HG23 VAL 84 -2.087 -3.670 -0.367 1.00 0.00
ATOM 1243 H VAL 84 -2.632 -3.270 -5.425 1.00 0.00
ATOM 1244 N ALA 85 -1.115 -6.383 -3.412 1.00 0.00
ATOM 1245 CA ALA 85 -1.012 -7.823 -3.726 1.00 0.00
ATOM 1246 C ALA 85 -0.801 -8.702 -2.531 1.00 0.00
ATOM 1247 O ALA 85 -0.279 -8.327 -1.407 1.00 0.00
ATOM 1248 CB ALA 85 0.196 -7.944 -4.692 1.00 0.00
ATOM 1249 HA ALA 85 -1.930 -8.089 -4.250 1.00 0.00
ATOM 1250 OXT ALA 85 -1.159 -9.943 -2.647 1.00 0.00
ATOM 1251 HBl ALA 85 0.254 -8.992 -4.989 1.00 0.00
ATOM 1252 HB2 ALA 85 0.138 -7.315 -5.580 1.00 0.00
ATOM 1253 HB3 ALA 85 1.099 -7.691 -4.137 1.00 0.00
ATOM 1254 H ALA 85 -0.478 -6.163 -2.661 1.00 0.00
TER 1255 ALA 85
ATOM 1256 H7 CPX 86 -4.120 5.294 9.673 1.00 0.00
ATOM 1257 C8 CPX 86 -3.665 5.010 8.723 1.00 0.00
ATOM 1258 S12 CPX 86 -3.287 6.586 7.972 1.00 0.00
ATOM 1259 CIl CPX 86 -4.417 6.307 6.624 1.00 0.00
ATOM 1260 NlO CPX 86 -5.082 5.115 6.815 1.00 0.00
ATOM 1261 C9 CPX 86 -4.804 4.36-6 7.928 1.00 0.00
ATOM 1262 017 CPX 86 -5.258 3.252 8.008 1.00 0.00
ATOM 1263 S18 CPX 86 -4.546 7.344 5.191 1.00 0.00
ATOM 1264 H8 CPX 86 -3.859 8.080 5.246 1.00 0.00
ATOM 1265 C7 CPX 86 -2.494 4.145 9.156 1.00 0.00
ATOM 1266 H6 CPX 86 -1.710 4.763 9.591 1.00 0.00
ATOM 1267 H5 CPX 86 -2.875 3.414 9.869 1.00 0.00
ATOM 1268 Cl CPX 86 -1.819 3.419 8.024 1.00 0.00
ATOM 1269 C6 CPX 86 -1.127 4.125 7.018 1.00 0.00
ATOM 1270 C5 CPX 86 -0.672 3.562 5.816 1.00 0.00
ATOM 1271 C4 CPX 86 -0.745 2.219 5.533 1.00 0.00
ATOM 1272 C3 CPX 86 -1.462 1.494 6.492 1.00 0.00
ATOM 1273 C2 CPX 86 -2.060 2.073 7.698 1.00 0.00
ATOM 1274 Hl CPX 86 -2.541 1.411 8.403 1.00 0.00
ATOM 1275 H2 CPX 86 -1.434 0.425 6.344 1.00 0.00
ATOM 1276 C13 CPX 86 -0.008 1.610 4.371 1.00 0.00
ATOM 1277 F16 CPX 86 -0.175 0.223 4.425 1.00 0.00
ATOM 1278 F15 CPX 86 1.353 1.931 4.311 1.00 0.00
ATOM 1279 Fl4 CPX 86 -0.620 2.008 3.146 1.00 0.00
ATOM 1280 H3 CPX 86 -0.168 4.236 5.137 1.00 0.00
ATOM 1281 H4 CPX 86 -1.060 5.198 7.120 1.00 0.00
TER 1282 CPX 86
HETATM 1283 H19 H19 1 -3.181 7.132 4.106 1.00 0.00
CONECT 1 2 15 16 17
CONECT 5 2 6 11 12
CONECT 6 5 7 13 14
CONECT 11 5
CONECT 13 6
CONECT 15 1
CONECT 16 1
CONECT 17 1
CONECT 23 22 25 28 29
CONECT 28 23
CONECT 42 41 44 47 48
CONECT 47 42
CONECT 104 101 105 109 110
CONECT 109 104
CONECT 123 120 124 129 130
CONECT 124 123 125 131 132
CONECT 125 124 126 133 134
CONECT 126 125- 127 135 136
CONECT 129 123
CONECT 131 124
CONECT 133 125
CONECT 135 126
CONECT 145 142 146 151 152
CONECT 146 145 147 153 154
CONECT 147 146 148 155 156
CONECT 148 147 149 157 158
CONECT 151 145
CONECT 153 146
CONECT 155 147
CONECT 157 148
CONECT 167 164 168 173 174
CONECT 168 167 169 175 176
CONECT 173 167
CONECT 175 168
CONECT 184 181 185 189 190
CONECT 189 184
CONECT 195 194 196 198 199
CONECT 198 195
CONECT 205 202 206 210 211
CONECT 206 205 207 212 213
CONECT 210 205
CONECT 212 206-
CONECT 219 218 220 222 223
CONECT 222 219
CONECT 229 226 230 234 235
CONECT 234 229
CONECT 248 245 249 251 252
CONECT 251 248
CONECT 260 259 262 265 266
CONECT 265 260
CONECT 314 311 315 320 321
CONECT 315 314 316 322 323
CONECT 316 315 317 324 325
CONECT 317 316 318 326 327
CONECT 320 314
CONECT 322 315
CONECT 324 316
CONECT 326 317
CONECT 333 332 334 336 337
CONECT 336 333
CONECT 350 349 351 353 354
CONECT 353 350
CONECT 360 357 361 366 367
CONECT 361 360 362 368 369
CONECT 366 360
CONECT 368 361
CONECT 377 374 378 382 383
CONECT 382 377
CONECT 389 386 390 395 396
CONECT 390 389 391 397 398
CONECT 391 390 392 399 400
CONECT 392 391 393 401 402
CONECT 395 389
CONECT 397 390
CONECT 399 391
CONECT 401 392
CONECT 411 408 412 416 417
CONECT 416 411
CONECT 427 426 428 430 431
CONECT 430 427
CONECT 438 437 440 443 444
CONECT 443 438
CONECT 456 453 457 465 466
CONECT 465 456
CONECT 493 490 494 499 500
CONECT 494 493 495 501 502
CONECT 495 494 496 503 504
CONECT 496 495 497 505 506
CONECT 499 493
CONECT 501 494
CONECT 503 495
CONECT 505 496
CONECT 515 512 516 518 519
CONECT 518 515
CONECT 558 555 559 564 565
CONECT 559 558 560 566 567
CONECT 560 559 561 568 569
CONECT 561 560 562 570 571
CONECT 564 558
CONECT 566 559
CONECT 568 560
CONECT 570 561
CONECT 577 576 578 580 581
CONECT 580 577
CONECT 584 583 585 587 588
CONECT 587 584
CONECT 614 611 615 619 620
CONECT 619 614
CONECT 642 639 643 647 648
CONECT 647 642
CONECT 651 650 652 654 655
CONECT 654 651
CONECT 661 658 662 669 670
CONECT 662 661 663 671 672
CONECT 663 662 664 673 674
CONECT 669 661
CONECT 671 662
CONECT 673 663
CONECT 685 682 686 690 691
CONECT 690 685
CONECT 721 720 722 724 725
CONECT 724 721
CONECT 731 728 732 736 737
CONECT 736 731
CONECT 743 740 744 749 750
CONECT 744 743 745 751 752
CONECT 749 743
CONECT 751 744
CONECT 760 757 761 765 766
CONECT 765 760
CONECT 779 776 780 784 785
CONECT 784 779
CONECT 798 795 799 801 802
CONECT 801 798
CONECT 825 822 826 830 831
CONECT 830 825
CONECT 834 833 835 837 838
CONECT 837 834
CONECT 844 841 845 852 853
CONECT 845 844 846 854 855
CONECT 846 845 847 856 857
CONECT 852 844
CONECT 854 845
CONECT 856 846
CONECT 868 865 869 871 872
CONECT 871 868
CONECT 879 876 880 884 885
CONECT 884 879
CONECT 911 910 912 914 915
CONECT 914 911
CONECT 921 918 922 926 927
CONECT 926 921
CONECT 940 937 941 943 944
CONECT 943 940
CONECT 951 948 952 957 958
CONECT 952 951 953 959 960
CONECT 957 951
CONECT 959 952
CONECT 968 965 969 974 975
CONECT 969 968 970 976 977
CONECT 974 968
CONECT 976 969
CONECT 983 980 984 991 992
CONECT 984 983 985 993 994
CONECT 985 984 986 995 996
CONECT 991 983
CONECT 993 984
CONECT 995 985
CONECT 1027 1024 1028 1033 1034
CONECT 1028 1027 1029 1035 1036
CONECT 1033 1027
CONECT 1035 1028
CONECT 1042 1039 1043 1047 1048
CONECT 1047 1042
CONECT 1061 1058 1062 1066 1067
CONECT 1062 1061 1063 1068 1069
CONECT 1066 1061
CONECT 1068 1062
CONECT 1092 1089 1093 1100 1101
CONECT 1093 1092 1094 1102 1103
CONECT 1094 1093 1095 1104 1105
CONECT 1100 1092
CONECT 1102 1093
CONECT 1104 1094
CONECT 1130 1127 1131 1133 1134
CONECT 1133 1130
CONECT 1141 1138 1142 1144 1145
CONECT 1144 1141
CONECT 1198 1195 1199 1203 1204
CONECT 1203 1198
CONECT 1217 1214 1218 1223 1224
CONECT 1218 1217 1219 1225 1226
CONECT 1223 1217
CONECT 1225 1218
CONECT 1256 1257
CONECT 1257 1256 1258 1261 1265
CONECT 1258 1257 1259
CONECT 1259 1258 1260 1263
CONECT 1260 1259 1261
CONECT 1261 1257 1260 1262
CONECT 1262 1261
CONECT 1263 1259 1264
CONECT 1264 1263
CONECT 1265 1257 1266 1267 1268
CONECT 1266 1265
CONECT 1267 1265
CONECT 1268 1265 1269 1273
CONECT 1269 1268 1270 1281
CONECT 1270 1269 1271 1280
CONECT 1271 1270 1272 1276
CONECT 1272 1271 1273 1275
CONECT 1273 1268 1272 1274
CONECT 1274 1273
CONECT 1275 1272
CONECT 1276 1271 1277 1278 1279
CONECT 1277 1276
CONECT 1278 1276
CONECT 1279 1276
CONECT 1280 1270
CONECT 1281 1269
MASTER 0 0 0 0 0 1281 2 220
END
00779
Tabelle 2. Apparente Kd-Werte von Liganden der PDZ-Domänen von AFβ und Syntrophin.
Legende : n.d. = not determined;
Die Zahl hinter dem + Zeichen gibt die statistische Standardabweichung einer mathematischen Kurven-Anpassung an die chemische Bindungsgleichung „Protein + Ligand = Komplex" wider.
Claims
Patentansprüche :
1. Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I
Formel I
wobei Rl und R2 =0 oder =S und gleich oder verschieden sind, wobei R2 alternativ für zwei -H stehen kann, wobei R3 =CHR4, -CH2R4 oder -CHR5R4 ist, wobei R4 Phenyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder
3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes Phenyl; 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl; mit -HaI oder - C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl, 2- , 3-, 4-, oder 5-Furyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1,
2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Furyl; oder C1-C5
Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, wobei R5 C1-C5 Alkyl, linear oder verzeigt, oder
-CH2-CO-N(Ro)2 mit Rβ = C1-C5 Alkyl, linear oder
verzweigt, ist wobei das Ring -S- ersetzt sein kann durch -0-, -CH2- oder -CO-,
oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins .
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei R4 3-Thienyl, Phenyl, oder mit -HaI, vorzugsweise -Br, in para substituiertes Phenyl ist.
4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2~R4 ist, und R4 3-Furyl oder mit
-CHal3, vorzugsweise -CF3, in para substituiertes Phenyl ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei R4 Isopropyl oder mit -CHal3, vorzugsweise -CF3, in meta oder para substituiertes Phenyl ist.
7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2~R4 ist, und wobei R4 mit -HaI, insbesondere -Br, oder mit -CHa_-3, insbesondere -CF3 in para substituiertes Phenyl ist.
8. Verwendung einer Verbindung gemäß Formel II
Formel II wobei Rl -HaI oder C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist wobei R2 -H ist, und wobei R3 -NO2, -HaI, C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, wobei an Stelle von Rl und R2 ein Ring mit -CH=CHaI-
CH=CH- gebildet sein kann, oder wobei an Stelle von R2 und R3 ein Ring mit -CH=CH-
CH=CH- gebildet sein kann, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden
Proteins .
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei R3 -Br oder tertiär- Butyl ist.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei-' Rl -Cl, -Br, oder tertiär-Butyl ist. .?
11. Verwendung nach Anspruch 1, wobei Rl -Br ist und wobei an Stelle von R2 und R3 ein Ring mit -CH=CH-CH=CH- gebildet ist.
12. Verwendung nach Anspruch 1, wobei R3 -Br ist und wobei an Stelle von Rl und R2 ein Ring mit -CH=CBr-CH=CH- gebildet ist.
13. Verwendung einer Verbindung gemäß Formel III
Formel III wobei Rl -NO2 oder -HaI ist wobei R2 und R3 gleich oder verschieden und -H oder - HaI sind, wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J' ist, wobei freie Valenzen der Ringe mit Wasserstoff gebunden sind, oder ein physiologisch verträgliches Salz einer solchen Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Modulation eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins .
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei Rl, R2 und R3 -HaI, insbesondere -Cl sind.
15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei Rl -NO2 ist und wobei R2 und R3 -H sind.
6. Verbindung gemäß Formel I
Formel I
wobei Rl und R2 =0 oder =S und gleich oder verschieden sind, wobei R2 alternativ für zwei -H stehen kann, wobei R3 =CHR4, -CH2R4 oder -CHR5R4 ist, wobei R4 Phenyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1, 2, oder
3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes Phenyl; 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl; mit -HaI oder - C(HaI)n (n= 1, 2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Thienyl, 2- , 3-, 4-, oder 5-Furyl; mit -HaI oder -C(HaI)n (n= 1,
2, oder 3) einfach, zweifach oder dreifach substituiertes 2-, 3-, 4-, oder 5-Furyl; oder C1-C5 Alkyl, linear oder verzweigt, ist, , wobei -HaI -F, -Cl, -Br, oder -J ist, wobei R5 C1-C5 Alkyl, linear oder verzeigt, oder -CH2-CO-N(Ro)2 mit R6 = C1-C5 Alkyl, linear oder
verzweigt, ist, wobei freie Valenzen des Ringes mit Wasserstoff gebunden sind, wobei R4 nicht 2-Furyl oder 2-Thienyl ist, wenn Rl =0 oder =S ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei R4 nicht Phenyl oder mit -CF3 oder -Br in meta oder para substituiertes Phenyl ist, wenn Rl =0 oder
=S ist, wenn R2 =0 ist, und wenn R3 =CH-R4 oder -CH2-
R4 ist, wobei R4 nicht Phenyl ist, wenn Rl =0 oder =S ist, wenn R2 =0 ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei R4 nicht mit -Br in para substituiertes Phenyl ist, wenn Rl und R2 =0 sind, und wenn R3 -CH2~R4 ist, wobei R4 nicht Isopropyl ist, wenn Rl =S ist, wenn R2
=0 ist, und wenn R3 =CH-R4 ist, wobei das Ring -S- ersetzt sein kann durch -0-, -CH2- oder -CO-, oder physiologisch verträgliches Salz einer solchen
Verbindung.
17. Verbindung nach Anspruch 16, wobei Rl =S ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist.
18. Verbindung nach Anspruch 17, wobei R4 3-Thienyl, Phenyl, oder mit -HaI, vorzugsweise -Br, in para substituiertes Phenyl ist.
19. Verbindung nach Anspruch 16, wobei Rl =S ist, wobei R2
=0 ist, wobei R3 -CH2-R4 ist, und R4 3-Furyl oder mit -CHal.3, vorzugsweise -CF3, in para substituiertes Phenyl ist.
20. Verbindung nach Anspruch 16, wobei Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 =CH-R4 ist.
21. Verbindung nach Anspruch 20, wobei R4 Isopropyl oder mit -CHal.3, vorzugsweise -CF3, in meta oder para substituiertes Phenyl ist.
22. Verbindung nach Anspruch 16, wobei Rl =0 ist, wobei R2 =0 ist, wobei R3 -CH2-R4 ist, und wobei R4 mit -HaI, insbesondere -Br, oder mit -CHal3, insbesondere -CF3 in para substituiertes Phenyl ist.
23. Verfahren zur Identifizierung eines Modulators eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins, wobei ein Strukturmodell eines Modulatorkandidaten zunächst mit einem Strukturmodell einer Referenzverbindung, die an die PDZ Domäne bindet, verglichen und bei Überlappung bioisosterer Atome des Modulatorkandidaten mit jenen der Referenzverbindung vorselektiert wird, und wobei dann der vorselektierte Modulatorkandidat mit einem Strukturmodell des Proteins in der Konformation eines Komplexes des Proteins mit der Referenzverbindung verglichen und untersucht wird, ob der
Modulatorkandidat an die PDZ Domäne bindet, wobei das Strukturmodel des Proteins oder des Komplexes hergleitet ist i) aus Strukturkoordinaten des Komplexes, ii) eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Fragmentes des Komplexes, oder eines Homologen zu i) oder ii) .
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vergleich das
Verbinden des Strukturmodells des Modulatorkandidaten mit dem Strukturmodell des Proteins umfasst, wobei optional die freie Bindungsenergie der Bindung zwischen Modulatorkandidat und Protein bestimmt wird, und wobei bei niedriger freier Bindungsenergie eine hohe Bindungswahrscheinlichkeit festgestellt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die freie Bindungsenergie berechnet wird: a) durch Summierung der freien Energien interatomarer Kontakte zwischen dem Strukturmodell des Modulatorkandidaten und dem Strukturmodell des Proteins, und/oder b) durch Bestimmung der freien Bindungsenergie zwischen dem Kraftfeld des Modulatorkandidaten und dem Kraftfeld des Proteins.
25. Verwendung von Strukturkoordinaten i) des mit einer Referenzverbindung komplexierten Proteins AF6, ii) eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Fragments von mit
der Referenzverbindung komplexierten AFβ, oder iii) eines Homologen zu i) oder ii) zur Identifizierung eines Modulators eines eine PDZ-Domäne enthaltenden Proteins, vorzugsweise in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 25.
27. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei die Strukturkoordinaten die der Tabelle I sind.
28. Maschinenlesbares Speichermedium enthaltend maschinenlesbare Daten, welche bei Auslesung und Verarbeitung mittels einer Datenverarbeitungsanlage mit einem geeignetem Programm eine Darstellung des Strukturmodells eines Proteins oder eines Komplexes gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 ergeben.
29. Computerprogramm mit einem Programmcode zur Ausübung eines Verfahrens oder einer Verwendung nach einem der Ansprüche 23 bis 27.
30. Datenverarbeitungsanlage umfassend ein
Computerprogramm nach Anspruch 29 und ein maschinenlesbares Speichermedium nach Anspruch 28.
31. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei
die Verbindung in physiologisch wirksamer Dosis mit zumindest einem Hilfs- oder Trägerstoff gemischt wird.
32. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 22 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei optional die Verbindung in physiologisch wirksamer Dosis mit zumindest einem Hilfs- oder Trägerstoff gemischt wird.
33. Komplex enthaltend das Protein AFβ und eine an die PDZ-Domäne des Proteins gebundene Substanz gemäß Anspruch 1.
34. Komplex nach Anspruch 33, wobei Rl =S, R2 =0, R3 -CH2- R4 und R4 in para mit CF3 substituiertes Phenyl ist, insbesondere Verbindung 1 ist.
35. Verwendung von Strukturkoordinaten eines Komplexes nach Anspruch 33 oder 34 zum Screenen nach Substanzen, welche an die PDZ-Domäne des Proteins AFβ binden.
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