EP1891229A2 - Verfahren zum identifizieren von fungizid wirksamen verbindungen basierend auf isopentenylpyrophosphat-isomerasen - Google Patents

Verfahren zum identifizieren von fungizid wirksamen verbindungen basierend auf isopentenylpyrophosphat-isomerasen

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Publication number
EP1891229A2
EP1891229A2 EP06742986A EP06742986A EP1891229A2 EP 1891229 A2 EP1891229 A2 EP 1891229A2 EP 06742986 A EP06742986 A EP 06742986A EP 06742986 A EP06742986 A EP 06742986A EP 1891229 A2 EP1891229 A2 EP 1891229A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ipp isomerase
activity
isomerase
ipp
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06742986A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Schreier
Birgitta Leuthner
Thorsten Leicher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience AG
Original Assignee
Bayer CropScience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer CropScience AG filed Critical Bayer CropScience AG
Publication of EP1891229A2 publication Critical patent/EP1891229A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi

Definitions

  • the invention relates to a method of identifying fungicides, the use of fungal isopentenyl pyrophosphate isomerase to identify fungicides, and the use of inhibitors of isopentenyl pyrophosphate isomerase as fungicides.
  • fungicides are often sought in essential biosynthetic pathways.
  • Ideal fungicides are also those substances which inhibit gene products which are of crucial importance in the expression of the pathogenicity of a fungus.
  • Isopentenyl pyrophosphate isomerase (EC 5.3.3.2), also known as isopentenyl pyrophosphate ⁇ isomerase, isopentenyl diphosphate ⁇ isomerase, or methylbutenyl pyrophosphate isomerase, catalyzes the isomerization of the carbon double bond of isopentenyl pyrophosphate (IPP), with dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP ) ( Figure 1).
  • the isopentenyl pyrophosphate isomerase - hereinafter also abbreviated to IPP isomerase or IPPI - thus catalyzes an essential step of isoprenoid biosynthesis with more than 23,000 known metabolites.
  • the synthetic route is described in all organisms and provides while different substance classes available. These include the sterols, carotenoids, dolichols, ubiquinones and prenylated proteins.
  • the IPP isomerase catalyzes the critical activation step in the pathway that converts isopentenyl pyrophosphate (IPP) into the highly electrophilic isomer dimethyl-allyl-diphosphate (DMAPP).
  • IPP and DMAPP are substrates for - prenyltransferases that synthesize polyisoprenoid chains.
  • the isoprenoid pathway occurs in all organisms and produces a variety of small, mostly lipophilic substances that perform a number of important functions.
  • Isoprenoids are synthesized in two different phases. The first phase of the synthesis is the stepwise construction of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A from three molecules of acetyl-CoA.
  • IPP isomerase Central to this first phase is the IPP isomerase, which provides both the isopentenyl phyrophosphate and the dimethylallyl phyrophosphate (Wouters et al., 2003). These two compounds are further condensed in a head to tail reaction to geranyl diphosphate. This can then be further processed in the metabolism depending on the organism to different products. For fungi, the synthesis of sterols is of essential importance.
  • the IPP isomerase is already known from a number of fungi (see also Figure 2). These include e.g. S. cerevisiae, S. pombe etc.
  • IPP isomerases are characterized by specific motifs at the amino acid level and can be identified, inter alia, from these motifs. For example, targeted mutagenesis in yeast has shown that two amino acids are essential. These are the amino acids Cys and GIn in positions 139 and 207 (S. cerevisiae, see also Fig. 2), embedded in the sequences CCSH and HEEDY, respectively (Street et al., 1994, Wouters et al, 2003).
  • Genes for the IPP isomerase have been cloned from various organisms, including from various yeasts such as Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No .: Pl 5496), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot Accession No .: QI Ol 32), and Phaffia rhodozyma (Swissprot Accession No .: 042641).
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No .: Pl 5496), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot Accession No .: QI Ol 32), and Phaffia rhodozyma (Swissprot Accession No .: 042641).
  • yeasts such as Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No .: Pl 5496), Schizosaccharomyces pombe (Swis
  • the object has been achieved by isolating the IPP isomerase-encoding nucleic acid (ipil) from a phytopathogenic fungus, U. maydis, the polypeptide encoded therefrom (IPI1) and providing a method with which inhibitors of this enzyme are determined can.
  • the inhibitors identified by this method can actually be used in vivo against fungi.
  • Figure 1 Schematic representation of the IPP isomerase-catalyzed isomerization of isopentenyl pyrophosphate to dimethylallyl pyrophosphate.
  • Figure 3 12% Bis-Tris-SDS gel to demonstrate heterologous expression of U.maydis IPP isomerase in E. coli.
  • Figure 4 Spore analog of the ipi-knock-out strains.
  • Candidate spores were streaked on medium (PD medium) without (1A-4A, PD / Hyg medium) and with selection 1B-4B.
  • the switched-off gene is essential, no spores may grow on PD / Hyg medium if all spores are haploid. Again and again it happens that diploid spores are selected as candidates. Therefore, in all cases where spores grew on PD / Hyg medium, they were examined by PCR analysis. It was shown that these spores were diploid, so they still contained a copy of the ipi wild-type gene.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleic acid sequence encoding the Ustilago maydis isopentenyl pyrophosphate isomerase.
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of the isopentenyl pyrophosphate isomerase from Ustilago maydis. definitions
  • identity is intended to mean the number of matching amino acids (identity) with other proteins, expressed as a percentage.
  • identity is determined by comparisons of a given sequence to other proteins using computer programs. If sequences that are compared to one another have different lengths, the identity must be determined in such a way that the number of amino acids which the shorter sequence has in common with the longer sequence determines the percentage of the identity.
  • the identity can be determined by standard means of known and publicly available computer programs such as ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680).
  • ClustalW is publicly available, for example, from Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) and Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 691 17 Heidelberg, Germany.
  • ClustalW can also be found on various websites, including the IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleisme et Cellulaire, BP163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) and the EBI ( ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) as well as on all mirrored websites of the EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 ISD, UK).
  • KTUPLE I
  • TOPDIAG 5
  • WINDO W 5
  • PAIRGAP 3
  • GAPOPEN IO
  • GAPEXTEND 0.05
  • GAPDIST 8
  • MAXDIV 40
  • sequence database searches one or more sequences are specified as so-called query. This query sequence is then compared by means of statistical computer programs with sequences contained in the selected databases.
  • Such database queries (“blast searches") are known to the person skilled in the art and can be carried out by various providers.
  • a protein according to the invention should therefore be understood as meaning those proteins which when using at least one of the identity determination methods described above, have an identity of at least 70%, preferably of at least 75%, more preferably of at least 80%, more preferably of at least 85%, and especially of at least 90%.
  • complete IPP isomerase describes an IPP isomerase encoded by a complete coding region of a transcriptional unit comprising an ATG start codon and comprising all the information-bearing exon regions of the organism of origin, for an IPP Isomerase coding gene, as well as the necessary for a correct termination of transcription signals.
  • biological activity of an IPP isomerase refers to the ability of a polypeptide to undergo the reaction described above, i. to catalyze the isomerization of the carbon double bond of isopentenyl pyrophosphate and dimethylallyl pyrophosphate.
  • active fragment describes no longer complete nucleic acids encoding IPP isomerase but which still encode polypeptides having the biological activity of an IPP isomerase, and the reaction characteristic of IPP isomerase, as above described catalyze. Such fragments are shorter than the above-described complete nucleic acids encoding IPP isomerase.
  • nucleic acids may have been removed both at the 3 'and / or 5' ends of the sequence, but parts of the sequence may also be deleted, i. have been removed that do not affect the biological activity of IPP isomerase crucial.
  • active fragment may also refer to the amino acid sequence of IPP isomerase, and then applies analogously to the above for those polypeptides which no longer contain certain parts compared to the complete sequence defined above, but the biological activity of the enzyme is not is decisively impaired.
  • the fragments can have different lengths.
  • IPP isomerase inhibition test or “inhibition test” as used herein refer to a method or assay that allows inhibition of the enzymatic activity of a polypeptide having the activity of an EPP isomerase by one or more of the detect multiple chemical compounds (candidate compound (s)) whereby the chemical compound can be identified as an inhibitor of IPP isomerase.
  • gene as used herein is the term for a portion of the genome of a cell responsible for the synthesis of a polypeptide chain.
  • fungicidal or “fungicidal” as used herein refers to chemical compounds which are suitable for controlling human, animal and phytopathogenic fungi, in particular phytopathogenic fungi. Such phytopathogenic fungi are named below, but the enumeration is not exhaustive:
  • Pythium species such as Pythium ultimum, Phytophthora species such as Phytophthora infestans, Pseudoperonospora species such as Pseudoperonospora humuli or Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara species such as Plasmopara viticola, Bremia species such as Bremia lactucae, Peronospora Species such as Peronospora pisi or P.
  • Erysiphe species such as Erysiphe graminis
  • Sphaerotheca species such as Sphaerotheca fuliginea
  • Podosphaera species such as Podosphaera leucotricha
  • Venturia species such as Venturia inaequalis
  • Pyrenophora species such as, for example, Pyrenophora teres or P.
  • Drechslera graminea
  • Cochliobolus species such as Cochliobolus sativus
  • Uromyces species such as, for example, Uromyces appendiculatus
  • Puccinia species such as Puccinia recondita
  • Sclerotinia-Ar such as Sclerotinia sclerotiorum
  • Tilletia species such as Tilletia caries
  • Ustilago species such as Ustilago n ⁇ da or Ustilago avenae
  • Pellicularia species such as Pellicularia sasakii
  • Pyricularia species such as Pyricularia oryzae
  • Fusarium species such as Fusarium culmorum
  • Botrytis species Septoria species such as Septoria nodorum
  • Leptosphaeria species such as Leptosphaeria species such as Leptos
  • fungicidal active substances which are found with the help of the IPP isomerases according to the invention from phytopathogenic fungi can also interact with IPP isomerase from human pathogenic fungus species, the interaction with the different IPP isomerases occurring in these fungi not always having to be equally strong.
  • the subject of the present invention is therefore also the use of inhibitors of IPP isomerase for the production of agents for the treatment of diseases caused by human pathogenic fungi.
  • Dermatophytes e.g. Trichophyton spec, Microsporum spec, Epidermophyton floccosum or Keratomyces ajelloi, which are e.g. Cause foot mycoses (tinea pedis),
  • Yeasts e.g. Candida albicans causing thrush oesophagitis and dermatitis, Candida glabrata, Candida krusei or Cryptococcus neoformans, which are e.g. can cause pulmonary cryptococcosis and also
  • Molds such as Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, e.g. bronchopulmonary aspergillosis or fungal sepsis, Mucor spec, Absidia spec, or Rhizopus spec.
  • zygomycoses intravascular mycoses
  • Rhinosporidium seeberi e.g. chronic granulomatous pharyngitis and tracheitis
  • Madurella myzetomatis e.g. subcutaneous mycetomas
  • Histoplasma capsulatum which is e.g. reticuloendothelial cytomycosis and M. darling causes, Coccidioides immitis, the z.
  • Pulmonary coccidioidomycosis and sepsis Pulmonary coccidioidomycosis and sepsis, Paracoccidioides brasiliensis, e.g. causes Brazilian blastomycosis, Blastomyces dermatitidis, e.g. Gilchrist's disease and North American blastomycosis, Loboa loboi, e.g. Keloid blastomycosis and Lobo's disease, and Sporothrix schenckii, which causes e.g. Sporotrichosis (granulomatous skin mycosis) causes.
  • IPP isomerase obtained, so can also interact with IPP isomerase from other numerous fungal species, especially with phytopathogenic fungi, the interaction with the different in these fungi occurring IPP isomerase does not always have to be the same strength. This explains, inter alia, the observed selectivity of the substances active on this enzyme.
  • homologous promoter refers to a promoter which controls the expression of the gene in question in the original organism.
  • heterologous promoter refers to a promoter that has other properties than the promoter that controls expression of the subject gene in the parent organism.
  • competitive refers to the property of the compounds to compete with other, optionally identifiable compounds for binding to the IPP isomerase and to displace or displace it from the enzyme.
  • the term "inhibitor” refers to a substance that directly inhibits an enzymatic activity of the IPP isomerase. Such an inhibitor is preferably "specific", i. it selectively inhibits IPP isomerase activity at a concentration lower than the concentration of inhibitor needed to elicit a different, unrelated effect. Preferably, the concentration is two fold lower, more preferably fivefold lower, and most preferably at least tenfold or fifty times lower than the concentration of a compound needed to produce a nonspecific effect.
  • modulator as used herein is a generic term for inhibitors and activators.
  • Modulators may be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to or influence the activity of the polypeptides of the invention.
  • modulators may be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which, in turn, binds to the polypeptides of the invention and thereby affects their biological activity.
  • Modulators may be natural substrates and ligands or structural or functional mimetics thereof.
  • the term “modulator” as used herein refers to those molecules that are not the natural substrates or ligands.
  • the complete sequence of an IPP isomerase from the plant pathogenic fungus Ustilago maydis is provided for the first time, the other
  • IPP isomerase has so far been limited primarily to its pharmacological importance (Cheng and Oldfield, 2004, Thompsom et al, 2002, Rohdich et al., 2004). In this case, inhibitors of this enzyme have also been processed, which are to find a pharmaceutical application. Inhibitors of IPP isomerase, such as natural inhibitors or transition state analogs of the IPP isomerase substrate have been described (Wouters et al., 2003).
  • the fungi IPP isomerase may be a target protein (a so-called "target") of fungicidally active substances.
  • target a target protein of fungicidally active substances.
  • the IPP isomerase is an enzyme which is particularly important for fungi and is therefore particularly suitable for use as a target protein for the search for further and improved fungicidally active compounds.
  • Inhibitors of the IPP isomerase with a fungicidal activity have not previously been described. It is known that the enzyme is essential in S. cerevisiae (Mayer et al., 1992). However, none of the publications comment on whether the fungal enzyme affects IPP isomerase, particularly in phytopathogenic fungi, by drugs, e.g. can be inhibited, and whether the control of fungi, in particular phytopathogenic fungi, in vivo with an IPP isomerase modulating agent is possible. The IPP isomerase has thus far not been described as a target protein for fungicides. There are no known active substances which have a fungicidal action and whose site of action is the IPP isomerase.
  • the IPP isomerase in the case of phytopathogenic fungi can be a point of attack or "target" for fungicidal active substances, ie inhibition of the IPP isomerase could lead to damage or death of the fungus.
  • Ustilago maydis a gene coding for an IPP isomerase according to SEQ ID NO: 1 was identified (ipil). The knockout of this gene proved lethal. No viable knockout spores were obtained from U. maydis.
  • the enzyme IPP isomerase could be further determined to be a polypeptide can be used to identify modulators or inhibitors of its enzymatic activity in suitable test methods, which is not self-evident in the case of various theoretically interesting targets.
  • the IPP isomerase can also be inhibited in vivo by active ingredients and a fungal organism treated with these active substances can be damaged and killed by the treatment with these active substances.
  • the inhibitors of a fungal IPP isomerase can therefore be used as fungicides in crop protection or as antimycotics in pharmaceutical indications.
  • the inhibition of IPP isomerase with a substance identified in a method according to the invention leads to the death of the treated fungi in synthetic media or on the plant.
  • the IPP isomerase can be obtained from various phytopathogenic or even human or animal pathogenic fungi, e.g. from mushrooms such as the phytopathogenic fungus U. maydis.
  • the gene may be e.g. recombinantly expressed in Escherichia coli and an enzyme preparation is prepared from E. coli cells (Example 1).
  • Preference is given to using IPP isomerases from phytopathogenic fungi in order to identify fungicides which can be used in crop protection. If the goal is the identification of fungicides or antimycotics that are to be used in pharmaceutical indications, the use of IPP isomerases from human or animal pathogenic fungi is recommended.
  • the associated ORF was amplified by means of PCR by methods known to those skilled in the art via selected primers.
  • the corresponding DNA was cloned into the expression vector pET21b such that the IPI1 protein is expressed with a His ⁇ tag.
  • the plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) and the polypeptide according to example 1 was recovered.
  • the present invention thus also provides a complete genomic sequence of a phytopathogenic fungus coding for an IPP isomerase, and the Use or the use of the encoded polypeptide for the identification of inhibitors of the enzyme described.
  • the present invention therefore also relates to the nucleic acid coding for a polypeptide having the enzymatic function of an IPP isomerase according to SEQ ID NO: 1 from the fungus Ustilago maydis.
  • IPP isomerases from other plant pathogenic fungi can also be identified and used to accomplish the above object, i. they may also be used to identify inhibitors of an IPP isomerase, which in turn may be used as fungicides in crop protection.
  • nucleic acids coding for IPP isomerases from other (phytopathogenic) fungi by PCR or to assign existing nucleic acid or amino acid sequences.
  • nucleic acids and their use in methods of identifying fungicidal agents are considered to be encompassed by the present invention.
  • nucleic acid sequence according to the invention As well as sequences obtained from other phytopathogenic fungi according to the methods described above, further nucleic acid sequences coding for an IPP isomerase from other fungi can be identified.
  • the present invention therefore relates to nucleic acids from phytopathogenic fungi which code for a polypeptide having the enzymatic activity of an IPP isomerase, in particular polypeptides comprising the motif described above.
  • the present invention preferably relates to nucleic acids from the phytopathogenic fungal species mentioned above under Defintionen, which code for a polypeptide with the enzymatic activity of an EPP isomerase.
  • the present invention particularly preferably relates to the nucleic acid coding for the Ustilago maydis IPP isomerase with the SEQ ID NO: 1 as well as the nucleic acids coding for the polypeptides according to SEQ ID NO: 2 or active fragments thereof.
  • the nucleic acids according to the invention are, in particular, single-stranded or double-stranded deoxyribonucleic acids (DNA) or ribonucleic acids (RNA).
  • DNA deoxyribonucleic acids
  • RNA ribonucleic acids
  • Preferred embodiments are fragments of genomic DNA, and cDNAs.
  • the nucleic acids according to the invention particularly preferably comprise a sequence of phytopathogenic fungi coding for a polypeptide having the enzymatic activity of an IPP isomerase selected from
  • sequences which have at least 80%, preferably at least 85% and more preferably at least 90% identity with the sequences defined under a) and b), and
  • the present invention is not limited only to the Ustilago maydis IPP isomerase.
  • IPP isomerase from Ustilago maydis is used.
  • the present invention furthermore relates to DNA constructs which comprise a nucleic acid according to the invention and a homologous or heterologous promoter.
  • heterologous promoters depend on whether pro- or eukaryotic cells or cell-free systems are used for expression.
  • heterologous promoters are the 35S promoter of cauliflower mosaic virus for plant cells, the alcohol dehydrogenase promoter for yeast cells, the T3, T7 or SP6 promoters for prokaryotic cells or cell-free systems.
  • Fungal expression systems such as, for example, the Pichia pastoris system should preferably be used, in which case the transcription is driven by the methanol-inducible AOX promoter.
  • the present invention furthermore relates to vectors which contain a nucleic acid according to the invention, a regulatory region according to the invention or a DNA construct according to the invention.
  • vectors all phages used in molecular biology laboratories, plasmids, phagemids, phasmids, cosmids, YACs, BACs, artificial chromosomes or particles suitable for particle bombardment can be used.
  • Preferred vectors are e.g. the p4XXprom. Vector series (Mumberg et al., 1995) for yeast cells, pSPORT vectors (Life Technologies) for bacterial cells, or the Gateway vectors (Life Technologies) for various expression systems in bacterial cells, plants, P. pastoris, S. cerevisiae or insect cells.
  • the present invention also provides host cells which contain a nucleic acid according to the invention, a DNA construct according to the invention or a vector according to the invention.
  • host cell refers to cells that naturally do not contain the nucleic acids of the invention.
  • Suitable host cells are both prokaryotic cells, preferably E. coli, and eukaryotic cells, such as cells of Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, insects, plants, frog oocytes and mammalian cell lines.
  • the present invention furthermore relates to polypeptides having the biological activity of an IPP isomerase which are encoded by the nucleic acids according to the invention.
  • polypeptides according to the invention preferably comprise an amino acid sequence selected from plant-pathogenic fungi
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It includes amino acid chains which may be modified either by natural processes such as post-translational processing or by prior art chemical methods. Such modifications may occur at various sites and multiply in a polypeptide, such as at the peptide backbone, at the amino acid side chain, at the amino and / or at the carboxy terminus.
  • acetylations include, for example, acetylations, acylations, ADP ribosylations, amidations, covalent linkages with flavins, heme fractions, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or phosphatidylinositol, cyclizations, disulfone bridge formations, demethylations, cystine formations, formylations, gamma-carboxylations, glycosylations, hydroxylations, iodinations, methylations, myristolations, oxidations, proteolytic processing, phosphorylations, selenoylations and tRNA-mediated additions of amino acids.
  • polypeptides of the invention may be in the form of "mature” proteins or as part of larger proteins, e.g. as fusion proteins. Furthermore, they may have secretion or "leader" sequences, pro-sequences, sequences that allow easy purification, such as multiple histidine residues, or additional stabilizing amino acids.
  • the proteins according to the invention can also be present as they are naturally present in their organism of origin, from which they can be obtained directly, for example. Active fragments of an EPP isomerase can also be used in the methods according to the invention, as long as they allow the determination of the enzymatic activity of the polypeptide or its inhibition by a candidate compound.
  • polypeptides used in the methods of the invention may have deletions or amino acid substitutions as compared to the corresponding regions of naturally occurring IPP isomerases, as long as they still show at least the biological activity of a complete IPP isomerase.
  • Conservative substitutions are preferred. Such conservative substitutions include variations wherein one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic radicals Phe, Tyr and Trp.
  • EPP isomerase purification procedure is based on preparative electrophoresis, FPLC, HPLC (e.g., using gel filtration, reverse phase or slightly hydrophobic columns), gel filtration, differential precipitation, ion exchange chromatography, or affinity chromatography (see Example 2).
  • a rapid method for isolating EPP isomerase synthesized by host cells begins with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner may be an MBP tag.
  • the fusion protein can then be purified on amylose resin.
  • the fusion partner can be separated by partial proteolytic cleavage, for example, on linkers between the fusion partner and the polypeptide of the invention to be purified.
  • the linker can be designed to include target amino acids, such as arginine and lysine residues, that define sites for cleavage by trypsin. To generate such linkers, standard cloning methods using oligonucleotides can be used.
  • compositions containing the polypeptides according to the invention are at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold enriched in protein content compared to a preparation from the host cells.
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without fusion partners with the aid of antibodies which bind to the polypeptides.
  • polypeptides having the activity of an IPP isomerase e.g. the polypeptide IPIII from U. maydis, is characterized by
  • the cells thus obtained containing the polypeptide of the present invention or the purified polypeptide thus obtained are suitable for use in methods of identifying modulators of IPP isomerase.
  • the present invention also provides the use of polypeptides from fungi, preferably from phytopathogenic fungi, which exert at least one biological activity of an IPP isomerase, in methods for identifying fungicides, wherein the inhibitors of IPP isomerase can be used as fungicides.
  • the IPP isomerase from Ustilago maydis is particularly preferably used.
  • Fungicidal agents which are found by means of an IPP isomerase from a certain fungal species and based on a method according to the invention, can also interact with IPP isomerase from other fungal species, the interaction with the different present in these fungi IPP isomerase is not always the same must be strong. This explains, among other things, the selectivity of effective substances.
  • the use of the active ingredients found with a specific IPP isomerase as a fungicide in other fungi can be attributed to the fact that IPP isomerases from different fungal species are close to each other and show clear homology in larger areas. Thus, it is clear from Figure 2 that such homology exists over significant sequence segments between S. cerevisiae, S. pombe, and U. maydis, thus diminishing the effect of e.g. is not restricted to U. maydis with the aid of the U. maydis IPP isomerase.
  • the present invention therefore also provides a method for identifying fungicides by testing potential inhibitors or modulators of the enzymatic activity of the IPP isomerase (candidate compound or test compound) in an IPP isomerase inhibition test, wherein an inhibitor or inhibitor found in an activity test is Modulater of IPP isomerase can then be tested for its effectiveness as a fungicide in vivo, ie on a fungus.
  • Methods which are suitable for identifying modulators, in particular inhibitors or antagonists of the polypeptides according to the invention are generally based on the determination of the activity or biological functionality of the polypeptide.
  • both whole-cell-based methods in vivo methods and methods based on the use of the polypeptide isolated from the cells, which may be present in purified or partially purified form or else as crude extract, are suitable.
  • These cell-free in vitro methods can be used as well as in vivo methods on a laboratory scale, but preferably also in HTS or UHTS methods.
  • assays on fungal cultures may be performed to assess the fungicidal activity of the compounds found.
  • test systems that aim to test compounds and natural extracts are preferably designed for high throughput rates to maximize the number of substances tested in a given time period.
  • Test systems based on cell-free work need purified or semi-purified protein. They are suitable for a "first" test, which primarily aims to detect a possible influence of a substance on the target protein. If such a first test has been carried out and one or more compounds, extracts, etc. found, the effect of such compounds in the laboratory can be investigated even more targeted.
  • the inhibition or activation of the polypeptide of the invention in vitro can be checked again, in order subsequently to test the efficacy of the compound on the target organism, here one or more phytopathogenic fungi.
  • the compound may then optionally be used as a starting point for the further search and development of fungicidal compounds based on the original structure, but e.g. are optimized in terms of efficacy, toxicity or selectivity.
  • modulators e.g. a synthetic reaction mix (e.g., products of in vitro transcription) or a cellular component such as a membrane, compartment, or any other preparation containing the polypeptides of the invention, together with an optionally labeled substrate or ligand of the polypeptides in the presence and
  • Absence of a candidate molecule are incubated.
  • the ability of the candidate molecule to inhibit the enzymatic activity of the polypeptides of the invention is e.g. Recognizable from a reduced binding of the optionally labeled ligand or at a reduced
  • Molecules which inhibit the biological activity of the polypeptides of the invention are good antagonists or inhibitors.
  • reporter systems in this regard are but not limited to colorimetric or fluorimetric detectable substrates that are converted to a product or a reporter gene that responds to changes in the activity or expression of the polypeptides of the invention or other known binding assays.
  • a displacement assay which comprises subjecting the polypeptides of the invention and a potential modulator to a molecule known to bind to the polypeptides of the invention, such as a natural one, under suitable conditions Substrate or ligands or a substrate or ligand mimetic.
  • the polypeptides of the invention themselves can be labeled, e.g. fluorimetric or colorimetric, so that one can accurately determine the number of polypeptides that are bound to a ligand or have undergone a reaction.
  • the binding can be monitored by means of the optionally labeled substrate, ligands or substrate analogues. In this way, the effectiveness of antagonists can be measured.
  • Test systems check both inhibitory or suppressive effects of the substances, as well as stimulatory effects.
  • the effectiveness of a substance can be checked by concentration-dependent test series. Control approaches without test substances or without enzyme can be used to evaluate the effects.
  • the host cells containing nucleic acids encoding nucleic acid encoding IPP isomerase useful in the present invention also allow the development of cell-based assays to identify substances that modulate the activity of the polypeptides of the present invention.
  • the modulators to be identified are small organic chemical compounds, but not the natural inhibitors of the enzyme, e.g. Ligands of the enzyme or substrate analogs to form inorganic or nonspecific inhibitors that generally destroy or reduce the activity of an enzyme, e.g. by the nonspecific disruption of the protein structure or the reaction with reactive amino acids of the protein.
  • a method for identifying a compound which modulates the activity of an IPP isomerase from fungi and which can be used as a fungicide in plant protection is therefore preferred in that one
  • the compound which specifically inhibits the activity of the polypeptide according to the invention is particularly preferably determined.
  • activity refers to the biological activity of the polypeptide of the invention.
  • the reaction catalyzed by the IPP isomerase is coupled with the reaction of isopentenyltransferase.
  • This enzyme catalyzes the reaction of dimethylallyl pyrophosphate and AMP to isopentenyladenine and pyrophosphate.
  • the pyrophosphate is further degraded by the enzyme pyrophosphatase.
  • the resulting 'phosphate may be known to the skilled person with a malachite green assay are determined.
  • the experimental approach can be illustrated schematically as follows:
  • the measurement of the enzymatic activity of the IPP isomerase or the inhibition of this enzymatic activity by an inhibitor then takes place on the basis of the phosphate concentration.
  • the lower or inhibited activity of the polypeptide according to the invention is monitored on the basis of the lower phosphate concentration relative to a control batch.
  • the detection reagent malachite green from the product, but not from the substrate of the IPP isomerase directly release phosphate and can detect. Therefore, in a particularly preferred embodiment of the method described, both isopentyl transferase and pyrophosphatase (IPPase) can be dispensed with.
  • the measurement may also be done in more common formats for HTS or UHTS assays, e.g. in microtiter plates in which e.g. a total volume of 5 to 50 ul per batch or per well is presented.
  • the compound (candidate molecule) to be tested potentially inhibiting or activating the activity of the enzyme (e.g. in a suitable concentration in
  • Test buffer submitted. Then the polypeptide according to the invention is added in the abovementioned test buffer and the reaction is started therewith. The batch is then incubated at a suitable temperature, e.g. measured the concentration of the resulting pyrophosphate.
  • Another measurement is carried out in a similar approach, but without the addition of a candidate molecule and without the addition of a polypeptide of the invention (negative control). Another measurement is again in the absence of a candidate molecule, but in the presence of the polypeptide of the invention (positive control). Negative and positive controls thus give the comparison values to the approaches in the presence of a candidate molecule.
  • inhibitors of IPP isomerase could be identified in this way.
  • inhibitors of an IPP isomerase according to the invention identified by means of a method according to the invention are suitable for damaging or killing fungi in a suitable formulation.
  • a solution of the active substance to be tested can be pipetted into the wells of microtiter plates. After the solvent is evaporated, becomes each Cavity medium added. The medium is previously mixed with a suitable concentration of spores or mycelium of the fungus to be tested. The resulting concentrations of the active ingredient are, for example, 0.1, 1, 10 and 100 ppm.
  • the plates are then incubated on a shaker at a temperature of 22 0 C until a sufficient growth is observed in the untreated control.
  • the evaluation is carried out photometrically at a wavelength of 620 nm. From the measurement data of the various concentrations, the drug dose can be determined, which leads to a 50% inhibition of fungal growth compared to the untreated control (ED 50 ).
  • the present invention therefore also relates to the use of modulators of the IPP isomerase from fungi, preferably from phytopathogenic fungi as fungicides, or to methods for controlling preferably phytopathogenic fungi, characterized in that a modulator, preferably an inhibitor of an IPP Isomerase with the relevant fungus and / or its environment in an effective amount brings into contact.
  • a modulator preferably an inhibitor of an IPP Isomerase with the relevant fungus and / or its environment in an effective amount brings into contact.
  • the present invention also relates to fungicides identified by means of a method according to the invention.
  • the present invention therefore also relates to methods for identifying fungicides and to the use of inhibitors of TPP isomerase from fungi, preferably from phytopathogenic fungi as fungicides.
  • natural inhibitors such as analogs of the substrate of the IPP isomerase or analogs of the transition state of the substrate and non-specific inhibitors, which also show a significant inhibitory effect in enzymes other than IPP isomerase or in principle have an inhibitory effect by damaging the protein structure , and inorganic compounds are not included.
  • a specific inhibitor should have at least 10 times, preferably 20 times, particularly preferably 50 times and preferably 100 times more, an inhibitory effect on the IPP isomerase than on another enzyme.
  • the present invention also relates to fungicides which are identified by means of a method according to the invention.
  • Compounds which are identified by means of a method according to the invention and which have a fungicidal action due to the inhibition of the fungal IPP isomerase can thus be used for the preparation of fungicidal agents.
  • the identified active compounds can be converted into the customary formulations, such as solutions, emulsions, suspensions, powders, foams, pastes, granules, aerosols, very fine encapsulations in polymeric substances and in seed coating compositions, and ULV-KaIt and warm mist formulations.
  • formulations are prepared in a known manner, e.g. by mixing the active compounds with extenders, that is to say liquid solvents, liquefied gases under pressure and / or solid carriers, if appropriate using surface-active agents, that is to say emulsifiers and / or dispersants and / or foam-forming agents.
  • extenders that is to say liquid solvents, liquefied gases under pressure and / or solid carriers
  • surface-active agents that is to say emulsifiers and / or dispersants and / or foam-forming agents.
  • organic solvents can be used as auxiliary solvents.
  • Suitable liquid solvents are essentially: aromatics, such as xylene, toluene or alkylnaphthalenes, chlorinated aromatics or chlorinated aliphatic hydrocarbons, such as chlorobenzenes, chloroethylenes or methylene chloride, aliphatic hydrocarbons, such as cyclohexane or paraffins, e.g. Petroleum fractions, alcohols, such as butanol or glycol, and their ethers and esters, ketones, such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone or cyclohexanone, strongly polar solvents, such as dimethylformamide and dimethyl sulfoxide, and water.
  • aromatics such as xylene, toluene or alkylnaphthalenes
  • chlorinated aromatics or chlorinated aliphatic hydrocarbons such as chlorobenzenes, chloroethylenes or methylene chloride
  • liquefied gaseous diluents or carriers are meant those liquids which are gaseous at normal temperature and under normal pressure, e.g. Aerosol propellants, such as halogenated hydrocarbons as well as butane, propane, nitrogen and carbon dioxide.
  • Suitable solid carriers are: e.g. ground natural minerals, such as kaolins, clays, talc, chalk, quartz, attapulgite, montmorillonite or diatomaceous earth, and ground synthetic minerals, such as finely divided silica, alumina and silicates.
  • Suitable solid carriers for granules are: e.g.
  • Suitable emulsifiers and / or foam-formers are: e.g. nonionic and anionic emulsifiers, such as polyoxyethylene fatty acid esters, polyoxyethylene fatty alcohol ethers, e.g. Alkylaryl polyglycol ethers, alkyl sulfonates, alkyl sulfates, aryl sulfonates and protein hydrolysates.
  • Suitable dispersants are: e.g. Lignin-sulphite liquors and methylcellulose.
  • Adhesives such as carboxymethyl cellulose, natural and synthetic powdery, granular or latex polymers may be used in the formulations, such as gum arabic, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, as well as natural phospholipids such as cephalins and lecithins, and synthetic phospholipids.
  • Other additives may be mineral and vegetable oils.
  • Dyes such as inorganic pigments such as iron oxide, titanium oxide, ferrocyan blue and organic dyes such as alizarin, azo and metal phthalocyanine dyes and trace nutrients such as salts of iron, manganese, boron, copper, cobalt, molybdenum and zinc can be used.
  • the formulations generally contain between 0.1 and 95% by weight of active ingredient, preferably between 0.5 and 90%.
  • the active compounds according to the invention can also be used in admixture with known fungicides, bactericides, acaricides, nematicides or insecticides, so as to obtain e.g. to broaden the spectrum of action or to prevent development of resistance.
  • synergistic effects i. E. the effectiveness of the mixture is greater than the effectiveness of the individual components.
  • the application rates can be varied within larger ranges depending on the application.
  • plants and parts of plants can be treated.
  • plants are understood as meaning all plants and plant populations, such as desired and undesired wild plants or crop plants (including naturally occurring crop plants).
  • Crop plants can be plants that can be obtained by conventional breeding and optimization methods or by biotechnological and genetic engineering methods or combinations of these methods, including the transgenic plants and including the protected by plant breeders' rights or non-protectable plant varieties.
  • Plant parts are to be understood as meaning all aboveground and subterranean parts and organs of the plants, such as shoot, leaf, flower and root, examples of which include leaves, needles, stems, stems, flowers, fruiting bodies, fruits and seeds, and roots, tubers and rhizomes.
  • the plant parts also include crops and vegetative and generative propagation material, such as cuttings, tubers, rhizomes, offshoots and seeds.
  • the treatment according to the invention of the plants and plant parts with the active ingredients is carried out directly or by acting on their environment, habitat or storage space according to the usual treatment methods, e.g. by dipping, spraying, vaporizing, atomizing, spreading, spreading and in propagation material, in particular in seeds, further by single or multi-layer wrapping.
  • the gene with the gene-specific oligonucleotides Idi-c (5 '-CTCGAGGATCCAGGAGGCGGTGAATG-S') and Idi-n (5'-CTCGCATATGTCGACCGCCACCGTCAC-3 ') was amplified by PCR and introduced via the introduced Ndel and ß ⁇ mFfl interface introduced into the vector pET21b (Novagen).
  • the resulting plasmids were transformed into E. co / z 'strain BL21 (DE3).
  • glycerol stock culture was prepared as follows: 900 ⁇ l culture and 100 ul of sterile glycerol mix and freezing at -70 0 C.
  • Preculture was inoculated 12 ml of dYT medium with 25 ul from the permanent culture and at 37 ° C over
  • Cells were harvested by centrifugation and frozen pellet at -70 0C.
  • the cell pellet of a 500 ml expression culture was resuspended in 35 ml of digestion buffer (50 mM Tris, 1% glycerol, ImM DTT, 300 mM NaCl, 0.5% Tween 20, pH 7.5).
  • the digestion of the cells was carried out with a Sonifizierstab on ice. It was sonicated 8 times 45 seconds with 45 seconds break.
  • the soluble and insoluble fractions were analyzed by Abzentri- fug Schl (30 min. At 4 0 C and 10 000 rpm) separately.
  • the supernatant was bound to a 50% Ni-NTA-agarose matrix by Qiagen for 60 minutes at 4 0 C and transferred to a blank column.
  • the binding capacity of the Ni-NTA matrix is 9 mg protein per 1 ml agarose.
  • the column was washed twice with 44 ml of digestion buffer + 10 mM imidazole. Elution was carried out in 2 ml fraction steps with digestion buffer + 250 mM imidazole. The fractions containing the purified enzyme were then pooled and diluted to 1 mg / ml. There was an addition of glycerol in a final concentration of 10%. The storage of the enzyme takes place at -7O 0 C.
  • the tests were performed in 384 MTPs from Greiner (transparent). The negative control was done by omitting the enzyme. 5 ⁇ l of RI buffer (10 mM Tris / HCl pH 7.5, 20 mM MgCl 2 , 10% glycerol) or the substance to be tested (1/10 of the assay volume) were mixed with 20 ⁇ l substrate solution (0.15 mM IPP in reaction buffer RI), 25 .mu.l enzyme mix (0.59 ug / ml of purified protein (IPP isomerase) in reaction buffer Rl) at 37 0 C for 25 minutes. 50 ⁇ l malachite green staining solution was added and incubated at RT for 90 minutes. The detection of a change in absorption took place at 620 nm.
  • a methanolic solution of the identified by a process according to the invention active ingredient (Example 3), mixed with an emulsifier, pipetted. After the solvent has evaporated, 200 ⁇ l of Potato Dextrose Medium are added per well. The medium is previously mixed with appropriate concentrations of spores or mycelia of the fungus to be tested.
  • the resulting concentrations of the active ingredient are 0.1, 1, 10 and 100 ppm.
  • the resulting concentration of the emulsifier is 300 ppm.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von pilzlicher IPP-Isomerase zum Identifizieren von Fungiziden, und die Verwendung von Inhibitoren der IPP-Isomerase als Fungizide.

Description

Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Isopentenylpyrophosphat-Isomerasen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, die Verwendung von pilzlicher Isopentenylpyrophosphat-Isomerase zum Identifizieren von Fungiziden, und die Verwendung von Inhibitoren der Isopentenylpyrophosphat-Isomerase als Fungizide.
Unerwünschtes Pilzwachstum, das in der Landwirtschaft jedes Jahr zu beträchtlichen Schäden führt, kann durch die Verwendung von Fungiziden kontrolliert werden. Die Ansprüche an Fungizide sind dabei hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Kosten und vor allem ihrer Umweltverträglichkeit stetig angestiegen. Es existiert deshalb ein Bedarf an neuen Substanzen bzw. Substanzklassen, die zu leistungsfähigen und umweltverträglichen neuen Fungiziden entwickelt werden können. Im Allgemeinen ist es üblich, in Gewächshaustests nach solchen neuen Leitstrukturen zu suchen. Solche Tests sind jedoch arbeitsintensiv und teuer. Die Anzahl der Substanzen, die im Gewächshaus getestet werden können, ist entsprechend begrenzt. Eine Alternative zu solchen Tests ist die Verwendung von sogenannten Hochdurchsatzverfahren (HTS = high throughput Screening). Dabei werden in einem automatisierten Verfahren eine große Anzahl von Einzelsubstanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Zellen, individuelle Genprodukte oder Gene getestet. Wird für bestimmte Substanzen eine Wirkung nachgewiesen, so können diese in herkömmlichen Screeningverfahren untersucht und gegebenenfalls weiter entwickelt werden.
Vorteilhafte Angriffspunkte für Fungizide werden oft in essentiellen Biosynthesewegen gesucht. Ideale Fungizide sind weiterhin solche Stoffe, die Genprodukte hemmen, die eine entscheidende Bedeutung bei der Ausprägung der Pathogenität eines Pilzes haben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, einen geeigneten neuen Angriffspunkt für potentielle fungizide Wirkstoffe zu identifizieren und zugänglich zu machen, und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Identifizierung von Modulatoren dieses Angriffspunkts ermög- licht, die dann als Fungizide verwendet werden können.
Die Isopentenylpyrophosphat-Isomerase (EC 5.3.3.2), auch bekannt als Isopentenylpyrophosphat- Δ-Isomerase, Isopentenyl-Diphosphat-Δ-Isomerase, oder Methylbutenylpyrophosphat-Isomerase, katalysiert die Isomerisierung der Kohlenstoff-Doppelbindung von Isopentenylpyrophosphat (IPP), wobei Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) (Abbildung 1) entsteht.
Die Isopentenylpyrophosphat-Isomerase - im Folgenden auch als IPP-Isomerase oder IPPI abgekürzt - katalysiert damit einen essentiellen Schritt der Isoprenoid-Biosynthese mit mehr als 23000 bekannten Metaboliten. Der Syntheseweg ist in allen Organismen beschrieben und stellt dabei unterschiedliche Stoffklassen zur Verfügung. Dazu gehören die Sterole, die Carotinoide, die Dolichole, die Ubichinone und prenylierte Proteine. Die IPP-Isomerase katalysiert den kritischen Aktivierungsschritt im Syntheseweg, der Isopentenylpyrophosphat (IPP) in das stark elektrophile Isomer Dimethyl-allyl-diphophat (DMAPP) umwandelt. IPP und DMAPP sind Substrate für - Prenyltransferasen, die Polyisoprenoid Ketten synthetisieren.
In S.cerevisiae (einem Ascomyceten) konnte gezeigt werden, dass das entsprechende Gen IDIl essentiell ist und im Genom nur einmal vorkommt. (Mayer et al. 1992).
Der Isoprenoid Stoffwechselweg kommt in allen Organismen vor und erzeugt eine Vielzahl von kleinen, meist lipophilen Stoffen, die eine Reihe wichtiger Funktionen erfüllen. Eine hervor- ragende Rolle spielen dabei die Sterole, Bestandteile eukariotischer Membranen und Hormone, die Carotene, Photorezeptoren beim Sehen und bei der Photosynthese, Coenzyme bei der Atmung, die Häutungshormone bei Insekten, sowie die Cytokinine, Hormone bei Pflanzen. Isoprenoide werden in zwei verschiedenen Phasen synthetisiert. Die erste Phase der Synthese ist der schrittweise Aufbau von Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A aus drei Molekülen Acetyl-CoA. Dies wird durch HMG-CoA Reduktase zu Mevalonat reduziert und wird in einer Reihe weiterer Reaktionen zu Squalen kondensiert. An zentraler Stelle dieser ersten Phase steht die IPP-Isomerase, die sowohl das Isopentenyl-phyrophosphat als auch das Dimethylallyl-phyrophosphat zur Verfügung stellt (Wouters et al., 2003). Diese beiden Verbindungen werden weiter in einer Kopf zu Schwanz Reaktion zu Geranyl-diphosphat kondensiert. Dies kann dann im Stoffwechsel je nach Organismus zu unterschiedlichen Produkten weiter verarbeitet werden. Für Pilze ist dabei die Synthese von Sterolen von essentieller Bedeutung.
Die IPP-Isomerase ist bereits aus einer Reihe von Pilzen bekannt (siehe dazu auch Abbildung 2). Dazu gehören z.B. S. cerevisiae, S. pombe etc.
IPP-Isomerasen sind durch spezifische Motive auf Aminosäureebene gekennzeichnet und können unter anderem anhand dieser Motive identifiziert werden. So konnte durch gezielte Mutagenese in Hefe gezeigt werden, dass zwei Aminosäuren eine essentielle Bedeutung haben. Es handelt sich um die Aminosäuren Cys und GIn in den Positionen 139 und 207 (S. cerevisiae, siehe auch Abb. 2), eingebettet in die Sequenzen CCSH bzw. HEEDY (Street et al. 1994, Wouters et al, 2003).
Gene für die IPP-Isomerase wurden aus verschiedenen Organismen kloniert, darunter auch aus verschiedenen Hefen wie Saccharomyces cerevisiae (Swissprot Accession No.: Pl 5496), Schizosaccharomyces pombe (Swissprot Accession No.: Ql Ol 32), und Phaffia rhodozyma (Swissprot Accession No.: 042641). Die Sequenzähnlichkeiten sind innerhalb der eukaryontischen Klassen signifikant. Weiterhin war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung neue Angriffspunkte von Fungiziden in Pilzen, insbesondere in phytopathogenen Pilzen, zu identifizieren und ein Verfahren zugänglich zu machen, in denen Inhibitoren eines solchen Angriffspunktes bzw. Polypeptids identifiziert und auf ihre fungiziden Eigenschaften hin geprüft werden können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher zu prüfen, ob die IPP-Isomerase des pflanzenpathogenen Basidiomyceten U.maydis ebenfalls ein essentielles Gen ist und deren Entfernung zu nicht lebensfähigen Sporen führt, und die IPP-Isomerase aus pflanzenpathogenen Pilzen als ein Target für Fungizide grundsätzlich geeignet ist.
Die Aufgabe wurde gelöst, indem aus einem phytopathogenen Pilz, U. maydis, die für IPP- Isomerase kodierende Nukleinsäure (ipil) isoliert, das davon kodierte Polypeptid (IPIl) gewonnen und ein Verfahren zur Verfügung gestellt wurde, mit dem Inhibitoren dieses Enzyms bestimmt werden können. Die mit diesem Verfahren identifizierten Inhibitoren können tatsächlich in vivo gegen Pilze eingesetzt werden.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1: Schematische Darstellung der von der IPP-Isomerase katalysierten Iso- merisierung des Isopentenylpyrophosphats zu Dimethylallylpyrophosphat.
Abbildung 2: Vergleich der bekannten IPP-Isomerase Proteine aus Pilzen und phyto- pathogenen Pilzen (UM = U. maydis; PC = P. chrysosporium; IDIl = S. cerevisiae; ADL = A. gossypii; Idil = S. pombe; MG = M. grisea; CA = C. albicans; AN = A.. nidulans; FG = F. graminis; NC = N. crassa; PHYSO = P. soyae; PHYTRA = P. ramorum). Bereiche mit Identität bzw. hoher Homologie sind grau unterlegt
Abbildung 3: 12% Bis-Tris-SDS Gel zur Darstellung der heterologen Expression von U.maydis IPP-Isomerase in E.coli.
1+18 = Marker; 2-13 = Eluierte Fraktionen mit 25OmM Imidazol; 14-17 = Eluierte Fraktionen mit IM Imidazol; 19 = Cytoplasmafraktion; 20 = Membranfraktion; 21 = Durchfluss; 22+23 = 1. und 2. Waschfraktion; 24 = Gepoolte Fraktionen Nr. 6,7,8,9
Abbildung 4: Sporenanalvse der ipi-knock-out Stämme. Kandidaten-Sporen wurden auf Medium (PD-Medium) ohne (1A-4A, PD/Hyg-Medium) und mit Selektion 1B-4B ausgestrichen. Ist das ausgeschaltete Gen essentiell, dürfen auf PD/Hyg Medium keine Sporen wachsen, wenn alle Sporen haploid sind. Immer wieder kommt es vor, das diploide Sporen als Kandidaten ausgesucht werden. Deshalb wurden in allen Fällen bei denen Sporen auf PD/Hyg-Medium wuchsen, diese mit Hilfe einer PCR-Analyse untersucht. Es wurde gezeigt, dass diese Sporen diploid waren, also noch eine Kopie des ipi- Wildtyp-Gens enthielten.
SEQ ID NO :1 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Isopentenylpyrophosphat-Isomerase aus Ustilago maydis.
SEQ ID NO: 2 Aminosäuresequenz der Isopentenylpyrophosphat-Isomerase aus Ustilago maydis. Definitionen
Unter dem Begriff "Homologie" bzw. "Identität" soll die Anzahl der übereinstimmenden Aminosäuren (Identität) mit anderen Proteinen, ausgedrückt in Prozent verstanden werden. Bevorzugt wird die Identität durch Vergleiche einer gegebenen Sequenz zu anderen Proteinen mit Hilfe von Computerprogrammen ermittelt. Weisen Sequenzen, die miteinander verglichen werden, unterschiedliche Längen auf, ist die Identität so zu ermitteln, dass die Anzahl an Aminosäuren, welche die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat, den prozentualen Anteil der Identität bestimmt. Die Identität kann standardmäßig mittels bekannten und der Öffentlichkeit zur Verfügung stehenden Computerprogrammen wie z.B. ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) ermittelt werden. ClustalW wird z.B. öffentich zur Verfügung gestellt von Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 691 17 Heidelberg, Germany. ClustalW kann ebenfalls von verschiedenen Internetseiten, u.a. beim IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) und beim EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie bei allen gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CBlO ISD, UK), heruntergeladen werden. Wenn das ClustalW Computerprogramm der Version 1.8 benutzt wird, um die Identität zwischen z.B. einem gegebenen Referenzprotein und anderen Proteinen zu bestimmen, sind folgende Parameter einzustellen: KTUPLE=I, TOPDIAG=5, WINDO W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=IO, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRDC=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. Eine Möglichkeit zum Auffinden von ähnlichen Sequenzen ist die Durchführung von Sequenzdatenbankrecherchen. Hierbei wird eine oder werden mehrere Sequenzen als sogenannte Abfrage ("query") vorgegeben. Diese Abfragesequenz wird dann mittels statistischen Computerprogrammen mit Sequenzen, die in den ausgewählten Datenbanken enthalten sind, verglichen. Solche Datenbankabfragen ("blast searches") sind dem Fachmann bekannt und können bei verschiedenen Anbietern durchgeführt werden. Wird eine solche Datenbankabfrage z.B. beim NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) durchgeführt, so sollen die Standardeinstellungen, die für die jeweilige Vergleichsanfrage vorgegeben sind, benutzt werden. Für Proteinsequenzvergleiche ("blastp") sind dieses folgende Einstellungen: Limit entrez = nicht aktiviert; Filter = low complexity aktiviert; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1. Als Ergebnis einer solchen Abfrage werden neben anderen Parametern auch der Anteil an Identität zwischen der Abfragesequenz und den in den Datenbanken aufgefundenen ähnlichen Sequenzen dargestellt. Unter einem erfindungsgemäßen Protein sollen daher im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche Proteine verstanden werden, die bei der Verwendung mindestens einer der vorstehend beschriebenen Methoden zur Identitätsbestimmung eine Identität von mindestens 70 % aufweisen, bevorzugt von mindestens 75 %, besonders bevorzugt von mindestens 80 %, weiter bevorzugt von mindestens 85 %, und insbesondere von mindestens 90 %.
Der Ausdruck "vollständige IPP-Isomerase" wie er hierin verwendet wird, beschreibt eine IPP- Isomerase, die von einer vollständigen kodierenden Region einer Transkriptionseinheit kodiert wird, umfassend ein ATG- Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des im Herkunftsorganismus vorliegenden, für eine IPP-Isomerase kodierenden Gens, sowie die für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale.
Der Ausdruck "biologische Aktivität einer IPP-Isomerase" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit eines Polypeptids, die vorstehend beschriebene Reaktion, d.h. die Isomeri- sierung der Kohlenstoff-Doppelbindung von Isopentenylpyrophosphat und Dimethylallylpyro- phosphat zu katalysieren.
Der Ausdruck "aktives Fragment" wie er hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend für IPP-Isomerase, die aber noch für Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase kodieren, und die eine für die IPP-Isomerase charakteristische Reaktion wie vorne beschrieben katalysieren können. Solche Fragmente sind kürzer als die oben beschriebenen vollständigen, für die IPP-Isomerase kodierenden Nukleinsäuren. Dabei können sowohl an den 3'- und/oder 5 '-Enden der Sequenz Nukleinsäuren entfernt worden sein, es können aber auch Teile der Sequenz deletiert, d.h. entfernt worden sein, die die biologische Aktivität der IPP-Isomerase nicht entscheidend beeinträchtigen. Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung bzw. Verwendung des resultierenden IPP- Isomerase Fragments gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck "aktives Fragment" kann sich ebenso auf die Aminosäuresequenz der IPP-Isomerase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen für solche Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die biologische Aktivität des Enzyms jedoch nicht entscheidend beeinträchtigt ist. Die Fragmente können dabei verschiedene Länge besitzen.
Die Begriffe "IPP-Isomerase-Hemmtest" oder "Hemmtest " wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf ein Verfahren bzw. einen Test, der es gestattet, die Inhibition der enzymatischen Aktivität eines Polypeptids mit der Aktivität einer EPP-Isomerase durch eine oder mehrere chemische Verbindungen (Kandidatenverbindung(en)) zu erkennen, wodurch die chemische Verbindung als Inhibitor der IPP-Isomerase identifiziert werden kann. Der Ausdruck "Gen", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette verantwortlich ist.
Der Ausdruck "Fungizid" bzw. "fungizid" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf chemische Verbindungen, die zur Bekämpfung von human-, tier- und pflanzenpathogenen Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen geeignet sind. Solche pflanzenpathogene Pilze werden nachfolgenden genannt, wobei die Aufzählung nicht abschließend ist:
Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidio- mycetes und Deuteromycetes, z.B.
Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise Phytophthora infestans, Pseudoperonospora- Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasmopara viticola, Bremia-Arten, wie beispielsweise Bremia lactucae, Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisi oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sphaerotheca fuliginea, Podosphaera-Arten, wie beispielsweise Podosphaera leucotricha, Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus (Konidienform: Drechslera, Syn: Helminthosporium),- Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita, Sclerotinia-Arten, wie beispielsweise Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries; Ustilago-Arten, wie beispielsweise Ustilago nύda oder Ustilago avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii, Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae, Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.
Von besonderem Interesse sind z.B. auch Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococcus and Phytophtora species.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen IPP-Isomerasen aus pflanzenpathogenen Pilzen gefunden werden, können aber auch mit IPP-Isomerase aus humanpathogenen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden IPP-Isomerasen nicht immer gleich stark sein muss. Gegenstand der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch die Verwendung von Inhibitoren der IPP-Isomerase zum Herstellen von Mitteln zur Behandlung von durch humanpathogene Pilze hervorgerufenen Erkrankungen.
Dabei sind die folgenden humanpathogenen Pilze von besonderem Interesse, die die nachfolgend genannten Krankheitsbilder hervorrufen können:
Dermatophyten, wie z.B. Trichophyton spec, Microsporum spec, Epidermophyton floccosum oder Keratomyces ajelloi, die z.B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen,
Hefen, wie z.B. Candida albicans, die Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervorruft, Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die z.B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können,
Schimmelpilze, wie z.B. Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. niger, die z.B. bronchopulmonale Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec, Absidia spec, oder Rhizopus spec, die z.B. Zygomykosen (intravasale Mykosen) hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z.B. chronische granulomatöse Pharyngitis und Tracheitis hervorruft, Madurella myzetomatis, der z.B. subkutane Myzetome hervorruft, Histoplasma capsulatum, der z.B. retikuloendotheliale Zytomykose und M. Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis hervorruft, Paracoccidioides brasiliensis, der z.B. brasilianische Blastomykose hervorruft, Blastomyces dermatitidis, der z.B. Gilchrist-Krankheit und nordamerikanische Blastomykose hervorruft, Loboa loboi, der z.B. Keloid-Blastomykose und Lobo's Krankheit hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z.B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose) hervorruft.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer aus einem bestimmten Pilz, hier aus Ustilago maydis, gewonnenen IPP-Isomerase gefunden werden, können also auch mit IPP-Isomerase aus anderen zahlreichen Pilzspezies, gerade auch mit pflanzenpathogenen Pilzen interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden IPP-Isomerase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die beobachtete Selektivität der an diesem Enzym wirksamen Substanzen.
Der Ausdruck "homologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Ausdruck "Kompetitor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigenschaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls zu identifizierenden Verbindungen um die Bindung an der IPP-Isomerase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.
Der Ausdruck "Inhibitor" bzw. "spezifischer Inhibitor", wie er hierin gebraucht wird, bezeichnet eine Substanz, die direkt eine enzymatische Aktivität der IPP-Isomerase inhibiert. Ein solcher Inhibitor ist vorzugsweise "spezifisch", d.h. er inhibiert gezielt die IPP-Isomerase-Aktivität bei einer Konzentration die niedriger ist als die Konzentration eines Inhibitors, die benötigt wird, um einen anderen, damit nicht verbundenen Effekt hervorzurufen. Vorzugsweise ist die Konzentration zweifach niedriger, insbesondere bevorzugt fünffach niedriger und ganz besonders bevorzugt zumindest zehnfach oder 20fach niedriger als die Konzentration einer Verbindung, die zum Hervorrufen eines unspezifischen Effekts benötigt wird.
Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt einen Oberbegriff für Inhibitoren und Aktivatoren dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden bzw. die deren Aktivität beeinflussen. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum, an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon. Bevorzugt handelt es sich beim Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, jedoch um solche Moleküle, die nicht die natürlichen Substrate bzw. Liganden darstellen.
Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird zum ersten Mal die vollständige Sequenz einer IPP-Isomerase aus dem pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis zur Verfügung gestellt, die die weitere
Erforschung von EPP-Isomerasen insbesondere aus pflanzenpathogenen Pilzen und damit die Er- Schließung eines neuen Zielproteins für die Identifizierung neuer fungizider Wirkstoffe ermöglicht.
Die Forschung an der IPP-Isomerase beschränkte sich bislang in erster Linie auf deren pharmakologische Bedeutung (Cheng und Oldfield, 2004; Thompsom et al, 2002;Rohdich et al. 2004). Dabei sind durchaus auch Inhibitoren dieses Enzyms bearbeitet worden, die eine pharmazeutische Anwendung finden sollen. Inhibitoren der IPP-Isomerase wie natürliche Inhibitoren oder Analoga des Übergangszustandes des Substrats der IPP-Isomerase sind beschrieben worden (Wouters et al., 2003).
Trotz der umfangreichen Forschung an der IPP-Isomerase war bislang dennoch unbekannt, dass die IPP-Isomerase in Pilzen ein Zielprotein (ein so genanntes "Target") fungizid wirksamer Substanzen sein kann. Damit wird in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass die IPP-Isomerase ein insbesondere für Pilze wichtiges Enzym darstellt und deshalb in besonderem Maße dazu geeignet ist, als Zielprotein für die Suche nach weiteren und verbesserten fungizid wirksamen Wirkstoffen verwendet zu werden.
Inhibitoren der IPP-Isomerase mit einer fungiziden Wirkung wurden bisher nicht beschrieben. Es ist zwar bekannt, dass das Enzym in S. cerevisiae essentiell ist (Mayer et al. 1992). Allerdings nimmt keine der Veröffentlichungen Stellung zu der Frage, ob das pilzliche Enzym IPP-Isomerase, insbesondere in pflanzenpathogenen Pilzen, durch Wirkstoffe beeinflusst, z.B. inhibiert werden kann, und ob die Bekämpfung von Pilzen, insbesondere von pflanzenpathogenen Pilzen, in vivo mit einem die IPP-Isomerase modulierenden Wirkstoff möglich ist. Die IPP-Isomerase -wurde damit als Zielprotein für Fungizide bislang noch nicht beschrieben. Es sind keine Wirkstoffe be- kannt, die eine fungizide Wirkung aufweisen und deren Wirkort die IPP-Isomerase ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte nun gezeigt werden, dass die IPP-Isomerase bei pflanzenpathogenen Pilzen ein Angriffspunkt oder "Target" für fungizide Wirkstoffe sein kann, die Inhibition der IPP-Isomerase also zur Schädigung oder zum Absterben des Pilzes führen könnte. So wurde im pflanzenpathogenen Pilz Ustilago maydis ein für eine IPP-Isomerase kodierendes Gen gemäß SEQ ID NO: 1 identifiziert (ipil). Der Knock-out dieses Gens erwies sich als letal. Es konnten keine lebensfähigen Knock-out Sporen von U. maydis erhalten werden. In weiteren Versuchen, die auf die Zugänglichkeit der IPP-Isomerase für Wirkstoffe in vitro und auch in vivo gerichtet waren, konnte das Enzym IPP-Isomerase weiter als ein Polypeptid bestimmt werden, das zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren seiner enzymatischen Aktivität in geeigneten Testverfahren verwendet werden kann, was bei verschiedenen theoretisch interessanten Targets nicht selbstverständlich gegeben ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde deshalb ein Verfahren entwickelt, das geeignet ist, die Aktivität der IPP-Isomerase sowie die Hemmung dieser Aktivität in einem so genannten Hemmtest zu bestimmen, auf diese Weise Inhibitoren des Enzyms z.B. in HTS- und UHTS- Verfahren zu identifizieren und deren fungizide Eigenschaften zu prüfen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gezeigt, dass die Inhibitoren der IPP-Isomerase aus Pilzen als Fungizide verwendet werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde weiter gefunden, dass die IPP-Isomerase auch in vivo durch Wirkstoffe inhibiert werden kann und ein mit diesen Wirkstoffen behandelter pilzlicher Organismus durch die Behandlung mit diesen Wirkstoffen geschädigt und abgetötet werden kann. Die Inhibitoren einer pilzlichen IPP-Isomerase können also als Fungizide im Pflanzenschutz oder als Antimykotika in Pharmaindikationen verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise gezeigt, dass die Hemmung der IPP-Isomerase mit einer in einem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen zum Absterben der behandelten Pilze in synthetischen Medien bzw. auf der Pflanze führt.
Die IPP-Isomerase kann aus verschiedenen pflanzenpathogenen oder auch aus human- oder tierpathogenen Pilzen gewonnen werden, z.B. aus Pilzen wie dem pflanzenpathogenen Pilz U. maydis. Zur Herstellung der IPP-Isomerase aus Pilzen kann das Gen z.B. rekombinant in Escherichia coli exprimiert und aus E. coli Zellen eine Enzympräparation hergestellt werden (Beispiel 1). Bevorzugt werden IPP-Isomerasen aus pflanzenpathogenen Pilzen verwendet, um im Pflanzenschutz einsetzbare Fungizide zu identifizieren. Ist das Ziel die Identifizierung von Fungiziden bzw. Antimycotika, die in Pharmaindikationen verwendet werden sollen, empfiehlt sich der Einsatz von IPP-Isomerasen aus human- bzw. tierpathogenen Pilzen.
So wurde für die Expression des von ipil kodierten Polypeptids IPIl aus U. maydis der zugehörige ORF mittels PCR nach dem Fachmann bekannten Methoden über ausgewählte Primer amplifϊziert. Die entsprechende DNA wurde in den Expressionsvektor pET21b kloniert, so dass das IPIl- Protein mit einem Hisβ-Tag exprimiert wird. Zur Expression der IPIl wurde das Plasmid in E.coli BL21(DE3) transformiert und das Polypeptid gemäß Beispiel 1 gewonnen.
In der vorliegenden Erfindung wird damit auch eine vollständige genomische Sequenz eines pflanzenpathogenen Pilzes kodierend für eine IPP-Isomerase zur Verfügung gestellt, und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms beschrieben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Funktion einer IPP-Isomerase kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ BD NO: 1 aus dem Pilz Ustilago maydis.
Aufgrund der Homologien (siehe auch Abb. 2), die bei speziesspezifischen Nukleinsäuren kodierend für IPP-Isomerasen vorliegen, können auch IPP-Isomerasen aus anderen pflanzen- pathogenen Pilzen identifiziert und verwendet werden, um die oben gestellte Aufgabe zu lösen, d.h. sie können ebenfalls zum Identifizieren von Inhibitoren einer IPP-Isomerase verwendet werden, welche wiederum als Fungizide im Pflanzenschutz verwendet werden können. Es ist jedoch auch denkbar einen anderen Pilz, der nicht pflanzenpathogen ist, bzw. dessen IPP- Isomerase oder die dafür kodierende Sequenz zu verwenden, um fungizid wirkende Inhibitoren der IPP-Isomerase zu identifizieren. Aufgrund der hier angegebenen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und eventuell davon abgeleiteten Primern sowie gegebenenfalls unter Zuhilfenahme der in Abbildung 2 dargestellten Konsensussequenzabschnitte, insbesondere der vorstehend genannten (Aminosäure-)Sequenzabschnitte „CCSH" und „HEIDY", ist es dem Fachmann möglich, z.B. mittels PCR weitere für IPP-Isomerasen kodierende Nukleinsäuren aus anderen (pflanzenpathogenen) Pilzen zu erhalten und zu identifizieren oder vorliegende Nukleinsäure- bzw. Aminos.äuresequenzen zuzuordnen. Solche Nukleinsäuren und deren Verwendung in Verfahren zum Identifizieren von fungiziden Wirkstoffen werden als von der vorliegenden Erfindung umfasst betrachtet.
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz sowie gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Sequenzen aus anderen pflanzenpathogenen Pilzen können weitere für eine IPP-Isomerase kodierende Nukleinsäuresequenzen aus anderen Pilzen identifiziert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäuren aus pflanzenpathogenen Pilzen, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer IPP-Isomerase kodieren, insbesondere Polypeptide, die das vorstehend beschriebene Motiv umfassen.
Bevorzugt sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren aus den vorstehend unter Defintionen genannten pflanzenpathogenen Pilzspezies, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer EPP-Isomerase kodieren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere bevorzugt die für die IPP-Isomerase aus Ustilago maydis kodierende Nukleinsäure mit der SEQ ID NO: 1 sowie die für die Polypeptide gemäß SEQ ID NO:2 oder aktive Fragmente davon kodierenden Nukleinsäuren.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, und cDNAs.
Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz aus pflanzenpathogenen Pilzen kodierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer IPP-Isomerase ausgewählt aus
a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
c) Sequenzen, welche an die unter a) und b) definierten Sequenzen bei einer Hybridisierungstemperatur von 42-65°C hybridisieren,
d) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt zumindest 85 %ige und besonders bevorzugt eine zumindest 90 %ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen, und
e) Sequenzen, welche zu den unter a) bis d) definierten Sequenzen komplementär sind.
Wie bereits vorstehend ausgeführt, ist die vorliegende Erfindung nicht nur auf die IPP-Isomerase aus Ustilago maydis beschränkt. In analoger und dem Fachmann bekannter Weise können auch aus anderen Pilzen, vorzugsweise aus pflanzenpathogenen Pilzen, Polypeptide mit der Aktivität einer IPP-Isomerase gewonnen werden, die dann z.B. in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Bevorzugt wird die IPP-Isomerase aus Ustilago maydis verwendet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine er- findungsgemäße Nukleinsäure und einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.
Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7- oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme. Bevorzugt sollten pilzliche Expressionssysteme wie z.B. das Pichia pastoris-System verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol induzierbaren AOX-Promotor angetrieben wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfindungsgemäßes DNA- Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.
Bevorzugte Vektoren sind z.B. die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg et al., 1995) für Hefezellen, pSPORT-Vektoren (Fa. Life Technologies) für bakterielle Zellen, oder den Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies) für verschiedene Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastoris, S. cerevisiae oder Insektenzellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfmdungsgemäßen Vektor enthalten.
Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugera.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden.
Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Aminosäuresequenz aus pflanzen- pathogenen Pilzen ausgewählt aus
(a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO:2,
(b) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine zumindest 85 %ige, besonders bevorzugt eine 90 %ige und insbesondere bevorzugt eine 95 %ige Identität mit der unter a) definierten Sequenz haben,
(c) Fragmenten der unter a) oder b) angegebenen Sequenzen, welche die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie die unter a) definierte Sequenz. Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise am Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosy- lierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfϊdbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma- Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoy- lierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs- oder "Leader"- Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Aminosäuren aufweisen. Die erfindungsgemäßen Proteine können ebenfalls so vorliegen, wie sie natürlicherweise in ihrem Herkunftsorganismus vorliegen, aus dem sie zum Beispiel direkt gewonnen werden können. In den erfindungsgemäßen Verfahren können ebenso aktive Fragmente einer EPP-Isomerase eingesetzt werden, solange sie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Polypeptids bzw. deren Inhibition durch eine Kandidatenverbindung ermöglichen.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polypeptide können im Vergleich zu den entsprechenden Regionen von natürlich vorkommender IPP-Isomerasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch die biologische Aktivität einer vollständigen IPP-Isomerase zeigen. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: AIa, Ser, Thr, Pro und GIy;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, GIu und GIn;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys; 4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, He, VaI und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
Ein mögliches Reinigungsverfahren der EPP-Isomerase basiert auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie oder Affinitätschromatographie (vgl. Beispiel 2).
Ein schnelles Verfahren zum Isolieren von EPP-Isomerase, die von Wirtszellen synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise ein MBP-Tag sein. Das Fusionsprotein kann dann an Amylose-Resin gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard- Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren wiederum auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen); Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatögraphie.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfindungsgemäßen Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.
Das Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden mit der Aktivität einer IPP-Isomerase, wie z.B. des Polypeptids IPIl aus U. maydis, ist damit gekennzeichnet durch
(a) das Kultivieren einer Wirtszelle enthaltend zumindest eine exprimierbare Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase unter Bedingungen, die die Expression dieser Nukleinsäure gewährleisten, oder
(b) das Exprimieren einer exprimierbaren Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase in einem in v/Yro-System, und
(c) die Gewinnung des Polypeptids aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in vitro- System.
Die so erhaltenen Zellen enthaltend das erfindungsgemäße Polypeptid oder das so erhaltene gereinigte Polypeptid sind geeignet, in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren bzw. Inhibitoren der IPP-Isomerase verwendet zu werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Polypeptiden aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen, welche zumindest eine biologische Aktivität einer IPP- Isomerase ausüben, in Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, wobei die Inhibitoren der IPP-Isomerase als Fungizide verwendet werden können. Besonders bevorzugt wird die IPP- Isomerase aus Ustilago maydis verwendet.
Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe einer IPP-Isomerase aus einer bestimmten Pilzspezies und auf Basis eines erfindungsgemäßen Verfahrens gefunden werden, können auch mit IPP-Isomerase aus anderen Pilzspezies interagieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkommenden IPP-Isomerase nicht immer gleich stark sein muss. Dies erklärt unter anderem die Selektivität wirksamer Substanzen. Die Nutzung der Wirkstoffe, die mit einer spezifischen IPP- Isomerase gefunden wurden, als Fungizid auch bei anderen Pilzen kann darauf zurückgeführt werden, dass sich IPP-Isomerasen aus verschiedenen Pilzspezies nahe stehen und in größeren Bereichen eine klare Homologie zeigen. So wird an Abbildung 2 deutlich, dass eine solche Homologie über beträchtliche Sequenzabschnitte hinweg zwischen S. cerevisiae, S. pombe, und U. maydis besteht und damit die Wirkung der z.B. mit Hilfe der IPP-Isomerase aus U. maydis gefundenen Substanzen nicht auf U. maydis beschränkt bleibt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden durch Testen von potentiellen Inhibitoren bzw. Modulatoren der enzymatischen Aktivität der IPP-Isomerase (Kandidatenverbindung oder Testverbindung) in einem IPP-Isomerase-Hemmtest, wobei ein in einem Aktivitätstest gefundener Inhibitor bzw. Modulater der IPP-Isomerase anschließend auf seine Wirksamkeit als Fungizid in vivo, d.h. an einem Pilz, getestet werden kann. Verfahren, die geeignet sind, Modulatoren, insbesondere Inhibitoren bzw. Antagonisten der erfindungsgemäßen Polypeptide zu identifizieren, beruhen in aller Regel auf der Bestimmung der Aktivität bzw. der biologischen Funktionalität des Polypeptids. Dazu kommen prinzipiell sowohl auf ganzen Zellen beruhende Verfahren (in vivo Verfahren) in Frage, wie auch Verfahren, die auf der Verwendung des aus den Zellen isolierten Polypeptids beruhen, das in gereinigter oder teilweise gereinigter Form oder auch als Rohextrakt vorliegen kann. Diese zellfreien in vitro Verfahren können ebenso wie in vivo Verfahren im Labormaßstab, in bevorzugter Weise aber auch in HTS oder UHTS Verfahren genutzt werden. Im Anschluss an die in vivo oder in vitro Identifizierung von Modulatoren des Polypeptids können Tests an Pilzkulturen durchgeführt werden, um die fungizide Wirksamkeit der gefundenen Verbindungen zu prüfen.
Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind bevorzugt auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Ist eine solche erste Prüfung erfolgt und eine oder mehrere Verbindungen, Extrakte etc. gefunden, kann die Wirkung solcher Verbindungen im Labor noch gezielter untersucht werden. So kann in einem ersten Schritt die Inhibierung oder Aktivierung des erfindungsgemäßen Polypeptids in vitro noch einmal geprüft werden, um im Anschluss daran die Wirksamkeit der Verbindung am Zielorganismus, hier einem oder mehreren pflanzenpathogenen Pilzen, zu testen. Die Verbindung kann dann gegebenenfalls als Ausgangspunkt für die weitere Suche und Entwicklung von fungiziden Verbindungen verwendet werden, die auf der ursprünglichen Struktur basieren, jedoch z.B. hinsichtlich Wirksamkeit, Toxizität oder Selektivität optimiert sind.
Um Modulatoren aufzufinden, kann z.B. ein synthetischer Reaktionsmix (z.B. Produkte der in vitro Transkription) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran, ein Kompartiment oder irgendeine andere Präparation, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthält, zusammen mit einem gegebenenfalls markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und
Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu hemmen, wird z.B. erkennbar an einer verringerten Bindung des gegebenenfalls markierten Liganden oder an einer verringerten
Umsetzung des gegebenenfalls markierten Substrates. Moleküle, die die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide hemmen, sind gute Antagonisten bzw. Inhibitoren.
Die Detektion der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide kann durch ein so genanntes Reportersystem verbessert werden. Reportersysteme in dieser Hinsicht umfassen, sind aber nicht beschränkt auf colorimetrisch oder fluorimetrische nachweisbare Substrate, die in ein Produkt umgewandelt werden oder ein Reportergen, das auf Veränderungen der Aktivität oder der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide anspricht oder andere bekannte Bindungstests.
Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsgemäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst können markiert werden, z.B. fluorimetrisch oder colorimetrisch, so dass man die Anzahl der Polypeptide, die an einen Liganden gebunden sind oder die eine Umsetzung mitgemacht haben, exakt bestimmen kann. Ebenso kann jedoch die Bindung mittels des gegebenenfalls markierten Substrats, Liganden bzw. Substratanalogen verfolgt werden. Auf diese Weise lässt sich die Effektivität Antagonisten ermessen.
Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen bzw. ohne Enzym können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.
Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, für eine erfindungsgemäße IPP- Isomerase kodierende Nukleinsäuren enthaltenden Wirtszellen, wird auch die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren.
Vorzugsweise handelt es sich bei den zu identifizierenden Modulatoren um kleine organischchemische Verbindungen, nicht jedoch um die natürlichen Inhibitoren des Enzyms, wie z.B. Liganden des Enzyms oder Substratanaloga, um anorganische oder unspezifische Inhibitoren, die generell die Aktivität eines Enzyms zerstören oder vermindern, z.B. durch die unspezifische Störung der Proteinstruktur oder die Reaktion mit reaktiven Aminosäuren des Proteins.
Ein Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung, die die Aktivität einer IPP-Isomerase aus Pilzen moduliert und die als Fungizid im Pflanzenschutz verwendet werden kann, besteht demnach bevorzugt darin, dass man
a) ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine Wirtszelle enthaltend dieses Polypeptid mit einer chemischen Verbindung oder mit einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben,
b) die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und
c) die chemische Verbindung auswählt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch moduliert, vorzugsweise inhibiert, und gegebenenfalls
d) die fungizide Wirkung der ausgewählten Verbindung in vivo prüft.
Besonders bevorzugt wird dabei diejenige Verbindung bestimmt, die die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids spezifisch inhibiert. Der Begriff "Aktivität", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids.
In einer Ausfuhrungsform, die sich an einen bekannten Test zur Bestimmung der IPP-Isomerase anlehnt, wird die von der IPP-Isomerase katalysierte Reaktion mit der Reaktion der Isopentenyl- Transferase gekoppelt. Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von Dimethylallylpyrophosphat und AMP zu Isopentenyladenin und Pyrophosphat. Das Pyrophosphat wird durch das Enzym Pyrophosphatase weiter abgebaut. Das dabei entstehende'Phosphat kann mit einem dem Fachmann bekannten Malachitgrün-Test bestimmt werden. Der Versuchsansatz lässt sich wie folgt schematisch darstellen:
Isopentenylpyrophosphat <=> Dimethylallylpyrophosphat
Isopentenyl-Transferase
Dimethylallylpyrophosphat + AMP — > Isopentenyladenin + PPj
Pyrophosphatase
Die Messung der enzymatischen Aktivität der IPP-Isomerase bzw. die Hemmung dieser enzymatischen Aktivität durch einen Inhibitor erfolgt dann auf Basis der Phosphat-Konzentration. Dabei wird die geringere bzw. inhibierte Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids anhand der geringeren Phosphat-Konzentration relativ zu einem Kontrollansatz verfolgt. Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung überraschenderweise festgestellt, dass das Nachweisreagenz Malachitgrün aus dem Produkt, aber nicht aus dem Substrat der IPP-Isomerase direkt Phosphat freisetzen und nachweisen kann. Daher kann in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des beschriebenen Verfahrens sowohl auf die Isopentyl-Transferase als auch auf die Pyrophosphatase (IPPase) verzichtet werden.
Weitere Möglichkeiten zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der IPP-Isomerase werden unter anderem auch in Ramos-Valdivia (1997) beschrieben und sollen ausdrücklich Teil der vorliegenden Anmeldung sein.
Die Messung kann auch in für HTS- oder UHTS-Assays gängigeren Formaten erfolgen, z.B. in Mikrotiterplatten, in denen z.B. ein Gesamtvolumen von 5 bis 50 μl pro Ansatz bzw. pro Well vorgelegt wird. Dabei wird die zu testende, potentiell die Aktivität des Enzyms inhibierende oder aktivierende Verbindung (Kandidatenmolekül) z.B. in einer geeigneten Konzentration in
Testpuffer vorgelegt. Dann wird das erfindungsgemäße Polypeptid im oben genannten Testpuffer zugegeben und die Reaktion damit gestartet. Der Ansatz wird dann bei einer geeigneten Temperatur inkubiert und z.B. die Konzentration des entstehenden Pyrophosphats gemessen.
Eine weitere Messung erfolgt in einem entsprechenden Ansatz, jedoch ohne Zugabe eines Kandidatenmoleküls und ohne Zugabe eines erfindungsgemäßen Polypeptids (Negativkontrolle). Eine weitere Messung erfolgt wiederum bei Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, jedoch bei Anwesenheit des erfindungsgemäßen Polypeptids (Positivkontrolle). Negativ- und Positivkontrolle ergeben damit die Vergleichswerte zu den Ansätzen bei Anwesenheit eines Kandidatenmoleküls.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnten auf diese Weise Inhibitoren der IPP-Isomerase identifiziert werden.
Es versteht sich von selbst, dass neben den genannten Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einer IPP-Isomerase bzw. der Inhibition dieser Aktivität und zum Identifizieren von Fungiziden auch andere, z.B. bereits bekannte, Verfahren bzw. Hemmtests verwendet werden können, solange diese Verfahren es gestatten, die Aktivität einer IPP-Isomerase zu bestimmen und eine Inhibition dieser Aktivität durch eine Kandidatenverbindung zu erkennen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde auch gefunden, dass die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Inhibitoren einer erfindungsgemäßen IPP-Isomerase geeignet sind, in einer geeigneten Formulierung Pilze zu schädigen oder zu töten.
Dazu können z.B. in die Kavitäten von Mikrotiterplatten eine Lösung des zu prüfenden Wirkstoffs pipettiert werden. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft wird, wird zu jeder Kavität Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit einer geeigneten Konzentration von Sporen bzw. Mycel des zu prüfenden Pilzes versetzt. Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffes betragen z.B. 0,1, 1 , 10 und 100 ppm.
Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 220C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist.
Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen kann die Wirkstoffdosis bestimmt werden, die zu einer 50 %igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED50).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf die Verwendung von Modulatoren der IPP-Isomerase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide, bzw. auf Verfahren zum Bekämpfen von vorzugsweise pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Modulator, bevorzugt einen Inhibitor einer IPP-Isomerase mit dem betreffenden Pilz und/oder seiner Umgebung in einer wirksamen Menge in Kontakt bringt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher ebenfalls auf Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden sowie die Verwendung von Inhibitoren der TPP-Isomerase aus Pilzen, bevorzugt aus pflanzenpathogenen Pilzen als Fungizide. Davon sollen jedoch natürliche Inhibitoren wie Analoga des Substrats der IPP-Isomerase bzw. Analoga des Übergangszustandes des Substrats und unspezifische Inhibitoren, die auch bei anderen Enzymen als der IPP-Isomerase eine deutliche inhibitorische Wirkung zeigen oder grundsätzlich durch die Schädigung der Proteinstruktur eine inhibitorische Wirkung haben, sowie anorganische Verbindungen nicht umfasst sein. Ein spezifischer Inhibitor sollte eine zumindest lOfach, bevorzugt 20fach, besonders bevorzugt 50fach und vorzugsweise lOOfach stärkere inhibitorische Wirkung gegenüber der IPP-Isomerase aufweisen als gegenüber einem anderen Enzym.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Fungizide, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden.
Verbindungen, die mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden, und die aufgrund der Inhibition der pilzlichen IPP-Isomerase eine fungizide Wirkung aufweisen, können somit zur Herstellung von fungiziden Mitteln verwendet werden. Die identifzierten Wirkstoffe können in Abhängigkeit von ihren jeweiligen physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften in die üblichen Formulierungen überfuhrt werden, wie Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Pulver, Schäume, Pasten, Granulate, Aerosole, Feinstverkapselungen in polymeren Stoffen und in Hüllmassen für Saatgut, sowie ULV-KaIt- und Warmnebel-Formu- lierungen.
Diese Formulierungen werden in bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Vermischen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, also flüssigen Lösungsmitteln, unter Druck stehenden verflüssigten Gasen und/oder festen Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln, also Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln und/oder schaumerzeugenden Mitteln. Im Falle der Benutzung von Wasser als Streckmittel können z.B. auch organische Lösungsmittel als Hilfslösungs- mittel verwendet werden. Als flüssige Lösungsmittel kommen im wesentlichen in Frage: Aromaten, wie Xylol, Toluol oder Alkylnaphthaline, chlorierte Aromaten oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzole, Chlorethylene oder Methylenchlorid, aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie Cyclohexan oder Paraffine, z.B. Erdölfraktionen, Alkohole, wie Butanol oder Glycol sowie deren Ether und Ester, Ketone, wie Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon oder Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel, wie Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, sowie Wasser. Mit verflüssigten gasförmigen Streckmitteln oder Trägerstoffen sind solche Flüssigkeiten gemeint, welche bei normaler Temperatur und unter Normaldruck gasförmig sind, z.B. Aerosol- Treibgase, wie Halogenkohlenwasserstoffe sowie Butan, Propan, Stickstoff und Kohlendioxid. Als feste Trägerstoffe kommen in Frage: z.B. natürliche Gesteinsmehle, wie Kaoline, Tonerden, Talkum, Kreide, Quarz, Attapulgit, Montmorillonit oder Diatomeenerde und synthetische Gesteinsmehle, wie hochdisperse Kieselsäure, Aluminiumoxid und Silikate. Als feste Trägerstoffe für Granulate kommen in Frage: z.B. gebrochene und fraktionierte natürliche Gesteine wie Calcit, Marmor, Bims, Sepiolith, Dolomit sowie synthetische Granulate aus anorganischen und organischen Mehlen sowie Granulate aus organischem Material wie Sägemehl, Kokosnussschalen, Maiskolben und Tabakstängel. Als Emulgier und/oder schaumerzeugende Mittel kommen in Frage: z.B. nichtionogene und anionische Emulgatoren, wie Polyoxyethylen-Fettsäureester, Polyoxyethylen-Fettalkoholether, z.B. Alkylaryl- polyglycolether, Alkylsulfonate, Alkylsulfate, Arylsulfonate sowie Eiweißhydrolysate. Als Dispergiermittel kommen in Frage: z.B. Lignin-Sulfitablaugen und Methylcellulose.
Es können in den Formulierungen Haftmittel wie Carboxymethylcellulose, natürliche und synthetische pulverige, körnige oder latexförmige Polymere verwendet werden, wie Gummiarabicum, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, sowie natürliche Phospholipide, wie Kephaline und Lecithine, und synthetische Phospholipide. Weitere Additive können mineralische und vegetabile Öle sein. Es können Farbstoffe wie anorganische Pigmente, z.B. Eisenoxid, Titanoxid, Ferrocyanblau und organische Farbstoffe, wie Alizarin-, Azo- und Metallphthalocyaninfarbstoffe und Spurennährstoffe, wie Salze von Eisen, Mangan, Bor, Kupfer, Kobalt, Molybdän und Zink verwendet werden.
Die Formulierungen enthalten im allgemeinen zwischen 0,1 und 95 Gewichtsprozent Wirkstoff, vorzugsweise zwischen 0,5 und 90 %.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe können als solche oder in ihren Formulierungen auch in Mischung mit bekannten Fungiziden, Bakteriziden, Akariziden, Nematiziden oder Insektiziden verwendet werden, um so z.B. das Wirkungsspektrum zu verbreitern oder Resistenzentwicklungen vorzubeugen. In vielen Fällen erhält man dabei synergistische Effekte, d.h. die Wirksamkeit der Mischung ist größer als die Wirksamkeit der Einzelkomponenten.
Beim Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindungen als Fungizide können die Aufwandmengen je nach Applikation innerhalb größerer Bereiche variiert werden.
Erfindungsgemäß können alle Pflanzen und Pflanzenteile behandelt werden. Unter Pflanzen werden hierbei alle Pflanzen und Pflanzenpopulationen verstanden, wie erwünschte und unerwünschte Wildpflanzen oder Kulturpflanzen (einschließlich natürlich vorkommender Kulturpflanzen). Kulturpflanzen können Pflanzen sein, die durch konventionelle Züchtungs- und Optimierungsmethoden oder durch biotechnologische und gentechnologische Methoden oder Kombinationen dieser Methoden erhalten werden können, einschließlich der transgenen Pflanzen und einschließlich der durch Sortenschutzrechte schützbaren oder nicht schützbaren Pflanzen- Sorten. Unter Pflanzenteilen sollen alle oberirdischen und unterirdischen Teile und Organe der Pflanzen, wie Spross, Blatt, Blüte und Wurzel verstanden werden, wobei beispielhaft Blätter, Nadeln, Stängel, Stämme, Blüten, Fruchtkörper, Früchte und Samen sowie Wurzeln, Knollen und Rhizome aufgeführt werden. Zu den Pflanzenteilen gehört auch Erntegut sowie vegetatives und generatives Vermehrungsmaterial, beispielsweise Stecklinge, Knollen, Rhizome, Ableger und Samen.
Die erfindungsgemäße Behandlung der Pflanzen und Pflanzenteile mit den Wirkstoffen erfolgt direkt oder durch Einwirkung auf deren Umgebung, Lebensraum oder Lagerraum nach den üblichen Behandlungsmethoden, z.B. durch Tauchen, Sprühen, Verdampfen, Vernebeln, Streuen, Aufstreichen und bei Vermehrungsmaterial, insbesondere bei Samen, weiterhin durch ein- oder mehrschichtiges Umhüllen.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung und sind nicht limitierend auszulegen. Beispiele
Beispiel 1
Klonierung, Expression und Reinigung der IPIl aus U. maydis
Für die heterologe Expression des ipil-Gens wurde das Gen mit den genspezifischen Oligonucleotiden Idi-c (5 '-CTCGAGGATCCAGGAGGCGGTGAATG-S ') und Idi-n (5'- CTCGCATATGTCGACCGCCACCGTCAC-3') mittels PCR amplifiziert und über die eingeführte Ndel- und ßαmFfl-Schnittstelle in den Vektor pET21b (Novagen) eingebracht. Die erhaltenen Plasmide wurden in den E. co/z'-Stamm BL21 (DE3) transformiert.
5 ml Selektionsmedium (dYT Medium mit 100 μg/ml Ampicillin) wurde mit einer Einzelkolonie angeimpft und bei 370C über Nacht im Schüttler inkubiert. Eine Glycerindauerkultur wurde wie folgt hergestellt: 900μl Kultur und 100 μl steriles Glycerin mischen und bei -700C einfrieren. Als
Vorkultur wurde 12 ml dYT Medium mit 25 μl aus der Dauerkultur angeimpft und bei 37°C über
Nacht im Schüttler inkubiert. Die Hauptkultur wurde 1 :40 angeimpft, d.h. 12 ml Vorkultur und
500 ml dYT-Medium + 100 μg/ml Ampicillin. Das Wachstum der Kultur erfolgte bei 370C unter Schütteln und nach Erreichen einer OD6oo von 0,8 wurde die Kultur durch Zugabe von ImM IPTG
(Endkonzentration) induziert. Nach einer Inkubationszeit von 5 Stunden bei 37°C wurden die
Zellen durch Zentrifugation geerntet und das Pellet bei -700C eingefroren.
Das Zellpellet einer 500 ml Expressionskultur wurde in 35 ml Aufschlusspuffer resuspendiert (50 mM Tris, 1 % Glycerin, ImM DTT, 300 raM NaCl, 0,5 % Tween 20, pH 7,5). Der Aufschluss der Zellen erfolgte mit einem Sonifizierstab auf Eis. Es wurde 8 mal 45 Sekunden mit jeweils 45 Sekunden Pause sonifiziert. Die löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden durch Abzentri- fugieren (30 min. bei 40C und 10 000 rpm) getrennt. Der Überstand wurde an eine 50%ige Ni- NTA-Agarose Matrix von Qiagen für 60 Minuten bei 40C gebunden und in eine Leersäule überführt. Die Bindekapazität der Ni- NTA Matrix liegt bei 9 mg Protein pro 1 ml Agarose. Die Säule wurde zweimal mit je 44 ml Aufschlusspuffer + 10 mM Imidazol gewaschen. Die Elution erfolgte in 2 ml Fraktionsschritten mit Aufschlusspuffer + 250 mM Imidazol. Die das gereinigte Enzym enthaltenden Fraktionen wurden danach gepoolt und auf 1 mg/ml verdünnt. Es erfolgte eine Zugabe von Glycerin in einer Endkonzentration von 10 %. Die Lagerung des Enzyms erfolgt bei -7O0C. Beispiel 2
Identifzierung von Modulatoren der IPP-Isomerase in einem Hemmtest
Die Test wurden in 384er MTPs von Greiner (transparent) durchgeführt. Die Negativkontrolle erfolgte durch Weglassen des Enzyms. 5 μl Rl-Puffer (10 mM Tris/HCl pH 7,5, 20 mM MgCl2, 10 % Glycerin) bzw. die zu prüfende Substanz (1/10 des Assayvolumens) wurden zusammen mit 20 μl Substratlösung (0,15 mM IPP in Reaktionspuffer Rl), 25 μl Enzymmix (0,59 μg/ml gereinigtes Protein (IPP-Isomerase) in Reaktionspuffer Rl) bei 370C für 25 Minuten inkubiert. Es wurden 50 μl Malachitgrün-Färbelösung zugegeben und bei RT für 90 Minuten inkubiert. Die Detektion einer Änderung der Absorption erfolgte bei 620 nm.
Beispiel 3
Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der IPP-Isomerase
In die Kavitäten von Mikrotiterplatten werden eine methanolische Lösung des anhand eines erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten Wirkstoffs (Bsp. 3), versetzt mit einem Emulgator, pipettiert. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft ist, werden je Kavität 200 μl Potatoe-Dextrose- - Medium hinzugefügt. Das Medium wird vorher mit geeigneten Konzentrationen von Sporen bzw. Mycelen des zu prüfenden Pilzes versetzt.
Die resultierenden Konzentrationen des Wirkstoffs beträgt 0,1, 1, 10 und 100 ppm. Die resultierende Konzentration des Emulgators beträgt 300 ppm.
Die Platten werden anschließend auf einem Schüttler bei einer Temperatur von 220C inkubiert, bis in der unbehandelten Kontrolle ein ausreichendes Wachstum feststellbar ist. Die Auswertung erfolgt photometrisch bei einer Wellenlänge von 620 nm. Aus den Messdaten der verschiedenen Konzentrationen wird die Wirkstoffdosis, die zu einer 50 %igen Hemmung des Pilzwachstums gegenüber der unbehandelten Kontrolle führt (ED50), berechnet. Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden, dadurch gekennzeichnet, dass man
(a) ein pilzliches Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer IPP-Isomerase mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion der chemischen Verbindung mit dem
Polypeptid erlauben, in Kontakt bringt,
(b) die Aktivität der IPP-Isomerase bei Abwesenheit einer chemischen Verbindung mit der Aktivität der IPP-Isomerase bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung oder eines Gemisches von chemischen Verbindungen vergleicht, und
(c) die chemische Verbindung, die die IPP-Isomerase spezifisch inhibiert, auswählt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aktivität der IPP- Isomerase bestimmt, indem man die Entstehung von Phosphat aus dem Produkt der von der IPP-Isomerase katalysierten Reaktion misst.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hemmung der enzymatischen Aktivität der IPP-Isomerase bei Anwesenheit einer chemischen Verbindung anhand einer abnehmenden Menge an Phosphat bestimmt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion der IPP-Isomerase direkt mittels eines Malachitgrün-Tests bestimmt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem weiteren Schritt (d) die fungizide Wirkung der identifizierten Verbindung testet, indem man sie mit einem Pilz in Kontakt bringt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine IPP-Isomerase aus einem pflanzenpathogenen Pilz verwendet.
7. Verwendung von Polypeptiden mit der Aktivität einer IPP-Isomerase zum Identifizieren von Fungiziden.
8. Verwendung von Inhibitoren von Polypeptiden mit der Aktivität einer IPP-Isomerase als Fungizide.
9. Verfahren zur Kontrolle von pflanzenpathogenen Pilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man (a) eine fungizid wirksame Verbindung in einem Verfahren gemäß Anspruch 1 identifiziert,
(b) die identifizierte Verbindung in geeigneter Weise formuliert, und
(c) mit dem pflanzenpathogenen Pilz und/oder seiner Umgebung in Kontakt bringt.
10. Verwendung von fungiziden Verbindungen, die in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 gefunden werden, zum Herstellen von fungiziden Mitteln.
11. Nukleinsäure gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:
(a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1,
(b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst,
(c) Sequenzen, welche an die unter a) definierten Sequenzen bei einer Hybridisie- rungstemperatur von 42-65°C hybridisieren, und
(d) Sequenzen, welche eine zumindest 80 %ige, bevorzugt eine zumindest 85 %ige und besonders bevorzugt eine zumindest -90 %ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen aufweisen.
12. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 10 oder 11 und einen heterologen Promotor.
13. Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12, oder ein DNA- Konstrukt gemäß Anspruch 12.
14. Vektor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure funktionell mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die die Expression der Nukleinsäure in pro- oder eukaryotischen Zellen gewährleisten.
15. Wirtszelle enthaltend eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12, ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 13 oder einen Vektor gemäß Anspruch 14 oder 15.
16. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase, welches von einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 11 oder 12 kodiert wird.
17. Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer IPP-Isomerase, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 umfasst.
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