EP1844067A2 - Nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations - Google Patents

Nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de proteines bcl-2 et utilisations

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EP1844067A2
EP1844067A2 EP06709202A EP06709202A EP1844067A2 EP 1844067 A2 EP1844067 A2 EP 1844067A2 EP 06709202 A EP06709202 A EP 06709202A EP 06709202 A EP06709202 A EP 06709202A EP 1844067 A2 EP1844067 A2 EP 1844067A2
Authority
EP
European Patent Office
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seq
bcl
peptide
family
proteins
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06709202A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Olivier Geneste
John Hickman
Jean-Christophe Rain
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Les Laboratoires Servier SAS
Aton SA
Original Assignee
Hybrigenics SA
Les Laboratoires Servier SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Hybrigenics SA, Les Laboratoires Servier SAS filed Critical Hybrigenics SA
Publication of EP1844067A2 publication Critical patent/EP1844067A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention is part of the research and identification of novel peptides interacting with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • the invention relates to a method for screening and identifying modulators of the protein interaction between these novel peptides and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • Modulators isolated by this screening method are useful for regulating programmed apoptotic and / or autophagic cell death. These modulators are administered to patients during cancer treatments.
  • the invention relates to five peptide motifs capable of interacting respectively with an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins and their uses for inducing programmed cell death in cancer patients.
  • the programmed cell death is composed, on the one hand, of apoptosis and, on the other hand, of autophagic death.
  • Apoptosis is the best known phenomenon. This type of cell death involves morphological changes, such as core condensation, DNA fragmentation, as well as biochemical phenomena, such as the activation of caspases that will degrade key structural components of the cell to induce it. his disassembly and his death.
  • the regulation of the apoptosis process is complex and involves activation or repression of several intracellular signaling pathways.
  • Autophagic death is a second less known mechanism of programmed cell death.
  • autophagy can be summed up in three stages: the formation of an initial autophagic vacuole (autophagosome) and the maturation of the autophagosome into a degradative vacuole and its fusion with the lysosome.
  • Autophagic death therefore involves processes of lysosomal degradation, characterized by the accumulation of autophagic vacuoles, independent of a caspase-type regulatory pathway.
  • Maintaining a cell alive or programming its death requires the regulation of a major signaling pathway involving in particular proteins of the Bcl-2 family.
  • Proteins of the Bcl-2 family are divided into three main classes.
  • Anti-apoptotic proteins such as Bcl-2, BCI-XL and BcI-W, show strong homology in their four BH domains.
  • the pro-apoptotic proteins are divided into two categories, on the one hand, multidomain proteins such as BAX and BAK and, on the other hand, pro-apoptotic proteins such as BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM and BAD. characterized by the presence of a single domain of homology, the BH3 motif (Cory and Adams, The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch Nature reviews vol.2 september 2002).
  • the BH3 motif is an amphiphilic helical ⁇ region whose sequence identity is relatively low in the BcI-2 family of proteins.
  • the presence of the BH3 motif in a protein is required to allow interaction with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • the activity of an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is regulated by the product of the pro-apoptotic genes of said family, the two proteins assembling into heterodimers. Under this state the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is inactive and therefore no longer has its anti-apoptotic activity.
  • the specific interaction of the BH3 motif with the anti- Apoptotic family of Bcl-2 proteins can be modified by modulators to specifically induce programmed cell death.
  • the invention therefore proposes to screen and identify new peptides interacting with the anti-apoptotic members of the protein family
  • Bcl-2 and use as such these new peptides to screen and identify molecules capable of modifying these interactions to obtain real drug candidates effective in pathologies involving deregulation of apoptosis, including cancers.
  • the dual hybrid system initially consists of a yeast test between two recombinant proteins.
  • the first protein called “bait” is a fusion protein containing a DNA binding domain (BD) linked upstream of a protein A.
  • the second protein is also a fusion protein, commonly called “prey”, containing an activation domain (activation domain or
  • AD bound to a protein B.
  • the binding and activation domains commonly used are those of Gal4 or E. CoIi Lex A.
  • the proteins A and B are respectively an anti-apoptotic member of the family of Bcl-2 proteins and a pattern from a cDNA library.
  • the association of proteins A and B by protein interaction allows the formation, by complementation, of a functional domain (BD-AD) capable of binding to the binding site (BS or BS) present upstream of a reporter gene and to ensure the transcription of said reporter gene.
  • BD-AD functional domain capable of binding to the binding site (BS or BS) present upstream of a reporter gene and to ensure the transcription of said reporter gene.
  • the inventors have established, on the basis of the double hybrid system, the existence of a structural interaction between the anti-apoptotic members of the Bcl-2 protein family and the following peptides of amino acid sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID No. 5 according to the invention. This protein interaction between these partners is similar to that existing in the regulation of the apoptotic phenomenon between the anti- and pro-apoptotic partners of the Bcl-2 protein family.
  • the following peptide unit NH 2 - XXXXXXXXLXXXDXXXXXXXXXX -COOH (SEQ ID NO.6) in which X corresponds to any amino acid, corresponds to a consensus sequence of the peptide sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID No. 5 according to the invention.
  • This consensus sequence is similar to that of the BH3 motifs present in the pro-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • the size of the peptides according to the invention make them ideal candidates for the elaboration of tests allowing the highly efficient screening of molecules capable of modulating the interactions between these peptides and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family.
  • Numerous screening assays for protein-protein interaction modulators are found in the literature, but often have limitations on their sensitivity and high-throughput feasibility.
  • the commonly used methods require the implementation of complex tools (fusion proteins, recombinant proteins, etc.) that are not very compatible with high throughput screening. They generate most often a significant background noise and are unreliable from a quantitative point of view: they have a reduced reading window that does not allow optimal screening of the molecules tested.
  • the present invention relates to a peptide interacting with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins.
  • This peptide comprises the following amino acid sequences: a) MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.1); b) VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.2); c) RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.3); d) DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.4); e) VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.5); f) XXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX (SEQ ID NO.6); and functional variants of these amino acid sequences.
  • amino acid sequence is to be understood a peptide sequence isolated from the natural context. These include isolated sequences, synthesized chemically and / or purified and possibly modified by genetic engineering.
  • NO.5 are, for example, the following: glycine by alanine (GA), valine by leucine (VL); aspartic acid by glutamic acid (DE), asparagine by glutamine (NQ), arginine by lysine (R - K), tyrosine by leucine (YL), leucine by methionine (LM), valine by isoleucine (VI) and glutamine by histidine (QH).
  • the invention also relates to the nucleic acid sequences encoding the peptides of SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5.
  • These nucleotide sequences corresponding to the peptide sequences SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5 are respectively: a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be obtained according to the genetic code from the corresponding amino acid sequences and their variants.
  • variants of these nucleic acid sequences are in particular: sequences capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleic acid sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 11 or sequences complementary to those and encoding polypeptides having respectively substantially the same properties as the peptides of SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5, or, sequences of a mammalian species homologous to sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 11 isolated in humans.
  • stringent conditions is meant the conditions which allow the specific hybridization of two single-stranded DNA sequences at about 65 ° C., for example in a solution of 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS, 5 ⁇
  • Tm Denhardt's solution and 100 ⁇ g nonspecific carrier DNA or any other solution of equivalent ionic strength and after washing at 65 ° C, for example in a solution of at most 0.2 x SSC and 0.1% SDS or any another solution of equivalent ionic strength.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm 81, 5 + 0.41 (% G + C) + 16.6Log (cation concentration) - 0.63 (% formamide) - ( 600 / number of bases).
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the stringency conditions can therefore be adapted by those skilled in the art depending on the size of the sequence, the GC content and any other parameter, in particular according to the protocols described in Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd Ed., Spring Harbor Co, Spring Press, Spring Harbor Co, New York).
  • sequences of a species of mammals homologous to the sequences SEQ ID No. 7 to SEQ ID NO.11 structural sequences similar to said nucleotide sequences and coding respectively for polypeptides having essentially the same properties in species of non-human mammals, including primates, rats or mice.
  • the percentage identity between two homologous sequences in the functional regions is generally greater than 80%, preferably greater than 90%.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising one of the nucleic acid sequences, SEQ ID No. 7 to SEQ ID No. 11 as claimed according to the invention.
  • vector it is necessary to understand any type of vector allowing the introduction of the nucleic acid sequence into the host cell and possibly the expression of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence in this host cell.
  • a vector is for example a plasmid, a cosmid, an artificial bacterial chromosome or a bacteriophage comprising the sequences necessary for the expression of the peptides of amino acid sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5.
  • the recombinant vector according to the invention comprises the sequences necessary for the expression of the peptides of SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5 sequences in the host cell. These sequences include sequences promoting transcription and translation in the host cell as well as terminator sequences.
  • the recombinant vector may also include sequences encoding secretion signals allowing the release of translated proteins into the extracellular environment.
  • the invention also relates to the host cells transformed with a recombinant vector according to the invention.
  • these host cells are bacterial cells such as Escherichia coli, for example streptococci or eukaryotic cells such as yeast cells, filamentous fungi, insect cells and preferably mammalian cells. .
  • the peptides of amino acid sequence SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5, can also be synthesized chemically, by contract, by Neosystem.
  • the chemical synthesis of the peptide sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 and their functional variants is carried out by solid-state synthesis according to the Boc / benzyl strategy using an "Applied Biosystems 430A" peptide synthesizer. .
  • the synthesis is based on the development of the desired sequence on resin, followed by deprotection of the N- and C-terminal amino functions.
  • Boc / benzyl strategy it is necessary to introduce the amino acid Boc-L-Lys (Fmoc) -OH during the synthesis of the peptide. After developing the entire sequence, the amino function is deprotected and the peptide cut off from the resin in the presence of a strong acid.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide of amino acid sequences SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4 or SEQ ID NO. active ingredient in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • excipients of a pharmaceutical composition any agent ensuring the transport of the active ingredient in the internal routes in the patient treated.
  • active principle is meant any substance responsible for the pharmacodynamic or therapeutic properties of the pharmaceutical composition.
  • the present invention relates not only to the pharmaceutical composition as such and defined above, but also to the use of this composition in a method of inducing programmed cell death.
  • This induction method comprises the administration to the patient, in particular of cancers, of an effective quantity of pharmaceutical composition comprising one of the peptides according to the invention.
  • the subject of the invention is also a method for identifying modulators of the interaction between a peptide according to the invention and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins comprising the following steps:
  • the method for identifying modulators of the interaction comprises the following steps:
  • modulator is meant any compound capable of increasing, preventing or at least limiting a specific activity such as a protein-protein interaction, an enzymatic activity, an attachment to cellular receptors.
  • the modulators are inhibitors or activators of the protein interaction between the peptide partners of amino acid sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5 and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 proteins.
  • the invention also relates to a method for identifying an inhibitor of the interaction between one of the peptides according to the invention and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins capable of decreasing the fluorescence polarization with respect to a control consisting of this interaction in the absence of a modulator.
  • the invention also relates to a method for identifying an activator of the interaction between one of the peptides according to the invention and an anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins capable of increasing the fluorescence polarization by compared to a control consisting of this interaction in the absence of a modulator.
  • the fluorescent ligand ie one of the peptide motifs SEQ ID NO.1 to SEQ ID No. 5 fluorescent, after binding with the anti-apoptotic partner of the Bcl-2 protein family, has a lower rotation constant than the corresponding free ligand. and thus the fluorescence emitted by the bound ligand becomes polarized. As a result, there is an increase in the polarization of the fluorescence emitted by the ligand bound versus free ligand.
  • the fluorescence probe used in the screening and identification method according to the invention is bodipy, oregon green and more preferably fluorescein. More particularly, the anti-apoptotic member of the protein family
  • Bcl-2 acting as a partner of the interaction in the screening and identification process according to the invention, may be the Bcl-2 protein, BCI-XL or BcI-W.
  • the anti-apoptotic member of the Bcl-2 family of proteins is a fusion protein.
  • fusion protein is meant the fusion between a domain of the Bcl-2 protein, Bcl-X L or BcI-W and a protein domain such as GST (Glutathione-S-transferase).
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one modulator, activator or inhibitor, identified from the modulator identification method according to the invention, as the active principle of said composition in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients. acceptable.
  • the invention also relates to a method of inducing programmed apoptotic (caspase-dependent) and / or autophagic (independent caspase) programmed cell death from the administration of an effective amount of composition defined above to a patient suffering from cancers.
  • the pharmaceutical compositions as described above can be used in the treatment of cancers, by action on programmed apoptotic and / or autophagic cell death.
  • compositions according to the invention are in a form suitable for oral, parenteral, nasal, percutaneous, rectal, perlingual, ocular or respiratory administration and in particular simple or coated tablets, sublingual tablets, sachets, packets, capsules, glossettes, tablets, suppositories, creams, ointments, dermal gels, and ampoules drinkable or injectable.
  • FIG. 4 amino acid sequence SEQ ID NO. 4 of the Loc 51569 peptide interacting with the anti-apoptotic members of the Bcl-2 protein family.
  • FIG. 6 SEQ ID NO.6 consensus pattern of the peptide sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID No. 5 according to the invention.
  • FIG. 7 determination of Ki in fluorescence polarization of the peptides competing with amino acid sequences SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 according to the invention, on the interaction between the pro-apoptotic peptide Bak and the member anti-apoptotic BCI-XL.
  • Bcl-2 (accession number XM_008738) deleted from its C-terminus (1-211) and fused to the LexA DNA binding domain.
  • These baits are expressed in the yeasts Saccharomyces cerevisiae strain L40 ⁇ gal4 (MATa ade2, trp1-901, leu2-3, 112, Iys2-8O1, his3 ⁇ 200, LYS2 (lexAop) 4 -HIS3, ura3-52 :: URA3 (lexAop) 8 - LacZ, GAL4 :: Kan R ) and placed in preculture at 30 0 C in a synthetic medium free of tryptophan (DO-Trp) until an optical density OD 6 oonm of between 0.1 and 0 is obtained, 5.
  • L40 ⁇ gal4 MATa ade2, trp1-901, leu2-3, 112, Iys2-8O1, his3 ⁇ 200
  • a Saccharomyces cerevisiae yeast strain YHGX13 strain (MAT ⁇ Gal4 ⁇ Gal ⁇ O ⁇ ade2-101 :: Kan R , his3, leu2-3-112, trp1-901, ura3-52 URA3 :: UASGAL1-LacZ, Met) containing the plasmids Expressing the cDNA libraries fused to the Gal4 transcriptional activation domain is obtained by transformation after selection on a culture medium lacking leucine (OD-Leu). These yeasts are aliquoted and stored at -80 ° C.
  • the conjugation is carried out with a ratio "bait” / "prey” equal to 2.
  • a quantity of yeast cells "baits” obtained in stage 1) a) corresponding to 50 units OD ⁇ oonm is mixed with yeasts "prey” obtained in stage 1 ) b).
  • the pellet is resuspended in YPGIu medium, spread on YPGIu culture dishes and incubated for 4 hours 30 to 30 ° C.
  • the selection of conjugated yeasts containing a "bait” and a "prey” capable of interacting sets is performed on a medium DO-
  • Leu-Trp-His the absence of leucine and tryptophan makes it possible to maintain a selection pressure that allows only the yeasts containing both types of plasmids ("bait” / "prey") to grow; the absence of histidine in the medium makes it possible to select the conjugated yeasts containing a "bait” plasmid and a "prey” plasmid capable of interacting together: the complementation as described makes it possible to activate the HIS3 gene, as a gene reporter coding for an enzyme involved in the biosynthesis of histidine.
  • prey fragments of a colony of yeasts selected according to the conjugation method described in paragraph 2) are amplified by PCR at from a crude lysate of this colony, using primers specific for the vector "prey”:
  • the PCR products are then sequenced and the sequences obtained are identified by comparison with databases.
  • the double hybrid system makes it possible to identify several "prey” fragments. This identification is done by comparing sequences of "prey” selected from a computer program such as Blastwun available on the website of the University of Washington: http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/blastwu .html.
  • Ki in fluorescence polarization consists in measuring the effect of the competing peptides of respective amino acid sequences SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 5 on the interaction between the pro-apoptotic peptide Bak and the anti members.
  • -apoptotic family of Bcl-2 proteins such as BCI-XL.
  • the anti-apoptotic member of the Bcl-2 protein family at a final concentration of 100 nM for BCI-XL.
  • reagents are in solution in the interaction buffer (20 mM Na 2 HPO 4 pH 7.4, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl and 0.05% pluronic acid F-68). The mixture is then incubated for 30 minutes at room temperature and the fluorescence polarization determined on the Fusion apparatus (Packard) (excitation at 485 nm and reading at 530 nm). The values are given in mP (fluorescence polarization unit).
  • the determination of Ki in fluorescence polarization consists of measuring the competitive effect of the peptides SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5 mutated, from leucine to alanine (LA), on the interaction between the pro-apoptotic peptide BAK and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins such as Bcl-X L.
  • the peptide sequences SEQ ID NO.1 to SEQ ID NO.5 mutated (LA) are as follows:
  • VMTQEVGQLAQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.15); RLKHSCLLAAKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.16);
  • the protocol for determining Ki in fluorescence polarization is identical to the protocol described above. By comparison of the fluorescence polarization analysis results, a loss of competitive effect of the mutated peptides (LA) SEQ ID No. 14 to SEQ ID NO. 18 compared with the peptides SEQ ID NO. 1 to SEQ ID is observed.
  • NO.5 according to the invention in the peptide interaction between the pro-apoptotic peptide Bak and the anti-apoptotic members of the Bcl-2 family of proteins such as Bcl-X L.
  • the products to be tested are distributed in 384-well plates (Corning Fiat Bottom) at a final concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • a well is filled with an equivalent amount of buffer / solvent without test compound and will constitute the control.
  • the peptides obtained in Example 1 labeled with fluorescein are added to the wells so as to obtain a final concentration ranging from 1 to 100 nM.
  • the GST-BCI-XL or GST-Bcl-2 or GST-BcI-W fusion protein is then added so as to obtain a final concentration of 0.1 to 1 ⁇ M in a buffer containing

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Abstract

L'invention s'inscrit dans le cadre de la recherche et l'identification de nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 par le système du double hybride. L'invention a pour objet une méthode de criblage et d'identification de modulateurs de l'interaction protéique entre ces nouveaux peptides et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. Les modulateurs identifiés sur la base de cette méthode sont administrés, aux patients atteints de cancers afin d'induire de la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique chez ces derniers.

Description

NOUVEAUX PEPTIDES INTERAGiSSANT AVEC LES MEMBRES ANTI-APOPTOTIQUES DE LA FAMILLE DE PROTEINES BCL-2
ET UTILISATIONS
La présente invention s'inscrit dans le cadre de la recherche et l'identification de nouveaux peptides interagissant avec les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
L'invention concerne une méthode de criblage et d'identification de modulateurs de l'interaction protéique entre ces nouveaux peptides et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. Les modulateurs isolés par cette méthode de criblage sont utiles pour réguler la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique. Ces modulateurs sont administrés aux patients lors de traitements de cancers.
L'invention a pour objet cinq motifs peptidiques capables d'interagir respectivement avec un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 et leurs utilisations pour induire de la mort cellulaire programmée chez les patients atteints de cancers.
La mort cellulaire programmée est composée, d'une part de l'apoptose et, d'autre part de la mort autophagique. L'apoptose est le phénomène le mieux connu. Ce type de mort cellulaire fait intervenir des changements morphologiques, tels que la condensation du noyau, la fragmentation de l'ADN, ainsi que des phénomènes biochimiques, tels que l'activation des caspases qui vont dégrader des composants structuraux clés de la cellule pour induire son désassemblage et sa mort. La régulation du processus d'apoptose est complexe et implique l'activation ou la répression de plusieurs voies de signalisation intracellulaire.
La mort autophagique est un deuxième mécanisme moins connu de la mort cellulaire programmée. Sur le plan cellulaire, l'autophagie peut se résumer en trois étapes : la formation d'une vacuole autophagique initiale (autophagosome) et la maturation de l'autophagosome en vacuole dégradative puis sa fusion avec le lysosome. La mort autophagique fait donc intervenir des processus de dégradation lysosomale, caractérisés par l'accumulation de vacuoles autophagiques, indépendants d'une voie de régulation de type caspase.
Maintenir une cellule en vie ou programmer sa mort nécessite la régulation d'une voie de signalisation majeure impliquant en particulier les protéines de la famille Bcl-2.
Les protéines de la famille Bcl-2 sont divisées en trois classes principales.
Les protéines anti-apoptotiques, telles que Bcl-2, BCI-XL et BcI-W, présentent une forte homologie au niveau de leurs quatre domaines BH. Les protéines pro-apoptotiques sont divisées en deux catégories, d'une part, les protéines multidomaines telles que BAX et BAK et, d'autre part, les protéines pro-apoptotiques telles que BID, NOXA, PUMA, BIK, BIM et BAD se caractérisant par la présence d'un seul domaine d'homologie, le motif BH3 (Cory and Adams, The Bcl-2 family : regulators of the cellular life-or- death switch Nature reviews vol.2 september 2002).
Le motif BH3 est une région α hélicoïdale amphiphile dont l'identité de séquences est relativement faible dans la famille de protéines BcI-2. En outre, la présence du motif BH3 chez une protéine est requise pour permettre une interaction avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. En effet, l'activité d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est régulée par le produit des gènes pro- apoptotiques de ladite famille, les deux protéines s'assemblant en hétérodimères. Sous cet état le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est inactif et n'a donc plus son activité anti-apoptotique. En outre l'interaction spécifique du motif BH3 avec les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 peut être modifiée par des modulateurs de façon à induire de manière spécifique la mort cellulaire programmée.
L'invention propose donc, de cribler et identifier de nouveaux peptides interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines
Bcl-2 et d'utiliser à ce titre ces nouveaux peptides pour cribler et identifier des molécules capables de modifier ces interactions pour obtenir de réels candidats médicaments efficaces dans les pathologies impliquant des dérégulations de l'apoptose, notamment les cancers.
Le système du double hybride consiste initialement en un test en levure entre deux protéines recombinées. La première protéine, appelée « appât », est une protéine de fusion contenant un domaine de liaison à l'ADN (DNA binding domain ou BD) lié en amont d'une protéine A. La seconde protéine est également une protéine de fusion, communément appelée « proie », contenant un domaine d'activation (activation domain ou
AD) lié à une protéine B. Les domaines de liaison et d'activation couramment utilisés sont ceux de Gal4 ou E. CoIi Lex A. Les protéines A et B sont respectivement un membre anti-apoptotique de Ia famille de protéines Bcl-2 et un motif issu d'une banque ADNc. L'association des protéines A et B par interaction protéique permet la formation, par complémentation, d'un domaine fonctionnel (BD-AD) capable de se lier au site de liaison (binding site ou BS) présent en amont d'un gène rapporteur et d'assurer la transcription dudit gène rapporteur.
Cependant, cette méthode conventionnelle du double hybride a ses limites. II est par exemple bien connu que de tels criblages peuvent conduire à des faux positifs et/ou faux négatifs et des confirmations biochimiques des résultats obtenus sont nécessaires. Les faux positifs obtenus via le système du double hybride sont particulièrement fréquents et sont à l'origine de mise en évidence d'interactions fonctionnelles et non structurelles.
Une technique plus performante, permettant de minimiser les faux positifs et/ou négatifs, est décrite dans la demande de brevet international WO 99/42612 ou le brevet US 6,187,535 et utilise des levures haploïdes recombinantes contenant les polypeptides «appât» et «proie». Ce système permet la détection d'un plus grand nombre de «proies» à partir d'un seul «appât», de façon plus précise, plus reproductible et plus sensible que les autres méthodes conventionnelles utilisées dans le domaine.
Les inventeurs ont établi, sur la base du système du double hybride, l'existence d'une interaction structurelle entre les membres anti- apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 et les peptides suivants de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention. Cette interaction protéique entre ces partenaires est similaire à celle existant dans la régulation du phénomène apoptotique entre les partenaires anti- et pro-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
Des peptides originaux de séquences peptidiques SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5 ont été mis en évidence dans le cadre de l'invention par le système du double hybride. Chacun de ces peptides est capable d'interagir de manière très spécifique avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. En effet, cette spécificité d'interaction est liée à la séquence, la structure tridimensionnelle et/ou l'hélicité dudit peptide sélectionné. De plus, ces peptides correspondent au domaine précis d'interaction avec Bcl-2, BCI-XL et/ou BcI-W et possèdent les critères structuraux typiques permettant la formation d'homo- ou d'hétérodimères. Le motif peptidique suivant NH2- XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX -COOH (SEQ ID NO.6) dans lequel X correspond à tout acide aminé, correspond à une séquence consensus des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention. Cette séquence consensus est similaire à celle des motifs BH3 présents chez les membres pro-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
Enfin, la taille des peptides selon l'invention en font des candidats idéaux pour l'élaboration de tests permettant le criblage hautement efficace de molécules capables de moduler les interactions entre ces peptides et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. On trouve dans la littérature de nombreux tests de criblage de modulateurs d'interactions protéines-protéines mais ils présentent souvent des limites quant à leur sensibilité et leur faisabilité à haut débit. Les méthodes couramment utilisées nécessitent la mise en œuvre d'outils complexes (protéines de fusion, protéines recombinantes...) peu compatibles avec un criblage à haut débit. Elles génèrent le plus souvent un bruit de fond important et sont peu fiables d'un point de vue quantitatif : elles présentent une fenêtre de lecture réduite ne permettant pas un criblage optimal des molécules testées.
De manière alternative aux méthodes déjà disponibles, un test de criblage hautement efficace basé sur la polarisation de fluorescence a été mis en œuvre dans la présente invention (Owicki et al., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306). Cette technique permet par exemple de mesurer l'interaction entre un ligand marqué avec un fluorophore et un récepteur. Le principe consiste à mesurer une augmentation de la polarisation de fluorescence émise par le ligand fixé à son récepteur comparée à celle émise par le ligand libre. La polarisation de fluorescence du ligand libre est dépendante de son poids moléculaire et sera d'autant plus importante que le poids moléculaire sera élevé. Ainsi lorsque ce test est réalisé avec un ligand de haut poids moléculaire, ayant une forte polarisation de fluorescence intrinsèque, il sera difficile d'apprécier de façon fiable la différence de polarisation de fluorescence entre le ligand libre et le ligand fixé. L'utilisation d'un ligand au poids moléculaire minimal permettra au contraire d'exacerber cette différence, et par conséquent d'augmenter la précision de la méthode. Il sera ainsi possible de mieux évaluer la réelle activité d'une molécule, et d'effectuer des criblages à haut débit.
La présente invention a pour objet un peptide interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. Ce peptide comprend les séquences d'acides aminés suivantes : a) MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.1) ; b) VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.2) ; c) RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.3) ; d) DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.4) ; e) VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.5) ; f) XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX (SEQ ID NO.6) ; et les variants fonctionnels de ces séquences d'acides aminés.
Par « séquence d'acides aminés », il doit être compris une séquence peptidique isolée du contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, synthétisées chimiquement et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.
On entend par « variants fonctionnels » les séquences d'acides aminés des peptides décrits supra comprenant des substitutions conservatrices ou des mutations ponctuelles conservatrices et ayant essentiellement les mêmes propriétés que les peptides, respectivement, codés par les séquences SEQ
ID NO.1 à SEQ ID NO.5, soit la capacité d'interagir avec un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2. Les substitutions ou mutations conservatrices des séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID
NO.5 sont, par exemple, les suivantes : glycine par alanine (G-A), valine par leucine (V-L) ; acide aspartique par acide glutamique (D-E), asparagine par glutamine (N-Q), arginine par lysine (R--K), tyrosine par leucine (Y-L), leucine par méthionine (L-M), valine par isoleucine (V-I) et glutamine par histidine (Q-H).
L'invention concerne aussi les séquences d'acides nucléiques codant pour les peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5. Ces séquences nucléotidiques correspondant aux séquences peptidiques SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5 sont respectivement les suivantes : a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.7) ; b) gttatgacccaagaggttggccagctcctgcaagacatgggtgatgatgtataccagcag taccggtcactt (SEQ ID NO.8) ; c) agacttaaacattcctgcctgctggctctgaagagagcagcggatctcctaggacagcgc tcaagctctact (SEQ ID NO.9) ; d) gatatgtgggacactcgtatagccaaactccgagtgtctgctgacagctttgtgagacag caggaggca (SEQ ID NO.10) ; g) gttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcacc aaagaactgctt (SEQ ID NO.11 ).
Ces séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être obtenues d'après le code génétique à partir des séquences d'acides aminés correspondantes et leurs variants.
Les «variants» de ces séquences d'acides nucléiques sont notamment : - des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 ou des séquences complémentaires de celles-ci, et codant des polypeptides ayant respectivement essentiellement les mêmes propriétés que les peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5, ou, - des séquences d'une espèce de mammifère homologues aux séquences SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 isolées chez l'Homme.
Par «conditions stringentes», on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65°C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5 % SDS, 5X
Denhardt's solution et 100 μg d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65°C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1 % SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50 % des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41 (%G+C) + 16,6Log (concentration en cations) - 0,63 (% formamide) - (600 / nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2(A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., CoId Spring Harbor, laboratory press, CoId Spring Harbor, New York).
On entend par « séquences d'une espèce de mammifères homologues aux séquences SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 », des séquences de structure similaires auxdites séquences nucléotidiques et codant respectivement pour des polypeptides ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80 %, de préférence supérieur à 90 %. L'invention concerne également un vecteur recombinant comprenant une des séquences d'acides nucléiques, SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11 telle que revendiquée selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans cette cellule hôte. Un tel vecteur est par exemple un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression des peptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5.
De façon préférée, le vecteur recombinant selon l'invention comprend les séquences nécessaires à l'expression des peptides de séquences SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 dans la cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices de la transcription et de la traduction dans la cellule hôte ainsi que des séquences terminatrices. Le vecteur recombinant peut également comprendre des séquences codant pour des signaux de sécrétions permettant la libération des protéines traduites dans l'environnement extracellulaire.
L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces cellules hôtes sont des cellules bactériennes telles que Escherichia coli, les streptococci par exemple ou des cellules eucaryotes telles que des cellules de levures, de champignons filamenteux, des cellules d'insectes et de préférence des cellules de mammifères.
La transformation de cellules hôtes appropriées par un vecteur recombinant comprenant les séquences d'acides nucléiques selon l'invention permet d'exprimer respectivement les peptides revendiqués SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5. Dans un second temps, il est possible de purifier les peptides exprimés dans ces cellules hôtes à partir de différentes méthodes connues de l'homme du métier et abondamment décrites dans l'état de la technique. Citons par exemple les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium, par chromatographie d'exclusion par la taille et de préférence par chromatographie d'affinité.
Les peptides de séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 et SEQ ID NO.5, peuvent également être synthétisés chimiquement, à façon, par Néosystem. La synthèse chimique des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et de leurs variants fonctionnels est réalisée par synthèse sur support solide selon la stratégie Boc/benzyle à l'aide d'un synthétiseur de peptides « Applied Biosystems 430A ». La synthèse repose sur l'élaboration sur résine de la séquence voulue, puis la déprotection des fonctions aminés N et C- terminales. En stratégie Boc/benzyle, il est nécessaire d'introduire l'acide aminé Boc-L-Lys(Fmoc)-OH lors de la synthèse du peptide. Après avoir élaboré toute la séquence, la fonction amino est déprotégée et le peptide coupé de la résine en présence d'un acide fort.
L'invention porte également sur une composition pharmaceutique comprenant un peptide de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 , SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 ou SEQ ID NO.5 en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Dans le contexte de l'invention, on entend par « excipients » d'une composition pharmaceutique tout agent assurant le transport du principe actif dans les voies internes chez le patient traité. Par « principe actif », on entend toute substance responsable des propriétés pharmacodynamiques ou thérapeutiques de la composition pharmaceutique. Parmi les excipients, non toxiques, pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre indicatif et non limitatif les diluants, les solvants, les conservateurs, les agents mouillants, les émulsifiants, les agents dispersants, les liants, les agents gonflants, les agents désintégrants, les retardants, les lubrifiants, les absorbants, les agents de suspension, les colorants ou les aromatisants.
La présente invention concerne non seulement la composition pharmaceutique considérée en tant que telle et définie supra, mais également l'utilisation de cette composition dans une méthode d'induction de mort cellulaire programmée. Cette méthode d'induction comprend l'administration au patient atteint notamment de cancers d'une quantité efficace de composition pharmaceutique comprenant l'un des peptides selon l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode d'identification de modulateurs de l'interaction entre un peptide selon l'invention et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 comprenant les étapes suivantes :
a) la mise en contact dudit peptide et dudit membre anti-apoptotique de la famille de protéines BcI-2 ; b) l'ajout du composé à tester ; et c) la mesure de l'activité du composé à tester comme modulateur de l'interaction protéique entre le peptide et le membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 puis la comparaison de ladite mesure en l'absence du composé à tester. Avantageusement, la méthode d'identification de modulateurs de l'interaction comprend les étapes suivantes :
a) le marquage fluorescent d'un peptide selon la revendication 1 ; b) l'incubation dudit peptide en présence du composé à tester ; c) l'ajout d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 ; d) la mesure de la polarisation de fluorescence ; e) la comparaison de la mesure avec ou sans le composé à tester.
On entend par « modulateur » tout composé capable d'accroître, d'empêcher ou au moins de limiter une activité spécifique telle qu'une interaction protéine-protéine, une activité enzymatique, une fixation à des récepteurs cellulaires. Selon la présente invention, les modulateurs sont des inhibiteurs ou bien des activateurs de l'interaction protéique entre les partenaires peptidiques de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
L'invention concerne aussi une méthode d'identification d'un inhibiteur de l'interaction entre un des peptides selon l'invention et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable de diminuer la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur.
L'invention porte également sur une méthode d'identification d'un activateur de l'interaction entre un des peptides selon l'invention et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 capable d'augmenter la polarisation de fluorescence par rapport à un témoin consistant en cette interaction en l'absence de modulateur. Le ligand fluorescent, i.e. un des motifs peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 fluorescent, après liaison avec le partenaire anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 a une constante de rotation plus faible que le ligand libre correspondant et de ce fait la fluorescence émise par le ligand lié devient polarisée. En conséquence, on observe une augmentation de la polarisation de la fluorescence émise par le ligand lié versus ligand libre.
Dans un mode de réalisation préférée, la sonde de fluorescence utilisée dans la méthode de criblage et d'identification selon l'invention est le bodipy, l'oregon green et de manière encore préférée la fluorescéine. Plus particulièrement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines
Bcl-2, intervenant comme partenaire de l'interaction dans le processus de criblage et d'identification selon l'invention, peut être la protéine Bcl-2, BCI-XL ou BcI-W.
Avantageusement, le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est une protéine de fusion. Par «protéine de fusion», on entend la fusion entre un domaine de la protéine Bcl-2, Bcl-XL ou BcI-W et un domaine de protéine telle que la GST (Glutathion-S-transferase).
L'invention vise également une composition pharmaceutique comprenant au moins un modulateur, activateur ou inhibiteur, identifié à partir de la méthode d'identification de modulateurs selon l'invention, en tant que principe actif de ladite composition en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
L'invention porte aussi sur une méthode d'induction de mort cellulaire programmée de type apoptotique (caspase dépendante) et/ou autophagique (caspase indépendante) à partir de l'administration d'une quantité efficace de composition définie supra à un patient atteint de cancers. Les compositions pharmaceutiques telles que décrites supra sont utilisables dans le traitement de cancers, par action sur la mort cellulaire programmée de type apoptotique et/ou autophagique.
Les compositions selon l'invention sont sous une forme convenant à l'administration orale, parentérale, nasale, per ou transcutanée, rectale, perlinguale, oculaire ou respiratoire et notamment les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les sachets, les paquets, les gélules, les glossettes, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, et les ampoules buvables ou injectables.
La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les figures et exemples suivants :
- Figure 1 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.1 du peptide Cerd4 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2. - Figure 2 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.2 du peptide Kiaa
1578 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 3 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.3 du peptide Genematch interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 4 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.4 du peptide Loc 51569 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 5 : séquence d'acides aminés SEQ ID NO.5 du peptide Mina53 interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2.
- Figure 6 : Motif consensus SEQ ID NO.6 des séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention. - Figure 7 : détermination de Ki en polarisation de fluorescence des peptides compétiteurs de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention, sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et le membre anti-apoptotique BCI-XL.
- Figure 8 : Tableau récapitulatif des séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 et de leurs séquences d'acides nucléiques respectives SEQ ID NO.7 à SEQ ID NO.11.
EXEMPLE 1 : Identification, par le système du double hybride, des peptides décrits dans les figures 1 à 5
Trois banques de cDNA humains ont été criblées (placenta, cerveau, lignée cellulaire CEMC7) par la technique du double hybride (Fields et al.) chez la levure en utilisant le protocole de conjugaison décrit par Legrain et al. dans Nature Genetics, 1997, vol.16, 277-282 (US 6,187,535).
1) Préparation des « appâts » et « proies »
a) Les « appâts » utilisés sont :
- BCI-XL (numéro d'accession Z23115) délétée de son extrémité C- terminale (1-209) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA ;
- Bcl-2 (numéro d'accession XM_008738) délétée de son extrémité C- terminale (1-211 ) et fusionnée au domaine de liaison à l'ADN LexA. Ces appâts sont exprimés dans les levures Saccharomyces cerevisiae souche L40Δgal4 (MATa ade2, trp1-901 , leu2-3, 112, Iys2-8O1 , his3Δ200, LYS2 (lexAop)4-HIS3, ura3-52 ::URA3 (lexAop)8-LacZ, GAL4 ::KanR) et mis en pré-culture à 300C dans un milieu synthétique dépourvu de tryptophane (DO-Trp) jusqu'à obtention d'une densité optique DO6oonm comprise entre 0,1 et 0,5. Cinquante ml d'une dilution de cette pré-culture (DO6oonm =0,006) sont incubés à 3O0C pendant une nuit. b) Une collection de levures Saccharomyces cerevisiae, souche YHGX13 (MATα Gal4Δ GalδOΔ ade2-101 ::KanR, his3, leu2-3-112, trp1-901 , ura3- 52 URA3 ::UASGAL1-LacZ, Met) contenant les plasmides exprimant les banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription Gal4 est obtenue par transformation après sélection sur un milieu de culture dépourvu en leucine (DO-Leu). Ces levures sont aliquotées et conservées à -800C.
2) Conjugaison
La conjugaison est réalisée avec un ratio « appât »/ « proie » égal à 2. Une quantité de cellules de levures «appâts» obtenues au stade 1 )a) correspondant à 50 unités DOβoonm est mélangée aux levures «proies» obtenues au stade 1 )b). Après centrifugation, le culot est re-suspendu dans un milieu YPGIu, étalé sur des boîtes de culture YPGIu et incubé 4 heures 30 à 300C. La sélection des levures conjuguées contenant un « appât » et une « proie » capables d'interagir ensembles est réalisée sur un milieu DO-
Leu-Trp-His : l'absence de leucine et de tryptophane permet de maintenir une pression de sélection ne permettant qu'aux levures contenant les deux types de plasmides (« appâts »/« proies ») de pousser ; l'absence d'histidine dans Ie milieu permet de sélectionner les levures conjuguées contenant un plasmide « appât » et un plasmide « proie » capables d'interagir ensembles : la complémentation telle que décrite permet d'activer le gène HIS3, en tant que gène rapporteur codant pour une enzyme impliquée dans la biosynthèse de l'histidine.
3) Identification des clones positifs
Les fragments «proies» d'une colonie de levures sélectionnées selon la méthode de conjugaison décrite au paragraphe 2) sont amplifiés par PCR à partir d'un lysat brut de cette colonie, en utilisant des amorces spécifiques du vecteur « proie » :
ABS 1 5'-GCTTTGGAATCACTACAGG-3' (SEQ ID NO.12) ;
ABS2 5'-CACGATGCACGTTGAAGTG-3' (SEQ ID NO.13). Les produits de PCR sont ensuite séquences et les séquences obtenues sont identifiées par comparaison avec des banques de données.
4) Identification des peptides décrits aux figures 1 à 5
Pour chaque fragment «appât» testé, le système du double hybride permet d'identifier plusieurs fragments «proies». Cette identification se fait par comparaison de séquences des « proies » sélectionnées à partir d'un programme informatique tel que Blastwun disponible sur le site internet de l'Université de Washington : http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/blastwu.html.
EXEMPLE 2 : Validation de l'interaction entre les peptides obtenus dans l'exemple 1 et Bcl-2, BcI-Xi et/ou BcI-W
1 ) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence
La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet des peptides compétiteurs de séquences d'acides aminés respectives SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que BCI-XL.
Les réactifs suivants sont mélangés dans l'ordre précisé :
- du peptide compétiteur à une concentration finale de 1nM à 100 μM ; - du peptide ligand fluorescent (Bak BH3 carboxyfluoresceine) à une concentration finale de 15 nM ;
- du membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 à une concentration finale de 100 nM pour BCI-XL.
Ces réactifs sont en solution dans le tampon d'interaction (Na2HPO4 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, NaCI 50 mM et acide pluronique F-68 0.05%). Le mélange est ensuite incubé 30 minutes à température ambiante et la polarisation de fluorescence déterminée sur l'appareil Fusion (Packard) (excitation à 485 nm et lecture à 530 nm). Les valeurs sont données en mP (unité de polarisation de fluorescence).
Ces analyses en polarisation de fluorescence ont mis en évidence que les peptides de séquences d'acides aminés SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 sont des peptides compétiteurs de l'interaction peptidique entre Bak et BCI-XL. Les Ki obtenus au cours de ces tests en polarisation de fluorescence sont les suivants :
BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.1 Ki = 9 μM
BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.2 Ki = 32 μM
BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.3 Ki = 1 μM
BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.4 Ki = 8 μM BCI-XL/ Bak / SEQ ID NO.5 Ki = 20 μM
2) Détermination de Ki en polarisation de fluorescence avec les motifs peptidiques respectivement mutés (L-A)
La détermination de Ki en polarisation de fluorescence consiste à mesurer l'effet compétitif des peptides SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 mutés, de leucine en alanine (L-A), sur l'interaction entre le peptide pro-apoptotique BAK les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que Bcl-XL. Les séquences peptidiques SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 mutées (L-A) sont les suivantes :
MATVIHNPAKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.14) ;
VMTQEVGQLAQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.15); RLKHSCLLAAKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.16);
DMWDTRIAKARVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.17);
VATRRLSGFARTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.18).
Le protocole de détermination de Ki en polarisation de fluorescence est identique au protocole décrit supra. On observe, par comparaison des résultats d'analyses en polarisation de fluorescence, une perte d'effet compétitif des peptides mutés (L-A) SEQ ID NO.14 à SEQ ID NO.18 par rapport aux peptides SEQ ID NO.1 à SEQ ID NO.5 selon l'invention dans l'interaction peptidique entre le peptide pro- apoptotique Bak et les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2 tel que Bcl-XL.
EXEMPLE 3 : Test de criblage de molécules capables d'inhiber l'interaction entre Bcl-2 et/ou BcI-Xi et les peptides obtenus dans l'Exemple 1
Les produits à tester sont distribués dans des plaques 384 puits (Corning Fiat Bottom) à une concentration finale de 10 μg/ml. Un puits est rempli avec une quantité équivalente de tampon/solvant sans composé à tester et constituera le témoin. Les peptides obtenus dans l'Exemple 1 marqués à la fluorescéine sont ajoutés dans les puits de manière à obtenir une concentration finale allant de 1 à 100 nM. La protéine de fusion GST-BCI-XL ou GST-Bcl-2 ou encore GST-BcI-W est ensuite ajoutée de façon à obtenir une concentration finale de 0,1 à 1 μM dans un tampon contenant
Na2HPO4 20 mM pH 7,4, de l'EDTA 1 mM, NaCI 50 mM, de l'acide pluronique F-68 0,05%. La polarisation de fluorescence est ensuite mesurée par l'appareil En Vision (Packard Perkin-Elmer). Une diminution significative de la polarisation de fluorescence enregistrée dans l'essai réalisé avec le composé à tester comparée à celle obtenue sans le composé à tester (puits témoin) permet de conclure à une activité inhibitrice de la molécule. A l'inverse, une augmentation significative de la polarisation de fluorescence dans l'essai avec le produit à tester comparée au témoin permet de conclure à une activité activatrice de la molécule.

Claims

REVENDICATIONS
1. Peptide interagissant avec les membres anti-apoptotiques de la famille de protéines Bcl-2, caractérisé en qu'il comprend les séquences d'acides aminés suivantes : a) MATVIHNPLKALGDQFYKEAIEHC (SEQ ID NO.1 ) ; b) VMTQEVGQLLQDMGDDVYQQYRSL (SEQ ID NO.2) ; c) RLKHSCLLALKRAADLLGQRSSST (SEQ ID NO.3) ; d) DMWDTRIAKLRVSADSFVRQQEA (SEQ ID NO.4) ; e) VATRRLSGFLRTLADRLEGTKELL (SEQ ID NO.5) ; f) XXXXXXXXLXXXXDXXXXXXXXXX (SEQ ID NO.6) ; et les variants fonctionnels desdites séquences d'acides aminés.
2. Séquence d'acides nucléiques codant pour un peptide selon la revendication 1.
3. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle comprend les séquences nucléotidiques suivantes :
a) atggcgactgtcattcacaaccccctgaaagcgctcggggaccagttctacaaggaa gccattgagcactgc (SEQ ID NO.7); b) gttatgacccaagaggttggccagctcctgcaagacatgggtgatgatgtataccagcag taccggtcactt (SEQ ID NO.8); c) agacttaaacattcctgcctgctggctctgaagagagcagcggatctcctaggacagcgc tcaagctctact (SEQ ID NO.9); d) gatatgtgggacactcgtatagccaaactccgagtgtctgctgacagctttgtgagacag caggaggca (SEQ ID NO.10); e) gttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcacc aaagaactgctt (SEQ ID NO.11).
4. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une des séquences d'acides nucléiques selon l'une des revendications 2 ou 3.
5. Vecteur recombinant selon la revendication 4, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide, un cosmide, un chromosome bactérien artificiel ou un bactériophage comprenant les séquences nécessaires à l'expression d'un peptide selon la revendication 1.
6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression d'un peptide selon la revendication 1 comprennent une séquence promotrice de la transcription et de la traduction.
7. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 4 à 6.
8. Cellule hôte selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule bactérienne ou eucaryote.
9. Composition pharmaceutique comprenant un peptide selon la revendication 1 , en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
10. Méthode d'induction de la mort cellulaire programmée comprenant l'administration au patient atteint de cancers d'une quantité efficace de composition pharmaceutique selon la revendication 9.
11. Méthode d'identification de modulateurs de l'interaction entre un peptide selon la revendication 1 et un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2, caractérisé en qu'elle comprend les étapes suivantes : a) la mise en contact dudit peptide et dudit membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 ; b) l'ajout du composé à tester ; et c) la mesure de l'activité du composé à tester comme modulateur de l'interaction protéique entre le peptide et le membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 puis la comparaison de ladite mesure en l'absence du composé à tester.
12. Méthode d'identification de modulateurs de l'interaction selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) le marquage fluorescent d'un peptide selon la revendication 1 ; b) l'incubation dudit peptide en présence du composé à tester ; c) l'ajout d'un membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 ; d) la mesure de la polarisation de fluorescence ; e) la comparaison de la mesure avec ou sans le composé à tester.
13. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le peptide et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est un activateur augmentant la polarisation de fluorescence.
14. Méthode selon la revendication 12, caractérisée en ce que le modulateur de l'interaction entre le peptide et un membre anti- apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est un inhibiteur diminuant la polarisation de fluorescence.
15. Méthode selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que la sonde de fluorescence est la fluorescéine.
16. Méthode selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce que le membre anti-apoptotique de la famille de protéines Bcl-2 est la protéine Bcl-2, Bcl-XL ou BcI-W.
17. Composition pharmaceutique comprenant un modulateur obtenu à partir de la méthode d'identification de modulateurs selon l'une des revendications 11 à 16, en tant que principe actif en combinaison avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
18. Méthode d'induction de la mort cellulaire programmée comprenant l'administration au patient atteint de cancers d'une quantité efficace de composition pharmaceutique selon la revendication 17.
19. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 9 ou 17 utilisables dans le traitement de cancers.
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