EP1828136A1 - (5s)-3-[(s)-fluor(4-trifluoromethylphenyl)methyl]-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-5-ol derivate und ihre verwendung als cetp-inhibitoren - Google Patents

(5s)-3-[(s)-fluor(4-trifluoromethylphenyl)methyl]-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-5-ol derivate und ihre verwendung als cetp-inhibitoren

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EP1828136A1
EP1828136A1 EP05815944A EP05815944A EP1828136A1 EP 1828136 A1 EP1828136 A1 EP 1828136A1 EP 05815944 A EP05815944 A EP 05815944A EP 05815944 A EP05815944 A EP 05815944A EP 1828136 A1 EP1828136 A1 EP 1828136A1
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EP
European Patent Office
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compound
formula
salts
solvates
cetp
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05815944A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hilmar Bischoff
Heike Gielen-Haertwig
Volkhart Li
Carsten Schmeck
Michael Thutewohl
Martina Wuttke
Alexandros Vakalopoulos
Olaf Weber
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Bayer Pharma AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
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Publication date
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    • C07D215/02—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen atoms or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present application relates to a novel tetrahydroquinoline derivative, a process for its preparation, its use alone or in combinations for the treatment and / or prevention of diseases and its use for the production of medicaments, in particular as an inhibitor of cholesterol ester transfer.
  • Protein (CETP) for the treatment and / or prevention of cardiovascular diseases, in particular hypolipoproteinemias, dyslipidaemias, hypertriglyceridemias, hyperlipidemias, hypercholesterolemias and arteriosclerosis.
  • HDL high-density lipoprotein
  • LDL low-density lipoprotein
  • VLDL very low-density lipoprotein
  • High LDL cholesterol levels (> 160 mg / dl) and low HDL cholesterol levels ( ⁇ 40 mg / dl) contribute significantly to the development of arteriosclerosis [ATP III Guidelines, Report of the NCEP Expert Panel].
  • peripheral vascular disease and stroke are also promoted by unfavorable HDL / LDL ratios.
  • New methods for increasing HDL cholesterol in plasma therefore represent a therapeutically useful enrichment in the prevention and treatment of arteriosclerosis and the associated diseases.
  • CETP Cholesterol ester transfer protein
  • Tetrahydroquinolines with pharmacological activity are known from EP-A-818 448, WO 99/14215, WO 99/15504 and WO 03/028727.
  • Substituted tetrahydronaphthalenes with pharmacological activity are known from WO 99/14174.
  • the object of the present invention is to provide new substances for the control of diseases, in particular of cardiovascular diseases, which have an improved therapeutic profile.
  • the present invention relates to the compounds of structural formula (I)
  • R 1 is cyclohexyl or cyclopentyl
  • R 2 and R 3 are each methyl or together form a cyclobutane
  • R 4 is cyclopentyl or iso-propyl
  • the present invention is in particular the compound having the systematic name (J'5) -4 l-cyclohexyl-2'-cyclopentyl-3 '- ⁇ (5) -fluoro [4- (trifluoromethyl) phenyl] methyl ⁇ -5' , 8 1 -dihydro- ⁇ 'H-spiro-cyclopropane-1- j- T'-quinoline-S-ol and the structural formula (Ia)
  • the present invention also relates, in particular, to the compound having the systematic name (J'iS 1 -Z '1'-dicyclopentyl-S'-KSJ-fluoro-1'-trifluoromethylphenyl-methyl) -S''-dihydro-1'H-spiro-cyclopropane.
  • J'iS 1 -Z '1'-dicyclopentyl-S'-KSJ-fluoro-1'-trifluoromethylphenyl-methyl -S''-dihydro-1'H-spiro-cyclopropane.
  • the subject matter of the present invention is also the compound having the systematic name (C 1 -C 4) -dicyclopentyl-S-KSJ-fluoro-3-trifluoromethyl-phenylmethyl-J-dimethyl-S, n, delta-tetrahydroquinolin-5-ol and the structural formula id)
  • the subject of the present invention is in particular also the compound with the systematic name (5S) -4-cyclohexyl-3- ⁇ (5) -fluoro [4- (trifluoromethyl) phenyl] methyl ⁇ -2-isopropyl-7,7-dimethyl- 5,6,7,8-tetrahydroquinoline-5-ol and the structural formula (Ie)
  • novel compounds of the formulas (Ia) - (Ie) are referred to below in the singular as the compound of the formula (I) according to the invention.
  • the compound according to the invention can also be present in other stereoisomeric forms (enantiomers, diastereomers).
  • the present invention includes all enantiomers, diastereomers and their respective mixtures. From such mixtures of enantiomers and / or diastereomers, the stereoisomerically uniform components can be isolated in a known manner.
  • the S configuration given in formula (I) is at C-5 'and at C-3'a.
  • Salts used in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compound according to the invention. Also included are salts which are not suitable for pharmaceutical applications themselves, but can be used, for example, for the isolation or purification of the compound according to the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compound of the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g. Salts of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, methanesulfonic, ethanesulfonic, toluenesulfonic, benzenesulfonic, naphthalenedisulfonic, acetic, trifluoroacetic, propionic, lactic, tartaric, malic, citric, fumaric, maleic and benzoic acids.
  • Salts of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, methanesulfonic, ethanesulfonic, toluenesulfonic, benzenesulfonic, naphthalenedisulfonic acetic, trifluoroacetic, propionic, lactic, tartaric, malic, citric, fumaric, maleic and benzoic acids.
  • Physiologically acceptable salts of the compound according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from Ammonia or organic amines having 1 to 16 carbon atoms, such as, by way of example and by way of preference, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, arginine, lysine, ethylenediamine and N-methylpiperidine.
  • customary bases such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts
  • Solvates in the context of the invention are those forms of the compound according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water. As solvates, hydrates are preferred in the context of the present invention.
  • the present invention also includes prodrugs of the compound of the invention.
  • prodrugs encompasses compounds which may themselves be biologically active or inactive, but are only converted during their residence time in the body to the compound according to the invention (for example metabolically or hydrolytically).
  • Q-Q1-Alkyl in the context of the invention represents a straight-chain or branched alkyl radical having 1 to 4 carbon atoms, by way of example and preferably: methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec. Butyl and tert-butyl.
  • the invention further provides a process for the preparation of the compound of the formula (I) according to the invention in which R 1 , R 2 , R 3 and R 4 each have the meanings given above and which is illustrated by way of example for the compound of the formula (Ia) , characterized in that the compound of the formula (II),
  • PG is a hydroxy-protecting group, preferably a radical of the formula -SiR 1 R 2 R 3 , wherein
  • R 1 , R 2 and R 3 are identical or different and denote (C 1 -C 4 ) -alkyl
  • the compound of the formula (II) can be prepared by reacting the compounds of the formulas (VIII), (IX) and (X)
  • the compound of the formula (IX) can be obtained by acid-catalyzed Wittig reaction of a cyclopropanone acetal with 1- (triphenylphosphoranylidene) acetone to give 1-cyclopropylideneacetone and subsequent reaction with a malonic acid diester (see Scheme 1, see WO 03/028727 and I. Kortmann, B. Westermann, Synthesis 1995, 931-933).
  • Suitable inert solvents for the individual process steps are, for example, ethers, such as diethyl ether, diisopropyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether or diethylene glycol dimethyl ether, hydrocarbons, such as benzene, toluene, xylene, hexane, cyclohexane or petroleum fractions, or halogenated hydrocarbons, such as dichloromethane, trichloromethane, carbon tetrachloride, 2-dichloroethane, trichlorethylene or chlorobenzene suitable. It is also possible to use mixtures of the solvents mentioned.
  • ethers such as diethyl ether, diisopropyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether or diethylene glycol dimethyl ether
  • hydrocarbons such as benzene, toluene, xy
  • reducing agents which are suitable for the reduction of ketones to hydroxy compounds.
  • reducing agents include in particular complex aluminum or borohydrides for example, lithium, sodium, potassium, zinc borohydride, lithium aluminum hydride, diisobutylaluminum hydride (DIBAH), sodium bis (2-methoxyethoxy) aluminum dihydride, lithium tri-alkyl borohydrides or lithium trialkoxyaluminium hydrides, or borane complexes such as borane-tetrahydrofuran. , Borane-dimethylsulfide or borane-N, N-diethylaniline complex.
  • the asymmetric reduction in process step (D) -> (DI) takes place in the presence of catalytic amounts (0.01 to 0.3 molar equivalents) of enantiomerically pure (/ R, 2S) -1-aminoindan-2-ol as chiral inductor.
  • the reducing agent used here is preferably borane-N, N-diethylaniline complex.
  • the reaction is generally carried out in one of the ethers listed above or in toluene, preferably in tetrahydrofuran, in a temperature range of -80 0 C to +50 0 C, preferably from 0 0 C to +30 0 C is performed.
  • diisobutylaluminum hydride (DIBAH) is preferably used as the reducing agent.
  • the reactions are generally carried out in one of the ethers listed above or in toluene, preferably in tetrahydrofuran or toluene, in a temperature range of -80 0 C to + 5O 0 C, preferably from -60 0 C to +30 0 C is performed.
  • the introduction of the silyl group is generally carried out in one of the abovementioned hydrocarbons, halogenated hydrocarbons, ethers or in dimethylformamide as solvent in the presence of a base such as triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, pyridine, 2,6-lutidine or 4-N, N-dimethylaminopyridine ( DMAP).
  • a base such as triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, pyridine, 2,6-lutidine or 4-N, N-dimethylaminopyridine ( DMAP).
  • tert-butyldimethylsilyl trifluoromethanesulfonate is preferably used as silylating reagent in combination with 2,6-lutidine as base.
  • the reaction is preferably conducted in dichloromethane or toluene in a temperature range of -40 0 C to +40 0 C, preferably from -20 0 C to 3O 0 C is performed.
  • tert-butyldimethylsilyl chloride as the silylating reagent in combination with triethylamine and DMAP as bases.
  • the reaction is preferably in dimethylformamide in a temperature range of 0 0 C to +100 0 C, preferably +20 0 C to +80 0 C is performed.
  • the fluorination in process step (VI) -> (VII) is generally carried out in one of the abovementioned hydrocarbons or halogenated hydrocarbons or in acetonitrile, preferably in toluene or dichloromethane, with diethylaminosulfur trifluoride (DAST) or morpholino- Sulfur trifluoride performed as Fluorier ⁇ ngsreagenz.
  • the reaction is generally carried out in a temperature range of -80 0 C to +40 0 C, preferably from -60 0 C to +20 0 C.
  • the removal of a silyl protecting group in process step (VII) -> (I) is generally carried out with the aid of acids, such as hydrochloric acid or trifluoroacetic acid, or with the aid of fluorides, such as hydrogen fluoride or tetrabutylammonium fluoride (TBAF).
  • Suitable inert solvents are the ethers listed above, alcohols such as methanol or ethanol, or mixtures of the solvents mentioned. Preference is given to cleavage with TBAF in tetrahydrofuran as solvent.
  • the reaction is generally carried out in a temperature range of -20 0 C to +60 0 C, preferably from 0 0 C to +30 0 C.
  • the condensation reaction (Vi ⁇ ) + (DC) + (X) ⁇ (XI) is generally carried out in one of the abovementioned ethers, in alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol or isopropanol, in acetonitrile or in mixtures of the solvents mentioned carried out. Preference is given to using diisopropyl ether.
  • Suitable proton acids for this process step are generally organic acids, such as, for example, acetic acid, trifluoroacetic acid, oxalic acid or para-toluenesulfonic acid, or inorganic acids, such as, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid. Also suitable are Lewis acids such as aluminum chloride or zinc chloride. Preference is given to trifluoroacetic acid.
  • the reaction is generally carried out in a temperature range of 0 0 C to +120 0 C, preferably +20 0 C to +80 0 C.
  • the oxidation (dehydrogenation) in process step (XI) -> (U) is generally carried out in one of the abovementioned halogenated hydrocarbons or, if appropriate, in alcohols such as methanol or ethanol, in acetonitrile or in water.
  • Suitable oxidizing agents are, for example, nitric acid, cerium (rV) ammonium nitrate, 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ), pyridinium chlorochromate (PCC), osmium tetroxide, manganese dioxide or catalytic dehydrogenation by means of platinum dioxide or Palladium on activated carbon. Preference is given to oxidation with DDQ in dichloromethane as solvent.
  • the oxidation is generally carried out in a temperature range of -50 0 C to +100 0 C, preferably from 0 0 C to +40 0 C.
  • tBu /er/.-Butyl
  • DAST dimethylaminosulfur trifluoride
  • DDQ 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone
  • DIBAH diisobutylaluminum hydride
  • Et ethyl
  • Me methyl
  • Ph phenyl
  • p-TsOH para-toluenesulfonic acid
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • TBDMSOTf tert-butyldimethylsilyltrifluoromethanesulfonate
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the compound of the invention shows an unpredictable, valuable spectrum of pharmacological activity. It is therefore suitable for use as a medicament active ingredient for the treatment and / or prophylaxis of diseases in humans and animals.
  • the compound according to the invention opens up a further treatment alternative and represents an enrichment of the pharmaceutical industry. In comparison to the known and hitherto used preparations, the compound according to the invention exhibits an improved spectrum of activity.
  • It is preferably characterized by high specificity, good tolerability and lower side effects as well as lower toxicity, in particular in the cardiovascular area and in the area of the liver.
  • An advantage of the compound according to the invention is its high activity in human plasma.
  • a further advantage of the compound according to the invention is a reduced potential for interaction with metabolizing enzymes, in particular with the cytochrome P450 enzymes and in particular with the cytochrome P450 3A4 enzyme.
  • the compound of the invention also shows a reduced deposition behavior in adipose tissue.
  • the compound of the formula (I) according to the invention has valuable pharmacological properties and can be used for the prevention and treatment of diseases.
  • the compound of the invention is a potent inhibitor of cholesterol ester transfer protein (CETP) and stimulates reverse cholesterol transport. It causes an increase in the HDL cholesterol level in the blood.
  • CETP cholesterol ester transfer protein
  • the compound of the invention is particularly useful for the treatment and primary or secondary prevention of coronary heart disease, e.g. of myocardial infarction, can be used.
  • the compound of the invention may also be used for the treatment and prevention of arteriosclerosis, restenosis, strokes and Alzheimer's disease.
  • the compound of the invention may also be used for the treatment and prevention of hypolipoproteinemias, dyslipidemias, hypertriglyceridemias, hyperlipidemia, hypercholesterolemias, obesity, obesity, pancreatitis, insulin-dependent and non-insulin-dependent diabetes, diabetic sequelae, such as retinopathy, nephropathy and neuropathy, combined hyperlipidaemias and the metabolic syndrome.
  • the pharmacological activity of the compound according to the invention can be determined by means of the CETP inhibition tests listed below.
  • Another object of the present invention is the use of the compound of the invention for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • Another object of the present invention is the use of the compound of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • Another object of the present invention is a method for the treatment and / or prevention of diseases, in particular the aforementioned diseases, using an effective amount of the compound of the invention.
  • compositions containing the compound of the invention and one or more other active ingredients for the treatment and / or prevention of diseases are by way of example and preferably mentioned:
  • the compound of the formula (1) according to the invention may preferably contain one or more
  • Antithrombotic agents by way of example and preferably from the group of platelet aggregation inhibitors or anticoagulants,
  • the blood pressure-lowering active ingredients by way of example and preferably from the group of calcium antagonists, angiotensin Aü antagonists, ACE inhibitors, beta-blockers, phosphodiesterase inhibitors, stimulators of soluble guanylate cyclase, cGMP enhancers and diuretics, and / or
  • the fat metabolism-altering agents by way of example and preferably from the group of thyroid receptor agonists, cholesterol synthesis inhibitors such as HMG-CoA reductase inhibitors, squalene synthase inhibitors, squalene epoxidase inhibitors or oxidosqualene cyclase inhibitors, the ACAT inhibitors , MTP inhibitors, PPAR agonists, fibrates, Lipase inhibitors, cholesterol absorption inhibitors, bile acid reabsorption inhibitors, polymeric bile acid adsorbers and the lipoprotein (a) antagonists
  • cholesterol synthesis inhibitors such as HMG-CoA reductase inhibitors, squalene synthase inhibitors, squalene epoxidase inhibitors or oxidosqualene cyclase inhibitors
  • the ACAT inhibitors MTP inhibitors
  • PPAR agonists oxidosqualene cyclase inhibitors
  • fibrates Lipa
  • Antidiabetics are understood by way of example and preferably as meaning insulin and insulin derivatives, as well as orally active hypoglycemic agents.
  • Insulin and insulin derivatives here include both insulins of animal, human or biotechnological origin as well as mixtures thereof.
  • the orally active hypoglycemic agents include, by way of example and by way of illustration, sulfonylureas, biguadins, meglitinide derivatives, oxadiazolidinones, thiazolidinediones, glucosidase inhibitors, glucagon antagonists, GLP-1 agonists, insulin sensitizers, inhibitors of liver enzymes that are active in the art Stimulation of gluconeogenesis and / or glycogenolysis are involved, modulators of glucose uptake and potassium channel opener, such as those disclosed in WO 97/26265 and WO 99/03861.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with insulin.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a sulphonylurea, such as by way of example and preferably tolbutamide, glibenclamide, glimepiride, glipizide or gliclazide.
  • a sulphonylurea such as by way of example and preferably tolbutamide, glibenclamide, glimepiride, glipizide or gliclazide.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a biguanide, such as by way of example and preferably metformin.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a meglitinide derivative, such as by way of example and preferably repaglinide or nateglinide.
  • a meglitinide derivative such as by way of example and preferably repaglinide or nateglinide.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a PPARgamma agonist, for example from the class of thiazolidinediones, by way of example and preferably pioglitazone or rosiglitazone.
  • a PPARgamma agonist for example from the class of thiazolidinediones, by way of example and preferably pioglitazone or rosiglitazone.
  • the compound of formula (I) is used in combination with a mixed PPARalpha / gamma agonist such as exemplified and preferably GI-262570 (Farglitazar), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847 , MK-0767 (KRP-297) or AZ-242.
  • Antithrombotic agents are preferably understood as meaning compounds from the group of platelet aggregation inhibitors, such as, for example and preferably, aspirin, clopidogrel, ticlopidine or dipyridamole, or anticoagulants.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a thrombin inhibitor such as, by way of example and by way of preference, ximelagatran, melagatran, bivalirudin or Clexane.
  • a thrombin inhibitor such as, by way of example and by way of preference, ximelagatran, melagatran, bivalirudin or Clexane.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a GPUb / IIIa antagonist, by way of example and with preference tirofiban or abciximab.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a factor Xa inhibitor, as exemplified and preferably DX 9065a, DPC 906, JTV 803 or BAY 59-7939.
  • a factor Xa inhibitor as exemplified and preferably DX 9065a, DPC 906, JTV 803 or BAY 59-7939.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with heparin or a low molecular weight (LMW) heparin derivative.
  • LMW low molecular weight
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a vitamin K antagonist, such as by way of example and preferably coumarin.
  • antihypertensive agents are, by way of example and by way of preference, compounds from the group of calcium antagonists, such as, for example, the compounds nifedipine, amlodipine, nitrendipine, nisoldipine, verapamil or diltiazem, the angiotensin AU antagonists, ACE inhibitors, Blocker and diuretics understood.
  • compounds from the group of calcium antagonists such as, for example, the compounds nifedipine, amlodipine, nitrendipine, nisoldipine, verapamil or diltiazem, the angiotensin AU antagonists, ACE inhibitors, Blocker and diuretics understood.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an antagonist of the alpha 1 receptors.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with reserpine, minoxidil, diazoxide, dihydralazine, hydralazine and nitric oxide-releasing substances, such as by way of example and preferably glycerol nitrate or nitroprusside sodium.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an angiotensin Aü antagonist, such as by way of example and preferably losartan, valsartan, candesartan, telmisartan, embusartan, irbesartan, olmesartan, tasosartan or saprisartan.
  • an ACE inhibitor such as, for example and preferably, enalapril, captopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinopril, perindopril or trandolapril.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a beta-blocker such as, by way of example and by way of preference, propranolol or atenolol.
  • a beta-blocker such as, by way of example and by way of preference, propranolol or atenolol.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a diuretic, such as by way of example and preferably furosemide.
  • lipid metabolizing agents are exemplified and preferably compounds from the group of thyroid receptor agonists, cholesterol synthesis inhibitors such as HMG-CoA reductase inhibitors or squalene synthesis inhibitors, ACAT inhibitors, MTP inhibitors, PPAR agonists, Fibrates, cholesterol absorption inhibitors, bile acid reabsorption inhibitors, lipase inhibitors, polymeric Benklareadsorber and the lipoproteins antagonists understood.
  • cholesterol synthesis inhibitors such as HMG-CoA reductase inhibitors or squalene synthesis inhibitors
  • ACAT inhibitors such as HMG-CoA reductase inhibitors or squalene synthesis inhibitors
  • MTP inhibitors such as MTP inhibitors, PPAR agonists, Fibrates, cholesterol absorption inhibitors, bile acid reabsorption inhibitors, lipase inhibitors, polymeric Benklareadsorber and the lipoproteins antagonists understood.
  • PPAR agonists such as
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a thyroid receptor agonist such as, by way of example and by way of preference, D-thyroxine, 3,5,3'-triiodothyronine (T3), CGS 23425 or axitirome (CGS 26214). administered.
  • a thyroid receptor agonist such as, by way of example and by way of preference, D-thyroxine, 3,5,3'-triiodothyronine (T3), CGS 23425 or axitirome (CGS 26214). administered.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a squalene synthesis inhibitor such as, for example and preferably, BMS-188494 or TAK 475.
  • a squalene synthesis inhibitor such as, for example and preferably, BMS-188494 or TAK 475.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an ACAT inhibitor, such as by way of example and preferably avasimibe, eflucimibe or CS-505.
  • an ACAT inhibitor such as by way of example and preferably avasimibe, eflucimibe or CS-505.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a cholesterol absorption inhibitor, such as by way of example and preferably ezetimibe, tiqueside or pamaqueside.
  • a cholesterol absorption inhibitor such as by way of example and preferably ezetimibe, tiqueside or pamaqueside.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a bile acid reabsorption inhibitor such as by way of example and preferably barixibate, AZD 7508, SC 435, SC 635, S-8921, 264W94 or HM 1453.
  • a bile acid reabsorption inhibitor such as by way of example and preferably barixibate, AZD 7508, SC 435, SC 635, S-8921, 264W94 or HM 1453.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an MTP inhibitor, by way of example and preferably implitapide, BMS-201038 or R-103757.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a PPARalpha agonist, e.g. the fibrates fenofibrate, clofibrate, bezafibrate, ciprofibrate or gemfibrozil or as exemplarily and preferably GW 9578, GW 7647, LY-518674 or NS-220.
  • a PPARalpha agonist e.g. the fibrates fenofibrate, clofibrate, bezafibrate, ciprofibrate or gemfibrozil or as exemplarily and preferably GW 9578, GW 7647, LY-518674 or NS-220.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a PPARdelta agonist such as, for example and preferably, GW 501516.
  • the compound of formula (I) is used in combination with a mixed PPARalpha / gamma agonist such as exemplified and preferably GI-262570 (Farglitazar), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847 , MK-0767 (KRP-297) or AZ-242.
  • a mixed PPARalpha / gamma agonist such as exemplified and preferably GI-262570 (Farglitazar), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847 , MK-0767 (KRP-297) or AZ-242.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a mixed PPARalpha / gamma / delta agonist such as, by way of example and by way of preference MCC-555.
  • the compound of formula (I) in combination with a lipase inhibitor from the group of endothelial lipase inhibitors, pancreatic lipase inhibitors, gastric lipase inhibitors, hormone-sensitive lipase inhibitors or the hepatic lipase inhibitors administered.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an inhibitor of pancreatic lipase, preferably from the class of lipstins such as, for example, orlistat.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with a polymeric bile acid adsorbent such as, by way of example and by way of preference, cholestyramine, colestipol, colesolvam, cholesta gel or colestimide.
  • a polymeric bile acid adsorbent such as, by way of example and by way of preference, cholestyramine, colestipol, colesolvam, cholesta gel or colestimide.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with a lipoprotein (a) antagonist, such as by way of example and with preference gemabenbene calcium (CI-1027) or nicotinic acid.
  • a lipoprotein (a) antagonist such as by way of example and with preference gemabenbene calcium (CI-1027) or nicotinic acid.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an antagonist of the niacin receptor, such as by way of example and preferably Niaspan, Acipimox or Niceritrol.
  • the compound of formula (I) is administered in combination with an antioxidant such as, by way of example and by way of preference probucol, AGI 1067 or Bo 653.
  • the compound of the formula (I) is administered in combination with an LDL receptor inducer, such as, for example, Lif ⁇ brol.
  • the compound of the formula (I) is combined with an HMG-CoA reductase inhibitor from the class of statins, such as, for example and preferably, lovastatin, simvastatin, pravastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, cerivastatin or pitavastatin.
  • statins such as, for example and preferably, lovastatin, simvastatin, pravastatin, fluvastatin, atorvastatin, rosuvastatin, cerivastatin or pitavastatin.
  • Another object of the present invention are combinations of the compound of formula (I) with substances that cause a reduction in HMG-CoA reductase gene expression.
  • substances may be, for example, inhibitors of HMG-CoA reductase transcription or HMG-CoA reductase translation.
  • Inhibition of HMG-CoA reductase gene expression can be caused, for example, by inhibition of the SlP (site I) protease or by lowering the SREBP (sterol receptor binding protein) levels.
  • Another object of the present invention are combinations of the compound of formula (I) with substances which have anti-inflammatory and / or the atherosclerotic plaque stabilizing effect.
  • substances may be, for example, agents from the class of NSAIDs, PAF-AH antagonists or chemokine receptor antagonists such as, for example, IL-8 receptor antagonists or MCP-1 antagonists.
  • the active compound combinations according to the invention have valuable pharmacological properties and can be used for the prevention and treatment of diseases.
  • the active compound combinations according to the invention can be used in particular for the treatment and for the primary or secondary prevention of coronary heart diseases, for example of myocardial infarction. They can also be used to treat and prevent atherosclerosis, restenosis, strokes and Alzheimer's disease.
  • the named combinations of active substances may also be used for the treatment and prevention of hypolipoproteinemias, dyslipidaemias, hypertriglyceridemias, hyperlipidemias, hypercholesterolemias, obesity (adipositas), obesity, pancreatitis, insulin-dependent and non-insulin-dependent Diabetes, diabetic sequelae such as retinopathy, nephropathy and neuropathy, combined hyperlipidaemias and the metabolic syndrome.
  • the active compound combinations according to the invention are suitable for the treatment of hypertension, cardiac insufficiency, angina pectoris, ischaemias and inflammatory diseases.
  • Another object of the present invention are pharmaceutical compositions containing the compound of the invention, usually together with one or more inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients, and their use for the purposes mentioned above.
  • Parenteral administration can be accomplished by bypassing a resorption step (e.g., intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinal, or intralumbar) or by resorting to absorption (e.g., intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously, or intraperitoneally).
  • a resorption step e.g., intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinal, or intralumbar
  • absorption e.g., intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously, or intraperitoneally.
  • parenteral administration are suitable as application forms u.a. Injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates or sterile powders.
  • inhalation medicaments including powder inhalers, nebulizers
  • nasal drops solutions or sprays
  • lingual, sublingual or buccal tablets to be applied films / wafers or capsules, suppositories, ear or eye preparations, vaginal capsules , aqueous suspensions (lotions, shake mixtures), lipophilic Suspensions, ointments, creams, transdermal therapeutic systems (eg patches), milk, pastes, foams, powdered powders, implants or stents.
  • Emulsifiers and dispersing or wetting agents for example sodium dodecyl sulfate, polyoxy sorbitan oleate
  • binders for example polyvinylpyrrolidone
  • synthetic and natural polymers for example albumin
  • stabilizers for example antioxidants such as ascorbic acid
  • dyes for example inorganic pigments such as, for example Iron oxides
  • flavor and / or smell corrigents for example sodium dodecyl sulfate, polyoxy sorbitan oleate
  • binders for example polyvinylpyrrolidone
  • synthetic and natural polymers for example albumin
  • stabilizers for example antioxidants such as ascorbic acid
  • dyes for example inorganic pigments such as, for example Iron oxides
  • flavor and / or smell corrigents for example sodium dodecyl sulfate, polyoxy sorbitan oleate
  • binders for example polyvinylpyrrolidone
  • synthetic and natural polymers
  • a pH of 1-2 is set with half-concentrated hydrochloric acid (foaming) and stirring is continued for 15 minutes.
  • the methanol is removed at a bath temperature of 55 ° C on a rotary evaporator until a pressure of 60 mbar is reached.
  • the contents of the flask are extracted twice with ethyl acetate, the organic phases are combined, dried and concentrated in vacuo.
  • the resulting oil is dissolved in dichloromethane concentrated and chromatographed on silica gel (eluent: dichloromethane / methanol 95: 5).
  • the product fractions are concentrated and the remaining oil is then stirred in diethyl ether.
  • the resulting solid is filtered off with suction and dried under high vacuum at room temperature.
  • the enantiomeric excess is determined to be 71% ee.
  • CETP is recovered from human plasma by differential centrifugation and column chromatography in partially purified form and used for testing.
  • human plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.21 g per ml and centrifuged for 18 h at 50,000 rpm and 4 0 C.
  • the bottom fraction (d> 1.21 g / ml) is applied to a Sephadex ® phenyl-Sepharose 4B column (Fa. Pharmacia) eluted with 0.15M NaCl / 0.001 M trisHCl pH 7.4 and then washed with distilled water.
  • the CETP-active fractions are pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate pH 4.5 and applied to a CM-Sepharose ® column (Fa. Pharmacia). With a linear gradient (0-1 M NaCl) is then eluted.
  • the pooled CETP fractions are dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and then by chromatography on a Mono Q ® - further purified column (from Pharmacia.).
  • the acceptor liposomes are obtained analogously from 86 mg of cholesteryl oleate, 20 mg of triolein and 100 mg phosphatidylcholine, 1.2 ml of dioxane and 114 ml of the above buffer, recovered minute 30 by ultrasonication at 50 watts (2O 0 C).
  • test mix consisting of 1 part of the above buffer, 1 part of donor liposomes and 2 parts of acceptor liposomes is used. 50 .mu.l of test mixture are mixed with 48 .mu.l enriched CETP fraction (1-3 ug), obtained via hydrophobic chromatography from human plasma, and 2 .mu.l of a solution of the substance to be examined in DMSO and incubated at 37 ° C for 4 h.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the change in fluorescence at 510/520 nm is a measure of the CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • test mix 80 .mu.l of test mix are treated with 10 ul of buffer and 2 ul serum and incubated for 4 h at 37 0 C.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the batch is then adjusted to density 1.21 with NaBr and 18 h in the Ty 65 rotor
  • the retentate contains radioactively labeled 3 H-CE-HDL which is used for testing at approximately 5 x 10 6 cmp per ml.
  • the activity transferred in the control mixtures with CETP at 37 ° C is rated as 100% transmission.
  • the substance concentration at which this transfer is reduced by half is given as the IC 50 value.
  • the substances are administered orally by gavage to self-bred transgenic hCETP mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)].
  • each mouse is sampled for the determination of its basal CETP activity in serum by puncture of the retroorbital venous plexus (time T 1).
  • the animals are then given the test substance by gavage.
  • the animals are bled a second time (time T2), usually 16 or 24 hours after substance administration; if necessary, this can also be done at a different time.
  • an appropriate control group is used for each time point, ie 16 or 24 hours, whose animals only receive the formulating agent without substance.
  • the two blood withdrawals per animal are the same as for the substance-treated animals in order to be able to determine the change in CETP activity without inhibitor over the corresponding experimental period (16 or 24 h).
  • the blood samples are centrifuged at the end of the coagulation and the serum is pipetted off.
  • the cholesteryl ester transport over 4 h is determined.
  • usually 2 ul serum are used in the test batch; the test becomes as under B-I.2.3. described carried out.
  • cholesteryl ester transport [pM CE / h (T2) -pM CE / h (Tl)] are calculated for each animal and averaged in the groups. A substance that reduces> 20% cholesteryl ester transport at any one time is considered to be effective.
  • triglycerides total cholesterol, HDL cholesterol and LDL cholesterol is carried out with the aid of the COBAS INTEGRA 400 plus analyzer (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • transgenic mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] are administered gavage.
  • BBA lipoproteins and triglycerides
  • mice 4 0 C overnight and subsequent centrifugation at 6,000 g recovered. After three days, the mice are bled again to re-assay lipoproteins and triglycerides. The changes in the measured parameters are expressed as a percentage change over the
  • the compound according to the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • the compound according to the invention is dissolved in a concentration below the saturation solubility in a physiologically tolerated solvent (eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%).
  • a physiologically tolerated solvent eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%.
  • the solution is sterile filtered and filled into sterile and pyrogen-free injection containers.
  • a pH of 1-2 is set with half-concentrated hydrochloric acid (foaming) and stirring is continued for 15 minutes.
  • the methanol is removed at a bath temperature of 55 ° C on a rotary evaporator until a pressure of 60 mbar is reached.
  • the contents of the flask are extracted twice with ethyl acetate, the organic phases are combined, dried and concentrated in vacuo.
  • the resulting oil is dissolved in dichloromethane concentrated and chromatographed on silica gel (eluent: dichloromethane / methanol 95: 5).
  • the product fractions are concentrated and the remaining oil is then stirred in diethyl ether.
  • the resulting solid is filtered off with suction and dried under high vacuum at room temperature.
  • Example 5A Under argon, the compound of Example 5A and 1.99 g (18.61 mmol) of 2,6-dimethylpyridine in 20 ml of absolute toluene are 2.25 g (4.65 mmol) and cooled to -20 0 C. At this temperature, a solution of 2.46 g (9.31 mmol) trifluoromethanesulfonic acid tert-butyldimethylsilyl ester in 5 ml of absolute toluene is added dropwise, then stirred for 15 min at -20 ° C, then heated to 0 0 C and 1 h at this temperature further stirred. The mixture is mixed with 75 ml of 0.1 N hydrochloric acid and extracted several times with ethyl acetate.
  • CETP is recovered from human plasma by differential centrifugation and column chromatography in partially purified form and used for testing.
  • human plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.21 g per ml and centrifuged for 18 h at 50,000 rpm and 4 ° C.
  • the bottom fraction (d> 1.21 g / ml) is applied to a Sephadex ® phenyl-Sepharose 4B column (Fa. Pharmacia) eluted with 0.15M NaCl / 0.001 M trisHCl pH 7.4 and then washed with distilled water.
  • the CETP-active fractions are pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate pH 4.5 and applied to a CM-Sepharose ® column (Fa. Pharmacia). With a linear gradient (0-1 M NaCl) is then eluted.
  • the pooled CETP fractions are dialyzed against 10 mM TrisHCl pH 7.4 and then further purified by chromatography on a Mono Q * column (Pharmacia).
  • cholesteryl 4,4-difluoro-5,7-dirnethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoate (cholesteryl BODIPY ® FL Cn, Fa. Molecular Probes) with 5.35 mg of triolein and 6.67 mg of phosphatidylcholine in an ultrasonic bath with gentle heating in 600 .mu.l of dioxane and this solution was added very slowly under ultrasonication to 63 ml of 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA buffer pH 7.3 at room temperature. The suspension is then sonicated under N 2 atmosphere for 30 min in Branson ultrasonic bath at about 50 watts, the temperature is maintained at about 20 0 C.
  • the acceptor liposomes are obtained analogously from 86 mg of cholesteryl oleate, 20 mg of triolein and 100 mg of phosphatidylcholine dissolved in 1.2 ml of dioxane and 1 14 ml of the above buffer, recovered minute 30 by ultrasonication at 50 watts (20 0 C).
  • test mix consisting of 1 part of the above buffer, 1 part of donor liposomes and 2 parts of acceptor liposomes is used. 50 .mu.l of test mixture are mixed with 48 .mu.l enriched CETP fraction (1-3 ug), obtained via hydrophobic chromatography from human plasma, and 2 .mu.l of a solution of the substance to be examined in DMSO and incubated at 37 ° C for 4 h.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the change in fluorescence at 510/520 nm is a measure of the CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • test mix 80 ⁇ l of test mix are mixed with 10 ⁇ l buffer and 2 ⁇ l serum and incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the batch is then adjusted to density 1.21 with NaBr and 18 h in the Ty 65 rotor
  • SPA-streptavidin-bead solution (TRKQ 7005) are added, incubated further for 1 h with shaking and then measured in the scintillation counter.
  • the controls are incubations with 10 ⁇ l buffer, 10 ⁇ l CETP at 4 ° C and 10 ⁇ l CETP at 37 ° C.
  • the activity transferred in the control mixtures with CETP at 37 ° C. is rated as 100% transmission.
  • the substance concentration at which this transfer is reduced by half is given as the IC 50 value.
  • the substances are administered orally by gavage to self-bred transgenic hCETP mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)].
  • each mouse is sampled by puncturing the retroorbital venous plexus to determine its basal CETP activity in the serum (time T1).
  • the animals are then given the test substance by gavage.
  • the animals are bled a second time (time T2), m usually 16 or 24 hours after substance aphcation; if necessary, this can also be done at a different time.
  • an appropriate control group is used for each time point, ie 16 or 24 hours, whose animals receive only the formulation without substance.
  • the two blood withdrawals per animal are the same as for the substance-treated animals in order to be able to determine the change in CETP activity without inhibitor over the corresponding experimental period (16 or 24 h).
  • the blood samples are zent ⁇ fugiert after completion of the Ge ⁇ nnung and the serum is pipetted off.
  • the cholesteryl ester transport over 4 h is determined.
  • usually 2 ul serum are used in the test batch; the test becomes as under B-I.2.3. described carried out.
  • cholesteryl ester transport [pM CE / h (T2) -pM CE / h (Tl)] are calculated for each animal and averaged in the groups. A substance that reduces> 20% cholesteryl ester transport at any one time is considered to be effective.
  • transgenic mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] are administered gavage.
  • BBA lipoproteins and triglycerides
  • mice are bled again to re-assay lipoproteins and triglycerides.
  • the changes in the measured parameters are expressed as a percentage change over the
  • the compound according to the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • the mixture of compound of the invention, lactose and starch is granulated with a 5% solution (m / m) of the PVP in water.
  • the granules are mixed after drying with the magnesium stearate for 5 minutes.
  • This mixture is compressed with a conventional tablet press (for the tablet format see above).
  • a pressing force of 15 kN is used as a guideline for the compression.
  • Method 2 Instrument: HP 1 100 with DAD Detection; Column: Kromasil RP-18, 60 mm ⁇ 2 mm, 3.5 ⁇ m; Eluent A: 5 ml HCIO 4 / l water, eluent B: acetonitrile; Gradient: 0 min 2% B ⁇ 0.5 min 2% B ⁇ 4.5 min 90% B ⁇ 9 min 90% B; Flow: 0.75 ml / min; Temperature: 30 ° C .; UV detection: 210 nm.
  • Method 3 (LC / MS): Device Type MS: Micromass ZQ; Device type HPLC: HP 1 100 Series; UV DAD; Column: Phenomenex Synergi 2 ⁇ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 l of water + 0.5 ml of 50% formic acid, eluent B: 1 l of acetonitrile + 0.5 ml of 50% formic acid; Gradient: 0.0 min 90% A ⁇ 2.5 min 30% A ⁇ 3.0 min 5% A ⁇ 4.5 min 5% A; Flow: 0.0 min 1 ml / min ⁇ 2.5 min / 3.0 min / 4.5 min 2 ml / min; Oven: 50 ° C .; UV detection: 210 nm.
  • the enantiomeric excess is determined by method 1 to 94.0% ee.
  • CETP is recovered from human plasma by differential centrifugation and column chromatography in partially purified form and used for testing.
  • human plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.21 g per ml and centrifuged for 18 h at 50,000 rpm and 4 ° C.
  • the bottom fraction (d> 1.21 g / ml) is applied to a Sephadex ® phenyl-Sepharose 4B column (Fa. Pharmacia) eluted with 0.15M NaCl / 0.001 M trisHCl pH 7.4 and then washed with distilled water.
  • the CETP-active fractions are pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate pH 4.5 and applied to a CM-Sepharose ® column (Fa. Pharmacia). With a linear gradient (0-1 M NaCl) is then eluted.
  • the pooled CETP fractions are dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and then by chromatography on a Mono Q ® - further purified column (from Pharmacia.).
  • cholesteryl 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoate (cholesteryl BODIPY ® FL C 12, Fa. Molecular Probes ) with 5.35 mg of triolein and 6.67 mg of phosphatidylcholine in an ultrasonic bath with gentle heating in 600 .mu.l of dioxane and this solution was added very slowly under ultrasonication to 63 ml of 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA buffer pH 7.3 at room temperature. The suspension is then sonicated under N 2 atmosphere for 30 min in Branson ultrasonic bath at about 50 watts, the temperature is maintained at about 20 0 C.
  • the acceptor liposomes are obtained analogously from 86 mg of cholesteryl oleate, 20 mg of triolein and 100 mg phosphatidylcholine, 1.2 ml of dioxane and 114 ml of the above buffer, recovered minute 30 by ultrasonication at 50 watts (20 0 C).
  • test mix consisting of 1 part of the above buffer, 1 part of donor liposomes and 2 parts of acceptor liposomes is used. 50 .mu.l of test mixture are mixed with 48 .mu.l enriched CETP fraction (1-3 ug), obtained via hydrophobic chromatography from human plasma, and 2 .mu.l of a solution of the substance to be examined in DMSO and incubated at 37 ° C for 4 h.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the change in fluorescence at 510/520 nm is a measure of the CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • test mix 80 ⁇ l of test mix are mixed with 10 ⁇ l buffer and 2 ⁇ l serum and incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • 50 ml of fresh human EDTA plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.12 and centrifuged at 4 0 C in a Ty 65 rotor for 18 h at 50,000 rpm.
  • the upper phase is used to recover cold LDL.
  • the lower phase is added to 3 x 4 liters of PDB buffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN 3 ).
  • 20 ⁇ l of 3 H-cholesterol (Dupont NET-725, 1 ⁇ C / ⁇ l dissolved in ethanol) are then added per 10 ml of retentate volume and incubated at 37 ° C. under N 2 for 72 h.
  • the batch is then adjusted to the density 1.21 using NaBr and centrifuged Ty 65 rotor 18 h at 50,000 rpm and 20 0 C.
  • the upper phase is recovered and the lipoprotein fractions are purified by gradient centrifugation.
  • the isolated, labeled lipoprotein fraction is adjusted to a density of 1.26 with NaBr. 4 ml each of this solution are placed in centrifuge tubes (SW 40 rotor) with 4 ml of a solution of density 1.21 and 4.5 ml of a solution of density
  • Coated 1.063 (density solutions of PDB buffer and NaBr) and then centrifuged for 24 h at 38,000 rpm and 20 0 C in SW 40 rotor.
  • the intermediate layer containing the labeled HDL between density 1.063 and 1.21 is dialysed against 3 x 100 volumes of PDB buffer at 4 ° C.
  • the retentate contains radioactively labeled 3 H-CE-HDL which is used for testing at approximately 5 x 10 6 cmp per ml.
  • SPA-streptavidin-bead solution (TRKQ 7005) are added, incubated for 1 h with shaking and then measured in the scintillation counter.
  • the controls are incubations with 10 ⁇ l buffer, 10 ⁇ l CETP at 4 ° C and 10 ⁇ l CETP at 37 ° C.
  • the activity transferred in the control mixtures with CETP at 37 ° C. is rated as 100% transmission.
  • the substance concentration at which this transfer is reduced by half is given as the IC 50 value.
  • the substances are administered orally by gavage to self-bred transgenic hCETP mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)].
  • each mouse is sampled for the determination of its basal CETP activity in serum by puncture of the retroorbital venous plexus (time T 1).
  • the animals are then given the test substance by gavage.
  • the animals are bled a second time (time T2), usually 16 or 24 hours after substance administration; if necessary, this can also be done at a different time.
  • an appropriate control group is used for each time point, ie 16 or 24 hours, whose animals receive only the formulation without substance.
  • the two blood withdrawals per animal are the same as for the substance-treated animals in order to be able to determine the change in CETP activity without inhibitor over the corresponding experimental period (16 or 24 h).
  • the blood samples are centrifuged at the end of the coagulation and the serum is pipetted off.
  • the cholesteryl ester transport over 4 h is determined.
  • usually 2 ul serum are used in the test batch; the test becomes as under B-I.2.3. described carried out.
  • cholesteryl ester transport [pM CE / h (T2) -pM CE / h (Tl)] are calculated for each animal and averaged in the groups. A substance that reduces> 20% cholesteryl ester transport at any one time is considered to be effective.
  • triglycerides total cholesterol, HDL cholesterol and LDL cholesterol is carried out with the aid of the COBAS INTEGRA 400 plus analyzer (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • transgenic mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] are administered gavage.
  • BBA lipoproteins and triglycerides
  • mice are bled again to re-assay lipoproteins and triglycerides.
  • the changes in the measured parameters are expressed as a percentage change over the
  • the compound according to the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • the mixture of compound of the invention, lactose and starch is granulated with a 5% solution (m / m) of the PVP in water.
  • the granules are mixed after drying with the magnesium stearate for 5 minutes.
  • This mixture is compressed with a conventional tablet press (for the tablet format see above).
  • a pressing force of 15 kN is used as a guideline for the compression.
  • a single dose of 100 mg of the compound of the invention corresponds to 10 ml of oral suspension.
  • the rhodigel is suspended in ethanol, the compound according to the invention is added to the suspension. While stirring, the addition of water. Until the completion of the swelling of Rhodigels is stirred for about 6 h.
  • the compound of the invention is suspended in the mixture of polyethylene glycol and polysorbate with stirring. The stirring is continued until complete dissolution of the compound according to the invention.
  • the compound according to the invention is dissolved in a concentration below the saturation solubility in a physiologically tolerated solvent (eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%).
  • a physiologically tolerated solvent eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%.
  • the solution is sterile filtered and filled into sterile and pyrogen-free injection containers.
  • Method IA Column: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: isohexane / 1-propanol 97: 3; Flow: 1.0 ml / min; UV detection: 254 nm.
  • Method IB column: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 ⁇ m; Eluent: isohexane / 1-propanol 97.5: 2.5; Flow: 1.0 ml / min; UV detection: 254 nm.
  • Method 3 (LC / MS): Device Type MS: Micromass ZQ; Device type HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Column: Phenomenex Synergi 2 ⁇ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 l of water + 0.5 ml of 50% formic acid, eluent B: 1 l of acetonitrile + 0.5 ml of 50% formic acid; Gradient: 0.0 min 90% A ⁇ 2.5 min 30% A ⁇ 3.0 min 5% A ⁇ 4.5 min 5% A; Flow: 0.0 min 1 ml / min ⁇ 2.5 min / 3.0 min / 4.5 min 2 ml / min; Oven: 50 ° C .; UV detection: 210 nm.
  • the product fraction thus obtained is taken up with a little diisopropyl ether and stirred at room temperature for 16 h.
  • the resulting precipitate is filtered off, washed with cold diisopropyl ether and freed of solvent residues in a high vacuum.
  • the residue is partitioned between 150 ml of water and 150 ml of ethyl acetate.
  • the aqueous phase is extracted twice with 100 ml of ethyl acetate.
  • the combined organic phases are washed with 50 ml of saturated sodium chloride solution, dried over sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo.
  • the crude product is then purified by chromatography (silica gel, eluent: isohexane / ethyl acetate 100: 0, then 4: 1).
  • the enantiomeric excess is determined by method IA to 93.5% ee.
  • saturated ammonium chloride solution (100 ml) is added and the mixture, after warming to room temperature, extracted with ethyl acetate.
  • the aqueous phase is extracted twice more with ethyl acetate, the combined organic phases are washed with saturated sodium chloride solution, dried on sodium sulfate, filtered and concentrated in vacuo.
  • the residue is purified by chromatography (silica gel, eluent: isohexane / ethyl acetate 9: 1).
  • 0.59 ml of diethylaminosulfur trifluoride (4.4 mmol, 1.5 eq.) are added dropwise at -17 ° C. under argon to a solution of 1.78 g (3.0 mmol) of the compound from Example 5A in 29 ml of dry dichloromethane. It is cooled to -66 ° C and then heated again to 0 0 C with stirring within 6 h. The reaction solution is cooled again to -78 ° C and treated with another 0.25 ml diethylaminosulfur trifluoride (1.9 mmol, 0.64 eq.). Thereafter, the mixture is heated to 10 0 C with stirring within 16 h.
  • CETP is recovered from human plasma by differential centrifugation and column chromatography in partially purified form and used for testing.
  • human plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.21 g per ml and centrifuged for 18 h at 50,000 rpm and 4 ° C.
  • the bottom fraction (d> 1.21 g / ml) is applied to a Sephadex ® phenyl-Sepharose 4B column (Fa. Pharmacia) eluted with 0.15M NaCl / 0.001 M trisHCl pH 7.4 and then washed with distilled water.
  • the CETP-active fractions are pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate pH 4.5 and applied to a CM-Sepharose ® column (Fa. Pharmacia). With a linear gradient (0-1 M NaCl) is then eluted.
  • the pooled CETP fractions are dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and then by chromatography on a Mono Q ® - further purified column (from Pharmacia.).
  • cholesteryl 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoate (cholesteryl BODIPY ® FL Ci 2, Fa. Molecular Probes ) with 5.35 mg of triolein and 6.67 mg of phosphatidylcholine in an ultrasonic bath with gentle heating in 600 .mu.l of dioxane and this solution was added very slowly under ultrasonication to 63 ml of 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA buffer pH 7.3 at room temperature. The suspension is then sonicated under N 2 atmosphere for 30 min in Branson ultrasonic bath at about 50 watts, the temperature is maintained at about 2O 0 C.
  • the acceptor liposomes are obtained analogously from 86 mg of cholesteryl oleate, 20 mg of triolein and 100 mg phosphatidylcholine, 1.2 ml of dioxane and 114 ml of the above buffer, recovered minute 30 by ultrasonication at 50 watts (20 0 C).
  • test mix consisting of 1 part of the above buffer, 1 part of donor liposomes and 2 parts of acceptor liposomes is used. 50 .mu.l of the test mixture are mixed with 48 .mu.l of enriched CETP fraction (1-3 .mu.g), obtained by hydrophobatic chromatography from human plasma, and 2 .mu.l of a solution of the substance to be examined in DMSO and incubated for 4 h at 37.degree.
  • enriched CETP fraction 1-3 .mu.g
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the change in fluorescence at 510/520 nm is a measure of the CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • test mix 80 ⁇ l of test mix are mixed with 10 ⁇ l buffer and 2 ⁇ l serum and incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • 50 ml of fresh human EDTA plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.12 and centrifuged at 4 0 C in a Ty 65 rotor for 18 h at 50,000 rpm.
  • the upper phase is used to recover cold LDL.
  • the lower phase is added to 3 x 4 liters of PDB buffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN 3 ).
  • 20 ⁇ l of 3 H-cholesterol (Dupont NET-725, 1 ⁇ C / ⁇ l dissolved in ethanol) are then added per 10 ml of retentate volume and incubated at 37 ° C. under N 2 for 72 h.
  • the batch is then adjusted to the density 1.21 using NaBr and in the Ty 65 -rotor 18 h centrifuged at 50,000 rpm and 20 0 C.
  • the upper phase is recovered and the lipoprotein fractions are purified by gradient centrifugation.
  • the isolated, labeled lipoprotein fraction is adjusted to a density of 1.26 with NaBr. 4 ml each of this solution are placed in centrifuge tubes (SW 40 rotor) with 4 ml of a solution of density 1.21 and 4.5 ml of a solution of density
  • Coated 1.063 (density solutions of PDB buffer and NaBr) and then centrifuged for 24 h at 38,000 rpm and 20 0 C in SW 40 rotor.
  • the intermediate layer containing the labeled HDL between density 1.063 and 1.21 is dialysed against 3 x 100 volumes of PDB buffer at 4 ° C.
  • the retentate contains radioactively labeled 3 H-CE-HDL which is used for testing at approximately 5 x 10 6 cmp per ml.
  • SPA-streptavidin-bead solution (TRKQ 7005) are added, incubated for 1 h with shaking and then measured in the scintillation counter.
  • the controls used are appropriate incubations with 10 ⁇ l buffer, 10 ⁇ l CETP at 4 ° C. and 10 ⁇ l CETP at 37 ° C.
  • the activity transferred in the control mixtures with CETP at 37 ° C is rated as 100% transmission.
  • the substance concentration at which this transfer is reduced by half is given as the IC 50 value.
  • the substances are administered orally by gavage to self-bred transgenic hCETP mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)].
  • each mouse is sampled for the determination of its basal CETP activity in serum by puncture of the retroorbital venous plexus (time T 1).
  • the animals are then given the test substance by gavage.
  • the animals are bled a second time (time T2), usually 16 or 24 hours after substance administration; if necessary, this can also be done at a different time.
  • an appropriate control group is used for each time point, ie 16 or 24 hours, whose animals receive only the formulation without substance.
  • the two blood withdrawals per animal are the same as for the substance-treated animals in order to be able to determine the change in CETP activity without inhibitor over the corresponding experimental period (16 or 24 h).
  • the blood samples are centrifuged at the end of the coagulation and the serum is pipetted off.
  • the cholesteryl ester transport over 4 h is determined.
  • usually 2 ul serum are used in the test batch; the test becomes as under B-1.2.3. described carried out.
  • cholesteryl ester transport [pM CE / h (T2) -pM CE / h (Tl)] are calculated for each animal and averaged in the groups. A substance that reduces> 20% cholesteryl ester transport at any one time is considered to be effective.
  • CETP inhibitors To determine the oral effect of CETP inhibitors on serum lipoproteins and triglycerides, 150-200 g of female Syrian golden hamsters of their own breed (strain BAYrDSN) are used. The animals are grouped in groups of six per cage and acclimatized for two weeks with food and water ad libitum.
  • triglycerides total cholesterol, HDL cholesterol and LDL cholesterol is carried out with the aid of the COBAS INTEGRA 400 plus analyzer (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • transgenic mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] are administered gavage.
  • BBA lipoproteins and triglycerides
  • mice are bled again to re-assay lipoproteins and triglycerides.
  • the changes in the measured parameters are expressed as a percentage change over the
  • the compound of the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • the mixture of compound of the invention, lactose and starch is granulated with a 5% solution (m / m) of the PVP in water.
  • the granules are mixed after drying with the magnesium stearate for 5 minutes.
  • This mixture is compressed with a conventional tablet press (for the tablet format see above).
  • a pressing force of 15 kN is used as a guideline for the compression.
  • a single dose of 100 mg of the compound according to the invention corresponds to 10 ml of oral suspension.
  • the rhodigel is suspended in ethanol, the compound according to the invention is added to the suspension. While stirring, the addition of water. Until the swelling of the Rhodigels swirling is about 6 h stirred.
  • Orally administrable solution :
  • the compound of the invention is suspended in the mixture of polyethylene glycol and polysorbate with stirring. The stirring is continued until complete dissolution of the erf ⁇ ndungswashen connection.
  • the compound according to the invention is dissolved in a concentration below the saturation solubility in a physiologically tolerated solvent (eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%).
  • a physiologically tolerated solvent eg isotonic saline solution, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%.
  • the solution is sterile filtered and filled into sterile and pyrogen-free injection containers.
  • Method IA Column: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: isohexane / 1 -propanol 97: 3; Flow: 1.0 ml / min; UV detection: 254 nm.
  • Method IB column: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 ⁇ m; Eluent: isohexane / isopropanol 97.5: 2.5; Flow: 1.0 ml / min; UV detection: 254 nm.
  • Method IC Column: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 ⁇ m; Eluent: isohexane / isopropanol 97.5: 2.5; Flow: 1.5 ml / min; UV detection: 254 nm.
  • Method 2 Instrument: HP 1100 with DAD Detection; Column: Kromasil RP-18, 60 mm ⁇ 2 mm, 3.5 ⁇ m; Eluent A: 5 ml HC1O 4/1 water, eluent B: acetonitrile; Gradient: 0 min 2% B ⁇ 0.5 min 2% B -> 4.5 min 90% B ⁇ 9 min 90% B; Flow: 0.75 ml / min; Temperature: 30 ° C .; UV detection: 210 nm.
  • Method 3 (LC / MS): Device Type MS: Micromass ZQ; Device type HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Column: Phenomenex Synergi 2 ⁇ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 l of water + 0.5 ml of 50% formic acid, eluent B: 1 l of acetonitrile + 0.5 ml of 50% formic acid; Gradient: 0.0 min 90% A ⁇ 2.5 min 30% A ⁇ 3.0 min 5% A ⁇ 4.5 min 5% A; Flow: 0.0 min 1 ml / min ⁇ 2.5 min / 3.0 min / 4.5 min 2 ml / min; Oven: 50 ° C .; UV detection: 210 nm.
  • the mixture is then refluxed for 18 h on a water separator. After cooling, the mixture is stirred for 30 min in an ice bath, the precipitate obtained is filtered off with suction, washed with cold diisopropyl ether and freed of solvent residues in a high vacuum.
  • the enantiomeric excess is determined according to method IA to 88% ee.
  • CETP is recovered from human plasma by differential centrifugation and column chromatography in partially purified form and used for testing.
  • human plasma is adjusted with NaBr to a density of 1.21 g per ml and centrifuged for 18 h at 50,000 rpm and 4 ° C.
  • the bottom fraction (d> 1.21 g / ml) is applied to a Sephadex ® phenyl-Sepharose 4B column (Fa. Pharmacia) eluted with 0.15M NaCl / 0.001 M trisHCl pH 7.4 and then washed with distilled water.
  • the CETP-active fractions are pooled, dialyzed against 50 mM sodium acetate pH 4.5 and applied to a CM-Sepharose ® column (Fa. Pharmacia). With a linear gradient (0-1 M NaCl) is then eluted.
  • the pooled CETP fractions are dialysed against 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and then by chromatography on a Mono Q ® - further purified column (from Pharmacia.).
  • cholesteryl 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoate (cholesteryl BODIPY ® FL C n, Molecular Fa. Probes ) with 5.35 mg of triolein and 6.67 mg of phosphatidylcholine in an ultrasonic bath with gentle heating in 600 .mu.l of dioxane and this solution was added very slowly under ultrasonication to 63 ml of 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA buffer pH 7.3 at room temperature. The suspension is then sonicated under N 2 atmosphere for 30 min in Branson ultrasonic bath at about 50 watts, the temperature is maintained at about 20 0 C.
  • the acceptor liposomes are obtained analogously from 86 mg of cholesteryl oleate, 20 mg of triolein and 100 mg phosphatidylcholine, 1.2 ml of dioxane and 114 ml of the above buffer, recovered minute 30 by ultrasonication at 50 watts (20 0 C).
  • test mix consisting of 1 part of the above buffer, 1 part of donor liposomes and 2 parts of acceptor liposomes is used. 50 .mu.l of test mixture are mixed with 48 .mu.l enriched CETP fraction (1-3 ug), obtained via hydrophobic chromatography from human plasma, and 2 .mu.l of a solution of the substance to be examined in DMSO and incubated at 37 ° C for 4 h.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the change in fluorescence at 510/520 nm is a measure of the CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • test mix 80 ⁇ l of test mix are mixed with 10 ⁇ l buffer and 2 ⁇ l serum and incubated for 4 h at 37 ° C.
  • the change in fluorescence at 485/535 nm is a measure of CE transfer; the inhibition of the transfer compared to the control batch without substance is determined.
  • the batch is then adjusted to density 1.21 with NaBr and 18 h in the Ty 65 rotor
  • the retentate contains radioactively labeled 3 H-CE-HDL which is used for testing at approximately 5 x 10 6 cmp per ml.
  • SPA-streptavidin-bead solution (TRKQ 7005) are added, incubated further for 1 h with shaking and then measured in the scintillation counter.
  • the controls are incubations with 10 ⁇ l buffer, 10 ⁇ l CETP at 4 ° C and 10 ⁇ l CETP at 37 ° C.
  • the activity transferred in the control mixtures with CETP at 37 ° C is rated as 100% transmission.
  • the substance concentration at which this transfer is reduced by half is given as the IC 50 value.
  • the substances are administered orally by gavage to self-bred transgenic hCETP mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)].
  • each mouse is sampled for the determination of its basal CETP activity in serum by puncture of the retroorbital venous plexus (time T 1).
  • the animals are then given the test substance by gavage.
  • the animals are bled a second time (time T2), usually 16 or 24 hours after substance administration; if necessary, this can also be done at a different time.
  • an appropriate control group is used for each time point, ie 16 or 24 hours, whose animals only receive the formulating agent without substance.
  • the two blood withdrawals per animal are the same as for the substance-treated animals in order to be able to determine the change in CETP activity without inhibitor over the corresponding experimental period (16 or 24 h).
  • the blood samples are centrifuged at the end of the coagulation and the serum is pipetted off.
  • the cholesteryl ester transport over 4 h is determined.
  • usually 2 ul serum are used in the test batch; the test becomes as under B-I.2.3. described carried out.
  • cholesteryl ester transport [pM CE / h (T2) -pM CE / h (Tl)] are calculated for each animal and averaged in the groups. A substance that reduces> 20% cholesteryl ester transport at any one time is considered to be effective.
  • triglycerides total cholesterol, HDL cholesterol and LDL cholesterol is carried out with the aid of the COBAS INTEGRA 400 plus analyzer (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • transgenic mice [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] are administered gavage.
  • BBA lipoproteins and triglycerides
  • mice are bled again to re-assay lipoproteins and triglycerides.
  • the changes in the measured parameters are expressed as a percentage change over the
  • the compound of the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • the mixture of compound of the invention, lactose and starch is granulated with a 5% solution (m / m) of the PVP in water.
  • the granules are mixed after drying with the magnesium stearate for 5 minutes.
  • This mixture is compressed with a conventional tablet press (for the tablet format see above).
  • a pressing force of 15 kN is used as a guideline for the compression.
  • a single dose of 100 mg of the compound of the invention corresponds to 10 ml of oral suspension.
  • the rhodigel is suspended in ethanol, the compound according to the invention is added to the suspension. While stirring, the addition of water. Until the completion of the swelling of Rhodigels is stirred for about 6 h.
  • the compound of the invention is suspended in the mixture of polyethylene glycol and polysorbate with stirring. The stirring is continued until complete dissolution of the compound according to the invention.
  • the compound of the invention is dissolved at a concentration below saturation solubility in a physiologically acceptable solvent (e.g., isotonic saline, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%).
  • a physiologically acceptable solvent e.g., isotonic saline, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%.
  • the solution is sterile filtered and filled into sterile and pyrogen-free injection containers.

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Tetrahydrochinolin-Derivate der formel (I), in denen R<SUP>1</SUP> für Cyclohexyl oder Cyclopentyl, R<SUP>2</SUP> und R<SUP>3</SUP> jeweils für Methyl stehen oder gemeinsam einen Cyclobutan bilden, R<SUP>4</SUP> für Cyclopentyl oder iso-Propyl steht, sowie ihre Salze, Solvate and Solvate der Salze, ein Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung allein oder in Kombinationen zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten sowie seine Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere als Inhibitor des Cholesterin-Ester-Transfer-Proteins (CETP) zur Behandlung und/oder Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, insbesondere von Hypolipoproteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hypercholesterolämien und Arteriosklerose.

Description

( 5S) - 3 - [ ( S ) - FLUOR (4 -TRIFLUOROMETHYLPHENYD METHYL] - 5 , 6 , 7 , 8 - TETRAHYDROCHINOLIN- 5 - O L DERIVATE UND IHRE VERWENDUNG ALS CETP- INHIBITOREN
Die vorliegende Anmeldung betrifft ein neues Tetrahydrochinolin-Derivat, ein Verfahren zu seiner Herstellung, seine Verwendung allein oder in Kombinationen zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten sowie seine Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln, insbe- sondere als Inhibitor des Cholesterin-Ester-Transfer-Proteins (CETP) zur Behandlung und/oder Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, insbesondere von Hypolipoproteinämien, Dyslipid- ämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hypercholesterolämien und Arteriosklerose.
Durch Arteriosklerose bedingte koronare Herzerkrankungen gehören zu den Haupttodesursachen in der modernen Gesellschaft. In einer Vielzahl von Studien konnte gezeigt werden, dass niedrige Plasmaspiegel des HDL-Cholesterins einen wichtigen Risikofaktor für die Entwicklung von Arteriosklerose darstellen [Barter und Rye, Atherosclerosis 121. 1-12 (1996)]. HDL (high density lipoprotein) stellt neben LDL (low density lipoprotein) und VLDL (very low density lipoprotein) eine Klasse von Lipoproteinen dar, deren wichtigste Funktion der Transport von Lipiden, wie zum Beispiel Cholesterin, Cholesterinester, Triglyceriden, Fettsäuren oder Phospholipiden, im Blut ist. Hohe LDL-Cholesterinspiegel (>160 mg/dl) sowie niedrige HDL-Cholesterinspiegel (<40 mg/dl) tragen wesentlich zur Entwicklung von Arteriosklerose bei [ATP III Guidelines, Report of the NCEP Expert Panel]. Neben koronaren Herzerkrankungen werden auch periphäre Gefäßerkrankungen sowie Schlaganfall durch ungünstige HDL/LDL-Verhältnisse in ihrer Entstehung gefördert. Neue Methoden zur Erhöhung von HDL-Cholesterin im Plasma stellen demzufolge eine thera- peutisch sinnvolle Bereicherung bei der Vorbeugung und Behandlung von Arteriosklerose und der damit verbundenen Krankheiten dar.
Cholesterinester-Transfer-Protein (CETP) mediiert den Austausch von Cholesterinestern und Triglyceriden zwischen den verschiedenen Lipoproteinen im Blut [TaIl, J. Lipid Res. 34, 1255-74 (1993)]. Von besonderer Bedeutung ist dabei der Transfer von Cholesterinestern vom HDL auf das LDL, der zu einer Senkung der HDL-Cholesterin-Plasmaspiegel führt. Die Inhibition von CETP sollte demzufolge eine Erhöhung der Plasmaspiegel des HDL-Cholesterins und eine Absenkung der Plasmaspiegel des LDL-Cholesterins bewirken und damit zu einer therapeutisch nützlichen Beeinflussung des Lipidprofils im Plasma führen [McCarthy, Medicinal Res. Rev. j_3, 139-59 (1993); Sitori, Pharmac. Ther. 67, 443-47 (1995); Swenson, J. Biol. Chem. 264, 14318 (1989)].
Tetrahydrochinoline mit pharmakologischer Aktivität sind aus der EP-A-818 448, WO 99/14215, WO 99/15504 sowie WO 03/028727 bekannt. Substituierte Tetrahydronaphthaline mit pharmakologischer Aktivität sind aus der WO 99/14174 bekannt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Substanzen zur Bekämpfung von Erkrankungen, insbesondere von kardiovaskulären Erkrankungen, die ein verbessertes therapeutisches Profil aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der Strukturformel (I)
in denen R1 für Cyclohexyl oder Cyclopentyl, R2 und R3 jeweils für Methyl stehen oder gemeinsam einen Cyclobutan bilden, R4 für Cyclopentyl oder iso-Propyl steht, j
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Verbindung mit dem systematischen Namen (J'5)-4l-Cyclohexyl-2'-cyclopentyl-3'-{(5)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]methyl}-5',81- dihydro-ό'H-spirofcyclopropan-ljT'-chinolinJ-S'-ol und der Strukturformel (Ia)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auch die Verbindung mit dem systematischen Namen (J'iS^-Z'^'-Dicyclopentyl-S'-KSJ-fluor^^trifluormethyOphenylJmethyl}- S'^'-dihydro-ό'H-spirofcyclopropan-lJ'-chinolinj-S'-ol und der Strukturformel (Ib) - -
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auch die Verbindung mit dem systematischen Namen (5 'SΗ'-Cyclopentyl-3'- {(S)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]methyl } -T- isopropyl-5',8'-dihydro-6'H-spiro[cyclobutan-l,7l-chinolin]-5l-ol und der Strukturformel (Ic)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verbindung mit dem systematischen Namen (J^^^-Dicyclopentyl-S-KSJ-fluorμ^trifluormethyOphenyηmethylJ-T.y-dimethyl-S.ό^.δ-tetra- hydrochinolin-5-ol und der Strukturformel (Id)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze. - A -
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auch die Verbindung mit dem systematischen Namen (5S)-4-Cyclohexyl-3- {(5)-fluor[4-(trifluoiτnethyl)phenyl]methyl} -2- isopropyl-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-5-ol und der Strukturformel (Ie)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ia) -(Ie) werden im Folgenden im Singular als erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch in anderen stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst alle Enantiomeren, Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren. Bevorzugt ist die in Formel (I) wiedergegebene S-Konfiguration an C-5' und an C-3'a.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindung bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische An- Wendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindung verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindung umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindung umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kalium- salze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- moφholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindung bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindung. Der Begriff "Prodrugs" umfasst Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch erst während ihrer Verweilzeit im Körper zur erfindungsgemäßen Verbindung umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
("Q-QI-Alkyl steht im Rahmen der Erfindung für einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methyl, Ethyl, n- Propyl, Isopropyl, n-Butyl, iso-Butyl, sec.-Butyl und tert.-Butyl.
Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel (I), in denen R1, R2, R3 und R4 jeweils die oben angegebenen Bedeutungen haben und das beispielhaft für die Verbindung der Formel (Ia) dargestellt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindung der Formel (II),
zunächst durch eine asymmetrische Reduktion in die Verbindung der Formel (III) überführt, diese dann entweder
[A] durch Einführung einer Hydroxy-Schutzgruppe zu einer Verbindung der Formel (IV)
in welcher
PG für eine Hydroxy-Schutzgruppe, vorzugsweise für einen Rest der Formel -SiR1R2R3 steht, worin
R1, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und (Ci-C4)-Alkyl bedeuten,
umsetzt und anschließend über eine diastereoselektive Reduktion in eine Verbindung der Formel (V)
in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat,
überfuhrt oder in umgekehrter Abfolge der Reaktionssequenz
[B] zunächst diastereoselektiv zu der Verbindung der Formel (VI)
reduziert und diese dann durch regioselektive Einführung der Hydroxy-Schutzgruppe PG in eine Verbindung der Formel (V) überführt,
anschließend die Verbindung der Formel (V) mit Hilfe eines Fluorierungsmittels zu einer Verbindung der Formel (VIT)
in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat,
umsetzt und dann die Hydroxy-Schutzgruppe PG nach üblichen Methoden unter Erhalt der Verbindung der Formel (I) wieder abspaltet
und die Verbindung der Formel (I) gegebenenfalls mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Basen oder Säuren zu ihren Solvaten, Salzen und/oder Solvaten der Salze umsetzt.
Die Verbindung der Formel (II) kann hergestellt werden, indem man die Verbindungen der For- mein (VIII), (IX) und (X)
(VUI) (DC) (X) miteinander in einer 3-Komponenten-Reaktion in Gegenwart einer Protonen- oder Lewis-Säure zu der Verbindung der Formel (XI)
umsetzt und diese dann zu der Verbindung der Formel (E) oxidiert.
Die Verbindungen der Formeln (VIII) und (X) sind kommerziell erhältlich, literaturbekannt oder können in Analogie zu literaturbekannten Verfahren hergestellt werden (vgl. WO 99/14215 und WO 03/028727).
Die Verbindung der Formel (IX) kann durch säurekatalysierte Wittig-Reaktion eines Cyclopro- panon-Acetals mit l-(Triphenylphosphoranyliden)aceton zu 1-Cyclopropylidenaceton und nachfolgende Umsetzung mit einem Malonsäurediester erhalten werden (s. Schema 1; vgl. WO 03/028727 sowie I. Kortmann, B. Westermann, Synthesis 1995, 931-933).
Als inerte Lösungsmittel für die einzelnen Verfahrensschritte sind beispielsweise Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether oder Diethylen- glykoldimethylether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Hexan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, oder Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan, 1 ,2-Dichlorethan, Trichlorethylen oder Chlorbenzol geeignet. Ebenso ist es möglich, Gemische der genannten Lösungsmittel zu verwenden.
Die Reduktionen in den Verfahrensschritten (II) → (JS), (IV) → (V) und (HI) → (VI) werden im Allgemeinen mit Reduktionsmitteln, die für die Reduktion von Ketonen zu Hydroxyverbindungen geeignet sind, durchgeführt. Hierzu gehören insbesondere komplexe Aluminium- oder Borhydride wie beispielsweise Lithium-, Natrium-, Kalium-, Zinkborhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Diiso- butylaluminiumhydrid (DIBAH), Natrium-bis-(2-methoxyethoxy)-aluminiumdihydrid, Lithiumtri- alkylborhydride oder Lithiumtrialkoxyaluminiumhydride, oder Boran-Kompfexe wie beispielsweise Boran-Tetrahydrofuran-, Boran-Dimethylsulfϊd- oder Boran-NN-Diethylanilin-Komplex.
Die asymmetrische Reduktion im Verfahrensschritt (D) — > (DI) erfolgt in Gegenwart katalytischer Mengen (0.01 bis 0.3 Mol-Äquivalente) von enantiomerenreinem (/R, 2S)- l-Aminoindan-2-ol als chiralem Induktor. Als Reduktionsmittel wird hierbei bevorzugt Boran-NN-Diethylanilin-Komplex verwendet. Die Reaktion wird im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Ether oder in Toluol, vorzugsweise in Tetrahydrofuran, in einem Temperaturbereich von -800C bis +500C, bevorzugt von 00C bis +300C, durchgeführt.
Bei den Reduktionen (FV) — > (V) und (HI) — > (VI) wird bevorzugt Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAH) als Reduktionsmittel eingesetzt. Die Reaktionen werden im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Ether oder in Toluol, vorzugsweise in Tetrahydrofuran oder Toluol, in einem Temperaturbereich von -800C bis +5O0C, bevorzugt von -600C bis +300C, durchgeführt.
Als Hydroxy-Schutzgruppe bei den Verfahrensschritten (III) -> (IV) bzw. (VI) -» (V) wird eine Silylgruppe, wie beispielsweise Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Triisopropylsilyl oder tert.-Butyl- dimethylsilyl, bevorzugt. Besonders bevorzugt ist /ert.-Butyldimethylsilyl. Die Einführung der Silylgruppe erfolgt im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Kohlenwasserstoffe, Halogenkohlenwasserstoffe, Ether oder in Dimethylformamid als Lösungsmittel in Gegenwart einer Base wie beispielsweise Triethylamin, NN-Diisopropylethylamin, Pyridin, 2,6-Lutidin oder 4-NN-Di- methylaminopyridin (DMAP).
Im Verfahrensschritt (ITI) -> (FV) wird bevorzugt terΛ-Butyldimethylsilyltrifluormethansulfonat als Silylierungsreagenz in Kombination mit 2,6-Lutidin als Base verwendet. Die Reaktion wird bevorzugt in Dichlormethan oder Toluol in einem Temperaturbereich von -400C bis +400C, bevorzugt von -200C bis +3O0C, durchgeführt.
Im Verfahrensschritt (VI) -> (V) wird bevorzugt /ert.-Butyldimethylsilylchlorid als Silylierungsreagenz in Kombination mit Triethylamin und DMAP als Basen verwendet. Die Reaktion wird bevorzugt in Dimethylformamid in einem Temperaturbereich von 00C bis +1000C, bevorzugt von +200C bis +800C, durchgeführt.
Die Fluorierung im Verfahrensschritt (VI) -> (VII) wird im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Kohlenwasserstoffe oder Halogenkohlenwasserstoffe oder in Acetonitril, vorzugsweise in Toluol oder Dichlormethan, mit Diethylaminoschwefeltrifluorid (DAST) oder Morpholino- schwefeltrifluorid als Fluorierυngsreagenz durchgeführt. Die Reaktion erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -800C bis +400C, bevorzugt von -600C bis +200C.
Die Abspaltung einer Silyl-Schutzgruppe im Verfahrensschritt (VII) -» (I) wird im Allgemeinen mit Hilfe von Säuren, wie beispielsweise Salzsäure oder Trifluoressigsäure, oder mit Hilfe von Fluoriden, wie beispielsweise Fluorwasserstoff oder Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF), durchgeführt. Als inerte Lösungsmittel sind die oben aufgeführten Ether, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, oder Gemische der genannten Lösungsmittel geeignet. Bevorzugt ist eine Abspaltung mit TBAF in Tetrahydrofuran als Lösungsmittel. Die Reaktion erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -200C bis +600C, bevorzugt von 00C bis +300C.
Die Kondensationsreaktion (Viπ) + (DC) + (X) → (XI) wird im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Ether, in Alkoholen wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder Isopropanol, in Aceto- nitril oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt. Bevorzugt wird Diisopropyl- ether verwendet.
Als Protonen-Säuren eignen sich für diesen Verfahrensschritt im Allgemeinen organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, Trifluoressigsäure, Oxalsäure oder para-Toluolsulfonsäure, oder anorganische Säuren, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Ebenfalls geeignet sind Lewis-Säuren wie beispielsweise Aluminiumchlorid oder Zinkchlorid. Bevorzugt ist Trifluoressigsäure.
Die Reaktion erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von 00C bis +1200C, bevorzugt von +200C bis +800C.
Die Oxidation (Dehydrierung) im Verfahrensschritt (XI) — > (U) wird im Allgemeinen in einem der oben aufgeführten Halogenkohlenwasserstoffe oder gegebenenfalls in Alkoholen wie Methanol oder Ethanol, in Acetonitril oder in Wasser durchgeführt. Als Oxidationsmittel eignen sich beispielsweise Salpetersäure, Cer(rV)-amrnoniurnnitτat, 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ), Pyridiniumchlorochromat (PCC), Osmiumtetroxid, Mangandioxid oder eine katalytische Dehydrierung mittels Platindioxid oder Palladium auf Aktivkohle. Bevorzugt ist eine Oxidation mit DDQ in Dichlormethan als Lösungsmittel. Die Oxidation erfolgt im Allgemeinen in einem Temperaturbereich von -500C bis +1000C, bevorzugt von 00C bis +400C.
Die einzelnen Verfahrensschritte können bei normalem, erhöhtem oder bei erniedrigtem Druck durchgeführt werden (z.B. von 0.5 bis 5 bar). Im Allgemeinen arbeitet man bei Normaldruck.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln (Ib) - (Ie) erfolgen analog und werden durch die folgenden Syntheseschemata veranschaulicht: Schema al
Schema a2
Schema bl
Schema b2
BH3 x PhNEt2
(7R,2S)-1-Amino- indan-2-ol
Schema c
- - Schema d
Schema e
[Abkürzungen: tBu = /er/.-Butyl; DAST = Dimethylaminoschwefeltrifluorid; DDQ = 2,3-Dichlor- 5,6-dicyano-l,4-benzochinon; DIBAH = Diisobutylaluminiumhydrid; Et = Ethyl; Me = Methyl; Ph = Phenyl; p-TsOH = para-Toluolsulfonsäure; TBAF = Tetrabutylammoniumfluorid; TBDMSOTf = /ert.-Butyldimethylsilyl-trifluormethansulfonat; TFA = Trifluoressigsäure].
Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologisches Wirkspektrum. Sie eignet sich daher zur Verwendung als Arzneimittelwirkstoff zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren. Die erfindungsgemäße Verbindung eröffnet eine weitere Behandlungsalternative und stellt eine Bereicherung der Pharmazie dar. Im Vergleich zu den bekannten und bisher eingesetzten Präparaten zeigt die erfindungsgemäße Verbindung ein verbessertes Wirkungsspektrum.
Sie zeichnet sich vorzugsweise durch große Spezifität, gute Verträglichkeit und geringere Neben- Wirkungen sowie eine geringere Toxizität insbesondere im Herz-Kreislauf-Bereich und im Bereich der Leber aus.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindung ist ihre hohe Aktivität in humanem Plasma. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verbindung ist ein verringertes Interaktionspotential mit metabolisierenden Enzymen, insbesondere mit den Cytochrom P450-Enzymen und in besonderem Maße mit dem Cytochrom P450 3A4-Enzym. Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt darüber hinaus ein verringertes Ablagerungsverhalten im Fettgewebe.
Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (I) besitzt wertvolle pharmakologische Eigenschaften und kann zur Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen verwendet werden. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Verbindung ein hochwirksamer Inhibitor des Cholesterin-Ester-Transfer- Proteins (CETP) und stimuliert den reversen Cholesterin-Transport. Sie bewirkt eine Erhöhung des HDL-Cholesterinspiegels im Blut. Die erfindungsgemäße Verbindung ist insbesondere zur Behandlung und zur primären oder sekundären Prävention koronarer Herzerkrankungen, z.B. von Myokardinfarkt, einsetzbar. Die erfindungsgemäße Verbindung kann zudem zur Behandlung und Prävention von Arteriosklerose, Restenose, Schlaganfällen sowie der Alzheimer'schen Krankheit verwendet werden. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Verbindung auch zur Behandlung und Prävention von Hypolipoproteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipid- ämien, Hypercholesterolämien, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas), Pankreatitis, Insulin-abhängigem und nicht-Insulin-abhängigem Diabetes, diabetischen Spätfolgen, wie beispielsweise Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie, von kombinierten Hyperlipidämien sowie des Metabolischen Syndroms eingesetzt werden.
Die pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung kann mittels der im Folgenden aufgeführten CETP-Inhibitions-Tests ermittelt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor ge- nannten Erkrankungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prä- vention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die erfindungsgemäße Verbindung sowie einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten, zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft und vorzugs- weise genannt:
• Antidiabetika,
• antithrombotisch wirkende Substanzen,
• blutdrucksenkende Substanzen,
• den Fettstoffwechsel verändernde Substanzen,
• antientzündlich wirkende Substanzen,
• den arteriosklerotischen Plaque stabilisierende Substanzen.
Die erfindungsgemäße Verbindung der Formel (1) kann vorzugsweise mit einem oder mehreren
• Antidiabetika, die in der Roten Liste 2002/11, Kapitel 12 genannt sind,
• antithrombotisch wirkenden Mitteln, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thrombozytenaggregationshemmer oder der Antikoagulantien,
• den Blutdruck senkenden Wirkstoffen, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Calcium-Antagonisten, Angiotensin Aü-Antagonisten, ACE-Hemmer, beta-Blocker, Phospho- diesterase-Inhibitoren, Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase, cGMP-Enhancer sowie der Diuretika, und/oder
• den Fettstoffwechsel verändernden Wirkstoffen, beispielhaft und vorzugsweise aus der Gruppe der Thyroidrezeptor-Agonisten, der Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie HMG-CoA-Reduk- tase-Inhibitoren, Squalensynthase-Inhibitoren, Squalenepoxidase-Inhibitoren oder Oxidosqua- lencyclase-Inhibitoren, der ACAT-Inhibitoren, MTP -Inhibitoren, PPAR-Agonisten, Fibrate, Lipase-Inhibitoren, Cholesterinabsorptionshemmer, Gallensäure-Reabsoφtionshemmer, poly- meren Gallensäureadsorber und der Lipoprotein(a)-Antagonisten
kombiniert werden.
Unter Antidiabetika werden beispielhaft und vorzugsweise Insulin und Insulinderivate sowie oral wirksame hypoglykämische Wirkstoffe verstanden.
Insulin und Insulinderivate umfasst hierbei sowohl Insuline tierischen, menschlichen oder biotechnologischen Ursprungs als auch Gemische hieraus.
Die oral wirksamen hypoglykämischen Wirkstoffe umfassen beispielhaft und vorzugsweise SuI- phonylhamstoffe, Biguadine, Meglitinid-Derivate, Oxadiazolidinone, Thiazolidindione, Glukosi- dase-Inhibitoren, Glukagon-Antagonisten, GLP-1-Agonisten, Insulin-Sensitizer, Inhibitoren von Leberenzymen, die an der Stimulation der Glukoneogenese und/oder Glykogenolyse beteiligt sind, Modulatoren der Glukoseaufnahme sowie Kaliumkanalöffner, wie z.B. diejenigen, die in WO 97/26265 und WO 99/03861 offenbart sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit Insulin verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Sulphonylharnstoff, wie beispielhaft und vorzugsweise Tolbutamid, Glibenclamid, Glimepirid, Glipizid oder Gliclazid, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Biguanid, wie beispielhaft und vorzugsweise Metformin, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Meglitinid-Derivat, wie beispielhaft und vorzugsweise Repaglinid oder Nateglinid, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem PPARgamma-Agonisten beispielsweise aus der Klasse der Thiazolidindione, wie beispielhaft und vorzugsweise Pioglitazon oder Rosiglitazon, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem gemischten PPARalpha/gamma-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise GI-262570 (Farglitazar), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847, MK- 0767 (KRP-297) oder AZ-242, verabreicht. Unter antithrombotisch wirkenden Mitteln werden vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Thrombozytenaggregationshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Aspirin, Clopidogrel, Ticlopidin oder Dipyridamol, oder der Antikoagulantien verstanden.
Bei einer bevorzugten Ausfύhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Thrombin-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Ximelagatran, Melagatran, Bivalirudin oder Clexane, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem GPÜb/IIIa-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Tirofiban oder Abciximab, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Faktor Xa-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise DX 9065a, DPC 906, JTV 803 oder BAY 59-7939, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit Heparin oder einem low molecular weight (LMW)-Heparin-Derivat verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Vitamin K-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Coumarin, verabreicht.
Unter blutdrucksenkenden Mitteln werden beispielhaft und vorzugsweise Verbindungen aus der Gruppe der Calcium-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise die Verbindungen Nife- dipin, Amlodipin, Nitrendipin, Nisoldipin, Verapamil oder Diltiazem, der Angiotensin Aü-Antago- nisten, ACE-Hemmer, beta-Blocker sowie der Diuretika verstanden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Antagonisten der alpha 1 -Rezeptoren verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit Reserpin, Minoxidil, Diazoxid, Dihydralazin, Hydralazin sowie Stickoxid freisetzenden Stoffen, wie beispielhaft und vorzugsweise Glycerinnitrat oder Nitroprussidnatrium, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Angiotensin Aü-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Losar- tan, Valsartan, Candesartan, Telmisartan, Embusartan, Irbesartan, Olmesartan, Tasosartan oder Saprisartan, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem ACE-Hemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Enalapril, Captopril, Ramipril, Delapril, Fosinopril, Quinopril, Perindopril oder Trandolapril, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem beta-Blocker, wie beispielhaft und vorzugsweise Propranolol oder Atenolol, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Diuretikum, wie beispielhaft und vorzugsweise Furosemid, verabreicht.
Unter den Fettstoffwechsel verändernden Mitteln werden beispielhaft und vorzugsweise Verbin- düngen aus der Gruppe der Thyroidrezeptor-Agonisten, der Cholesterinsynthese-Inhibitoren wie HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren oder Squalensynthese-Inhibitoren, der ACAT-Inhibitoren, MTP-Inhibitoren, PPAR-Agonisten, Fibrate, Cholesterinabsorptionshemmer, Gallensäure-Reab- sorptionshemmer, Lipase-Inhibitoren, polymeren Gallensäureadsorber sowie der Lipoproteine- Antagonisten verstanden.
Bei einer bevorzugten Ausfϋhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Thyroidrezeptor-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise D- Thyroxin, 3,5,3'-Triiodothyronin (T3), CGS 23425 oder Axitirome (CGS 26214), verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Squalensynthese-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise BMS- 188494 oder TAK 475, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem ACAT-Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Avasimibe, Efluci- mibe oder CS-505, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Cholesterinabsorptionshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Ezeti- mibe, Tiqueside oder Pamaqueside, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Gallensäure-Reabsorptionshemmer, wie beispielhaft und vorzugsweise Barixibat, AZD 7508, SC 435, SC 635, S-8921, 264W94 oder HM 1453, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem MTP -Inhibitor, wie beispielhaft und vorzugsweise Implitapide, BMS- 201038 oder R-103757, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem PPARalpha-Agonisten, wie z.B. die Fibrate Fenofibrat, Clofibrat, Bezafibrat, Ciprofibrat oder Gemfibrozil oder wie beispielhaft und vorzugsweise GW 9578, GW 7647, LY-518674 oder NS-220, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem PPARdelta-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise GW 501516, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem gemischten PPARalpha/gamma-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise GI-262570 (Farglitazar), GW 2331, GW 409544, AVE 8042, AVE 8134, AVE 0847, MK- 0767 (KRP-297) oder AZ-242, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem gemischten PPARalpha/gamma/delta-Agonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise MCC-555, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Lipase-Inhibitor aus der Gruppe der endothelialen Lipase-Inhibitoren, der pankreatischen Lipase-Inhibitoren, der gastrischen Lipase-Inhibitoren, der Hormon-sensitiven Lipase-Inhibitoren oder der hepatischen Lipase-Inhibitoren verabreicht.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Inhibitor der pankreatrischen Lipase, vorzugsweise aus der Klasse der Lipstatine wie beispielhaft Orlistat, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem polymeren Gallensäureadsorber, wie beispielhaft und vorzugsweise Cholestyramin, Colestipol, Colesolvam, CholestaGel oder Colestimide, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Lipoprotein(a)-Antagonisten, wie beispielhaft und vorzugsweise Gemca- bene calcium (CI- 1027) oder Nicotinsäure, verabreicht. Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Antagonisten des Niacin-Rezeptors, wie beispielhaft und vorzugsweise Niaspan, Acipimox oder Niceritrol, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsfoπn der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem Antioxidans, wie beispielhaft und vorzugsweise Probucol, AGI 1067 oder Bo 653, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem LDL-Rezeptor-Inducer, wie beispielhaft Lifϊbrol, verabreicht.
Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die Verbindung der Formel (I) in Kombination mit einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor aus der Klasse der Statine, wie beispielhaft und vorzugsweise Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Fluvastatin, Atorvastatin, Rosuva- statin, Cerivastatin oder Pitavastatin, verabreicht.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Kombinationen der Verbindung der Formel (I) mit Substanzen, die eine Senkung der HMG-CoA-Reduktase-Genexpression bewirken. Derartige Substanzen können beispielsweise Inhibitoren der HMG-CoA-Reduktasetranskription oder der HMG-CoA-Reduktasetranslation sein. Eine Inhibition der HMG-CoA-Reduktase-Gen- expression kann beispielsweise durch Inhibition der SlP (Site-l)-Protease oder durch Senkung der SREBP (sterol receptor binding protein)-Spiegel hervorgerufen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Kombinationen der Verbindung der Formel (I) mit Substanzen, die antientzündlich und/oder den arteriosklerotischen Plaque stabilisierend wirken. Derartige Substanzen können beispielsweise Wirkstoffe aus der Klasse der NSAIDs, der PAF-AH-Antagonisten oder der Chemokin-Rezeptor-Antagonisten, wie beispielhaft IL-8-Rezeptor-Antagonisten oder MCP-I -Antagonisten, darstellen.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffkombinationen besitzen wertvolle pharmakologische Eigen- schaften und können zur Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Wirkstoffkombinationen sind insbesondere zur Behandlung und zur primären oder sekundären Prävention koronarer Herzerkrankungen, z.B. von Myokardinfarkt, einsetzbar. Sie können zudem zur Behandlung und Prävention von Arteriosklerose, Restenose, Schlaganfällen sowie der Alzheimer'schen Krankheit verwendet werden. Darüber hinaus können die ge- nannten Wirkstoffkombinationen auch zur Behandlung und Prävention von Hypolipoproteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hypercholesterolämien, Fettsucht (Adi- positas), Fettleibigkeit (Obesitas), Pankreatitis, Insulin-abhängigem und nicht-Insulin-abhängigem Diabetes, diabetischen Spätfolgen, wie beispielsweise Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie, von kombinierten Hyperlipidämien sowie des Metabolischen Syndroms eingesetzt werden. Ferner eignen sich die erfindungsgemäßen Wirkstoffkombinationen zur Behandlung von Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Angina Pectoris, Ischämien sowie von entzündlichen Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die die erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege kann die erfindungsgemäße Verbindung in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende, die erfin- dungsgemäße Verbindung schnell und/oder modifiziert abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäße Verbindung in kristalliner und/oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nicht-überzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulver- Inhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen oder -sprays, lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augen- präparationen, Vaginalkapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (z.B. Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Bevorzugt sind die orale oder parenterale Applikation, insbesondere die orale Applikation.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in die angeführten Applikationsformen überfuhrt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Lactose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole),
Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecylsulfat, Polyoxy- sorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche PoIy- mere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbin- säure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und/oder Geruchskorrigentien.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 20 mg/kg und ganz besonders bevorzugt 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. Experimenteller Teil zu Verbindungen der Formel (Ia)
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
CE Cholesterinester
CETP Cholesterinester-Transferprotein
DAST Dimethylaminoschwefeltrifluorid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DDQ 2.3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon de Diastereomerenüberschuss
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
EDTA Ethylendiamin-NNN',N'-tetraessigsäure ee Enantiomerenüberschuss eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) h Stunde(n)
HDL High Density Lipoprotein
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDL Low Density Lipoprotein min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
MTBE Methyl-Zert.-butylether
NMR Kernresonanzspektroskopie
R. Retentionszeit (bei HPLC)
SPA Scintillation Proximity Assay
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMSOTf ter/.-Butyldimethylsilyl-trifluormethansulfonat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran - -
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Beispiel IA
1 -Cyclopropylidenaceton
274 g (1.57 mol) [(1-Ethoxycyclopropyl)oxy](trimethyl)silan, 650 g (2.04 mol) 1 -(Triphenyl- phosphoranyliden)aceton und 29.9 g (157 mmol) para-Toluolsulfonsäure-Monohydrat werden in 1.58 Liter 1 ,2-Dichlorbenzol suspendiert und 2.5 h lang bei 1000C gerührt. Beim Aufheizen geht das l-(Triphenylphosphoranyliden)aceton in Lösung. Anschließend wird der Ansatz auf Raumtemperatur abgekühlt und das Rohprodukt über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: zunächst Petrolether, dann Dichlormethan). Die Produktfraktionen werden eingeengt und kurz im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 78.5 g (46% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 6.42 (t, IH), 2.31 (s, 3H), 1.53-1.46 (m, 2H), 1.36-1.29 (m, 2H)
MS (DCI, NH3): m/z = 114 [M+NH4]+.
Beispiel 2A
Spiro[2.5]octan-5,7-dion
37.09 g (687 mmol) Natriummethylat werden in 388 ml Methanol vorgelegt und unter Rühren auf Rückfluss erhitzt. Es werden 96.2 g (728 mmol) Malonsäuredimethylester zugegeben, weitere 10 min bei Rückfluss gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend werden 66 g (687 mmol) 1 -Cyclopropylidenaceton aus Beispiel IA bei Raumtemperatur zugetropft und die Mischung danach 4 h bei Rückfluss gerührt. Nach Entfernen des Heizbads wird eine Lösung aus 84.75 g (1.51 mol) Kaliumhydroxid in 264 ml Wasser zügig zugetropft und 1 h bei Rückfluss weiter gerührt. Anschließend wird mit halbkonzentrierter Salzsäure ein pH-Wert von 1-2 eingestellt (Schäumen) und 15 min weiter gerührt. Das Methanol wird bei einer Badtemperatur von 55°C solange am Rotationsverdampfer abgezogen, bis ein Druck von 60 mbar erreicht ist. Der Kolbeninhalt wird zweimal mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Phasen werden vereinigt, getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das erhaltene Ol wird konzentriert in Dichlormethan gelöst und über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 95:5). Die Produktfraktionen werden eingeengt und das zurückbleibende Öl anschließend in Diethylether verrührt. Der resultierende Feststoff wird abgesaugt und im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute: 37.2 g (39% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 3.49 (s, 2H), 2.47 (s, 4H), 0.58 (s, 4H)
MS (DCI, NH3): m/z = 156 [M+NH4]+.
Beispiel 3A
4'-Cyclohexyl-2'-cyclopentyl-3'-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-4',8l-dihydro-7 'H-spiro[cyclopropan- l,7'-chinolin]-5'(<5H)-on
8.0 g (28.24 mmol) 3-Amino-3-cyclopentyl-l-(4-trifluormethylphenyl)-propenon (Darstellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 4) werden in 350 ml Diisopropylether vorgelegt und mit 3.63 ml (47.1 mmol) Trifluoressigsäure und 3.25 g (23.53 mmol) Spiro[2.5]octan-5,7-dion (Beispiel 2A) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 10 min werden 5.70 ml (47.1 mmol) Cyclohexan- carbaldehyd zugegeben und die Mischung anschließend für 18 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird für 15 min im Eisbad gerührt, der erhaltene Niederschlag abgesaugt und mit kaltem Diisopropylether gewaschen.
Ausbeute: 2.92 g (25% d. Th.) 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.80 (d, 2H), 7.67 (d, 2H), 5.88 (s, IH), 3.80 (d, IH), 3.51 (quin, IH), 2.85 (d, IH), 2.69 (d, IH), 2.26-2.14 (m, IH), 2.00 (t, 2H), 1.80-1.46 (m, 9H), 1.44-1.31 (m, 2H), 1.25-1.13 (m, IH), 1.12-0.96 (m, 4H), 0.93-0.75 (m, 2H), 0.62-0.43 (m, 4H)
MS (DCI): m/z = 498 [M+H]+.
Beispiel 4A
4'-Cyclohexyl-2'-cyclopentyl-3'-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-6'H-spiro[cyclopropan-l,7'-chinolin]- 5'(8'H)-on
1.90 g (3.82 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3 A werden in 60 ml Dichlormethan gelöst und mit 950 mg (4.20 mmol) 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ) für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 20: 1 -> 10: 1).
Ausbeute: 1.3 g (69% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.10-7.82 (br. s, 2H), 7.74 (d, 2H), 3.41-3.14 (br. s, IH), 3.05 (dd, 2H), 2.71-2.50 (m, 3H), 1.98-1.36 (m, 16H), 1.24-1.05 (m, 2H), 0.62-0.50 (m, 4H)
MS (ESIpos): m/z = 496 [M+H]+.
Beispiel 5A
[(5'iS)-4'-Cyclohexyl-2'-cyclopentyl-5'-hydroxy-5',8'-dihydro-<5'H-spiro[cyclopropan-l,7'-chmolin]- 3 '-yl] [4-(trifluormethyl)phenyl]methanon
190 mg (1.24 mmol) (7R,2S)-l-Aminoindan-2-ol werden in 150 ml THF vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 5.40 g (33.1 mmol) Boran-NN-Diethylanilin-Komplex versetzt. Nach beendeter Gasentwicklung wird auf 00C gekühlt, und 4.10 g (8.27 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A, gelöst in 150 ml THF, werden zugegeben. Man lässt unter Rühren über mehrere Stunden auf Raumtemperatur kommen. Nach erfolgter Umsetzung wird die Reaktionsmischung mit Methanol versetzt, eingeengt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Es wird je zweimal mit 1 N Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird über Säulenchromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: zunächst Cyclo- hexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 10: 1).
Ausbeute: 3.4 g (83% d. Th.)
Der Enantiomerenüberschuss wird zu 71% ee bestimmt.
Anschließende chromatographische Enantiomerentrennung an chiraler Phase [Säule: Chiralpak AD, 500 mm x 40 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 2.5:97.5; Fluss: 50 ml/min; Temperatur: 25°C; Detektion: 254 nm] liefert 2.83 g der enantiomerenreinen Titelverbindung:
Rt = 4.96 min [Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 2.5:97.5; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 254 nm].
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.50-7.35 (m, 4H), 5.48-5.02 (m, IH), 3.43-3.14 (m, 2H), 2.71- 2.27 (m, 3H), 2.18-0.93 (m, 19H), 0.83-0.73 (m, IH), 0.72-0.56 (m, IH), 0.52-0.43 (m, 2H)
MS (ESIpos): m/z = 498 [M+H]+.
Beispiel 6A
((5'5)-5'-{[/e/-/.-Butyl(dimethyl)silyl]oxy}-4'-cyclohexyl-2l-cyclopentyl-5',81-dihydro-6'H-spiro- [cyclopropan-l,7'-chinolin]-3'-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanon
Unter Argon werden 100 mg (0.20 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A und 86 mg (0.80 mmol) 2,6-Dimethylpyridin in 0.75 ml absolutem Toluol gelöst und auf -200C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 106 mg (0.40 mmol) Trifluormethansulfonsäure-ter/.-butyl- dimethylsilylester in 0.25 ml absolutem Toluol zugetropft, anschließend 15 min bei -200C gerührt, dann auf 00C erwärmt und 1 h bei dieser Temperatur weiter gerührt. Der Ansatz wird mit 3 ml 0.1 N Salzsäure versetzt und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit einer l :l-Mischung aus gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung und einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Laufmittel: zunächst Cyclohexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 15: 1).
Ausbeute: 1 15 mg (94% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 8.02-7.48 (m, 4H), 5.51-5.18 (br. s, IH), 3.25-2.68 (m, 2H), 2.65- 2.45 (m, IH), 2.13-1.03 (m, 21H), 0.93-0.83 (m, 9H), 0.81-0.70 (m, IH), 0.68-0.58 (m, IH), 0.44- 0.39 (m, IH), 0.38-0.28 (m, IH), 0.25-0.14 (m, 6H)
MS (ESIpos): m/z = 612 [M+H]+.
Beispiel 7A
(5)-((5'5)-5'-{[/eA-/.-Butyl(dimethyl)silyl]oxy}-4'-cyclohexyl-2'-cyclopentyl-5',8'-dihydro-ό'H-spiro- [cyclopropan-l,7'-chinolin]-3'-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanol
Unter Argon werden 3.10 g (5.07 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 50 ml absolutem Toluol vorgelegt und auf -500C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 25.4 ml (25.4 mmol) einer 1 M Lösung von Diisobutylaluminiumhydrid in Toluol langsam zugetropft. Es wird 10 min bei -500C nachgerührt und dann innerhalb von 1 h auf Raumtemperatur erwärmt. Der Ansatz wird unter Eiskühlung mit 20%-iger Kalium-Natriumtartrat-Lösung versetzt und mehrfach mit Ethyl- acetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumchlorid- Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es werden 3.2 g als Rohprodukt erhalten.
Anschließende chromatographische Diastereomerentrennung an chiraler Phase [Säule: Chiralpak AD, 500 mm x 40 mm, 20 μm; Eluent: Isopropanol/Isohexan 2.5:97.5; Fluss: 50 ml/min; Raumtemperatur; Detektion: 254 nm] ergibt 1.4 g (45% d. Th.) der diastereomerenreinen Titelverbindung (anti-Isomer) und 1.3 g (42% d. Th.) des diastereomeren syn-Isomers.
anti-Diastereomer:
R, = 8.09 min [Säule: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 3:97; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 254 nm]
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.58 (d, 2H), 7.42 (d, 2H), 6.68 und 6.49 (2 br. s, zusammen IH), 5.58 und 5.21 (2 br. s, zusammen IH), 3.45-3.22 (m, IH), 2.99-2.78 (m, 2H), 2.33-2.18 (m, IH), 2.14-1.05 (m, 20H), 0.95-0.82 (m, 9H), 0.80-0.70 (m, IH), 0.68-0.43 (m, 2H), 0.42-0.26 (m, IH), 0.25-0.02 (m, 6H)
MS (ESIpos): m/z = 614 [M+H]+.
syn-Diastereomer:
R, = 5.70 min [Säule: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 3:97; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 254 nm] 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.59-7.51 (m, 2H), 7.48-7.28 (m, 2H), 6.64 und 6.49 (2 br. s, zusammen IH), 5.58 und 5.22 (2 br. s, zusammen IH), 3.45-3.22 (m, IH), 3.10-2.76 (m, 2H), 2.33- 2.18 (m, IH), 2.12-1.05 (m, 20H), 0.94-0.82 (m, 9H), 0.80-0.70 (m, IH), 0.68-0.43 (m, 2H), 0.42- 0.27 (m, IH), 0.26-0.01 (m, 6H)
MS (ESIpos): m/z = 614 [M+H]+.
Beispiel 8A
(J'^-S'-ICrer/.-ButyKdimethyOsilylloxyJ^'-cyclohexyl^'-cyclopentyl^'-K^-fluor^-Ctrifluor- methyOphenylJmethylJ-S'.δ'-dihydro-ό'H-spirofcyclopropan-lJ'-chinolin]
Unter Argon werden 813 mg (1.32 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A in 17 ml Toluol gelöst und auf -200C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 0.29 ml (2.19 mmol) Diethylamino- schwefeltrifluorid hinzugetropft. Nach Entfernen der Kühlung wird für 2 h weiter gerührt. Der Ansatz wird mit Wasser versetzt und mehrfach mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung umgesetzt.
Ausbeute: 770 mg (94% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.60 (d, 2H), 7.46-6.98 (m, 3H), 5.59 und 5.22 (2 br. s, zusammen IH), 3.42-3.20 (m, IH), 3.02-2.67 (m, 3H), 2.20-0.99 (m, 20H), 0.90 (s, 9H), 0.82-0.68 (m, IH), 0.67-0.48 (m, 2H), 0.44-0.27 (m, IH), 0.25-0.01 (m, 6H)
MS (ESIpos): m/z = 616 [M+H]+. Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1
(J'^^'-Cyclohexyl^'-cyclopentyl^'-f^-fluor^^trifluormethyOphenylJmethylJ-S'.S'-dihydro- <5'H-spiro[cyclopropan- 1 ,7'-chinolin]-5'-ol
Unter Argon werden 770 mg (1.25 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 1 ml THF gelöst, mit 6.25 ml (6.25 mmol) einer 1 M TBAF-Lösung in THF versetzt und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 50 ml 0.2 N Salzsäure versetzt und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung ge- waschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Laufmittel: zunächst Cyclohexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 10: 1).
Ausbeute: 594 mg (95% d. Th.)
Die weitere Abtrennung von im Produkt noch enthaltenem Diastereomer durch Chromatographie an chiraler Phase [Säule: KBD 5945, 400 mm x 30 mm, basierend auf dem chiralen Selektor PoIy- (N-rnethacryloyl-L-leucin-tert.-butylamid; Eluent: MTBE/iso-Hexan 20:80; Fluss: 50 ml/min; Raumtemperatur; Detektion: 254 nm] liefert 540 mg der diastereomerenreinen Titelverbindung:
R, = 3.76 min [Säule: KBD 5945, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: MTBE/iso-Hexan 3:7; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 265 nm]
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.61 (d, 2H), 7.48-7.29 (m, 3H), 5.47-5.39 und 5.18-5.07 (2 m, zusammen IH), 3.60-3.46 (m, IH), 3.31-3.11 (m, IH), 2.96-2.68 (m, IH), 2.47-2.20 (m, 2H), 2.10- 1.10 (m, 19H), 0.84-0.70 (m, 2H), 0.66-0.58 (m, IH), 0.50-0.38 (m, 2H)
MS (ESIpos): m/z = 502 [M+H]+. B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
B-I. CETP-Inhibitions-Testung
B-1.1. Gewinnung von CETP
CETP wird aus humanem Plasma durch Differential-Zentrifugation und Säulenchromatographie in partiell gereinigter Form gewonnen und zum Test verwendet. Dazu wird humanes Plasma mit NaBr auf eine Dichte von 1.21 g pro ml eingestellt und 18 h bei 50.000 Upm und 40C zentrifugiert. Die Bodenfraktion (d >1.21 g/ml) wird auf eine Sephadex®-Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen, mit 0.15 M NaCl / 0.001 M TrisHCl pH 7.4 gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser eluiert. Die CETP-aktiven Fraktionen werden gepoolt, gegen 50 mM Natriumacetat pH 4.5 dialysiert und auf eine CM-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Mit einem linearen Gradienten (0-1 M NaCl) wird anschließend eluiert. Die gepoolten CETP-Fraktionen werden gegen 10 mM TrisHCl pH 7.4 dialysiert und anschließend durch Chromatographie über eine Mono Q®- Säule (Fa. Pharmacia) weiter gereinigt.
B-I.2. CETP-Fluoreszenztest
Messung der CETP-katalysierten Übertragung eines fluoreszierenden Cholesterinesters zwischen Liposomen [modifiziert nach der Vorschrift von Bisgaier et al., J. LipidRes. 34, 1625 (1993)]:
Zur Herstellung der Donorliposomen wird 1 mg Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-dodecanoat (Cholesteryl BODIPY® FL Ci2, Fa. Molecular Probes) mit 5.35 mg Triolein und 6.67 mg Phosphatidylcholin am Ultraschallbad unter leichtem Erwärmen in 600 μl Dioxan gelöst und diese Lösung sehr langsam unter Ultrabeschallung zu 63 ml 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA-Puffer pH 7.3 bei Raumtemperatur gegeben. Die Suspension wird anschließend unter N2-Atmosphäre 30 min im Branson-Ultraschallbad bei ca. 50 Watt beschallt, wobei die Temperatur auf ca. 200C gehalten wird.
Die Akzeptorliposomen werden analog aus 86 mg Cholesteryloleat, 20 mg Triolein und 100 mg Phosphatidylcholin, in 1.2 ml Dioxan und 114 ml des obigen Puffers gelöst, durch 30-minütige Ultrabeschallung bei 50 Watt (2O0C) gewonnen.
B-I.2.1. CETP-Fluoreszenztest mit angereichertem CETP
Zur Testung wird ein Testmix bestehend aus 1 Teil obigen Puffers, 1 Teil Donorliposomen und 2 Teilen Akzeptorliposomen verwendet. 50 μl Testmix werden mit 48 μl angereicherter CETP-Fraktion (1-3 μg), gewonnen über hydrophobe Chromatographie aus Humanplasma, sowie 2 μl einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.2. CETP-Fluoreszenztest mit humanem Plasma
42 μl (86% v/v) humanes Plasma (Sigma P9523) werden mit 6 μl (12% v/v) Donorliposomen so- wie 1 μl (2% v/v) einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 510/520 nm (Spaltbreite 2.5 nm) ist ein Maß für den CE- Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.3. Zx v/voCETP-Fluoreszenztest
80 μl Testmix werden mit 10 μl Puffer sowie 2 μl Serum versetzt und 4 h bei 370C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.3. Gewinnung von radioaktiv markiertem HDL
50 ml frisches humanes EDTA-Plasma wird mit NaBr auf eine Dichte von 1.12 eingestellt und bei 4°C im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm zentrifugiert. Die Oberphase wird zur Gewinnung von kaltem LDL verwendet. Die Unterphase wird gegen 3 x 4 Liter PDB-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3) dialysiert. Pro 10 ml Retentatvolumen werden an- - - schließend 20 μl 3H-Cholesterin (Dupont NET-725; 1 μC/μl gelöst in Ethanol) hinzugesetzt und 72 h bei 370C unter N2 inkubiert.
Der Ansatz wird dann mit NaBr auf die Dichte 1.21 eingestellt und im Ty 65-Rotor 18 h bei
50.000 Upm und 200C zentrifugiert. Man gewinnt die Oberphase und reinigt die Lipoprotein- fraktionen durch Gradientenzentrifugation. Dazu wird die isolierte, markierte Lipoproteinfraktion mit NaBr auf eine Dichte von 1.26 eingestellt. Je 4 ml dieser Lösung werden in Zentrifugenröhr- chen (SW 40-Rotor) mit 4 ml einer Lösung der Dichte 1.21 sowie 4.5 ml einer Lösung der Dichte
1.063 überschichtet (Dichtelösungen aus PDB-Puffer und NaBr) und anschließend 24 h bei 38.000
Upm und 200C im SW 40-Rotor zentrifugiert. Die zwischen der Dichte 1.063 und 1.21 liegende, das markierte HDL enthaltende Zwischenschicht wird gegen 3 x 100 Volumen PDB-Puffer bei 4°C dialysiert.
Das Retentat enthält radioaktiv markiertes 3H-CE-HDL, das auf ca. 5 x 106 cmp pro ml eingestellt zum Test verwendet wird.
B-I.4. CETP-SPA-Test
Zur Testung der CETP-Aktivität wird die Übertragung von 3H-Cholesterolester von humanen HD- Lipoproteinen auf biotinylierte LD-Lipoproteine gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Streptavidin-SPA®-beads (Fa. Amersham) beendet und die übertragene Radioaktivität direkt im Liquid Scintillation Counter bestimmt.
Im Testansatz werden 10 μl HDL-3H-Cholesterolester (ca. 50.000 cpm) mit 10 μl Biotin-LDL (Fa. Amersham) in 50 mM Hepes / 0.15 M NaCl / 0.1% Rinderserumalbumin (RSA) / 0.05% NaN3 pH 7.4 mit 10 μl CETP (1 mg/ml) und 3 μl einer Lösung der zu prüfenden Substanz in 10% DMSO / 1% RSA für 18 h bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl der SPA-Streptavidin-bead- Lösung (TRKQ 7005) zugesetzt, 1 h unter Schütteln weiter inkubiert und dann im Scintillations- zähler gemessen. Als Kontrollen dienen entsprechende Inkubationen mit 10 μl Puffer, 10 μl CETP bei 40C sowie 10 μl CETP bei 37°C.
Die in den Kontrollansätzen mit CETP bei 37°C übertragene Aktivität wird als 100% Übertragung gewertet. Die Substanzkonzentration, bei der diese Übertragung auf die Hälfte reduziert ist, wird als IC50- Wert angegeben.
B-II.l. Messung der ex v/vo-Aktivität an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Prüfung auf CETP-inhibitorische Aktivität werden die Substanzen transgenen hCETP-Mäusen aus eigener Zucht [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] oral mit der Schlundsonde verabreicht. Dazu werden männliche Tiere einen Tag vor Versuchsbeginn randomisiert Gruppen mit gleicher Tierzahl, in der Regel n = 4, zugeordnet. Vor der Substanzapplikation wird jeder Maus zur Bestimmung ihrer basalen CETP-Aktivität im Serum Blut durch Punktion des retroorbitalen Venen- plexus entnommen (Zeitpunkt Tl). Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation der Testsubstanz wird den Tieren ein zweites Mal Blut durch Punktion entnommen (Zeitpunkt T2), in der Regel 16 oder 24 h nach Substanzapplikation; gegebenenfalls kann dies aber auch zu einem anderen Zeitpunkt erfolgen.
Um die Hemmaktivität einer Substanz bewerten zu können, wird für jeden Zeitpunkt, also 16 bzw. 24 Stunden, eine entsprechende Kontrollgruppe eingesetzt, deren Tiere nur das Formulierungsmittel ohne Substanz erhalten. Bei den Kontrolltieren erfolgen die zwei Blutentnahmen pro Tier wie bei den substanzbehandelten Tieren, um die Veränderung der CETP-Aktivität ohne Inhibitor über den entsprechenden Versuchszeitraum (16 bzw. 24 h) bestimmen zu können.
Die Blutproben werden nach Abschluß der Gerinnung zentrifugiert und das Serum wird abpipettiert. Zur Bestimmung der CETP-Aktivität wird der Cholesterylester-Transport über 4 h bestimmt. Dazu werden im Testansatz in der Regel 2 μl Serum eingesetzt; der Test wird wie unter B-I.2.3. beschrieben durchgeführt.
Die Differenzen im Cholesterylester-Transport [pM CE/h (T2) - pM CE/h (Tl)] werden für jedes Tier berechnet und in den Gruppen gemittelt. Eine Substanz, die zu einem der Zeitpunkte den Cholesterylester-Transport um >20% herabsetzt, wird als wirksam angesehen.
B-II.2. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an Syrischen Goldhamstern
Zur Bestimmung der oralen Wirkung von CETP-Inhibitoren auf Serum-Lipoproteine und -Triglyceride werden 150-200 g schwere weibliche syrische Goldhamster aus eigener Zucht (Stamm BAY:DSN) verwendet. Die Tiere werden pro Käfig zu sechst gruppiert und zwei Wochen bei Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert. Unmittelbar vor Versuchsbeginn und nach Abschluss der Substanzapplikation wird mittels retro- orbitaler Punktion des Venenplexus Blut entnommen, woraus nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur und 20 min Zentrifugation bei 30.000 g Serum gewonnen wird. Die Substanzen werden in 20% Solutol / 80% Wasser gelöst und mit Hilfe einer Schlundsonde peroral verabreicht. Die Kontrolltiere erhalten identische Volumina Lösungsmittel ohne Testsubstanz.
Die Bestimmung von Triglyceriden, Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin erfolgt mit Hilfe des Analysegeräts COBAS INTEGRA 400 plus (Fa. Roche Diagnostics) nach Angaben des Herstellers. Aus den Messwerten wird für jeden Parameter die durch Substanzbehandlung hervorgerufene prozentuale Veränderung für jedes Tier berechnet und als Mittelwert mit Standardabweichung pro Gruppe (n = 6 oder n = 12) angegeben. Sind die Substanzeffekte im Vergleich zur Lösungsmittel-behandelten Gruppe signifikant, wird der mittels t-Test ermittelte p- Wert hinzugefügt (* p <0.05; ** p ≤O.Ol; *** p <0.005).
B-II.3. Messung der in vtvo- Wirksamkeit an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Bestimmung der oralen Wirkung auf Lipoproteine und Triglyceride wird transgenen Mäusen [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Vor
Versuchsbeginn wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen, um Cholesterin und Triglyceride im Serum zu bestimmen. Das Serum wird, wie oben für Hamster beschrieben, durch Inkubation bei
40C über Nacht und anschließende Zentrifugation bei 6.000 g gewonnen. Nach drei Tagen wird den Mäusen wieder Blut entnommen, um Lipoproteine und Triglyceride erneut zu bestimmen. Die Veränderungen der gemessenen Parameter werden als prozentuale Veränderung gegenüber dem
Ausgangswert ausgedrückt.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Verbindung kann folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt.
i.v.-Lösung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.
Experimenteller Teil zu Verbindungen der Formel (Ib)
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
CE Cholesterinester
CETP Cholesterinester-Transferprotein
DAST Dimethylaminoschwefeltrifluorid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DDQ 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon de Diastereomerenüberschuss
DMF NN-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
EDTA Ethylendiamin-NNN'.N'-tetraessigsäure ee Enantiomerenüberschuss eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) h Stunde(n)
HDL High Density Lipoprotein
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDL Low Density Lipoprotein min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
MTBE Methyl-tert.-butylether
NMR Kemresonanzspektroskopie
R. Retentionszeit (bei HPLC)
SPA Scintillation Proximity Assay
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMSOTf ter/.-Butyldimethylsilyl-trifluormethansulfonat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Beispiel IA
1 -Cyclopropylidenaceton
274 g (1.57 mol) [(1-Ethoxycyclopropyl)oxy](trimethyl)silan, 650 g (2.04 mol) l-(Triphenyl- phosphoranyliden)aceton und 29.9 g (157 mmol) para-Toluolsulfonsäure-Monohydrat werden in 1.58 Liter 1 ,2-Dichlorbenzol suspendiert und 2.5 h lang bei 1000C gerührt. Beim Aufheizen geht das l-(Triphenylphosphoranyliden)aceton in Lösung. Anschließend wird der Ansatz auf Raumtemperatur abgekühlt und das Rohprodukt über Kieselgel Chromatographien (Laufmittel: zunächst Petrolether, dann Dichlormethan). Die Produktfraktionen werden eingeengt und kurz im Hochvakuum getrocknet.
Ausbeute: 78.5 g (46% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 6.42 (t, IH), 2.31 (s, 3H), 1.53-1.46 (m, 2H), 1.36-1.29 (m, 2H)
MS (DCI, NH3): m/z = 114 [M+NH4]+.
Beispiel 2A
Spiro[2.5]octan-5,7-dion
37.09 g (687 mmol) Natriummethylat werden in 388 ml Methanol vorgelegt und unter Rühren auf Rückfluss erhitzt. Es werden 96.2 g (728 mmol) Malonsäuredimethylester zugegeben, weitere 10 min bei Rückfluss gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend werden 66 g (687 mmol) 1 -Cyclopropylidenaceton aus Beispiel IA bei Raumtemperatur zugetropft und die Mischung danach 4 h bei Rückfluss gerührt. Nach Entfernen des Heizbads wird eine Lösung aus 84.75 g (1.51 mol) Kaliumhydroxid in 264 ml Wasser zügig zugetropft und 1 h bei Rückfluss weiter gerührt. Anschließend wird mit halbkonzentrierter Salzsäure ein pH- Wert von 1-2 eingestellt (Schäumen) und 15 min weiter gerührt. Das Methanol wird bei einer Badtemperatur von 55°C solange am Rotationsverdampfer abgezogen, bis ein Druck von 60 mbar erreicht ist. Der Kolbeninhalt wird zweimal mit Ethylacetat extrahiert, die organischen Phasen werden vereinigt, getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das erhaltene Ol wird konzentriert in Dichlormethan gelöst und über Kieselgel chromatographiert (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 95:5). Die Produktfraktionen werden eingeengt und das zurückbleibende Öl anschließend in Diethylether verrührt. Der resultierende Feststoff wird abgesaugt und im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Ausbeute: 37.2 g (39% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ - 3.49 (s, 2H), 2.47 (s, 4H), 0.58 (s, 4H)
MS (DCI, NH3): m/z = 156 [M+NH4]+.
Beispiel 3A
2',4I-Dicyclopentyl-3'-[4-(tπfluormethyl)benzoyl]-4',8'-dihydro-7 'H-spiro[cyclopropan-l,7'-chmo- hn]-5'(6'H)-on
9.0 g (31.77 mmol) 3-Amino-3-cyclopentyl-l-(4-trifluormethylphenyl)-propenon (Darstellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 4) werden in 350 ml Diisopropylether vorgelegt und mit 4.08 ml (52.95 mmol) Trifluoressigsäure und 3.66 g (26.47 mmol) Spiro[2.5]octan-5,7-dion (Beispiel 2A) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 10 min werden 5.20 g (52.95 mmol) Cyclopentan- carbaldehyd zugegeben und die Mischung anschließend für 18 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird für 15 min im Eisbad gerührt, der erhaltene Niederschlag abgesaugt und mit kaltem Diisopropylether gewaschen.
Ausbeute: 1.9 g (15% d. Th.) 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.81 (d, 2H), 7.67 (d, 2H), 5.91 (s, IH), 3.88 (d, IH), 3.52 (quin, IH), 2.88 (d, IH), 2.70 (d, IH), 2.26-2.14 (m, IH), 1.94 (dd, 2H), 1.80-1.24 (m, 14H), 1.16-0.88 (m, 2H), 0.62-0.40 (m, 4H)
MS (ESIpos): m/z = 484 [M+H]+.
Beispiel 4A
2',4'-Dicyclopentyl-3'-[4-(tτifluormethyl)benzoyl]-(5'H-spiro[cyclopropan-l,7'-chinolin]-5'(5'H)-on
4.80 g (9.93 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden in 150 ml Dichlormethan gelöst und mit 2.48 g (10.92 mmol) 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ) für 1 h bei Raumtempe- ratur gerührt. Die Mischung wird am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 20:1 — > 10:1).
Ausbeute: 2.7 g (56% d. Th.)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.98 (d, 2H), 7.76 (d, 2H), 3.18-2.97 (m, 3H), 2.72-2.55 (m, 3H), 1.98-1.64 (m, 10H), 1.60-1.36 (m, 6H), 0.64-0.49 (m, 4H)
MS (DCI): m/z = 482 [M+H]+.
Beispiel 5A
[(J'^^'^'-Dicyclopentyl-S'-hydroxy-S'.δ'-dihydro-ό'H-spirotcyclopropan-l^'-chinolinl-S'-yl]^- (trifluormethyl)phenyl]methanon
130 mg (0.84 mmol) (7R,25)-l-Aminoindan-2-ol werden in 100 ml THF vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 3.66 g (22.43 mmol) Boran-N,N-Diethylanilin-Komplex versetzt. Nach beendeter Gasentwicklung wird auf 00C gekühlt, und 2.70 g (5.61 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A, gelöst in 150 ml THF, werden zugegeben. Man lässt unter Rühren über mehrere Stunden auf Raumtemperatur kommen. Nach erfolgter Umsetzung wird die Reaktionsmischung mit Methanol versetzt, eingeengt und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen. Es wird je zweimal mit 1 N Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird über Säulenchromatographie aufgereinigt (Kieselgel, Laufmittel: zunächst Cyclohexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 20:1).
Ausbeute: 2.8 g (chemische Reinheit: ca. 83%, Enantiomerenüberschuss: 91% ee).
Anschließende chromatographische Enantiomerentrennung an chiraler Phase [Säule: Chiralpak AD, 500 mm x 40 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 2.5:97.5; Fluss: 50 ml/min; Temperatur: 240C; Detektion: 254 nm] liefert, ausgehend von 2.65 g des oben erhaltenen Produkts, 2.4 g der enantiomerenreinen Titelverbindung:
Rt = 6.78 min [Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: iso-Propanol/iso-Hexan 2.5:97.5; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 254 nm]
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.00-7.89 (m, 2H), 7.72 (d, 2H), 5.68-5.59 (m, IH), 3.36-3.14 (m, 2H), 2.65-2.50 (m, 2H), 2.34 (d, IH), 2.20-2.04 (m, 2H), 1.94-1.30 (m, 16H), 0.83-0.73 (m, IH), 0.72-0.59 (m, IH), 0.53-0.41 (m, 2H)
MS (DCI): m/z = 484 [M+H]+.
Beispiel 6A
((51S)S'- { [tert. -Butyl(dimethyl)silyl]oxy} -2',4l-dicyclopentyl-5',8'-dihydro-(J'H-spiro[cyclopropan- 1 ,7'-chinolin]-3'-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanon - -
Unter Argon werden 2.25 g (4.65 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A und 1.99 g (18.61 mmol) 2,6-Dimethylpyridin in 20 ml absolutem Toluol gelöst und auf -200C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 2.46 g (9.31 mmol) Trifluormethansulfonsäure-tert.-butyldimethylsilyl- ester in 5 ml absolutem Toluol zugetropft, anschließend 15 min bei -20°C gerührt, dann auf 00C erwärmt und 1 h bei dieser Temperatur weiter gerührt. Der Ansatz wird mit 75 ml 0.1 N Salzsäure versetzt und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit einer l:l-Mischung aus gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gesättigter Natriumchlorid-Lösung und einmal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Laufmittel: zunächst Cyclohexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 15:1).
Ausbeute: 2.18 g (78% d. Th.)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 8.00-7.87 (m, 2H), 7.71 (d, 2H), 5.28-5.18 (m, IH), 3.38-3.11 (m, IH), 2.96 (d, IH), 2.80 (d, IH), 2.65-2.43 (m, IH), 2.08-1.23 (m, 18H), 0.87 (s, 9H), 0.76-0.58 (m, 2H), 0.46-0.38 (m, IH), 0.37-0.25 (m, IH), 0.18 (s, 3H), 0.10 (s, 3H).
MS (ESIpos): m/z = 598 [M+H]+.
Beispiel 7A
(^-((J'^-S'-lf/er/.-ButyKdimethyOsilyljoxyJ^'^'-dicyclopentyl-S'^'-dihydro-ό'H-spirofcyclopro- pan-1 ,7'-chinolin]-3'-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanol
Unter Argon werden 2.10 g (3.51 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 35 ml absolutem Toluol vorgelegt und auf -500C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 17.56 ml (17.56 mmol) einer 1 M Lösung von Diisobutylaluminiumhydrid in Toluol langsam zugetropft. Es wird 10 min bei -500C nachgerührt und dann innerhalb von 1 h auf Raumtemperatur erwärmt. Der Ansatz wird unter Eiskühlung mit 20%-iger Kalium-Natriumtartrat-Lösung versetzt und mehrfach mit Ethyl- acetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumchlorid- Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Es werden 2.4 g als Rohprodukt erhalten.
Anschließende chromatographische Diastereomerentrennung an chiraler Phase [Säule: Chiralpak AD, 500 mm x 40 mm, 20 μm; Eluent: Isopropanol/Isohexan 2.5:97.5; Fluss: 50 ml/min; Temperatur: 24°C; Detektion: 254 nm] ergibt 1.2 g (56% d. Th.) der diastereomerenreinen Titelverbindung (anti-Isomer) und 0.9 g (42% d. Th.) des diastereomeren syn-Isomers.
anti-Di astereomer :
Rt = 5.25 min [Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Isopropanol/Isohexan 2.5:97.5; Fluss: 1.5 ml/min; Detektion: 250 nm]
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.58 (d, 2H), 7.41 (d, 2H), 6.23 (br. s, IH), 5.20 (t, IH), 3.68- 3.55 (m, IH), 3.08-2.70 (m, 3H), 2.29-2.18 (m, IH), 2.12-1.94 (m, 2H), 1.90-1.22 (m, 15H), 0.89 (s, 9H), 0.76-0.68 (m, IH), 0.62-0.55 (m, IH), 0.43-0.36 (m, IH), 0.33-0.25 (m, IH), 0.13 (s, 3H), 0.11 (s, 3H)
MS (ESIpos): m/z = 600 [M+H]+.
svn-Diastereomer:
R1 = 4.36 min [Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Isopropanol/Isohexan 2.5:97.5; Fluss: 1.5 ml/min; Detektion: 250 nm] 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.56 (d, 2H), 7.34 (d, 2H), 6.23 (br. s, IH), 5.20 (t, IH), 3.68- 3.55 (m, IH), 3.13-2.60 (m, 3H), 2.29-2.11 (m, 2H), 2.10-1.98 (m, IH), 1.90-1.22 (m, 15H), 0.89 (s, 9H), 0.76-0.68 (m, IH), 0.62-0.55 (m, IH), 0.43-0.36 (m, IH), 0.33-0.25 (m, IH), 0.13 (s, 3H), 0.11 (s, 3H)
MS (ESIpos): m/z = 600 [M+H]+.
Beispiel 8A
(5',S)-5l-{[/er/.-Butyl(dimethyl)silyl]oxy}-2l,41-dicyclopentyl-3I-{(5)-fluor[4-(trifluormethyl)- pheny^methylJ-S'^'-dihydro-ό'H-spirofcyclopropan-l^'-chinolin]
Unter Argon werden 500 mg (0.83 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A in 10 ml Toluol gelöst und auf -2O0C abgekühlt. Bei dieser Temperatur werden 0.18 ml (1.38 mmol) Diethylamino- schwefeltrifluorid hinzugetropft. Nach Entfernen der Kühlung wird für 2 h weiter gerührt. Der Ansatz wird mit Wasser versetzt und mehrfach mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Das Rohprodukt wird im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung umgesetzt.
Ausbeute: 485 mg (96% d. Th.)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.61 (d, 2H), 7.38 (d, 2H), 6.91 (d, IH), 5.21 (t, IH), 3.66-3.55 (m, IH), 2.97-2.80 (m, 3H), 2.16-2.00 (m, 2H), 1.98-1.60 (m, 12H), 1.50-1.22 (m, 3H), 1.20-1.05 (m, IH), 0.90 (s, 9H), 0.78-0.70 (m, IH), 0.63-0.57 (m, IH), 0.44-0.37 (m, IH), 0.35-0.28 (m, IH), 0.13 (s, IH), 0.11 (s, 3H)
MS (ESIpos): m/z = 602 [M+H]+. Ausführungsbeispiele;
Beispiel 1
(J'^^'^'-Dicyclopentyl-S'-l^-fluor^-CtrifluormethyOpheny^methyll-S'.S'-dihydro-o'H-spiro- [cyclopropan-l,7'-chinolin]-5'-ol
Unter Argon werden 475 mg (0.79 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A in 1 ml THF gelöst, mit 3.95 ml (3.95 mmol) einer 1 M TBAF-Lösung in THF versetzt und 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird mit 50 ml 0.2 N Salzsäure versetzt und mehrfach mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung ge- waschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt. Der Rückstand wird über Kieselgel chromatographisch gereinigt (Laufmittel: zunächst Cyclohexan, dann Cyclohexan/Ethylacetat 10: 1).
Ausbeute: 293 mg (76% d. Th.), mit einem Diastereomerenüberschuss von 90%.
Die weitere Abtrennung von im Produkt noch enthaltenem Diastereomer durch Chromatographie an chiraler Phase [Säule: KBD 5945, 400 mm x 30 mm, basierend auf dem chiralen Selektor PoIy- (N-methacryloyl-L-leucin-tert.-butylamid; Eluent: MTBE/Isohexan 20:80; Fluss: 50 ml/min; Temperatur: 24°C; Detektion: 254 nm] liefert 251 mg der diastereomerenreinen Titelverbindung:
R, = 4.67 min [Säule: KBD 5945, 250 x 4.6 mm; Eluent: MTBE/Isohexan 3:7; Fluss: 1.0 ml/min; Detektion: 280 nm]
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 7.62 (d, 2H), 7.36 (d, 2H), 6.97 (d, IH), 5.12 (br. s, IH), 3.84 (quin, IH), 3.24 (dd, IH), 2.98-2.86 (m, IH), 2.48 (d, IH), 2.36 (d, IH), 2.22-1.52 (m, 14H), 1.49- 1.20 (m, 3H), 1.06-0.90 (m, IH), 0.80-0.72 (m, IH), 0.67-0.58 (m, IH), 0.51-0.40 (m, 2H)
MS (ESIpos): m/z = 488 [M+H]+. . .
B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
B-I. CETP-Inhibitions-Testung
B-1.1. Gewinnung von CETP
CETP wird aus humanem Plasma durch Differential-Zentrifugation und Säulenchromatographie in partiell gereinigter Form gewonnen und zum Test verwendet. Dazu wird humanes Plasma mit NaBr auf eine Dichte von 1.21 g pro ml eingestellt und 18 h bei 50.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Bodenfraktion (d >1.21 g/ml) wird auf eine Sephadex®-Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen, mit 0.15 M NaCl / 0.001 M TrisHCl pH 7.4 gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser eluiert. Die CETP-aktiven Fraktionen werden gepoolt, gegen 50 mM Natriumacetat pH 4.5 dialysiert und auf eine CM-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Mit einem linearen Gradienten (0-1 M NaCl) wird anschließend eluiert. Die gepoolten CETP-Fraktionen werden gegen 10 mM TrisHCl pH 7.4 dialysiert und anschließend durch Chromatographie über eine Mono Q*- Säule (Fa. Pharmacia) weiter gereinigt.
B-I.2. CETP-Fluoreszenztest
Messung der CETP-katalysierten Übertragung eines fluoreszierenden Cholesterinesters zwischen Liposomen [modifiziert nach der Vorschrift von Bisgaier et al., J. Lipid Res. 34, 1625 (1993)]:
Zur Herstellung der Donorliposomen wird 1 mg Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dirnethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-dodecanoat (Cholesteryl BODIPY® FL Cn, Fa. Molecular Probes) mit 5.35 mg Triolein und 6.67 mg Phosphatidylcholin am Ultraschallbad unter leichtem Erwärmen in 600 μl Dioxan gelöst und diese Lösung sehr langsam unter Ultrabeschallung zu 63 ml 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA-Puffer pH 7.3 bei Raumtemperatur gegeben. Die Suspension wird anschließend unter N2-Atmosphäre 30 min im Branson-Ultraschallbad bei ca. 50 Watt beschallt, wobei die Temperatur auf ca. 200C gehalten wird.
Die Akzeptorliposomen werden analog aus 86 mg Cholesteryloleat, 20 mg Triolein und 100 mg Phosphatidylcholin, in 1.2 ml Dioxan und 1 14 ml des obigen Puffers gelöst, durch 30-minütige Ultrabeschallung bei 50 Watt (200C) gewonnen.
B-I.2.1. CETP-Fluoreszenztest mit angereichertem CETP
Zur Testung wird ein Testmix bestehend aus 1 Teil obigen Puffers, 1 Teil Donorliposomen und 2 Teilen Akzeptorliposomen verwendet. 50 μl Testmix werden mit 48 μl angereicherter CETP-Fraktion (1-3 μg), gewonnen über hydrophobe Chromatographie aus Humanplasma, sowie 2 μl einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.2. CETP-Fluoreszenztest mit humanem Plasma
42 μl (86% v/v) humanes Plasma (Sigma P9523) werden mit 6 μl (12% v/v) Donorliposomen sowie 1 μl (2% v/v) einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 510/520 nm (Spaltbreite 2.5 nm) ist ein Maß für den CE- Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.3. Ex Wvo-CETP-Fluoreszenztest
80 μl Testmix werden mit 10 μl Puffer sowie 2 μl Serum versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.3. Gewinnung von radioaktiv markiertem HDL
50 ml frisches humanes EDTA-Plasma wird mit NaBr auf eine Dichte von 1.12 eingestellt und bei 4°C im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm zentrifugiert. Die Oberphase wird zur Gewinnung von kaltem LDL verwendet. Die Unterphase wird gegen 3 x 4 Liter PDB-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3) dialysiert. Pro 10 ml Retentatvolumen werden an- schließend 20 μl 3H-Cholesterin (Dupont NET-725; 1 μC/μl gelöst in Ethanol) hinzugesetzt und 72 h bei 37°C unter N2 inkubiert.
Der Ansatz wird dann mit NaBr auf die Dichte 1.21 eingestellt und im Ty 65-Rotor 18 h bei
50.000 Upm und 200C zentrifugiert. Man gewinnt die Oberphase und reinigt die Lipoprotein- fraktionen durch Gradientenzentrifugation. Dazu wird die isolierte, markierte Lipoproteinfraktion mit NaBr auf eine Dichte von 1.26 eingestellt. Je 4 ml dieser Lösung werden in Zentrifugenröhr- chen (SW 40-Rotor) mit 4 ml einer Lösung der Dichte 1.21 sowie 4.5 ml einer Lösung der Dichte
1.063 überschichtet (Dichtelösungen aus PDB-Puffer und NaBr) und anschließend 24 h bei 38.000
Upm und 200C im SW 40-Rotor zentrifugiert. Die zwischen der Dichte 1.063 und 1.21 liegende, das markierte HDL enthaltende Zwischenschicht wird gegen 3 x 100 Volumen PDB-Puffer bei 4°C dialysiert.
Das Retentat enthält radioaktiv markiertes 3H-CE-HDL, das auf ca. 5 x 106 cmp pro ml eingestellt zum Test verwendet wird.
B-I.4. CETP-SPA-Test
Zur Testung der CETP-Aktivität wird die Übertragung von 3H-Cholesterolester von humanen HD- Lipoproteinen auf biotinylierte LD-Lipoproteine gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Streptavidin-SPA®-beads (Fa. Amersham) beendet und die übertragene Radioaktivität direkt im Liquid Scintillation Counter bestimmt.
Im Testansatz werden 10 μl HDL-3H-Cholesterolester (ca. 50.000 cpm) mit 10 μl Biotin-LDL (Fa. Amersham) in 50 mM Hepes / 0.15 M NaCl / 0.1% Rinderserumalbumin (RSA) / 0.05% NaN3 pH 7.4 mit 10 μl CETP (1 mg/ml) und 3 μl einer Lösung der zu prüfenden Substanz in 10% DMSO / 1% RSA für 18 h bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl der SPA-Streptavidin-bead- Lösung (TRKQ 7005) zugesetzt, 1 h unter Schütteln weiter inkubiert und dann im Scintillations- zähler gemessen. Als Kontrollen dienen entsprechende Inkubationen mit 10 μl Puffer, 10 μl CETP bei 4°C sowie 10 μl CETP bei 37°C.
Die in den Kontrollansätzen mit CETP bei 370C übertragene Aktivität wird als 100% Übertragung gewertet. Die Substanzkonzentration, bei der diese Übertragung auf die Hälfte reduziert ist, wird als IC50- Wert angegeben.
B-π 1. Messung der ex wvo-Aktivität an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Prüfung auf CETP-inhibitorische Aktivität werden die Substanzen transgenen hCETP-Mäusen aus eigener Zucht [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] oral mit der Schlundsonde verabreicht. Dazu werden männliche Tiere einen Tag vor Versuchsbeginn randomisiert Gruppen mit gleicher Tierzahl, in der Regel n = 4, zugeordnet. Vor der Substanzapphkation wird jeder Maus zur Bestimmung ihrer basalen CETP-Aktivitat im Serum Blut durch Punktion des retroorbitalen Venen- plexus entnommen (Zeitpunkt Tl). Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation der Testsubstanz wird den Tieren ein zweites Mal Blut durch Punktion entnommen (Zeitpunkt T2), m der Regel 16 oder 24 h nach Substanzapphkation; gegebenenfalls kann dies aber auch zu einem anderen Zeitpunkt erfolgen.
Um die Hemmaktivität einer Substanz bewerten zu können, wird für jeden Zeitpunkt, also 16 bzw. 24 Stunden, eine entsprechende Kontrollgruppe eingesetzt, deren Tiere nur das Formulierungs- mittel ohne Substanz erhalten. Bei den Kontrolltieren erfolgen die zwei Blutentnahmen pro Tier wie bei den substanzbehandelten Tieren, um die Veränderung der CETP-Aktivität ohne Inhibitor über den entsprechenden Versuchszeitraum (16 bzw. 24 h) bestimmen zu können.
Die Blutproben werden nach Abschluss der Geπnnung zentπfugiert und das Serum wird ab- pipettiert. Zur Bestimmung der CETP-Aktivität wird der Cholesterylester-Transport über 4 h bestimmt. Dazu werden im Testansatz in der Regel 2 μl Serum eingesetzt; der Test wird wie unter B-I.2.3. beschrieben durchgeführt.
Die Differenzen im Cholesterylester-Transport [pM CE/h (T2) - pM CE/h (Tl)] werden für jedes Tier berechnet und in den Gruppen gemittelt. Eine Substanz, die zu einem der Zeitpunkte den Cholesterylester-Transport um >20% herabsetzt, wird als wirksam angesehen.
B-II.2. Messung der in v;vo-Wirksamkeit an Syrischen Goldhamstem
Zur Bestimmung der oralen Wirkung von CETP-Inhibitoren auf Serum-Lipoproteine und -Triglyceride werden 150-200 g schwere weibliche syrische Goldhamster aus eigener Zucht (Stamm BAY:DSN) verwendet. Die Tiere werden pro Käfig zu sechst gruppiert und zwei Wochen bei Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert. Unmittelbar vor Versuchsbeginn und nach Abschluss der Substanzapplikation wird mittels retro- orbitaler Punktion des Venenplexus Blut entnommen, woraus nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur und 20 min Zentrifugation bei 30.000 g Serum gewonnen wird. Die Substanzen werden in 20% Solutol / 80% Wasser gelöst und mit Hilfe einer Schlundsonde peroral verabreicht. Die Kontrolltiere erhalten identische Volumina Lösungsmittel ohne Testsubstanz.
Die Bestimmung von Triglyceriden, Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin erfolgt mit Hilfe des Analysegeräts COBAS INTEGRA 400 plus (Fa. Roche Diagnostics) nach Angaben des Herstellers. Aus den Messwerten wird für jeden Parameter die durch Substanzbehandlung hervorgerufene prozentuale Veränderung für jedes Tier berechnet und als Mittelwert mit Standardabweichung pro Gruppe (n = 6 oder n = 12) angegeben. Sind die Substanzeffekte im Vergleich zur Lösungsmittel-behandelten Gruppe signifikant, wird der mittels t-Test ermittelte p- Wert hinzugefügt (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.005).
B-II.3. Messung der in Wvo-Wirksamkeit an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Bestimmung der oralen Wirkung auf Lipoproteine und Triglyceride wird transgenen Mäusen [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Vor
Versuchsbeginn wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen, um Cholesterin und Triglyceride im Serum zu bestimmen. Das Serum wird, wie oben für Hamster beschrieben, durch Inkubation bei
4°C über Nacht und anschließende Zentrifugation bei 6.000 g gewonnen. Nach drei Tagen wird den Mäusen wieder Blut entnommen, um Lipoproteine und Triglyceride erneut zu bestimmen. Die Veränderungen der gemessenen Parameter werden als prozentuale Veränderung gegenüber dem
Ausgangswert ausgedrückt.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Verbindung kann folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfϊndungs- gemäßen Verbindung fortgesetzt.
i.v.-Lösung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.
Experimenteller Teil zu Verbindungen der Formel (Ic)
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
CE Cholesterinester
CETP Cholesterinester-Transferprotein
DAST Dimethylaminoschwefeltrifluorid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DDQ 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon
De Diastereomerenüberschuss
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
EDTA Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure
Ee Enantiomerenüberschuss eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
H Stunde(n)
HDL High Density Lipoprotein
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDL Low Density Lipoprotein
Min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
NMR Kernresonanzspektroskopie
Rf Retentionsindex (bei Dünnschicht-Chromatographie)
R, Retentionszeit (bei HPLC)
SPA Scintillation Proximity Assay
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMSOTf /er/.-Butyldimethylsilyl-trifluorrnethansulfonat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran HPLC- und LC/MS-Methoden:
Methode 1 : Säule: Chiralpak LA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Isohexan/ 1-Propanol 97:3; Fluss: 1.0 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode 2: Instrument: HP 1 100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B → 0.5 min 2% B → 4.5 min 90% B → 9 min 90% B; Fluss: 0.75 ml/min; Temperatur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (LC/MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1 100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 2.5 min 30% A → 3.0 min 5% A → 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min → 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Ausgangsverbinduneen und Intermediate:
Beispiel IA
4'-Cyclopentyl-2'-isopropyl-3'-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-4',8'-dihydro-rH-spiro[cyclobutan-l,7l- chinolin]-5'(6'H)-on
6.3 g (24.5 mmol, 1.2 eq.) 3-Amino-3-isopropyl-l-(4-trifluormethylphenyl)-propenon (Darstellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 2) werden in 188 ml Diisopropylether vorgelegt und mit 3.14 ml (40.8 mmol, 2.0 eq.) Trifluoressigsäure und 3.1 g (20.4 mmol, 1 eq.) Spiro[3.5]nonan-6,8-dion (Darstellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 5) versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur fiir 10 min werden 3.0 g (30.6 mmol, 1.5 eq.) Cyclopentancarbaldehyd zugegeben. Anschließend wird die Mischung für 18 h am Wasserabscheider unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird für 30 min im Eisbad gerührt, der erhaltene Niederschlag abgesaugt, mit kaltem Diisopropylether gewaschen und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit.
Ausbeute: 4.37 g (45.5% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.91 (m, 2H), 1.05 (d, 3H), 1.28 (d, 3H), 1.21-2.07 (m, 13H), 2.43 und 2.70 (2d, 2H), 2.63 (s, 2H), 3.47 (sept, IH), 3.80 (d, IH), 6.03 (s, IH), 7.66 (d, 2H), 7.77 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 472 [M+H]+.
Beispiel 2A
4'-Cyclopentyl-2'-isopropyl-3'-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-6'H-spiro[cyclobutan-l,7'-chinolin]- 5'(81H)-On
5.19 g (11.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel IA werden in 180 ml Dichlormethan gelöst und bei Raumtemperatur portionsweise mit 2.75 g (12.1 mmol, 1.1 eq.) 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4- benzochinon (DDQ) versetzt. Es wird 1 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Die Mischung wird am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 100:0 → 50:50).
Ausbeute: 4.74 g (91.6% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.10 (d, 3H), 1.19 (d, 3H), 1.33-2.10 (m, 14H), 2.59 (sept, IH), 2.82 (s, 2H), 2.99 (sept, IH), 3.30 (s, 2H), 7.75 (d, 2H), 7.94 (m, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+. Beispiel 3A
[(i'^^'-Cyclopentyl-S'-hydroxy^'-isopropyl-S'^'-dihydro-ό'H-spirofcyclobutan-lJ'-chinolin]^1- yl][4-(trifluormethyl)phenyl]methanon
120 mg (0.81 mmol, 0.08 eq.) (/Λ,2S)-l-Aminoindan-2-ol werden in 250 ml THF vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 6.6 g (40.4 mmol, 4.0 eq.) Boran-NN-Diethylanilin-Komplex versetzt. Nach beendeter Gasentwicklung wird auf O0C gekühlt, und 4.74 g (10.1 mmol, 1 eq.) der Verbindung aus Beispiel 2A, gelöst in 250 ml THF, werden zugegeben. Man lässt unter Rühren innerhalb von 18 h auf Raumtemperatur kommen. Nach erfolgter Umsetzung wird die Reaktionsmischung mit 20 ml Methanol versetzt und zur Trockene eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester-Mischungen).
Ausbeute: 4.33 g (91.1% d. Th.)
Der Enantiomerenüberschuss wird nach Methode 1 zu 94.0% ee bestimmt.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.99-1.19 (m, 6H), 1.29-2.41 (m, 14H), 2.53 (sept, IH), 2.93 (d, IH), 3.15-3.54 (m, 2H), 5.13 (m, IH), 7.73 (d, 2H), 7.94 (m, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 472 [M+H]+.
Beispiel 4A
((J'^-S'-ltter/.-ButyKdimethyOsilyπoxyJ^'-cyclopentyl^'-isopropyl-S'^'-dihydro-ό'H-spiro- [cyclobutan-l,7'-chinolin]-3'-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanon
4.00 g (8.48 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden unter Argon in 30 ml trockenem ToIu- ol vorgelegt. Anschließend werden 3.64 g (33.9 mmol, 4 eq.) 2,6-Lutidin bei Raumtemperatur zugegeben und das Gemisch auf -16°C gekühlt. Zu dieser Lösung werden 3.90 ml (17.0 mmol, 2 eq.) Trifluorrnethansulfonsäure-terf.-butyldimethylsilylester, gelöst in 10 ml Toluol, tropfenweise hinzugefügt. Nach 15 min wird auf O0C erwärmt und das Reaktionsgemisch weitere 80 min bei dieser Temperatur gerührt. Zur Aufarbeitung werden 124 ml 0.1 N Salzsäure hinzugefügt und das Gemisch nach Erwärmung auf Raumtemperatur mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird mit einer 1 : 1 -Mischung aus gesättigter Kochsalz-Lösung und gesättigter Natriumhydro- gencarbonat-Lösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden noch zweimal mit Essigsäureethylester rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 9:1).
Ausbeute: 4.61 g (92.7% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.12 (s, 3H), 0.23 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 1.06 (d, 3H), 1.12 (d, 3H), 1.24-2.12 (m, 14H), 2.19-2.35 (m, 2H), 2.51 (m, IH), 2.89-3.44 (m, 3H), 5.17 (m, IH), 7.73 (d, 2H), 7.84-8.02 (m, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 586 [M+H]+.
Beispiel 5A
(^-((J'^-S'-ft^^.-ButyKdimethyOsilylJoxyJ^'-cyclopentyl^'-isopropyl-S'.δ'-dihydro-ό'H-spiro- [cyclobutan-l^'-chinolin^S'-yl^^trifluormethyOphenylJmethanol
Zu einer Lösung von 2.71 g (4.6 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A in 46 ml trockenem THF werden bei 00C 5.1 ml einer 1 M Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (5.1 mmol, 1.1 eq.) in THF getropft. Es wird unter Rühren innerhalb von 3.5 h auf Raumtemperatur erwärmt. Zur Aufarbei- tung werden 120 ml einer gesättigten Natrium-Kaliumtartrat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Nach Abklingen der Gasentwicklung wird viermal mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt und dabei die Produkt-Diastereomere aufgetrennt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 95:5).
Ausbeute: 1.39 g (51.2% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.16 (s, 3H), 0.25 (s, 3H), 0.67-0.98 (m, 18H), 1.02-2.34 (m, 14H), 2.80-3.76 (m, 4H), 5.19 (m, IH), 6.21 (br. s, IH), 7.43 (d, 2H), 7.59 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 588 [M+H]+
LC/MS (Methode 3): R, = 3.03 min.
svn-Diastereomer:
(^-((J'^-S'-lt/er/.-ButyKdimethyOsilyljoxyJ^'-cyclopentyl^'-isopropyl-S'^'-dihydro-o'H-spiro- [cyclobutan-l^'-chinolinj-S'-yO^^trifluormethy^phenyljmethanol
Ausbeute: 1.04 g (38.1% d. Th.).
Beispiel 6A
(5'1S)-51-{[/er/.-Butyl(dimethyl)silyl]oxy}-4I-cyclopentyl-3l-{(5)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]- methylJ^'-isopropyl-S'jδ'-dihydro-ό'H-spirofcyclobutan-lJ'-chinolin]
Zu einer Lösung von 0.94 g ( 1.6 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5 A in 15 ml trockenem ToIu- ol werden bei -15°C unter Argon 0.42 ml Diethylaminoschwefeltrifluorid (3.2 mmol, 2.0 eq.) getropft. Es wird 5 h unter Erwärmung auf 00C gerührt. Zur Aufarbeitung werden unter Eisküh- lung 40 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Es wird insgesamt dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Anschließend werden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Filtration durch Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Essigsäureethylester 9: 1) gereinigt.
Ausbeute: 0.65 g (69.0% d. Th.)
Rf = 0.72 (Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1).
Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1
(i'^^'-Cyclopentyl-S'-i^-fluor^^trifluormethyOphenylJmethyO^'-isopropyl-S'.S'-dihydro-o'H- spiro[cyclobutan-l,7'-chinolin]-5'-ol
Zu einer Lösung von 0.65 g (1.1 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 6 ml trockenem THF werden bei O0C 4.4 ml einer 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (4.4 mmol, 4.0 eq.) in THF getropft. Die Reaktionsmischung wird 4 h im Eisbad gerührt. Zur Aufarbeitung wird mit 20 ml Essigsäureethylester verdünnt und mit 20 ml Wasser gewaschen. Die wässrige Phase wird zweimal mit je 20 ml Essigsäureethylester rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 50 ml gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographisch gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Iso- hexan/Essigsäureethylester 9: 1 → 4:1).
Ausbeute: 0.47 g (88.6% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.75 (d, 3H), 1.11 (d, 3H), 1.30-2.33 (m, 17H), 2.89 (m, IH), 2.89 und 3.33 (2d, 2H), 3.82 (s, IH), 5.12 (m, IH), 6.94 (d, IH), 7.35 (d, 2H), 7.62 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 476 [M+H]+
Rf = 0.14 (Isohexan/Essigsäureethylester 9:1).
B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
B-I. CETP-Inhibitions-Testung
B-1.1. Gewinnung von CETP
CETP wird aus humanem Plasma durch Differential-Zentrifugation und Säulenchromatographie in partiell gereinigter Form gewonnen und zum Test verwendet. Dazu wird humanes Plasma mit NaBr auf eine Dichte von 1.21 g pro ml eingestellt und 18 h bei 50.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Bodenfraktion (d >1.21 g/ml) wird auf eine Sephadex®-Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen, mit 0.15 M NaCl / 0.001 M TrisHCl pH 7.4 gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser eluiert. Die CETP-aktiven Fraktionen werden gepoolt, gegen 50 mM Natriumacetat pH 4.5 dialysiert und auf eine CM-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Mit einem linearen Gradienten (0-1 M NaCl) wird anschließend eluiert. Die gepoolten CETP-Fraktionen werden gegen 10 mM TrisHCl pH 7.4 dialysiert und anschließend durch Chromatographie über eine Mono Q®- Säule (Fa. Pharmacia) weiter gereinigt.
B-I.2. CETP-Fluoreszenztest
Messung der CETP-katalysierten Übertragung eines fluoreszierenden Cholesterinesters zwischen Liposomen [modifiziert nach der Vorschrift von Bisgaier et al., J. LipidRes. 34, 1625 (1993)]:
Zur Herstellung der Donorliposomen wird 1 mg Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-dodecanoat (Cholesteryl BODIPY® FL C12, Fa. Molecular Probes) mit 5.35 mg Triolein und 6.67 mg Phosphatidylcholin am Ultraschallbad unter leichtem Erwärmen in 600 μl Dioxan gelöst und diese Lösung sehr langsam unter Ultrabeschallung zu 63 ml 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA-Puffer pH 7.3 bei Raumtemperatur gegeben. Die Suspension wird anschließend unter N2-Atmosphäre 30 min im Branson-Ultraschallbad bei ca. 50 Watt beschallt, wobei die Temperatur auf ca. 200C gehalten wird.
Die Akzeptorliposomen werden analog aus 86 mg Cholesteryloleat, 20 mg Triolein und 100 mg Phosphatidylcholin, in 1.2 ml Dioxan und 114 ml des obigen Puffers gelöst, durch 30-minütige Ultrabeschallung bei 50 Watt (200C) gewonnen.
B-I.2.1. CETP-Fluoreszenztest mit angereichertem CETP
Zur Testung wird ein Testmix bestehend aus 1 Teil obigen Puffers, 1 Teil Donorliposomen und 2 Teilen Akzeptorliposomen verwendet. 50 μl Testmix werden mit 48 μl angereicherter CETP-Fraktion (1-3 μg), gewonnen über hydrophobe Chromatographie aus Humanplasma, sowie 2 μl einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.2. CETP-Fluoreszenztest mit humanem Plasma
42 μl (86% v/v) humanes Plasma (Sigma P9523) werden mit 6 μl (12% v/v) Donorliposomen so- wie 1 μl (2% v/v) einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 510/520 nm (Spaltbreite 2.5 nm) ist ein Maß für den CE- Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.3. Ex vtvo-CETP-Fluoreszenztest
80 μl Testmix werden mit 10 μl Puffer sowie 2 μl Serum versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.3. Gewinnung von radioaktiv markiertem HDL
50 ml frisches humanes EDTA-Plasma wird mit NaBr auf eine Dichte von 1.12 eingestellt und bei 40C im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm zentrifugiert. Die Oberphase wird zur Gewinnung von kaltem LDL verwendet. Die Unterphase wird gegen 3 x 4 Liter PDB-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3) dialysiert. Pro 10 ml Retentatvolumen werden anschließend 20 μl 3H-Cholesterin (Dupont NET-725; 1 μC/μl gelöst in Ethanol) hinzugesetzt und 72 h bei 37°C unter N2 inkubiert.
Der Ansatz wird dann mit NaBr auf die Dichte 1.21 eingestellt und im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm und 200C zentrifugiert. Man gewinnt die Oberphase und reinigt die Lipoprotein- fraktionen durch Gradientenzentrifugation. Dazu wird die isolierte, markierte Lipoproteinfraktion mit NaBr auf eine Dichte von 1.26 eingestellt. Je 4 ml dieser Lösung werden in Zentrifugenröhr- chen (SW 40-Rotor) mit 4 ml einer Lösung der Dichte 1.21 sowie 4.5 ml einer Lösung der Dichte
1.063 überschichtet (Dichtelösungen aus PDB-Puffer und NaBr) und anschließend 24 h bei 38.000 Upm und 200C im SW 40-Rotor zentrifugiert. Die zwischen der Dichte 1.063 und 1.21 liegende, das markierte HDL enthaltende Zwischenschicht wird gegen 3 x 100 Volumen PDB-Puffer bei 4°C dialysiert.
Das Retentat enthält radioaktiv markiertes 3H-CE-HDL, das auf ca. 5 x 106 cmp pro ml eingestellt zum Test verwendet wird.
B-I.4. CETP-SPA-Test
Zur Testung der CETP-Aktivität wird die Übertragung von 3H-Cholesterolester von humanen HD- Lipoproteinen auf biotinylierte LD-Lipoproteine gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Streptavidin-SPA®-beads (Fa. Amersham) beendet und die übertragene Radioaktivität direkt im Liquid Scintillation Counter bestimmt.
Im Testansatz werden 10 μl HDL-3H-Cholesterolester (ca. 50.000 cpm) mit 10 μl Biotin-LDL (Fa. Amersham) in 50 mM Hepes / 0.15 M NaCl / 0.1% Rinderserumalbumin (RSA) / 0.05% NaN3 pH 7.4 mit 10 μl CETP (1 mg/ml) und 3 μl einer Lösung der zu prüfenden Substanz in 10% DMSO / 1% RSA für 18 h bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl der SPA-Streptavidin-bead- Lösung (TRKQ 7005) zugesetzt, 1 h unter Schütteln weiter inkubiert und dann im Scintillations- Zähler gemessen. Als Kontrollen dienen entsprechende Inkubationen mit 10 μl Puffer, 10 μl CETP bei 4°C sowie 10 μl CETP bei 37°C.
Die in den Kontrollansätzen mit CETP bei 370C übertragene Aktivität wird als 100% Übertragung gewertet. Die Substanzkonzentration, bei der diese Übertragung auf die Hälfte reduziert ist, wird als IC50-WeIt angegeben.
B-II.1. Messung der ex v/vo-Aktivität an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Prüfung auf CETP-inhibitorische Aktivität werden die Substanzen transgenen hCETP-Mäusen aus eigener Zucht [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] oral mit der Schlundsonde verabreicht. Dazu werden männliche Tiere einen Tag vor Versuchsbeginn randomisiert Gruppen mit gleicher Tierzahl, in der Regel n = 4, zugeordnet. Vor der Substanzapplikation wird jeder Maus zur Bestimmung ihrer basalen CETP-Aktivität im Serum Blut durch Punktion des retroorbitalen Venen- plexus entnommen (Zeitpunkt Tl). Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation der Testsubstanz wird den Tieren ein zweites Mal Blut durch Punktion entnommen (Zeitpunkt T2), in der Regel 16 oder 24 h nach Substanzapplikation; gegebenenfalls kann dies aber auch zu einem anderen Zeitpunkt erfolgen.
Um die Hemmaktivität einer Substanz bewerten zu können, wird für jeden Zeitpunkt, also 16 bzw. 24 Stunden, eine entsprechende Kontrollgruppe eingesetzt, deren Tiere nur das Formulierungs- mittel ohne Substanz erhalten. Bei den Kontrolltieren erfolgen die zwei Blutentnahmen pro Tier wie bei den substanzbehandelten Tieren, um die Veränderung der CETP-Aktivität ohne Inhibitor über den entsprechenden Versuchszeitraum (16 bzw. 24 h) bestimmen zu können.
Die Blutproben werden nach Abschluß der Gerinnung zentrifυgiert und das Serum wird abpipettiert. Zur Bestimmung der CETP-Aktivität wird der Cholesterylester-Transport über 4 h bestimmt. Dazu werden im Testansatz in der Regel 2 μl Serum eingesetzt; der Test wird wie unter B-I.2.3. beschrieben durchgeführt.
Die Differenzen im Cholesterylester-Transport [pM CE/h (T2) - pM CE/h (Tl)] werden für jedes Tier berechnet und in den Gruppen gemittelt. Eine Substanz, die zu einem der Zeitpunkte den Cholesterylester-Transport um >20% herabsetzt, wird als wirksam angesehen.
B-II.2. Messung der in vi'vo-Wirksamkeit an Syrischen Goldhamstern
Zur Bestimmung der oralen Wirkung von CETP-Inhibitoren auf Serum-Lipoproteine und -Triglyceride werden 150-200 g schwere weibliche syrische Goldhamster aus eigener Zucht (Stamm BAY:DSN) verwendet. Die Tiere werden pro Käfig zu sechst gruppiert und zwei Wochen bei Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert.
Unmittelbar vor Versuchsbeginn und nach Abschluss der Substanzapplikation wird mittels retro- orbitaler Punktion des Venenplexus Blut entnommen, woraus nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur und 20 min Zentrifugation bei 30.000 g Serum gewonnen wird. Die Substanzen werden in 20% Solutol / 80% Wasser gelöst und mit Hilfe einer Schlundsonde peroral verabreicht. Die Kontrolltiere erhalten identische Volumina Lösungsmittel ohne Testsubstanz.
Die Bestimmung von Triglyceriden, Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin erfolgt mit Hilfe des Analysegeräts COBAS INTEGRA 400 plus (Fa. Roche Diagnostics) nach Angaben des Herstellers. Aus den Messwerten wird für jeden Parameter die durch Substanzbehandlung hervorgerufene prozentuale Veränderung für jedes Tier berechnet und als Mittelwert mit Standardabweichung pro Gruppe (n = 6 oder n = 12) angegeben. Sind die Substanzeffekte im Vergleich zur Lösungsmittel-behandelten Gruppe signifikant, wird der mittels t-Test ermittelte p- Wert hinzugefügt (* p <0.05; ** p <0.01 ; *** p <0.005).
B-II.3. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Bestimmung der oralen Wirkung auf Lipoproteine und Triglyceride wird transgenen Mäusen [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Vor
Versuchsbeginn wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen, um Cholesterin und Triglyceride im Serum zu bestimmen. Das Serum wird, wie oben für Hamster beschrieben, durch Inkubation bei
4°C über Nacht und anschließende Zentrifugation bei 6.000 g gewonnen. Nach drei Tagen wird den Mäusen wieder Blut entnommen, um Lipoproteine und Triglyceride erneut zu bestimmen. Die Veränderungen der gemessenen Parameter werden als prozentuale Veränderung gegenüber dem
Ausgangswert ausgedrückt. C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Verbindung kann folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluß der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt.
i.v.-Lösung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.
Experimenteller Teil zu Verbindungen der Formel (Id)
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
CE Cholesterinester
CETP Cholesterinester-Transferprotein
DAST Dimethylaminoschwefeltrifiuorid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DDQ 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon de Diastereomerenüberschuss
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
EDTA Ethylendiamm-N,NN',N'-tetraessigsäure ee Enantiomerenüberschuss eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) h - Stunde(n)
HDL High Density Lipoprotein
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDL Low Density Lipoprotein min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
NMR Kernresonanzspektroskopie
Rf Retentionsindex (bei Dünnschicht-Chromatographie)
R« Retentionszeit (bei HPLC)
SPA Scintillation Proximity Assay
TBAF Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMSOTf /erΛ-Butyldirnethylsilyl-trifluorrnethansulfonat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran HPLC- und LC/MS-Methoden:
Methode IA: Säule: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Isohexan/ 1-Propanol 97:3; Fluss: 1.0 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode IB: Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 μm; Eluent: Isohexan/ 1-Propanol 97.5:2.5; Fluss: 1.0 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode 2: Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B -> 0.5 min 2% B → 4.5 min 90% B → 9 min 90% B; Fluss: 0.75 ml/min; Temperatur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (LC/MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 2.5 min 30% A → 3.0 min 5% A → 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min → 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Beispiel IA
2,4-Dicyclopentyl-7,7-dimethyl-3-(4-trifluormethylbenzoyl)-4,6,7,8-tetrahydro-lH-chinolin-5-on
16.8 g (59.4 mmol, 1.0 eq.) 3-Amino-3-cyclopentyl-l-(4-trifluormethylphenyl)-propenon (Dar- Stellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 4) werden in 600 ml Diisopropylether vorgelegt und mit 9.16 ml (118.9 mmol, 2.0 eq.) Trifluoressigsäure und 8.3 g (59.4 mmol, 1 eq.) 5,5-Dimethylcyclo- hexan-l,3-dion versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 30 min werden 7.0 g (71.3 mmol, 1.2 eq.) Cyclopentancarbaldehyd zugegeben und die Mischung anschließend für 15 h am Wasserabscheider unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird erneut mit 1.0 g (10.2 mmol, 0.17 eq.) Cyclopentancarbaldehyd versetzt, wiederum zum Rückfluss erhitzt und das Lösungsmittel-Volumen auf ca. 500 ml reduziert. Die Mischung wird für weitere 20 h am Wasserabscheider unter Rückfluss erhitzt. Zur Aufarbeitung wird das Gemisch nach Abkühlen im Vakuum zur Trockene eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie an Kieselgel (Lauf- mittel: Isohexan/Essigsäureethylester 4: 1) vorgereinigt. Die so erhaltene Produktfraktion wird mit wenig Diisopropylether aufgenommen und bei Raumtemperatur für 16 h verrührt. Der erhaltene Niederschlag wird abgesaugt, mit kaltem Diisopropylether gewaschen und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit.
Ausbeute: 3.8 g (13% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.14 (s, 3H), 1.16 (s, 3H), 1.21-2.00 (m, 16H), 2.20 (m, IH), 2.28 und 2.51 (2d, 2H), 2.34 (s, 2H), 3.50 (sept, IH), 3.83 (d, IH), 5.91 (s, IH), 7.66 (d, 2H), 7.78 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 486 [M+H]+.
Beispiel 2A
2,4-Dicyclopentyl-7,7-dimethyl-3-(4-trifluoπnethylbenzoyl)-7,8-dihydro-6H-chmolin-5-on
3.79 g (7.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel IA werden in 78 ml Dichlormethan gelöst und bei 00C portionsweise mit 1.95 g (8.6 mmol, 1.1 eq.) 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ) versetzt. Es wird unter Rühren innerhalb von 3 h auf Raumtemperatur erwärmt. Die Mischung wird am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1, 4: 1).
Ausbeute: 3.53 g (93.6% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 1.10 (d, 3H), 1.17 (d, 3H), 1.35-1.97 (m, 16H), 2.51-2.71 (m, 3H), 2.94-3.15 (m, 3H), 7.75 (d, 2H), 7.93 (m, 2H) ppm. MS (ESIpos): m/z = 484 [M+H]+.
Beispiel 3A
[(55)-2,4-Dicyc]opentyl-5-hydroxy-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-3-yl](4-trifluormethyl- phenyl)-methanon
87 mg (0.58 mmol, 0.08 eq.) (/./?, 25)- l-Aminoindan-2-ol werden in 340 ml THF vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 4.76 g (29.2 mmol, 4.0 eq.) Boran-NN-Diethylanilin-Komplex versetzt. Nach beendeter Gasentwicklung wird auf 00C gekühlt, und 3.53 g (7.3 mmol, 1 eq.) der Verbindung aus Beispiel 2A, gelöst in 25 ml THF, werden zugegeben. Man lässt unter Rühren innerhalb von 16 h auf Raumtemperatur kommen. Nach erfolgter Umsetzung wird die Reaktionsmischung mit 20 ml Methanol versetzt und eingeengt. Der Rückstand wird zwischen 150 ml Wasser und 150 ml Essig- säureethylester verteilt. Die wässrige Phase wird zweimal mit je 100 ml Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 50 ml gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Anschließend wird das Rohprodukt durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäure- ethylester 100:0, dann 4:1).
Ausbeute: 3.13 g (88.2% d. Th.)
Der Enantiomerenüberschuss wird nach Methode IA zu 93.5% ee bestimmt.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.00 (m, 3H), 1.23 (m, 3H), 1.29-2.03 (m, 19H), 2.56 (m, IH), 2.64-3.08 (m, 2H), 3.29 (m, IH), 5.17 (m, IH), 7.73 (d, 2H), 7.93 (m, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 486 [M+H]+.
Beispiel 4A
((i^-S-lf/ert.-ButyKdimethyOsilylloxyj^^-dicyclopentyl^J-dimethyl-S.όJ.δ-tetrahydrochino- lin-3 -yl) [4-(tri fluormethyl)phenyl] -methanon
3.12 g (6.43 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden unter Argon in 64 ml trockenem ToIu- ol vorgelegt. Anschließend werden 2.76 g (25.7 mmol, 4 eq.) 2,6-Lutidin bei Raumtemperatur hinzugegeben und das Gemisch auf -18°C gekühlt. Zu dieser Lösung werden 2.95 ml (12.9 mmol, 2 eq.) Trifluormethansulfonsäure-/er/.-butyldimethylsilylester tropfenweise hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wird 2 h bei O0C gerührt. Zur Aufarbeitung wird gesättigte Ammoniumchlorid- Lösung (100 ml) hinzugegeben und das Gemisch nach Erwärmung auf Raumtemperatur mit Essig- säureethylester extrahiert. Die wässrige Phase wird noch zweimal mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1).
Ausbeute: 3.90 g (quantitativ)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.08 (s, 3H), 0.18 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.91 (s, 3H), 1.24 (s, 3H), 1.28-2.06 (m, 18H), 2.47-3.23 (m, 3H), 3.32 (m, IH), 5.20 (m, IH), 7.73 (d, 2H), 7.81-8.03 (m, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 600 [M+H]+.
Beispiel 5A
(5)-((5.S)-5-{[rerΛ-Butyl(dimethyl)silyl]oxy}-2,4-dicyclopentyl-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydro- chinolin-3-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanol
Zu einer Lösung von 3.9 g (6.5 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A in 65 ml trockenem THF werden bei 00C 9.8 ml einer 1 M Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (9.8 mmol, 1.5 eq.) in THF getropft. Es wird 4 h bei 00C nachgerührt. Zur Aufarbeitung werden 120 ml einer gesättigten Natrium-Kaliumtartrat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Nach Abklingen der Gasentwicklung wird dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter
Ammoniumchlorid-Lösung sowie mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt und dabei die Produkt-Diastereomere aufgetrennt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäure- ethylester 95:5).
Ausbeute: 1.87 g (47.8% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.13 (s, 3H), 0.19 (s, 3H), 0.82-0.97 (m, 15H), 1.09-2.12 (m, 18H), 2.19 (m, IH), 2.56 (d, IH), 2.86-3.05 (m, 2H), 3.70 (m, IH), 5.21 (t, IH), 6.23 (br. s, IH), 7.42 (d, 2H), 7.59 (d, 2H) ppm.
MS (DCI) : m/z = 602 [M+H]+
Rf = 0.26 (Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1).
svn-Diastereomer:
(^-((JSJ-S-IC/er/.-ButyKdimethyOsilyηoxyJ^^-dicyclopentyl-T^-dimethyl-S.ό.T^-tetrahydro- chinolin-3-yl) [4-(tri fluormethyl)phenyl] methanol
Ausbeute: 2.16 g (53.9% d. Th.)
Rf = 0.34 (Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1). Beispiel 6A
(55)-5-{[/e^.-Butyl(dirnethyl)silyl]oxy}-2,4-dicyclopentyl-3-{(S)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]- methyl}-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrochinolin
Zu einer Lösung von 1.78 g (3.0 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 29 ml trockenem Di- chlormethan werden bei -17°C unter Argon 0.59 ml Diethylaminoschwefeltrifluorid (4.4 mmol, 1.5 eq.) getropft. Es wird auf -66°C gekühlt und anschließend unter Rühren innerhalb von 6 h wieder auf 00C erwärmt. Die Reaktionslösung wird erneut auf -78°C gekühlt und mit weiteren 0.25 ml Diethylaminoschwefeltrifluorid (1.9 mmol, 0.64 eq.) versetzt. Danach wird innerhalb von 16 h unter Rühren auf 100C erwärmt. Zur Aufarbeitung werden unter Eiskühlung 40 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Es wird insgesamt dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Anschließend werden die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Filtration durch Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Essig- säureethylester 9:1) gereinigt.
Ausbeute: 1.67 g (93.3% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.13 (s, 3H), 0.19 (s, 3H), 0.90 (3, 9H), 0.93 (s, 3H), 1.21 (s, 3H), 1.58-2.15 (m, 17H), 2.51-3.05 (m, 4H), 3.70 (m, IH), 5.21 (t, IH), 6.92 (d, IH), 7.38 (d, 2H), 7.62 (d, 2H) ppm.
HPLC (Methode 2): R, = 6.30 min.
MS (ESIpos): m/z = 604 [M+H]+
Rf = 0.68 (Isohexan/Essigsäureethylester 9:1). Ausführungsbeispiele:
Beispiel 1
(5S)-2,4-Dicyclopentyl-3-{(S)-fluor[4-(trifluoiτnethyl)phenyl]methyl}-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetra- hydrochinolin-5 -ol
Zu einer Lösung von 1.67 g (2.8 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 16 ml trockenem THF werden bei 00C 11.0 ml einer 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (1 1.0 mmol, 4.0 eq.) in THF getropft. Die Reaktionsmischung wird 4 h im Eisbad gerührt. Zur Aufarbeitung wird mit 100 ml Essigsäureethylester verdünnt und zweimal mit je 100 ml Wasser sowie mit 50 ml gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographisch gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1 -> 4:1).
Ausbeute: 0.74 g (55.1% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 1.02 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.34-2.19 (m, 18H), 2.61-2.97 (m, 3H), 3.72 (m, IH), 3.84 (sept, IH), 5.14 (q, IH), 6.96 (d, IH), 7.34 (d, 2H), 7.61 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 490 [M+H]+
Rf = 0.13 (Isohexan/Essigsäureethylester 9: 1).
Die weitere Abtrennung von im Produkt noch enthaltenen Diastereomeren erfolgt chromatographisch (Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 20 mm, 5 μm; Eluent: Isohexan/Isopropanol 97:3; Fluss: 15 ml/min).
Ausbeute: 0.57 g (42.4% d. Th.).
HPLC (Methode IB): R1 = 5.60 min. B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
B-I. CETP-Inhibitions-Testung
B-1.1. Gewinnung von CETP
CETP wird aus humanem Plasma durch Differential-Zentrifugation und Säulenchromatographie in partiell gereinigter Form gewonnen und zum Test verwendet. Dazu wird humanes Plasma mit NaBr auf eine Dichte von 1.21 g pro ml eingestellt und 18 h bei 50.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Bodenfraktion (d >1.21 g/ml) wird auf eine Sephadex®-Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen, mit 0.15 M NaCl / 0.001 M TrisHCl pH 7.4 gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser eluiert. Die CETP-aktiven Fraktionen werden gepoolt, gegen 50 mM Natriumacetat pH 4.5 dialysiert und auf eine CM-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Mit einem linearen Gradienten (0-1 M NaCl) wird anschließend eluiert. Die gepoolten CETP-Fraktionen werden gegen 10 mM TrisHCl pH 7.4 dialysiert und anschließend durch Chromatographie über eine Mono Q®- Säule (Fa. Pharmacia) weiter gereinigt.
B-I.2. CETP-Fluoreszenztest
Messung der CETP -katalysierten Übertragung eines fluoreszierenden Cholesterinesters zwischen Liposomen [modifiziert nach der Vorschrift von Bisgaier et al., J. Lipid Res. 34, 1625 (1993)]:
Zur Herstellung der Donorliposomen wird 1 mg Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-dodecanoat (Cholesteryl BODIPY® FL Ci2, Fa. Molecular Probes) mit 5.35 mg Triolein und 6.67 mg Phosphatidylcholin am Ultraschallbad unter leichtem Erwärmen in 600 μl Dioxan gelöst und diese Lösung sehr langsam unter Ultrabeschallung zu 63 ml 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA-Puffer pH 7.3 bei Raumtemperatur gegeben. Die Suspension wird anschließend unter N2-Atmosphäre 30 min im Branson-Ultraschallbad bei ca. 50 Watt beschallt, wobei die Temperatur auf ca. 2O0C gehalten wird.
Die Akzeptorliposomen werden analog aus 86 mg Cholesteryloleat, 20 mg Triolein und 100 mg Phosphatidylcholin, in 1.2 ml Dioxan und 114 ml des obigen Puffers gelöst, durch 30-minütige Ultrabeschallung bei 50 Watt (200C) gewonnen.
B-I.2.1. CETP-Fluoreszenztest mit angereichertem CETP
Zur Testung wird ein Testmix bestehend aus 1 Teil obigen Puffers, 1 Teil Donorliposomen und 2 Teilen Akzeptorliposomen verwendet. 50 μl Testmix werden mit 48 μl angereicherter CETP-Fraktion (1-3 μg), gewonnen über hyd Iro- phobe Chromatographie aus Humanplasma, sowie 2 μl einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.2. CETP-Fluoreszenztest mit humanem Plasma
42 μl (86% v/v) humanes Plasma (Sigma P9523) werden mit 6 μl (12% v/v) Donorliposomen so- wie 1 μl (2% v/v) einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 510/520 nm (Spaltbreite 2.5 nm) ist ein Maß für den CE- Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.3. Ex v/vo-CETP-Fluoreszenztest
80 μl Testmix werden mit 10 μl Puffer sowie 2 μl Serum versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.3. Gewinnung von radioaktiv markiertem HDL
50 ml frisches humanes EDTA-Plasma wird mit NaBr auf eine Dichte von 1.12 eingestellt und bei 40C im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm zentrifugiert. Die Oberphase wird zur Gewinnung von kaltem LDL verwendet. Die Unterphase wird gegen 3 x 4 Liter PDB-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3) dialysiert. Pro 10 ml Retentatvolumen werden anschließend 20 μl 3H-Cholesterin (Dupont NET-725; 1 μC/μl gelöst in Ethanol) hinzugesetzt und 72 h bei 37°C unter N2 inkubiert.
Der Ansatz wird dann mit NaBr auf die Dichte 1.21 eingestellt und im Ty 65 -Rotor 18 h bei 50.000 Upm und 200C zentrifugiert. Man gewinnt die Oberphase und reinigt die Lipoprotein- fraktionen durch Gradientenzentrifugation. Dazu wird die isolierte, markierte Lipoproteinfraktion mit NaBr auf eine Dichte von 1.26 eingestellt. Je 4 ml dieser Lösung werden in Zentrifugenröhr- chen (SW 40-Rotor) mit 4 ml einer Lösung der Dichte 1.21 sowie 4.5 ml einer Lösung der Dichte
1.063 überschichtet (Dichtelösungen aus PDB-Puffer und NaBr) und anschließend 24 h bei 38.000 Upm und 200C im SW 40-Rotor zentrifugiert. Die zwischen der Dichte 1.063 und 1.21 liegende, das markierte HDL enthaltende Zwischenschicht wird gegen 3 x 100 Volumen PDB-Puffer bei 4°C dialysiert.
Das Retentat enthält radioaktiv markiertes 3H-CE-HDL, das auf ca. 5 x 106 cmp pro ml eingestellt zum Test verwendet wird.
B-I.4. CETP-SPA-Test
Zur Testung der CETP-Aktivität wird die Übertragung von 3H-Cholesterolester von humanen HD- Lipoproteinen auf biotinylierte LD-Lipoproteine gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Streptavidin-SPA®-beads (Fa. Amersham) beendet und die übertragene Radioaktivität direkt im Liquid Scintillation Counter bestimmt.
Im Testansatz werden 10 μl HDL-3H-Cholesterolester (ca. 50.000 cpm) mit 10 μl Biotin-LDL (Fa. Amersham) in 50 mM Hepes / 0.15 M NaCl / 0.1% Rinderserumalbumin (RSA) / 0.05% NaN3 pH 7.4 mit 10 μl CETP (1 mg/ml) und 3 μl einer Lösung der zu prüfenden Substanz in 10% DMSO / 1% RSA für 18 h bei 370C inkubiert. Anschließend werden 200 μl der SPA-Streptavidin-bead- Lösung (TRKQ 7005) zugesetzt, 1 h unter Schütteln weiter inkubiert und dann im Scintillations- Zähler gemessen. Als Kontrollen dienen entsprechende Inkubationen mit 10 μl Puffer, 10 μl CETP bei 40C sowie 10 μl CETP bei 370C.
Die in den Kontrollansätzen mit CETP bei 37°C übertragene Aktivität wird als 100% Übertragung gewertet. Die Substanzkonzentration, bei der diese Übertragung auf die Hälfte reduziert ist, wird als IC50-Wert angegeben.
B-H 1. Messung der ex v/vo-Aktivität an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Prüfung auf CETP-inhibitorische Aktivität werden die Substanzen transgenen hCETP-Mäusen aus eigener Zucht [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] oral mit der Schlundsonde verabreicht. Dazu werden männliche Tiere einen Tag vor Versuchsbeginn randomisiert Gruppen mit gleicher Tierzahl, in der Regel n = 4, zugeordnet. Vor der Substanzapplikation wird jeder Maus zur Bestimmung ihrer basalen CETP-Aktivität im Serum Blut durch Punktion des retroorbitalen Venen- plexus entnommen (Zeitpunkt Tl). Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation der Testsubstanz wird den Tieren ein zweites Mal Blut durch Punktion entnommen (Zeitpunkt T2), in der Regel 16 oder 24 h nach Substanzapplikation; gegebenenfalls kann dies aber auch zu einem anderen Zeitpunkt erfolgen.
Um die Hemmaktivität einer Substanz bewerten zu können, wird für jeden Zeitpunkt, also 16 bzw. 24 Stunden, eine entsprechende Kontrollgruppe eingesetzt, deren Tiere nur das Formulierungs- mittel ohne Substanz erhalten. Bei den Kontrolltieren erfolgen die zwei Blutentnahmen pro Tier wie bei den substanzbehandelten Tieren, um die Veränderung der CETP-Aktivität ohne Inhibitor über den entsprechenden Versuchszeitraum (16 bzw. 24 h) bestimmen zu können.
Die Blutproben werden nach Abschluss der Gerinnung zentrifugiert und das Serum wird abpipettiert. Zur Bestimmung der CETP-Aktivität wird der Cholesterylester-Transport über 4 h bestimmt. Dazu werden im Testansatz in der Regel 2 μl Serum eingesetzt; der Test wird wie unter B-1.2.3. beschrieben durchgeführt.
Die Differenzen im Cholesterylester-Transport [pM CE/h (T2) - pM CE/h (Tl)] werden für jedes Tier berechnet und in den Gruppen gemittelt. Eine Substanz, die zu einem der Zeitpunkte den Cholesterylester-Transport um >20% herabsetzt, wird als wirksam angesehen.
B-II.2. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an Syrischen Goldhamstern
Zur Bestimmung der oralen Wirkung von CETP-Inhibitoren auf Serum-Lipoproteine und -Triglyceride werden 150-200 g schwere weibliche syrische Goldhamster aus eigener Zucht (Stamm BAYrDSN) verwendet. Die Tiere werden pro Käfig zu sechst gruppiert und zwei Wochen bei Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert.
Unmittelbar vor Versuchsbeginn und nach Abschluss der Substanzapplikation wird mittels retro- orbitaler Punktion des Venenplexus Blut entnommen, woraus nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur und 20 min Zentrifugati on bei 30.000 g Serum gewonnen wird. Die Substanzen werden in 20% Solutol / 80% Wasser gelöst und mit Hilfe einer Schlundsonde peroral verabreicht. Die Kontrolltiere erhalten identische Volumina Lösungsmittel ohne Testsubstanz.
Die Bestimmung von Triglyceriden, Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin erfolgt mit Hilfe des Analysegeräts COBAS INTEGRA 400 plus (Fa. Roche Diagnostics) nach Angaben des Herstellers. Aus den Messwerten wird für jeden Parameter die durch Substanzbehandlung hervorgerufene prozentuale Veränderung für jedes Tier berechnet und als Mittelwert mit Standardabweichung pro Gruppe (n = 6 oder n = 12) angegeben. Sind die Substanzeffekte im Vergleich zur Lösungsmittel-behandelten Gruppe signifikant, wird der mittels t-Test ermittelte p- Wert hinzugefügt (* p <0.05; ** p <0.01 ; *** p <0.005).
B-II.3. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Bestimmung der oralen Wirkung auf Lipoproteine und Triglyceride wird transgenen Mäusen [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Vor
Versuchsbeginn wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen, um Cholesterin und Triglyceride im Serum zu bestimmen. Das Serum wird, wie oben für Hamster beschrieben, durch Inkubation bei
4°C über Nacht und anschließende Zentrifugation bei 6.000 g gewonnen. Nach drei Tagen wird den Mäusen wieder Blut entnommen, um Lipoproteine und Triglyceride erneut zu bestimmen. Die Veränderungen der gemessenen Parameter werden als prozentuale Veränderung gegenüber dem
Ausgangswert ausgedrückt.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Verbindung kann folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:
Tablette:
Zusammensetzun g :
100 mg der erfmdungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung:
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfϊndungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefugt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfϊndungs- gemäßen Verbindung fortgesetzt.
i.v.-Lösung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.
Experimenteller Teil zu Verbindungen der Formel (Ie)
A. Beispiele
Abkürzungen und Akronyme:
CE Cholesterinester
CETP Cholesterinester-Transferprotein
DAST Dimethylaminoschwefeltrifluorid
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DDQ 2,3 -Dichlor-5 ,6-dicyano- 1 ,4-benzochinon de Diastereomerenüberschuss
DMF NN-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid d. Th. der Theorie (bei Ausbeute)
EDTA Ethylendiamin-NNN',N-tetraessigsäure ee Enantiomerenüberschuss eq. Äquivalent(e)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) h Stunde(n)
HDL High Density Lipoprotein
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
LC/MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDL Low Density Lipoprotein min Minute(n)
MS Massenspektroskopie
NMR Kernresonanzspektroskopie
Rf Retentionsindex (bei Dünnschicht-Chromatographie)
R. Retentionszeit (bei HPLC)
SPA Scintillation Proximity Assay
TBAF Tetrabutylammoniumfiuorid
TBDMSOTf /erΛ-Butyldimethylsilyl-trifluormethansulfonat
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran HPLC- und LC/MS-Methoden:
Methode IA: Säule: Chiralpak IA, 250 mm x 4.6 mm; Eluent: Isohexan/ 1 -Propanol 97:3; Fluss: 1.0 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode IB: Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 μm; Eluent: Isohexan/Isopropanol 97.5:2.5; Fluss: 1.0 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode IC: Säule: Chiralpak AD, 250 mm x 4.6 mm, 10 μm; Eluent: Isohexan/Isopropanol 97.5:2.5; Fluss: 1.5 ml/min; UV-Detektion: 254 nm.
Methode 2: Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HC1O4/1 Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2% B → 0.5 min 2% B -> 4.5 min 90% B → 9 min 90% B; Fluss: 0.75 ml/min; Temperatur: 300C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (LC/MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%-ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A → 2.5 min 30% A → 3.0 min 5% A → 4.5 min 5% A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min → 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Beispiel IA
4-Cyclohexyl-2-isopropyl-7,7-dimethyl-3-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-4,6,7,8-tetrahydrochinolin- 5(/H)-on
5.0 g (19.4 mmol, 1.2 eq.) 3-Amino-3-isopropyl-l-(4-trifluormethylphenyl)-propenon (Darstellung gemäß WO 03/028727, Beispiel 2) werden in 150 ml Diisopropylether vorgelegt und mit 2.50 ml (32.4 mmol, 2.0 eq.) Trifluoressigsäure und 2.3 g (16.2 mmol, 1 eq.) 5,5-Dimethylcyclohexan-l,3- dion versetzt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 10 min werden 2.7 g (24.3 mmol, 1.5 eq.) Cyclohexancarbaldehyd zugegeben. Anschließend wird die Mischung für 18 h am Wasserabscheider unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wird für 30 min im Eisbad gerührt, der erhaltene Nie- derschlag abgesaugt, mit kaltem Diisopropylether gewaschen und im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit.
Ausbeute: 2.63 g (34.3% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.78-1.36 (m, 6H), 1.04 (d, 3H), 1.16 (2s, 6H), 1.29 (d, 3H), 1.28 (d, 3H), 1.46-1.67 (m, 5H), 2.32 und 2.49 (2d, 2H), 2.34 (s, 2H), 3.46 (sept, IH), 3.75 (d, IH), 5.89 (s, IH), 7.65 (d, 2H), 7.77 (d, 2H) ppm.
MS (DCI): m/z = 474 [M+H]+.
Beispiel 2A
4-Cyclohexyl-2-isopropyl-7,7-dimethyl-3-[4-(trifluormethyl)benzoyl]-7,8-dihydrochinolin-5((5H)- on
2.30 g (4.9 mmol) der Verbindung aus Beispiel IA werden in 50 ml Dichlormethan gelöst und bei 00C portionsweise mit 1.10 g (4.9 mmol, 1 eq.) 2,3-Dichlor-5,6-dicyano-l,4-benzochinon (DDQ) versetzt. Es wird 1 h bei O0C und anschließend 18 h bei Raumtemperatur nachgerührt. Die Mischung wird am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand durch Chromatographie ge- reinigt (Kieselgel, Laufmittel: Cyclohexan/Essigsäureethylester 5:1).
Ausbeute: 2.16 g (94.2% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 1.00-1.89 (m, 10H), 1.08 (d, 3H), 1.11 (s, 3H), 1.14 (d, 3H), 1.17 (s, 3H), 2.48-2.69 (m, 3H), 3.09 (s, 2H), 3.27 (m, IH), 7.75 (d, 2H), 7.94 (m, 2H) ppm. MS (DCI): m/z = 472 [M+H]+.
Beispiel 3A
[(55)-4-Cyclohexyl-5-hydroxy-2-isopropyl-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-3-yl][4-(tri- fluormethyl)phenyl]methanon
55 mg (0.37 mmol, 0.08 eq.) (7Ä,25)-l-Aminoindan-2-ol werden in 115 ml THF vorgelegt und bei Raumtemperatur mit 2.98 g (18.3 mmol, 4.0 eq.) Boran-N,N-Diethylanilin-Komplex versetzt. Nach beendeter Gasentwicklung wird auf 00C gekühlt, und 2.16 g (4.6 mmol, 1 eq.) der Verbindung aus Beispiel 2A, gelöst in 115 ml THF, werden zugegeben. Man lässt unter Rühren innerhalb von 18 h auf Raumtemperatur kommen. Nach erfolgter Umsetzung wird die Reaktionsmischung mit 20 ml Methanol versetzt und zur Trockene eingeengt. Anschließend wird das Rohprodukt durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester-Mischungen).
Ausbeute: 2.01 g (93.0% d. Th.)
Der Enantiomerenüberschuss wird nach Methode IA zu 88% ee bestimmt.
Die Enantiomere werden durch Chromatographie an chiraler Phase getrennt (Säule: Chiralpak AD- H, 250 mm x 20 mm, 20 μm; Eluent: Isohexan/Isopropanol 97:3; Fluss: 15 ml/min):
Ausbeute: 1.70 g (78.5% d. Th.)
Der Enantiomerenüberschuss wird nach Methode IA zu >99% ee bestimmt; Rt (Methode IA) = 5.22 min.
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.88-2.12 (m, 26H), 2.50 (sept, IH), 2.71 (d, IH), 2.98 (d, IH), 5.18 (m, IH), 7.45-8.50 (br. m, 4H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 474 [M+H]+. Beispiel 4A
((J^-S-lf/er/.-ButylCdimethyOsilylJoxyJ^-cyclohexyl^-isopropyl-VJ-dimethyl-S.oJ^-tetra- hydrochinolin-3-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanon
2.82 g (5.95 mmol) der Verbindung aus Beispiel 3A werden unter Argon in 22 ml trockenem ToIu- ol vorgelegt. Anschließend werden 2.55 g (23.8 mmol, 4 eq.) 2,6-Lutidin bei Raumtemperatur hinzugegeben und das Gemisch auf -16°C gekühlt. Zu dieser Lösung werden 2.74 ml (11.9 mmol, 2 eq.) Trifluormethansulfonsäure-terΛ-butyldimethylsilylester, gelöst in 7 ml Toluol, tropfenweise hinzugefügt. Nach 15 min wird auf 00C erwärmt und das Reaktionsgemisch weitere 80 min bei dieser Temperatur gerührt. Zur Aufarbeitung werden 124 ml 0.1 N Salzsäure hinzugefügt und das Gemisch nach Erwärmung auf Raumtemperatur mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird mit einer l :l-Mischung aus gesättigter Kochsalz-Lösung und gesättigter Natriumhydro- gencarbonat-Lösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen werden noch zweimal mit Essigsäureethylester rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Natrium- sulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird durch Chromatographie gereinigt (Kieselgel, Laufmittel: Isohexan/Essigsäureethylester 9:1).
Ausbeute: 3.17 g (90.7% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.14 (s, 3H), 0.19 (s, 3H), 0.86 (s, 9H), 0.65-1.83 (m, 24H), 1.96- 2.07 (m, IH), 2.47 (m, IH), 2.63 (m, IH), 3.10 (m, IH), 5.25 (m, IH), 7.43-8.54 (br. m, 4H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 588 [M+H]+.
Beispiel 5A
(-^-((J^-S-lt/erΛ-ButyKdimethyOsilylJoxyJ^-cyclohexyl^-isopropyl-T^-dimethyl-S.όJ^-tetra- hydrochinolin-3-yl)[4-(trifluormethyl)phenyl]methanol
Zu einer Lösung von 3.17 g (5.4 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A in 75 ml trockenem THF werden bei 00C 5.9 ml einer 1 M Lösung von Lithiumaluminiumhydrid (5.9 mmol, 1.1 eq.) in THF getropft. Es wird unter Rühren innerhalb von 5 h auf Raumtemperatur erwärmt. Zur Aufarbeitung werden 120 ml einer gesättigten Natrium-Kaliumtartrat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Nach Abklingen der Gasentwicklung wird viermal mit Essigsäureethylester extrahiert, die vereinten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird chromatographisch gereinigt und dabei die Produkt-Diastereomere aufgetrennt (Säule: Chiralpak AD, 500 mm x 40 mm, 20 μm; Eluent: Iso- hexan/Isopropanol 97.5:2.5; Fluss: 50 ml/min; Temperatur: 24°C; UV-Detektion: 254 nm).
Ausbeute: 0.95 g (29.8% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.20 (br. s, 6H), 0.76-2.03 (m, 30H), 1.02-2.34 (m, 14H), 2.17 (m, IH), 2.43-3.10 (m, 3H), 3.36 (m, IH), 5.26 (m, IH), 6.66 (br. s, IH), 7.32-7.65 (m, 4H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 590 [M+H]+
LC/MS (Methode 3): R, = 3.03 min.
HPLC (Methode IB): R, = 2.84 min.
svn-Diastereomer:
(^-((i^-S-ft^r/.-ButyKdimethyOsilylloxyJ^-cyclohexyl^-isopropyl-T^-dimethyl-S^J.δ-tetra- hydrochinolin-3 -yl) [4-(tri fluormethyl)phenyl] methanol
Ausbeute: 1.25 g (39.2% d. Th.).
Beispiel 6A
(5S)-5-{ [tert.-Butyl(dimethyl)silyl]oxy} -4-cyclohexyl-3- {(1S)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]- methyl}-2-isopropyl-7,7-dimethyl-5,6,7,8-tetrahydrochinolin
Zu einer Lösung von 1.35 g (2.3 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A in 30 ml trockenem ToIu- ol werden bei -600C unter Argon 0.45 ml Diethylaminoschwefeltrifluorid (3.4 mmol, 1.5 eq.) getropft. Es wird 3 h unter Erwärmung auf -100C gerührt. Zur Aufarbeitung werden unter Eiskühlung 40 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung vorsichtig hinzugefügt. Es wird insgesamt dreimal mit Essigsäureethylester extrahiert. Anschließend werden die vereinten organischen Phasen mit gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird durch Filtration durch Kieselgel (Laufmittel: Cyclo- hexan/Essigsäureethylester 9: 1) gereinigt.
Ausbeute: 1.28 g (94.8% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): δ = 0.20 (br. s, 6H), 0.71 (d, 3H), 0.91 (s, 9H), 0.77-2.06 (m, 21H), 2.60 und 3.03 (2d, 2H), 2.78 (m, IH). 3.36 (m, IH), 5.25 (m, IH), 7.10-7.50 (m, 3H), 7.63 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 592 [M+H]+.
Ausfuhrungsbeispiele:
Beispiel 1
(5S)-4-Cyclohexyl-3- {(S)-fluor[4-(trifluormethyl)phenyl]methyl } -2-isopropyl-7,7-dimethyl- 5,6,7,8-tetrahydrochinolin-5-ol
Zu einer Lösung von 1.28 g (2.2 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A in 25 ml trockenem THF werden bei 00C 5.4 ml einer 1 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid (5.4 mmol, 2.5 eq.) in THF getropft. Es wird 4 h im Eisbad gerührt. Zur Aufarbeitung wird mit 20 ml Essigsäureethyl- ester verdünnt und mit 20 ml Wasser gewaschen. Die wässrige Phase wird zweimal mit je 20 ml Essigsäureethylester rückextrahiert. Die vereinten organischen Phasen werden mit 50 ml gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wird chromatographisch gereinigt und dabei noch enthaltene Diastereomere abgetrennt (Säule: Chiralpak AD-H, 250 mm x 20 mm, 5 μm; Eluent: Isohexan/Isopropanol 97:3; Fluss: 25 ml/min).
Ausbeute: 0.67 g (65.3% d. Th.)
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.60 (d, 3H), 1.03 (s, 3H), 1.12 (d, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.08-1.51 (m, 4H), 1.67-2.14 (m, 9H), 2.61-2.94 (m, 3H), 3.52 (m, IH), 5.14 (m, IH), 7.33 (d, 2H), 7.37 (d, IH), 7.61 (d, 2H) ppm.
MS (ESIpos): m/z = 478 [M+H]+
HPLC (Methode IC): R, = 4.33 min. B. Bewertung der pharmakologischen Wirksamkeit
B-I. CETP-Inhibitions-Testung
B-Ll. Gewinnung von CETP
CETP wird aus humanem Plasma durch Differential-Zentrifugation und Säulenchromatographie in partiell gereinigter Form gewonnen und zum Test verwendet. Dazu wird humanes Plasma mit NaBr auf eine Dichte von 1.21 g pro ml eingestellt und 18 h bei 50.000 Upm und 4°C zentrifugiert. Die Bodenfraktion (d >1.21 g/ml) wird auf eine Sephadex®-Phenyl-Sepharose 4B-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen, mit 0.15 M NaCl / 0.001 M TrisHCl pH 7.4 gewaschen und anschließend mit destilliertem Wasser eluiert. Die CETP-aktiven Fraktionen werden gepoolt, gegen 50 mM Natriumacetat pH 4.5 dialysiert und auf eine CM-Sepharose®-Säule (Fa. Pharmacia) aufgetragen. Mit einem linearen Gradienten (0-1 M NaCl) wird anschließend eluiert. Die gepoolten CETP-Fraktionen werden gegen 10 mM TrisHCl pH 7.4 dialysiert und anschließend durch Chromatographie über eine Mono Q®- Säule (Fa. Pharmacia) weiter gereinigt.
B-I.2. CETP-Fluoreszenztest
Messung der CETP-katalysierten Übertragung eines fluoreszierenden Cholesterinesters zwischen Liposomen [modifiziert nach der Vorschrift von Bisgaier et al., J. Lipid Res. 34, 1625 (1993)]:
Zur Herstellung der Donorliposomen wird 1 mg Cholesteryl-4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacen-3-dodecanoat (Cholesteryl BODIPY® FL Cn, Fa. Molecular Probes) mit 5.35 mg Triolein und 6.67 mg Phosphatidylcholin am Ultraschallbad unter leichtem Erwärmen in 600 μl Dioxan gelöst und diese Lösung sehr langsam unter Ultrabeschallung zu 63 ml 50 mM TrisHCl / 150 mM NaCl / 2 mM EDTA-Puffer pH 7.3 bei Raumtemperatur gegeben. Die Suspension wird anschließend unter N2-Atmosphäre 30 min im Branson-Ultraschallbad bei ca. 50 Watt beschallt, wobei die Temperatur auf ca. 200C gehalten wird.
Die Akzeptorliposomen werden analog aus 86 mg Cholesteryloleat, 20 mg Triolein und 100 mg Phosphatidylcholin, in 1.2 ml Dioxan und 114 ml des obigen Puffers gelöst, durch 30-minütige Ultrabeschallung bei 50 Watt (200C) gewonnen.
B-I.2.1. CETP-Fluoreszenztest mit angereichertem CETP
Zur Testung wird ein Testmix bestehend aus 1 Teil obigen Puffers, 1 Teil Donorliposomen und 2 Teilen Akzeptorliposomen verwendet. 50 μl Testmix werden mit 48 μl angereicherter CETP-Fraktion (1-3 μg), gewonnen über hydrophobe Chromatographie aus Humanplasma, sowie 2 μl einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.2. CETP-Fluoreszenztest mit humanem Plasma
42 μl (86% v/v) humanes Plasma (Sigma P9523) werden mit 6 μl (12% v/v) Donorliposomen so- wie 1 μl (2% v/v) einer Lösung der zu untersuchenden Substanz in DMSO versetzt und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 510/520 nm (Spaltbreite 2.5 nm) ist ein Maß für den CE- Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.2.3. Ex v/vo-CETP-Fluoreszenztest
80 μl Testmix werden mit 10 μl Puffer sowie 2 μl Serum versetzt und 4 h bei 37°C inkubiert.
Die Veränderung der Fluoreszenz bei 485/535 nm ist ein Maß für den CE-Transfer; die Hemmung des Transfers im Vergleich zum Kontrollansatz ohne Substanz wird ermittelt.
B-I.3. Gewinnung von radioaktiv markiertem HDL
50 ml frisches humanes EDTA-Plasma wird mit NaBr auf eine Dichte von 1.12 eingestellt und bei 4°C im Ty 65-Rotor 18 h bei 50.000 Upm zentrifugiert. Die Oberphase wird zur Gewinnung von kaltem LDL verwendet. Die Unterphase wird gegen 3 x 4 Liter PDB-Puffer (10 mM TrisHCl pH 7.4, 0.15 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02% NaN3) dialysiert. Pro 10 ml Retentatvolumen werden an- schließend 20 μl 3H-Cholesterin (Dupont NET-725; 1 μC/μl gelöst in Ethanol) hinzugesetzt und 72 h bei 370C unter N2 inkubiert.
Der Ansatz wird dann mit NaBr auf die Dichte 1.21 eingestellt und im Ty 65-Rotor 18 h bei
50.000 Upm und 200C zentrifugiert. Man gewinnt die Oberphase und reinigt die Lipoprotein- fraktionen durch Gradientenzentrifugation. Dazu wird die isolierte, markierte Lipoproteinfraktion mit NaBr auf eine Dichte von 1.26 eingestellt. Je 4 ml dieser Lösung werden in Zentrifugenröhr- chen (SW 40-Rotor) mit 4 ml einer Lösung der Dichte 1.21 sowie 4.5 ml einer Lösung der Dichte
1.063 überschichtet (Dichtelösungen aus PDB-Puffer und NaBr) und anschließend 24 h bei 38.000
Upm und 200C im SW 40-Rotor zentrifugiert. Die zwischen der Dichte 1.063 und 1.21 liegende, das markierte HDL enthaltende Zwischenschicht wird gegen 3 x 100 Volumen PDB-Puffer bei 4°C dialysiert.
Das Retentat enthält radioaktiv markiertes 3H-CE-HDL, das auf ca. 5 x 106 cmp pro ml eingestellt zum Test verwendet wird.
B-I.4. CETP-SPA-Test
Zur Testung der CETP-Aktivität wird die Übertragung von 3H-Cholesterolester von humanen HD- Lipoproteinen auf biotinylierte LD-Lipoproteine gemessen. Die Reaktion wird durch Zugabe von Streptavidin-SPA®-beads (Fa. Amersham) beendet und die übertragene Radioaktivität direkt im Liquid Scintillation Counter bestimmt.
Im Testansatz werden 10 μl HDL-3H-Cholesterolester (ca. 50.000 cpm) mit 10 μl Biotin-LDL (Fa. Amersham) in 50 mM Hepes / 0.15 M NaCl / 0.1% Rinderserumalbumin (RSA) / 0.05% NaN3 pH 7.4 mit 10 μl CETP (1 mg/ml) und 3 μl einer Lösung der zu prüfenden Substanz in 10% DMSO / 1% RSA für 18 h bei 37°C inkubiert. Anschließend werden 200 μl der SPA-Streptavidin-bead- Lösung (TRKQ 7005) zugesetzt, 1 h unter Schütteln weiter inkubiert und dann im Scintillations- zähler gemessen. Als Kontrollen dienen entsprechende Inkubationen mit 10 μl Puffer, 10 μl CETP bei 4°C sowie 10 μl CETP bei 37°C.
Die in den Kontrollansätzen mit CETP bei 37°C übertragene Aktivität wird als 100% Übertragung gewertet. Die Substanzkonzentration, bei der diese Übertragung auf die Hälfte reduziert ist, wird als IC50-WeIt angegeben.
B-Hl . Messung der ex v/vo-Aktivität an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Prüfung auf CETP-inhibitorische Aktivität werden die Substanzen transgenen hCETP-Mäusen aus eigener Zucht [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] oral mit der Schlundsonde verabreicht. Dazu werden männliche Tiere einen Tag vor Versuchsbeginn randomisiert Gruppen mit gleicher Tierzahl, in der Regel n = 4, zugeordnet. Vor der Substanzapplikation wird jeder Maus zur Bestimmung ihrer basalen CETP-Aktivität im Serum Blut durch Punktion des retroorbitalen Venen- plexus entnommen (Zeitpunkt Tl). Anschließend wird den Tieren die Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Zu bestimmten Zeiten nach Applikation der Testsubstanz wird den Tieren ein zweites Mal Blut durch Punktion entnommen (Zeitpunkt T2), in der Regel 16 oder 24 h nach Substanzapplikation; gegebenenfalls kann dies aber auch zu einem anderen Zeitpunkt erfolgen.
Um die Hemmaktivität einer Substanz bewerten zu können, wird für jeden Zeitpunkt, also 16 bzw. 24 Stunden, eine entsprechende Kontrollgruppe eingesetzt, deren Tiere nur das Formulierungsmittel ohne Substanz erhalten. Bei den Kontrolltieren erfolgen die zwei Blutentnahmen pro Tier wie bei den substanzbehandelten Tieren, um die Veränderung der CETP-Aktivität ohne Inhibitor über den entsprechenden Versuchszeitraum (16 bzw. 24 h) bestimmen zu können.
Die Blutproben werden nach Abschluss der Gerinnung zentrifugiert und das Serum wird ab- pipettiert. Zur Bestimmung der CETP-Aktivität wird der Cholesterylester-Transport über 4 h bestimmt. Dazu werden im Testansatz in der Regel 2 μl Serum eingesetzt; der Test wird wie unter B-I.2.3. beschrieben durchgeführt.
Die Differenzen im Cholesterylester-Transport [pM CE/h (T2) - pM CE/h (Tl)] werden für jedes Tier berechnet und in den Gruppen gemittelt. Eine Substanz, die zu einem der Zeitpunkte den Cholesterylester-Transport um >20% herabsetzt, wird als wirksam angesehen.
B-II.2. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an Syrischen Goldhamstern
Zur Bestimmung der oralen Wirkung von CETP-Inhibitoren auf Serum-Lipoproteine und -Triglyceride werden 150-200 g schwere weibliche syrische Goldhamster aus eigener Zucht (Stamm BAY:DSN) verwendet. Die Tiere werden pro Käfig zu sechst gruppiert und zwei Wochen bei Futter und Wasser ad libitum akklimatisiert.
Unmittelbar vor Versuchsbeginn und nach Abschluss der Substanzapplikation wird mittels retro- orbitaler Punktion des Venenplexus Blut entnommen, woraus nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur und 20 min Zentrifugation bei 30.000 g Serum gewonnen wird. Die Substanzen werden in 20% Solutol / 80% Wasser gelöst und mit Hilfe einer Schlundsonde peroral verabreicht. Die Kontrolltiere erhalten identische Volumina Lösungsmittel ohne Testsubstanz.
Die Bestimmung von Triglyceriden, Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin und LDL-Cholesterin erfolgt mit Hilfe des Analysegeräts COBAS INTEGRA 400 plus (Fa. Roche Diagnostics) nach Angaben des Herstellers. Aus den Messwerten wird für jeden Parameter die durch Substanzbehandlung hervorgerufene prozentuale Veränderung für jedes Tier berechnet und als Mittelwert mit Standardabweichung pro Gruppe (n = 6 oder n = 12) angegeben. Sind die Substanzeffekte im Vergleich zur Lösungsmittel-behandelten Gruppe signifikant, wird der mittels t-Test ermittelte p- Wert hinzugefügt (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.005).
B-II.3. Messung der in v/vo-Wirksamkeit an transgenen hCETP-Mäusen
Zur Bestimmung der oralen Wirkung auf Lipoproteine und Triglyceride wird transgenen Mäusen [Dinchuk et al., BBA, 1295-1301 (1995)] Testsubstanz mit der Schlundsonde verabreicht. Vor
Versuchsbeginn wird den Mäusen retroorbital Blut entnommen, um Cholesterin und Triglyceride im Serum zu bestimmen. Das Serum wird, wie oben für Hamster beschrieben, durch Inkubation bei
4°C über Nacht und anschließende Zentrifugation bei 6.000 g gewonnen. Nach drei Tagen wird den Mäusen wieder Blut entnommen, um Lipoproteine und Triglyceride erneut zu bestimmen. Die Veränderungen der gemessenen Parameter werden als prozentuale Veränderung gegenüber dem
Ausgangswert ausgedrückt.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäße Verbindung kann folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:
Tablette:
Zusammensetzung:
100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm.
Herstellung:
Die Mischung aus erfindungsgemäßer Verbindung, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat 5 Minuten gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzun g :
1000 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel® (Xanthan gum der Firma FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung:
Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, die erfindungsgemäße Verbindung wird der Suspension zugefügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluß der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt. Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung:
500 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g Polyethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung:
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfindungsgemäßen Verbindung fortgesetzt.
i.v.-Lösung;
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der Formel (I)
in denen R1 für Cyclohexyl oder Cyclopentyl, R2 und R3 jeweils für Methyl stehen oder gemeinsam einen Cyclobutan bilden, R4 für Cyclopentyl oder iso-Propyl steht,
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
2. Verbindung der Formel (Ia)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
3. Verbindung der Formel (Ib)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
4. Verbindung der Formel (Ic)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
5. Verbindung der Formel (Id)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
6. Verbindung der Formel (Ie)
sowie ihre Salze, Solvate und Solvate der Salze.
7. Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten.
8. Verwendung der Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur primären und/oder sekundären Prävention von koronaren Herzerkrankungen.
9. Verwendung der Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis όdefiniert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Hypolipo- proteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hypercholesterol- ämien, Arteriosklerose, Restenose, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas), Diabetes, Schlaganfall und der Alzheimer'schen Krankheit.
10. Arzneimittel enthaltend die Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten
Hilfsstoff.
11. Arzneimittel enthaltend die Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Wirkstoffen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antidiabetika, Thrombozytenaggregationshemmer, Antikoagu- lantien, Calcium-Antagonisten, Angiotensin AII-Antagonisten, ACE-Hemmer, beta-
Blocker, Phosphodiesterase-Inhibitoren, Stimulatoren der löslichen Guanylatcyclase, cGMP-Enhancer, Diuretika, Thyroidrezeptor-Agonisten, HMG-CoA-Reduktase-Inhibi- toren, Squalensynthase-Inhibitoren, Squalenepoxidase-Inhibitoren, Oxidosqualencyclase- Inhibitoren, ACAT-Inhibitoren, MTP-Inhibitoren, PPAR-Agonisten, Fibrate, Lipase- Inhibitoren, Cholesterinabsorptionshemmer, Gallensäure-Reabsorptionshemmer, poly- meren Gallensäureadsorber und Lipoprotein(a)- Antagonisten.
12. Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 11 zur primären und/oder sekundären Prävention von koronaren Herzerkrankungen.
13. Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 11 zur Behandlung und/oder Prävention von Hypolipoproteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hyper- cholesterolämien, Arteriosklerose, Restenose, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas), Diabetes, Schlaganfall und der Alzheimer'schen Krankheit.
14. Verfahren zur primären und/oder sekundären Prävention von koronaren Herzerkrankungen in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, oder eines Arzneimittels, wie in einem der
Ansprüche 10 bis 13 definiert.
15. Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Hypolipoproteinämien, Dyslipidämien, Hypertriglyceridämien, Hyperlipidämien, Hypercholesterolämien, Arteriosklerose, Restenose, Fettsucht (Adipositas), Fettleibigkeit (Obesitas), Diabetes, Schlaganfall und der AIz- heimer'schen Krankheit in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer wirksamen Menge der Verbindung der Formel (I), wie in Ansprüchen 1 bis 6 definiert, oder eines
Arzneimittels, wie in einem der Ansprüche 10 bis 13 definiert.
16. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel (I), wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass man die Verbindung der Formel (II) in denen R1, R2, R3 und R4 jeweils die oben angegebenen Bedeutungen haben,
zunächst durch eine asymmetrische Reduktion in eine Verbindung der Formel (UI) überfuhrt, diese dann entweder
[A] durch Einführung einer Hydroxy-Schutzgruppe zu einer Verbindung der Formel (FV) in welcher
PG für eine Hydroxy-Schutzgruppe, vorzugsweise für einen Rest der Formel -SiR1R2R3 steht, worin
R1, R2 und R3 gleich oder verschieden sind und (Ci-C4)-Alkyl bedeuten,
umsetzt und anschließend über eine diastereoselektive Reduktion in eine Verbindung der Formel (V)in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat,
überführt
oder
[B] zunächst diastereoselektiv zu der Verbindung der Formel (VI) reduziert und diese dann durch regioselektive Einführung der Hydroxy-Schutzgruppe PG in eine Verbindung der Formel (V) überführt,
anschließend die Verbindung der Formel (V) mit Hilfe eines Fluorierungsmittels zu einer Verbindung der Formel (VIT) in welcher PG die oben angegebene Bedeutung hat,
umsetzt und dann die Hydroxy-Schutzgruppe PG nach üblichen Methoden unter Erhalt der Verbindung der Formel (I) wieder abspaltet und die Verbindung der Formel (I) gegebenenfalls mit den entsprechenden (i) Lösungsmitteln und/oder (ii) Basen oder Säuren zu ihren Solvaten, Salzen und/oder Solvaten der Salze umsetzt.
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