EP1807115A1 - Nanoparticules pourvues d'un element de ciblage intra-cellulaire, preparation et utilisations - Google Patents

Nanoparticules pourvues d'un element de ciblage intra-cellulaire, preparation et utilisations

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Publication number
EP1807115A1
EP1807115A1 EP05815304A EP05815304A EP1807115A1 EP 1807115 A1 EP1807115 A1 EP 1807115A1 EP 05815304 A EP05815304 A EP 05815304A EP 05815304 A EP05815304 A EP 05815304A EP 1807115 A1 EP1807115 A1 EP 1807115A1
Authority
EP
European Patent Office
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molecule
nanoparticles
targeting
cells
core
Prior art date
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Ceased
Application number
EP05815304A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laurent Levy
Abdel Kader Boussaha
Edouard André PANAK
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanobiotix SA
Original Assignee
Nanobiotix SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Nanobiotix SA filed Critical Nanobiotix SA
Publication of EP1807115A1 publication Critical patent/EP1807115A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
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    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
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    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
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    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
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    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present application relates to new activatable particles for use in the field of health. It relates more particularly to composite particles provided with an intracellular targeting element, capable of generating a response under excitation, and their uses in health, particularly human.
  • the particles of the invention comprise a core comprising at least one activatable inorganic or organic compound for labeling or altering cells, tissues or organs.
  • the invention also relates to methods for producing such particles, as well as pharmaceutical or diagnostic compositions containing them.
  • Dynamic Photo Therapy is used to treat superficial cancers such as the skin or esophagus (see, for example, McCaughan, JS Jr., Drugs and Aging. 68 (1999) "Photodynamic Therapy: A Review”).
  • This treatment is based on the production of free radicals by photosensitive molecules, when exposed to strong UV or LASER radiation. Indeed, the activated molecules transform the surrounding oxygen into free radicals that are highly reactive species producing irreversible damage in the cells.
  • Mainly attacked cellular organs are mitochondria, cell and nuclear membranes, lysosomes, etc.
  • Photosensitive molecules are injected intravenously and are generally retained in higher concentrations in cancerous tissues. This allows, after a certain time, to have a concentration in the tissues to be treated more than in healthy tissues. When these molecules are exposed to light (with an appropriate wavelength), they produce free radicals from oxygen, which will react with vital elements of the cell.
  • photodynamic has certain limitations. Indeed, patients can develop a certain sensitivity to light, which limits the number of applications of this therapy to a given individual.
  • the low wavelengths of the radiation used for the excitation of photosensitive molecules do not allow to cross a large thickness of tissue, which has the advantage of being low toxicity for other tissues, but restricted indication for superficial cancers (skin and subcutaneous).
  • Other potential problems inherent in the use of photodynamic therapy are related to the toxicity of photosensitive molecules and the need, in some cases, the use of oxygen to "load" the tissues to be treated.
  • NanoXRay activated by X-rays or UV and able, once activated, to generate free radicals or heat
  • the present application proposes improvements to nanoproducts for therapeutic or diagnostic purposes, such as those mentioned above.
  • the inventors have sought to minimize the potential toxicity of the nanoparticles capable of generating a response under excitation, such as those described in the prior art mentioned above, by developing new nanoparticles.
  • activatable Le., capable of labeling, altering or destroying cells, tissues or organs, even at low concentrations, in vivo, in vitro or ex vivo.
  • These objectives have been achieved by the development of new compounds that can be used in therapeutics and / or diagnostics (for example in imaging), in particular in humans, specifically recognizing an intracellular molecule or structure.
  • the particles of the invention are applicable to any type of tissue, superficial or deep, in any mammalian organism.
  • a first aspect of the invention thus relates to biocompatible composite nanoparticles, comprising:
  • a core comprising at least one inorganic or organic compound activatable by excitation
  • At least one targeting molecule preferably exposed on the surface of the particle, having an affinity for an intracellular molecule or structure.
  • Another subject of the invention relates to a method for preparing nanoparticles as defined above, comprising:
  • nucleus comprising one or more compounds as defined above
  • the invention resides in pharmaceutical or diagnostic compositions comprising nanoparticles as defined above or capable of being obtained by the above process.
  • compositions and nanoparticles as defined above, in combination with a source appropriate excitation (eg, radiation, radiation, external field, ultrasound, etc.), for the labeling, (targeted) destruction, detection or visualization of cells, tissues or organs in vitro, ex vivo or in vivo, as well as in corresponding methods.
  • a source appropriate excitation eg, radiation, radiation, external field, ultrasound, etc.
  • composite nanoparticle is understood to mean any synthetic complex product of the nanoparticulate particle or aggregate type, of reduced size, generally less than 1000 nm.
  • Their shape can be varied, for example rounded, flattened, elongated, spherical, oval, etc.
  • the shape is preferably substantially spherical.
  • the shape can be determined or controlled by the manufacturing method, and adapted by those skilled in the art according to the desired applications.
  • the shape of the particles does not have a great influence on their properties, especially on the yield of the production of free radicals or heat or on the nature of the vibrations emitted. However, the shape can influence the "biocompatibility" of the particles. Thus, for reasons of pharmacokinetics, nanoparticles of essentially spherical or rounded shape are preferred. On the other hand, nanoparticles of fairly homogeneous form are preferred.
  • the size of the nanoparticles according to the invention is typically between about 4 and 1000 nm.
  • the size of the objects should ideally be small enough to allow them to diffuse into the body (tissues, cells, blood vessels, etc.), essentially without being captured by macrophages (phagocytosis) and without causing significant obstruction.
  • the nanoparticles according to the invention must be biocompatible, that is to say they can be administered to an organism, typically a mammal. This biocompatible nature can be ensured, for example, by the nature of the constitutive constituents of the particle and / or the possible coating.
  • the particles according to the invention comprise a core containing at least one type of inorganic or organic compound having particular properties, optionally coated with a coating.
  • a compound capable of entering into the composition of the nucleus of the particle is an inorganic compound (s) or organic compound (s) capable of generating a response under excitation.
  • a compound suitable for the present invention may for example have magnetic properties, in which case the particle undergoes a change of orientation under the influence of a magnetic field.
  • Another suitable compound can absorb X-rays, laser light or UV light and emit a response such as UV-visible energy, heat or free radicals.
  • Another type of suitable compound may be ultrasonically sensitive and emit heat or a particular vibration or may be sensitive to alternating magnetic fields or microwaves and generate heat, etc.
  • the main function of this or these inorganic or organic material (s) is to react to a stimulus and generate a signal in response to said stimulus.
  • Compounds sensitive to a magnetic field likely to enter the composition of the nucleus of a particle according to the invention are typically inorganic compounds. Such compounds are for example unoxidized metals, metal oxides or mixed compounds of metal oxides, allowing a physical reversal of the particle under the effect of a magnetic field. It is for example a ferrous or ferric oxide, a cobalt oxide or a mixed iron / cobalt oxide.
  • the compounds sensitive to X-rays likely to enter the composition of the nucleus of a particle according to the invention are advantageously inorganic compounds (s). These compounds are preferably in the form of oxide, hydroxide, oxysulfide or salt, advantageously doped with a doping agent, preferably chosen from rare earths (as described in document FR 04 05036).
  • the dopant used is advantageously a rare earth chosen, for example, from Gd, Eu, Tb, Er, Nb, Pret Ce.
  • Metal compounds in particular unoxidized, may moreover be used for their property of X-ray absorption and heat emission.
  • Metal compounds having these properties are for example Au, Pb or a mixture of amorphous materials and metal compounds.
  • Molecules containing X-sensitive atoms can also be used.
  • the compounds sensitive to UV-visible rays capable of entering into the core composition of the nanoparticles according to the invention are advantageously of inorganic nature and may be chosen from the semiconductor compounds, such as in particular TiO2, ZnO and, without limitation, CdS, CdSe, CdTe, MnTe and mixed solutions (for example CdZnSe, CdMnSe, etc.), optionally doped with a rare earth (as described in FR 04 05036).
  • the compound (s) sensitive to UV-visible radiation used can also be organic compounds / molecules capable of producing heat or free radicals under the effect of UV light.
  • a compound sensitive to LASER radiation capable of entering into the core composition of the nanoparticles according to the invention, is preferably a compound or a mixture of photosensitive compounds / molecules of organic or inorganic nature.
  • Such compounds are for example constituted by biological or chemical molecules or a mixture of these.
  • the compound may be a semiconductor compound or a mixed solution, optionally doped with a rare earth.
  • Activated molecules (under the effect of a LASER light) transform oxygen or other molecules around them into free radicals or produce heat.
  • the molecules used can be, for example and without limitation, haernatoporphyrin, mTHPC, chlorine, mono-L-aspartylchlorine, phthalocyanine, etc.
  • Other organic compounds that may be used in the context of the present invention may be, for example, semiconductors (ZnO, TiO2, etc.), metals (Au, etc.).
  • the compounds sensitive to other types of radiation which may be included in the composition of the core of the nanoparticles according to the invention, are preferably chosen from a compound or a mixture of compounds of organic or inorganic nature which makes it possible to absorb radiation. High frequency type, Ultrasonic, radio waves, etc. or interact with it. Such compounds are for example made of semiconductor, magnetic, insulating materials or a mixture thereof.
  • the activated compounds can for example and as indicated above generate heat or vibrations.
  • the efficiency or the properties of the particles can be adapted by those skilled in the art by varying the relative amount of the different types of compounds, the overlap between the emission and absorption spectra of the compounds, the structure crystalline materials, the contact surface between an organic compound and the water and / or the distance between the compounds.
  • the inorganic or organic compound (s) can be arranged or organized in different ways.
  • a first compound preferably an inorganic compound
  • a second compound inorganic or organic
  • Several constituent compounds of the core may also be arranged in successive multilayers, a first inorganic compound preferentially forming the inner layer (the core).
  • the core of the core formed by the first inorganic compound typically has a size between about 5 and 50 nm, for example between 7 and 40 nm, and / or the layer formed by the second compound on the surface of the core has a thickness typically comprised between 1 and 30 nm, for example between 2 and 25 nm.
  • the core compounds may also be present as a mixture of nanoparticles. Such nanoparticles can be of various sizes and shapes.
  • the inorganic compounds of the ring may be present in the form of at least two nuclei in contact with each other.
  • the particles of the invention may comprise, in addition to the various types of compounds described above, other molecules, compounds or materials of structure or surface, intended to improve their stability, property, function, specificity, etc.
  • the nanoparticles according to the invention may further comprise a coating.
  • a coating advantageously makes it possible to preserve the integrity of the particles in vivo, to ensure or improve their biocompatibility, and to facilitate their functionalization [for example with binding molecules ("spacer”), biocompatible polymers, targeting, proteins, etc.].
  • the coating may be composed of any inorganic or organic structure, amorphous or crystalline.
  • a coating having a porosity of between 0.2 and 10 nm is typically used.
  • the coating also has a thickness generally between 0.1 and 50 nm, for example between 0.2 and 40 nm.
  • the coating may be non-biodegradable or biodegradable.
  • non-biodegradable coatings use is made, for example, of one or more materials chosen from silica, agarose, alumina, a saturated carbonaceous polymer or an inorganic polymer, crosslinked or otherwise, modified or not (polystyrene, etc.).
  • biodegradable coatings use is made, for example, of one or more materials chosen from modified or unmodified biological molecules, natural or otherwise, a polymer of modified or unmodified biological molecule, of natural or non-natural form, or a biological polymer, such as saccharide.
  • an oligosaccharide a polysaccharide, polysulphated or not, for example dextran.
  • the materials or compounds thus mentioned may be used alone or in mixtures or assemblies, composite or otherwise, covalent or otherwise, optionally in combination with other compounds.
  • the coating preferably comprises one or more compounds selected from silica (SiO 2 ), alumina, metals (Au, etc.), polyethylene glycol (PEG) or dextran, optionally in admixture (s).
  • the coating can also comprise different functional groups (or linkers), allowing the binding to the surface of the particle of any molecule of interest.
  • Useful functional groups are for example (CHb) n COOH, in which n is an integer ranging from 1 to 10.
  • the targeting molecule and / or the surface element can thus advantageously be linked to the coating via a functional group.
  • the molecules coupled to the surface of the particle can be, for example:
  • a surface targeting agent for specifically targeting biological cells or tissues for specifically targeting biological cells or tissues
  • the nanoparticles according to the invention comprise a coating to which an intracellular targeting molecule and optionally a surface targeting element is bonded, preferably via a linker.
  • Intra-cellular targeting element Intra-cellular targeting element
  • the present application offers novel compounds that can be used in therapeutics and / or diagnostics in humans or animals, specifically recognizing an intracellular structure or molecule.
  • the specificity of recognition of the nanoparticles according to the invention allows them to label, alter or destroy cells, tissues or organs, even at low concentrations, especially in vivo.
  • the products according to the invention thus have a potential risk of toxicity reduced compared to the products of the prior art.
  • An object of the invention relates to a nanoparticle as defined above, characterized in that it comprises a targeting molecule having an affinity for a molecule present in a human or animal cell.
  • the targeting molecule having an affinity for an intracellular molecule may be a biological or chemical molecule.
  • a molecule is for example chosen from a peptide, a polypeptide, a nucleic acid, a nucleotide, a lipid, a metabolite, etc.
  • the targeting molecule is preferably an antibody, a receptor ligand, a ligand receptor or a fragment or derivative thereof. It can also be a hormone, a sugar, an enzyme, a vitamin or others.
  • Specific examples of targeting molecules that may be used are phalloidin, phosphatidylinositol, rhodamine, or HPPH, and the like.
  • the selected intracellular targeting molecule crosses the cell membrane either spontaneously or because of its association with the other elements constituting the nanoparticles of the cell. the invention. It has preferential binding affinity for a molecule or structure that is present only or substantially only in the cytoplasm or nucleus of the targeted cells. By “preferential binding affinity” is meant a substantially higher binding affinity for the intracellular molecule or structure than for any surface or extracellular molecule.
  • the target intracellular molecule or structure within the meaning of the invention may be a biological or chemical structure, for example a biological structure chosen from a molecule of an intracellular membrane such as the Golgi apparatus, the endoplasmic reticulum, vesicles intracellular (endosome, peroxisome, etc.), or a nuclear membrane, etc., a lysosome, a cytoskeleton molecule, a cytoplasmic molecule, a mitochondria, an enzyme (for example a replication, repair enzyme, transcription or translation of the DNA, mitochondrial enzyme), a nuclear receptor, a nucleic acid [for example a preRNA, an mRNA, a tRNA (in particular their anti-codon fragment), an rRNA, a DNA], a factor transcription or translation, a co-factor (for example ATP, CoA, NAD, NADPH, etc.), a natural substrate (for example O 2 or other substrates or reaction products), etc.
  • the targeting molecule is linked to the coating that may be present or to the constituent nucleus of said nanoparticle, ie, to the inorganic or organic compound constituting said nanoparticle.
  • the molecule is preferentially covalently attached to the surface or adsorbed. This binding may be effected for example via hydrocarbon molecular chains of variable length but also via other types of molecules such as polysaccharides, polypeptides, DNA, etc.
  • the intracellular targeting element makes it possible to develop nanoparticles capable of targeting an intracellular molecule or structure, preferably a vital component of the cell when these nanoparticles are used in therapy and, on the contrary, preferably a non-vital component. , when used in diagnostics.
  • Examples of vital structures that are preferentially targeted are the nucleus, the mitochondria, substrates (O2 for example) or reaction products of a metabolic pathway necessary for cell survival, the aim being, for example, to freeze reactionary equilibria and thus the set of cellular functioning.
  • smaller doses of nanoparticles can be used to achieve the expected result in therapy, ie, cell destruction, when the nanoparticle comprises both a surface targeting element and a targeting molecule of a molecule or intracellular structure instead of the only surface targeting element (see FIGS. 3 and 4 which respectively relate to nanoparticles activated by a LASER radiation and by a magnetic field).
  • Rhodamine is used as a targeting molecule in the examples of the application. This molecule has an affinity for mitochondria naturally present inside the cells.
  • the nanoparticles according to the invention may comprise, in addition to the targeting molecule having an affinity for an intracellular structure or molecule, a surface element making it possible to specifically target cells or biological tissues.
  • This surface element may be bound to the particles by any means, preferably covalent, optionally via a linker. It may be associated with the nucleus, eg, with an inorganic compound, or with the coating that may be present, as will be described later in the text.
  • the surface targeting element may be any biological or chemical structure having affinity for molecules present in the human or animal body. It can thus be a peptide, a polypeptide, a protein, a glycoprotein, a lipid, etc. It can for example be a hormone, a vitamin, an enzyme, etc. and, in general, any ligand of molecules (eg, receptors, markers, antigens, etc.). By way of illustration, mention may be made of ligands of molecules expressed by pathological cells, for example ligands of tumor antigens, of hormone receptors, of cytokine receptors or of growth factor receptors, for example.
  • Such targeting elements may be, for example, chosen from LHRH, EGF, folate, anti-B-FN antibody, E-selectin / P-selectin, Anti-IL-2Ra antibody, GHRH , trastuzumab, Gefitinib, PSMA, Tamoxifen / toremifen, Imatinib, Gemtuzumab, Rituximab, Alemtuzumab, Cetximab, LDL.
  • the surface targeting element allows, when present, recognition and preferential accumulation of the particles of the invention in cells, tissues or organs of interest, and thus to confine the action to these tissues. Such targeting is particularly useful when the particles are administered systemically, for example for deep tissues.
  • the surface targeting element for specifically targeting biological cells or tissues is bound to the coating optionally present or to the inorganic or organic compound constituting said nanoparticle.
  • the combined presence, at the level of the nanoparticles according to the invention, of a targeting molecule having an affinity for a molecule or an intracellular structure and a surface targeting element making it possible to specifically target cells or tissues biological improves the specificity of recognition of said nanoparticles for their target.
  • This increased specificity of the nanoparticles enables them to label, alter or destroy cells, tissues or organs, even at low concentrations, especially in vivo, thus reducing, as indicated above, the risks of potential toxicity inherent in the use of any pharmaceutical composition. or diagnostic.
  • LHRH is used as a surface targeting element in the examples of the application.
  • This molecule has an affinity for LHRH receptors present on the surface of cancer cells, particularly in the context of hormone-dependent cancers.
  • LHRH can target tumor cells in the breast, ovary or prostate.
  • the effectiveness of the nanoparticles according to the invention in terms of destruction of the target cells, is increased when the double targeting, ie, the attachment of a targeting molecule having an affinity for a specific target. molecule or an intracellular structure and that of a surface targeting element, is put into practice.
  • the nanoparticles of the invention may be produced by any technique known in the art.
  • An object of the invention relates to a method for producing nanoparticles as defined above, comprising: the formation of a nucleus comprising one or more compounds as defined above,
  • the materials that make up the nanoparticles of the invention can be produced by various techniques, which are known to those skilled in the art.
  • the method can be adapted by those skilled in the art depending on the nature of the compounds used, and according to their arrangement in the nanoparticles.
  • Alternative methods of producing materials useful for the production of the particles of the invention are described for example in Nelson et al., Chem. Mater.
  • the methods of attachment of the targeting elements can be carried out by following, for example, the protocol described in L. Levy et al., "Nanochemistry: Synthesis and Characterization of Multifunctional NanoBiodrugs for Biological Applications. (Chem Mater 2002, 14 (9), 3715-3721).
  • the shape of the particles does not have a great influence on their properties, in particular on the yield of the production of free radicals or heat or on the nature of the vibrations emitted.
  • the shape that can influence the "biocompatibility" of particles the forms essentially spherical or rounded as well as essentially homogeneous forms, are preferred.
  • the size of the nanoparticles according to the invention is typically between about 4 and 1000 nm, preferably between 300 and 1000 nm, more preferably between 4 and 250 nm.
  • nanoparticles whose size is between 4 and 100 nm, and more preferably between 4 and 50 nm, are particularly preferred.
  • the size of the objects should ideally be small enough to allow them to diffuse into the body (tissues, cells, blood vessels, etc.), essentially without being captured by macrophages (phagocytosis) and without causing significant obstruction. Such effects can be advantageously obtained in humans with particles having a size of less than 100 nm, preferably less than 50 nm.
  • the shape and size of the nanoparticles can easily be calibrated by those skilled in the art implementing the processes for preparing the nanoparticles according to the invention.
  • Another object of the invention resides in any composition comprising nanoparticles as defined above and / or capable of being obtained by the method described above.
  • the particles advantageously have a fairly uniform shape and size.
  • the compositions comprise between 0.3 and 3000 mg of particles per 100 ml.
  • the compositions can be in solid, liquid (suspended particles), gel, paste, etc.
  • a particular object of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising nanoparticles as defined above and, optionally, a pharmaceutically acceptable excipient or vehicle.
  • Another particular object of the invention relates to a diagnostic or imaging composition
  • a diagnostic or imaging composition comprising nanoparticles as defined above and, optionally, a physiologically acceptable excipient or vehicle.
  • the excipient or vehicle used may be any usual support for this type of application, such as for example saline, isotonic, sterile, buffered, etc. solutions.
  • the compositions of the invention may further comprise stabilizing agents, sweetening agents, surfactants, etc. They can be formulated in the form of ampoules, vials, tablets, capsules, using known pharmaceutical techniques per se.
  • compositions, particles and aggregates of the invention can be used in many fields, particularly in human or animal medicine.
  • the particles can allow the destruction of cells or tissues or simply a visualization (imaging, diagnosis).
  • the nanoparticles according to the invention may be exposed to an excitation source for a period of time, usually comprised, for example, between one second and two hours, preferably between 30 minutes and one hour, more preferably for a period less than or equal to about 30 minutes, for example 5, 10 or 15 minutes.
  • the exposure times of the nanoparticles according to the invention generally vary between a second and about 30 minutes, for example between one minute and about 20 minutes or between one second and about 5 minutes, or even between one and about 60 seconds. It is understood that the greater the area exposed to the excitation source, the greater the exposure time will be important and the duration of exposure is inversely proportional to the intensity of the excitation source.
  • a particular object of the invention resides in the use of compositions, or nanoparticles as defined above, in combination with an excitation source adapted to the core of the nanoparticle, for the preparation of a medicament intended for the destruction of cells. targets.
  • Another particular object of the invention resides in a method for inducing or causing lysis or destruction of target cells, in vitro, ex vivo or in vivo, comprising contacting target cells with one or more nanoparticles as defined previously, for a period of time sufficient to allow the nanoparticles to enter target cells and, exposing the cells to an excitation source adapted to the core of the nanoparticles, said exposure inducing or causing the lysis or destruction of said target cells .
  • the target cells may be any pathological cells, that is to say cells that are involved in a pathological mechanism, for example proliferating cells, such as tumor cells, stenosing cells (smooth muscle cells), or the immune system (clones pathological cells).
  • pathological cells that is to say cells that are involved in a pathological mechanism, for example proliferating cells, such as tumor cells, stenosing cells (smooth muscle cells), or the immune system (clones pathological cells).
  • a preferred application is the treatment (e.g., destruction or alteration of functions) of cancer cells.
  • a particular object of the invention lies in the use of compositions or nanoparticles as defined above (in combination with an excitation source adapted to the core of nanoparticles) for the preparation of a medicament for the treatment of cancer.
  • Another subject of the invention relates to a method of treating cancer, comprising administering to a cancer patient a composition or nanoparticles as defined above, under conditions allowing the nanoparticles to enter the cells.
  • cancerous and the subsequent treatment of the patient in the presence of an excitation source adapted to the core of the nanoparticles which may be selected from radiation, radiation or an external field, more particularly from X-rays and UV rays, a field external magnetic, ultrasound, etc., leading to alteration, disruption or functional destruction of cancer cells of the patient, thereby treating cancer.
  • the invention is usable for treating any type of cancer, in particular solid tumors, metastasized or not, for example chosen from cancers of the lung, liver, kidney, bladder, breast, head-and-neck, brain, ovaries, prostate, skin, intestine, colon, pancreas, eye, etc.
  • the invention can also be used to treat a cardiovascular pathology such as atherosclerosis, for example, or to treat a neurodegenerative pathology, for example chosen from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis. , multiple sclerosis.
  • a cardiovascular pathology such as atherosclerosis
  • a neurodegenerative pathology for example chosen from Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis. , multiple sclerosis.
  • the type of nanoparticles (and its associated therapeutic effect) as well as the intracellular targeting molecule and the surface-targeting molecule, if present, making it possible to specifically target biological cells or tissues, can thus be chosen according to the type of cell or tissue sick.
  • the stimuli can be applied at any time after the administration of the particles, in one or more times, using any suitable system already available such as for example a radiotherapy system or radiography (scanner for example).
  • the particles can be administered by
  • - X-rays (ortho voltage) from 200 to 500 keV allowing penetration of tissue thicknesses up to 6 cm.
  • nanoparticles for the treatment of prostate cancer can be via focused x-rays having an energy of 15000keV.
  • the duration of exposure to X-rays as described above can be easily determined by those skilled in the art depending on the desired therapeutic or diagnostic use and the nature of the nanoparticles.
  • Magnetic fields of 1.5, 4 or 5 Tesla, for example, as well as fields greater than 5 Tesla, can moreover be applied to the nanoparticles according to the invention comprising a compound sensitive to a magnetic field.
  • the skilled person will be able to determine himself the magnetic field to be applied and its duration depending on the use therapeutic or diagnostic desired. Similarly, the skilled person can easily determine the duration and intensity of exposure to laser radiation, UV or ultrasound according to the intended applications and the nature of the nanoparticles used.
  • the particles of the invention can be used as a contrast agent to detect and / or visualize any type of tissue. They can also be used to freeze reactionary equilibria and thus cellular functioning.
  • an object of the invention relates to the use of compositions, or nanoparticles as defined above, in combination with a stimulus (particle excitation source) suitable for the manufacture of a composition intended for the detection or the visualization of cells, tissues or organs.
  • a stimulus particle excitation source
  • Target cells that can be detected or visualized are, for example, cancer cells.
  • treatment refers to any improvement of the pathological signs, such as a decrease in the size or development of a tumor or a pathological tissue area, the suppression or destruction of pathological cells or tissues, a slowing down of progression pathology, reduction of metastasis, regression or complete remission, etc.
  • the particles of the invention can also be used in vitro or ex vivo.
  • Figure 1 provides a schematic representation of the principle of double targeting (Module A: extracellular targeting allowing the specific recognition of a cell type, an organ, a biological tissue of the body to be treated, and Module B: targeting intra-cellular allowing the specific recognition of a molecule or intracellular structure) with nanoparticles activated by an external field.
  • Module A extracellular targeting allowing the specific recognition of a cell type, an organ, a biological tissue of the body to be treated
  • Module B targeting intra-cellular allowing the specific recognition of a molecule or intracellular structure
  • Figure 2 shows the different mechanisms of action of nanoparticles in therapy or diagnosis.
  • Figure 3 shows the survival rate of MCF7 cells (cell line of human origin, breast cancer) after incubation with photosensitive nanoparticles of the invention and exposure or not to laser radiation.
  • the experimental conditions are as follows: a) Nanoparticles, placed in the presence of free rhodamine and free LHRH, the nanoparticles, rhodamine and LHRH being dispersed in an isotonic solution. Cells not exposed to Laser radiation. Experiment carried out for 10 minutes, on 4 boxes of kneaded in parallel.
  • Nanoparticles provided with a targeting molecule having an affinity for an intracellular molecule or structure, Le., rhodamine (targeting molecule having an affinity for mitochondria), put in the presence of free LHRH, the nanoparticles and the LHRH being dispersed in an isotonic solution. Cells exposed to laser radiation (10 minutes). Experiment carried out on 4 boxes of petri in parallel.
  • Figure 4 shows the survival rate of MCF7 cells after incubation with magnetic nanoparticles of the invention and whether or not exposed to a magnetic field.
  • the experimental conditions are: a) Nanoparticles, placed in the presence of free rhodamine and free LHRH, the nanoparticles, rhodamine and LHRH being dispersed in an isotonic solution. Cells not exposed to the magnetic field. Experiment performed for 10 minutes on 4 boxes of kneaded in parallel.
  • Protoporphyrin-IX doped nanoparticles targeted and nanoparticles were synthesized using the following method: a) 0.5 g of AOT mixed with 0.5 g of butanol are dissolved in 20 ml of distilled water, b) 30 microliter of DMF and 15nM protoporphyrin IX are added to the solution obtained in a) and mixed, c) triethoxyvinylsilane (200 micro L) and 3-aminopropyltriethoxysilane (10 microliters) are added to the mixture obtained in b) and mixed for several hours, d) the solution obtained in c) is dialysed and filtered e) 3- (triethoxylsilanylpropyl-carbamoyl) -butyric acid molecules are added to the nanoparticles of solution d), dispersed in DMF, the mixture is then stirred for 24h, f) The targeting element having an affinity for an intracellular molecule or structure (rhodamine
  • Sample a consists of nanoparticles placed in the presence of rhodamine and free LHRH, the nanoparticles, rhodamine and LHRH being dispersed in an isotonic solution.
  • Sample b) consists of nanoparticles, provided with a targeting molecule having an affinity for a molecule or intracellular structure (rhodamine), placed in the presence of LHRH, the nanoparticles and the LHRH being dispersed in an isotonic solution .
  • a targeting molecule having an affinity for a molecule or intracellular structure (rhodamine)
  • Sample c) consists of nanoparticles provided with a targeting molecule having an affinity for an intracellular molecule or structure (rhodamine) and a surface targeting element for specifically targeting cells or biological tissues. (LHRH), said nanoparticles being dispersed in an isotonic solution.
  • the three samples (a, b and c) are added to MCF7 cells (cell line of human origin, breast cancer) and then incubated for 20 h.
  • the concentration used is 2 ⁇ mol of particles per petri dish.
  • the cells containing samples a and b are exposed for 10 minutes to a laser source (650 nm). The survival rate of the cells is measured 20 minutes after exposure.
  • the experiment is repeated four times in order to have a statistically significant result.
  • the results presented in FIG. 3 show a greater efficiency (cell destruction) of the nanoparticles of the sample c (with double targeting).
  • Sample a consists of nanoparticles placed in the presence of rhodamine and free LHRH, the nanoparticles, rhodamine and LHRH being dispersed in an isotonic solution.
  • Sample b) consists of nanoparticles, provided with a targeting molecule having an affinity for a molecule or intracellular structure (rhodamine), placed in the presence of LHRH, the nanoparticles and the LHRH being dispersed in an isotonic solution .
  • a targeting molecule having an affinity for a molecule or intracellular structure (rhodamine)
  • Sample c) consists of nanoparticles provided with a targeting molecule having an affinity for an intracellular molecule or structure (rhodamine) and a surface targeting element for specifically targeting cells or biological tissues. (LHRH), said nanoparticles being dispersed in an isotonic solution.
  • the three samples (a, b and c) are added and then incubated 20 h with MCF7 cells.
  • the used particle concentration is 0.5 picograms per petri dish.
  • the cells containing samples b) and c) are exposed 10 minutes to a unidirectional magnetic field (4.7 Tesla).
  • the survival rate of the cells is measured 20 minutes after exposure.
  • the experiment is repeated four times in order to have a statistically significant result.
  • the results presented in FIG. 4 show a greater efficiency (cell destruction) of the nanoparticles of the sample c) (with double targeting).

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Abstract

La présente invention concerne de nouvelles particules activables utilisables dans le domaine de la santé. Elle concerne plus particulièrement des nanoparticules composites pourvue d'un élément de ciblage intra-cellulaire capables de générer une réponse sous excitation, et leurs utilisations en santé, notamment humaine. Les particules de l'invention comprennent un noyau comprenant au moins un composé inorganique et éventuellement un ou plusieurs autres composé(s) organique(s) et peuvent être activées in vivo, pour marquer ou altérer des cellules, tissus ou organes. L'invention concerne également des méthodes de production de telles particules, ainsi que des compositions pharmaceutiques ou diagnostiques les contenant.

Description

NANOPARTICULES POURVUES D'UN ELEMENT DE CIBLAGE INTRA¬ CELLULAIRE, PREPARATION ET UTILISATIONS
La présente demande concerne de nouvelles particules activables utilisables dans le domaine de la santé. Elle concerne plus particulièrement des particules composites pourvues d'un élément de ciblage intra-cellulaire, capables de générer une réponse sous excitation, et leurs utilisations en santé, notamment humaine. Les particules de l'invention comprennent un noyau comprenant au moins un composé inorganique ou organique activable, pour marquer ou altérer des cellules, tissus ou organes. L'invention concerne également des méthodes de production de telles particules, ainsi que des compositions pharmaceutiques ou diagnostiques les contenant.
Durant les 30 dernières années, des avancées majeures ont été réalisées dans le domaine du diagnostic et du traitement des cancers humains. En parallèle, les biotechnologies et les nanotechnologies ont ouvert de nouvelles voies de développement et sont à l'origine de traitements nouveaux des pathologies humaines. En pratique, la chimiothérapie est la méthode la plus largement utilisée pour traiter de nombreux cancers. Elle présente toutefois certaines limites et des inconvénients conséquents. Le principal inconvénient de la chimiothérapie est certainement sa toxicité à l'égard des cellules saines du patient, qui restreint de façon drastique les doses de médicament susceptibles d'être employées pour détruire les cellules cancéreuses. De façon à fournir une approche chimiothérapeutique plus efficace, la recherche s'est concentrée sur le ciblage spécifique des molécules de chimiothérapie vers les cellules malades, les cellules cancéreuses étant reconnues en tant que cellules cibles via des molécules présentes à leur surface (Schally et al., 1999, J. Endocrinol., 141 :1 ; Nagy et al., 1996, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 93:7269; Emons et al., 1993, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77:1458).
Depuis 1950, les sondes et particules magnétiques ont été identifiées comme moyen de traitement potentiel des cancers. Les études démontrent que l'hyperthermie (Grittner et al., 1997, Hybridoma, 16:109; Higler et al., 1997, Invest. Radiol., 32:705) générée par des particules magnétiques couplées à un champ magnétique de fréquence élevée pourrait être utilisée comme un adjuvant dans le traitement du cancer. Il a été démontré que l'activité hyperthermique (chaleur produite par l'énergie de relaxation magnétique du matériel magnétique) détruit effectivement les tissus cancéreux à proximité des sondes ou particules.
Le développement de très petites particules magnétiques (ferrofluides) présentant une cristallinité élevée a constitué l'étape ultérieure dans le développement de la thérapie basée sur l'hyperthermie induite par un champ magnétique. Ce traitement provoque une réduction de la taille de la tumeur quand les particules sont directement injectées dans le tissu. Cependant, aucune spécificité tissulaire ou cellulaire liée à cette thérapie n'a pu être démontrée.
Une approche basée sur l'utilisation de particules activables par application d'un champ magnétique a été décrite dans le brevet No. US6.514,481.
La thérapie photo dynamique (PDT) est une autre méthode de traitement récemment développée, utilisée pour traiter les cancers superficiels comme celui de la peau ou de l'œsophage (voir par exemple McCaughan, J.S. Jr., Drugs and Aging. 15: 49-68 (1999) "Photodynamic Therapy: A Review"). Ce traitement est basé sur la production de radicaux libres par des molécules photosensibles, lors de l'exposition à de forts rayonnements UV ou LASER. En effet, les molécules activées transforment l'oxygène qui les entoure en radicaux libres qui sont des espèces hautement réactives produisant des dommages irréversibles dans les cellules. Les organes cellulaires principalement attaqués sont les mitochondries, les membranes cellulaire et nucléaire, les lysosomes, etc. Les molécules photosensibles sont injectées par voie intraveineuse et sont généralement retenues en concentration supérieure dans les tissus cancéreux. Ceci permet, après un certain temps, d'avoir une concentration dans les tissus à traiter plus importante que dans les tissus sains. Lorsque ces molécules sont exposées à la lumière (avec une longueur d'onde appropriée), elles produisent des radicaux libres à partir de l'oxygène, qui vont réagir avec des éléments vitaux de la cellule.
La thérapie . photodynamique présente cependant certaines limites. En effet, les patients peuvent développer une certaine sensibilité à la lumière, ce qui limite le nombre d'applications de cette thérapie à un individu donné. D'autre part, les faibles longueurs d'ondes des rayonnements utilisés pour l'excitation des molécules photosensibles ne permettent pas de traverser une grande épaisseur de tissu, ce qui présente l'avantage d'être peu toxique pour les autres tissus, mais restreint l'indication aux cancers superficiels (peau et sous- cutanés). D'autres problèmes potentiels inhérents à l'utilisation de la thérapie photodynamique sont liés à la toxicité des molécules photosensibles et à la nécessité, dans certains cas, de l'utilisation d'oxygène pour « charger » les tissus à traiter.
Une autre approche utilisant des particules de TÏO2 a montré qu'il était possible de générer des radicaux libres à partir de molécules d'eau et d'oxygène sous une excitation UV (Shibata et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 62:2306-2311 (1998)). Cette approche a été utilisée sur des modèles in vitro et in vivo de cancer de la vessie.
Une approche basée sur l'utilisation d'une nouvelle classe de particules, désignées NanoXRay, activables par des rayons X ou par des UV et capables, une fois activées, de générer des radicaux libres ou de la chaleur, a par ailleurs été décrite dans la demande FR 04 05036. Ces particules peuvent induire une réponse thérapeutique ou diagnostique in vivo même dans des tissus profonds.
La présente demande propose des améliorations aux nanoproduits à vocation thérapeutique ou diagnostique, tels ceux mentionnés ci-dessus.
Plus particulièrement, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont cherché à minimiser la toxicité potentielle des nanoparticules capables de générer une réponse sous excitation, telles celles décrites dans l'art antérieur mentionné ci-dessus, en mettant au point de nouvelles nanoparticules activables, Le., capables de marquer, altérer ou détruire des cellules, tissus ou organes, même à faibles concentrations, in vivo, in vitro ou ex vivo. Ces objectifs ont été atteints par la mise au point de nouveaux composés utilisables en thérapeutique et/ou en diagnostique (par exemple en imagerie), notamment chez l'homme, reconnaissant de manière spécifique une molécule ou structure intra-cellulaire. Les particules de l'invention sont applicables à tout type de tissu, superficiel ou profond, chez tout organisme mammifère.
Un premier aspect de l'invention concerne ainsi des nanoparticules composites biocompatibles, comprenant :
- un noyau comprenant au moins un composé inorganique ou organique activable par excitation,
- de manière facultative, un enrobage biocompatible, et
- au moins une molécule de ciblage, de préférence exposée à la surface de la particule, présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra¬ cellulaire.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation de nanoparticules telles que définies ci-dessus comprenant :
- la formation d'un noyau comprenant un ou plusieurs composés tels que définis ci-dessus,
- l'enrobage éventuel du noyau,
- la fixation d'au moins une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire à la surface de ladite particule ainsi formée éventuellement enrobé(e) et, éventuellement
- la fixation d'au moins un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou tissus biologiques.
Selon un autre aspect, l'invention réside dans des compositions, pharmaceutiques ou diagnostiques, comprenant des nanoparticules telles que définies ci-dessus ou susceptibles d'être obtenues par le procédé ci-dessus.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation des compositions et nanoparticules telles que définies ci-dessus, en combinaison avec une source d'excitation appropriée (e.g., un rayonnement, une radiation, un champ externe, des ultrasons, etc.), pour le marquage, la destruction (ciblée), la détection ou la visualisation de cellules, tissus ou organes in vitro, ex vivo ou in vivo, ainsi que dans des méthodes correspondantes.
Au sens de l'invention, on entend par « nanoparticule composite » tout produit complexe synthétique du type particule ou agrégat nanoparticulaire, de taille réduite, généralement inférieure à 1000 nm. Leur forme peut être variée, par exemple arrondie, aplatie, allongée, sphérique, ovale, etc. La forme est de préférence essentiellement sphérique. La forme peut être déterminée ou contrôlée par le procédé de fabrication, et adaptée par l'homme du métier selon les applications recherchées.
La forme des particules n'a pas une grande influence sur leurs propriétés, notamment sur le rendement de la production de radicaux libres ou de chaleur ou sur la nature des vibrations émises. Cependant, la forme peut influencer la « biocompatibilité » des particules. Ainsi, pour des raisons de pharmacocinétique, on préfère des nanoparticules de forme essentiellement sphérique ou arrondie. On préfère d'autre part des nanoparticules de forme assez homogène.
De manière préférée, la taille des nanoparticules selon l'invention est typiquement comprise entre 4 et 1000 nm environ. La taille des objets doit idéalement être suffisamment petite pour leur permettre de diffuser dans l'organisme (tissus, cellules, vaisseaux sanguins, etc.), essentiellement sans être captés par les macrophages (phagocytose) et sans provoquer d'obstruction significative.
Les nanoparticules selon l'invention doivent être biocompatibles, c'est-à- dire pouvoir être administrées à un organisme, typiquement un mammifère. Ce caractère biocompatible peut être assuré par exemple par la nature des composés constitutifs de la particule et/ou de l'enrobage éventuel. Noyau
Comme indiqué précédemment, les particules selon l'invention comprennent un noyau contenant au moins un type de composé inorganique ou organique ayant des propriétés particulières, éventuellement recouvert d'un enrobage.
Un composé susceptible de rentrer dans la composition du noyau de la particule est un composé (ou un mélange de composés) inorganique(s) ou organique(s) capable(s) de générer une réponse sous excitation. Un composé adapté à la présente invention peut par exemple posséder des propriétés magnétiques, auquel cas la particule subit un changement d'orientation sous l'influence d'un champ magnétique. Un autre composé adapté peut absorber les rayons X, une lumière laser ou une lumière UV et émettre une réponse telle que de l'énergie UV-visible, de la chaleur ou des radicaux libres. Un autre type de composé adapté peut être sensible aux ultrasons et émettre de la chaleur ou une vibration particulière ou peut être sensible aux champs magnétiques alternatifs ou aux micro-ondes et générer de la chaleur, etc. La fonction principale de ce ou ces matériau(x) inorganique(s) ou organique(s) est de réagir à un stimulus et de générer un signal en réponse audit stimulus.
Composés sensibles à un champ magnétique
Les composés sensibles à un champ magnétique susceptibles de rentrer dans la composition du noyau d'une particule selon l'invention sont typiquement des composés inorganiques. De tels composés sont par exemple des métaux non oxydés, des oxydes métalliques ou des composés mixtes d'oxydes métalliques, permettant un retournement physique de la particule sous l'effet d'un champ magnétique. Il s'agit par exemple d'un oxyde ferreux ou ferrique, d'un oxyde de cobalt ou d'un oxyde de fer/cobalt mixte. Composés sensibles aux rayons X
Les composés sensibles aux rayons X susceptibles de rentrer dans la composition du noyau d'une particule selon l'invention sont avantageusement des composés inorganique(s). Ces composés se présentent préférentiellement sous forme d'oxyde, hydroxyde, oxysulfure ou de sel, avantageusement dopé par un agent dopant, de préférence choisi parmi les terres rares (comme décrit dans le document FR 04 05036). Ils sont par exemple choisis parmi Y2O3, (Y1Gd)2O3, CaWO4, GdO2S, LaOBr, YTaO3, BaFCI, Gd2O2S, Gd3Ga5Oi2, Rb3Lu(PO-Oa et Cs3Lu(PO^2. Le dopant utilisé est avantageusement une terre rare choisie par exemple parmi Gd, Eu, Tb, Er, Nb, Pr êt Ce.
Des composés métalliques, en particulier non oxydés, peuvent par ailleurs être utilisés pour leur propriété d'absorption des Rayons X et émission de chaleur. Des composés métalliques présentant ces propriétés sont par exemple Au, Pb ou un mélange de matériaux amorphes et de composés métalliques.
Des molécules contenant des atomes sensibles aux rayons X peuvent également être utilisées.
Il est entendu que d'autres composés inorganiques, métaux, oxydes, hydroxydes, oxysulfures ou sels et dopants peuvent être envisagés par l'homme du métier pour rentrer dans la composition des noyaux des particules selon l'invention. Il est entendu que plusieurs métaux, oxydes, hydroxydes, oxysulfures ou sels et/ou dopants peuvent être utilisés en mélange dans le ou les noyaux d'une même particule de l'invention.
Composés sensibles aux rayons UV-visible IR
Les composés sensibles aux rayons UV-visible susceptibles de rentrer dans la composition du noyau des nanoparticules selon l'invention, sont avantageusement de nature inorganique et peuvent être choisis parmi les composés semi-conducteurs, tels que notamment le TiO2, le ZnO et, de manière non restrictive, CdS, CdSe, CdTe, MnTe et des solutions mixtes (par exemple CdZnSe, CdMnSe, etc.), éventuellement dopé(e)s avec une terre rare (comme décrit dans le document FR 04 05036). Le ou les composés sensibles aux rayons UV-visible utilisés peuvent également être des composés/molécules organiques capables de produire de la chaleur ou des radicaux libres sous l'effet d'une lumière UV.
Composés sensibles à un rayonnement LASER
Un composé sensible à un rayonnement LASER, susceptible de rentrer dans la composition du noyau des nanoparticules selon l'invention, est de préférence un composé ou un mélange de composés/molécules photosensibles de nature organique ou inorganique. De tels composés sont par exemple constitués de molécules biologiques, chimiques ou d'un mélange de celles-ci. Le composé peut être un composé semi-conducteur ou une solution mixte, éventuellement dopé(e) avec une terre rare. Les molécules activées (sous l'effet d'une lumière LASER) transforment l'oxygène ou d'autres molécules qui les entourent en radicaux libres ou produisent de la chaleur.
Les molécules utilisées peuvent être par exemple et de façon non limitative l'haernatoporphyrine, le mTHPC, la chlorine, la mono-L-aspartylchlorine, la phthalocyanine, etc. D'autres composés organiques utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être, par exemple, des semi-conducteurs (ZnO, TiO2, etc.), des métaux (Au, etc).
Composés sensibles à d'autres types de rayonnement
Les composés sensibles à d'autres types de rayonnement, susceptibles de rentrer dans la composition du noyau des nanoparticules selon l'invention, sont de préférence choisis parmi un composé ou un mélange de composés de nature organique ou inorganique qui permet d'absorber un rayonnement de type Haute fréquence, Ultrasons, ondes radio, etc. ou d'interagir avec celui-ci. De tels composés sont par exemple constitués de matériaux semi-conducteurs, magnétiques, isolants ou d'un mélange de ceux-ci.
Les composés activés peuvent par exemple et comme indiqué précédemment générer de la chaleur ou des vibrations.
De manière générale, l'efficacité ou les propriétés des particules peuvent être adaptées par l'homme du métier en jouant sur la quantité relative des différents types de composés, le recouvrement entre les spectres d'émission et d'absorption des composés, la structure cristalline des matériaux, la surface de contact entre un composé organique et l'eau et/ou la distance entre les composés.
Dans le noyau des particules de l'invention, le ou les composés inorganiques ou organiques peuvent être agencés ou organisés de différentes façons. Ainsi, un premier composé, de préférence inorganique, peut former le cœur du noyau, et un second composé (inorganique ou organique) se présenter sous forme d'une couche ou de nanoparticules à la surface du cœur. Plusieurs composés constitutifs du noyau peuvent également être disposés en multicouches successives, un premier composé inorganique formant préférentiellement la couche interne (le cœur). Le cœur du noyau formé par le premier composé inorganique présente typiquement une dimension comprise en 5 et 50 nm environ, par exemple entre 7 et 40 nm, et/ou la couche formée par le second composé à la surface du cœur possède une épaisseur comprise typiquement entre 1 et 30 nm environ, par exemple entre 2 et 25 nm. Les composés du noyau peuvent également être présents sous forme d'un mélange de nanoparticules. De telles nanoparticules peuvent être de taille et de forme variées. Dans une autre variante de mise en œuvre, les composés inorganiques du noyau peuvent être présents sous forme d'au moins deux noyaux au contact l'un de l'autre.
L'homme du métier peut donc adapter les propriétés des particules en faisant varier les paramètres mentionnés ci-dessus, par exemple en fonction des utilisations envisagées (diagnostic, thérapeutique, etc.). II est entendu que les particules de l'invention peuvent comprendre, outre les différents types de composés décrits précédemment, d'autres molécules, composés ou matériaux de structure ou de surface, destinés à améliorer leur stabilité, propriété, fonction, spécificité, etc.
Enrobage
Comme indiqué précédemment, les nanoparticules selon l'invention peuvent comprendre en outre un enrobage. Un tel enrobage permet avantageusement de préserver l'intégrité des particules in vivo, d'assurer ou d'améliorer leur biocompatibilité, et de faciliter leur fonctionnalisation [par exemple avec des molécules de liaison (« spacer »), des polymères biocompatibles, des agents de ciblage, des protéines, etc.].
L'enrobage peut être composé de toute structure inorganique ou organique, amorphe ou cristalline. Pour préserver l'activité des particules de l'invention, selon la nature du noyau, il peut être souhaitable que l'enrobage permette la diffusion de petites molécules et/ou de radicaux libres. En particulier, il est important que l'enrobage permette le passage de l'eau (ou O2) et de sa forme radicalaire après transformation lorsque la nanoparticule comprend un composé organique capable de réagir avec celle-ci. Ceci peut être assuré en utilisant des matériaux présentant une certaine porosité et/ou une couche d'enrobage de faible épaisseur et poreuse. Ainsi par exemple, on utilise typiquement un enrobage possédant une porosité comprise entre 0,2 et 10 nm. L'enrobage possède par ailleurs une épaisseur comprise généralement entre 0,1 et 50 nm environ, par exemple entre 0,2 et 40 nm.
De façon générale, l'enrobage peut être non-biodégradable ou biodégradable. Pour les enrobages non-biodégradables, on utilise par exemple un ou plusieurs matériaux choisis parmi la silice, l'agarose, l'alumine, un polymère carboné saturé ou un polymère inorganique, réticulé ou non, modifié ou non (polystyrène, etc.). Pour les enrobages biodégradables, on utilise par exemple un ou plusieurs matériaux choisis parmi des molécules biologiques modifiées ou non, naturelles ou non, un polymère de molécule biologique modifiée ou non, de forme naturelle ou non, ou un polymère biologique, tel que le saccharide, un oligosaccharide, un polysaccharide, polysulfaté ou non, par exemple le dextran. Les matériaux ou composés ainsi mentionnés peuvent être utilisés seuls ou en mélanges ou en assemblages, composite ou non, covalent ou non, éventuellement en combinaison avec d'autres composés. D'autre part, on peut également utiliser tout matériau mentionné ci-dessus, hydro- ou liposoluble, de façon naturelle ou artificielle.
L'enrobage comprend de préférence un ou des composés choisis parmi la silice (SiO2), l'alumine, les métaux (Au, etc.), le Polyéthylène Glycol (PEG) ou le Dextran, éventuellement en mélange(s).
L'enrobage peut par ailleurs comporter différents groupes fonctionnels (ou segments de liaison), permettant la liaison à la surface de la particule de toute molécule d'intérêt.
Des groupes fonctionnels utiles sont par exemple (CHb)nCOOH, dans lequel n est un entier allant de 1 à 10. La molécule de ciblage et/ou l'élément de surface peuvent ainsi avantageusement être liés à l'enrobage via un groupe fonctionnel (CH2)nCOOH de l'enrobage dans lequel n est un entier allant de 1 à 10.
Les molécules couplées à la surface de la particule peuvent être, par exemple :
-un agent de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou tissus biologiques;
-une molécule assurant ou améliorant la biocompatibilité ; ou
-une molécule permettant à la particule d'échapper au système immunitaire (et notamment d'éviter les interactions avec les macrophages et SRE). Dans un mode de réalisation particulier, les nanoparticules selon l'invention comprennent un enrobage auquel une molécule de ciblage intra¬ cellulaire et éventuellement un élément de ciblage de surface est lié, de préférence par l'intermédiaire d'un segment de liaison.
Elément de ciblage intra-cellulaire
Comme indiqué ci-dessus, la présente demande offre de nouveaux composés utilisables en thérapeutique et/ou en diagnostique, chez l'homme ou l'animal, reconnaissant de manière spécifique une structure ou molécule intra¬ cellulaire. La spécificité de reconnaissance des nanoparticules selon l'invention leur permet de marquer, altérer ou détruire des cellules, tissus ou organes, même à faibles concentrations, notamment in vivo. Les produits selon l'invention présentent donc un risque de toxicité potentielle réduit par rapport aux produits de l'art antérieur.
Un objet de l'invention concerne une nanoparticule telle que définie précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule présente dans une cellule humaine ou animale.
La molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule intra¬ cellulaire peut être une molécule biologique ou chimique. Une telle molécule est par exemple choisie parmi un peptide, un polypeptide, un acide nucléique, un nucléotide, un lipide, un métabolite, etc. La molécule de ciblage est de préférence un anticorps, un ligand de récepteur, un récepteur de ligand ou un fragment ou un dérivé de ceux-ci. Il peut s'agir également d'une hormone, d'un sucre, d'une enzyme, d'une vitamine ou autres. Des exemples particuliers de molécules de ciblage susceptibles d'être utilisées sont la phalloidine, le phosphatidylinositol, la rhodamine ou l'HPPH, etc. La molécule de ciblage intra¬ cellulaire choisie traverse la membrane cellulaire, soit spontanément, soit du fait de son association avec les autres éléments constituant les nanoparticules de l'invention. Elle présente une affinité de liaison préférentielle pour une molécule ou une structure qui est présente uniquement ou pratiquement uniquement dans le cytoplasme ou le noyau des cellules ciblées. Par "affinité de liasion préférentielle", on entend une affinité de liaison substantiellement plus élevée pour la molécule ou la structure intracellulaire, que pour toute molécule de surface ou extra-cellulaire.
La molécule ou structure intra-cellulaire cible au sens de l'invention peut être une structure biologique ou chimique, par exemple une structure biologique choisie parmi une molécule d'une membrane intracellulaire telle que l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, des vésicules intra-cellulaires (endosome, peroxysome, etc.), ou d'une membrane nucléaire, etc., un lysosome, une molécule du cytosquelette, une molécule cytoplasmique, une mitochondrie, une enzyme (par exemple un enzyme de réplication, de réparation, de transcription ou de traduction de l'ADN, enzyme mitochondriale), un récepteur nucléaire, un acide nucléique [par exemple un préARN, un ARNm, un ARNt (notamment leur fragment anti-codon), un ARNr, un ADN], un facteur de transcription ou de traduction, un co-facteur (par exemple l'ATP, le CoA, le NAD, le NADPH, etc.), un substrat naturel (par exemple O2 ou autres substrats ou produits de réaction), etc. La molécule ou structure intra-cellulaire cible au sens de l'invention, présentant une affinité pour la molécule de ciblage, peut également être de nature chimique. Il peut par exemple s'agir d'un substrat synthétique injecté artificiellement dans une cellule cible (O2 ou autres substrats ou produits de réaction).
La molécule de ciblage est liée à l'enrobage éventuellement présent ou au noyau constitutif de ladite nanoparticule, i.e., au composé inorganique ou organique constitutif de ladite nanoparticule. La molécule est préférentiellement fixée de manière covalente à la surface ou adsorbée. Cette fixation peut se faire par exemple via des chaînes moléculaires hydrocarbonées de longueur variable mais aussi via d'autres types de molécules telles que des polysaccharides, polypeptides, de l'ADN, etc. L'élément de ciblage intra-cellulaire permet de développer des nanoparticules capables de cibler une molécule ou une structure intra-cellulaire, de préférence un composant vital de la cellule lorsque ces nanoparticules sont utilisées en thérapie et au contraire, de préférence un composant non vital, lorsqu'elles sont utilisées en diagnostique. Des exemples de structures vitales préférentiellement ciblées sont le noyau, les mitochondries, des substrats (O2 par exemple) ou des produits de réaction d'une voie métabolique nécessaire à la survie cellulaire, le but étant par exemple de geler des équilibres réactionnaires et donc l'ensemble du fonctionnement cellulaire. Comme le démontrent les exemples et comme rappelé précédemment, des doses de nanoparticules moins importantes peuvent être employées pour atteindre le résultat attendu en thérapie, i.e., la destruction de la cellule, lorsque la nanoparticule comprend à la fois un élément de ciblage de surface et une molécule de ciblage d'une molécule ou structure intra-cellulaire au lieu du seul élément de ciblage de surface (cf. Figures 3 et 4 qui concernent respectivement des nanoparticules activées par un rayonnement LASER et par un champ magnétique).
La rhodamine est utilisée comme molécule de ciblage dans les exemples de la demande. Cette molécule présente une affinité pour les mitochondries naturellement présentes à l'intérieur des cellules. Le ciblage, permis par la rhodamine, des nanoparticules selon l'invention vers les mitochondries intra¬ cellulaires, favorise la destruction de la cellule lors de l'exposition à une source d'excitation, dans la mesure où les mitochondries constituent un élément vital de cette cellule.
Elément de ciblage de surface
Les nanoparticules selon l'invention peuvent comprendre, outre la molécule de ciblage présentant une affinité pour une structure ou une molécule intra-cellulaire, un élément de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques. Cet élément de surface peut être lié aux particules par tout moyen, de préférence covalent, éventuellement par l'intermédiaire d'un segment de liaison. Il peut être associé au noyau, e.g., à un composé inorganique, ou à l'enrobage éventuellement présents, comme il sera décrit dans la suite du texte.
L'élément de ciblage de surface peut être toute structure biologique ou chimique présentant une affinité pour des molécules présentes dans le corps humain ou animal. Il peut ainsi s'agir d'un peptide, d'un polypeptide, d'une protéine, d'une glycoprotéine, d'un lipide, etc. Il peut par exemple s'agir d'une hormone, d'une vitamine, d'un enzyme, etc. et, de manière générale, de tout ligand de molécules (par exemple récepteurs, marqueurs, antigènes, etc.). On peut mentionner à titre d'illustration des ligands de molécules exprimées par des cellules pathologiques, notamment des ligands d'antigènes tumoraux, de récepteurs hormonaux, de récepteurs de cytokines ou de récepteurs de facteurs de croissance, par exemple. De tels éléments de ciblage peuvent être par exemple choisis parmi la LHRH, l'EGF, un folate, l'anticorps anti-B-FN, la E- selectin / P-selectin, l'anticorps Anti-IL-2Ra, la GHRH, le trastuzumab, le Gefitinib, la PSMA, le Tamoxifen / toremifen, l'Imatinib, le Gemtuzumab, le Rituximab, l'Alemtuzumab, le Cetximab, une LDL.
L'élément de ciblage de surface permet, lorsqu'il est présent, une reconnaissance et une accumulation préférentielle des particules de l'invention dans des cellules, tissus ou organes d'intérêt, et ainsi de confiner l'action à ces tissus. Un tel ciblage est particulièrement utile lorsque les particules sont administrées par voie systémique, par exemple pour les tissus profonds.
L'élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques est lié à l'enrobage éventuellement présent ou au composé inorganique ou organique constitutif de ladite nanoparticule. La présence combinée, au niveau des nanoparticules selon l'invention, d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou pour une structure intra-cellulaire et d'un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques, améliore la spécificité de reconnaissance desdites nanoparticules pour leur cible. Cette spécificité accrue des nanoparticules leur permet de marquer, altérer ou détruire des cellules, tissus ou organes, même à faibles concentrations, notamment in vivo, réduisant ainsi, comme indiqué précédemment, les risques de toxicité potentielle inhérents à l'usage de toute composition pharmaceutique ou diagnostique.
La LHRH est utilisée comme élément de ciblage de surface dans les exemples de la demande. Cette molécule présente une affinité pour les récepteurs de la LHRH présents à la surface des cellules cancéreuses, notamment dans le cadre des cancers hormono-dépendants. La LHRH permet, par exemple, de cibler des cellules de tumeurs du sein, de l'ovaire ou de la prostate. Le double ciblage, permis par la LHRH et par la rhodamine, des nanoparticules selon l'invention vers les mitochondries de cellules cancéreuses, favorise la destruction de ces cellules lors de l'exposition à une source d'excitation. Comme le démontre l'exemple 4 en particulier, l'efficacité des nanoparticules selon l'invention, en terme de destruction des cellules cibles, est accrue lorsque le double ciblage, i.e., la fixation d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire et celle d'un élément de ciblage de surface, est mis en pratique.
Procédé de production
Les nanoparticules de l'invention peuvent être produites par toute technique connue dans le domaine.
Un objet de l'invention concerne un procédé de production de nanoparticules tels que définies précédemment, comprenant : - la formation d'un noyau comprenant un ou plusieurs composés tels que définis précédemment,
- l'enrobage éventuel du noyau,
- la fixation d'au moins une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire à la surface de ladite particule ainsi formée éventuellement enrobé(e) et, éventuellement
- la fixation d'au moins un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou tissus biologiques.
Les matériaux qui composent les nanoparticules de l'invention peuvent être produits par différentes techniques, qui sont connues en soi de l'homme du métier. Le procédé peut être adapté par l'homme du métier selon la nature des composés utilisés, et selon leur agencement dans les nanoparticules. Des méthodes alternatives de production de matériaux utilisables pour la production des particules de l'invention sont décrites par exemple dans Nelson et al, Chem. Mater. 2003, 15, 688-693 "Nanocrystalline Y2O3:Eu Phosphors Prepared by Alkalide Réduction" ou encore dans Liu et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials 270 (2004) 1-6 "Préparation and characterization of amino- silane modified superparamagnetic silica nanospheres" ainsi que dans les documents brevet FR 04 05036 et US 6,514,481.
Les méthodes d'accrochage des éléments de ciblages peuvent être effectuées en suivant par exemple le protocole décrit dans L. Levy et al., « Nanochemistry: Synthesis and Characterization of Multifunctional NanoBiodrugs for Biological Applications. » (Chem. Mater.; 2002; 14(9), 3715 - 3721).
Comme indiqué précédemment, la forme des particules n'a pas une grande influence sur leur propriétés, notamment sur le rendement de la production de radicaux libres ou de chaleur ou sur la nature des vibrations émises. Cependant, la forme pouvant influencer la « biocompatibilité » des particules, les formes essentiellement sphériques ou arrondies ainsi que les formes essentiellement homogènes, sont préférées.
De manière préférée, et comme indiqué au préalable, la taille des nanoparticules selon l'invention est typiquement comprise entre 4 et 1000 nm environ, de préférence entre 300 et 1000 nm, encore plus préférentiellement entre 4 et 250 nm. Pour des applications in vivo chez l'homme ou l'animal, on préfère tout particulièrement des nanoparticules dont la taille est comprise entre 4 et 100 nm, encore plus préférentiellement entre 4 et 50 nm. La taille des objets doit idéalement être suffisamment petite pour leur permettre de diffuser dans l'organisme (tissus, cellules, vaisseaux sanguins, etc.), essentiellement sans être captés par les macrophages (phagocytose) et sans provoquer d'obstruction significative. De tels effets peuvent être obtenus avantageusement chez l'homme avec des particules d'une taille inférieure à 100 nm, préférentiellement inférieure à 50 nm.
La forme et la taille des nanoparticules peuvent aisément être calibrées par l'homme du métier mettant en œuvre les procédés de préparation des nanoparticules selon l'invention.
Compositions
Un autre objet de l'invention réside dans toute composition comprenant des nanoparticules telles que définies précédemment et/ou susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus. Bien que cela ne soit pas obligatoire, dans les compositions de l'invention, les particules présentent avantageusement une forme et une taille assez homogènes. Généralement, les compositions comprennent entre 0,3 et 3000 mg de particules pour 100ml. Les compositions peuvent être sous forme solide, liquide (particules en suspension), de gel, pâte, etc. Un objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant des nanoparticules telles que définies précédemment et, éventuellement, un excipient ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre objet particulier de l'invention concerne une composition diagnostique ou d'imagerie comprenant des nanoparticules telles que définies précédemment et, éventuellement, un excipient ou véhicule acceptable sur le plan physiologique.
L'excipient ou véhicule mis en œuvre peut être tout support habituel pour ce type d'applications, comme par exemple des solutions salines, isotoniques, stériles, tamponnées, etc. Les compositions de l'invention peuvent comprendre en outre des agents de stabilisation, des agents édulcorants, tensio-actifs, etc. Elles peuvent être formulées sous forme d'ampoules, de flacons, de comprimés, de gélules, en utilisant des techniques de galénique connues en soi.
Utilisations
Les compositions, particules et agrégats de l'invention peuvent être utilisés dans de nombreux domaines, particulièrement en médecine humaine ou animale.
Selon le temps d'exposition à la source d'excitation, les particules peuvent permettre la destruction de cellules ou de tissus ou, simplement, une visualisation (imagerie, diagnostic).
L'homme du métier est aisément en mesure d'adapter la durée d'exposition des nanoparticules selon l'invention à la source d'excitation en fonction de la nature et de l'intensité de ladite source, selon que la destruction des cellules ou leur visualisation est souhaitée. Dans le cadre d'une utilisation thérapeutique, les nanoparticules selon l'invention peuvent être exposées à une source d'excitation pendant une durée, habituellement comprise, par exemple, entre une seconde et deux heures, de préférence entre 30 minutes et une heure, encore plus préférentiellement pendant une durée inférieure ou égale à environ 30 minutes, par exemple 5, 10 ou 15 minutes. Dans le cadre d'une utilisation diagnostique, les temps d'exposition des nanoparticules selon l'invention varient généralement entre une seconde et environ 30 minutes, par exemple entre une minute et environ 20 minutes ou entre une seconde et environ 5 minutes, voire entre une et 60 secondes environ. Il est entendu que plus la surface exposée à la source d'excitation est importante, plus la durée d'exposition sera importante et que la durée d'exposition est par ailleurs inversement proportionnelle à l'intensité de la source d'excitation.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de compositions, ou nanoparticules telles que définies précédemment, en combinaison avec une source d'excitation adaptée au noyau de la nanoparticule, pour la préparation d'un médicament destiné à la destruction de cellules cibles.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans une méthode pour induire ou causer la lyse ou la destruction de cellules cibles, in vitro, ex vivo ou in vivo, comprenant la mise en contact de cellules cibles avec une ou des nanoparticules telles que définies précédemment, pendant une période de temps suffisante pour permettre aux nanoparticules de pénétrer dans des cellules cibles et, l'exposition des cellules à une source d'excitation adaptée au noyau des nanoparticules, ladite exposition induisant ou causant la lyse ou la destruction desdites cellules cibles.
Les cellules cibles peuvent être toutes cellules pathologiques, c'est-à-dire des cellules impliquées dans un mécanisme pathologique, par exemple des cellules prolifératives, telles que des cellules tumorales, sténosantes (cellules du muscle lisse), ou du système immunitaire (clones de cellules pathologiques).
Une application préférée réside dans le traitement (par exemple la destruction ou l'altération des fonctions) de cellules cancéreuses. A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de compositions ou nanoparticules telles que définies précédemment (en combinaison avec une source d'excitation adaptée au noyau des nanoparticules) pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement du cancer, comprenant l'administration à un patient atteint d'un cancer d'une composition ou de nanoparticules telles que définies précédemment, dans des conditions permettant aux nanoparticules de pénétrer dans les cellules cancéreuses, et le traitement ultérieur du patient en présence d'une source d'excitation adaptée au noyau des nanoparticules qui peut être choisie parmi un rayonnement, une radiation ou un champ externe, plus particulièrement parmi les rayons X et les rayons UV, un champ magnétique extérieur, des ultrasons, etc., conduisant à une altération, une perturbation ou une destruction fonctionnelle de cellules cancéreuses du patient, traitant ainsi le cancer.
L'invention est utilisable pour traiter tout type de cancer, notamment les tumeurs solides, métastasées ou non, par exemple choisies parmi les cancers du poumon, foie, rein, vessie, sein, tête-et-cou, cerveau, ovaires, prostate, peau, intestin, colon, pancréas, œil, etc.
L'invention est également utilisable pour traiter une pathologie cardio- vasculaire telle que l'athérosclérose par exemple ou pour traiter une pathologie neurodégénérative par exemple choisie parmi la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose en plaques. Le type de nanoparticules (et son effet thérapeutique associé) ainsi que la molécule de ciblage intra-cellulaire et la molécule de ciblage de surface, éventuellement présente, permettant de cibler spécifiquement des cellules ou tissus biologiques, peuvent ainsi être choisies en fonction du type de cellule ou tissu malade. Les stimuli peuvent être appliqués à tout moment après l'administration des particules, en une ou plusieurs fois, en utilisant tout système adapté déjà disponible tels que par exemple, un système de radiothérapie ou de radiographie (scanner par exemple). Les particules peuvent être administrées par différentes voies, de préférence par injection, systémique ou locale, ou de manière orale. Des injections ou administrations répétées peuvent être envisagées, si nécessaire.
Des exemples de rayonnements et d'intensité de rayonnements susceptibles d'être mis en œuvre pour exciter les particules comprenant un composé sensible aux rayons X en fonction de l'utilisation diagnostique ou thérapeutique souhaitée sont indiquées dans le document FR 04 05036 et rappelés ci-dessous :
De façon générale et non restrictive, les rayonnements suivants peuvent être appliqués dans différents cas pour exciter les particules :
- Rayons X superficiels (20 à 50 keV) : pour l'excitation de nanoparticules en superficie (pénétration de quelques millimètres).
- Rayons X pour le diagnostic 50 à 150 keV.
- Rayons X (ortho voltage) de 200 à 500 keV permettant de pénétrer des épaisseurs de tissus jusqu'à 6 cm.
- Rayons X (méga voltage) de 1000keV 25000keV. Pour exemple l'excitation de nanoparticules pour le traitement du cancer de la prostate peut se faire via 5 rayons X focalisés ayant une énergie de 15000keV.
La durée d'exposition à des rayons X tels que décrits ci-dessus pourra être aisément déterminée par l'homme du métier en fonction de l'utilisation thérapeutique ou diagnostique souhaitée et de la nature des nanoparticules.
Des champs magnétiques de 1.5, 4 ou 5 Teslas par exemple, de même que des champs supérieurs à 5 Teslas, peuvent par ailleurs être appliqués aux nanoparticules selon l'invention comprenant un composé sensible à un champ magnétique. L'homme du métier sera en mesure de déterminer lui-même le champ magnétique à appliquer et sa durée en fonction de l'utilisation thérapeutique ou diagnostique souhaitée. De même, l'homme du métier pourra aisément déterminer la durée et l'intensité d'une exposition à un rayonnement laser, UV ou à des ultrasons selon les applications envisagées et la nature des nanoparticules utilisées.
Dans le domaine diagnostic, les particules de l'invention sont utilisables comme agent de contraste, pour détecter et/ou visualiser tout type de tissu. Elles peuvent également être utilisées pour geler des équilibres réactionnaires et donc le fonctionnement cellulaire.
Ainsi, un objet de l'invention concerne l'utilisation de compositions, ou nanoparticules telles que définies précédemment, en combinaison avec un stimulus (source d'excitation des particules) adapté, pour la fabrication d'une composition destinée à la détection ou à la visualisation de cellules, tissus ou organes.
Les sources d'excitation adaptées sont celles mentionnées précédemment. Des cellules cibles susceptibles d'être détectées ou visualisées sont par exemple les cellules cancéreuses.
Le terme "en combinaison" indique que l'effet recherché est obtenu lorsque les cellules, tissus ou organes d'intérêt, ayant incorporé en partie des nanoparticules de l'invention, sont excités par la source déterminée. Toutefois, il n'est pas nécessaire que les particules et les stimuli soient administrés simultanément, ni selon le même protocole.
Le terme "traitement" désigne toute amélioration des signes pathologiques, comme notamment une diminution de la taille ou du développement d'une tumeur ou d'une zone tissulaire pathologique, la suppression ou la destruction de cellules ou tissus pathologiques, un ralentissement de la progression de la pathologie, une réduction de la formation de métastases, une régression ou une rémission complète, etc. Les particules de l'invention peuvent également être utilisées in vitro ou ex vivo.
D'autres aspects et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
La Figure 1 fournit une représentation schématique du principe de double ciblage (Module A : ciblage extra-cellulaire permettant la reconnaissance spécifique d'un type cellulaire, d'un organe, d'un tissu biologique du corps à traiter ; et Module B : ciblage intra-cellulaire permettant la reconnaissance spécifique d'une molécule ou d'une structure intra-cellulaire) avec des nanoparticules activables par un champ externe.
La Figure 2 présente les différents mécanismes d'action des nanoparticules en thérapie ou en diagnostic.
La Figure 3 indique le taux de survie des cellules MCF7 (lignée cellulaire d'origine humaine, cancer du sein) après incubation avec des nanoparticules photosensibles de l'invention et exposition ou non à un rayonnement Laser. Les conditions expérimentales sont les suivantes : a) Nanoparticules, mises en présence de rhodamine libre et de LHRH libre, les nanoparticules, la rhodamine et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules non exposées à un rayonnement Laser. Expérience effectuée pendant 10 minutes, sur 4 boites de pétri en parallèles. b) Nanoparticules, pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire, Le., la rhodamine (molécule de ciblage présentant une affinité pour les mitochondries), mises en présence de LHRH libre, les nanoparticules et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules exposées à un rayonnement Laser (10 minutes). Expérience effectuée sur 4 boites de pétri en parallèle. c) Nanoparticules pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire, i.e., la rhodamine, et d'un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques, i.e., LHRH (élément de ciblage de surface présentant une affinité pour les cellules cancéreuses), les nanoparticules étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules exposées à un rayonnement Laser (10 minutes). Expérience effectuée sur 4 boites de pétri en parallèles.
La Figure 4 indique le taux de survie des cellules MCF7 après incubation avec des nanoparticules magnétiques de l'invention et exposition ou non à un champ magnétique. Les conditions expérimentales sont : a) Nanoparticules, mises en présence de rhodamine libre et de LHRH libre, les nanoparticules, la rhodamine et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules non exposées au champ magnétique. Expérience effectuée pendant 10 minutes sur 4 boites de pétri en parallèle. b) Nanoparticules pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire, i.e., la rhodamine (molécule de ciblage présentant une affinité pour les mitochondries), mises en présence de LHRH libre, les nanoparticules et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules exposées au champ magnétique (10 minutes). Expérience effectuée sur 4 boites de pétri en parallèle. c) Nanoparticules pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire, i.e., la rhodamine, et d'un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques, i.e., LHRH (élément de ciblage de surface présentant une affinité pour les cellules' cancéreuses), les nanoparticules étant dispersées dans une solution isotonique. Cellules exposées au champ magnétique (10 minutes). Expérience effectuée sur 4 boites de pétri en parallèle.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Préparation de nanoparticules photosensibles dopées avec la protoporphyrine IX et ciblées
Des nanoparticules photosensibles dopées avec la protoporphyrine IX et ciblées, ont été synthétisées en utilisant le procédé suivant : a) 0.5 g d'AOT mélangés à 0.5 g de Butanol sont dissous dans 20ml d'eau distillée, b) 30 microlitre de DMF et 15nM de protoporphyrine IX sont ajoutés à la solution obtenue en a) et mélangés, c) du triethoxyvinylsilane (200 micro L) et du 3-aminopropyltriethoxysilane (10 microlitres) sont ajoutés au mélange obtenu en b) et mélangés pendant plusieurs heures, d) la solution obtenue en c) est dialysée et filtrée e) des molécules d'acide 3-(triéthoxylsilanylpropyl-carbamoyl)-butyrique sont ajoutées aux nanoparticules de la solution d), dispersées dans le DMF, le mélange est ensuite agité pendant 24h, f) L'élément de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire (rhodamine) et l'élément de ciblage de surface (LHRH) sont ajoutés au mélange obtenu en e) en utilisant la procédure décrite dans L. Levy et al., « Nanochemistry: Synthesis and Characterization of Multifunctional NanoBiodrugs for Biological Applications. » (Chem. Mater.; 2002; 14(9), 3715 - 3721), puis g) les nanoparticules sont récupérées et leur intégrité est contrôlée. EXEMPLE 2 : Préparation de trois échantillons pour l'expérimentation in vitro :
L'échantillon a) est constitué de nanoparticules, mises en présence de rhodamine et de LHRH libres, les nanoparticules, la rhodamine et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique.
L'échantillon b) est constitué de nanoparticules, pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra¬ cellulaire (rhodamine), mise en présence de LHRH, les nanoparticules et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique.
L'échantillon c) est constitué de nanoparticules pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra¬ cellulaire (rhodamine) et d'un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques (LHRH), lesdites nanoparticules étant dispersées dans une solution isotonique.
Les trois échantillons (a, b et c) sont ajoutés à des cellules MCF7 (lignée cellulaire d'origine humaine, cancer du sein) puis incubés 2Oh. La concentration utilisée est de 2 μmoles de particules par boite de pétri. Après incubation, les cellules contenant les échantillons a et b sont exposées 10 minutes à une source laser (650nm). Le taux de survie des cellules est mesuré 20 minutes après exposition.
L'expérience est répétée quatre fois afin d'avoir un résultat statistiquement significatif. Les résultats présentés sur la figure 3 montrent une efficacité (destruction cellulaire) plus importante des nanoparticules de l'échantillon c (avec le double ciblage).
EXEMPLE 3 : Préparation de nanoparticules magnétiques
Des nanoparticules magnétiques ont été synthétisées en utilisant le procédé suivant : a) 32g de Fe(NO3)3. et 8g de Fe(CI)2 sont coprécipités avec de la soude (13g) à une température de 7O0C sous agitation (réacteur de 1 litre) ; b) les nanoparticules obtenues en a), après rinçage à l'eau (PH =8), sont dispersées dans un mélange éthanol/eau (4/1 ). Le TEOS est ajouté (proportion masse TEOS = 1 ,2 masse particules) et agité pendant plusieurs heures ; c) des molécules d'acide 3-(triéthoxylsilanylpropyl-carbamoyl)-butyrique sont ajoutées au nanoparticules dispersées dans le DMF et agitée pendant 24h ; d) l'élément de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire (rhodamine) et l'élément de ciblage de surface (LHRH) sont ajoutés en utilisant la procédure décrite dans L. Levy et al., « Nanochemistry: Synthesis and Characterization of Multifunctional NanoBiodrugs for Biological Applications. » (Chem. Mater.; 2002; 14(9), 3715 - 3721).
EXEMPLE 4 : Préparation de trois échantillons pour l'expérimentation in vitro :
L'échantillon a) est constitué de nanoparticules, mises en présence de rhodamine et de LHRH libres, les nanoparticules, la rhodamine et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique.
L'échantillon b) est constitué de nanoparticules, pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra¬ cellulaire (rhodamine), mise en présence de LHRH, les nanoparticules et la LHRH étant dispersées dans une solution isotonique.
L'échantillon c) est constitué de nanoparticules pourvues d'une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra¬ cellulaire (rhodamine) et d'un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques (LHRH), lesdites nanoparticules étant dispersées dans une solution isotonique.
Les trois échantillons (a, b et c) sont ajoutés puis incubés 2Oh avec des cellules MCF7. La concentration utilisée de particules est de 0,5 picogrammes par boite de pétri. Après incubation, les cellules contenant les échantillons b) et c) sont exposées 10 minutes à un champ magnétique unidirectionnel (4.7Tesla). Le taux de survie des cellules est mesuré 20 minutes après exposition. L'expérience est répétée quatre fois afin d'avoir un résultat statistiquement significatif. Les résultats présentés sur la figure 4 montrent une efficacité (destruction cellulaire) plus importante des nanoparticules de l'échantillon c) (avec le double ciblage).

Claims

REVENDICATIONS
1. Nanoparticule composite biocompatible, comprenant :
- un noyau comprenant au moins un composé inorganique ou organique activable par excitation,
- de manière facultative, un enrobage biocompatible, et
- au moins une molécule de ciblage, exposée à la surface de la particule, présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire.
2. Nanoparticule selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le noyau comprend un oxyde métallique ou un métal non oxydé, permettant un retournement physique de la particule sous l'effet d'un champ magnétique.
3. Nanoparticule selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le noyau comprend une molécule photosensible, permettant la production de chaleur ou de radicaux libres sous l'effet d'une lumière LASER.
4. Nanoparticule selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le noyau comprend un composé semi-conducteur ou une solution mixte, éventuellement dopé(e) avec une terre rare, ou une molécule organique, permettant la production de chaleur ou de radicaux libres sous l'effet d'une lumière UV ou Laser.
5. Nanoparticule selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le noyau comprend un composé inorganique sous forme d'oxyde, hydroxyde, oxysulfure, de sel ou de mélanges de ces derniers éventuellement dopés avec une terre rare, ou de métal non oxydé, permettant la production de chaleur ou de radicaux libres sous l'effet de rayons X.
6. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'enrobage éventuellement présent est composé d'une structure inorganique ou organique, amorphe ou cristalline.
7. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la molécule de ciblage est une molécule biologique ou chimique présentant une affinité pour une molécule présente dans une cellule humaine ou animale telle qu'un peptide, un polypeptide, un acide nucléique, un nucléotide, un lipide ou un métabolite.
8. Nanoparticule selon la revendication 7, caractérisée en ce que la molécule de ciblage présente une affinité pour une molécule d'une membrane intracellulaire ou nucléaire, une molécule du cytosquelette, une molécule cytoplasmique ou une mitochondrie.
9. Nanoparticule selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la molécule de ciblage présente une affinité pour une enzyme, un récepteur nucléaire, un facteur de transcription ou de traduction, un co-facteur ou un substrat naturel ou synthétique injecté artificiellement dans une cellule cible.
10. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 7-9, caractérisée en ce que la molécule de ciblage est un anticorps, un ligand de récepteur, un récepteur de ligand ou un fragment ou un dérivé de ceux-ci.
11. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en en ce que la molécule de ciblage est liée à l'enrobage éventuellement présent ou au noyau constitutif de ladite particule.
12. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en en ce qu'elle comprend en outre un élément de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques.
13. Nanoparticule selon la revendication 12, caractérisée en en ce que l'élément de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou des tissus biologiques est lié à l'enrobage éventuellement présent ou au noyau de ladite particule.
14. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en en ce que la molécule de ciblage et/ou l'élément de surface sont liés à l'enrobage via un groupe fonctionnel (Ch^)nCOOH dans lequel n est un entier allant de 1 à 10.
15. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que sa taille est comprise entre 4 et 1000 nm, de préférence entre 300 et 1000 nm, encore plus préférentiellement entre 4 et 250 nm, entre 4 et 100 nm ou entre 4 et 50 nm.
16. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que sa forme est essentiellement sphérique.
17. Procédé de production de nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, comprenant :
- la formation d'un noyau comprenant un ou plusieurs composés tels que définis dans les revendications 1 à 15,
- l'enrobage éventuel du noyau,
- la fixation d'au moins une molécule de ciblage présentant une affinité pour une molécule ou une structure intra-cellulaire à la surface de ladite particule ainsi formée éventuellement enrobé(e) et, éventuellement
- la fixation d'au moins un élément de ciblage de surface permettant de cibler spécifiquement des cellules ou tissus biologiques.
18. Composition pharmaceutique ou diagnostique comprenant des nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16.
19. Utilisation de nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ou d'une composition selon la revendication 18, en combinaison avec une source d'excitation adaptée au noyau des nanoparticules, pour la préparation d'un médicament destiné à la destruction de cellules cibles.
20. Utilisation de nanoparticules selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ou d'une composition selon la revendication 18, en combinaison avec une source d'excitation adaptée au noyau des nanoparticules, pour la préparation d'une composition destinée à la détection ou à la visualisation de cellules, tissus ou organes.
21. Utilisation selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en ce que les cellules cibles sont des cellules cancéreuses.
22. Utilisation selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en ce que la source d'excitation est un rayonnement, une radiation ou un champ externe.
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