EP1805301A1 - Souche de levure génétiquement modifiée présentant une production et une excrétion accrue de s-adénosylméthionine (sam) - Google Patents

Souche de levure génétiquement modifiée présentant une production et une excrétion accrue de s-adénosylméthionine (sam)

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EP1805301A1
EP1805301A1 EP05815142A EP05815142A EP1805301A1 EP 1805301 A1 EP1805301 A1 EP 1805301A1 EP 05815142 A EP05815142 A EP 05815142A EP 05815142 A EP05815142 A EP 05815142A EP 1805301 A1 EP1805301 A1 EP 1805301A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gene
strain
genetically modified
adenosylmethionine
gene coding
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05815142A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Dominique Thomas
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1805301A1 publication Critical patent/EP1805301A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/38—Nucleosides
    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
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    • A61P25/24—Antidepressants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0102—Adenosine kinase (2.7.1.20)

Definitions

  • the present invention relates to a genetically modified yeast strain having increased production and excretion of S-adenosylmethionine (SAM), its use for the production of SAM, and pharmaceutical compositions comprising it.
  • SAM S-adenosylmethionine
  • SAM S-adenosylmethionine
  • SAM S-adenosylmethionine
  • ATP methionine and adenosine triphosphate
  • This synthesis catalyzed by SAM synthetases (ATP: L-methionine S-adenosyltransferase, EC 2.5.1.6), can be considered as the terminal step of the metabolism of sulfur amino acids.
  • SAM synthetases ATP: L-methionine S-adenosyltransferase, EC 2.5.1.6
  • This reaction is quite exceptional because it involves the total dephosphorylation of the ATP molecule used (Methionine + ATP ⁇ SAM + PPi + Pi) and therefore represents a particularly high energy expenditure.
  • SAM is certainly the molecule that, after ATP, participates in the greatest number of cellular reactions.
  • SAM plays the role of quasi-universal donor of methyl group in the transmethylation reactions of proteins, nucleic acids, lipids, etc.
  • SAM also serves as donor of carboxyaminopropyl group in base modification reactions. of ribosomal RNA or transfer, or also during the synthesis of diphthinamide, a posttranslational modification of a histidine residue found in the EF2 elongation factor in eukaryotic organisms.
  • SAM also serves as an amino group donor in the biosynthesis of biotin in microorganisms.
  • SAM is also used as a precursor to the syntheses of polyamines, spermine and spermidine, where after an initial decarboxylation step, it fulfills the role of aminopropyl group donor (Cantoni, 1982, "The biochemistry of S-adenosyhnethionine", Columbia University Press, NY). This non-exhaustive description of the various metabolic functions of SAM demonstrates the central role played by this molecule in intermediate metabolism.
  • S-adenosylmetbionine is indicated for the treatment of depression (SAMYR®). It has also been implicated in the treatment of male infertility (Piacentino et al., (1991) Minerva Gynecol 43: 191-193), rosteoarthritis (Najm et al., (2004) BMC Muscoskeletal Disord .5: 6-21) and fibromyalgia (Tavoni et al (1998) Clin Exp Rheumatol 16: 106-107).
  • SAM's industrial production processes involve microbiological production that is carried out in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • patent application US 2002/0192784 relates to yeast strains Saccharomyces cerevisiae having an increased production of SAM which have been genetically modified by the introduction of a chimeric gene coding for a methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) composed in part of the enzyme Ai'abidopsis thaliana and part of the yeast enzyme.
  • MTHFR methylene tetrahydrofolate reductase
  • the SAM does not appear to be excreted by these yeast strains, which makes the process of obtaining the SAM from these strains of little interest in an industrial production perspective, insofar as the extraction of the SAM from yeast cells is a relatively long and expensive process; on the other hand, the purification of SAM from the culture medium of the yeast strains is particularly easy.
  • the yeast strains described in this document are genetically modified by the introduction of heterologous nucleic sequences, which poses a biological safety problem, because the effects, especially on human health, of these new nucleic sequences and proteins they code are not known.
  • Shiomi et al. (1995) Appl. Microbiol Biotechnol. 42: 730-733 discloses a yeast strain Saccharomyces cerevisiae having increased production of SAM, genetically modified by the introduction of additional copies of an ethionine resistance gene.
  • the SAM does not appear to be excreted by the yeast strains described in these two documents, moreover the production of SAM by these strains appears to be too weak for an industrial application.
  • An object of the present invention is therefore to provide genetically modified yeast strains having a production and / or excretion of SAM greater than the yeast strains of the prior art.
  • Another object of the invention is to provide genetically modified yeast strains not comprising heterologous nucleic sequences, that is to say not coming from an organism of a species different from that of the yeast considered.
  • Yet another object of the invention is to use the genetically modified yeast strains of the invention for the industrial production of SAM.
  • Another object of the invention is to provide pharmaceutical compositions comprising the genetically modified yeast strains of the invention.
  • the present invention stems, in particular, from the demonstration by the inventors that a yeast strain for which the ADO1 gene, which codes for yeast adenosine kinase, has been inactivated has increased S-adenosylmethionine production and excretion. relative to the corresponding wild strain.
  • the present invention relates to the use of a genetically modified yeast strain, wherein the gene encoding adenosine kinase has been inactivated by genetic modification, for the production of S-adenosylmethionine (SAM).
  • SAM S-adenosylmethionine
  • Yeast means any fungus of unicellular type. Yeasts include the genera Saccharomyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, and Kluyveromyces.
  • Adenosine kinase is also called adenosine phosphotransferase.
  • the gene coding for adenosine kinase is the ADO1 gene corresponding to the open reading phase YJR1 05w (Lecoq et al (2001) Yeast 18: 335-342) and is especially represented by SEQ ID NO : 1.
  • SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 1.
  • the invention thus relates to the use of a genetically modified yeast strain, in which the ADO1 gene coding for adenosine kinase has been inactivated by genetic modification, for the production of S-adenosylmethionine (SAT).
  • SAT S-adenosylmethionine
  • a yeast gene is said to be “inactivated” when the product for which it codes is not expressed in said yeast.
  • this gene is said to be inactivated if the adenosine kinase is not expressed.
  • point mutations into the coding sequence of the gene in question, such as: nucleotide substitutions leading to missense mutations (amino acid change in the protein encoded by the gene to be inactivated) or nonsense (stop codon); insertions or deletions of nucleotides leading to an interruption of the open reading phase of said gene;
  • nucleotide sequences coding for example, for selection genes within the coding sequence of the gene to be inactivated
  • nucleotide sequences coding for example, for selection genes
  • a selection gene is usually an antibiotic resistance gene (for example a geneticin resistance gene) or a wild-type copy of a gene coding for a yeast metabolism step (for example URA3, TRP1, LEU2, or HISS), which gene is mutated and inactive in the yeast that is to be modified.
  • an antibiotic resistance gene for example a geneticin resistance gene
  • a wild-type copy of a gene coding for a yeast metabolism step for example URA3, TRP1, LEU2, or HISS
  • the sequence of the gene coding for adenosine kinase has been genetically modified by mutation.
  • mutation of a given nucleotide sequence, the insertion, substitution and / or deletion of one or more nucleotides in said nucleotide sequence.
  • the gene sequence coding for the adenosine kinase of the genetically modified strain defined above has been disrupted.
  • disruption of the sequence of a gene means the interruption of the coding sequence of said gene by the introduction of a nucleotide sequence within this coding sequence. In general, this introduction is accompanied by the substitution of a substantial part of the coding sequence, or of the entire coding sequence, by the introduced sequence. This introduced sequence is usually a selection gene.
  • the genetically modified strain defined above has at least one other genetic modification chosen from the group comprising:
  • yeast S-adenosylmethionine synthetase 1 The gene coding for yeast S-adenosylmethionine synthetase 1 is in particular represented by the SAM1 gene of Saccharomyces cerevisiae (Thomas and Surdin-Kerjan (1987) J. Biol Chem, 262: 16704-16709).
  • yeast S-adenosylmethionine synthetase 2 is especially represented by the SAM2 gene of Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al (1998) Mol., Cell Biol., 8: 5132-5139).
  • the gene coding for the high affinity transporter of S-adenosyhnethionine is notably represented by the SAM3 gene of Saccharomyces cerevisiae (Rouillon et al., J. Biol Chem 274: 28096-28105).
  • the gene coding for S-adenosylmethionine homocysteine methyl transferase is notably represented by the Saccharomyces cerevisiae SAM4 gene (Thomas et al., (2000) J Biol Chem 275: 40718-40724).
  • the gene coding for S-methyln ⁇ ethionine homocysteine methyl transferase is especially represented by the MHT1 gene of Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al., (2000) J. Biol Chem 275: 40718-40724).
  • the gene coding for the Met30 receptor subunit of the Met3 ° SCF ubiquitin ligase ligase is notably represented by the Saccharomyces cerevisiae METSO gene (Patron et al., (1998) Gene Dev 12: 692-705).
  • the gene coding for the low affinity methionine permease is, in particular, represented by the Saccharomyces cerevisiae AGP1 gene (Iraqui et al (1999) Mol, Cell Biol 19: 989-1001).
  • the gene coding for high affinity methionine permease is in particular represented by the MUP1 gene of Saccharomyces cerevisiae (Isnard et al (1996) Mol Mol Biol 262: 473-484).
  • the gene coding for the methionine permease with very low affinity is especially represented by the MUP 3 gene of Saccharomyces cerevisiae (Isnard et al (1996) J Mol Biol 262: 473-484).
  • a gene coding for a broad-spectrum permease capable of transporting methionine is especially represented by the BAP2 gene or by the BAPS gene of Saccharomyces cerevisiae (Regenberg et al (1999) Curr, Genet 36: 317-328).
  • the genetically modified strain defined above has at least one other genetic modification chosen from the group comprising:
  • the SAM1 sequence of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 3) and of its translation product, the Samlp protein (SEQ ID NO: 4), is that deposited in the EMBL databank 3 identifying "SCSAMl", access number J03477. -
  • the sequence of the SAM3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 7) and of its translation product, the Sam3p protein (SEQ ID NO: 8), is that deposited in the EMBL databank, identifier "SCYPL274W”. access number Z73630.
  • the sequence of the SAM4 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 9) and of its translation product, the Sam4p protein (SEQ ID NO: 10), is that deposited in the EMBL databank, identifier "SCYPL273W”. access number Z73629.
  • the sequence of the MHT1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 11) and of its translation product, the Mhtlp protein (SEQ ID NO: 12), is that deposited in the EMBL databank, identifier "SCYLL062C", access number Z73167.
  • sequence of the AGPl gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 13) and of its translation product, the Agplp protein (SEQ ID NO: 14), corresponds to the sequence of the ORF YCL025C and is included in the sequence deposited in the EMBL database, identifier "SCCHRIII", accession number X59720.
  • the sequence of the BAP2 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 15) and of its translation product, the Bap2p protein (SEQ ID NO: 16), is that deposited in the EMBL databank, identifier "SCYBRO68C", access number Z35937.
  • the sequence of the BAP 3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 17) and of its translation product, the Bap3p protein (SEQ ID NO: 18), corresponds to the sequence of the ORF YDR046C and is included in the sequence deposited in the EMBL database, identifier "SC9609X", access number Z49209.
  • the inactivation of genes coding for the high affinity transporter of S-adenosylmethionine, for S-adenosylmethionine-homocysteine methyl transferase, S-methylmethionine-homocysteine methyl transferase, and the Met30 receptor subunit of the ubiquitin ligase complex is advantageousously, the inactivation of genes coding for the high affinity transporter of S-adenosylmethionine, for S-adenosylmethionine-homocysteine methyl transferase, S-methylmethionine-homocysteine methyl transferase, and the Met30 receptor subunit of the ubiquitin ligase complex.
  • gCF Met30 in a yeast strain makes it possible to increase the production and / or the excretion of SAM by said strain.
  • this copy may be carried by an autonomously replicating vector such as an artificial plasmid or chromosome, or be inserted into one or more chromosomes of said genetically modified strain.
  • the genetically modified strain defined above carries a modified copy of the gene coding for methylene tetrahydrofolate reductase (METl 3 for Saccharomyces cerevisiae, Raymond et al (1999) Arch Biochem Biophys. 372: 300-308), the corresponding enzyme is no longer inhibited by SAM.
  • methylene tetrahydrofolate reductase METl 3 for Saccharomyces cerevisiae, Raymond et al (1999) Arch Biochem Biophys. 372: 300-308
  • the sequence of at least one of the genes of the genetically modified strain defined above is chosen from the group comprising the gene coding for the high affinity transporter of S-adenosylmethionine.
  • the gene encoding S-adenosylmethionine homocysteine methyl transferase, the gene coding for S-methyhnethionine homocysteine methyl transferase, and the gene coding for the Met30 receptor subunit of the Met30 SCF ubiquitin ligase complex was disrupted.
  • strong promoter refers to a promoter conferring on the gene placed under its control, that is to say, generally directly downstream of the promoter sequence, a level of transcription higher than the average level of transcription of the genes in the yeast. Strong yeast promoters are described in particular in Velculescu et al. (1997) Cell 88: 243-251.
  • the promoter sequence of the GAL1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae used in the following descriptions corresponds in particular to the sequence described by Johnston and Davis (1984) Mol CeIl Biol. 4: 1440-1448.
  • the sequence of the promoter of the TEF1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae used in the following descriptions corresponds in particular to the sequence described by Schaaff-Gerstenschlager et al. (1993) EUT. J. Biochem. 217: 487-492).
  • the promoter sequence of the PGK1 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae used in the following descriptions corresponds in particular to the sequence described by Bonneau et al. (1991) Yeast 87: 609-615).
  • the promoter sequence of the PH05 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae used in the following descriptions corresponds in particular to the sequence described by Feldmann ⁇ /. (1994) MSO J. 13: 5795-5809).
  • the use of a strong promoter makes it possible to increase the level of transcription of the genes placed under its control and therefore the level of translation of the corresponding proteins, which induces an increase in SAM synthesis.
  • the genes encoding the Met30 receptor subunit of the Met30 SCF ubiquitin ligase complex , S-methylmethionine-homocysteine methyl transferase, adenosine kinase, and S-adenosylmethionine-homocysteine methyl transferase of the genetically modified strain defined above are inactivated, in particular by disruption of the sequences of said genes.
  • an additional copy of the gene sequence coding for S-adenosylmethionine synthetase 2, coupled to a strong promoter, has been introduced into the genome of the genetically modified strain defined above.
  • the promoter sequence of the low affinity methionine permease gene of the genetically modified strain defined above has been substituted by the sequence of a strong promoter.
  • the gene coding for the high affinity transporter of S-adenosylmethionine and the gene coding for S-adenosylmethionine homocystem methyl transferase of said strain have been inactivated by substitution of the sequence said genes by a copy of the gene sequence coding for S-adenosylmethionine synthetase 2, coupled to a strong promoter.
  • the strong promoter defined above is chosen from the group comprising the natural promoters of the genes PGK1, ADH1, TDH3, TEF1, PHO5, LEU2, GAL1 of the genetically modified strain defined herein. - above.
  • the genetically modified strain defined above is prototrophic for adenine.
  • prototroph for adenine means that the strain defined above does not require an exogenous supply of adenine for its growth and that it is capable of ensuring alone the production of adenine necessary for its survival and / or its growth. This means that genes involved in the adenine synthesis pathway are functional.
  • the strains defined above carry a wild-type, that is to say non-mutated, allele of the gene which codes for phosphoribosylaminoimidazole carboxylase (ADE2 in Saccharomyces cerevisiae).
  • the yeast strain genetically defined above is haploid.
  • the genetically modified yeast strain defined above is diploid.
  • the genetically modified yeast strain according to the invention is characterized in that when the genetic modifications are chromosomal, said genetic modifications are carried by each of the two homologous chromosomes.
  • the genetically modified yeast strain according to the invention does not comprise hetero nucleotide nucleotide sequences.
  • heterologous refers to nucleotide sequences that are not found naturally in yeast cells belonging to the same yeast species as that of the strain in question.
  • the yeast strain genetically modified according to the present invention is chosen from the group comprising yeasts of the genus Saccharomyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, and Kluyveromyces, and that said strain is in particular a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae.
  • the strain belongs to the Saccharomyces cerevisiae species and when the gene coding for the Met30 receptor subunit of the Met3 ° sCF ubiquitin ligase complex (MET30) of said strain is inactivated, in particular by disruption of the MET30 gene sequence, then the MET4 gene and / or the MET32 gene of said strain is also inactivated, in particular by disruption of the corresponding gene sequences.
  • the MET4 gene encodes the main transcriptional activator of sulfur amino acid metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al (1992) Mol., Cell Biol., 12: 1719-1727).
  • the MET32 gene encodes a transcription factor involved in the regulation of the metabolism of sulfur-containing amino acids in the yeast Saccharomyces cerevisiae (Blaiseau et al (1997) Mol., Cell Biol., 17: 3640-3648).
  • the sequence of the MET4 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 19) and of its translation product, the Met4p protein (SEQ ID NO: 20), is that deposited in the EMBL databank, identifier "SCMETBLZP”. access number M84455.
  • the sequence of the MET32 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae (SEQ E ) NO: 21) and of its translation product, the Met32p protein (SEQ ID NO: 22), is that deposited in the EMBL databank, identifier "AY557729”. , access number AY557729.
  • the present invention also relates to a genetically modified yeast strain having increased production and excretion of S-adenosylmethionine relative to the corresponding unmodified yeast strain, said genetically modified strain being as defined above.
  • the present invention also relates to a process for producing S-adenosylmethionine, characterized in that it comprises the steps of:
  • the genetically modified yeast strains of the invention excrete a large quantity of SAM in their culture medium, which allows an easy recovery of this product, without it being necessary to extract it from the yeasts, whose cell wall is particularly resistant.
  • the culture is carried out in a chemostat.
  • a chemostat allows a continuous culture of yeasts.
  • chemostat is in particular denoted by a bioreactor in which the supply of nutrient medium and the evacuation of the culture medium containing the yeasts are carried out continuously, so as to maintain substantially constant physico-chemical parameters of the culture while recovering the culture medium.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises as active substance at least one yeast strain as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • Yeasts are known to be able to take place easily in the human intestine, the ingestion of cells of the yeast strains according to the invention, possibly lyophilized, could thus make it possible to increase the intake of SAM in individuals in need on a relatively long period, corresponding approximately to the duration of the colonization of the intestine by the yeasts.
  • the present invention also relates to the use of a genetically modified yeast strain as defined above, for the preparation of a medicament for the treatment of diseases requiring an increased intake of S-adenosylmethionine, such as depression, laryngeal arthritis, fibromyalgia, or male infertility.
  • diseases requiring an increased intake of S-adenosylmethionine such as depression, laryngeal arthritis, fibromyalgia, or male infertility.
  • the present invention also relates to the use of a genetically modified yeast strain as defined above, for the preparation of food or drinks enriched in S-adenosylmethionine.
  • yeast strains of the invention for the preparation of certain foods or beverages (such as bread or beer in the case of Saccharomyces cerevisiae allows their spontaneous enrichment in SAM.
  • the present invention also relates to a food preparation or a drink, intended for human or animal food, characterized in that it comprises at least one genetically modified yeast strain as defined above.
  • FIG. 1 schematizes the steps of cloning the MHT1 gene of Saccharomyces cerevisiae.
  • FIG. 2A schematizes the cloning of the Saccharomyces cerevisiae SAM2 gene under the control of the strong promoter of the PGK1 gene.
  • FIG. 2B schematizes the steps of disruption of the SAMS and SAM4 genes of Saccharomyces cerevisiae by the substitution of a copy of the SAM2 gene under the control of the PGK1 gene promoter.
  • Figure 3 schematizes the cloning of the Saccharomyces cerevisiae AGPl gene under the control of the strong promoter of the PGK1 gene.
  • each gene is designated by three italic letters followed by a number, for example ADO1.
  • the dominant alleles in this case, the wild-type allele
  • URA3 denotes the insertion of the URA3 gene at the ADOJ locus, in which URA3 is functional and adol is defective.
  • the protein encoded by a given gene is designated by the name of the gene where the first letter is in uppercase and the other two in lower case, followed by the letter "p", for example Ado Ip for the ADO1 gene product.
  • CC788-2B (MATa, his3, leu2, ura3, trpl), described in Chérest et al. (2000) J Biol. Chem. 275: 14056-14063, and
  • CC788-2D (MAT ⁇ , his3, Ieu2, ura3, trpl) described in Chérest et al. (2000) J Biol. Chem. 275: 14056-14063.
  • test strain which is a particular strain of Saccharomyces cerevisiae genotype MATa 1 his3, Ieu2, ura3, ade2, trp, saml :: LEU2, sam2 :: HIS3 which has a disruption of the two genes SAM1 and SAM2 encoding SAM synthetases and whose growth absolutely requires a contribution of exogenous SAM.
  • this strain is cultured in medium containing increasing concentrations of supernatant cultures of strains tested. The yield of the cultures thus produced is proportional to the amount of SAM present in the supernatant.
  • a calibration curve is performed at each experiment using SAM.
  • the strain to be tested is cultured for 24 hours in 5 ml of complete YPD medium (Kuras et al., 2002, 2002, Mol., CeIl 10, 69-80). After centrifugation, all the cells are transferred into 5 ml of production medium and incubated with stirring for 24 hours at 30 ° C. The culture supernatants are then recovered by removing the cells by centrifugation followed by filtration on 0.45 micron filters and aliquots of these supernatants are added to cultures of the test strain.
  • EXAMPLE 1 EXAMPLE 1
  • SAM S-adenosylmethionine
  • yeast strains whose growth would be greatly altered by the presence in the culture medium of large amounts of SAM or one of its precursors, methionine or cysteine.
  • a haploid strain of wild-type Saccharomyces cerevisiae (W303-1 A) was mutagenized with ethyl methane sulphonate and colonies showing growth defects in high concentrations of organic sulfur compounds, but still able to grow on low concentrations of these same compounds have been sought.
  • the latter phenotype thus demonstrates that the mutations cys5-l and cys6-1 are different from the mutations str1 and str4 (also called cys1 and cys4, respectively) which are the only two mutations known to date which lead to a non-growth phenotype on cysteine ( Chérest and Surdin-Kerjan, 1992, Genetics 130, 51-58).
  • a genomic library consisting of DNA fragments obtained by partial HindIII digestion of the DNA of a wild strain X2180-1 A, cloned into the shuttle vector pEMBLYe23 (Baldari and Cesarini, 1985, Gene 35, 27-32) was used and used to search for plasmids capable of restoring 5 mM cysteine growth of cys5-1 and cys6-1 mutant strains.
  • the CYS5 gene corresponds to the gene specifying S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase and called SAH1.
  • SAH S-adenosylhomocysteine
  • the CYS6 gene (YIR1 05w) is equivalent to the ADO1 gene and codes for adenosine kinase (Lecoq et al., 2001, Yeast 18, 335-342).
  • the ADO1 gene was inactivated in a W303 diploid and the resultant diploid sporulation (adol :: URA3 / ADO1) spore analysis showed that half of the 40 spores studied were unable to grow on minimal medium containing 5 rM. L-cysteine. All spores unable to grow on 5 mM cysteine are protracted for uracil and therefore correspond to spores comprising an inactivated allele of the ADO1 gene.
  • the ADO1 gene was cloned by functional complementation of a strain carrying a mutation in the ADO1 gene.
  • the library used was constructed by inserting the product of the partial digestion with the restriction enzyme HmdIII of the chromosomal DNA isolated from strain X2180-1A into the plasmid site pEMBLYe23 (1) Baldari and Cesarini, 1985, Gene 35, 27-32).
  • the plasmid thus isolated by functional complementation carried a 1690 bp fragment containing the ADO1 gene deleted from the first 176 base pairs of the open reading phase.
  • the plasmid carrying the ADO1 region was digested with the restriction enzyme EcoRI and self-ligated, thus leading to the removal of the 2 micron fragment of the plasmid pEMBLYe23 (Baldari and Cesarini (1985) Gene 35: 27-32) and therefore to a plasmid incapable of replicating in yeast.
  • the Aspl1 8-Asp178 (460 bp) fragment internal to the open reading phase was then replaced by the URA3 selection gene. This leads to the elimination of an Adolp fragment bounded by codons 118 and 271.
  • strains carrying a mutation inactivating the ADO1 gene to excrete SAM were then analyzed.
  • the ADO1 gene was therefore disrupted in the CC788-2B and CC788-2D strains, as described above, to give the CY78-3B and CY78-8B strains of MATa genotype, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol. :: URA3 and MATa, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol :: URA3. respectively.
  • a decrease in catabolism of SAM was thus obtained by inactivating the ADO1 gene, which modifies the functioning of the methyl cycle, this decrease in SAM catabolism accompanied by an overproduction and an increased excretion of SAM. It is important to note, however, that the methyl cycle is not the only way to recycle SAM. In fact, it has recently been demonstrated that SAM recycling can also take place via a homocysteine methylation reaction. using SAM as a methyl group donor.
  • the MHT1 gene was cloned by the "GAP repair” method (Rothstein (1991) Methods Enzymol 194: 281-301, Mallet and Jacquet (1996) Yeast 12: 1351-1357, see Figure 1).
  • the DNA fragments included in the 5 '(A) and 3' (B) regions of the MHT1 gene were amplified by PCR using oligonucleotides bearing Clal and EcoRI (A) or EcoR1 and Bam1l ( ⁇ ) sites.
  • Olil CCATCGATGGCACAGAGCATAGATGCGCCGACC (SEQ ID NO: 23) (CM site in bold) OH 2: GGAATTCCGAAGGTTTGCTGTATTCGGAGC (SEQ ID NO: 24) (EcoKL site in bold) Oli3: GGAATTCCCCCCTTGCTGTGGCATGCTAG (SEQ ID # 25) (EcoKL site in bold) OR4: CGGGATCCCGGTATAGCGAAGGTTGTTGTCCC (SEQ ID NO: 26) (BamHI site in bold) The amplification leads to obtaining 232 bp (A) and 344 bp (B) fragments, which have been digested with EcoR1 and either with Clal ( A), or Bam ⁇ l (B).
  • the fragments thus digested are ligated with plasmid pRS314 digested with ClaI and BamHI, as shown in the figure above.
  • the Ncol-HpaI fragment of plasmid pRS314-MHT1 was replaced by a BamHI-Bam1 fragment carrying the Saccharomyces cerevisiae HIS3 selection gene (pRS314: Sikorski and Hieter (1989) Genetics 122: 19-27
  • the sequence of the plasmid pRS314 is that deposited in the EMBL database, identifier "PRS314", accession number U03440). This leads to the elimination of codon 128 at codon 236 of Mhtlp.
  • the plasmid was then digested with ClaI and BamHI and the fragment obtained was used for one-step disruption by transforming strain CY251-17D (Mat-a, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, adol :: URA3, sarn4 :: proSAM4-SAM2, and selecting prototrophic transformants for histidine
  • the disruption was verified by PCR using primers complementary to sequences adjacent to the MET32 ORF.
  • the SAM4 gene was cloned and inactivated as described in Thomas et al. (2000) J. Biol. Chenu 275: 40718-40724.
  • the mutant triple strains MATa / ⁇ , Ms3, Ieu2, ura3, trp1, adol :: URA3, mhtl :: HIS3, sam4 :: URA3 obtained, are therefore totally deficient for the catabolism of the SAM associated with its use as a methyl group donor.
  • the simultaneous presence of these three mutations significantly increases the amount of SAM produced and excreted by the yeast cells.
  • the CY168-14A and CY168-1C strains were obtained by crossing the CY78-3B strains (Mata, his3, Ieu2, ur ⁇ 3, trp1, ⁇ dol :: URA3) and CY55-5A (M ⁇ t ⁇ , Ms3, Ieu3, ur ⁇ 3, ⁇ de2, trpl, s ⁇ m4 :: URA3, mhtl :: HIS3) and sporulating the diploids obtained, then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the desired gene recombinations.
  • the modification of the downregulation of the SAM biosynthesis could be obtained by inactivating the METiO gene which codes for the Met30 receptor subunit of the Met3 ° SCF ubiquitin ligase ligand (Patton et al, 1998, Genes Dey., 12, 692 -705).
  • the Met30p protein is an essential enzyme for maintaining the viability of yeast cells and the inactivation of the MET30 gene is lethal.
  • the Met30p protein is not essential for yeast cells if they do not express at the same time either the Met4p protein or the Met32p protein (Patton et al., 2000, The Embo J 19, 1613-1624).
  • a BamHI-BamHI DNA fragment carrying the METiO gene was cloned into the plasmid pUC19 as described in Thomas et al (1995) Mol. CeIl Biol 15: 6526-6534. The resulting plasmid was digested with EcoRY and dephoshorylated. A BglII-BglII fragment carrying the URA3 gene whose ends were made blunt is ligated with the EcoRV-dephosphorylated pUC19 plasmid, giving a plasmid carrying the MET30 gene disrupted by the URA3 gene. This results in the elimination of codons 264 to 448 from Met30p.
  • the diploid strain W303 was then transformed with the BamH1-SalI fragment and the prototrophic transformants for uracil were selected (one-step disruption, Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301). Homologous recombination thus led to the interruption of one of the chromosomal copies of the MET30 gene by the URA3 gene. This was verified by "Southern Blotting" using a radiolabeled probe corresponding to the URA3 gene. Analysis of the diploid progeny thus obtained (CD 126) heterozygous for the mutation met30 :: URA3 showed that the tetrads contained only two viable spores as had previously shown (Thomas et al., 1995, Mol.
  • strains carrying the two mutations met30 ⁇ , met4 ⁇ or met30A, met32 ⁇ are viable (Patton et al., 2000, The Embo J. 19, 1613-1624).
  • a HindIII-EcoRI DNA fragment carrying the MET32 gene was cloned into plasmid pUC9.
  • the TRPl gene of Saccharomyces cerevisiae was then inserted into the unique SwaI site present in the open reading phase of the MET32 gene (Blaiseau et al., (1997) Mol., Cell Biol., 17: 3640-3648).
  • the plasmid thus modified was digested with HinS ⁇ 1 and EcoRI and the resulting fragment (3680 bp) was used for one-step disruption (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301) by transforming strain W303-1A and selecting prototrophic transformants for tryptophan. The disruption was verified by polymerase chain reaction (PCR).
  • the strain CY82-7C was obtained by crossing the CC867-1D strains ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl, met32 :: TKPl, met30 :: URA3) and CY78-3B ⁇ Mata, Hs3, Ieu2, ura3 trpl, adol :: URA3) and sporulating the diploids obtained, then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the desired gene recombinations.
  • the CY154-17A strain was obtained by crossing the CC867-1D ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl, met32 :: TRP1, met30 :: URA3) and CY82-7C ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3 strains. , trpl, adol :: URA3, met32 :: TRP1).
  • This double inactivation of the MET30 and MET32 genes therefore makes it possible to inactivate the negative transcriptional regulation of the inorganic sulfur metabolism without the strains that possess this double mutation having a specific auxotrophy phenotype. This is to be compared with the presence of a double mutation met4 ⁇ , met30 ⁇ which, if it allows the maintenance of cell viability, results in an auxotrophic phenotype for methionine.
  • the simultaneous inactivation of the MET30 and MET32 genes is therefore compatible with the growth of the strains on economically advantageous culture media.
  • the SAM2 gene was placed under the control of the PGK1 gene promoter by a "GAP repair" experiment.
  • the promoter of the PGK1 gene carried by the plasmid pFL61 (Bonneau et al (1991) Yeast 87: 609-615) was amplified using two bi-functional oligonucleotides.
  • Oli-5'-SAM2-PGK comprises 42 nucleotides homologous to the target sequence located 5 'of the SAM2 gene (-222 to -181, in bold below), followed by 24 nucleotides homologous to the PGK1 gene promoter (- 771 to -747).
  • the second oligonucleotide (Oli-3'-SAM2-PGK) is formed from 45 nucleotides homologous to the SAM2 gene comprising ATG starting the translation (44 to 1, in bold below) followed by 30 nucleotides homologous to the PGK1 gene promoter. (-2 to -31). Nucleotides are counted from the A of ATG beginning translation of each gene.
  • Oli-5'SAM2-PGK GCTCTTGTAAACGACGTCAAATCTTCATATGCAAGGAGATCTGATTCCTGACT
  • Oli-3'-SAM2-PGK CCGACGGATTCAGAGGTAAATAAGAAAGTTTTGCTCTTGGACATTGTTTTATA
  • the fragment obtained by amplification is used in a "GAP repair" experiment with the plasmid ⁇ SAM2-3 (Thomas et al., 1988, Mol., Cell Biol., 8, 5132-5139) in the strain W303-1A.
  • the plasmid resulting from this experiment carries the SAM2 gene under the control of the PGK1 gene promoter (see FIG. 2A).
  • the resulting plasmid was digested with HndIII, and the generated fragment was used in a one-step disruption experiment (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301) by transforming the W744-1A strain and selecting prototrophic transformants for SAM. The disruption was verified by PCR.
  • the SAM4 gene has been inactivated simultaneously with the adjacent SAM3 gene which encodes the high affinity transporter of SAM, so as to significantly reduce the possibility that the Yeast cells do not re-sample the SAM that they would have excreted.
  • this double inactivation of the SAM3 and SAM4 genes was carried out by inserting at their locus a fusion overexpressing the enzyme Sam2p (SAM synthetase 2) under the control of the strong promoter. constituent PGK1.
  • the yeast cells thus constructed have the advantage of having, through this specific modification to their genome, reduced catabolism of SAM, a high affinity transport system of inactivated SAM and increased expression of activity.
  • SAM synthetase thanks to the presence of an additional SAM2 gene, moreover expressed from a strong constitutive promoter (whereas the promoters of the native SAM1 and SAM2 genes are down-regulated by the increase in the endogenous concentrations of sulfur compounds organic, Thomas and Surdin-Kerjan, 1997, Microbiol Mol Biol.Rev. 61, 503-532).
  • the strains carrying at the level of the left arm of the chromosome -XVI the insertion of the proPGK1-SAM2 fusion in place of the SAM3 and SAM4 genes (construction indicated in the genotype of strains such as sam3-sam4 :: proPGK1-SAM2) actually demonstrate an increased synthesis of SAM compared to their parental strain.
  • the SAM3-PGK oligonucleotide comprises 77 nucleotides homologous to the 5 'target sequence of the SAM3 gene (-80 to -3, appearing in bold below) followed by 24 nucleotides homologous to the promoter region of the PGK1 gene (-771 to -748).
  • the SAM4-SAM2 oligonucleotide comprises 70 nucleotides homologous to the 3 'target sequence of the SAM4 gene (1043 to 974, appearing in bold below) followed by 21 homologous nucleotides at the end of the SAM2 gene (1155 to 1134). The nucleotides are numbered from the ATG starting translation for each gene.
  • Oli-SAM3-proPGK TGATGTTATGTCGAGAGCTCTGAAAACCAATTATTTTGAAAGCTAACATTTCA
  • Q1-SAM4-SAM2 GTGTAACATGCTGCTTTTAGCATATATATAATGTTAAGAATTATTTAACTTCT
  • the amplification fragment was used in a one-step disruption experiment (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301) by transforming the W744-1A strain and selecting prototrophic transformants for SAM (see figure
  • the CY273 strains were obtained by crossing CY270-7D strains ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, adol :: UJRA3, sam3-sam4 :: proPGK1-SAM2) and CY258-10D ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, met30 :: URA3, adol :: URA3, sam3-sam4 :: proSAM4-SAM2, mht1) and by sporulating the diploids obtained, then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the desired gene recombinations.
  • One of the methods implemented by the present invention relates to the cultivation of yeast cells genetically modified to produce a large amount of SAM.
  • the culture medium of the yeast cells contains high concentration of methionine, inexpensive product, which is the immediate precursor of SAM.
  • the capacity for transporting methionine from the cells of the culture medium to their cytoplasm has been improved.
  • the yeast has at least three transport systems whose enzymatic characteristics are different. These transport systems differ in particular by their affinity for methionine and their capacity to transport this sulfur amino acid.
  • the proPGK1-A GP1 fusion was used to replace the endogenous copy of the AGP1 gene.
  • the agpl :: proPGK1-AGP1 mutation was introduced into strains exhibiting met30 ⁇ , met32 ⁇ , sam4 ⁇ , mhtl ⁇ , adol ⁇ mutations and the analysis of the corresponding strain CY208-7B demonstrates an increase in the amount of SAM produced following introduction to the AGPl locus of fasionproPGK1-AGP1.
  • the AGP1 gene was placed under the control of the PGK1 gene promoter by a "GAP repair" experiment.
  • the promoter of the PGK1 gene carried by the plasmid pFL ⁇ l was amplified using two bi-functional oligonucleotides.
  • Oli-5'-AGP1-PGK comprises 45 nucleotides homologous to the target sequence located 5 'of the AGP1 gene (-387 to 342, bolded below), followed by 24 nucleotides homologous to the promoter of the PGK1 gene (-771 to -747).
  • the second oligonucleotide (Oli-3 '-AGP1 -PGK) is formed from 45 nucleotides homologous to the AGP1 gene comprising F ATG starting translation (45-1, bolded below) followed by 30 nucleotides homologous to the PGK1 gene promoter ( -1 to -30). Nucleotides are counted from the A of ATG beginning translation of each gene.
  • Oli-5 '-AGPl -PGK CACGTCCAGCGGATTGCTGCTCCTTAGTAGTCCACAGTTCTTAAGGATTCCTG
  • Oli-3'-AGP1-PGK ATTTTTCAAGTCTTTCAGTTCGTATAGAGACTTCGACGACGACATTGTTTTAT
  • the fragment obtained by amplification was then used in a "GAP repair" experiment with the plasmid p ⁇ 406 (the vector pFL38 carrying a 3 kb fragment comprising the AGP1 gene, Iraqui et al., 1999, Mol. 989-1001) in strain W303-1A.
  • the plasmid resulting from this experiment carries the AGP1 gene under the control of the PGK1 gene promoter (see FIG. 3).
  • This plasmid was digested with BssEU and BamHI, and the generated fragment was used in a one-step disruption experiment (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301), transforming strain EKOI1 (Iraqui et al.
  • the CY131 strains were obtained by crossing the CC867-1D ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl, met32 :: TRP1, met30 :: URA3) and CY121-3D ⁇ Mata, his3, ura3, trpl, met32 strains. :: TRPl, adol :: UR3, agpl :: proPGK1 -AGPl) and sporulating the diploids obtained and then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores presentnat the desired gene recombinations.
  • CY208 strains were obtained by crossing CY188-9A strains (Mata, his3, trpl, ura3, met32 :: TRP1, adol :: UM3, met30 :: URA3, sam4 :: UM3, mht1 :: HIS3) and CY121- 1C (Mata, his3, ura3, trpl, met32 :: TRP1, adol :: URA3, agpl :: proPGK1 -AGP1) and by sporulating the diploids obtained, and then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores presenting the gene recombinations desired
  • the CY284 strains were obtained by crossing the CY273-2B strains (Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, met30 :: UR3, adol :: URA3, sam3 ⁇ sam4 :: proPGK1-SAM2) and CY121 -1C ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, agpl :: proPGK1 -AGP1) and sporulating the diploids obtained, and then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the desired gene recombinations.
  • ADE2 gene located on chromosome XV, coding for phosphoribosylaminoimidazole carboxylase
  • This mutation affects the biosynthesis of purines but its influence on the ability of yeast cells to overproduce SAM remains difficult to explain. Nevertheless, in view of the results obtained, the strains constructed for the present invention will all carry a non-mutated wild-type allele of the ADE2 gene.
  • Cultures of haploid genotypes CY208-7B and CY208-11B, CY273-9D and CY273-2B, CY284-9B and CY284-2B and diploid CY303-1 and CY303-4, and CY304-1 and CY304-2 (see Table 1), in economically advantageous culture medium (containing between 3 and 10% of ammonium phosphate, between 0.5 and 5% of ammonium sulphate, between 0.1% and 1% of sulphate magnesium, between 0.5 and 4% citrate sodium, 5-10% glucose and 0.1-2% DL-methionine) averaged about 8 g per liter in 24 hours of SAM (see Table 1). About 40% of this produced SAM is excreted in the culture medium and can therefore be purified without breaking the cells.
  • the CY208 strains were obtained by crossing the strains ⁇ Mata, his3, trp1, ura3, met32 :: TRP1, adol :: URA3, met30 :: URA3, sam4 :: URA3, mhtl :: HIS3) and CY121-1C CY121- IC (Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, agpl :: proPGK1 -AGP1) and sporulating the diploids obtained and then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the desired gene recombinations.
  • the CY273 strains were obtained by crossing the CY270-7D strains (Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, adol :: URA3, sam3-sam4 :: proPGK1-SAM2) and CY258-10D ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, met30 :: UR3, adol :: URA3, sam3-sam4 :: proSAM4-SAM2, mht1) and sporulating the diploids obtained, then analyzing the tetrads to select spores exhibiting the desired gene recombinations.
  • the CY284 strains were obtained by crossing the CY273-2B strains ⁇ Mata, his3, Ieu2, ura.3, trpl, met32 :: TRPl, met30 :: URA3, adol :: URA3, sam3-sam4 :: proPGK1-SAM2) and CY121-1C ⁇ Mata, his3, leu2, ura3, trpl, met32 :: TRP1, agpl :: proPGK1 -AGP1) and sporulating the diploids obtained, then analyzing the tetrads obtained in order to select the spores with the gene recombinations desired.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée, dans laquelle le gène codant pour l'adénosine kinase a été inactivé par modification génétique, pour la production de S-adénosylméthionine (SAM).

Description

SOUCHE DE LEVURE GENETIQUEMENT MODIFIEE PRESENTANT UNE PRODUCTION ET UNE EXCRETION ACCRUE DE S-ADENOSYLMETHIONINE
(SAM)
La présente invention concerne une souche de levure génétiquement modifiée présentant une production et une excrétion accrue de S-adénosylméthionine (SAM), son utilisation pour la production de SAM, et des compositions pharmaceutiques la comprenant.
S-adénosylméthionine (SAM)
La S-adénosylméthionine (SAM) (voir la formule ci-dessus) est un composé essentiel du métabolisme intermédiaire chez l'ensemble des organismes vivants. Ce métabolite est synthétisé à partir de méthionine et d'adénosine triphosphate (ATP). Cette synthèse, catalysée par les SAM synthétases (ATP : L-méthionine S-adénosyltransférase, EC 2.5.1.6), peut être considérée comme l'étape terminale du métabolisme des acides aminés soufrés. Cette réaction est assez exceptionnelle car elle implique la déphosphorylation totale de la molécule d'ATP employée (Méthionine + ATP → SAM + PPi + Pi) et représente donc une dépense énergétique particulièrement élevée.
La SAM est certainement la molécule, qui après l' ATP, participe au plus grand nombre de réactions cellulaires. La SAM joue en effet le rôle de donneur quasi-universel de groupement méthyle dans les réactions de transméthylations des protéines, des acides nucléiques, des lipides etc .. La SAM sert également de donneur de groupement carboxy- aminopropyle dans des réactions de modifications de bases d'ARN ribosomaux ou de transferts, ou également lors de la synthèse de la diphtamide, une modification post- -traductionnelle d'un résidu histidine trouvé dans le facteur d'élongation EF2 chez les organismes eucaryotes. La SAM sert également de donneur de groupement aminé lors de la biosynthèse de la biotine chez les microorganismes. La SAM est également employée comme précurseur de la synthèses des polyamines, spermine et spermidine, où après une étape initiale de décarboxylation, elle remplit le rôle de donneur de groupement aminopropyle (Cantoni, 1982, « The biochemistry of S-adenosyhnethionine », Columbia University Press, NY). Cette description non exhaustive des différentes fonctions métaboliques de la SAM démontre le rôle central joué par cette molécule dans le métabolisme intermédiaire.
En médecine humaine la S-adénosylmétbionine est indiquée dans le traitement de la dépression (SAMYR®). Elle a également été impliquée dans le traitement de la stérilité masculine (Piacentino et al, (1991) Minerva Gynecol. 43:191-193), de rostéoarthrite (Najm et al. (2004) BMC Muscoskeletal Disord. 5:6-21) et des fibromyalgies (Tavoni et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:106-107).
A ce jour, il n'existe pas de possibilité de synthétiser chimiquement de la SAM avec des rendements suffisants pour obtenir de la SAM de qualité pharmaceutique à un coût compatible avec une commercialisation. Les procédés industriels de production de SAM mettent en jeu une production microbiologique qui est réalisée chez la levure Saccharomyces cerevisiae.
Plusieurs documents de l'art antérieurs décrivent des souches de levure génétiquement modifiées présentant une production accrue de SAM.
Ainsi, la demande de brevet US 2002/0192784 concerne des souches de levure Saccharomyces cerevisiae présentant une production accrue de SAM qui ont été génétiquement modifiées par l'introduction d'un gène chimérique codant pour une méthylène tétrahydrofolate réductase (MTHFR) composée pour partie de l'enzyme d'Ai'abidopsis thaliana et pour partie de l'enzyme de levure.
Cependant, la SAM n'apparaît pas être excrétée par ces souches de levure, ce qui rend le procédé d'obtention de la SAM à partir de ces souches peu intéressant dans une perspective de production industrielle, dans la mesure où l'extraction de la SAM à partir des cellules de levure est un processus relativement long et coûteux ; a contrario, la purification de la SAM à partir du milieu de' culture des souches de levure est particulièrement aisée. De plus, les souches de levure décrites dans ce document sont génétiquement modifiées par l'introduction de séquences nucléiques hétérologues, ce qui pose un problème de sécurité biologique, car les effets, notamment sur la santé humaine, de ces nouvelles séquences nucléiques et des protéines qu'elles codent ne sont pas connus.
Le document Shiomi et al. (1995) Appl. Microbiol Biotechnol. 42:730-733 décrit une souche de levure Saccharomyces cerevisiae présentant une production accrue de SAM, génétiquement modifiée par l'introduction de copies supplémentaires d'un gène de résistance à l'éthionine.
Le document Yu et al. (2003) Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao 35: 127- 132 décrit une souche de levure Pichia pastoris présentant une production accrue de SAM, génétiquement modifiée par l'introduction de copies supplémentaires du gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2 (SAM2).
La SAM n'apparaît pas être excrétée par les souches de levures décrites dans ces deux documents, de plus la production de SAM par ces souches apparaît être trop faible pour une application industrielle.
Un objet de la présente invention est donc de fournir des souches de levure génétiquement modifiées présentant une production et/ou une excrétion de SAM supérieure aux souches de levure de l'art antérieur.
Un autre objet de l'invention est de fournir des souches de levure génétiquement modifiée ne comprenant pas de séquences nucléiques hétérologues, c'est-à-dire ne provenant pas d'organisme d'une espèce différente de celle de la levure considérée.
Encore un autre objet de l'invention est d'utiliser les souches de levures génétiquement modifiées de l'invention pour la production industrielle de SAM.
Enfin, un autre objet de l'invention est de fournir des compositions pharmaceutiques comprenant les souches de levure génétiquement modifiées de l'invention.
La présente invention découle, notamment, de la mise en évidence par les Inventeurs qu'une souche de levure pour laquelle le gène ADOl, codant l'adénosine kinase de levure, a été inactivé présentait une production et une excrétion accrue de S-adénosylméthionine par rapport à la souche sauvage correspondante.
La présente invention concerne l'utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée, dans laquelle le gène codant pour l'adénosine kinase a été inactivé par modification génétique, pour la production de S-adénosylméthionine (SAM).
On désigne par « levure » tout champignon de type unicellulaire. Les levures comprennent notamment les genres Saccharomyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, et Kluyveromyces.
L'adénosine kinase est également appelée adénosine 5 phosphotransférase.
Dans la levure Saccaromyces cerevisiae, le gène codant pour l'adénosine kinase est le gène ADOl correspondant à la phase de lecture ouverte YJRl 05w (Lecoq et al. (2001) Yeast 18:335-342) et est notamment représenté par SEQ ID NO : 1. Par ailleurs, à titre d'exemple, pour Kluyveromyces lactis, il est représenté par la référence EMBL CR382124 et pour Schizosaccharomycespom.be il est représenté par la référence EMBL SPCC338.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne donc l'utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée, dans laquelle le gène ADOl codant pour l'adénosine kinase a été inactivé par modification génétique, pour la production de S- adénosylméthionine (SAM).
Un gène de levure est dit « inactivé » lorsque le produit pour lequel il code n'est pas exprimé dans ladite levure. Dans le cas du gène codant pour l'adénosine kinase, ce gène est dit inactivé si l'adénosine kinase n'est pas exprimée.
De nombreuses méthodes d'inactivation d'un gène donné sont connues de l'homme de l'art, parmi lesquelles on peut citer :
• l'introduction de mutations ponctuelles dans la séquence codante du gène en question, telle que : des substitutions de nucléotides conduisant à des mutations faux-sens (changement d'acide aminé dans la protéine codée par le gène à inactiver) ou non-sens (codon stop) ; des insertions ou des délétions de nucléotides conduisant à une interruption de la phase ouverte de lecture dudit gène ;
• l'insertion de séquences nucléotidiques codant par exemple pour des gènes de sélection à l'intérieur de la séquence codante du gène à inactiver ;
• le remplacement d'une partie substantielle de la séquence codante du gène à inactiver par des séquences nucléotidiques codant par exemple pour des gènes de sélection ;
• la modification de la séquence promotrice du gène à inactiver, notamment au niveau de séquences consensus, telle que la boite TATA ;
• l'introduction dans le génome de la levure de séquences codant pour un antisens de l'ARNTm messager du gène à inactiver.
Un gène de sélection est habituellement un gène de résistance à un antibiotique (par exemple un gène de résistance à la généticine) ou la copie sauvage d'un gène codant pour une étape du métabolisme de la levure (par exemple URA3, TRPl, LEU2, ou HISS), lequel gène est muté et inactif dans la levure que l'on souhaite modifier.
Toutes ces méthodes sont particulièrement aisées à mettre en œuvre par l'homme de l'art, notamment lorsque la séquence du gène à inactiver est connue. Avantageusement, l'inactivation du gène codant pour l'adénosine kinase dans une souche de levure conduit à la production et à l'excrétion accrue de S-adénosylméthionine par ladite souche.
La détermination de la séquence du gène codant pour l'adénosine kinase des levures pour lesquelles il n'a pas été identifié est aisée pour l'homme de l'art. Dans le cas où le génome de la levure pour laquelle on souhaite identifier le gène codant pour l'adénosine kinase est partiellement ou intégralement séquence il est possible de lancer une recherche dans les bases de données de séquences adéquates, soit sur la base du nom de l'enzyme codée par le gène recherché, c'est-à-dire adénosine kinase, soit par homologie avec une séquence connue du gène, par exemple ADOl, à l'aide d'un logiciel tel que le logiciel BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Alternativement, il est également possible de cribler une banque d'ADNc ou d'ADN génomique de la levure en question à l'aide d'une sonde dérivée d'une séquence connue du gène, par exemple ADOl, comme cela est bien connu de l'homme de l'art ; on pourra, par exemple, se reporter à cet effet à l'ouvrage Sambrook et Russel (2000) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence du gène codant pour l'adénosine kinase a été génétiquement modifiée par mutation.
On désigne par « mutation » d'une séquence nucléotidique donnée, l'insertion, la substitution et/ou la suppression d'un ou plusieurs nucléotides dans ladite séquence nucléotidique.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence du gène codant pour l'adénosine kinase de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus a été disruptée.
On désigne par « disruption » de la séquence d'un gène, l'interruption de la séquence codante dudit gène par l'introduction d'une séquence nucléotidique à l'intérieur de cette séquence codante. En général, cette introduction s'accompagne de la substitution d'une partie substantielle de la séquence codante, voir de toute la séquence codante, par la séquence introduite. Cette séquence introduite est habituellement un gène de sélection.
De nombreuses méthodes de disruption sont à la disposition de l'homme de l'art telles que, par exemple, celles décrites par Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194:281-301 ; Wach et al. (1994) Yeast 10:1793-1808 ou encore Gûldener et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2519-254. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus présente au moins une autre modification génétique choisie parmi le groupe comprenant :
- l'inactivation d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine, le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase, le gène codant pour la S-méthylméthionine-homocystéine méthyle transférase, et le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ύbiquitine ligase SCFMβt30,
- l'introduction d'une copie supplémentaire de la séquence d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine, dans le génome de ladite souche, et
- la mutation de la séquence d'un promoteur d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine.
Le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1 de levure est notamment représenté par le gène SAMl de Saccharomyces cerevisiae (Thomas and Surdin-Kerjan (1987) J. Biol. Chem, 262 : 16704-16709).
Le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2 de levure est notamment représenté par le gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al. (1998) Mol. CeIl. Biol. 8 : 5132-5139).
Le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosyhnéthionine est notamment représenté par le gène SAM3 de Saccharomyces cerevisiae (Rouillon et al., J. Biol. Chem. 274 : 28096-28105).
Le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase est notamment représenté par le gène SAM4 de Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al. (2000) J Biol. Chem. 275 : 40718-40724). Le gène codant pour la S-méthylnαéthionine-homocystéine méthyle transférase est notamment représenté par le gène MHTl de Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al. (2000) J. Biol. Chem. 275 : 40718-40724).
Le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet3° est notamment représenté par le gène METSO de Saccharomyces cerevisiae (Patron ét al. (1998) Gènes Dev. 12 : 692-705).
Le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité est notamment représenté par le gène AGPl de Saccharomyces cerevisiae (Iraqui et al. (1999) Mol. CeIl. Biol. 19 : 989- 1001).
Le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité est notamment représenté par le gène MUPl de Saccharomyces cerevisiae (Isnard et al. (1996) J Mol. Biol. 262 : 473- 484).
Le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité est notamment représenté par le gène MUP 3 de Saccharomyces cerevisiae (Isnard et al. (1996) J. Mol. Biol. 262 : 473-484).
Un gène codant pour une perméase à large spectre capable de transporter la méthionine est notamment représenté par le gène BAP2 ou par le gène BAPS de Saccharomyces cerevisiae (Regenberg et al. (1999) Curr. Genêt. 36 : 317-328).
Selon un mode de réalisation plus particulier de l'invention, la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus présente au moins une autre modification génétique choisie parmi le groupe comprenant :
- l'inactivation d'un gène choisi parmi le groupe comprenant SAMS, SAM4, MHTl, QtMETSO,
- l'introduction d'une copie supplémentaire de la séquence d'un gène choisi parmi le groupe comprenant SAMl, SAM2, AGPl, MUPl, MUPS, BAP2, et BAPS, dans le génome de ladite souche, et
- la mutation de la séquence d'un promoteur d'un gène choisi parmi le groupe comprenant SAMl, SAM2, AGPl, MUPl, MUP3, BAP2, et BAPS.
La séquence du gène SAMl de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 3) et de son produit de traduction, la protéine Samlp (SEQ ID NO : 4), est celle déposée à la banque de données EMBL3 identificateur « SCSAMl », numéro d'accès J03477. —
La séquence du gène SAM2 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 5) et de son produit de traduction, la protéine Sam2p (SEQ ID NO : 6), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCSAM2SA », numéro d'accès M23368. La séquence du gène SAM3 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 7) et de son produit de traduction, la protéine Sam3p (SEQ ID NO : 8), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCYPL274W », numéro d'accès Z73630.
La séquence du gène SAM4 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 9) et de son produit de traduction, la protéine Sam4p (SEQ ID NO : 10), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCYPL273W», numéro d'accès Z73629.
La séquence du gène MHTl de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ED NO : 11) et de son produit de traduction, la protéine Mhtlp (SEQ ID NO : 12), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCYLL062C », numéro d'accès Z73167.
La séquence du gène AGPl de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 13) et de son produit de traduction, la protéine Agplp (SEQ ID NO : 14), correspond à la séquence de l'ORF YCL025C et est comprise dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCCHRIII », numéro d'accès X59720.
La séquence du gène BAP2 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 15) et de son produit de traduction, la protéine Bap2p (SEQ ID NO : 16), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCYBRO68C », numéro d'accès Z35937.
La séquence du gène BAP 3 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 17) et de son produit de traduction, la protéine Bap3p (SEQ ID NO : 18), correspond à la séquence de l'ORF YDR046C et est comprise dans la séquence déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SC9609X », numéro d'accès Z49209.
La détermination de la séquence des gènes décrits ci-dessus pour d'autres espèces de levure, est aisée pour l'homme de métier, qui pourra par exemple procéder comme cela est décrit précédemment pour le gène codant pour l'adénosine kinase.
Avantageusement, l'inactivation des gènes codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine, pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase, la S-méthylméthionine-homocystéine méthyle transférase, et la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase gCFMet30 dans une souche de levure permet d'augmenter la production et/ou l'excrétion de SAM par ladite souche. Par ailleurs l'augmentation de la transcription des gènes codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, la S-adénosyhnéthionine synthétase 2, la méthionine perméase à faible affinité, la méthionine perméase à haute affinité, la méthionine perméase à très faible affinité, une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine, soit par modification de leurs séquences promotrices, soit en augmentant leur nombre de copies dans une souche de levure, permet également d'augmenter la production et/ou l'excrétion de SAM par ladite souche. Lorsque une copie supplémentaire de la séquence d'un gène est introduite dans le génome de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus, cette copie peut être soit portée par un vecteur à réplication autonome tel qu'un plasmide ou un chromosome artificiel, soit être insérée dans un ou plusieurs chromosome de ladite souche génétiquement modifiée.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus porte une copie modifiée du gène codant pour la méthylène tétrathydrofolate réductase (METl 3 pour Saccharomyces cerevisiae, Raymond et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 372 : 300-308), l'enzyme correspondante n'étant plus inhibée par la SAM.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence d'au moins un des gènes de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus est choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine, le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase, le gène codant pour la S-méthyhnéthionine-homocystéine méthyle transférase, et le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet30, a été disruptée.
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, au moins une séquence d'un promoteur d'un des gènes de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus choisi parmi le groupe comprenant le gène codant poux la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine, a été substituée par une séquence d'un promoteur fort de levure.
L'expression « promoteur fort » désigne un promoteur conférant au gène placé sous son contrôle, c'est-à-dire en général directement en aval de la séquence promotrice, un niveau de transcription plus élevé que le niveau de transcription moyen des gènes dans la levure. Les promoteurs forts de levures sont notamment décrits dans Velculescu et al. (1997) CeIl 88 : 243-251.
Il s'agit, en particulier des promoteurs naturels des gènes PGKl, ADHl, TDHS, TEFl, PHO5, LEU2, et GALl.
La séquence du promoteur du gène GALl de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent correspond notamment à la séquence décrite par Johnston et Davis (1984) Mol CeIl Biol. 4 : 1440-1448. La séquence du promoteur du gène TEFl de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent correspond notamment à la séquence décrite par Schaaff-Gerstenschlager et al. (1993) EUT. J. Biochem. 217 : 487-492).
La séquence du promoteur du gène PGKl de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent correspond notamment à la séquence décrite par Bonneau et al. (1991) Yeast 87 : 609- 615).
La séquence du promoteur du gène PH05 de la levure Saccharomyces cerevisiae utilisé dans les descriptions qui suivent correspond notamment à la séquence décrite par Feldmann ^ β/. (1994) £MSO J. 13 : 5795-5809).
Avantageusement, l'utilisation d'un promoteur fort permet d'augmenter le niveau de transcription des gènes placés sous son contrôle et donc le niveau de traduction des protéines correspondante, ce qui induit une augmentation de la synthèse de SAM.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les gènes codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet30, la S-méthylméthionine- homocystéine méthyle transférase, l'adénosine kinase, et la S-adénosylméthionine- homocystéine méthyle transférase de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus sont inactivés, notamment par disruption des séquences desdits gènes.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, une copie supplémentaire de la séquence du gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, couplée à un promoteur fort, a été introduite dans le génome de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la séquence du promoteur du gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité de la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus a été substituée par la séquence d'un promoteur fort.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine et le gène codant pour la S- adénosylméthionine-homocystéme méthyle transférase de ladite souche ont été inactivés par substitution de la séquence desdits gènes par une copie de la séquence du gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, couplée à un promoteur fort.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le promoteur fort défini ci- dessus est choisi parmi le groupe comprenant les promoteurs naturels des -gènes PGKl, ADHl, TDH3, TEFl, PHO5, LEU2, GALl de la souche génétiquement modifiée définie ci- dessus. Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, la souche génétiquement modifiée définie ci-dessus est prototrophe pour l'adénine.
L'expression « prototrophe pour l'adénine » signifie que la souche définie ci-dessus ne nécessite pas un apport exogène d'adénine pour sa croissance et qu'elle est capable d'assurer seule la production d'adénine nécessaire à sa survie et/ou à sa croissance. Ceci signifie que les gènes impliqués dans la voie de synthèse de l'adénine sont fonctionnels. En particulier, les souches définie ci-dessus portent un allèle sauvage, c'est-à-dire non muté, du gène qui code pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase (ADE2 dans Saccharomyces cerevisiae).
Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la souche de levure génétiquement définie ci-dessus est haploïde.
Dans un mode de réalisation alternatif de l'invention, la souche de levure génétiquement modifiée définie ci-dessus est diploïde.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche de levure génétiquement modifiée selon l'invention est caractérisée en ce que lorsque les modifications génétiques sont chromosomiques, lesdites modifications génétiques sont portées par chacun des deux chromosomes homologues.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la souche de levure génétiquement modifiée selon l'invention ne comprend pas de séquences nucléotidiques hétéro Io gués.
Le terme « hétérologue » désigne des séquences nucléotidiques que l'on ne trouve pas présentes à l'état naturel dans les cellules de levure appartenant à la même espèce de levure que celle de la souche considérée.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la souche de levure génétiquement modifiée selon la présente invention est choisie parmi le groupe comprenant les levures du genre Saccharomyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, et Kluyveromyces, et que ladite souche est notamment une levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche appartient à l'espèce Saccharomyces cerevisiae et lorsque le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase sCFMet3° (MET30) de ladite souche est inactivé, notamment par disruption de la séquence du gène MET30, alors le gène MET4 et/ou le gène MET32 de ladite souche est également inactivé, notamment par disruption des séquences géniques correspondantes. Le gène MET4 code pour l'activateur transcriptionnel principal du métabolisme des acides aminés soufrés dans la levure Saccharomyces cerevisiae (Thomas et al. (1992) Mol. CeIl Biol. 12 : 1719-1727).
Le gène MET32 code pour un facteur transcriptionnel impliqué dans la régulation du métabolisme des acides aminés soufrés de la levure Saccharomyces cerevisiae (Blaiseau et al. (1997) Mol. CeIl Biol. 17 : 3640-3648).
Dans une souche de levure de type sauvage l'inactivation du gène METSO est létale pour la souche chez laquelle elle a été pratiquée. Avantageusement l'inactivation préalable de MET4 et/ou de MET32 permet d'abolir l'effet létal de l'inactivation de MET30 (Patton et al. (200O) EMBO J. 19 : 1613-1624).
La séquence du gène MET4 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO : 19) et de son produit de traduction, la protéine Met4p (SEQ ID NO : 20), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « SCMETBLZP », numéro d'accès M84455.
La séquence du gène MET32 de la levure Saccharomyces cerevisiae (SEQ E) NO : 21) et de son produit de traduction, la protéine Met32p (SEQ ID NO : 22), est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « AY557729», numéro d'accès AY557729.
La présente invention concerne également une souche de levure génétiquement modifiée présentant une production et une excrétion accrue de S-adénosylméthionine par rapport à la souche de levure non modifiée correspondante, ladite souche génétiquement modifiée étant telle que définie ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé dé production de S- adénosylméthionine, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes de :
- culture d'une souche de levure génétiquement modifiée telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture,
- purification de la S-adénosylméthionine à partir du surnageant du milieu de culture et/ou des cellules de levure génétiquement modifiées.
Avantageusement, les souches de levure génétiquement modifiées de l'invention excrètent de grande quantité de SAM dans leur milieu de culture, ce qui permet une récupération aisée de ce produit, sans qu'il ne soit nécessaire de l'extraire à partir des levures, dont la paroi cellulaire est particulièrement résistante.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé défini ci-dessus, la culture est réalisée en chémostat.
Avantageusement, un chémostat permet une culture en continu des levures. En effet, on désigne notamment par chémostat un bioréacteur dans lequel l'apport de milieu nutritif et l'évacuation du milieu de culture contenant les levures sont réalisés en continu, de façon à maintenir essentiellement constants les paramètres physico-chimiques de la culture tout en récupérant le milieu de culture.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de substance active au moins une souche de levure telle que définie ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les levures sont connues pour pouvoir prendre place aisément dans l'intestin humain, l'ingestion de cellules des souches de levure selon l'invention, éventuellement lyophilisées, pourrait ainsi permettre d'augmenter les apports en SAM chez les individus en ayant besoin sur une période relativement longue, correspondant environ à la durée de la colonisation de l'intestin par les levures.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies nécessitant un apport accru en S-adénosylméthionine, telle que la dépression, l'arthrite, les fïbromyalgies, ou la stérilité masculine.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'aliments ou de boissons enrichis en S-adénosylméthionine.
L'utilisation des souches de levure génétiquement modifiée de l'invention pour la préparation de certains aliments ou boissons (tel que du pain ou de la bière dans le cas de Saccharomyces cerevisiae permet leur enrichissement spontané en SAM.
La présente invention concerne également une préparation alimentaire ou une boisson, destinée à l'alimentation humaine ou animale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une souche de levure génétiquement modifiée telle que définie ci-dessus.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1
La figure 1 schématise les étapes du clonage du gène MHTl de Saccharomyces cerevisiae.
Figure 2A et Figure 2B
La figure 2A schématise le clonage du gène SAM2 de Saccharomyces cerevisiae sous le contrôle du promoteur fort du gène PGKl. La figure 2B schématise les étapes de disruption des gènes SAMS et SAM4 de Saccharomyces cerevisiae par la substitution d'une copie du gène SAM2 sous le contrôle du promoteur du gène PGKl.
Figure 3
La Figure 3 schématise le clonage du gène AGPl de Saccharomyces cerevisiae sous le contrôle du promoteur fort du gène PGKl.
EXEMPLES
MATERIELS ET METHODES
Nomenclature utilisée
La nomenclature utilisée dans ce travail pour désigner les gènes de Saccharomyces cerevisiae est la nomenclature classique et connue de l'homme du métier : chaque gène est désigné par trois lettres italiques suivies par un nombre, par exemple ADOl. Les allèles dominants (dans le cas présent, l'allèle de type sauvage) sont notés avec des lettres capitales italiques, tandis que les lettres minuscules sont utilisées pour désigner l'allèle récessif (dans le cas présent, l'allèle muté). Le symbole adol::URA3 désigne l'insertion du gène URA3 au locus ADOJ, dans lequel URA3 est fonctionnel et adol est défectif. La protéine codée par un gène donné est désignée par le nom du gène où la première lettre est en majuscules et les deux autres en minuscules, suivie de la lettre « p », par exemple Ado Ip pour le produit du gène ADOl.
Souches utilisées
Le travail décrit ci-après a été réalisé avec des souches haploïdes et auxotrophes de Saccharomyces cerevisiae pour plusieurs acides aminés ou bases. Ces souches sont isogéniques avec les souches :
- CC788-2B (MATa, his3, Ieu2, ura3, trpl), décrite dans Chérest et al. (2000) J Biol. Chem. 275 : 14056-14063, et
- CC788-2D (MATα, his3, Ieu2, ura3, trpl) décrite dans Chérest et al. (2000) J Biol. Chem. 275 : 14056-14063.
Ces deux souches sont elles-mêmes des dérivés ADE2+ (prototrophes pour l'adénine) de la souche de référence W303 de la levure Saccharomyces cerevisiae décrite par Bailis A. M. et al, 1990, Genetics 126, 535-547). La souche W303 est déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 201239.
Méthodes génétiques utilisées
Les méthodes employées pour croiser des souches et pour disséquer les asques sont celles décrites par Sherman et al, 1979, «Methods in Yeast Genetics : a Laboratory Manual », CoId Spring Harbor, N. Y. Les protocoles classiques de manipulation de gènes dans Saccharomyces cerevisiae ont été employés et les transformations de levure ont été effectuées selon la méthode de Gietz et ah, 1992, Nucleic Àcids Res. 20, 1425. Les remplacements de gènes ont été effectués selon la méthode décrite par Rothstein (Rothstein, 1991, Methods Enzymol. 194, 281-301). L'intégration correcte est vérifiée à chaque fois soit par « Southern blotting », soit par amplification en chaîne par polymérase (PCR).
Les stratégies utilisées lors des manipulations de gènes ont été conçues pour qu'aucun fragment d'ADN de E. coli ne reste dans le génome de la levure. Les souches obtenues ne contiennent donc que des séquences d'ADN de Saccharomyces cerevisiae.
Mesure de l'accumulation et de l'excrétion de la SAM par chromatographie à haute pression Les mesures de concentration de SAM dans les surnageants de culture ou sur des extraits des cellules par chromatographie liquide à haute pression ont réalisés selon la méthode de Wise et al, 1997, J Chromatogr. B. Biomed. Sd. Appl, 696,145-152) sur une résine Waters Spherisob ODS2, en employant des standards de SAM de concentrations connues.
Mesure de l 'excrétion de la SAM par méthode microbiologique.
Pour ce travail, une méthode rapide de mesure de SAM par « alimentation croisée » a été développée. Cette méthode emploie une souche test, qui est une souche particulière de Saccharomyces cerevisiae de génotype MATa1 his3, Ieu2, ura3, ade2, trp, saml::LEU2, sam2::HIS3 qui présente une disruption les deux gènes SAMl et SAM2 codant les SAM synthétases et dont la croissance requiert absolument un apport de SAM exogène. Pour mesurer l'excrétion de SAM, cette souche est cultivée dans du milieu contenant des concentrations croissantes de surnageant des cultures des souches testées. Le rendement des cultures ainsi réalisées est proportionnel à la quantité de SAM présente dans le surnageant. Une courbe de calibration est réalisée à chaque expérience en employant de la SAM. La souche à tester est cultivée pendant 24 heures dans 5 ml de milieu complet YPD (Kuras et al. 2002, 2002, Mol. CeIl 10, 69-80). Après centrifugation, la totalité des cellules est transférée dans 5 ml de milieu de production et incubée sous agitation pendant 24 heures à 30 °C. Les surnageants de culture sont ensuite récupérés par élimination des cellules par centrifugation suivie d'une filtration sur filtres 0.45 microns et des aliquotes de ces surnageants sont ajoutés à des cultures de la souche test. EXEMPLE 1
Identification de gènes dont l'inactivation permet l'obtention souches de levure produisant et excrétant des quantités accrues de S-adénosylméthionine (SAM) : disruption du gène ADOl
Afin de caractériser de nouvelles souches capables de produire de large concentrations de composés soufrés organiques et notamment de SAM, les Inventeurs ont recherché des souches de levure dont la croissance serait fortement altérée par la présence dans la milieu de culture de grandes quantités de SAM ou de l'un de ses précurseurs, la méthionine ou la cystéine. Une souche haploïde de Saccharomyces cerevisiae de type sauvage (W303-1 A) a été mutagénéisée à l'aide d'éthyle méthane sulfonate et des colonies présentant des défauts de croissance sur de fortes concentrations de composés soufrés organiques, mais toujours aptes à croître sur de faibles concentrations de ces mêmes composés, ont été recherchées.
Ce travail a permis de caractériser en particulier deux mutations ponctuelles, génétiquement indépendantes, temporairement dénommées cys5-l et cys6-l. La présence de chacune de ces mutations induit un phénomène d'arrêt de croissance lorsque ces cellules sont cultivées en milieu minimum contenant 5 mM de L-cystéine. Par contre les souches mutées cys5-l et cys6-l sont capables de croître en présence de 0,2 mM L-cystéine employée comme source de soufre. Ce dernier phénotype démontre donc que les mutations cys5-l et cys6-l sont différentes des mutations strl et str4 (également dénommée cysl et cys4 respectivement) qui sont les deux seules mutations connues à ce jour qui entraînent un phénotype de non croissance sur cystéine (Chérest et Surdin-Kerjan, 1992, Genetics 130, 51-58).
Pour comprendre la nature moléculaire de ces mutations, les gènes correspondants à ces mutations ont été clones par complémentation fonctionnelle. Une libraire génomique constituée de fragments d'ADN obtenus par digestion partielle HindHl de l'ADN d'une souche sauvage X2180-1 A, clones dans le vecteur navette pEMBLYe23 (Baldari et Cesarini, 1985, Gène 35, 27-32) a été employée et utilisée pour rechercher des plasmides capables de restaurer la croissance sur cystéine 5 mM des souches mutantes cys5-l et cys6-l. Ces expériences ont permis d'isoler des plasmides comportant respectivement, un fragment d'ADN comprenant la phase ouverte de lecture YER043w, située sur le bras droit du chromosome V de la levure et complémentant le défaut de croissance de la souche cys5-l, et un fragment d'ADN comprenant la phase ouverte YJRl 05w, située sur la bras droit du chromosome X et complémentant le défaut de croissance de la souche cys6-l. Pour confirmer l'identité des gènes CYS5 et CYS6 avec respectivement, les phases ouvertes YER043w et YJRl 05w, une technique d'intégration dirigée au locus a été employée et a confiimé ces assignations.
L'analyse des séquences peptidiques déduites de ces deux phases ouvertes a montré que : i) le gène CYS5 (YER043w) correspond au gène spécifiant la S-adénosylhomocystéine (SAH) hydrolase et dénommé SAHl. L'inactivation de ce gène dans une souche diploïde W303 et l'analyse des spores issues de la sporulation du diploïde (sahl::URA3 I SAHl) résultant a démontré que seules deux spores par tétrades étaient viables et que toutes les spores viables étaient auxotrophes pour l'uracile, ce qui signifie que l'inactivation du gène SAHl est létale dans un contexte génique W303 haploïde. ii) le gène CYS6 (YIRl 05w) est équivalent au gène ADOl et code pour l'adénosine kinase (Lecoq et al, 2001, Yeast 18, 335-342). Le gène ADOl a été inactivé dans un diploïde W303 et l'analyse des spores issues de la sporulation du diploïde (adol::URA3 /ADOl) résultant a montré que la moitié des 40 spores étudiées étaient incapables de croître sur milieu minimum contenant 5 raM L-cystéine. L'ensemble des spores incapables de croître sur cystéine 5 mM sont protrophes pourl'uracile et correspondent donc à des spores comprenant un allèle inactivé du gène ADOl. Ces expériences démontrent que la disruption du gène ADOl résulte bien dans le même phénotype que les cellules portant la mutation cys6-l originalement isolée.
Le gène ADOl a été clone par complémentation fonctionnelle d'une souche portant une mutation dans le gène ADOl. La banque utilisée a été construite en insérant le produit de la digestion partielle par l'enzyme de restriction HmdlII de FADN chromosomique isolé de la souche X2180-1A dans le site Hmdlïï du plasmide pEMBLYe23 (1) Baldari et Cesarini, 1985, Gène 35, 27-32). Le plasmide ainsi isolé par complémentation fonctionnelle portait un fragment de 1690 pb contenant le gène ADOl délété des 176 premières paires de base de la phase ouverte de lecture. Le plasmide portant la région ADOl a été digéré par l'enzyme de restriction EcoRl et auto-ligaturé, conduisant ainsi à l'élimination du fragment 2 microns du plasmide pEMBLYe23 (Baldari et Cesarini (1985) Gène 35 :27-32) et donc à un plasmide incapable de se répliquer chez la levure. Le fragment Aspll 8-Asp7l8 (460 pb) interne à la phase ouverte de lecture a été ensuite remplacé par le gène de sélection URA3. Ceci conduit à l'élimination d'un fragment d'Adolp borné par les codons 118 et 271. La transformation, déjà souche diploïde CC572 (issue du croisement W303-1A x W303-1B) par le fragment HmdlII- HindΩI du plasmide ainsi obtenu et sélection des transformants prototrophes pour l'uracile, conduit au remplacement d'une des copies chromosomiques du gène ADOl par la méthode de disraption en une étape (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301). L'analyse de la descendance de la souche diploïde ainsi obtenue (CD215) hétérozygote pour la mutation adol::URΛ3 montre que cette disraption n'est pas létale. La disruption a été vérifiée par PCR.
Le clonage des gènes correspondant aux mutations cys5-l et cys6-l démontrent donc que ces deux mutations affectent deux enzymes impliquées dans le catabolisme de la SAM et plus particulièrement impliquées dans le catabolisme de la SAH, produit libéré lors des réactions de méthylation employant la SAM. Les mutations qui affectent les gènes SAHl ou ADOl compromettent donc le cycle du méthyle en conduisant à une accumulation de SAH, molécule qui est connue pour inhiber les méthyltransférases qui sont les utilisatrices principales de SAM. Ces mutations sont par conséquent susceptibles de modifier le rendement des réactions qui permettent la synthèse de cystéine à partir de méthionine ou de cystéine (Thomas et Surdin-Kerjan, 1997, Microbiol. Mol. Biol Rev. 61, 503-532).
La capacité de souches portant une mutation inactivant le gène ADOl à excréter de la SAM a ensuite été analysée.
Le gène ADOl a donc été disrupté dans les souches CC788-2B et CC788-2D, comme cela est décrit ci-dessus, pour donner les souches CY78-3B et CY78-8B de génotype MATa, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URA3 et MATa, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URA3. respectivement.
Ces souches pour lesquelles le gène ADOl a été disrupté produisent environ 10 fois plus, et excrètent environ 40 fois plus de SAM, que leurs souches parentales respectives (voir le Tableau 1).
EXEMPLE 2
Obtention de souches présentant une diminution du catabolisme de Ia SAM : disruption des gènes SAM4 et MHTl
Une diminution du catabolisme de la SAM a donc été obtenue en inactivant le gène ADOl, ce qui modifie le fonctionnement du cycle du méthyle, cette diminution du catabolisme de la SAM s' accompagnant d'une surproduction et d'une excrétion accrue de SAM. Il est cependant important de noter que le cycle du méthyle n'est pas la voie unique de recyclage de la SAM. En effet il a été récemment démontré le recyclage de la SAM peut également avoir lieu par l'intermédiaire d'une réaction de méthylation de l'homocystéine en employant la SAM comme donneur de groupe méthyle. L'existence de ce second cycle a été démontrée lors de la caractérisation fonctionnelle de deux nouveaux gènes, SAM4 et MHTl qui codent respectivement la SAM-homocystéine méthyltransférase et la S- méthylméthionine-homocystéine méthyltransférase (Thomas et al, 2000, J. Biol.Chem. 275, 40718-40724). Alors que l'enzyme Sam4p est très spécifique et ne semble employer que la SAM comme substrat donneur de méthyle, l'enzyme Mhtlp utilise la S-méthylméthionine et la SAM comme substrat donneur de méthyle, mais son affinité pour ce second substrat est 10 fois plus faible que pour la S-méthylméthionine (Thomas et al, 2000, J. Biol.Chem. 275, 40718-40724). Pour augmenter la production de SAM par les souches de levures, des mutations inactivant les gènes SAM4 et MHTl ont été introduites dans les souches CY78-3B et CY78-8B de génotype MhTdJa, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URΛ3 de l'Exemple 1.
Clonage et disruption du gène MHTl
Le gène MHTl a été clone par la méthode du « GAP repair » (Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194 : 281-301 ; Mallet et Jacquet (1996) Yeast 12 : 1351-1357 ; voir la Figure 1)
Les fragments d'ADN compris dans les régions 5' (A) et en 3' (B) du gène MHTl ont été amplifiés par PCR en utilisant des oligonucléotides portant des sites Clal et EcoRl (A) ou EcoRl et BamΗl (β).
Olil : CCATCGATGGCACAGAGCATAGATGCGCCGACC (SEQ ID NO : 23) (site CM en gras) OH 2 : GGAATTCCGAAGGTTTGCTGTATTCGGAGC (SEQ ID NO : 24) (site EcoKL en gras) Oli3 : GGAATTCCCCCCTTGCTGTGGCATGCTAG (SEQ ÏÏ) NO : 25) (site EcoKL en gras) OU4 : CGGGATCCCGGTATAGCGAAGGTTGTTGTCCC (SEQ ID NO : 26) (site BamΗl en gras) L'amplification conduit à l'obtention de fragments de 232 pb (A) et 344 pb (B), qui ont été digérés par EcoRl et soit par Clal (A), soit par BamΗl (B). Les fragments ainsi digérés sont ligaturés avec le plasmide pRS314 digéré par Clal et BamΗl, comme le montre la figure ci-dessus. Le plasmide ainsi obtenu, ouvert par EcoRl a ensuite été utilisé pour une expérience de « GAP repair » avec le gène chromosomique dans la souche W303-1 A.
Afin de disrupter le gène MHTl, le fragment Ncol- Hpal du plasmide pRS314-MHTl a été remplacé par un fragment BamΗl-BamΗl portant le gène de sélection HIS3 de Saccharomyces cerevisiae (pRS314 : Sikorski et Hieter (1989) Genetics 122 :19-27 ; La séquence du plasmide pRS314 est celle déposée à la banque de données EMBL, identificateur « PRS314 », numéro d'accès U03440). Ceci conduit à l'élimination du codon 128 au codon 236 de Mhtlp. Puis le plasmide a été digéré par Clal et BamΗl et le fragment obtenu a été utilisé pour une disruption en une étape en transformant la souche CY251-17D (Mat-a, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl, adol::URA3, sarn4::proSAM4-SAM2, et en sélectionnant les transformants prototrophes pour l'histidine. La disruption a été vérifiée par PCR en utilisant des amorces complémentaires à des séquences adjacentes à l'ORF MET32.
Le gène SAM4 a été clone et inactivé comme décrit dans Thomas et aï. (2000) J. Biol. Chenu 275 : 40718-40724.
Les souches triples mutantes MATa/α, Ms 3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URA3, mhtl::HIS3, sam4::URA3 obtenues, sont donc totalement déficientes pour le catabolisme de la SAM associé à son emploi en tant que donneur de groupement méthyle. Comme on le voit dans le Tableau 1, la présence simultanée de ces trois mutations augmente de façon significative la quantité de SAM produite et excrétée par les cellules de levure.
Les souches CY168-14A et CY168-1C ont été obtenues en croisant les souches CY78-3B (Mata, his3, Ieu2, urα3, trpl, αdol::URA3) et CY55-5A (Mαtα, Ms3, Ieu3, urα3, αde2, trpl, sαm4::URA3, mhtl::HIS3) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées. Dans un tel croisement, on obtient les spores portant la double disruption adol::URA3, sam4::URA3 en sélectionnant spécifiquement les spores URA+ dans les tétrades qui présentent 2 spores URA+ et 2 spores URA' (c'est-à-dire le ditype recombinant, à opposer aux tétrades tétratype, 3 URA+, 1 URA").
EXEMPLE 3
Obtention de souches chez lesquelles la régulation transcriptionnelle négative agissant sur la synthèse de la SAM a été inactivée : disruption du gène MET30
La synthèse des composés soufrés organiques, méthionine, cystéine et SAM est soumise à une régulation négative spécifique, qui agit au niveau transcriptionnel et qui se déclenche suite à une augmentation de la concentration intracellulaire de composés soufrés organiques. Pour augmenter de manière significative la synthèse de SAM en augmentant le flux de soufre réduit nécessaire à la synthèse de ce composé, cette régulation négative a été supprimée et les modifications génétiques nécessaires à cette suppression ont été combinées dans une même souche aux mutations inactivant le catabolisme de la SAM et le transport de la SAM décrites ci-dessus. La modification de la régulation négative de la biosynthèse de la SAM a pu être obtenue en inactivant le gène METiO qui code pour la sous unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet3° (Patton et al, 1998, Gènes Dey., 12, 692-705). Pour réaliser cette inactivation, il a été nécessaire d'employer des souches possédant préalablement un gène MET4 inactivé ou un gène MET32 inactivé. En effet, la protéine Met30p est une enzyme essentielle au maintien de la viabilité des cellules de levures et l'inactivation du gène MET30 est létale. Cependant, il a été montré que la protéine Met30p n'est pas indispensable aux cellules de levures si celles-ci n'expriment pas en même temps, soit la protéine Met4p, soit la protéine Met32p (Patton et al, 2000, The Embo J. 19, 1613-1624).
Disruption du gène MET30
Un fragment d'ADN BamΗI - BωriΑl portant le gène METiO a été clone dans le plasmide pUC19 comme décrit dans Thomas et al (1995) Mol. CeIl Biol 15 : 6526-6534. Le plasmide résultant a été digéré par EcoRY et déphoshorylé. Un fragment BgUl-BgUl portant le gène URA3 dont les extrémités ont été rendues franches est ligaturé avec le plasmide pUC19 digéré par EcoRV-déphosphorylé, donnant un plasmide portant le gène MET30 disrupté par le gène URA3. Ceci résulte en l'élimination des codons 264 à 448 de Met30p. La souche diploïde W303 été alors transformée par le fragment BamBl-Sali et les transformants prototrophes pour l'uracile ont été sélectionnés (disruption en une étape, Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301). La recombinaison homologue a conduit ainsi à l'interruption d'une des copies chromosomiques du gène MET30 par le gène URA3. Ceci a été vérifié par « Southern Blotting » en employant une sonde radiomarquée correspondant au gène URA3. L'analyse de la descendance du diploïde ainsi obtenu (CD 126) hétérozygote pour la mutation met30::URA3 a montré que les tétrades ne contenaient que deux spores viables comme cela avait montré précédemment (Thomas et al, 1995, Mol. CeIl. Biol, 15, 6526-6534). Il a été démontré par la suite que les souches portant les deux mutations met30Δ, met4Δ ou met30A, met32Δ sont viables (Patton et al, 2000, The Embo J. 19, 1613-1624).
Disruption du gène MET32.
Un fragment d'ADN HindlIÏ-EcoRl portant le gène MET32 a été clone dans le plasmide pUC9. Le gène TRPl de Saccharomyces cerevisiae a ensuite été inséré dans le site unique Swaï présent dans la phase ouverte de lecture du gène MET32 (Blaiseau et al, (1997) Mol. CeIl. Biol. 17 : 3640-3648). Le plasmide ainsi modifié a été digéré par HinSΩl et EcoRÏ et le fragment obtenu (3680 pb) a été utilisé pour une disruption en une étape (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301) en transformant la souche W303-1A et en sélectionnant les transformants prototroph.es pour le tryptophane. La disruption a été vérifiée par amplification en chaîne par polymérase (PCR).
Les analyses réalisées avec les souches CY82-7C (génotype d'intérêt ; met32Λ, adolA), CY117-3A (génotype d'intérêt ; met30Δ, met4Δ, adolΛ) et CY154-17A (génotype d'intérêt ; met30Δ, met32Λ, adolΔ) démontrent que des souches portant une double inactivation des gènes MET4 et MET30 combinée à l'inactivation du gène ADOl surproduisent de la SAM en comparaison à une souche de type sauvage. De plus, la même analyse montre que les cellules portant une double inactivation des gènes MET30 et MET32 combinée à l'inactivation du gène ADOl produisent plus de SAM que les cellules possédant une simple inactivation du gène ADOl (voir le Tableau I).
La souche CY82-7C a été obtenue en croisant les souches CC867-1D {Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl, met32::TKPl, met30::URA3) et CY78-3B {Mata, Hs3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URA3) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées.
La souche CY154-17A a été obtenue en croisant les souches CC867-1D {Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl,met32::TRPl, met30::URA3) et CY82-7C {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, adol::URA3, met32::TRPl).
Cette double inactivation des gènes MET30 et MET32 permet donc d'inactiver la régulation transcriptionnelle négative du métabolisme du soufre inorganique sans que les souches qui possèdent cette double mutation présentent de phénotype d'auxotrophie spécifique. Cela est à comparer à la présence d'une double mutation met4Δ, met30Δ qui, si elle permet le maintien de la viabilité cellulaire, résulte, elle, en un phénotype d'auxotrophie pour la méthionine. L'inactivation simultanée des gènes MET30 et MET32 est donc compatible avec la croissance des souches sur des milieux de culture économiquement avantageux.
EXEMPLE 4
Obtention de souches montrant une augmentation de l'activité SAM synthétase : surexpression du gène SAM2 Comme indiqué dans l'introduction, une des étapes limitantes de la biosynthèse de la SAM est la réaction qui permet la synthèse de ce composé à partir de méthionine et d'ATP. En effet cette réaction est particulière car elle requiert la déphosphorylation totale d'une molécule d'ATP. Chez la levure, deux isoenzymes codées par les gènes SAMl et SAM2 catalysent cette réaction. Le mécanisme enzymatique de la réaction catalysée par les SAM synthétases est un mécanisme en deux étapes : la molécule d'ATP et de méthionine réagissent pour former de la SAM et du triphosphate, puis dans une seconde étape, le triphosphate est clivé en Pi et PPi. Afin d'augmenter la synthèse de SAM, les Inventeurs ont cherché à sur¬ exprimer les gènes SAMl et SAM2 à partir de différents promoteurs forts de levure, tels que les promoteurs des gènes PGiC/ et TEFl .
Des souches ont été construites dans lesquelles les copies endogènes des gènes SAMl et SAM2 ont été remplacées par les fusions proPGKl-SAMl etpτoPGKl~SAM2 respectivement ou proTEFl-SAMl et proTEFl-SAM2. L'analyse de la production de SAM des souches correspondantes a permis de montrer que ces remplacements géniques conduisaient à une légère augmentation de la production de SAM. Une stratégie alternative a donc été employée et a conduit à l'ajout d'une copie supplémentaire du gène SAM2, qui a été insérée dans le chromosome XVI de la levure, en lieu et place des deux gènes adjacents SAM3 et SAM4. L'analyse de la production de SAM dans de telles souches a révélé que la présence d'une telle copie supplémentaire du gène SAM2 à ce locus génique induisait une augmentation significative de la production de SAM par les cellules de levure.
Construction du gène fusion proP GKl-S AM2
Le gène SAM2 a été placé sous le contrôle du promoteur du gène PGKl par une expérience de « GAP repair ». Pour cela, le promoteur du gène PGKl porté par le plasmide pFL61 (Bonneau et al. (1991) Yeast 87 : 609- 615) a été amplifié en utilisant deux oligonucléotides bi fonctionnels. Oli-5'-SAM2-PGK comprend 42 nucléotides homologues à la séquence-cible située en 5' du gène SAM2 (-222 à -181, en gras ci-dessous), suivis de 24 nucléotides homologues au promoteur du gène PGKl (-771 à -747). Le deuxième oligonucléotide (Oli-3'-SAM2-PGK) est formé de 45 nucléotides homologues au gène SAM2 comprenant l'ATG débutant le traduction (44 à 1, en gras ci-dessous) suivis de 30 nucléotides homologues du promoteur du gène PGKl (-2 à -31). Les nucléotides sont comptée à partir _de l'A de l'ATG débutant le traduction de chaque gène. Oli-5'SAM2-PGK : GCTCTTGTAAACGACGTCAAATCTTCATATGCAAGGAGATCTGATTCCTGACT
TCAACTCAAGACG (SEQ ID NO : 27)
Oli-3'-SAM2-PGK : CCGACGGATTCAGAGGTAAATAAGAAAGTTTTGCTCTTGGACATTGTTTTATA
TTTGTTGTAAAAAGTAGATAAT (SEQ ID NO : 28)
Le fragment obtenu par amplification est utilisé dans une expérience de « GAP repair » avec le plasmide ρSAM2-3 (Thomas et al, 1988, Mol. CeIl. Biol., 8, 5132-5139) dans la souche W303-1A. Le plasmide résultant de cette expérience porte le gène SÂM2 sous le contrôle du promoteur du gène PGKl (voir Figure 2A).
Le plasmide obtenu a été digéré par HzndIII, et le fragment généré a été utilisé dans une expérience de disruption en une étape (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281- 301) en transformant la souche W744-1A et en sélectionnant des transformants prototrophes pour la SAM. La disruption a été vérifiée par PCR.
Remplacement des gènes SAM3 et SAM4 par le gène fusion proPGKl-SAM2
Dans un mode de mise en œuvre avantageux des procédés selon l'invention, le gène SAM4 a été inactivé de façon simultanée avec le gène SAM3 adjacent qui code pour le transporteur à haute affinité de la SAM, de façon à diminuer significativement la possibilité que les cellules de levure ne re-prélèvent la SAM qu'elles auraient excrétée.
Dans un autre mode de mise en œuvre avantageux des procédés selon l'invention , cette double inactivation des gènes SAM3 et SAM4 a été réalisée en insérant à leur locus une fusion surexprimant l'enzyme Sam2p (SAM synthétase 2) sous le contrôle du promoteur fort constitutif PGKl. Les cellules de levure ainsi construites présentent l'avantage d'avoir, grâce à cette modification spécifique apportée à leur génome, un catabolisme de la SAM diminué, un système de transport à haute affinité de la SAM inactivé et une expression accrue de l'activité SAM synthétase grâce à la présence d'un gène SAM2 supplémentaire, de surcroît exprimé à partir d'un promoteur fort constitutif (alors que les promoteurs des gènes natifs SAMl et SAM2 sont régulés de manière négative par l'augmentation des concentrations endogènes de composés soufrés organiques, Thomas et Surdin-Kerjan, 1997, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61, 503-532). Les souches portant au niveau du bras gauche du chromosome -XVI l'insertion de la fusion proPGKl-SAM2 en lieu et place des gènes SAM3 et SAM4 (construction indiquée dans le génotype des souches comme sam3-sam4 : :proPGKl-SAM2) démontrent effectivement un synthèse accrue de SAM par rapport à leur souche parentale.
Le plasmide portant le gène SAM2 placé sous le contrôle du promoteur du gène PGKl, obtenu comme décrit ci-dessus, a été utilisé pour amplifier le fragment portant le gène proPGK-SAM2 avec des oligonucléotides bi fonctionnels. L'oligonucléotide SAM3-PGK comprend 77 nucléotides homologue à la séquence cible en 5' du gène SAM3 (-80 à -3, apparaissant en gras ci-dessous) suivis de 24 nucléotides homologues à la région promoteur du gène PGKl (-771 à -748). L'oligonucléotide SAM4-SAM2 comprend 70 nucléotides homologues à la séquence cible en 3' du gène SAM4 (1043 à 974, apparaissant en gras ci- dessous) suivis par 21 nucléotides homologues à la fin du gène SAM2 (1155 à 1134). Les nucléotides sont numérotés à partir de l' ATG débutant la traduction pour chaque gène.
Oli-SAM3-proPGK : TGATGTTATGTCGAGAGCTCTGAAAACCAATTATTTTGAAAGCTAACATTTCA
AAAGGCTATTTCTTCTGAAATATCGATTCCTGACTTCAACTCAAGACG (SEQ ID NO : 29)
Q1Î-SAM4-SAM2 : GTGTAACATGCTGCTTTTAGCATATATATAATGTTAAGAATTATTTAACTTCT
TTAAAAACGCATTTACGTTAAAATTCCAATTTCTTTGG (SEQ ID NO : 30)
Le fragment obtenu par amplification a été utilisé dans une expérience de disruption en une étape (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301) en transformant la souche W744-1A et en sélectionnant les transformants prototrophes pour la SAM (voir la Figure
2B).
Le remplacement simultané des gènes SAM3 et SAM4 par le gène proPGK-SAM2 a été vérifié par PCR.
Les souches CY273 ont été obtenues en croisant les souches CY270-7D {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl,adol::UJRA3, sam3-sam4::proPGKl-SAM2) et CY258-10D {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl, met30::URA3, adol::URA3, sam3- sam4 : :proSAM4-SAM2, mhtl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées. EXEMPLE 5
Obtention de souches présentant des capacités de transport de la méthionme accrues : sur expression du gène A GPl
Un des procédés mis en œuvre par la présente invention concerne la culture de cellules de levure génétiquement modifiées afin de produire de large quantité de SAM. Dans un mode avantageux des procédés mis en œuvre, le milieu de culture des cellules de levure contient de forte concentration de méthionine, produit peu onéreux, qui est le précurseur immédiat de la SAM. Afin d'augmenter dans de telles conditions de culture la production de SAM, la capacité de transport de la méthionme des cellules du milieu de culture vers leurs cytoplasme a été améliorée. Pour prélever la méthionine du milieu extérieur, la levure possède au moins trois systèmes de transport dont les caractéristiques enzymatiques sont différentes. Ces systèmes de transport diffèrent notamment par leur affinité pour la méthionine et leur capacité de transport de cet acide aminé soufré. Ces systèmes sont appelés méthionine perméase à haute affinité, codée par le gène MUPl, méthionine perméase à faible affinité, codée par le gène AGPl (et peut être d'autres gènes) et méthionme perméase à très faible affinité, codée par le gène MUP 3 (Isnard et al, 1996, J. Mol. Biol. 262, 473-484) L'expression de ces différents gènes est soumise à des régulations complexes et les capacités de transport de la méthionine varient donc largement selon les conditions de croissance. Pour augmenter le prélèvement de la méthionine du milieu extérieur et le rendre moins dépendant des variations environnementales, des souches de levures ont été construites chez lesquelles le gène AGPl codant pour la méthionine perméase à faible affinité, a été placé sous le contrôle du promoteur fort constitutifs PGKl. La fusion proPGKl -A GPl a été employée pour remplacer la copie endogène du gène AGPl. La mutation agpl : :proPGKl-AGP 1 a été introduite dans des souches présentant des mutations met30Δ, met32Λ, sam4Λ, mhtlΔ, adolΔ et l'analyse de la souche correspondante CY208-7B démontre une augmentation de la quantité de SAM produite suite à l'introduction au locus AGPl de la fasionproPGKl-AGPl.
Remplacement du gène AGPl par le gène fusion proP GKl -AGP 1
Le gène AGPl a été placé sous le contrôle du promoteur du gène PGKl par une expérience de « GAP repair ». Pour cela, le promoteur du gène PGKl porté par le plasmide pFLόl a été amplifié en utilisant deux oligonucléotides bi fonctionnels. Oli-5'-AGPl-PGK comprend 45 nucléotides homologues à la séquence cible située en 5' du gène AGPl (-387 à - 342, en gras ci-dessous), suivis de 24 nucléotides homologues au -promoteur du gène PGKl (- 771 à -747). Le deuxième oligonucléotide (Oli-3 ' -AGPl -PGK) est formé de 45 nucléotides homologues au gène AGPl comprenant F ATG débutant le traduction (45 à 1, en gras ci- dessous) suivis de 30 nucléotides homologues du promoteur du gène PGKl (-1 à -30). Les nucléotides sont comptée à partir de l'A de l'ATG débutant le traduction de chaque gène.
Oli-5 '-AGPl -PGK : CACGTCCAGCGGATTGCTGCTCCTTAGTAGTCCACAGTTCTTAAGGATTCCTG
ACTTCAACTCAAGACG (SEQ ID NO : 31)
Oli-3'-AGPl-PGK : ATTTTTCAAGTCTTTCAGTTCGTATAGAGACTTCGACGACGACATTGTTTTAT
ATTTGTTGTAAAAAGTAGATAAT (SEQ ID NO : 32)
Le fragment obtenu par amplification a été ensuite utilisé dans une expérience de « GAP repair » avec le plasmide pϋ406 (le vecteur pFL38 portant un fragment de 3 kb comprenant le gène AGPl, Iraqui et al, 1999, Mol. CeIl. BioL, 19, 989-1001) dans la souche W303-1A. Le plasmide résultant de cette expérience porte le gène AGPl sous le contrôle du promoteur du gène PGKl (voir Figure 3).
Ce plasmide a été digéré par BssEU et BamΗI, et le fragment généré a été utilisé dans une expérience de disruption en une étape (Rothstein, 1991, Methods in Enzymology, 194, 281-301), en transformant la souche EKOIl (Iraqui et al. (1999) Mol. CeIl. BioL 19 : 989- 1001) et en sélectionnant les transformants capables de croître sur un milieu contenant 1 mM d'isoleucine (la souche EKOI l qui porte simultanément une délétion dans le gène GAPl et une disruption du gène AGPl a une croissance très ralentie sur une forte concentration d'isoleucine (1 mM). De plus, dans cette souche la disruption du gène A GPl a été effectuée par le gène KanMX, la souche est donc résistante à la généticine (Iraqui et al., 1999, Mol. CeIl. Biol, 19, 989-1001). Un transformant, CD225 capable de croître sur 1 mM isoleucine et devenu parallèlement sensible à la généticine a été conservé. Le remplacement du gène AGPl par le gène proP 'GK-AGPl a été vérifié par PCR.
Les souches CY131 ont été obtenues en croisant les souches CC867-1D {Mata, his3, Ieu2, ura3, ade2, trpl, met32::TRPl, met30::URA3) et CY121-3D {Mata, his3, ura3, trpl, met32::TRPl, adol::URΛ3, agpl::proPGKl -AGPl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentnat les recombinaisons géniques souhaitées.
Les souches CY208 ont été obtenues en croisant les souches CY188-9A (Mata, his3, trpl, ura3, met32::TRPl, adol::UM3, met30::URA3, sam4::UM3, mhtl::HIS3) et CY121-1C (Mata, his3, ura3, trpl, met32::TRPl, adol::URA3, agpl::proPGKl -AGPl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées
Les souches CY284 ont été obtenues en croisant les souches CY273-2B (Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl,met32::TRPl, met30::URΛ3, adol::URA3, sam3~sam4::proPGKl-SAM2) et CY121-1C {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl, agpl::proPGKl -AGPl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées.
EXEMPLE 6
Analyse de l'effet de la mutation ADE2 sur la production de SAM
L'analyse de la production et d'excrétion de SAM dans les différentes souches qui ont été construites pour cette invention ont permis d'observer que la production et l'excrétion de SAM était systématiquement plus faible dans des souches portant une mutation inactivant le gène ADE2 (gène situé sur le chromosome XV, codant pour la phosphoribosylaminoimidazole carboxylase) que dans des souches comprenant un génome exactement équivalent mais portant un allèle sauvage du gène ADE2. Cette mutation affecte la biosynthèse des purines mais son influence sur la capacité des cellules de levure à surproduire de la SAM reste difficile à expliquer. Néanmoins, au vu des résultats obtenus, les souches construites pour la présente invention porteront toutes un allèle sauvage non muté du gène ADE2.
EXEMPLE 7
Culture des souches de levures génétiquement modifiées de l'invention dans un milieu de culture économiquement avantageux
La cultures des souches haploïdes de génotype CY208-7B et CY208-11B, CY273-9D et CY273-2B, CY284-9B et CY284-2B et des souches diploïdes CY303-1 et CY303-4, et CY304-1 et CY304-2 (voir le Tableau 1), dans un milieu de culture économiquement avantageux (contenant entre 3 et 10 % de phosphate d'ammonium, entre 0,5 et 5 % de sulfate d'ammonium, entre 0,1 % et 1 % de sulfate de magnésium, entre 0,5 et 4 % de citrate de sodium, entre 5 et 10 % de glucose et entre 0,1 et 2 % de DL-méthionine) ont permis d'obtenir en moyenne environ 8 g par litre en 24 heures de SAM (voir le Tableau 1). Environ 40 % de cette SAM produite est excrétée dans le milieu de culture et peut donc être purifiée sans cassage des cellules.
Les souches CY208 ont été obtenues en croisant les souches {Mata, his3, trpl, ura3, met32 ::TRP1, adol::URA3, met30::URA3, sam4::URA3, mhtl::HIS3) et CY121-1C CY121- IC {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl, agpl::proPGKl -AGPl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées.
Les souches CY273 ont été obtenues en croisant les souches CY270-7D {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl,met32::TRPl,adol::URA3, sam3-sam4 ::proPGKl-SAM2) et CY258-10D {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl,met30::URÂ3, adol::URA3, sam3-sam4 ::proSAM4- SAM2, mhtl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées.
Les souches CY284 ont été obtenues en croisant les souches CY273-2B {Mata, his3, Ieu2, ura.3, trpl, met32:: TRPl, met30::URA3, adol::URA3, sam3-sam4 ::proPGKl-SAM2) et CY121-1C {Mata, his3, Ieu2, ura3, trpl, met32::TRPl, agpl::proPGKl -AGPl) et en faisant sporuler les diploïdes obtenus, puis en analysant les tétrades obtenues afin de sélectionner les spores présentant les recombinaisons géniques souhaitées.
Tableau 1 : génotype des souches obtenues et profil de production et d'excrétion de la SAM associé

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée, dans laquelle le gène codant pour l'adénosine ldnase a été inactivé par modification génétique, pour la production de S- adénosylméthionine (SAM).
2. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence du gène codant pour l'adénosine kinase de ladite souche a été disruptée.
3. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ladite souche présente au moins une autre modification génétique choisie parmi le groupe comprenant :
- l'inactivation d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine, le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase, le gène codant pour la S-méthylméthionine-homocystéine méthyle transférase, et le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet30,
- l'introduction d'une copie supplémentaire de la séquence d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine, dans le génome de ladite souche, et
- la mutation de la séquence d'un promoteur d'un gène choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine.
4. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence d'au moins un des gènes choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S-adénosylméthionine, le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase,, le gène codant pour la S-méthylméthionine-hornocystéine méthyle transférase, et le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet3° de la dite souche a été disruptée.
5. Utilisation d'une souche, de levure génétiquement modifiée selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce qu'au moins une séquence d'un promoteur d'un des gènes de ladite souche choisi parmi le groupe comprenant le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 1, le gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, le gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à haute affinité, le gène codant pour la méthionine perméase à très faible affinité, un gène codant pour une perméase à large spectre pouvant transporter la méthionine, a été substituée par une séquence d'un promoteur fort de levure.
6. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les gènes codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase SCFMet3°, la S-méthylméthionine-homocystéine méthyle transférase, l'adénosine kinase, et la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase de la dite souche sont inactivés, notamment par disruption des séquences desdits gènes.
7. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisée en ce qu'une copie supplémentaire de la séquence du gène codant pour la S- adénosylméfhionine synthétase 2, couplée à un promoteur fort, a été introduite dans le génome de ladite souche.
8. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisée en ce la séquence du promoteur du gène codant pour la méthionine perméase à faible affinité de ladite souche a été substituée par la séquence d'un promoteur fort.
9. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que le gène codant pour le transporteur à haute affinité de la S- adénosylméthionine et le gène codant pour la S-adénosylméthionine-homocystéine méthyle transférase de ladite souche ont été inactivés par substitution de la séquence desdits gènes par une copie de la séquence du gène codant pour la S-adénosylméthionine synthétase 2, couplée à un promoteur fort.
10. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que le promoteur fort est choisi parmi le groupe comprenant les promoteurs naturels des gènes PGKl, ADHl, TDH3, TEFl, PHO5, LEU2, et GALl de ladite souche.
11. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est prototrophe pour l'adénine.
12. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est haploïde.
13. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est diploïde.
14. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon la revendication 13, caractérisée en ce que lorsque les modifications génétiques sont chromosomiques, lesdites modifications génétiques sont portées par chacun des deux chromosomes homologues.
15. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite souche ne comprend pas de séquences nucléotidiques hétérologues.
16. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ladite souche est choisie parmi le groupe comprenant les levures du genre Saccharomyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, et Kluyveromyces, et que ladite souche est notamment une levure de l'espèce Saccharomyces cerevisiae.
17. Utilisation d'une souche de levure génétiquement modifiée selon l'une des revendications 3 à 10, caractérisée en ce que la souche appartient à l'espèce Saccharomyces cerevisiae et en ce que lorsque le gène codant pour la sous-unité réceptrice Met30 du complexe ubiquitine ligase sCFMet3t) [METSO) de ladite souche est inactivé, notamment par disruption de la séquence du gène MET30, alors le gène MET4 et/ou le gène MET32 de ladite souche est également inactivé, notamment par disruption des séquences géniques correspondantes,
18. Souche de levure génétiquement modifiée présentant une production et une excrétion accrue de S-adénosylméthionine par rapport à la souche de levure non modifiée correspondante, ladite souche génétiquement modifiée étant telle que définie dans l'une des revendications 3 à 17.
19. Procédé de production de S-adénosylméthionine, caractérisée en ce qu'il comprend les étapes de :
- culture d'une souche de levure génétiquement modifiée telle que définie dans l'ixne des revendications 1 à 17 dans un milieu de culture,
- purification de la S-adénosylméthionine à partir du surnageant du milieu de culture et/ou des cellules de levure génétiquement modifiées.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la culture est réalisée en chémostat.
21. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de substance active au moins une souche de levure telle que définie dans l'une des revendications 1 à 17, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Utilisation d'une souche de levure telle que définie dans l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies nécessitant un apport accru en S-adénosylméthionine, telle que la dépression, l'arthrite, les fïbromyalgies, ou la stérilité masculine.
23. Utilisation d'une souche de levure telle que définie dans l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'aliments ou de boissons enrichis en S-adénosylméthionine.
24. Préparation alimentaire ou boisson, destinée à l'alimentation humaine ou animale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une souche de levure telle que définie dans l'une des revendications 1 à 17.
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