EP1802642A2 - Composes fluorophosphonocinnamiques, synthese et applications dans le traitement des troubles causés par un stress oxydatif - Google Patents
Composes fluorophosphonocinnamiques, synthese et applications dans le traitement des troubles causés par un stress oxydatifInfo
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Classifications
-
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Definitions
- the invention relates to a process for preparing organofluorophosphorus compounds. More specifically, it relates to a novel method for fluorinating organophosphorus compounds as well as to the synthesis of ophosphonocinnamic fluorine compounds. These fluorophosphonocinnamic compounds, new in themselves, in particular by their antioxidant activity, are of particular industrial interest, particularly in the medical and / or cosmetic fields.
- organofluoro (thio) phosphorus esters which can be generalized by the following formula:
- R 1 and R 2 may denote a wide variety of radicals: alkyl, aryl, alkyl, amide, anilide, etc.
- esters are generally described as inhibitors of enzymatic acylation reactions, particularly effective on acetylcholinesterases. Moreover, because of their bactericidal and fungicidal properties, they are conventionally used in the development of insecticidal and / or disinfectant compositions.
- R denote phenyl, methoxy, ethoxy and / or tert-butylmethoxy radicals.
- the preparation of these compounds consists of a reaction between phosphino (thio) selenoate, phosphino (thio) chloridate compounds or their phosphono- or phosphoro- analogues, and silver fluoride (AgF).
- the reaction is carried out in solution (preferably in trichloromethane or methylnitrile) and can be carried out at room temperature.
- the product of interest appears as an insoluble precipitate of dark gray color. It is recovered after a dilution of mixture in dichloromethane, followed by washing with brine and drying over magnesium sulphate.
- the first disadvantage is the reagent used, silver fluoride, a particularly expensive reagent.
- Another disadvantage lies in the impossibility of obtaining by this method, fluorothiophosphorus type compounds but only fluorophosphorus type compounds. Indeed, even starting from a thiophosphonate compound, the fluorination with silver fluoride is also accompanied by the conversion of the thiophosphonate function into a phosphonate function and ultimately results in the formation of a fluorophosphorus compound.
- R denoting alkyl radicals.
- a reaction is carried out between a ⁇ -alkoxy- or ⁇ -alkylmercaptovinylphosphonic acid dichloride and alkaline fluorides in the presence of an anhydrous alcohol and a solvent of the benzene, toluene or chlorobenzene type.
- Alkaline fluorides especially sodium fluoride
- the reaction temperature is of the order of 60-90 ° C.
- the invention aims to provide a process for fluorinating organophosphorus compounds, including organothiophosphorus compounds, to corresponding fluoro (thio) phosphorus compounds, the implementation of which requires the use of any substance having a risk. serious for health or any danger of manipulation, under the normal conditions of implementation of the said process.
- the invention aims to allow the fluorination, according to a simple and rapid process to implement, of particular organo (thio) phosphorus compounds, in this case (thio) phosphonochemical compounds, for which attempts For the moment, fluoridation has been little or not considered at all.
- organo (thio) phosphorus compounds in this case (thio) phosphonochemical compounds, for which attempts For the moment, fluoridation has been little or not considered at all.
- Another object of the invention is to be able to propose new chemical compounds thus synthesized having an industrial application of a particular interest and a substantially improved potential compared with corresponding or non-fluorinated compounds.
- phosphorus "phosphorus”, “phosphoric”, “phosphonic” ... will be used either specifically to designate phosphorus groups in which the phosphorus atom is bound, by a double bond to an oxygen atom, or so more general, to also include the possibility that said phosphorus atom can also be bound, by a double bond, not to an oxygen atom, but to a sulfur atom (in other words, "phosphorus",
- phosphoric "phosphonic” ... may also and possibly be understood as respectively "thiophosphorus”, “thiophosphoric”, “thiophosphonic” ).
- the invention relates to fluorophosphonocinnamic compounds of the general formula:
- X is chosen from: an oxygen atom or a sulfur atom
- R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are chosen from: H, an alkyl group, an aryl group, OH, O -alkyl, S-alkyl, NH 2 ,
- R 7 is chosen from:
- R is selected from: H 5 alkyl group, an aryl group, and wherein said alkyl and aryl groups contain about 1 to 6 carbon atoms linearly linked.
- these fluorophosphono- cinnamic compounds of general formula (I) can be obtained by fluorination of phosphonocinnamic compounds of general formula:
- X is selected from: an oxygen atom or a sulfur atom
- R ' is selected from: S-alkyl, S-aryl, S-amine, S-amide, NH-alkyl, NH-aryl,
- fluorophosphonocinnamic compounds of general formula (I) according to the invention can also be obtained by fluorination of phosphonocinnamic compounds, analogous to the compounds of general formula (II) and corresponding to the general formula:
- TBDPS is ⁇ -butyldiphenylsilyl.
- phosphonocinnamic compounds (non-fluorinated) of general formulas (II) and (IF), which can be used as starting products in the process according to the invention are already known from the state of the art. Examples of their preparation can be found particularly in publications such as Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14: 217-237) and Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44: 2445-2447).
- a phosphonocinnamic compound of general formula (II) or (IF), specifically on the phosphorus atom it is reacted at a temperature of between -20 ° C. and 85 ° C. and advantageously at room temperature, with a fluorinating agent comprising a complex formed between a tertiary amine, denoted R 3 N, and hydrogen fluoride (HF); said tertiary amine (R 3 N) being substituted by alkyl groups comprising on the order of 1 to 6 linearly bound carbon atoms.
- a fluorinating agent comprising a complex formed between a tertiary amine, denoted R 3 N, and hydrogen fluoride (HF); said tertiary amine (R 3 N) being substituted by alkyl groups comprising on the order of 1 to 6 linearly bound carbon atoms.
- the invention thus relies on the demonstration that a complex formed between a tertiary amine and hydrogen fluoride constitutes an excellent agent for the fluorination, especially on the phosphorus atom, of phosphonocinnamic compounds.
- Hydrogen fluoride in the form of a complex with a tertiary amine is already known to allow the substitution of an ad hoc leaving group by a fluorine atom (McClinton, 1995, Aldrichimica Acta, 28 (2): 31- 35). It is well established that the reactivity, and therefore the fluorination capacity, of these complexes is a function of their nucleophilia.
- This nucleophilia largely depends on the molar ratio between the tertiary amine and hydrogen fluoride which, in general, can be of the order of 1: 1, 1: 2 or 1: 3.
- R 3 N HF, R 3 N * 2HF and R 3 N" 3HF which respectively correspond to the molar proportions previously indicated.
- the nucleophilia of these different complexes varies in the following order: R 3 N "2HF> R 3 N"3HF> R 3 N-HF.
- R 3 N substitution mediated by such complexes, concerned only leaving groups supposed to be worn by carbon atoms.
- a process according to the invention makes it possible to fluorinate, in a simple manner, specifically the phosphorus atom of organophosphorus compounds of general formula (II) or (H ') and this, in a single step with a good yield and a total selectivity.
- a simple conventional purification step is sufficient to collect the fluorophosphonocinnamic compounds thus synthesized.
- the method according to the invention also has the advantage of being able to be conducted with readily available starting materials and reagents (that is to say either because they are already commercially available and reasonable prices, either because their method (s) of synthesis has (have) already been described in the literature) and whose dangerousness is negligible under normal conditions of implementation of a process in accordance with the 'invention.
- the fluorination reaction according to the invention can advantageously be carried out at ambient temperature or at much lower temperatures.
- tertiary amines according to the invention are trimethylamine (Me 3 N), triethylamine (Et 3 N), tripropylamine, tributylamine and tripentylamine. Triethylamine (Et 3 N) is preferably used.
- a complex of the R 3 N 'HF type in particular Et 3 N' HF, is used as the fluorination agent; that is to say with a ternary amine / hydrogen fluoride molar ratio of the order of 1: 1.
- R 3 N "HF especially with triethylamine as tertiary amine according to the invention
- nucleophilia significantly less compared to the complexes of R 3 N" 2HF or R 3 N "3HF it still had a remarkable reactivity.
- the reaction is carried out in the liquid phase. It is then possible to use a solvent in which the organic compound is soluble, for example dichloromethane, acetonitrile or else tetrahydrofuran.
- the reaction is carried out with an excess of fluorinating agent.
- a molar ratio between the starting compound of formula (II) and the fluorinating agent is used, of the order of 1.2 to 20.
- this molar ratio is at least order of 5.
- the R group of a starting phosphonocinnamic compound of general formula (II) is chosen from leaving groups: -SCH 2 CH 2 NHCOCH 3 , -NHCH 2 Ph (Ph denotes a phenyl radical).
- R 7 'de notes a group chosen from: -H or -CH 3 .
- - R and R denote groups chosen from: -H or -OCH 3 .
- the starting phosphonocinnamic compound having the general formula (II) one of the phosphonocinnamic thioesters whose preparation protocol is described in the publication Lapeyre et al, 2003 (Tetrahedron Letters, 44: 2445-2447), or a similar compound.
- the leaving group is of the S-amine type, in particular an N-acetylcysteamine radical (-SCH 2 CH 2 NHCOCH 3 ).
- the invention also relates, as new products, to fluorophosphonocinnamic compounds of general formula (I).
- the fluorophosphonocinnamic compounds according to the invention exhibit an antioxidant activity that is particularly advantageous in the context of therapeutic or cosmetic treatment of physiological disorders caused by oxidative stress.
- the work of the inventors has made it possible to show that the protective effect of the fluorophosphonocinnamic compounds according to the invention against the oxidation of LDL is advantageously very comparable to that observed with the corresponding non-fluorinated compounds.
- the fluorophosphonocinnamic compounds according to the invention surprisingly also exhibit a protective effect against the toxicity related to 4-HNE and this, very likely due to their fluorine atom.
- the compounds according to the invention have a major application interest in the treatment of atherosclerosis and its cardio or neuro-vascular complications.
- Atherosclerosis is a multifactorial pathology in which lipids play an important role, alongside other genetic or nutritional factors.
- LDL which carries blood cholesterol to peripheral tissues
- the oxidation induced in LDL causes in situ the formation of aldehydes (especially 4-HNE) which can in turn oxidize LDL.
- LDL Oxidized compounds play a major role in the formation of foam cells whose accumulation in fatty streaks is at the origin of the first lesions of atherosclerosis. These oxidized LDLs also have proinflammatory, mitogenic, procoagulant and proapoptotic properties that are potentially involved in the progression of plaques to more advanced stages, or even rupture and thrombosis phenomena that are at the origin of cardiovascular events.
- Molecules capable of blocking the LDL oxidation process are therefore extremely effective in inhibiting plaque development.
- the invention provides here new blocking agents of the LDL oxidation pathway and whose efficiency is all the more remarkable in that they act at least at two different levels of this pathway (direct action on the LDL, and via 4-HNE).
- the invention therefore also extends to a cosmetic or therapeutic composition, characterized in that it comprises at least one fluorophosphonocinnamic compound according to the invention, in particular for their blocking effect of the LDL oxidation route.
- the invention is a therapeutic composition intended for the treatment of physiological disorders caused by oxidative stress, in particular atherosclerosis and its cardio or neuro-vascular complications.
- the invention also extends to the use of a fluorophosphonocinnamic compound according to the invention for the preparation of a medicament for the therapeutic treatment of atherosclerosis.
- the invention also relates to a method for the in vitro protection of LDL against oxidation, in which LDL is brought into contact with at least one fluorophosphonocinnamic compound according to the invention.
- the invention also relates to a process for the preparation of fluorophosphonocinnamic compounds, fluorophosphonocinnamic compounds, a therapeutic composition and a method for protecting LDL from oxidation, characterized, in combination, by all or some of the above characteristics. or below.
- FIGS. 1A, 1B and 2 are statistical representations, in rods, of the overall antioxidant effect of particular compounds in accordance with the invention, as well as of their effect on the protection of cells subjected to oxidative stress,
- FIGS. 3 and 4 show the evolution of the survival of the cells in the presence of oxidized LDL or of 4-HNE, as a function of the concentration of the medium in a particular compound according to the invention.
- R' S (CH 2 ) 2 NHCOCH 3 6
- R' S (CH 3) 2 ) 2 NHCOCH 3 7
- R 7 H
- Phosphonothioesters designated 1 to 4 for which the leaving group R 'is an N-acetylcysteamine group, may be previously synthesized according to the method described in Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44: 2445-2447).
- the phosphonamide designated 4 ' for which the leaving group R' is a secondary amine, may be previously synthesized according to the method described in the publication Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14: 217-237).
- Avocado triethylamine (99% purity) and Aldrich Et3N ⁇ 3HF complex (98% purity) are used for the generation of the Et3N "HF complex.
- Anhydrous tetrahydrofuran (THF) (purity 99.7%) and ethyl acetate for preparative HPLC (purity 99.8%) are supplied by the company SDS, France.
- These phosphonochloridoate compounds AC have been described as intermediates for the synthesis of phosphonothioesters 1-4, according Lapeyre et al, 2003.
- these phosphonochloridoate compounds AC, used as starting materials in the implementation of a process according to the invention can be obtained in advance quantitatively from the corresponding phosphonodiesters according to the method described below.
- the melting points were measured on a BUCHI device.
- the IR spectra are recorded on a Perkin-Elmer Fourier Transform spectrophotometer model FT-IR spectrophometer 1725x.
- the mass spectra (DCI chemical ionization or EI electronic impact) are carried out on a NERMAG R10-10 quadrupole spectrometer.
- the chemical shifts ( ⁇ ) are expressed in ppm by taking the tetramethylsilane signal as a reference for the 1 H and 13 C nuclei, the phosphoric acid signal, as a reference for the 31 P nucleus and the acid signal. hydrofluoric, as a reference for the nucleus 19 F.
- the coupling constants J are expressed in Hertz and the multiplicity of the signals is indicated by a lowercase letter: s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), m (multiplet).
- the silylated phosphonothioester I (0.64 mmol) is dissolved in 4 mL of THF under nitrogen in a 25 mL two-necked flask. 2.1 mmol of triethylamine and then 1.1 mmol of the complex Et 3 N "3HF are then added to the microsyringe. The solution thus obtained is stirred at 20 ° C. for 2 hours. The reaction crude is concentrated under reduced pressure and the compound thus obtained is purified by MPLC (eluent AcOEt). b) Characterization: Appearance: white solid.
- Phosphonothioester 2 (0.64 mmol) is dissolved in 4 mL of THF under nitrogen in a 25 mL two-necked flask. 2.1 mmol of triethylamine then
- Phosphonothioester 3 (0.64 mmol) is dissolved in 4 mL of THF under nitrogen in a 25 mL two-necked flask. 2.1 mmol of triethylamine and then 1.1 mmol of the Et 3 N "3HF complex are then added to the microsyringe. The solution thus obtained is stirred at 20 ° C. for 3 hours. The reaction crude is concentrated under reduced pressure and the compound 7 thus obtained is purified by MPLC (eluent AcOEt). b) Characterization: Appearance: white solid. Yield: 68%.
- Phosphonothioester 4 (0.64 mmol) is dissolved in 4 mL of THF under nitrogen in a 25 mL two-necked flask. 2.1 mmol of triethylamine then
- LDL Native LDL are purified from serum pools derived from healthy subjects, by preparative ultracentrifugation in the K-Br gradient. The LDL are then dialyzed in isotonic NaCl buffer (9 g / l, pH 7.2), to remove the KBr, then sterilized (0.2 nm filter) and stored under nitrogen until use (maximum: 2 weeks). ). Human endothelial cells in culture (HMEC or ECV304 lines) are cultured in multi-well dishes and subconfluentially cultured in RPMI 1460 culture medium containing 10% fetal calf serum and antibiotics (penicillin, streptomycin).
- the standard culture medium is replaced by RPMI 1640 (1 mL / well) containing 1 ⁇ M CuSO 4 (to initiate oxidation) and 100 ⁇ g / mL of native LDL, as well as the various compounds (noted 5 to 8). to be tested at varying concentrations. After 6 hours of contact, part of the medium is taken to measure LDL oxidation parameters (TBARS). After 24 hours of contact, the residual viability of the cells in contact with the oxidized LDLs (and possibly protected from oxidation by the CPS) is measured (MTT test).
- TBARS LDL oxidation parameters
- LDL are rapidly oxidized by vascular cells in culture. Preliminary studies have shown that this oxidation requires the presence of heavy metals (such as copper or iron), hence the addition of CuSO 4 . Oxidation kinetics are initially slowed down by endogenous antioxidants (vitamin E), and continue beyond 24 hours (plateau). We measure the oxidation of LDL after 6 hours of contact because it is then in exponential phase and the possibly protective effect of the antioxidants is more sensitive. Oxidation is measured by the determination of TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), which allow a global, quantitative and sensitive evaluation of the oxidation phenomenon.
- TBARS thiobarbituric acid reactive substances
- the results are expressed as a percentage of the control (test without compound synthesized with either oxidized LDL alone).
- Compounds 5 to 8 are added at concentrations ranging from 0.1 to 100 ⁇ M. The results presented correspond to the average of three separate experiments performed in duplicate.
- Oxidized LDLs are toxic to vascular cells in culture. This toxic effect can be studied by the MTT colorimetric test, which measures cell viability. The results, shown in FIG. 1B, show a residual viability of 15 to 20% for the cells in contact for 24 hours with oxidized LDLs alone (in the absence of compounds 5 to 8). In correlation with the effect on TBARS, compound 5 is very effective in preventing the toxicity of cell-oxidized LDL, depending on the dose used. The other compounds have a more limited effect.
- Compound 5 is very effective in protecting LDL from oxidation by vascular cells and their subsequent toxicity is limited. This effect is comparable to that observed with polyphenols such as catechin or quercetin, with a less toxic effect (for cells) at concentrations equal to or greater than 100 ⁇ M.
- the ECV304 are incubated for 6 hours with native LDL (100 ⁇ g / mL) in the presence of CuSO 4 (1 ⁇ M) and variable concentrations of compound 1 or compound 5. The medium is then recovered, an aliquot is taken to assay for TBARS, and the rest of the medium is re-incubated with other
- the endothelial cells are incubated with 200 ⁇ g / ml of oxidized LDL or 25 ⁇ M of 4-HNE and increasing concentrations of compounds 1 or 5.
- the toxicity is evaluated after 24 hours by an MTT test.
- Figure 3 reports the results obtained in the tests carried out with the oxidized LDL; the results are expressed as a percentage of the unstimulated control.
- Figure 4 reports the results obtained in the tests performed with 4-HNE.
- the protective effect of the synthesized compounds on the 4-HNE induced toxicity is solely related to the carbonyl scavenging effect.
- the results show that only the compound 5 is effective, at fairly low concentrations (1 ⁇ M), and persists at higher concentrations, while the compound 1 is without effect, and even toxic at higher doses. These results therefore show that the compound has a carbonyl scavenging effect bound to the fluorine group, which allows an effective protection against the toxicity induced by the aldehydes.
- ApoE knockout mice are apoprotein E-deficient mice (apoE), which induces a plasma cholesterol accumulation associated with an increase in LDL and IDL (intermediate-density lipoproteins), and a decrease in the level of Plasma HDL. These mice represent a classic model for studying the development of atherosclerotic plaques
- mice spontaneously develop atherosclerotic plaques (without hyperlipidic diet).
- mice aged 4 weeks, are divided into 2 lots of 13 animals, fed a standard diet.
- Lot 1 (treated) receives 10 mg / kg of compound 7 in drinking water, compound 7 having been previously dissolved in ethanol, and then diluted in water to obtain a final concentration of compound 7 of 30 mg / L and ethanol 0.05%).
- Lot 2 receives drinking water containing 0.05% ethanol.
- the concentration of compound 7 was calculated with respect to a volume of water of 6 to 10 ml / day and per mouse weighing 30 g.
- Compound 7 is stable at ambient temperature for 4 days (stability verified by HPLC). Bottles are changed twice a week.
- the total duration of treatment is 4 months. After 4 months, the animals are sacrificed and the cores are washed in PBS buffer (phosphate buffered saline), frozen (Tissue TeK) and stored at -80 ° C.
- PBS buffer phosphate buffered saline
- Tissue TeK frozen
- the analysis of atherosclerosis lesions is carried out at the level of aortic sinus, on 10 .mu.m sections stained thick with a specific lipid dye (Oil Red O) 5 and against-stained with hematoxylin / eosin, and then the surface is measured by morphometric evaluation of lesion size ( Biocom Morphometry System, Cyberview 3.0 software). The average lesion area, expressed in ⁇ m 2 , is used to assess the lesion size of each animal.
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Abstract
L'invention concerne un procédé pour fluorer spécifiquement l'atome de phosphore d'un composé phosphonocinnamique de formule générale (II) ou (II') : X étant choisi parmi : un atome d'oxygène, un atome de soufre ; R1 , R2, R3, R4, R5 et R6 étant choisis parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2, NH-alkyle, N-(alkyle)2 ; R étant choisi parmi : H5 un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle ; R7 étant choisi parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, TBDPS représentant un groupe t-butyldiphénylsilyle, dans ledit procédé, on fait réagir ledit composé avec un agent de fluoration comprenant un complexe formé entre une aminé tertiaire et le fluorure d'hydrogène. L'invention s'étend aux nouveaux composés fluorés ainsi préparés, ainsi qu'à des compositions thérapeutiques comprenant de tels composés fluorés, et leur utilisation dans le traitement de l'athérosclérose.
Description
COMPOSES FLUOROPHOSPHONOCINNAMIQUES, SYNTHESE ET APPLICATIONS
L'invention concerne un procédé de préparation de composés organofluorophosphorés. Elle concerne, plus précisément, une nouvelle méthode de fluoration de composés organophosphorés ainsi que la synthèse de composés fluor ophosphonocinnamiques. Ces composés fluorophosphonocinnamiques, nouveaux en eux-mêmes, notamment par leur activité antioxydante, présentent un intérêt industriel tout particulier, notamment dans les domaines médical et/ou cosmétique.
A l'heure actuelle, on connaît de nombreux esters organofluoro(thio)phosphorés que l'on peut généraliser par la formule suivante :
ftl\ /0 : S
*"\ et dans laquelle, R1 et R2 peuvent désigner des radicaux très variés : alkyle, aryle, alcoyle, amide, anilide...
Ces esters sont généralement décrits comme des inhibiteurs des réactions d'acylation enzymatique, particulièrement efficaces sur les acétylcholinestérases. Par ailleurs, de par leur pouvoir bactéricide et fongicide, ils sont classiquement utilisés dans le développement de compositions insecticides et/ou désinfectantes.
Chworos et al, 1999 (Tetrahedron Letters, 40:9337-9340) décrit la préparation d'esters organofluorophosphorés particuliers, pour lesquels R1
2 et R désignent des radicaux de type phényle, méthoxy, éthoxy et/ou terbutylméthoxy.
La préparation de ces composés consiste en une réaction entre des composés de type phosphino(thio)sélénoate, ρhosphino(thio)chloridate ou leurs analogues phosphono- ou phosphoro-, et le fluorure d'argent (AgF). La réaction est réalisée en solution (de préférence dans le trichlorométhane ou le méthylnitrile) et peut être menée à température ambiante. Le produit d'intérêt apparaît sous la forme d'un précipité insoluble de couleur gris foncé. Il est récupéré après une dilution du
mélange dans le dichlorométhane, suivie d'un lavage à la saumure et d'un séchage sur du sulfate de magnésium.
La méthode de fluoration décrite par Chworos et al, 1999, bien que facile et rapide à mettre en œuvre, présente toutefois deux inconvénients majeurs. Le premier inconvénient tient du réactif utilisé, le fluorure d'argent, un réactif particulièrement coûteux. Un autre inconvénient repose sur l'impossibilité d'obtenir par cette méthode, des composés de type fluorothiophosphoré mais uniquement des composés de type fluorophosphoré. En effet, même en partant d'un composé de type thiophosphonate, la fluoration par le fluorure d'argent s'accompagne également de la conversion de la fonction thiophosphonate en une fonction phosphonate et aboutit en final à la formation d'un composé fluorophosphoré.
US 2,962,517 décrit une autre méthode de préparation d'esters organofluorophosphorés et d'ester organofluorothiophosphorés, en particulier des composés répondant à la formule générale suivante :
R désignant des radicaux de type alkyle.
Pour ce faire, une réaction est réalisée entre un dichlorure d'acide β-alcoxy- ou β-alcoylmercaptovinylphosphonique et des fluorures alcalins en présence d'un alcool anhydre et d'un solvant de type benzène, toluène ou chlorobenzène. Les fluorures alcalins (notamment, le fluorure de sodium) doivent être de préférence anhydres et à l'état finement divisé. La température de réaction est de l'ordre de 60-900C. Non seulement le procédé en question requiert la manipulation du benzène, du toluène ou du chlorobenzène, c'est-à-dire des solvants particulièrement volatils, inflammables, cancérigènes et nocifs notamment par inhalation et par contact cutané, qui plus est, il est prescrit de chauffer le milieu réactionnel, et donc de chauffer ces substances dont la dangerosité est expressément signalée même à température ambiante.
L'invention vise, dans ce contexte, à proposer un procédé pour fluorer des composés organophosphorés, y compris organothiophosphorés, en des composés fluoro(thio)phosphorés correspondants, et dont la mise en œuvre nécessite l'utilisation d'aucune substance ayant un risque sérieux pour la santé ou un quelconque danger de manipulation, dans les conditions normales de mise en œuvre dudit procédé.
En particulier, l'invention vise à permettre la fluoration, selon un procédé simple et rapide à mettre en œuvre, de composés organo(thio)- phosphorés particuliers, en l'occurrence des composés (thio)phosphono- cinnamiques, pour lesquels des tentatives de fluoration n'ont pour l'instant été que très peu envisagées, voire pas du tout.
Un autre objectif de l'invention est de pouvoir proposer de nouveaux composés chimiques ainsi synthétisés ayant une application industrielle d'un intérêt tout particulier et un potentiel sensiblement amélioré par rapport à des composés, correspondants ou analogues, non fluorés.
Dans la suite du texte et selon le contexte, les termes
"phosphore", "phosphorique", "phosphonique"... seront utilisés soit de manière spécifique pour désigner des groupes phosphores dans lesquels l'atome de phosphore se trouve lié, par une double liaison à un atome d'oxygène, soit de manière plus générale, pour inclure également la possibilité que ledit atome de phosphore puisse aussi être lié, par une double liaison, non pas à un atome d'oxygène, mais à un atome de soufre (en d'autres termes, "phosphore",
"phosphorique", "phosphonique"... pourront également et éventuellement être compris comme respectivement comme "thiophosphoré", "thiophosphorique", "thiophosphonique" ...).
L'invention concerne des composés fluorophosphono- cinnamiques de formule générale :
dans laquelle :
X est choisi parmi : un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R1, R2, R3, R4, R5 et R6 sont choisis parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2,
NH-âlkyle, N-(alkyle)2 ; R7 est choisi parmi :
H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle ; o
R est choisi parmi : H5 un groupe alkyle, un groupe aryle, et dans laquelle lesdits groupes alkyle et aryle contiennent de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés.
Selon l'invention, ces composés fluorophosphono- cinnamiques de formule générale (I) peuvent être obtenus par fluoration de composés phosphonocinnamiques de formule générale :
dans laquelle :
X est choisi parmi : un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R' est choisi parmi : un groupe S-alkyle, S-aryle, S-amine, S-amide, NH-alkyle, NH-aryle,
NH-benzyle, N-(alkyle)2, N-(aryle)2, R7' est choisi parmi :
H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés.
Egalement, ces composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale (I) selon l'invention peuvent aussi être obtenus par fluoration de
composés phosphonocinnamiques, analogues aux composés de formule générale (II) et répondant à la formule générale :
dans laquelle TBDPS désigne un groupe ^-butyldiphénylsilyle.
Les composés phosphonocinnamiques (non fluorés) de formules générale (II) et (IF), qui peuvent être utilisés comme produits de départ dans le procédé selon l'invention, sont déjà connus de l'état de l'art. Des exemples de leur préparation peuvent être trouvés notamment dans les publications telles que Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237) et Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447).
Selon l'invention, pour fluorer un composé phosphonocinnamique répondant à la formule générale (II) ou (IF), spécifiquement sur l'atome de phosphore, on le fait réagir, à une température comprise entre -200C et 850C, et avantageusement à température ambiante, avec un agent de fluoration comprenant un complexe formé entre une aminé tertiaire, notée R3N, et le fluorure d'hydrogène (HF) ; ladite aminé tertiaire (R3N) étant substituée par des groupes alkyle comprenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés.
L'invention repose ainsi sur la mise en évidence qu'un complexe formé entre une aminé tertiaire et le fluorure d'hydrogène constitue un excellent agent pour la fluoration, spécifiquement sur l'atome de phosphore, des composés phosphonocinnamiques. Le fluorure d'hydrogène sous forme d'un complexe avec une aminé tertiaire, est déjà connu comme permettant la substitution d'un groupe partant ad hoc par un atome de fluor (McClinton, 1995, Aldrichimica Acta, 28(2):31-35). Il est d'ailleurs bien établi que la réactivité, et donc la capacité de fluoration, de ces complexes est fonction de leur nucléophilie. Cette nucléophilie dépend en grande partie de la proportion molaire entre l'aminé tertiaire et le fluorure d'hydrogène qui, de manière générale, peut être de l'ordre de 1 :1, 1:2 ou 1 :3. On distingue alors trois
types de complexes notés R3N«HF, R3N*2HF et R3N»3HF qui correspondent respectivement aux proportions molaires précédemment indiquées. La nucléophilie de ces différents complexes varie selon l'ordre suivant : R3N»2HF > R3N«3HF > R3N-HF. Toutefois, jusqu'à présent, une substitution médiée par de tels complexes, concernait uniquement des groupes partants censés être portés obligatoirement par des atomes de carbone. Pour fluorer un composé organo(thio)phosphoré au niveau de l'atome de phosphore, des procédés tels que ceux décrits par US 2,962,517 ou par Chworos et al, 1999 (Tetrahedron Letters, 40:9337-9340), avec les inconvénients qui en découlent, étaient utilisés de manière prépondérante, voire exclusive.
Un procédé selon l'invention permet de fluorer, de manière simple, spécifiquement l'atome de phosphore de composés organophosphorés de formule générale (II) ou (H') et ce, en une seule étape avec un bon rendement et une sélectivité totale. Une simple étape de purification classique suffit pour recueillir les composés fluorophosphonocinnamiques ainsi synthétisés.
Le procédé selon l'invention présente par ailleurs l'avantage de pouvoir être mené avec des produits de départ et des réactifs facilement accessibles (c'est-à-dire soit parce qu'ils sont déjà disponibles dans le commerce et ce, à des prix raisonnables, soit parce que leur(s) méthode(s) de synthèse a(ont) déjà été décrite(s) dans la littérature) et dont la dangerosité est négligeable dans les conditions normales de mise œuvre d'un procédé conforme à l'invention. En particulier, la réaction de fluoration selon l'invention peut avantageusement être menée à température ambiante ou à des températures bien inférieures. Comme aminé tertiaire selon l'invention, on peut citer à titre d'exemple, la triméthylamine (Me3N), la triéthylamine (Et3N), la tripropylamine, la tributylamine ou encore la tripentylamine. On utilise de préférence la triéthylamine (Et3N).
Avantageusement et selon l'invention, on utilise à titre d'agent de fluoration, un complexe de type R3N»HF, en particulier Et3N»HF ; c'est-à-dire avec un rapport molaire aminé ternaire/fluorure d'hydrogène de l'ordre de 1 :1.
Les inventeurs ont aussi constaté qu'avec un complexe R3N«HF (notamment avec la triéthylamine comme aminé tertiaire selon l'invention), de nucléophilie significativement moindre par rapport aux complexes de type R3N»2HF ou R3N«3HF, celui-ci présentait tout de même une réactivité remarquable. De préférence, on effectue la réaction en phase liquide. On peut alors utiliser un solvant dans lequel le composé organique est soluble, par exemple, le dichlorométhane, l'acétonitrile ou encore le tétrahydrofurane.
Avantageusement et selon l'invention, on réalise la réaction avec un excès d'agent de fluoration. En particulier, on utilise un rapport molaire, entre le composé de départ de formule (II) et l'agent de fluoration, de l'ordre de 1,2 à 20. De préférence, ce rapport molaire est d'au moins de l'ordre de 5.
Avantageusement et selon l'invention, le groupe R d'un composé phosphonocinnamique de départ de formule générale (II) est choisi parmi les groupes partants : -SCH2CH2NHCOCH3, -NHCH2Ph (Ph désigne un radical phényle).
Avantageusement et selon l'invention, dans la formule générale (II) d'un composé de départ :
- R7' désigne un groupe choisi parmi : -H ou -CH3, et
- R et R désignent des groupes choisis parmi : -H ou -OCH3. Par exemple, on peut réaliser l'invention avec, comme composé phosphonocinnamique de départ répondant à la formule générale (II), un des thioesters phosphonocinnamiques dont un protocole de préparation est décrit dans la publication Lapeyre et al, 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447), ou un composé analogue. Dans cet exemple, le groupe partant est de type S-amine, en particulier un radical N-acétylcystéamine (-SCH2CH2NHCOCH3).
De manière très similaire, on peut aussi mettre en œuvre la synthèse des composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale (I) selon l'invention avec des composés phosphonochloridoates de formule générale (IF), notamment à partir de ceux qui sont décrits comme des produits intermédiaires de la réaction de synthèse des thioesters phosphonocinnamiques selon la méthode Lapeyre et al, 2003, précédemment évoquée.
Comme autre composé de départ répondant à la formule générale (II), on peut aussi citer réthyl-2-N-benzyl-2-(3,4-diméthoxyphényl)éthène phosphonamide dont un protocole de préparation est décrit dans la publication Kennedy et al, 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237), ou un composé analogue ou équivalent. Dans cet exemple, le groupe partant est de type aminé secondaire, en particulier -NHCH2Ph.
L'invention porte également, en tant que produits nouveaux, sur des composés fluorophosphonocinnamiques de formule générale (I).
A l'instar d'un grand nombre de composés de type cinnamique, et des composés phosphonocinnamiques non fluorés de formule (II) ou (IF) en particulier, les composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention, présentent une activité antioxydante particulièrement intéressante dans le cadre d'un traitement thérapeutique ou cosmétique des troubles physiologiques causés par un stress oxydatif. En effet, les travaux des inventeurs ont permis de montrer que l'effet protecteur des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention contre l'oxydation des LDL est avantageusement très comparable à celui observé avec les composés non fluorés correspondants. Toutefois, à la différence de ces composés non fluorés, les composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention manifestent de façon surprenante également un effet protecteur contre la toxicité afférente à 4-HNE et ceci, très vraisemblablement grâce à leur atome de fluor.
De par leur effet protecteur des LDL contre l'oxydation, cumulé à leur effet protecteur des cellules contre la toxicité du 4-HNE, les composés selon l'invention présentent un intérêt d'application majeur dans le traitement de l'athérosclérose et de ses complications cardio- ou neuro-vasculaires. L'athérosclérose est une pathologie multifactorielle dans laquelle les lipides jouent un rôle important, à côté d'autres facteurs génétiques ou nutritionnels. Parmi les facteurs métaboliques impliqués dans l'initiation et le développement des plaques, les LDL (qui transportent le cholestérol du sang vers les tissus périphériques), deviennent athérogènes après modification oxydative dans la paroi vasculaire. L'oxydation induite dans les LDL provoque in situ la formation d'aldéhydes (notamment 4-HNE) qui peuvent à leur tour oxyder les LDL. Les LDL
oxydées jouent un rôle majeur dans la formation de cellules spumeuses dont l'accumulation en stries graisseuses est à l'origine des premières lésions d'athérosclérose. Ces LDL oxydées présentent également des propriétés proinflammatoires, mitogènes, procoagulantes et proapoptotiques qui sont potentiellement impliquées dans l'évolution des plaques vers des stades plus avancés, voire des phénomènes de rupture et de thrombose qui sont à l'origine des accidents cardiovasculaires.
Les molécules capables de bloquer le processus d'oxydation des LDL sont donc extrêmement efficaces pour inhiber le développement des plaques. Dans ce contexte, l'invention fournit ici de nouveaux agents bloqueurs de la voie d'oxydation des LDL et dont l'efficacité est d'autant plus remarquable qu'ils agissent au moins à deux niveaux différents de cette voie (action directe sur les LDL, et via 4-HNE).
L'invention s'étend donc également à une composition cosmétique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé fluorophosphonocinnamique selon l'invention, en particulier pour leur effet bloqueur de la voie d'oxydation des LDL.
Avantageusement et selon l'invention, il s'agit d'une composition thérapeutique destinée au traitement des troubles physiologiques causés par un stress oxydatif, en particulier l'athérosclérose et ses complications cardio- ou neuro-vasculaires. L'invention s'étend également à l'utilisation d'un composé fluorophosphonocinnamique selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au traitement thérapeutique de l'athérosclérose.
L'invention concerne également un procédé de protection in vitro des LDL contre l'oxydation, dans lequel on met des LDL en contact avec au moins un composé fluorophosphonocinnamique selon l'invention.
Avantageusement et selon l'invention, à titre de composé selon l'invention, on peut citer tout particulièrement :
- le (E)-2-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
- le (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
- le (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
- le (E)-2-(3,4-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
L'invention concerne aussi un procédé de préparation de composés fluorophosphonocinnamiques, des composés fluorophosphono- cinnamiques, une composition thérapeutique ainsi qu'un procédé pour protéger les LDL de l'oxydation, caractérisés, en combinaison, par tout ou partie des caractéristiques ci-dessus ou ci-après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et qui fait référence, d'une part, à la synthèse de composés fluorophosphonocinnamiques particuliers (de formules notées 5 à 8) conformes à l'invention, et d'autre part, à l'étude de l'effet biologique antiathérogène de ces composés. Les résultats expérimentaux font notamment référence aux figures annexées dans lesquelles :
- les figures IA, IB et 2 sont des représentations statistiques, en bâtonnets, de l'effet antioxydant global de composés particuliers conformes à l'invention, ainsi que de leur effet sur la protection des cellules soumises à un stress oxy datif,
- les figures 3 et 4 montrent l'évolution de la survie des cellules en présence de LDL oxydées ou du 4-HNE, en fonction de la concentration du milieu en un composé particulier conforme à l'invention.
SYNTHESE CHIMIQUE ET ANALYSE
• La synthèse
1) Selon un premier mode opératoire, la synthèse des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention peut être mise en œuvre avec un composé de départ de formule (II). L'équation réactionnelle est alors schématiquement la suivante :
1, R^R^H, R4=OCH3, R'=S(CH2)2NHCOCH3 5, R!=R7=H, R4=OCH3
2, R!=R4=R7'=H, R'=S(CH2)2NHCOCH3 6, R^R^R^H 3, R^R^OCHb, R7'=H, R'=S(CH2)2NHCOCH3 7, R'=R4=OCH3, R7=H
4, R^H, R4=OCH3, R7'=CH3, R' = S (CEb)2NHCOCH3]
8, R^H, R4=OCH3, R7=CH3 4', R^H, R4=OCH3, R7' =CH3, R'=NHCH2Ph
Les phosphonothioesters désignés 1 à 4, pour lesquels le groupe partant R' est un groupe N-acétylcystéamine, peuvent être préalablement synthétisés selon la méthode décrite dans la publication Lapeyre et al., 2003 (Tetrahedron Letters, 44:2445-2447).
Le phosphonamide désigné 4', pour lequel le groupe partant R' est une aminé secondaire, peut être préalablement synthétisé selon la méthode décrite dans la publication Kennedy et al. 1999 (J. Enzyme Inhibition, 14:217-237).
La triéthylamine d'Avocado (pureté 99 %) et le complexe Et3N»3HF d'Aldrich (pureté 98 %) sont utilisés pour la génération du complexe Et3N«HF.
Le tétrahydrofurane (THF) anhydre (pureté 99,7 %) et l'acétate d'éthyle pour HPLC préparative (pureté 99,8%) sont fournis par la société SDS, France.
2) Selon un deuxième mode opératoire, la synthèse des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention peut être mise en œuvre à partir d'un phosphonochloridoate de formule générale (H'). L'équation réactionnelle est alors schématiquement la suivante :
B, R^R^H 6, R^R^R^H
RMN 31P (solvant : D2O, 81 MHz, δ ppm) : 30,10 (s, P-Cl)
Ç_, R^R^OCHs 7, R^=OCH3
RMN 31P (solvant : D2O, 81 MHz, δ ppm) : 23,23 (s, P-Cl)
Ces composés phosphonochloridoates A-C ont été décrits comme étant des produits intermédiaires de la synthèse des phosphonothioesters 1- 4, selon Lapeyre et al, 2003. Dans le cadre de l'invention, ces composés phosphonochloridoates A-C, utilisés comme produits de départ dans la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention, peuvent être préalablement obtenus quantitativement à partir des phosphonodiesters correspondants selon la méthode ci- après décrite.
A une solution de phosphonodiester silylé (1,9 mmol) dissous dans 9,7 mL de dichlorométhane, placé sous flux d'azote, le chlorure d'oxalyle fraîchement distillé (8,6 mmol) est ajouté à température ambiante. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 20 heures. Le dichlorométhane et l'excès de chlorure d'oxalyle sont éliminés sous pression réduite. Afin de supprimer toute trace de chlorure d'oxalyle, on additionne quelques millilitres de
dichlorométhane que l'on évapore ensuite. Cette opération est répétée à trois reprises. L'avancement de la réaction peut être suivi par RMN 31P (solvant : D2O5
81 MHz, δ ppm).
• La purification : L'ensemble des produits est purifié par chromatographie liquide moyenne pression (MPLC) sur gel de silice, sur un appareil JOBIN-YVON à compression axiale avec des colonnes de 20 ou 40 mm de diamètre remplies de silice 15-40 μm (MERCK France) en utilisant les systèmes d'éluants appropriés.
• Les analyses : Les chromatographies sur couches minces sont réalisées en utilisant des plaques de silice MERCK 60-F254.
Les points de fusion ont été mesurés sur un appareil BUCHI. Les spectres IR sont enregistrés sur un spectrophotomètre Perkin-Elmer à transformée de Fourrier modèle FT-IR spectrophometer 1725x. Les spectres de masse (ionisation chimique DCI ou impact électronique EI) sont réalisés sur un spectromètre quadripolaire NERMAG R10-10.
Les spectres ultraviolets sont enregistrés sur un instrument
HEWLETT PACKARD 8453.
Les spectres RMN sont enregistrés sur des appareils BRUCKER :
AC-250 travaillant à 250 MHz pour le noyau 1H, à 62,5 MHz pour le noyau 13C ; AC-200 travaillant à 81 MHz pour le noyau 31P, 188,5 MHz pour le noyau 19F.
Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en ppm en prenant le signal du tétraméthylsilane comme référence pour les noyaux 1H et 13C, le signal de l'acide phosphorique, comme référence pour le noyau 31P et, le signal de l'acide fluorhydrique, comme référence pour le noyau 19F. Les constantes de couplage J sont exprimées en Hertz et la multiplicité des signaux est indiquée par
une lettre minuscule : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), m (multiplet).
• Exemples de synthèse utilisant un phosphonothioester comme produit de départ : 1/ Le (E)-2-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)vinyl-phosphono- fluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse :
Le phosphonothioester silylé I (0,64 mmol) est dissout dans 4 mL de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2,1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3N«3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 2O0C pendant 2 heures. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 5 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation : Aspect : solide blanc.
Rendement : 64 %.
R1: 0,67 (AcOEt).
P1: 92-930C.
IR_: (lames de KBr, CHCl3) v (3242 cm"1, O-H), v (3006 cm"1, C-H alcène), v (1617 cm"1, C=C aromatique), v (1598, 1516 cm"1, C=C aromatique), v (1271 cm"1, P=O ), v (1162 cm"1, P-O-C ), δ (982 cm"1, C=C trans ), δ (881, 800 cm"1, aromatique ), δ (756 cm"1, P-O-R).
Masse : MS (CI NH3, MNH4 +) 278.
UV : (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) λ = 313 nm, ε = 18400 mol"1. L. cm"1. RMN 1H (solvant : CDCl3, 250 MHz5 δ ppm) :
1,38 (t, 3H, 3JH-H = 7,1 Hz, CH3CH2), 3,87 (s, 3H, CH3O)5 4,27 (qd, 2H, 3JH-H = 3Jp- o-cH = 7,1 Hz5 CH2O), 6,04 (dd, IH5 3JH-H = 17,5 Hz, 2JP-CH = 19,6 Hz, C=CH-P),
6,92 (m, 4H5 OH+H6+H2+H5)5 7.51 (dd5 IH5 3JH.H = 17,5 Hz5 3JP-CH=CH = 24,7 Hz,
CH=CH-P). RMN 13C (solvant : CDCl3, 62,5 MHz5 δ ppm)
17,38 (d, IC, 3Jc-P = 6,0 Hz, CH3CH2), 56,98 (s, IC, CH3O), 64,58 (d, IC, 2JC-P =
6.0 Hz, CH2O), 106,81 (dd, IC, 1Jc-P = 207,3 Hz, 2JC.F = 32,4 Hz, C=C-P), 110,60 (s, IC, C6), 116,09 (s, IC, C5), 124,16 (s, IC, C2), 127,45 (d, IC, 3JC-P = 26,2 Hz5 C1), 148,26 (s, IC, C4), 150,08 (s, IC, C3), 152,85 (dd, IC, 2JC_P = 7,9 Hz, 3JC.F = 3,9 Hz, C=C-P).
RMN 31P (solvant : CDCl3, 81 MHz, δ ppm) : 19,79 (d, 3Jp.F = 1023 Hz, P-F). PxMN 19F (solvant : CDCl3, 188,3 MHz, δ ppm) : 11,75 (d, 3JF-p = 1023 Hz, F-P). Analyses élémentaires (théoriques/expérimentales) : Carbone (50,78/50,93) Hydrogène (5,42/5,36)
2/ Le (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse :
Le phosphonothioester 2 (0,64 mmol) est dissout dans 4 mL de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2,1 mmol de triéthylamine puis
1.1 mmol du complexe Et3N*3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 2O0C pendant 3 heures. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 6 ainsi obtenu est purifié par MPLC
(éluant AcOEt). b) Caractérisation :
Aspect : huile transparente.
Rendement : 66 %. R£ : 0,64 (AcOEt).
IR_: (lames de KBr, CHCl3) v (3233 cmf1, O-H), v (3020 cm4, C-H alcène), v (1604 cm"1, C=C), v (1585, 1515 cm4, C=C), v (1230 cm"1, P=O ), v (1170 cm4, P-O-C ), δ (984 cm4, C=C trans ), δ (843 cm4, aromatique), δ (757 cm4, P-O-C).
Masse MS (CI NH3, MNH4 +) 248. UVj (Na2HPO4ZKH2PO4, 100 mM pH 6,25) λ = 285 nm, ε = 21200 mol4. L. cm4.
RMN 1H (solvant : CDCl3, 250 MHz, δ ppm)
1,41 (t, 3H5 3Jn-H = 7,0 Hz, CH3CH2), 4,30 (qd, 2H, 3JH-H = 3Jp-O-CH = 7,0 Hz, CH2O), 6,03 (dd, IH, 3JH-H = 17,5 Hz, 2JP.CH = 20,4 Hz, C=CH-P), 6,92 (d, 2H, 3JH-H = 8,7 Hz, H2H-H6), 7,37 (d, 2H, 3JH-H = 8,7 Hz, H3+H5), 7,54 (dd, IH, 3JH.H = 17,5 Hz, 3Jp-CH=CH = 25,0 Hz, CH=CH-P), 8,54 (s, IH, OH). RMN 13C (solvant : CDCl3, 62,5 MHz, δ ppm)
17,41 (d, IC, 3Jc-P = 6,0 Hz, CH3CH2), 65,00 (d, IC, 2JC.P = 6,2 Hz5 CH2O), 105,50 (dd, IC, 1Jc-P = 208,4 Hz, 2JC-F = 31,5 Hz5 C=C-P), 117,29 (s, 2C, C2+C6), 126,88 (d, IC, 3J0-P = 25,7 Hz, C1), 131,28 (s, 2C, C3+C5), 153,33 (dd, IC, 2JC.P = 7,8 Hz, 3JC-F = 4,7 Hz, C=C-P), 161,12 (s, IC, C4). RMN 31P (solvant : CDCl3, 81 MHz, δ ppm) 20,53 (d, 3Jp-F = 1024 Hz, P-F). RMN 19F (solvant : CDCl3, 188,3 MHz, δ ppm) 11,17 (d, 3JF-p = 1024 Hz, F-P).
3/ Le (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl-phosphono- fluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse :
Le phosphonothioester 3 (0,64 mmol) est dissout dans 4 mL de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2, 1 mmol de triéthylamine puis 1,1 mmol du complexe Et3N«3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 2O0C pendant 3 heures. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 7 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation : Aspect : solide blanc. Rendement : 68 %.
Rf : 0,59 (AcOEt).
P£ : 153-1550C.
IR_: (lames de KBr, CHCl3) v (3255 cm"1, O-H), v (3019 cm"1, C-H alcène), v (1618 cm'1, C=C aromatique), v (1597, 1513 cm"1, C=C aromatique), v (1251 cm"1, P=O ), v (1158 cm"1, P-O-C ), δ (975 cm"1, C=C trans ), v (752 cm"1, P-O-R).
Masse : MS (CI NH3, MNH4 +) 308.
UV : (Na2HPO4ZKH2PO4, 100 mM pH 6,25) λ = 310 nm, ε = 18000 mol"1. L. cm"1. RMN 1H (solvant : CDCl3, 250 MHz, δ ppm) :
1,40 (t, 3H, 3Jn-H = 7,0 Hz, CH3CH2), 3,90 (s, 6H, CH3O), 4,29 (qd, 2H, 3JH-H = 3Jp- O-CH = 7,0 Hz, CH2O), 6,00 (s, IH, OH), 6,08 (dd, IH, 3JH-H = 17,5 Hz, 2JP-CH = 19,2 Hz, C=CH-P), 6,73 (d, 2H, H2+H6), 7,50 (dd, IH, 3JH-H = 17,5 Hz, 3JP.CH=CH = 24,5 Hz, CH=CH-P).
RMN 13C (solvant : CDCl3, 62,5 MHz, δ ppm) : 17,45 (d, IC, 3Jc-P = 6,0 Hz, CH3CH2), 57,44 (s, 2C, CH3O), 64,54 (d, IC, 2J0-P =
6.0 Hz, CH2O), 106,12 (s, 2C, C2+C6), 107,81 (dd, IC, 1Jc-? = 207,0 Hz, 2JC-F = 32,9 Hz, C=C-P)5 126,60 (d, IC, 3JC.P = 26,2 Hz, C1), 138,88 (s, 2C, C3+C5), 148,39 (s,
IC, C4), 152,82 (dd, IC, 2JC-P = 7,9 Hz, 3JC-F = 4,2 Hz5 C=C-P).
RMN 31P (solvant : CDCl3, 81 MHz, δ ppm) :
19,43 (d, 3Jp-F = 1023 Hz, P-F).
RMN 19F (solvant : CDCl3, 188,3 MHz, δ ppm) : 11 ,90 (d, 3JF.p = 1023 Hz, F-P).
Analyses élémentaires (théoriques/expérimentales) :
Carbone (49,66/49,60)
Hydrogène (5,53/5,37)
4/ Le (E)-2-(3,4-diméthoxypliényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle a) Protocole de synthèse :
Le phosphonothioester 4 (0,64 mmol) est dissout dans 4 mL de THF sous azote dans un ballon bicol de 25 mL. 2,1 mmol de triéthylamine puis
1.1 mmol du complexe Et3N»3HF sont ensuite ajoutées à la microseringue. La solution ainsi obtenue est agitée à 2O0C pendant 2 heures. Le brut réactionnel est concentré sous pression réduite puis le composé 8 ainsi obtenu est purifié par MPLC (éluant AcOEt). b) Caractérisation : Aspect ; huile transparente. Rendement : 69 %. Rx: 0,59 (AcOEt).
IR_: (lames de KBr, CHCl3) v (3019 cm"1, C-H alcène), v (2938 cm'1, C-H alcane), v
(1616 cm4, C=C), v (1583, 1514 cm"1, C=C)5 v (1270 cm"1, P=O ), v (1160 cm"1, P-
O-C ), δ (981 cm"1, C=C trans ), δ (880, 852 cm"1, aromatique ), δ (757 cm"1, P-O-
R). Masse : MS (CI, MH+) 275
UV : (Na2HPO4ZKH2PO4, 100 mM pH 6.25) λ = 312 nm, ε = 2500 mol"1. L. cm"1.
RMN 1H (solvant : CDCl3, 250 MHz, δ ppm) :
1,42 (t, 3H, 3Jn-H = 7,0 Hz, CH3CH2), 3,92 (s, 6H, CH3O), 4,30 (qd, 2H, 3JH-H = 3Jp-
O-CH = 7,0 Hz, CH2O), 6,09 (dd, IH, 3JH-H = 2Jp-CH = 18,4 Hz, C-CH-P), 6,88 (d, IH, 2Jn-H = 8,2 Hz, H6), 7,03 (s, IH, H2), 7,10 (d, IH, 2JH-H = 8,2 Hz, H5), 7,56 (dd, IH,
3JH-H = 17,4 Hz, 3JP-CH=CH = 24,4 Hz, CH=CH-P).
RMN 13C (solvant : CDCl3, 62,5 MHz3 δ ppm) :
16,34 (d, IC, 3J0-P = 6,0 Hz, CH3CH2), 55,94, 56,02 (s, 2C, CH3O), 63,38 (d, IC,
2Jc-P = 6,8 Hz, CH2O), 106,85 (dd, IC, 1J0-P = 206,9 Hz, 2JC.F = 33,2 Hz, C=C-P), 109,51 (s, IC, C6), 111,03 (s, IC, C2), 122,75 (s, IC, C5), 149,34 (s, IC, C1), 151,32
(dd, IC, 2Jc-P = 8,3 Hz, 3Jc-F ≈ 4,5 Hz, C=C-P), 151,73 (s, 2C, C4+C3).
RMN 31P (solvant : CDCl3, 81 MHz, δ ppm) :
19,49 (d, 3JP-F = 1024 Hz, P-F).
RMN 19F (solvant : CDCl3, 188,3 MHz, δ ppm) : 11 ,92 (d, 3Jp-P = 1024 Hz, F-P). c) Observation :
Selon une autre méthode de synthèse du composé 8, à titre de composé de départ, on peut également utiliser le (E)-éthyl-2-N-benzyl-2(3,4- diméthoxyphényl)éthène phosphonamide. • Exemple de synthèse utilisant le phosphonochloridoate Ç comme produit de départ : Une fois le phosphonochloridoate C préparé, celui-ci
(0,42 mmol ; 1 éq.) est dissous sous atmosphère inerte dans 4 mL de THF fraîchement distillé. Le triéthylamine (197 μL ; 139 mmol ; 3,33 éq.) et le complexe Et3N*3HF (112 μL ; 0,69 mmol ; 1,67 éq.) sont additionnés. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation magnétique à température ambiante pendant 30 min.
L'avancement de la réaction est suivi par RMN 31P. La réaction est stoppée par addition d1 AcOEt. Le précipité obtenu est filtré sur BUCHNER puis le filtrat est hydrolyse. La phase aqueuse est extraite trois fois à I1AcOEt. Les phases organiques sont rassemblées, séchées sur Na2SO4 anhydre puis concentrées sous vide. b) Caractérisation :
Aspect : poudre blanche.
Rendement : 77 %.
R1: 0,23 (AcOEt/EP 4/6).
P1: 69-700C. IR_: (lames de KBr5 CHCl3) v (3233 cm"1. O-H), v (3020 cm"1, C-H alcène), v (1604 cm"1, C=C), v (1585 cm"1, C=C), v (1230 cm4, P=O ), v (1170 cm"1, P-O-C ), (985 cm4, C=C trans ), v (843 cm"1, C=C aromatique).
Masse : MS (CI NH3, MNH4 +) 308.
UV : (Na2HPO4/KH2PO4, 100 mM pH 6.25) λ = 310 nm, ε = 18000 mol4. L. cm4. RMN 1H (solvant : CDCl3, 250 MHz, δ ppm) :
1,38 (t, 3H, 3Jn-H = 7,0 Hz, CH3CH2), 3,88 (s, 6H, CH3O), 4,27 (qd, 2H, 3JH.H = 3JH-H
= 7,0 Hz, 3JH-P = 7,0 Hz, CH3CH2O), 5,81 (s, IH, OH), 6,07 (dd, IH, 3JH-H = 17,5
Hz5 2JH-P = 19,2 Hz, CH=CH-P), 6,72 (s, 2H, H2+H6), 7,49 (dd, IH, 3Jn-H = 17,5 Hz,
3Jn-P = 24,5 Hz, CH=CH-P). RMN 13C (solvant : CDCl3, 62,5 MHz, δ ppm) :
16,30 (d, IC, 3Jc-P = 6,0 Hz, CH3CH2O)5 56,35 (s, 2C, CH3O), 63,41 (d, IC, 2JC-P =
6,0 Hz, CH3CH2O), 105,11 (s, 2C, C2+C6), 106,75 (dd, IC, 1Jc-P = 207,0 Hz, 2JC-F =
33,0 Hz5 C=C-P)5 125,50 (d, IC, 3JC.P = 25,5 Hz, C1), 137,86 (s, IC5 C4), 147,32 (s,
2C5 C3+C5), 151,62 (dd, IC5 2JC_P = 7,5 Hz, 3JC.F = 3,8 Hz, C=C-P). RMN 31P (solvant : CDCl3, 81 MHz, δ ppm) :
19,50 (d, 1Jp-F = 1023 Hz, P-F).
RMN 19F (solvant : CDCl3, 188,3 MHz, δ ppm) :
11,88 (^ 1Jp-P = 1023 Hz, F-P).
MS (IC, NH3) m/z : 248 (MNH4 +, 100 %), 291 (MH+, 38 %). Analyses élémentaires (théoriques/expérimentales) :
Carbone (70,13/70,00)
Hydrogène (7,65/7,71)
EFFET ANTIATHEROGENE DES COMPOSES SYNTHETISES
1/ Etude de l'effet in vitro des composés synthétisés à l'égard de l'oxydation des LDL Les LDL natives sont purifiées à partir de pools de sérum issus de sujets sains, par ultracentrifugation préparative en gradient de K-Br. Les LDL sont ensuite dialysées dans un tampon NaCl isotonique (9 g/1, pH 7,2), pour éliminer le KBr, puis stérilisées (filtre 0,2 nm) et conservées sous azote jusqu'à utilisation (au maximum : 2 semaines). Les cellules endothéliales humaines en culture (lignées HMEC ou ECV304) sont cultivées dans des boîtes multi-puits et amenées à subconfluence dans du milieu de culture RPMI 1460 contenant 10 % de sérum de veau fétal et des antibiotiques (pénicilline, streptomycine).
Le milieu de culture standard est remplacé par du RPMI 1640 (1 mL/puits) contenant 1 μM de CuSO4 (pour initier l'oxydation) et 100 μg/mL de LDL natives, ainsi que les différents composés (notés 5_ à 8) à tester à concentrations variables. Après 6 heures de contact, une partie du milieu est prélevée pour mesurer les paramètres d'oxydation des LDL (TBARS). Après 24 heures de contact, la viabilité résiduelle des cellules en contact avec les LDL oxydées (et éventuellement protégées de l'oxydation par les CPS) est mesurée (test MTT).
Les LDL sont rapidement oxydées par les cellules vasculaires en culture. Des études préliminaires ont montré que cette oxydation nécessite la présence de métaux lourds (tels que le cuivre ou le fer) d'où l'addition de CuSO4. La cinétique d'oxydation est au départ ralentie par les antioxydants endogènes (vitamine E), et se poursuit au-delà de 24 heures (plateau). Nous mesurons l'oxydation des LDL après 6 heures de contact car elle est alors en phase exponentielle et l'effet éventuellement protecteur des antioxydants est plus sensible. L'oxydation est mesurée par le dosage des TBARS (substances réactives à l'acide thiobarbiturique), qui permettent une évaluation globale, quantitative et sensible du phénomène d'oxydation.
Les composés précédemment synthétisés, notés respectivement 5_ à 8, sont dissous dans du DMSO et testés à des concentrations
variant de O5I à 100 μM (concentration finale en DMSO n'excédant pas 0,05 %). Aucune autotoxicité de ces composés 5 à .8 n'a été observée sur les cellules aux concentrations utilisées dans cette étude (résultats non présentés).
Les résultats, présentés à la figure IA, montrent un effet antioxydant pour chacun des composés 5_ à 8, avec toutefois un effet antioxydant bien plus marqué pour le composé 5. avec une protection significative de l'oxydation des LDL dès 1 μM et plus important avec des concentrations plus élevées.
Dans la figure IA, les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (test sans composé synthétisé avec soit les LDL oxydées seules). Le taux de TBARS dans les LDL oxydées par les cellules en 6 heures et de 6 à 10 nmoles de TBARS/mg d'apoB. Les composés 5 à 8 sont ajoutés à concentrations variant de 0,1 à 100 μM. Les résultats présentés correspondent à la moyenne de trois expériences séparées réalisées en duplicate.
Les LDL oxydées sont toxiques pour les cellules vasculaires en culture. Cet effet toxique peut être étudié par le test colorimétrique MTT qui mesure la viabilité cellulaire. Les résultats, présentés à la figure IB, montrent une viabilité résiduelle de 15 à 20 % pour les cellules en contact 24 heures avec des LDL oxydées seules (en l'absence des composés 5 à 8). En corrélation avec l'effet sur les TBARS, le composé 5 se révèle très efficace pour prévenir la toxicité des LDL oxydées par les cellules, en fonction de la dose utilisée. Les autres composés ont un effet plus limité.
Le composé 5 est très efficace pour protéger les LDL de l'oxydation par les cellules vasculaires et leur toxicité consécutive est limitée. Cet effet est comparable à celui observé avec des polyphénols tels que catéchine ou quercétine, avec un effet moins toxique (pour les cellules) aux concentrations égales ou supérieures à 100 μM.
2/ Etude in vitro de l'effet cytoprotecteur du composé 5 à l'égard des LDL oxydées
Nous avons étudié l'effet cytoprotecteur du composé 5 sur la toxicité de LDL déjà oxydées en l'absence de tout autre composé synthétisé (6 à 8) ou d'agents antioxydants. Ces LDL oxydées sont toxiques pour les cellules
endothéliales (toxicité évaluée par le test MTT). Les cellules ECV304 sont incubées avec des LDL oxydées par irradiation UV (200 μg/mL) pendant 24 heures, en absence (0) ou en présence du composé 5. (concentrations de 0,1 à 100 μM). A la fin, le test MTT est réalisé. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle négatif (incubé en l'absence de LDL et du composé 5). Les résultats présentés correspondent à la moyenne de trois expériences séparées réalisées en duplicate.
Comme rapporté dans la figure 2, des doses croissantes de ce composé 5 protègent efficacement contre la toxicité des LDL oxydées dans les cellules endothéliales ECV304, ce qui suggère que ce composé 5 a un effet à la fois antioxydant et cytoprotecteur.
3/ Etude comparative in vitro des effets des composés 5, et 1 (même structure que le composé 5 sans le groupement fluoré)
L'effet antioxydant/piégeur de carbonyle pourrait être augmenté par l'atome de fluor. Pour confirmer cette hypothèse, nous avons étudié l'effet antioxydant et cytoprotecteur du composé 1 dont la structure chimique est identique à celle du composé 5, si ce n'est l'absence de l'atome de fluor.
Cet effet des composés 1 et 5. a été étudié d'une part sur l'oxydation des LDL par les ECV304, et leur toxicité consécutive.
Pour ce faire, les ECV304 sont incubées pendant 6h avec des LDL natives (100 μg/mL) en présence de CuSO4 (1 μM) et des concentrations variables de composé 1 ou de composé 5. Le milieu est ensuite récupéré, un aliquot est prélevé pour doser les TBARS, et le reste du milieu est ré-incubé avec d'autres
ECV304 afin d'étudier l'effet toxique. Le taux de TBARS dans le contrôle (LDL
- seules) est de 7,5 nmol/mg apoB. Les résultats obtenus sont présentés dans la Tableau 1 ci-après, et correspondent à la moyenne de 4 expériences séparées réalisées en duplicate.
Les résultats obtenus montrent que l'effet contre l'oxydation des LDL et leur toxicité consécutive est comparable entre le composé 1 et le composé 5. Cet effet est donc en principe lié à la présence du groupement phénolique sur les deux molécules.
Concentration (μM) TBARS (%) MTT (%)
Contrôle (LDL seules) 100 25± 5
composé ! 0,1 102 ± 5 23
1 47 ± 5 49
10 23 ± 5 85
100 8 ± 5 105 composé 5_ 0,1 100 ± 5 24
1 51 ± 5 52
10 24 ± 5 90
100 7 ± 5 104
Tableau 1
D'autre part, l'effet des composés 1 et 5 a également été comparé au niveau de leur effet cytoprotecteur à l'égard des LDL oxydées et de 4-HNE
Pour ce faire, les cellules endothéliales sont incubées avec 200 μg/mL de LDL oxydées ou 25 μM de 4-HNE et des concentrations croissantes de composés 1 ou 5. La toxicité est évaluée après 24 heures par un test au MTT. La figure 3 rapporte les résultats obtenus dans les tests réalisés avec les LDL oxydées ; les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle non stimulé.
La figure 4 rapporte les résultats obtenus dans les tests réalisés avec 4-HNE. L'effet protecteur des composés synthétisés sur la toxicité induite par le 4-HNE est uniquement lié à l'effet piégeur de carbonyle. On note sur les résultats, que seul le composé 5 est efficace, dès les concentrations assez faibles (1 μM), et persiste à des concentrations plus élevées, alors que le composé 1 est sans effet, et même toxique à doses plus élevées. Ces résultats montrent donc que le composé 5 a un effet piégeur de carbonyle lié au groupement fluor, ce qui permet une protection efficace contre la toxicité induite par les aldéhydes.
L'ensemble de ces résultats montre que la cytotoxicité des LDL oxydées n'est pas simplement liée à la présence des groupements carbonyle, et que le stress oxydant est également impliqué. Ceci explique un effet protecteur bien plus intéressant avec le composé 5 qu'avec le composé 1 non fluoré.
3/ Validation in vivo de l'effet antiathérogène des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention
L'effet potentiellement antiathérogène des composés fluorophosphonocinnamiques selon l'invention, en particulier le composé 7, a également été étudié sur un modèle animal d'athérosclérose représenté par les souris apoE"A. a) Description du modèle animal et protocole expérimental
Les souris apoE knock-out sont des souris déficientes en apoprotéine E (apoE), ce qui induit une accumulation de cholestérol plasmatique associé à une augmentation du taux de LDL et d'IDL (intermediate-density lipoproteins), et une diminution du taux d'HDL plasmatique. Ces souris représentent un modèle classique d'étude du développement des plaques d'athérosclérose
(accumulation de stries graisseuses qui forment les lésions primaires), et des molécules susceptibles de ralentir ou bloquer la formation de ces lésions. Ces souris développent spontanément des plaques d'athérosclérose (sans régime hyperlipidique).
Les souris sevrées, âgées de 4 semaines, sont divisées en 2 lots de 13 animaux, nourris avec un régime standard.
Le lot 1 (traité) reçoit 10 mg/kg du composé 7 dans l'eau de boisson, le composé 7 ayant été préalablement dissous dans Péthanol, puis dilué dans l'eau pour obtenir une concentration finale en composé 7 de 30 mg/L, et en éthanol de 0,05 %).
Le lot 2 (contrôle) reçoit l'eau de boisson contenant 0,05 % d' éthanol. La concentration en composé 7 a été calculée par rapport à un volume d'eau de 6 à 10 mL/jour et par souris pesant 30 g.
Le composé 7 est stable à température ambiante pendant 4 jours (stabilité vérifiée en HPLC). Les biberons sont changés deux fois par semaine.
La durée totale du traitement est de 4 mois. Après 4 mois, les animaux sont sacrifiés et les cœurs sont lavés dans un tampon PBS (phosphate buffered saline), congelés (Tissue TeK) et stockés à -800C. L'analyse des lésions d'athérosclérose est réalisée au niveau du
sinus aortique, sur des sections de 10 μm d'épaisseur colorées avec un colorant spécifique des lipides (oil red O)5 et contre-colorées avec l'hématoxyline/éosine, puis la surface est mesurée par évaluation morphométrique de la taille des lésions (Biocom morphometry System, logiciel Cyberview 3.0). La surface moyenne des lésions, exprimée en μm2, est utilisée pour évaluer la taille des lésions de chaque animal. b) Résultats
L'effet protecteur du composé 7 est testé sur des souris apoE"7" âgées de 4 semaines. A ce stade, le développement des lésions d'athérosclérose est mineur, donc l'addition de molécules à potentiel antiathérogène freine le développement spontané des plaques. Les lésions sont analysées au niveau du sinus aortique après 4 mois de traitement (ou non) car à ce stade, les lésions au niveau de la partie ascendante de l'aorte sont encore peu développées. Les résultats numériques obtenus correspondants sont reportés dans le tableau 2 ci-après.
Sl S2
Surface du sinus Surface du sinus aortique aortique (μm2) (μm2) + composé 7
11436 15012
20137 9886
26525 17441
11526 18430
26714 16651
17042 21429
14278 21710
14218 8274
28196 8539
24633 11266
23457 15381
22647 10310
21423 18774
Moyenne 20171,6923 14854,0769
Ecart type 5663,5393 4557,2625
S2/S1 = O ,73
Tableau 2
L'étude montre que la supplémentation dans l'eau de boisson en composé 7, entraîne une diminution sensible de la surface des plaques d'athérosclérose au niveau du sinus aortique (diminution de 27 % en moyenne par rapport à la surface des animaux contrôle non traités, avec un écart type large mais comparable dans les deux populations).
Claims
REVENDICATIONS 1/ Procédé de synthèse d'un composé fluorophosphono- cinnamique de formule générale :
X étant choisi parmi : un atome d'oxygène ou un atome de soufre,
R1, R2, R3, R4, R5 et R6 étant choisis parmi :
H5 un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2, NH-alkyle, N-(alkyle)2 , R7 étant choisi parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle,
R8 étant choisi parmi :
H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés, dans lequel on réalise la fluoration : d'un composé phosphonocinnamique de formule générale :
X étant choisi parmi : un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R' étant choisi parmi : un groupe S-alkyle, S-aryle, S-amine, S-amide, NH-alkyle, NH-aryle,
N-(alkyle)2, N-(aryle)2, R7' étant choisi parmi :
H, un groupe alkyle, un groupe aryle,
lesdits groupes alkyle et aryle contenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés, ou d'un composé phosphonocinnamique de formule générale :
TBDPS désignant un groupement t-butyldiphénylsilyle, en faisant réagir, à une température comprise entre -200C et 85°C, le composé phosphonocinnamique avec au moins un agent de fluoration comprenant un complexe formé entre une aminé tertiaire, notée R3N, et le fluorure d'hydrogène ; ladite aminé tertiaire étant substituée par des groupes alkyle comprenant de l'ordre de 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés.
2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite aminé tertiaire est la triéthylamine, Et3N.
3/ Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise à titre d'agent de fluoration un complexe avec un rapport molaire aminé tertiaire/fluorure d'hydrogène de l'ordre de 1 : 1, noté R3N-HF.
4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on effectue la réaction en phase liquide dans un solvant dans lequel le composé phosphonocinnamique de formule (II) est soluble.
5/ Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise un solvant choisi parmi : le dichlorométhane, l'acétonitrile, le tétrahydrofurane. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on réalise la réaction avec une rapport molaire, entre le composé phosphonocinnamique de formule (II) et l'agent de fluoration, de l'ordre de 1,2 à 20.
7/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le groupe R8 d'un composé phosphonocinnamique de formule générale (II) est choisi parmi les groupes partants : -SCH2CH2NHCOCH3, -NHCH2Ph.
8/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que dans le composé phosphonocinnamique de départ de formule générale (II) :
- R désigne un groupe choisi parmi : -H ou -CH3, et
- R1 et R2 désignent des groupes choisis parmi : -H ou -OCH3.
9/ Composés fluorophosphonocinnamiques de formule
X étant choisi parmi : un atome d'oxygène ou un atome de soufre, R1, R2, R3, R4, R5 et R6 étant choisis parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, OH, O-alkyle, S-alkyle, NH2,
NH-alkyle, N-(alkyle)2 , R étant choisi parmi :
H, un groupe alkyle, un groupe aryle, un groupe silyle, o
R étant choisi parmi : H, un groupe alkyle, un groupe aryle, lesdits groupes alkyle et aryle contenant 1 à 6 atomes de carbone linéairement liés.
10/ Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :'
11/ Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
12/ Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(4-hydroxy-3,5-diméthoxyphényl)vinyl phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
revendication 9, caractérisés en ce qu'il s'agit du (E)-2-(3,4-diméthoxyphényl)vinyl-phosphonofluoridoate d'éthyle, de formule :
14/ Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une des revendications 9 à 13.
15/ Composition thérapeutique selon la revendication 14, pour le traitement d'un trouble physiologique causé par un stress oxydatif.
16/ Composition thérapeutique selon l'une des revendications 14 ou 15, pour le traitement de l'athérosclérose. 17/ Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 9 à 13 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement thérapeutique de l'athérosclérose.
18/ Procédé de protection de l'oxydation des LDL in vitro, dans lequel on met des LDL en contact avec au moins un composé selon l'une des revendications 9 à 13.
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