EP1784495A2 - Verfahren zur herstellung von primären alkoholen durch reduktion von aldehyden unter verwendung einer alkoholdehydrogenase bei gekoppelter cofaktor-regenerierung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von primären alkoholen durch reduktion von aldehyden unter verwendung einer alkoholdehydrogenase bei gekoppelter cofaktor-regenerierung

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EP1784495A2
EP1784495A2 EP05772507A EP05772507A EP1784495A2 EP 1784495 A2 EP1784495 A2 EP 1784495A2 EP 05772507 A EP05772507 A EP 05772507A EP 05772507 A EP05772507 A EP 05772507A EP 1784495 A2 EP1784495 A2 EP 1784495A2
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EP
European Patent Office
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dehydrogenase
alcohol
reaction
alcohol dehydrogenase
cofactor regeneration
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05772507A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Harald GRÖGER
Françoise CHAMOULEAU
Chad Hagedorn
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Cargill Inc
Original Assignee
Cargill Inc
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of primary alcohols from aldehydes.
  • the reduction is accomplished by cofactor-dependent oxidoreductases, again regenerating the cofactor by a second enzymatic system.
  • the production of primary alcohols is of interest to the food industry due to the use of these products as aroma chemicals in direct form or after conversion to corresponding ester compounds.
  • a preferred preparation is the recovery of the primary alcohols by reduction of aldehydes. This could be done in principle by the use of non-natural chemical reducing agents according to numerous existing literature regulations, for example by the use of metal hydrides. However, only “naturally identical” but not “natural” primary alcohols would be obtained in this way. However, the extraction of natural primary alcohols is of particular importance for the food industry. One way to produce them is in the enzymatic reduction of aldehydes.
  • Substrate concentration of 0.05 g per L reaction volume is in the presence of Botyris cinerea strains of G. Bock et al. Bock et al., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1988, 186, 33-35). The highest yields were 0.019 and 0.025 g per L reaction volume.
  • Phenylethanol with a product concentration of 12.6 g / L, corresponding to an amount of about 100 mM (D. Stark, T. Münch, B. Sonnleitner, IW Marison, U. von Stockar, Biotechnol., Prog. 514-523).
  • Alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis is used after an activity for trans-2-hexenal has been found for these enzymes.
  • the cofactor regeneration was carried out with a formate dehydrogenase after this cofactor regenerating enzyme was used successfully in many cases in the enzymatic reduction of ketones (M.R. KuIa, U. Kragl, Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds in: Stereoselective Biocatalysis (ed. RN Patel), Marcel Dekker, New York, 2000, chapter 28, p. 839f.).
  • M.R. KuIa U. Kragl
  • the object of the present invention was therefore the development of a fast, simple, inexpensive and effective enzymatic process for the preparation of primary alcohols from aldehydes.
  • the space / time yield should be improved over the known methods of the prior art.
  • this requires working at high substrate concentrations with correspondingly good yields in a robust one
  • Claim 1 relates to a method according to the invention, in which a rec-whole-cell catalyst is used.
  • Claim 2 comprises a preferred embodiment of this method.
  • Claim 3 is directed to the use of the free enzymes for the purpose of the invention. Claims 3 to 9 protect preferred embodiments of the method according to the invention,
  • recombinant (rec-) whole-cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase and an enzyme capable of cofactor regeneration from the group of glucose dehydrogenases or malate dehydrogenases.
  • Alcohol dehydrogenase with an enzyme capable of cofactor regeneration from the group of glucose dehydrogenases or malate dehydrogenases as isolated enzymes, in particular taking into account the non-satisfactory yields in the same application the formate dehydrogenase (see also example 4 comparative example).
  • the reaction takes place at high substrate concentrations of> 150 mM, in particular> 250 mM and very preferably> 500 mM of aldehyde.
  • Substrate concentrations of> 150 mM are to be understood as meaning that> 150 mM of the substrate are reacted per starting volume of aqueous solvent (including buffer system) using the method shown
  • Concentration in the reaction mixture can actually be achieved, or whether a total of the starting volume of aqueous solvent, a substrate concentration of> 150 mM is reacted.
  • the variant in which a substrate concentration of> 150 mM etc. of aldehyde is actually provided for the reaction is very particularly preferred.
  • concentrations referred to here refer to concentrations of the substrate (aldehyde) actually obtained in the reaction mixture based on the starting volume of aqueous solvent, irrespective of when in the course of the incubation time of an all-cell catalyst or isolated enzymes (in purified or partially purified form or as crude extract) these Initial concentration is reached. It is only reached at least once.
  • the aldehyde When using a whole-cell catalyst, the aldehyde can be used in the form of a "baten" approach directly at the beginning of a whole-cell approach at these concentrations, or it can first be a whole-cell catalyst to a certain optical density are used before the aldehyde is added however, in the approach, preferably at least once in the batch, a concentration of substrate of> 150 inM, etc. during the conversion of the substrate to the desired alcohol This applies mutatis mutandis to higher concentrations.
  • aldehyde component all aldehydes can be used.
  • the aldehyde component used can be subsumed under the following general structural formula
  • R denotes (C 1 -C 2 O) -alkyl, (C 2 -C 20 ) -alkenyl
  • one of the preferred enzymes to be selected is an alcohol dehydrogenase.
  • the skilled person is free in the choice of alcohol dehydrogenase.
  • preferred alcohol dehydrogenases are alcohol dehydrogenases from a Lactobacillus strain, in particular from Lactobacillus kefir and Lactobacillus brevis, or alcohol dehydrogenases from a Rhodococcus strain, in particular from Rhodococcus erythropolis and Rhodococcus ruber, or alcohol dehydrogenases from an Arthrobacter strain, in particular from Arthrobacter paraffineus ,
  • Preferred dehydrogenases for cofactor generation have been glucose dehydrogenases, preferably a glucose dehydrogenase from Bacillus, Thermoplasma and Pseudomonas strains.
  • Glucose dehydrogenases are described, for example, in A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Ed .: K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Chapter 15.3.
  • Malate dehydrogenases are well known to those skilled in the art (S.-I. Suye, M. Kawagoe, S. Inuta, Can. J. Chem. Eng 1992, 70, 306-312; S.-I. Suye, Recent Res. Devel. Ferment Bioeng 1998, 1, 55-64, Dissertation S. Naamnieh, University of Dusseldorf, W02004 / 022764). Again, the skilled person will select the most efficient dehydrogenase for his purpose. In principle, those malate dehydrogenases are preferred which regenerate the NAD (P) H to such an extent that no bottleneck occurs for the reaction of the other enzyme used.
  • P NAD
  • Malate enzyme is preferably a "malic enzyme” from Sulfolobus, Clostridium, Bacillus and Pseudomonas strains and from E. coli used. Most preferably, the known malate dehydrogenase from E. coli K12 is in this context. Gene isolation and cloning are described in S. Naamnieh, Dissertation, University of Dusseldorf, p. 7Off.
  • the addition of the aldehyde can be done in any manner.
  • the aldehyde is added in the total amount from the beginning ("batch” approach) or alternatively metered in.
  • a continuous addition (“continuous feed-in process”) can also be used. These procedures are well known to the person skilled in the art and are used analogously in the present case.
  • a "recombinant whole-cell catalyst” is to be understood as meaning a cell in which at least one recombinant gene is expressed or expressed - ie at least one recombinant protein is present which has the inventive conversion (reduction of the aldehyde and / or regeneration of the cofactor) can catalyze.
  • the recombinant proteins are not limited to being present in living or non-living whole-cell catalysts, but may be in any active form.
  • active form is meant the ability of the recombinant protein to catalyze an enzymatic reaction.
  • the recombinant protein is distributed exclusively in free form over the cytosol of the cell and not in the form of inclusion bodies.
  • the cell is or was able to express an alcohol dehydrogenase and a dehydrogenase capable of cofactor regeneration.
  • microorganisms for the whole cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase and for cofactor regeneration Enabled enzyme, all known cells are suitable.
  • microorganisms in this regard are organisms such as yeasts such as Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, prokaryotes such as E. coli, Bacillus subtilis or eukaryotes such as mammalian cells, insect cells or
  • E. coli strains are to be used for this purpose. Most particularly preferred are: E.
  • Plasmids with which the gene construct comprising the nucleic acid according to the invention is preferably cloned into the host organism are likewise known to the person skilled in the art (see also PCT / EP03 / 07148, see below).
  • Such plasmids and vectors may, for. B. Studier and coworkers (Studier, WF, Rosenberg AH, thin JJ, Dubendroff JW, (1990), Use of the T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol 185, 61-89) or the leaflets of the Companies Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech or Gibco BRL. Further preferred plasmids and vectors can be found in: Glover, D.M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds)
  • Plasmids with which the gene constructs comprising the nucleic acid sequences of interest can be cloned into the host organism are or are based on: pUC18 / 19 (Roche Biochemicals), pKK-177-3H (Roche Biochemicals), pBTac2 (Roche Biochemicals ), pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pKK-233-3 (Stratagene) or pET (Novagen).
  • the whole-cell catalyst is preferably pretreated prior to its use in such a way that the permeability of the cell membrane for the substrates and products is increased compared to the intact system.
  • a process in which the whole-cell catalyst is pretreated for example, by freezing and / or treatment with an organic solvent, in particular toluene.
  • Whole-cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase from R. erythropolis or Lactobacillus kefir and a malate dehydrogenase are also recombinant whole cell catalysts with an alcohol dehydrogenase from R. erythropolis or Lactobacillus kefir and a glucose dehydrogenase from Thermoplasma acidophilum or Bacillus subtilis are suitable in all possible combinations.
  • the two particularly preferred recombinant whole-cell catalysts are those described in the experimental section.
  • the concentration of this recombinant whole-cell catalyst is preferably at most 75 g / L, in a further preferred embodiment up to 50 g / L, extremely preferably at up to 25 g / L and more preferably at up to 15 g / L, where g refers to g of wet biomass (BFM).
  • reaction temperatures which are suitable in particular for the recombinant whole-cell catalyst used.
  • a particularly suitable reaction temperature is to be regarded as a reaction temperature which is from 10 to 90 ° C., preferably from 15 to 50 ° C., and particularly preferably from 20 to 35 ° C.
  • the reaction can be carried out both at a fixed pH, and under variation of the pH in a pH interval.
  • the pH is chosen in particular taking into account the needs of the host organism used or the isolated enzymes used.
  • the reaction is preferably carried out at a pH which is at pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8 and particularly preferably pH 6.5 to 7.5.
  • the reaction of the substrate used to the desired product is preferably carried out in cell culture using a suitable recombinant whole-cell catalyst.
  • a suitable nutrient medium is used.
  • the media suitable for the host cells are well known and commercially available.
  • the cell cultures may also be supplemented with conventional additives, e.g. Antibiotics, growth promoting agents, e.g. Serums (fetal calf serum, etc.) and similar known additives.
  • the conversion of the aldehyde to the desired primary alcohol is carried out without addition of an organic solvent.
  • an organic solvent preferably those which are water-soluble, to the water additive necessary for carrying out the reaction.
  • further organic solvents preferably those which are water-soluble, to the water additive necessary for carrying out the reaction.
  • water-soluble organic solvents such as alcohols, in particular methanol or ethanol, or ethers, such as THF or dioxane understood.
  • a cell suspension of the suitable recombinant whole-cell catalyst wherein the aldehyde used in the cell suspension.
  • the aldehyde used in the cell suspension may also be present as a suspension, or in the form of an emulsion or solution in the cell suspension.
  • the corresponding cofactor is added in suitable amounts in a preferred embodiment.
  • the cofactor amounts added are in the range of 0 ' .00001 to 0.1 equivalents, preferably 0.0001 to 0.01 and more preferably 0.0001 and
  • an "external" cofactor additive can be dispensed with or such an “external” cofactor additive can be used in the amount range below 0.0005 equivalents.
  • the recombinant whole-cell catalyst or the isolated enzymes and the substrate are initially introduced in the chosen solvent system.
  • a specific amount of the cofactor required for this purpose for example NADH or NADPH or their oxidized forms NAD + and NADP +
  • NADH or NADPH or their oxidized forms NAD + and NADP + can then be added to the reaction mixture.
  • the order of addition is variable.
  • the work-up of the reaction mixture takes place according to methods known in the art.
  • the biomass can be easily separated from the product by filtration or centrifugation.
  • the alcohol obtained can then be isolated by conventional methods (eg extraction, distillation, crystallization).
  • the subject method can also be carried out continuously.
  • the reaction is carried out in a so-called enzyme membrane reactor in which high molecular weight substances - the enzymes or biomass - are retained behind an ultrafiltration membrane and low molecular weight substances - such as the amino acids produced - can pass through the membrane.
  • enzyme membrane reactor in which high molecular weight substances - the enzymes or biomass - are retained behind an ultrafiltration membrane and low molecular weight substances - such as the amino acids produced - can pass through the membrane.
  • Particularly suitable (C 1 -C 20 ) -alkyl radicals are methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl , Dodecyl with all its binding isomers.
  • a (C 1 -C 8 ) -alkyl radical is analogous to one in which 1 to 8 carbon atoms are present in the chain.
  • (C 2 -C 20) alkynyl group refers to a (Ci-C 20) -alkyl radical as described above with at least one C ⁇ C triple bond.
  • the radical (C 1 -C 2 O) -alkoxy corresponds to the radical (C 1 -C 20 ) -alkyl, with the proviso that it is bonded to the molecule via an oxygen atom. The same applies to a (C 1 -C 8 ) -alkoxy radical.
  • (C 2 -C 20 ) alkoxyalkyl residues in which the alkyl chain is interrupted by at least one oxygen function, whereby two oxygen atoms can not be linked together.
  • the number of Carbon atoms indicate the total number of carbon atoms in the rest.
  • radicals just described may be monosubstituted or polysubstituted by halogens and / or N, O, P, S, Si atom-containing radicals.
  • halogens and / or N, O, P, S, Si atom-containing radicals.
  • alkyl radicals of the abovementioned type which have one or more of these heteroatoms in their chain or which are bonded to the molecule via one of these heteroatoms.
  • (C 3 -C 8 ) -cycloalkyl is meant cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl radicals, etc. These may be with one or more halogens and / or N, O, P, S, Si atom-containing radicals be substituted and / or have N, 0, P, S atoms in the ring, such as. 1-, 2-, 3-, 4-piperidyl, 1-, 2-, 3-pyrrolidinyl, 2-, 3-tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-morpholinyl.
  • a (C 3 -C 8 ) -cycloalkyl (C 1 -C 20 ) -alkyl radical denotes a cycloalkyl radical as described above which is bonded to the molecule via an alkyl radical as specified above.
  • (Ci-C 8 ) -Acyloxy in the context of the invention means an alkyl radical as defined above with max. 8 C atoms, which is bound to the molecule via a COO function.
  • (C 1 -C 8 ) acyl means in the context of the invention an alkyl radical as defined above with max. 8 C atoms, which is bound to the molecule via a CO function.
  • a (C 6 -C 8 ) -aryl radical is meant an aromatic radical having 6 to 18 C atoms.
  • these include compounds such as phenyl, naphthyl, anthryl, phenanthryl, biphenyl radicals or systems of the type described above, such as, for example, indenyl systems which are optionally substituted by (C 1 -C 8 ) -alkyl, (C 1 -C 8 ) -alkyl.
  • C 8 ) - alkoxy, NR 1 R 2 , (Ci-C 8 ) acyl, (Ci-C 8 ) acyloxy may be substituted.
  • a (C 7 -C 26 ) aralkyl radical is a (C 6 -C 18 ) -aryl radical bonded to the molecule via a (C 1 -C 8 ) -alkyl radical.
  • a (C 3 -C 18 ) heteroaryl radical in the context of the invention denotes a five-, six- or seven-membered aromatic ring system of 3 to 18 C atoms, which
  • Heteroatoms such. B. nitrogen, oxygen or sulfur in the ring.
  • Particular examples of such heteroaromatics are radicals such as 1-, 2-, 3-furyl, such as 1-, 2-, 3-pyrrolyl, 1-, 2-, 3-thienyl, 2-, 3-, 4-pyridyl , 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-indolyl, 3-, 4-, 5-pyrazolyl, 2-, 4-, 5-imidazolyl, acridinyl, quinolinyl, phenanthridinyl, 2-, 4 , 5, 6-pyrimidinyl.
  • a (C 4 -C 26 ) heteroaralkyl is meant a heteroaromatic system corresponding to the (C 7 -C 26 ) aralkyl radical.
  • Halogens come fluorine, chlorine, bromine and iodine in question.
  • isolated enzyme is understood according to the invention to mean the use of alcohol dehydrogenase and of the enzyme capable of cofactor regeneration from the group of glucose dehydrogenases or malate dehydrogenases as isolated enzymes (in purified or partially purified form or as crude extract or in immobilized form).
  • Malate dehydrogenase catalyzes the oxidative decarboxylation of malate to pyruvate.
  • Many malate dehydrogenases from various organisms are known, including higher animals, plants, and microorganisms.There are four types of malate dehydrogenases that are known in the United States
  • Enzyme classes EC 1.1.1.37 to EC 1.1.1.40 are classified (http://www.genome.ad.jp). Depending on the type of Malate dehydrogenase requires NAD and / or NADP as cofactor.
  • the E. coli used in the examples was deposited by the applicant under the number DSM 14459 at DSMZ GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig on 24.08.01 under the Budapest Treaty.
  • FIG. 1 shows the plasmid map of the plasmid pNO5c
  • FIG. 2 shows the plasmid map of the plasmid pNO8c
  • Figure 3 shows the plasmid map of plasmid pN014c
  • This plasmid encodes Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase (Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase: a useful catalyst for synthesis, Bradshaw et al JOC 1992, 57 1532-6, Reduction of acetophenone to R (+) -phenylethanol by a novel alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir Hummel W Ap Microbiol Biotech 1990, 34, 15-19).
  • Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase
  • coli DSM14459 (pNO5c-1) was made chemically competent and transformed with the plasmid pNO8c ( Figure 2) which encodes the gene of a codon-optimized glucose dehydrogenase from Thermoplasma acidophilum (Bright, JR et al., 1993 Eur. J. Biochem 211: 549-554). Both genes are under the control of a rhamnose promoter (Stumpp, Tina, Wilms, Burkhard, Altenbuchner, Josef A new, L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli BIOspektrum (2000), 6 (1), 33-36). Sequences and plasmid maps of pN05c and pNO8c are given below. Production of active cells
  • E. coli DSM14459 (pN05c, pN08c) was incubated in 2 ml LB medium supplemented with antibiotics (50 ⁇ g / l ampicillin and 20 ⁇ g / ml chloramphenical) for 18 hours at 37 ° C, shaken (250 rpm).
  • This culture was diluted 1: 100, shaken in fresh LB medium with rhamnose (2 g / 1) as inducer, added antibiotics (50 ug / l ampicillin and 20 ug / ml chloramphenical) and IMM ZnCl2 diluted and 18 hours at 30 0 C (250 rpm ), incubated.
  • Cells were centrifuged (10000g, 10min, 4 0 C), discarded the supernatant and the cell pellet used directly or after storage at -2O 0 C in biotransformation experiments.
  • Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli Purification, characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium. HiIt W; Pfleiderer G; Fortnagel P Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29), 1076 (2), 298-304). Alcohol dehydrogenase is under the control of a rhamnose promoter (Stumpp, Tina, Wilms, Burkhard, Altenbuchner, Josef A new, L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli BIOspektrum (2000), 6 (1), 33-36). The sequence and plasmid map of pN014c is given below.
  • E. coli DSM14459 (pN014c - Fig. 3) was incubated in 2 ml LB medium supplemented with antibiotics (50 ⁇ g / l ampicillin and 20 ⁇ g / ml chloramphenical) shaken for 18 hours at 37 ° C (250 rpm).
  • This culture was diluted 1: 100 in fresh LB medium with rhamnose (2 g / l) as an inducer, antibiotics (50 ⁇ g / l ampicillin and 20 ⁇ g / ml chloramphenical) and ImM ZnCl2 and shaken for 18 hours at 30 0 C (250 rpm ), incubated.
  • Cells were centrifuged (10000g, 10min, 4 ° C), the supernatant discarded and the cell pellet used directly, or after storage at -2O 0 C in biotransformation experiments.
  • Example 1 Reduction of cinnamaldehyde in a 0.2 M solution using a whole-cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase and glucose dehydrogenase
  • Cinnamaldehyde (corresponding to a substrate concentration based on phosphate buffer used of 0.2 M) was added.
  • the reaction mixture is stirred at room temperature, the pH being kept constant by addition of sodium hydroxide solution (2M NaOH) (to pH 6.5).
  • Samples are taken at regular intervals and the conversion of cinnamic aldehyde to cinnamyl alcohol is determined by HPLC. Sales were 93% at 1 hour and 100% at 2 hours.
  • Example 2 Reduction of cinnamaldehyde in a 0.5 M solution using a whole-cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase and glucose dehydrogenase
  • reaction mixture is stirred for 25 h at room temperature, the pH being kept constant by addition of sodium hydroxide solution (2M NaOH) (to pH 6.5).
  • 2M NaOH sodium hydroxide solution
  • Samples are taken at regular intervals and the conversion of cinnamic aldehyde to cinnamyl alcohol is determined by HPLC. Sales were 44% after 1 hour, 91% after 5h and 93% after 25h.
  • Example 3 Reduction of cinnamaldehyde in a 1.5 M solution using a whole-cell catalyst containing an (R) -selective alcohol dehydrogenase
  • Cinnamaldehyde (corresponding to a substrate concentration based on phosphate buffer used of 1.5 M) was added.
  • the reaction mixture is stirred at room temperature, the pH being kept constant by addition of sodium hydroxide solution (5M NaOH). Samples are taken at regular intervals and the conversion of cinnamic aldehyde to cinnamyl alcohol is determined by HPLC. Sales were 15% after 1 hour, 58% after 5 hours and 98% after 23.5 hours.
  • Example 4 (Comparative Example): Reaction of trans-2-hexenal at 100 mM using a formate dehydrogenase for cofactor regeneration
  • reaction mixture consisting of trans-2-hexenal (100 mM) and NADH (3.5 mM, corresponding to 0.035 equivalents based on the aldehyde), sodium formate (455 mM, corresponding to 4.55 equivalents based on the aldehyde) at enzyme quantities of 20 U / mmol an (S) -ADH from R. erythropolis (expr in E. coli) and 20 U / mmol of a
  • Formate dehydrogenase from Candida boidinii is allowed to stir at a reaction temperature of 30 0 C over a period of 72 hours in 1 mL of a phosphate buffer (100 mM, pH 7.0). During this period, samples are taken and the respective turnover is determined via HPLC. Sales were 7% after 5h and 16% after 72h.
  • Example 5 Reaction of tra ⁇ s-2-hexenal at 100 mM using a glucose dehydrogenase for cofactor regeneration
  • a reaction mixture consisting of trai-S-2-hexenal (100 mM) and NADH (1.4 mM, corresponding to 0.014 equivalents based on the aldehyde), glucose (300 mM, corresponding to 3 equivalents based on the aldehyde) at enzyme quantities of 20 U / mmol of an (S) -ADH from R. erythropolis (expr. in E. coli) and 150 U / mmol of a glucose dehydrogenase from Bacillus sp., Is allowed at a reaction temperature of 30 0 C over a period of 72 hours in 1 mL of a phosphate buffer (100 mM, pH 7.0).
  • Example 6 Implementation of. trans-2-hexenal at 100 mM using a glucose dehydrogenase for cofactor regeneration
  • a reaction mixture consisting of trans-2-hexenal (100 mM) and NADPH (1 mM, corresponding to 0.01 equivalent based on the aldehyde), magnesium chloride (5 mM), glucose (300 mM, corresponding to 3 equivalents based on the aldehyde) Enzyme amounts of 13 U / mmol of an (R) -ADH from L. kefir and 60 U / mmol of a glucose dehydrogenase from Thermoplasma acidophilum, is allowed at a
  • Example 7 Reduction of trans-2-hexenal in a 0.5 M solution using a whole-cell catalyst containing an alcohol dehydrogenase and glucose dehydrogenase

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen aus Aldehyden mit Hilfe von Ganzzellkatalysatoren oder isolierten Enzymen. Zum Einsatz kommen eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, wobei vorzugsweise für die Umsetzung eine Substratkonzentration von >150 mM Aldehyd vorliegend kann.

Description

Verfahren zur Herstellung primärer Alkohole
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung primärer Alkohole ausgehend von Aldehyden. Die Reduktion wird durch cofaktorabhängige Oxidoreductasen bewerkstelligt, wobei der Cofaktor wiederum durch ein zweites enzymatisches System wieder regeneriert wird.
Die Herstellung primärer Alkohole ist von Interesse für die Nahrungsmittelindustrie aufgrund der Verwendung dieser Produkte als Aromachemikalien in direkter Form bzw. nach Überführung in entsprechende Esterverbindungen. Eine bevorzugte Herstellungsform ist die Gewinnung der primären Alkohole durch Reduktion von Aldehyden. Diese könnte prinzipiell durch den Einsatz nicht-natürlicher chemischer Reduktionsmittel erfolgen gemäß zahlreich vorhandener Literaturvorschriften, beispielsweise durch Einsatz von Metallhydriden. Allerdings würden auf diesem Wege lediglich „natur-identische" , nicht aber „natürliche" primäre Alkohole erhalten werden. Für die Nahrungsmittelindustrie ist aber gerade die Gewinnung natürlicher primärer Alkohole von hoher Bedeutung. Ein Weg zu deren Herstellung besteht in der enzymatischen Reduktion von Aldehyden.
Die enzymatische Reduktion von Aldehyden ist prinzipiell bereits eingehend in der Literatur beschrieben. Insbesondere sind dabei Beispiele zur Herstellung von trans-3-Hexenol, trans-2-Hexenol, Zimtalkohol und 2- Phenylethanol bekannt aufgrund deren Anwendung als Aromachemikalien bzw. als Zwischenprodukte für Aromachemikalien im Bereich der Nahrungsmittelindustrie. Allerdings werden die Reaktionen in sehr verdünnten Medien durchgeführt, was aus technischer Sicht den Nachteil damit verbundener niedriger Produktkonzentrationen mit sich bringt. Die Reduktion von Zimtaldehyd mit einer
Substratkonzentration von 0.05 g pro L Reaktionsvolumen ist in Gegenwart von Botyris cinerea-Stämmen von G. Bock et al. beschrieben (G. Bock et al., Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1988, 186, 33-35) . Die höchsten Ausbeuten lagen bei 0.019 bzw. 0.025 g pro L Reaktionsvolumen.
Die Nutzung von Alkoholdehydrogenasen zur Herstellung von 2-Phenylethanol durch Reduktionsreaktionen ist ebenfalls beschrieben. Typischerweise liegen die erhaltenen Produktkonzentrationen unter Standardbatchbedingungen lediglich bei <1 g/L (M. W. T. Etschmann, D. Seil, J. Schrader, Biotechnol. Lett. 2003, 25, 531-536.) . Eine Erhöhung auf 2 g/L konnte bei Anwendung einer in situ- Produktabtrennungstechnik erzielt werden, wobei hier mit Oleylalkohol als weiterer, zweiter Phase eine
Hilfsverbindung benötigt wird (M. W. T. Etschmann, D. Seil, J. Schrader, Biotechnol. Lett. 2003, 25, 531-536.) . Unter Einsatz einer extraktiven Fedbatch-Bioumwandlung mit Ölsäure als weitere, organische Phase gelang mit einem solchen speziellen Reaktionssystem Stark et al., 2-
Phenylethanol mit einer Produktkonzentration von 12.6 g/L, entsprechend einer Menge von ca. 100 mM, zu erhalten (D. Stark, T. Münch, B. Sonnleitner, I. W. Marison, U. von Stockar, Biotechnol. Prog. 2002, 18, 514-523) .
Für die Herstellung von trans-3-Hexenol und trans-2-Hexenol sind eine Reihe von enzymatischen Verfahren beschrieben, die als abschließenden Schlüsselschritt jeweils eine enzymatische Reduktion des entsprechenden Aldehyds beinhalten (S. K. Goers et al., US 4806379, 1989; B. Muller et al, Patent US 5464761, 1995; P. Brunerie et al. , US
5620879, 1997; M.-L. Fauconnier et al. , Biotechnology Lett. 1999, 21, 629-633; R. B. Holtz et al. , US 6274358, 2001) . Die höchsten Ausbeuten wurden dabei von Muller et al berichtet mit 4.2 g pro kg für trans-3-Hexenol und 1.5 g pro kg für trans-2-Hexenol (B. Muller et al, Patent US 5464761, 1995; siehe auch: J. Schrader et al., Biotechnology Letters 2004, 26, 463-472) . Nachteilig bei diesen Verfahren sind vor allem die niedrigen Substratkonzentrationen, bei denen gearbeitet wird und die daraus resultierenden niedrigen erhaltenen
Produktkonzentrationen von <5 g pro kg Reaktionslösung.
Um diesen Nachteil zu vermeiden wurden entsprechende Enzymreaktionen mit trans-2-Hexenal bei Substratkonzentrationen von 100 mM durchgeführt (Beispiel 4 = Vergleichsbeispiel) . Hierbei kam als Enzym eine
Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis zum Einsatz, nachdem für diese Enzyme eine Aktivität für trans- 2-Hexenal festgestellt wurde. Die Cofaktorregenerierung erfolgte mit einer Formiatdehydrogenase, nachdem dieses cofaktorregenerierende Enzym in vielen Fällen erfolgreich bei der enzymatischen Reduktion von Ketonen eingesetzt wurde (M.-R. KuIa, U. Kragl, Dehydrogenases in the Synthesis of Chiral Compounds in: Stereoselective Biocatalysis (Hrsg. : R. N. Patel) , Marcel Dekker, New York, 2000, chapter 28, S. 839f.) . In Gegenwart der beiden
Enzymkomponenten wurde allerdings die gewünschte Reaktion nur in geringem Umfang mit einem Umsatz von lediglich 16% nach 72 Stunden beobachtet (Beispiel 4) , vermutlich bedingt durch Inhibierungs und/oder Destabilisierungseffekte durch bereits geringe Konzentrationen an trans-2-Hexenal.
Über die Inhibierung von Alkoholdehydrogenasen beim Einsatz von Alkoholdehydrogenase-haltigen Mikroorganismen durch trans-3-Hexenal bereits bei sehr niedrigen
Substratkonzentrationen berichten auch M.-L. Fauconnier et al. (M.-L. Fauconnier et al., Biotechnology Lett. 1999, 21, 629-633) . Typischerweise wurden die Reaktionen bei 0.67 mM (!) , entsprechend 0.066 g/L, durchgeführt. Der maximale Umsatz lag bei 82 %.
Zusammenfassend werden bislang somit bei allen enzymatischen Reduktionsverfahren von Aldehyden zur Herstellung primärer Alkohole lediglich niedrige, technisch nicht attraktive Produktkonzentrationen von < 15 g/L erhalten. Entsprechend werden auch nur bei niedrigen Substratkonzentrationen von maximal ~100 mM technisch sinnvolle Umsätze von > 80 % erzielt. Ursächlich kann dies mit einer durch die Aldehydkomponente hervorgerufenen Inhibierung als auch Deaktivierung der Enzyme erklärt werden. Da Aldehyde im Vergleich mit Ketonen weitaus reaktivere Komponenten darstellen, können in verstärktem Maße diese Verbindungen in unerwünschter Weise mit funktionellen Gruppen (insbesondere Aminen) der Enzyme reagieren und diese entsprechend deaktivieren.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Entwicklung eines schnellen, einfachen, kostengünstigen und effektiven enzymatischen Verfahrens zur Herstellung von primären Alkoholen aus Aldehyden. Insbesondere die Raum/Zeit-Ausbeute sollte gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik verbessert sein. Dies bedingt einerseits das Arbeiten bei hohen Substratkonzentrationen mit entsprechend guten Ausbeuten in einem robusten
Arbeitsprozess. In ganz besonderem Maße sollte ein solches Verfahren zur Reduktion von ungesättigten Aldehyden einsetzbar sein.
Die Aufgabe wurde anspruchsgemäß gelöst. Anspruch 1 bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem ein rec- Ganzzellkatalysator zum Einsatz kommt. Anspruch 2 umfasst eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens. Anspruch 3 ist auf den Einsatz der freien Enzyme zum erfindungsgemäßen Zweck gerichtet. Ansprüchen 3 bis 9 stellen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Schutz,
Dadurch, dass man in einem Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen durch Reduktion von Aldehyden diese Umsetzung in Gegenwart eines rekombinanten Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, durchführt, gelangt man völlig überraschend, dafür aber nicht minder vorteilhaft zur Lösung der gestellten Aufgabe. Überraschenderweise werden unter Anwendung dieses Verfahrens bei hohen Substratkonzentrationen von > 150 mM, insbesondere >250 mM und ganz bevorzugt > 500 mM, hohe bis sehr hohe Umsätze erzielt. Diese liegen typischerweise bei über 80% und insbesondere bei größer 90 - 95 % Ausbeute. Dies war aufgrund der niedrigen Umsätze bisheriger Verfahren selbst bei niedrigen Substratkonzentrationen nicht zu erwarten, und ist gerade auch vor dem Hintergrund der aus dem Stand der Technik bekannten starken Inhibierungen bzw. DeStabilisierungen von Dehydrogenasen durch die eingesetzten Substrate äußerst überraschend.
Prinzipiell eignen sich für den Aufbau des rec-
Ganzzellkatalysators alle Alkoholdehydrogenasen, die dem Fachmann für die vorliegende Anwendung in den Sinn gekommen. Vorzugsweise erfolgte die erfindungsgemäße Umsetzung jedoch in Gegenwart eines rekombinanten (rec-) Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen.
Eine weitere Lösung der oben gestellten Aufgabe wird dadurch erreicht, dass man die erfindungsgemäße Umsetzung in Gegenwart einer isolierten Alkoholdehydrogenase sowie einem zur Cofaktorregenerierung befähigten isolierten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen durchführt. Überraschend ist hier die spezielle Eignung der Kombination einer
Alkoholdehydrogenase mit einem zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen als isoliert eingesetzte Enzyme, insbesondere unter Berücksichtigung der nicht zufriendenstellenden Ausbeuten bei der gleichen Anwendung der Formiatdehydrogenase (siehe auch Beispiel 4 = Vergleichsbeispiel) .
Die deutlich verbesserte Performance bei der Kombination einer Alkoholdehydrogenase mit einem zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen gegenüber der analogen Kombination mit einer Formiatdehydrogenase wird beispielsweise durch Vergleich der bei der Reduktion von trans-2-Hexenal erhaltenen Umsätze verdeutlicht (siehe Beispiel 4 (= Vergleichsbeispiel) sowie Beispiele 5 bis 7) .
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung bei hohen Substratkonzentrationen von > 150 mM, insbesondere >250 mM und ganz bevorzugt > 500 mM an Aldehyd.
Erfindungsgemäß ist der Aussage „bei hohen
Substratkonzentrationen von >150 mM" so zu verstehen, dass pro eingesetztem Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel (inkl. Puffersystem) > 150 mM des Substrats mittels des dargestellten Verfahrens umgesetzt werden. Es kann dabei dahingestellt bleiben, ob die > 150 mM an Substrat als
Konzentration in der Reaktionsmischung tatsächlich erreicht werden, oder ob insgesamt bezogen auf das Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel eine Substratkonzentration von > 150 mM umgesetzt wird.
Ganz besonders bevorzugt ist jedoch die Variante, bei der für die Umsetzung eine Substratkonzentration von > 150 mM etc. an Aldehyd tatsächlich bereitgestellt wird. Die hier bezeichneten Konzentrationen beziehen sich auf im Ansatz tatsächlich erreichte auf das Ausgangsvolumen an wässrigem Lösungsmittel bezogene Konzentrationen des Substrats (Aldehyds) , wobei es unabhängig davon ist, wann im Laufe der Zeitdauer der Inkubation eines eingesetzten Ganzzellkatalysators bzw. isolierter Enzyme (in gereinigter oder partiell gereinigter Form bzw. als Rohextrakt) diese Ausgangskonzentration erreicht wird. Sie wird nur mindestens einmal erreicht.
Bei Anwendung eines Ganzzellkatalysators kann der Aldehyd in Form eines „Baten"ansatzes direkt am Anfang eines Ganzzeil-Ansatzes in diesen Konzentrationen eingesetzt werden, oder es kann zunächst ein Ganzzellkatalysator bis zu einer gewissen optischen Dichte herangezogen werden, bevor der Aldehyd zugegeben wird. Ebenso kann dieser zunächst in niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden und im Laufe der Inkubationsdauer des Zeilansatzes bis zu Konzentrationen wie angegeben zugegeben werden. Erfindungsgemäß kann vorzugsweise jedoch in dem Ansatz wenigstens einmal eine Konzentration an Substrat von >150 inM etc. während des Umsatzes des Substrats zu dem gewünschten Alkohol erreicht werden. Dies gilt für höhere Konzentrationen sinngemäß.
Als Aldehydkomponente können sämtliche Aldehyde eingesetzt werden. Vorzugsweise lässt sich die eingesetzte Aldehydkomponente unter folgende allgemeine Strukturformel subsumieren,
in der R bedeutet (C1-C2O)-AIkYl, (C2-C20) -Alkenyl,
(C2-C20) -Alkinyl, (C1-C2Q)-AIkOXy, HO-(C1-C2Q)-AIkYl, (C2-C20) -Alkoxyalkyl, (C6-C18) -Aryl, (C7-C19) -Aralkyl,
(C3-C18) -Heteroaryl, (C4-C19) -Heteroaralkyl,
(C1-C20)-Alkyl- (C5-C18)-Aryl,
(C1-C20) -Alkyl- (C3-C18) -Heteroaryl, (C3-C8) -Cycloalkyl,
(C1-C30) -Alkyl- (C3-C8) -Cycloalkyl, (C3-C8) -Cycloalkyl- (C1-C20) -Alkyl,
(C6-C18) -Aryl- (C2-C20) -Alkenyl. Besonders wird das Verfahren herangezogen zur Reduktion von Aldehyden, enthaltend mindestens eine C=C-Doppelbindung im Rest. Ganz bevorzugt kommen dabei 2-trans-Hexenal, 2-cis-Hexenal, 3-trans- Hexenal, 3-cis-Hexenal und/oder Zimtaldehyd zum Einsatz.
Für die vorliegende Erfindung ist eines der bevorzugt auszuwählenden Enzyme eine Alkoholdehydrogenase. Der Fachmann ist frei in der Auswahl der Alkoholdehydrogenase. Als bevorzugte Alkoholdehydrogenasen haben sich beispielsweise Alkoholdehydrogenasen aus einem Lactobacillus Stamm, insbesondere aus Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis, bzw. Alkoholdehydrogenasen aus einem Rhodococcus Stamm, insbesondere aus Rhodococcus erythropolis und Rhodococcus ruber, bzw. Alkoholdehydrogenasen aus einem Arthrobacter Stamm, insbesondere aus Arthrobacter paraffineus, erwiesen.
Als bevorzugte Dehydrogenasen zur Cofaktoregenerierung haben sich Glucosedehydrogenasen, vorzugsweise eine Glucosedehydrogenase aus Bacillus-, Thermoplasma- und Pseudomonas-Stämmen erwiesen. Glucosedehydrogenasen sind beispielsweise beschrieben in A. Bommarius in: Enzyme Catalysis in Organic Synthesis (Hrsg. : K. Drauz, H. Waldmann), Volume III, Wiley-VCH, Weinheim, 2002, Kapitel 15.3.
Malatdehydrogenasen sind dem Fachmann geläufig (S.-I. Suye, M. Kawagoe, S. Inuta, Can. J. Chem. Eng. 1992, 70, 306-312; S.-I. Suye, Recent Res. Devel. Ferment. Bioeng. 1998, 1, 55-64; Dissertation S. Naamnieh, Universität Düsseldorf; W02004/022764) . Auch hier wird der Fachmann die für seinen Zweck am effizientesten einsetzbare Dehydrogenase auswählen. Im Prinzip sind solche Malatdehydrogenasen bevorzugt, die das NAD(P)H in einem solchen Maße regenerieren, dass kein Engpass für den Reaktionsablauf des anderen eingesetzten Enzyms auftritt. Als
Malatdehydrogenasen („malic enzyme") , wird vorzugsweise ein „malic enzyme" aus Sulfolobus-, Clostridium-, Bacillus- und Pseudomonas-Stämmen sowie aus E. coli, eingesetzt. Ganz bevorzugt ist die bekannte Malatdehydrogenase aus E. coli K12 in diesem Zusammenhang. Genisolierung und Klonierung sind beschrieben in S. Naamnieh, Dissertation, Universität Düsseldorf, S. 7Off.
Die Zugabe des Aldehyds kann in beliebiger Art und Weise erfolgen. Bevorzugt wird der Aldehyd in der Gesamtmenge von Anfang an („batch" Ansatz) bzw. alternativ dosiert zugegeben. Auch ein kontinuierliches Zugeben („kontinuierliches feed-in Verfahren") kann angewendet werden. Diese Verfahrensweisen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und werden vorliegendenfalls analog angewendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist unter einem "rekombinanten Ganzzellkatalysator" eine Zelle zu verstehen, in der wenigstens ein rekombinantes Gen exprimiert wird oder exprimiert wurde - sprich wenigstens ein rekombinantes Protein vorliegt, das den erfindungsgemäßen Umsatz (Reduktion des Aldehyds und/oder Regenerierung des Cofaktors) katalysieren kann. Die rekombinanten Proteine sind nicht auf ein Vorliegen in lebenden oder nicht lebenden Ganzzellkatalysatoren beschränkt, sondern können in jeglicher aktiver Form stehen. Unter "aktiver Form" ist dabei die Fähigkeit des rekombinanten Proteins zu verstehen, eine enzymatische Reaktion zu katalysieren. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Protein ausschließlich in freier Form über das Cytosol der Zelle verteilt und nicht in Form von Einschlusskörperchen (inclusion bodies) vor.
Erfindungsgemäß ist oder war die Zelle in der Lage eine Alkoholdehydrogenase und eine zur Cofaktorregenerierung befähigte Dehydrogenase zu exprimieren.
Für den Ganzzellkatalysator, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, eignen sich sämtliche bekannte Zellen. Als Mikroorganismen sind diesbezüglich Organismen wie z.B. Hefen wie Hansenula polymorpha, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Prokaryonten, wie E. coli, Bacillus subtilis oder Eukaryonten, wie Säugerzellen, Insektenzellen oder
Pflanzenzellen zu nennen. Die Verfahren zur Klonierung sind dem Fachmann wohlbekannt (Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) , Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York) . Vorzugsweise sind E. coli-Stämme für diesen Zweck zu benutzen. Ganz besonders bevorzugt sind: E.' coli XLl Blue, NM 522, JMlOl, JM109, JM105, RRl, DH5α, TOP 10- , HBlOl, BL21 codon plus, BL21 (DE3) codon plus, BL21, BL21 (DE3) , MM294. Plasmide, mit denen das die erfindungsgemäße Nukleinsäure aufweisende Genkonstrukt vorzugsweise in den Wirtsorganismus kloniert wird, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt (s.a. PCT/EP03/07148; s.u.) .
Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden
Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. von Studier und Mitarbeiter (Studier, W. F.; Rosenberg A. H.; Dünn J. J.; Dubendroff J. W.; (1990) , Use of the T7 RNA Polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185, 61-89) oder den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weiter bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985) , DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd. , Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds)
(1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990) , Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) , Molecular cloning: a laboratory manual, 2πd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Plasmide, mit denen die die ins Auge gefassten Nukleinsäuresequenzen aufweisenden Genkonstrukte in ganz bevorzugter Weise in den Wirtsorganismus kloniert werden können, sind oder basieren auf: pUC18/19 (Roche Biochemicals) , pKK-177-3H (Roche Biochemicals) , pBTac2 (Roche Biochemicals) , pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech) , pKK-233-3 (Stratagene) oder pET (Novagen) .
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Ganzzellkatalysator vorzugsweise vor dessen Einsatz so vorbehandelt, dass die Permeabilität der Zellmembran für die Substrate und Produkte gegenüber dem intakten System gesteigert ist. Besonders bevorzugt ist dabei ein Verfahren, bei dem der Ganzzellkatalysator beispielsweise durch Einfrieren und/oder Behandlung mit einem organischen Solvens, insbesondere Toluol vorbehandelt wird.
In besonderer Weise ist dabei ein rekombinanter
Ganzzellkatalysator, der eine Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis oder Lactobacillus kefir sowie eine Malatdehydrogenase (einschließlich sog. „Malic Enzymes") enthält, geeignet. Ebenso sind rekombinante Ganzzellkatalysatoren mit einer Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis oder Lactobacillus kefir und einer Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum oder Bacillus subtilis in allen möglichen Kombinationen geeignet. Als besonders geeignete rekombinante Ganzzellkatalysatoren sind die beiden im experimentellen Teil beschriebenen bevorzugt.
Die Konzentration dieses rekombinanten Ganzzellkatalysators liegt bevorzugt bei maximal 75 g/L, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform bei bis zu 50 g/L, äußerst bevorzugt bei bis zu 25 g/L und besonders bevorzugt bei bis zu 15 g/L, wobei sich g auf g Biofeuchtmasse (BFM) bezieht.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei beliebigen, insbesondere für den verwendeten rekombinanten Ganzzellkatalysator geeigneten Reaktionstemperaturen durchgeführt werden. Als besonders geeignete Reaktionstemperatur ist eine Reaktionstemperatur anzusehen, die bei 10 bis 900C, bevorzugt 15 bis 500C und besonders bevorzugt 20 bis 350C liegt.
Auch bei dem pH-Wert der Reaktion ist der Fachmann frei in der Wahl, wobei die Reaktion sowohl bei einem festen pH- Wert, als auch unter Variation des pH-Werts in einem pH- Intervall durchgeführt werden kann. Der pH-Wert wird insbesondere unter Berücksichtigung der Bedürfnisse des eingesetzten Wirtsorganismus oder der eingesetzten isolierten Enzyme gewählt. Bevorzugt wird die Reaktion bei einem pH-Wert durchgeführt, der bei pH 5 bis 9, bevorzugt pH 6 bis 8 und besonders bevorzugt pH 6.5 bis 7.5 liegt.
Die Umsetzung des eingesetzten Substrates zu dem gewünschten Produkt erfolgt vorzugsweise in Zellkultur unter Einsatz eines geeigneten rekombinanten Ganzzellkatalysators. Hierbei wird je nach verwendetem Wirtsorganismus ein geeignetes Nährmedium verwendet. Die für die Wirtszellen geeigneten Medien sind allgemein bekannt und kommerziell erhältlich. Den Zellkulturen können außerdem übliche Zusätze zugegeben werden, wie z.B. Antibiotika, wachstumsfördernde Mittel, wie z.B. Seren (fötales Kälberserum usw.) und ähnliche bekannte Zusatzstoffe.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz des Aldehyds zu dem gewünschten primären Alkohol ohne Zusatz eines organischen Lösungsmittels durchgeführt. Dies soll heißen, dass dem Ansatz, der den Biokatalysator enthält, kein organisches Lösungsmittel zugegeben wird. Alternativ kann jedoch auch dem zur Durchführung der Reaktion notwendigen Wasserzusatz weitere organische Lösungsmittel vorzugsweise solche, die wasserlöslich sind, zugegeben werden. Als solche werden insbesondere wasserlösliche organische Lösungsmittel wie z.B. Alkohole, insbesondere Methanol oder Ethanol, oder Ether, wie THF oder Dioxan, verstanden.
Außerdem ist es bevorzugt die Umsetzung in einer Zellsuspension des geeigneten rekombinanten Ganzzellkatalysators durchzuführen, wobei der eingesetzte Aldehyd in der Zellsuspension. ebenfalls als Suspension vorliegen kann, oder in Form einer Emulsion oder Lösung in der Zellsuspension vorliegt.
Bei Verwendung isolierter Enzyme (in gereinigter bzw. partiell gereinigter Form oder als Rohextrakte oder in immobilisierter Form) wird in einer bevorzugten Ausführungsform der entsprechende Cofaktor in geeigneten Mengen zugesetzt. Typischerweise liegen die zugesetzten Cofaktoπnengen im Bereich von 0'.00001 bis 0.1 Äquivalenten, bevorzugt 0.0001 bis 0.01 und ganz bevorzugt 0.0001 und
0.001 Äquivalenten. Beim Einsatz eines Ganzzellkatalysators kann in einer bevorzugten Ausführungsform auf den Einsatz eines „externen" Cofaktorzusatzes verzichtet bzw. ein solcher „externer" Cofaktorzusatz im Mengenbereich von unter 0.0005 Äquivalenten verwendet werden.
Bei der gegenständlichen Reaktion geht man in einer bevorzugten Ausführungsform so vor, dass man den rekombinanten Ganzzellkatalysator bzw. die isolierten Enzyme und das Substrat in dem gewählten Lösungsmittelsystem vorlegt. Je nach Anforderung kann sodann eine bestimmte Menge an dem entsprechend benötigten Cofaktor (beispielsweise NADH bzw. NADPH bzw. deren oxidierte Formen NAD+ und NADP+) zur Reaktionsmischung zugesetzt werden. Die Zugabereihenfolge ist jedoch variabel. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Im Batch-Prozess kann die Biomasse durch Filtration oder Zentrifugation leicht vom Produkt abgetrennt werden. Der erhaltene Alkohol kann dann nach gängigen Verfahren isoliert werden (z.B. Extraktion, Destillation, Kristallisation) .
Das gegenständliche Verfahren kann jedoch auch kontinuierlich durchgeführt werden. Dazu wird die Reaktion in einem so genannten Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt, in dem hochmolekulare Stoffe - die Enzyme oder Biomasse - hinter einer Ultrafiltrationmembran zurückgehalten werden und niedermolekulare Stoffe - wie die produzierten Aminosäuren - die Membran passieren können. Eine derartige Verfahrensweise wurde im Stand der Technik schon mehrfach beschrieben (Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI, S. 151ff; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684) .
Als (C1-C20) -Alkylreste sind insbesondere anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl samt aller ihrer Bindungsisomeren. Ein (Ci-C8)-Alkylrest ist sinngemäß einer, bei dem 1 bis 8 C- Atome in der Kette vorhanden sind.
(C2-C20) -Alkenylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten (Ci-C20) -Alkylrest mit mindestens einer C=C-Doppelbindung. (C2-C20) -Alkinylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten (Ci-C20) -Alkylrest mit mindestens einer C≡C-Dreifachbindung. Der Rest (C1-C2O)-AIkOXy entspricht dem Rest (C1-C20) -Alkyl mit der Maßgabe, daß dieser über ein Sauerstoffatom an das Molekül gebunden ist. Entsprechendes gilt für einen (C1- C8) -Alkoxyrest.
Als (C2-C20) -Alkoxyalkyl sind Reste gemeint, bei denen die Alkylkette durch mindestens eine Sauerstoffunktion unterbrochen ist, wobei nicht zwei Sauerstoffatome miteinander verbunden sein können. Die Anzahl der Kohlenstoffatome gibt die Gesamtzahl der im Rest enthaltenen Kohlenstoffatome an.
Die eben beschriebenen Reste können einfach oder mehrfach mit Halogenen und/oder N-, 0-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein. Dies sind insbesondere Alkylreste der oben genannten Art, welche eines oder mehrere dieser Heteroatome in ihrer Kette aufweisen bzw. welche über eines dieser Heteroatome an das Molekül gebunden sind.
Unter (C3-C8) -Cycloalkyl versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw. Cycloheptylreste etc. Diese können mit einem oder mehreren Halogenen und/oder N-, 0-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein und/oder N-, 0-, P-, S-Atome im Ring aufweisen, wie z. B. 1-, 2-, 3-, 4-Piperidγl, 1-, 2-, 3- Pyrrolidinyl, 2-, 3-Tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-Morpholinyl.
Ein (C3-C8) -Cycloalkyl- (C1-C20) -Alkylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten Cycloalkylrest, welcher über einen wie, oben angegebenen Alkylrest an das Molekül gebunden ist.
(Ci-C8) -Acyloxy bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine COO-Funktion an das Molekül gebunden ist.
(C1-C8) -Acyl bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine CO-Funktion an das Molekül gebunden ist.
Unter einem (C6-Ci8) -Arylrest wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl-, Biphenylreste oder an das betreffende Molekül annelierte Systeme der vorbeschriebenen Art, wie z.B. Indenylsysteme, welche ggf. mit (C1-C8) -Alkyl, (Ci-C8)- Alkoxy, NR1R2, (Ci-C8) -Acyl, (Ci-C8) -Acyloxy substituiert sein können. Ein (C7-C26) -Aralkylrest ist ein über einen (C1-C8) -Alkylrest an das Molekül gebundener (C6-C18) -Arylrest.
Ein (C3-C18) -Heteroarylrest bezeichnet im Rahmen der Erfindung ein fünf-, sechs- oder siebengliedriges aromatisches Ringsystem aus 3 bis 18 C-Atomen, welches
Heteroatome wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel im Ring aufweist. Als solche Heteroaromaten werden insbesondere Reste angesehen, wie 1-, 2-, 3-Furyl, wie 1-, 2-, 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 3-Thienyl, 2-,, 3-, 4-Pyridyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-Indolyl, 3-, 4-, 5-Pyrazolyl, 2-, 4-, 5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl, Phenanthridinyl, 2-, 4-, 5-, 6-Pyrimidinyl.
Unter einem (C4-C26) -Heteroaralkyl wird ein dem (C7-C26) -Aralkylrest entsprechendes heteroaromatisches System verstanden.
Als Halogene (HaI) kommen Fluor, Chlor, Brom und Iod in Frage.
Unter dem Begriff „isoliertes Enzym" wird erfindungsgemäß der Einsatz der Alkoholdehydrogenase sowie des zur Cofaktorregenerierung befähigten Enzyms aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen als isolierte Enzyme (in gereingter bzw. partiell gereingter Form oder als Rohextrakt oder in immobilisierter Form) verstanden.
Die „malic enzyme" genannte Malatdehydrogenase (MDH) katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Malat zu Pyruvat. Zahlreiche Malatdehydrogenasen aus verschiedenen Organismen sind bekannt, so u.a. aus höheren Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Es wird zwischen vier Arten von Malatdehydrogenasen unterschieden, die in den
Enzymklassen E.C. 1.1.1.37 bis EC 1.1.1.40 klassifiziert sind (http://www.genome.ad.jp) . In Abhängigkeit vom Typ der Malatdehydrogenase wird NAD und/oder NADP als Cofaktor benötigt.
Der in den Beispielen verwendete E. coli wurde durch die Anmelderin unter der Nummer DSM 14459 bei der DSMZ GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig am 24.08.01 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Figuren:
Figur 1 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pNO5c
Figur 2 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pNO8c
Figur 3 zeigt die Plasmidkarte des Plasmids pN014c
Experimenteller Teil:
Herstellung eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine (R) -Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir sowie eine Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum
Stanunherstellung
Chemisch kompetente Zellen von E. coli DSM14459 (beschrieben in Patent W003/042412) wurden mit dem Plasmid pNO5c transformiert (Sambrook et al. 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press) .Dieses Plasmid kodiert für die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (Lactobacillus kefir alcohol dehydrogenase: a useful catalyst for synthesis. Bradshaw et al. JOC 1992, 57 1532-6, Reduction of acetophenone to R(+) -phenylethanol by a new alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir. Hummel W. Ap Microbiol Biotech 1990, 34, 15-19) . Der rekombinante E. coli DSM14459 (pNO5c - Fig. 1) wurde chemisch kompetent gemacht und mit dem Plasmid pNO8c (Fig. 2) transformiert, welches das Gen einer codonoptimierten Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum codiert (Bright,J.R. et al., 1993 Eur. J. Biochem. 211:549-554) . Beide Gene stehen unter Kontrolle eines Rhamnosepromotors (Stumpp, Tina; Wilms, Burkhard; Altenbuchner, Josef. A new, L-rhamnose-inducible expression System for Escherichia coli. BIOspektrum (2000) , 6(1) , 33-36) . Sequenzen und Plasmidkarten von pN05c und pNO8c sind unten angegeben. Herstellung aktiver Zellen
Eine Einzelkolonie von E . coli DSM14459 (pN05c , pN08c) wurde in 2ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) 18 Stunden bei 37 °C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert . Diese Kultur wurde 1 : 100 in frischem LB-Medium mit Rhamnose (2g/ 1) als Induktor , Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) und ImM ZnCl2 verdünnt und 18 Stunden bei 300C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert . Zellen wurden zentrifugiert (10000g, 10min, 40C) , der Überstand verworfen und das Zellpellet direkt oder nach Lagerung bei -2O 0C in Biotransformationsversuchen eingesetzt .
Herstellung eines Ganzzellkatalysators , enthaltend eine
(S) -Alkoholdehγdrogenase aus Rhodococcus erythropolis sowie eine Glucosedehydrogenase aus Bacillus subtilis
Stammherstellung
Chemisch kompetente Zellen von E . coli DSM14459
(beschrieben in Patent W003/042412 ) wurden mit dem Plasmid pN014c transformiert (Sambrook et al . 1989 , Molecular cloning : A Labor atory Manual , 2nd Edition , CoId Spring Harbor Laboratory Press) . Dieses Plasmid kodiert für eine Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (Cloning , sequence analysis and heterologous expression of the gene encoding a (S) -specific alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis DSM 43297 . Abokitse , K . ; Hummel , W. Applied Microbiology and Biotechnology 2003 , 62 380-386) und einer Glucosedehydrogenase aus Bacillus subtilis
(Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli . I : Purification , characterization and comparison with glucose dehydrogenase from Bacillus megaterium. HiIt W; Pfleiderer G; Fortnagel P Biochimica et biophysica acta (1991 Jan 29), 1076(2), 298-304). Die Alkoholdehydrogenase steht unter der Kontrolle eines Rhamnosepromotors (Stumpp, Tina; Wilms, Burkhard; Altenbuchner, Josef. A new, L-rhamnose-inducible expression system for Escherichia coli. BIOspektrum (2000), 6(1), 33-36). Die Sequenz und Plasmidkarte von pN014c ist unten angegeben.
.
Herstellung aktiver Zellen
Eine Einzelkolonie von E.coli DSM14459 (pN014c - Fig. 3) wurde in 2ml LB-Medium mit Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) 18 Stunden bei 37° C, geschüttelt (250 upm) , inkubiert. Diese Kultur wurde 1:100 in frischem LB-Medium mit Rhamnose (2g/l) als Induktor, Antibiotikazusatz (50μg/l Ampicillin und 20 μg/ml Chloramphenical) und ImM ZnCl2 verdünnt und 18 Stunden bei 300C , geschüttelt (250 upm) , inkubiert. Zellen wurden zentrifugiert (10000g, 10min, 4°C) , der Überstand verworfen und das Zellpellet direkt, oder nach Lagerung bei -2O0C in Biotransformationsversuchen eingesetzt.
Beispiele für die Herstellung von Zimtalkohol und trans-2- Hexen-1-ol:
Beispiel 1: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 0.2 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase
In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO14c) mit einer Alkoholdehydrogenase (E. coli, (S)- Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis, Glucosedehydrogenase aus B. subtilis) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 24 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 8 mmol
Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 0.2 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird (auf pH 6.5) . In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 93% nach 1 Stunde und 100% nach 2h.
Beispiel 2: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 0.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase
In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pN014c) mit einer Alkoholdehydrogenase (E. coli, (S)- Alkoholdehydrogenase aus R. erythropolis, Glucosedehydrogenase aus B. subtilis) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 16 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 20 mmol Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer- von 0.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 25 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird (auf pH 6.5). In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 44% nach 1 Stunde, 91% nach 5h und 93% nach 25h.
Beispiel 3: Reduktion von Zimtaldehyd in einer 1.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine (R)-selektive Alkoholdehydrogenase
In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO5c,pNO8c) mit einer (R)-selektiven Alkoholdehydrogenase (E. coli, (R)-Alkoholdehydrogenase aus L. kefir, Glucosedehydrogenase aus T. acidophilum) in einer Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 30 ergibt, 1.05 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 60 mmol
Zimtaldehyd (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 1.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (5M NaOH) konstant gehalten wird. In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des Zimtaldehyds zum Zimtalkohol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 15% nach 1 Stunde, 58% nach 5 Stunden und 98% nach 23.5 Stunden. Beispiel 4 (Vergleichsbeispiel) : Umsetzung von trans-2- Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Formiatdehydrogenase zur Cofaktorregenerierung
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trans-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADH (3.5 mM, entsprechend 0.035 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Natriumformiat (455 mM, entsprechend 4.55 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 20 U/mmol einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 20 U/mmol einer
Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii, lässt man bei einer Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 7% nach 5h und 16% nach 72 Stunden.
Beispiel 5: Umsetzung von traπs-2-Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur Cofaktorregenerierung
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trai-S-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADH (1.4 mM, entsprechend 0.014 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Glucose (300 mM, entsprechend 3 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 20 U/mmol einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 150 U/mmol einer Glucosedehydrogenase aus Bacillus sp., lässt man bei einer Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 64% nach 5h und 72% nach 72 Stunden. Beispiel 6: Umsetzung von. trans-2-Hexenal bei 100 mM unter Einsatz einer Glucosedehydrogenase zur Cofaktorregenerierung
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus trans-2-Hexenal (100 mM) , sowie NADPH (1 mM, entsprechend 0.01 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) , Magnesiumchlorid (5 mM) , Glucose (300 mM, entsprechend 3 Äquivalente bezogen auf den Aldehyd) bei Enzymmengen von 13 U/mmol einer (R) -ADH aus L. kefir und 60 U/mmol einer Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum, lässt man bei einer
Reaktionstemperatur von 300C über einen Zeitraum von 72 Stunden in 1 mL eines Phosphat-Puffers (100 mM; pH 7.0) rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 40% nach Ih, 79% nach 5h und 86% nach 72 Stunden.
Beispiel 7: Reduktion von trans-2-Hexenal in einer 0.5 M Lösung unter Einsatz eines Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase und Glucosedehydrogenase
In einem Titrino-Reaktionsgefäß werden zu 40 mL eines
Phosphatpuffers (eingestellt auf pH 7.0) bei Raumtemperatur der zuvor beschriebene Ganzzellkatalysator E.coli DSM14459 (pNO5c,pNO8c) mit einer (R) -selektiven Alkoholdehydrogenase (E. coli, (R) -Alkoholdehydrogenase aus L. kefir, Glucosedehydrogenase aus T. acidophilum) in einer
Zellkonzentration, die eine optische Dichte von OD = 27 ergibt, 6 Äquivalente Glukose (Äquivalente sind bezogen auf Menge an eingesetztem Zimtaldehyd) und 20 mmol trans-2- Hexenal (entsprechend einer Substratkonzentration bezogen auf eingesetztem Phosphatpuffer von 0.5 M) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von Natronlauge (2M NaOH) konstant gehalten wird. In regelmäßigen Abständen werden Proben entnommen und der Umsatz des trans-2-Hexenal zum trans-2-Hexen-l-ol mittels HPLC ermittelt. Die Umsätze lagen bei 24% nach 1 Stunde, 61% nach 5 Stunden und >99% nach 24 Stunden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen durch
Reduktion von Aldehyden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in Gegenwart eines rekombinanten Ganzzellkatalysators, enthaltend eine Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym, durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in Gegenwart eines rekombinanten
Ganzzellkatalysators, enthaltend eine
Alkoholdehydrogenase sowie ein zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen, durchführt.
3. Verfahren zur Herstellung von primären Alkoholen durch Reduktion von Aldehyden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in Gegenwart einer isolierten
Alkoholdehydrogenase sowie einem zur
Cofaktorregenerierung befähigten isolierten Enzym aus der Gruppe der Glucosedehydrogenasen bzw. Malatdehydrogenasen durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man 2-trans-Hexenal, 2-cis-Hexenal, 3-trans-Hexenal, 3-cis-Hexenal und/oder Zimtaldehyd als Aldehydkomponente einsetzt.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Alkoholdehydrogenase eine Alkoholdehydrogenase aus einem Lactobacillus Stamm, insbesondere aus Lactobacillus kefir und Lactobacillus brevis, oder aus einem Rhodococcus Stamm, insbesondere aus Rhodococcus erythropolis, einsetzt.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym eine Glucosedehydrogenase, vorzugsweise aus Bacillus-, Thermoplasma- und Pseudomonas-Stämmen, oder eine Formiatdehydrogenase, vorzugsweise aus Candida- und Pseudomonas-Stämmen, einsetzt.
7. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als zur Cofaktorregenerierung befähigtes Enzym eine Malatdehydrogenase eingesetzt wird.
8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, sofern sich die Ansprüche auf den Einsatz eines Ganzzellkatalysators beziehen, dadurch gekennzeichnet, dass man E. coli als Wirtsorganismus verwendet.
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