EP1768654A2 - Selektive hemmstoffe humaner corticoidsynthasen - Google Patents

Selektive hemmstoffe humaner corticoidsynthasen

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EP1768654A2
EP1768654A2 EP05769814A EP05769814A EP1768654A2 EP 1768654 A2 EP1768654 A2 EP 1768654A2 EP 05769814 A EP05769814 A EP 05769814A EP 05769814 A EP05769814 A EP 05769814A EP 1768654 A2 EP1768654 A2 EP 1768654A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
hydrogen
alkyl
hydroxy
radicals
pyridine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05769814A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rolf Hartmann
Sarah Ulmschneider
Ursula MÜLLER-VIERA
Rita Bernhardt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
POMBIOTECH GmbH
Original Assignee
Universitaet des Saarlandes
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the invention relates to compounds for the selective inhibition of the human corticoids synthases CYPIIIIB and CYP1 1B2, their preparation and use for the treatment of hypercortisolism and diabetes mellitus or cardiac insufficiency and myocardial fibrosis.
  • corticosteroids Human adrenal glands are divided into two areas, the adrenal medulla and the adrenal cortex. The latter secretes a number of hormones known as corticosteroids that fall into two categories. Glucocorticoids (especially hydrocortisone or cortisol) act primarily on carbohydrate and glucose metabolism, secondarily they can retard wound healing by interfering with the inflammatory process and the formation of fibrous tissue. The second category, mineral corticoids, are involved primarily in the retention of sodium and the excretion of potassium. The most important and effective mineral corticoid is aldosterone.
  • hydrocortisone or cortisol act primarily on carbohydrate and glucose metabolism, secondarily they can retard wound healing by interfering with the inflammatory process and the formation of fibrous tissue.
  • mineral corticoids are involved primarily in the retention of sodium and the excretion of potassium. The most important and effective mineral corticoid is aldosterone.
  • glucocorticoid biosynthesis is u. a. controlled by adrenocorticotropin (ACTH).
  • ACTH adrenocorticotropin
  • CYPIIBl Steroid II ⁇ hydroxylase
  • Hypercortisolism in particular Cushing's syndrome, as well as a special form of diabetes mellitus characterized by an extreme morning increase in cortisol plasma levels.
  • cortisol Elevated cortisol levels are also associated with neurodegenerative disorders.
  • Aldosterone secretion is regulated by a variety of signals: the
  • Plasma concentrations of sodium and potassium and the multi-step renin-angiotensin-aldosterone system renin is secreted by the kidneys in response to low blood pressure releasing angiotensin I from a precursor peptide. Angiotensin I will turn to
  • Vasoconstrictor is. In addition, it acts as a hormone to stimulate the release of aldosterone (Weber, KT. & Brilla, CG., Circulation 83: 1849-1865
  • CYP11B2 aldosterone synthase
  • mitochondrial cytochrome P450 enzyme catalyzes the formation of the most potent mineral corticoid aldosterone from its steroidal substrate 11-deoxycorticosterone (Kawamoto, T. et al., Proc. Natl. Acad USA 89: 1458-1462 (1992)).
  • Excessive plasma aldosterone concentrations are associated with and contribute to the progression of these diseases, such as congestive heart failure and congestive heart failure, myocardial fibrosis, ventricular arrhythmia, cardiac fibroblast stimulation, cardiac hypertrophy, renal perfusion and hypertension (Brilla, CG, Herz 25: 299-306 (2000)).
  • RAAS renin-angiotensin system
  • its pathophysiological activation occurs in particular in patients with chronic heart failure or renal underperfusion or renal artery stenoses (Young, M., Funder, JW, Trends Endocrinol, Metab., 11: 224 -226 (2000)).
  • both elevated plasma aldosterone and angiotensin II levels as well as cardially locally-secreted aldosterone induce fibrotic structural changes of the myocardium, as a result of which the formation of myocardial fibrosis leads to further reduction Cardiac function (Brilla, CG, Cardiovasc., Res. 47: 1-3 (2000); Lijnen, P. & Petrov, VJ Mol. Cell. Cardiol. 32: 865-879 (2000)).
  • Fibrotic structural changes are characterized by the formation of tissue characterized by an abnormally high amount of fibrotic material (mainly collagen strands). Such fibroses are in some situation, e.g. wound healing, useful, but may be harmful, i.a. if they affect the function of internal organs. In myocardial fibrosis, the heart muscle is traversed by fibrotic strands that make the muscle stiff and inflexible, thereby impairing its function. Since even in patients with mild heart failure mortality is 10-20%, it is urgently necessary to intervene here with a suitable drug therapy. Despite long-term treatment with digitalis glycosides, diuretics, ACE inhibitors or AT II antagonists, plasma aldosterone levels remain elevated in patients and the medication has no effect on fibrotic structural changes.
  • fibrotic material mainly collagen strands
  • Mineralcorticoid antagonists in particular aldosterone blocking agents, are already the subject of numerous patents or patent applications.
  • the steroidal mineralocorticoid receptor antagonist spironolactone (17-hydroxy-7-alpha-mercapto-3-oxo-17 ⁇ -pregn-4-ene-21-carboxylic acid ⁇ -lactone acetate; Aldactone ®) aldosterone Receptors competitively blocked to aldosterone, thus preventing the receptor-mediated aldosterone effect.
  • US 2002/0013303, US 6,150,347 and US 6,608,047 describe the dosage of spironolactone for the therapy or prevention of cardiovascular diseases and myocardial fibrosis while maintaining the normal electrolyte and water balance of the patient.
  • Mespirenone (15,16-methylene-17-spirolactones) and its derivatives have been considered as promising alternatives to spironolactone because they have only a low percentage of the spironolactone antiandrogenic activity (Losert, W. et al., Drug Res. 36: 1583-1600 (nickisch, K. et al., J Med Chem 30 (8): 1403-1409 (1987); Nickisch, K. et al., J. Med. Chem. 34: 2464-2468 (1991); Agarwal , MK, Lazar, G., Renal Physiol., Biochem., 14: 217-223 (1991)).
  • Mespirenone blocks aldosterone biosynthesis as part of a complete mineral corticoid biosynthesis inhibition (Weindel, K. et al., Arzneiffenfor ⁇ tion 41 (9): 946-949 (1991)). However, like spironolactone, mespirenone inhibits aldosterone biosynthesis only in very high concentrations.
  • WO 01/34132 describes methods for the treatment, prevention or blocking of pathogenic changes due to vascular injury (restenosis) in mammals by the administration of an aldosterone antagonist, namely eplerenone (an aldosterone receptor antagonist) or related structures which are partially epoxysteroidal and all derived from 20-spiroxanes.
  • WO 96/40255 US 2002/0123485, US 2003/0220312 and US 2003/0220310 describe therapeutic methods for the treatment of cardiovascular diseases, myocardial fibrosis or cardiac hypertrophy by using a combination therapy of an angiotensin II antagonist and an epoxy-steroidal aldosterone receptor Antagonists such as Eplerone or Epoxymexrenone.
  • Selective aldosterone synthase inhibitors may also be a promising class of drugs that, after myocardial infarction, promote the healing of compromised myocardial tissue with reduced scarring, thereby reducing the incidence of serious complications.
  • WO 01/76574 describes a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of aldosterone formation or one of its pharmaceutically acceptable salts, optionally in combination with other active substances.
  • WO 01/76574 relates to the use of non-steroidal inhibitors of aldosterone formation which were commercially available at that time, in particular to the (+) - enantiomer of fadrozole, a 4- (5,6,7,8-tetrahydroimidazo (1, 5) a) pyridin-5-yl) benzonitrile, and its synergistic effect with angiotensin II receptor antagonists.
  • Anastrozole (Arimidex ®) and Exemestane (Coromasin ®) are other non ⁇ steroidal aromatase inhibitors. Their field of application is the treatment of breast cancer by inhibiting aromatase, which converts androstenedione and testosterone into estrogen.
  • the human steroid II ⁇ hydroxylase CYPIIIB1 shows greater than 93% homology to human CYPl 1B2 (Kawamoto, T. et al., Proc Natl Acad, See, USA 89: 1458-1462 (1992); Taymans, SE et al al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83: 1033-1036 (1998)).
  • strong inhibitors of aldosterone synthase must not affect steroid IL ⁇ hydroxylase and must therefore be tested for their selectivity.
  • nonsteroidal inhibitors of aldosterone synthase should preferably be used as therapeutics, since fewer side effects on the endocrine system are to be expected. This has been pointed out in previous studies, as well as the fact that the development of selective CYP11B2 inhibitors that do not affect CYPIIBl is hampered by the high similarity of the two enzymes (Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem 81: 173-179 (2002); Hartmann, R. et al., Eur. J. Med. Chem. 38: 363-366 (2003)).
  • the inhibitors should also interfere as little as possible with other P450 (CYP) enzymes.
  • CYP P450
  • the only drug known today that affects corticoid synthesis in humans is the aromatase (estrogen synthase, CYP19) inhibitor fadrozole, which is used in breast cancer therapy. It may also affect aldosterone and cortisone levels, but only at ten times the therapeutic dose (Demers, LM et al., J. Clin Endocrinol, Metabol 70: 1162-1166 (1990)).
  • Schizosaccharomyces pombe cells stably expressing human CYPl 1B2 and for subsequent selection of selectivity with V79MZ cells stably expressing either CYPl 1B2 or CYPIIBI (Ehmer, et al.
  • Inhibitor of human CYPl 1B2 (and strong aromatase inhibitor) and four others identified as non-selective but more potent than CYPIIBl inhibitors (A: CYP11B2 inhibitor; B 1 D: non-selective CYPIII inhibitors):
  • Structures were strong CYPIIBl inhibitors and therefore should not be considered for immediate use as selective CYP11B2 inhibitors.
  • R 1 , R 2, R 4, R 5 independently of one another, hydrogen, C 4 alkyl, C 2-4 alkenyl, C 3 - 6 cycloalkyl, hydroxy, Ci -4 alkoxy, Ci -4 hydroxyalkyl, halo, nitro or optionally substituted amino, and one of R 1 , R 2 , R 4 , R 5 is hydrogen; R 3 is a 4-imidazolyl radical; R 6 is hydrogen; R 7 is hydrogen or Ci- 4 alkyl; R 8
  • Ci- 4 alkyl hydroxy, or Ci -4 alkoxy
  • R 9 is hydrogen or Ci_ 4 alkyl
  • R 1 , R 2 , R 4 and R 5 are hydrogen or one to three of R 1 , R 2 , R 4 , R 5 independently halogen, hydroxy, NH 2, halo-Ci- 6 alkyl, CI_ 6 - alkyl, Ci 6 alkoxy, or HO- (Ci- 6) alkyl;
  • R 3 is a 4-imidazolyl radical;
  • R 6 and R 7 are hydrogen; one of R 6 , R 7 , R 8 and R 9 is a cyclic radical selected from phenyl, naphthyl, tetrahydronaphthyl, C 3-7 cycloalkyl and C 5-7 cycloalkenyl, or a methyl radical containing such a cyclic radical and optionally one or two Ci -6 -Al ky I residues carries two of the radicals R 6,
  • Undanylidenemethyl pyridine (CAS132819-71-7), Z-2- (1-undanylidenemethyl) -r-methylpyrene and Z-2- (undanylidenemethyl) benzothiazole.
  • Reaction conditions (a) NaBH 4 , MeOH / CH 2 Cl 2 , 15 min at 0 ° C., 1 h at RT; (b) PPh 3 HBr, benzene, 12h, reflux; (c) EtONa, 4 (5) -imidazole carboxaldehyde, N 2 , 12h, reflux; (d) Isomer separation by flash column chromatography.
  • the invention thus provides
  • R 1 and R 2 are independently selected from H, halo, CN, hydroxy, nitro, alkyl, alkoxy, alkylcarbonyl, alkylcarbonyloxy, alkylsulfinyl and alkylsulfonyl (wherein the alkyl radicals are straight, branched or cyclic, saturated or unsaturated and having 1 to 3 radicals R 12 may be substituted), aryl and Heteroaryl radicals and their partially or completely saturated equivalents, which may be substituted by 1 to 3 radicals R 12 , aryloxy and heteroaryloxy radicals, where aryl and heteroaryl have the abovementioned meaning, -COOR 11 , -SO 3 R 11 , -CHO, - CHNR 11 , -N (R n ) 2 , -NHCOR 11 and - NHS (O) 2 R 11 ;
  • R 3 is selected from nitrogen-containing monocyclic or bicyclic heteroaryl radicals and their partially or fully saturated equivalents, which may be substituted with 1 to 3 R 12 radicals and have at least one nitrogen atom not bonded to the methylidene C atom and unsubstituted;
  • R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 and R 10 are independently selected from H, halo, CN, hydroxy, nitro, lower alkyl, lower alkoxy, lower alkylcarbonyl, lower alkylcarbonyloxy, lower alkylcarbonylamino, lower alkylsulfonylamino, lower alkylthio, lower alkylsulfinyl and lower alkylsulfonyl (wherein the lower alkyl groups may be straight, branched or cyclic, saturated or unsaturated and substituted with 1 to 3 R 12's ), -N (R n ) 2 , -COOR 11 and -SO 3 R 11 , or
  • R 8 or R 9 with R 6 or R 7 and / or with R 8 or R 9 of the adjacent C atom form one or two double bonds
  • R 8 (and R 9 ) with R 6 (and R 7 ) or with R 8 (and R 9 ) of the adjacent C atom and the associated carbon atoms form a saturated or unsaturated fused aryl or heteroaryl ring
  • the atoms of the fused aryl or heteroaryl ring can be substituted by 1-3 radicals R 12 , or R 4 and R 10 together form a methylene, ethylene or ethylidene bridge, it being possible for the atoms of the bridge to be substituted by one or two radicals R 12 , or a ring atom in the ortho position of the heteroaryl radical of R 3 directly or via a methylene radical or methylidene bridge forms a bond with R 6 and / or R 7 , wherein the bridging atom may be substituted with one or two R 12 radicals;
  • R 11 is
  • Lower alkylsulfonyl hydroxy-lower alkyl, hydroxy-lower alkoxy, hydroxy-lower alkylcarbonyl, hydroxy-lower alkylcarbonyloxy, hydroxy-lower alkylcarbonylamino, hydroxy-lower alkylthio, hydroxy-lower alkylsilinyl, hydroxy-lower alkylsulfonyl, mono- and bis (hydroxy-lower alkyl) amino and mono- and polyhalogenated Lower alkyl (wherein the lower alkyl groups may be straight chain, branched or cyclic, saturated or unsaturated); n is an integer from 1 to 3; or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the treatment of hypercortisolism, diabetes mellitus, heart failure and
  • n 1, R 1 , R 2 and R 4 - R 10 is hydrogen, then R 3 is not 4-imidazolyl or 4-pyridyl;
  • n 1, R 1 and R 4 - R 10 is hydrogen and R 2 is F, Cl, Br or CN, then R 3 is not 4-imidazolyl;
  • R 3 is not 4-imidazolyl, 4-pyridyl, 4-methyl-3-pyridyl or 3-nitroimidazo [1, 2] a] pyrid-2-yl;
  • n 1 or 2;
  • three of the radicals R 1, R 2, R 4 and R 5 are independently hydrogen, Ci -4 alkyl, C 2-4 alkenyl, C 3-7 cycloalkyl, hydroxy, Ci -4 alkoxy, hydroxy-Ci - 4 -alkyl, halogen, trifluoromethyl, nitro or optionally substituted amino and the fourth radical of R 1 , R 2 , R 4 and R 5 is hydrogen, R 6 is hydrogen, R 7 is hydrogen or Ci -4 -Al ky I is , R, Ci -4 -Al ky I, hydroxy, or Ci -4 alkoxy 8 is hydrogen, R 9 and R 10 are independently hydrogen or Ci -4 alkyl, then R3 is not 4-imidazolyl;
  • n 1 or 2
  • three of the radicals R 1, R 2, R 4 and R 5 are independently hydrogen, hydroxy, amino, halo Ci -6 alkyl, Ci -6 alkyl, Ci -6 alkoxy or hydroxy-Ci- 6 are alkyl and the fourth radical selected from R 1, R 2, R 4 and R 5 is hydrogen, one of R 6 , R 7 , R 8 and R 9 is C 3-7 -cycloalkyl, C 5-7 -cycloalkenyl, C 3-7 -
  • Cycloalkylmethyl or C 3-7 -Cycloalkenylmethyl is, the methyl group may be substituted with one or two Ci -6 -Al ky I residues, two of the radicals R 6, R 7, R 8 and R 9 are independently hydrogen, hydroxy, C - 6 alkyl, halo-Ci- 6 -alkyl, Ci -6 -alkoxy or hydroxy-Ci -6- alkyl, and the remaining radicals R 6 , R 7 , R 8 and R 9
  • R 10 is hydrogen or C 6 -alkyl, then R 3 is not 4-
  • R 4 - R 10 is hydrogen, then R 3 is not 4-pyridyl;
  • n 2
  • R 1 is hydrogen
  • R 2 is hydroxy
  • Ci -4 -alkoxy or Ci -4 Al -Al is kylcarbonyloxy
  • R 4 - R 9 is hydrogen
  • R 10 is hydrogen or Ci -4 alkyl
  • R 3 is not 4-
  • n 1, R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 8 - R 10 is hydrogen, R 6 and R 7 are both hydrogen or both methyl, then R 3 is not 2-pyridyl;
  • R 3 is not 4-methyl-3-pyridyl or its pharmaceutically acceptable salts
  • Alkyl radicals and “alkoxy radicals” in the context of the invention may be straight-chain, branched or cyclic and be saturated or (partially) unsaturated. Preferred alkyl radicals and alkoxy radicals are saturated or have one or more double and / or triple bonds.
  • straight-chain or branched alkyl radicals those with 1 to 10 C atoms, in particular those with 1 to 6 C atoms, are particularly preferred.
  • cyclic alkyl radicals mono- or bicyclic alkyl radicals having 3 to 15 C atoms, in particular monocyclic alkyl radicals having 3 to 8 C atoms, are particularly preferred.
  • “Lower alkyl radicals” and “lower alkoxy radicals” for the purposes of the invention are straight-chain, branched or cyclic saturated lower alkyl radicals and lower alkoxy radicals or those having a double or triple bond. In the case of the straight-chain ones, those having 1 to 6 C atoms, in particular having 1 to 3 C atoms, are particularly preferred. In the cyclic ones, those having 3 to 8 C atoms are particularly preferred.
  • “Aryls” for the purposes of the present invention include mono-, bi- and tricyclic aryl radicals having 3 to 18 ring atoms, which may optionally be fused with one or more saturated rings.
  • anthracenyl dihydronaphthyl, fluorenyl, hydrindanyl, indanyl, indenyl, naphthyl, naphthenyl, phenanthrenyl, phenyl and tetralinyl.
  • 'heteroaryl radicals' are mono- or bicyclic heteroaryl radicals having 3 to 12 ring atoms, which preferably have 1 to 5 heteroatoms selected from nitrogen, oxygen and sulfur and which may be fused with one or more saturated rings.
  • the preferred nitrogen-containing monocyclic and bicyclic heteroaryls include benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, quinazolinyl, quinolyl, quinoxalinyl, cinnolinyl, dihydroindolyl, dihydroisoindolyl, dihydropyranyl, dithiazolyl, homopiperidinyl, imidazolidinyl, imidazolinyl, imidazolyl, indazolyl, indolyl, isoquinolyl, isoindolyl, isothiazolidinyl, isothiazolyl, Isoxazolidinyl, isoxazolyl, morpholinyl, oxadiazolyl, oxazolidinyl, oxazolyl, phthalazinyl, piperazinyl, piperidyl, pteridinyl, purinyl, pyrazolidin
  • mono- or bicyclic heteroaryl radicals having from 5 to 10 ring atoms, which preferably have from 1 to 3 nitrogen atoms, very particular preference to isoquinolyl, imidazolyl, pyridyl and pyrimidyl.
  • Anelliere aryl or heteroaryl rings in the context of the present invention include such monocyclic rings having 5 to 7 ring atoms, which are fused via two adjacent ring atoms with the adjacent ring. They can be saturated or unsaturated.
  • the fused heteroaryl rings comprise 1 to 3 heteroatoms, preferably nitrogen, sulfur or oxygen atoms, more preferably oxygen atoms.
  • Preferred fused aryl rings are cyclohexyl, cyclohexenyl, cyclopentyl, cyclopentenyl and benzyl
  • preferred heteroaryl rings are furanoyl, dihydropyranyl, pyranyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyridyl and pyrimidyl.
  • “Pharmaceutically acceptable salts” for the purposes of the present invention thereby include salts of the compounds with organic acids (such as lactic acid, acetic acid, amino acid, oxalic acid, etc.), inorganic acids (such as HCl, HBr, phosphoric acid, etc.) and, if the compounds have acid substituents , also with organic or inorganic bases. Preferred are salts with oxalic acid and HCl. Preferred compounds of embodiment (1) of the invention are those having the formulas (Ia) to (Ig), the compounds of the formula (Ia), (Ib), (Ic) and (Id) being particularly preferred:
  • a preferred embodiment of the compounds (Ia), (Ib) and (Ic) are the compounds of the following formula (Ih):
  • R 1 is H, halogen, CN, O-alkyl, O-alkenyl, O-alkynyl, alkyl, alkenyl or alkynyl, n is 1-3 and Het is a heteroaromatic with 5-10 ring atoms with 1-3 nitrogen atoms, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • a particularly preferred embodiment of the compounds (Ia), (Ib) and (Ic) are the compounds of the following formula (Ii):
  • R 1 is H, halogen, CN, O-alkyl, O-alkenyl, O-alkynyl, alkyl, alkenyl or alkynyl, n is 1 or 2 and the double bonds have E or Z configuration, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • R 1 or R 2 are independently selected from hydrogen , Halogen, CN, hydroxy, Ci-io-alkyl and Ci-I 0 -Al koxyresten, wherein the alkyl radicals or alkoxy radicals are straight-chain and saturated and may be substituted by 1 to 3 radicals R 12 ; and or
  • R 3 is selected from nitrogen-containing monocyclic heteroaryl radicals having 5 to 10 ring atoms and 1 to 3 nitrogen atoms, in particular selected from isoquinolyl, imidazolyl, oxazolyl, pyrazinyl, pyrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyrrolyl, thiazolyl, triazinyl and triazoyl; and or
  • R 4, R 5, R 6, R 7, R 8, R 9, R CN, hydroxy and Ci 10 are independently selected from H, halogen, Ci -6 alkyl and koxyresten -6 -alkyl, which may be substituted by 1 to 3 radicals R 12 ; and or
  • R 12 is selected from H, halogen, hydroxyl, CN, Ci- 3 alkyl and Ci -3 -alkoxy; and or
  • Particularly preferred compounds of this type are those of the formulas (I) and (Ia) to (Ig), in particular compounds of the formulas (Ia) to (Ic) in which
  • R 1 or R 2 is hydrogen
  • the other of the substituents R 1 or R 2 is selected from H, fluorine, chlorine,
  • R 3 is selected from isoquinolyl, pyridyl, imidazolyl and pyrimidyl; and (iv) R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 , R 9 , R 10 are H.
  • R 1 or R 2 is selected from H, fluoro, chloro, CN, hydroxy, Ci -3 alkyl, and Ci -3 alkoxy;
  • R 3 is selected from pyridyl, imidazolyl, isoquinolyl and pyrimidyl;
  • R 5, R 6, R 7, R 8, R 9 and R 12 are H; and
  • V is a double bond.
  • the compounds of formula (I) may be in E and Z configuration depending on the position of substituents R 3 and R 10 .
  • the present invention encompasses both the mixture of isomers and the isolated E and Z compounds.
  • the compounds (I) have chiral centers (eg, the C atoms substituted with R 6 / R 7 and R 8 / R 9 ). Again, both the mixtures of the stereoisomers and the isolated individual compounds of the invention are included.
  • Preferred compounds of the formula (I) are the following compounds: E, Z-3- (1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-ylidenemethyl) -pyridine, E, Z-3- (6-fluoro-1, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-ylidenemethyl) -pyridine, E, Z-3- (6-chloro-l, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-ylidene-methyl) -pyridine, E, Z-3 ( 6-methoxy-l, 2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenemethyl) pyridine, E, Z-3- (7-fluoro-1, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-ylidenemethyl) -pyridine, E, Z-3- (7-chloro-l, 2,3,4-tetrahydronaphth-l -ylidenemethyl) pyridine, E, Z-3- (7-methoxy-1,2,
  • the chemical compounds according to the invention can be synthesized in the process according to embodiment (3) by reducing the compound (II) to the corresponding alcohol and an adjoining Wittig reaction (cf., Examples 1-3).
  • the process preferably takes place according to the following general synthesis scheme:
  • Reaction conditions (a) NaBH 4 , MeOH / CH 2 Cl 2 , 15 min at 0 ° C., 1 h at RT; (b) PPh 3 «HBr, benzene, 12 h reflux; (c) heterocyclic carbonyl compound (III), base (preferably K 2 CO 3 with 18-crown-6, or EtONa), 12 h reflux.
  • the key step of the synthesis is a Wittig reaction using various heterocyclic carbonyl compounds, preferably aldehydes, and suitable salts, in particular phosphonium salts, of the bicyclic component.
  • a suitable reducing agent preferably NaBH 4
  • alcohol intermediates are formed. These are converted into their phosphonium salts.
  • a suitable base in particular K 2 CO 3 , for example in dry CH 2 Cl 2
  • a suitable phase transfer catalyst preferably 18-crown-6.
  • suitable base NaOEt for example in ethanol, without addition of a phase transfer catalyst is preferred.
  • the mixture of E and Z isomers obtained after the Wittig reaction can be used as a mixture or separated into its isomers.
  • the separation is carried out by crystallization or chromatographic methods, preferably by
  • the isomers can be converted into their stable salts, preferably in HCl or oxalic acid salts.
  • these are preferably stable hydrochlorides or oxalates, for the inventive use according to embodiment (1), these are preferably pharmaceutically acceptable salts.
  • the synthesis according to the invention can be used for the preparation of the E and Z isomers of the compounds according to the invention.
  • the yields can be increased drastically by the synthesis of the invention compared to previously known methods (up to 90%), in particular, the proportion of Z-isomer in the product can be significantly increased.
  • a preferred application of the synthesis is therefore the preparation of the Z-isomers of the compounds according to embodiment (3) of the invention.
  • the compounds of structure (Id) can be prepared in a four-step synthesis starting from acenaphthene or a suitable derivative thereof, optionally followed by purification eg by chromatographic separation (see also the reaction scheme below): nitration of the acenaphene (Chen, M. et al , Ranliao Gongye 38: 21-23 (2001)) and subsequent hydrogenation (Friedman, OM et al., J. Am. Chem. Soc. 71: 3010-3013 (1949)) provides, inter alia, 3-aminoacenaphthene.
  • the mixture of the resulting bromine compounds is isolated and reacted directly in a Suzuki coupling with 3-pyridineboronic acid to give the desired product.
  • the desired product, the acenaphthene derivative 50 is subsequently isolated, for example, by means of flash column chromatography.
  • the oil thus prepared can be converted to increase the stability in the corresponding hydrochloride.
  • Reaction conditions (a) HNO 3, in acetic anhydride for 20 hours at 1O 0 C; (b) H 2 , Pt / C (5%), in THF; (c) 1. NaNO 2, HBr, 0 ° C, 2. CuBr in HBr / toluene, O salt 0 C, the addition of the diazonium, 10 min at 0 ° C, 2 hours at 100 0 C; (d) Na 2 CO 3 solution, 3-pyridineboronic acid, in methanol, tetrakis (triphenylphosphine) palladium, N 2 , reflux, 12 h.
  • the test of the compounds according to the invention for use in accordance with embodiment (1) is carried out in in vitro test systems, preferably on more than one in wt test system.
  • the first step of these tests according to the invention comprises testing with nonspecific bovine adrenal CYPIIB from mitochondria for action of the test substances (Hartmann, R. et al., J. Med. Chem. 38: 2103-2111 (1995)).
  • the second step involves testing with human CYPIIB enzymes, preferably human CYPIIBI and CYP11B2.
  • human enzymes can either be expressed recombinantly, in particular in Schizosaccharomyces pombe or V79 cells, or in a tested human cell line, in particular the adrenocortical tumor cell line NCI-H295R (see example 5).
  • substances for use according to the invention according to (1) which have an effect on human CYPIIB enzymes, since there is no or only a very slight correlation between test data with bovine and human enzymes (compare Example 9).
  • fission yeast and V79MZh cells recombinantly expressing CYPIIB1 and CYP11B2 and NCI-H295R cells are suitable for the identification of novel therapeutically active compounds according to embodiment (1) for humans.
  • the compounds 41b, 42b, 44b, 45a, 45b, 48b, 49b are particularly suitable of the imidazole derivatives, which in comparison to the non-selective CYP inhibitor ketoconazole (78%) has a high inhibitory activity in the range of 90% (Table 4).
  • the Z isomers are particularly suitable for use according to (5), Z-4- (5-chloro-1-indanylidenemethyl) imidazole is most preferably 48 b ( Ex. 9); the latter is a highly potent CYP11B2 inhibitor (IC 50 : 4 nM), which has a five-fold selectivity in comparison with CYPIIBI (IC 50 : 20 nM).
  • a screening test can be used in recombinant S. pombe, especially CYPIIB2-expressing S. pombe Pl (Ex. 5A).
  • S. pombe especially CYPIIB2-expressing S. pombe Pl (Ex. 5A).
  • CYPIIB2-expressing S. pombe Pl Ex. 5A
  • For a further investigation on the use according to use (5) are then selected especially those compounds which show a higher inhibitory effect than the reference fadrozole.
  • compounds can be tested for their use according to (5) in V79 MZh cells (hamster lung fibroblasts) expressing either CYPIII Bl or CYPl 1B2 for their activity and selectivity (Ex. 5B).
  • V79 MZh cells hamster lung fibroblasts
  • CYPIII Bl CYPIII Bl
  • CYPl 1B2 CYPl 1B2
  • Different inhibition profiles are found: inhibitors which are either selective for CYPIIB1 or for CYP1B2, and inhibitors which can inhibit both CYPIIB enzymes.
  • the imidazole derivatives 41b, 42b, 44b, 45a, 45b, 46a, 48a and 49a and the compounds 6a, 8a, IQa, 13b are particularly suitable for the selective inhibition of CYP11B2 the imidazole derivatives 48b and 49b and many others of the compounds presented here (see Examples 6-9).
  • the inhibition of CYP19 by the test compounds can be performed in vitro using human placental microsomes and [I ⁇ , 2 ⁇ - 3 H] testosterone as substrate (modified according to: Thompson, EA Jr. & Siterii, PK, J. Biol. Chem. 249: 5364-5372 (1974)) (Example 4).
  • the inhibition of CYP 17 by the test substances can be determined in vitro with microsomes from E. coli recombinantly expressing CYP17 and progesterone as substrate (Example 4).
  • the NCI-H295R cell line is commercially available and is often used as a model for the human adrenal cortex.
  • the cells were first isolated in 1980 (Gazdar, AF et al., Cancer Res. 50: 5488-5496 (1990)) and contain 5 steroidogenic CYP450 enzymes, including 17-alpha-hydroxylase, CYPIIIBl and CYP11B2. Because all steroidogenic CYP enzymes found in the adrenal cortex are expressed in this cell line, it is an important tool in estimating the selectivity of inhibitors in vitro.
  • NCI-H295R is human cells, but also that in V79MZhllBl or V79MZhllB2 only one target enzyme is recombinantly expressed in an otherwise completely CYP-enzyme-free system, while NCI-H295R represents a much more complex model.
  • NCI-H295R represents a much more complex model.
  • Compound 50 was tested in V79 cells for inhibition of CYPIII and CYPl 1B2.
  • Compound 50 inhibits human aldosterone synthase in the deep nanomolar range and additionally shows only a very weak inhibition of the human CYPIIB.
  • the substance is not only highly potent but also very selective.
  • the substances of formula (I) which are suitable for use in accordance with embodiment (5) can be used to develop a drug which can improve the quality of life of patients with cardiac insufficiency or myocardial fibrosis and decisively reduce mortality.
  • the substances of formula (I) suitable for use in accordance with embodiment (5) may further serve for the development of a drug which can improve the quality of life of patients with hypercortisolism or diabetes mellitus and decisively reduce mortality.
  • the results of the present invention clearly show that it is possible for the
  • Target enzyme CYPIIBI to develop inhibitors that are highly active, but which have little effect on CYPl 1B2, which has a high structural and functional homology to CYPIIBl.
  • the compounds of the invention are as individual compounds and in combination with other active ingredients and excipients z.
  • active ingredients and excipients z for example, for the inhibition of human and mammalian P450 oxygenases, especially for the inhibition of human or mammalian aldosterone synthase, especially for the inhibition of human aldosterone synthase CYPl 1B2 with low impairment of human CYPIIBl and vice versa for the inhibition of CYPIIBl, while low impaired CYP11B2 is suitable in vitro and in vivo.
  • CYP1B2-selective compounds can be used in the preparation of medicaments for the treatment of heart failure, (myo) cardiac fibrosis, (congestive heart failure), hypertension, and primary hyperaldosteronism in humans and mammals.
  • the CYPIIBl-selective compounds can be used in the preparation of medicaments for the therapy of hypercortisolism and diabetes mellitus.
  • These medicaments or the pharmaceutical compositions according to embodiment (4) of the invention may contain, in addition to the compounds according to the invention, further active ingredients as well as suitable excipients and carriers. Suitable excipients and carriers are determined by the person skilled in the art depending on the field of application and the form of application.
  • the invention further includes a method or use of the compound of the invention for the prevention, slowing down or treatment of any of the following diseases or conditions: diabetes mellitus, hypercortisolism, hypertension, congestive heart failure, renal failure, especially chronic renal failure, restenosis, atherosclerosis, nephropathy , Coronary heart disease, increased formation of collagen, fibrosis, each associated with or not associated with the onset of hypertension, by administration of a pharmaceutical preparation according to the invention.
  • diseases or conditions diabetes mellitus, hypercortisolism, hypertension, congestive heart failure, renal failure, especially chronic renal failure, restenosis, atherosclerosis, nephropathy , Coronary heart disease, increased formation of collagen, fibrosis, each associated with or not associated with the onset of hypertension, by administration of a pharmaceutical preparation according to the invention.
  • this method is useful for preventing, slowing the course or therapy of myocardial fibrosis, congestive heart failure or congestive heart failure and comprises administering to the subject or an active dose of an aldosterone synthase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the invention affected mammal.
  • this method is useful for preventing, slowing the course or therapy of stress-dependent refractory diabetes mellitus or hypercortisolism and comprises administering an effective dose of a steroid hydroxylase inhibitor of the invention, particularly steroid IL ⁇ hydroxylase inhibitor, or a pharmaceutical acceptable salt thereof to the affected human or the affected mammal.
  • a steroid hydroxylase inhibitor of the invention particularly steroid IL ⁇ hydroxylase inhibitor, or a pharmaceutical acceptable salt thereof to the affected human or the affected mammal.
  • Reaction conditions (a) NaBH 4 , MeOH / CH 2 Cl 2 , 15 min at 0 ° C., 1 h at RT; (b) PPh 3 «HBr, benzene, 12 h reflux; (c) heterocyclic carbonyl compound, K 2 CO 3 and 18-crown-6 in CH 2 Cl 2 , 12 h reflux.
  • 3- (2-fluorophenyl) propanoic acid (Houghton, RP et al., J.Chem.Soc.Perkin.Trans. 1: 925-931 (1984)) was synthesized as a starting material in two steps : Knoevenagel reaction of malonic acid with 2-fluorobenzaldehyde (Rabjohn, M., Org. Synth. Collective 327-329 (1963)) followed by catalytic reduction of the produced 3- (2-fluorophenyl) acrylic acid (24Jy) (Luo, J. Chem K et al., J.
  • Reaction conditions (a) pyridine, piperidine, 1) for 15 min at 6O 0 C, 2) 45 minutes at 85 0 C, 3) for 3 h at HO 0 C; (b) PtO 2 H 2 O, MeOH, 12h at RT; (c) oxalyl chloride, DMF, 12h RT; (d) AICI 3 , O 0 C, 3.5h reflux, then 12h at RT.
  • 1,3-Thiazole-5-carbaldehyde (27i) was prepared in two steps (Dondoni, A. et al., Synthesis 11: 998-1001 (1987)):
  • the alcohol thus obtained was then converted directly into the phosphonium salt.
  • 40 mmol of the alcohol and 13.7 g of triphenylphosphonium bromide (40 mmol) (Hercouet, A. & Le Corre, M., Synth., Comm., 157-158 (1988)) were suspended in 50 ml of benzene and refluxed for 12 hours under a nitrogen atmosphere , The precipitate was filtered off and dried. The solid was suspended in dry diethyl ether and stirred for 10 minutes. The phosphonium salt was filtered off and washed with diethyl ether.
  • the free base was either dissolved in acetone and an excess of oxalic acid in acetone to afford the oxalate or it was dissolved in dry diethyl ether and an excess of HCl in diethyl ether added to the hydrochloride receive.
  • IR c ⁇ V 1 v max 3022, 2934, 2841, 2427, 1609, 1548, 1455, 1016, 902, 815, 760, 749.
  • IR c ⁇ V 1 v max 3056, 3019, 2953, 2278, 1621, 1569, 1460, 1351, 860, 818, 789, 756.
  • Anal. (Ci 6 H 15 N-HCl) C; H; N. 3-rfz ') -3,4-Dihvdronaphthalin-lf2H') -ylidenennethyllPyridin-hvdrochlorid (3BO cleaning.
  • FCC EtOAc: hexane, 1: 1). Yield 18%, white solid, mp 206 0 C..
  • IR cnrT 1 v max 3046, 2936, 1524, 1458, 813, 757.
  • 1 H NMR 400 MHz, DMSO-d 6 ) ⁇ 1.63-1.69 (m, 2H, H-3).
  • IR cnrT 1 v max 3017, 2399, 1637, 1591, 1484, 1240, 936, 859.
  • Anal. (C i 5 Hi 2 NF -HCl-0.5 H 2 O) C; N; H: lime 5.21, found 4.59.3-r (Z) - (5-fluoro-2- t 3-dihydro-1H-indan-1 ylidene) methyllpyridine hydrochloride (5b1)
  • IR cm '1 v max 3050, 3014, 2395, 1552, 1244, 1224, 933, 858, 813, 705.
  • IR OTT 1 v ma ⁇ 2361, 1583, 1511, 1247, 1209, 833, 805.
  • Anal. (C i H 5 H 12 NF-HCl-0.5 H 2 O) C H, N.
  • IR cnrT 1 v max 3003, 2955, 2630, 1619, 1590, 1499, 1199, 1189, 1072, 875, 815, 790, 750.
  • Anal. (Ci 5 H 12 NCI-HCl-0.3 H 2 O) C; H; N. 4-r (E) - (5-Chloro-2- t 3-dihydro-1H-indan-1-ylidenes) methyl-1-pyridine hydrochloride (8a1) Purification: FCC (EtOAc: hexane, 1: 1) Yield 29%. yellow solid, mp 213 ° C.
  • IR cnrT 1 v max 2844, 2361, 1632, 1602, 1545, 1489, 1309, 1256, 1227, 1109, 1021, 832, 797.
  • Anal. (Ci 6 Hi 5 ON-HCl-H 2 O) C; N; H: lime. 6.22, found 5.34.
  • IR cnrT 1 v max 2386, 1602, 1586, 1543, 1502, 1236, 1124, 1035, 899, 848, 833, 801.
  • Anal. (Ci 7 H 17 ON-HCI) C; H; N. 3-r (Z) - (6-methoxy-3,4-dihydronaphthalene-1 (2H) -ylidene) -ethylpyridine-hydrochloride (13b ' ).
  • IR cnrT 1 v max 3044, 1943, 2843, 2429, 1626, 1504, 1258, 1234, 1189, 1178, 1032, 881, 853, 831, 809.
  • Anal. (Ci 7 Hi 7 ON HCl 0.3 H 2 O) C; H; N.
  • IR c ⁇ V 1 v max 3041, 2935, 2823, 1631, 1595, 1565, 1494, 1253, 1139, 820, 797.
  • Anal. (Ci 7 H 17 ON-HCl-0.6 H 2 O) C; H; N. 3-r (E) - (6-Methoxy-2- t 3-dihydro-1H-indan-1-ylidenes) -ethylpyridine hydrochloride (15a 1 ).
  • IR cnrT 1 Vm a x 3051, 3001, 2736, 1604, 1508, 1497, 1222, 1200, 1020, 893, 806.
  • Anal. (CI 6 H 15 ON HCl 0.8 H 2 O) C; H; N. 4-r (Z) - (6-methoxy-2- t 3-dihydro-1H-indan-1-ylidenes) -ethylpyridine hydrochloride (161.0) Purification: FCC (EtOAc: hexane, 1: 1). Yield 13%. yellow solid, mp 207 0 C.
  • 1 H NMR 500 MHz, DMSO-d 6) ⁇ 3.03 to 3.05 (m, 2H, H-2),.
  • IR cnrT 1 v ma ⁇ 2931, 2835, 2419, 1714, 1603, 1586, 1550, 1514, 1466, 1454, 1254, 1215, 1139, 1028, 1016, 871, 855, 833, 800.
  • IR cnrT 1 v max 3027, 2930, 2360, 1627, 1597, 1571, 1503, 1358, 1257, 1218, 1192, 1141, 1025, 872, 844, 786.
  • Anal. (Ci 8 H 19 O 2 N HCI 1, H 2 O) C; H; N.
  • IR cm '1 v max 3032, 2984, 2921, 2880, 2595, 1632, 1590, 1552, 1475, 1247, 1092, 1045, 825, 806.
  • Anal. (Ci 7 H 17 ON HCl 0.2 H 2 O) C; H; N. 3 - f (E) -r5- (benzyloxy) -2,3-dihydro-1H-indan-1-ylidenemethylpyridine hydrochloride (20Al, Prepared from (20J)) Purification: FCC (EtOAc: hexane, 1.:. 3) 13% yield, yellow solid, mp 209 0 C.
  • IR cm- 1 v max 3013, 2408, 1635, 1552, 938, 885, 825, 784.
  • Anal. (Ci 6 H 15 N-HCl-0.3 H 2 O) H; N; C: lime. 74.56, found 75.52.
  • IR OTT 1 v max 2917, 2460, 1596, 1510, 1204, 880, 813.
  • IR cnrT 1 v ma 3003, 2839, 2363, 2083, 1605, 1584, 1481, 1468. 1455, 1303, 1067, 894, 794.
  • Anal. (Ci 6 H 15 ON-HCI-1, 2H 2 O) C; H; N.
  • IR cnrT 1 v max 3087, 2924, 2377, 1635, 1548, 1201, 1179, 1073, 919, 864, 825, 801.
  • Anal. C14 H13 ONS-HCl) C; H; N. 5-rrzi-r5-methoxy-2,3-dihydro-lH-indan-l-ylidene ') methyl-l, 3-thiazol-hvdrochloride (. 27b1 Prepared from (Z7J) cleaning.
  • FCC EtOAc: hexane Yield 9%, white solid, mp 211 ° C.
  • IR cnrT 1 v max 2940, 2361, 1598, 1549, 1492, 1318, 1298, 1253, 1110, 1032, 822, 798, 782, 770.
  • Anal. (Ci 4 Hi 3 ONS-HCl-0.4 H 2 O) C; H; N.
  • IR cnrT 1 v max 2930, 2852, 1563, 1340, 1250, 979, 813.
  • IR cnrT 1 v max 2929, 2360, 2341, 1574, 1244, 836, 759.
  • IR cnrT 1 v max 3042, 3007, 2955, 2423, 1540, 1442, 809, 767, 722.
  • Anal. (Ci 9 Hi 3 N-HCl) C; H; N. 4- (9H-Fluoren-9-ylidenemethyl) pyridine hydrochloride (34).
  • IR OTT 1 v m a ⁇ 3050, 3004, 2950, 1627, 1585, 1498, 1481, 807, 775, 727. Anal.
  • IR cm- 1 v max 3029, 2961, 2925, 2360, 1730, 1547, 1475, 1250, 1084, 1019, 933, 859, 825, 816.
  • Anal. (Ci 6 H 15 N-HCl-0.6 H 2 O) C; H; N.
  • Reaction conditions (a) AICI 3 , benzene, 3h reflux; (b) triflic anhydride, dry pyridine, 15 min at 0-5 0 C, then for 2 h at RT; (c) Zn, PPh3, KCN, Ni (PPh 3) 2 CI 2, MeCN, 2 h at 6O 0 C.
  • Reaction conditions (a) AlCl 3, 40-50 0 C; (b) HgCl 2 ZZn, H 2 O, toluene, 24h reflux, addition of HCl every 6h; (c) PPA, 40 min at 7O 0 C.
  • the resulting alcohol was converted to the phosphonium salt.
  • 40 mmol of the alcohol and 13.7 g of triphenylphosphonium bromide (40 mmol) were suspended in 25 ml of benzene and refluxed under nitrogen for 12 h.
  • the precipitate was filtered off and dried, then taken up in dry diethyl ether and stirred for 10 min.
  • the phosphonium salt was finally filtered off and washed with acetone.
  • a sodium ethoxide solution was prepared.
  • 2.1 g of imidazole-4 (5) -carbaldehyde (22 mmol) was added.
  • the free base was either dissolved in acetone and an excess of oxalic acid in acetone to afford the oxalate or it was dissolved in dry diethyl ether and an excess of HCl in diethyl ether added to the hydrochloride receive.
  • cnrT 1 v ma x 3055, 3020, 2960, 2920, 2840, 1643, 1601, 1460, 985, 757.
  • Anal. (C 13 H 12 N 2 -C 2 H 2 O 4 ) C; H; N. 5-rfZ1-2,3-dihydro-1H-ind-1-ylidene-methyl-1H-imidazolium oxalate (42r /).
  • n 1, 2 Reaction conditions: (a) NaBH 4 , MeOH / CH 2 Cl 2 , 15 min at 0 ° C., 1 h at RT; (b) PPh 3 «HBr, benzene, 12 h reflux; (c) EtONa, 4 (5) -imidazole carboxaldehyde, N 2 , 12 h reflux; (d) Isomer separation by flash column chromatography.
  • reaction mixture was then poured into water and extracted several times with dichloromethane. The combined organic phases were dried over MgSO 4 and the solvent removed in vacuo. After purification, 2.5 mmol of the sulfonamide (42ia / 42ib, 48ia / 48ib) was taken up in a few ml of dioxane and 75 ml of 4N HCl added. The mixture was refluxed overnight with stirring. Upon cooling to room temperature, the hydrochloride precipitated and could be filtered off and washed with dry diethyl ether (quantitative yield based on the sulfonic acid amide).
  • IR (Powder) cnrT 1 v max 3124, 2923, 2361, 1465, 1386, 1174, 1080, 962, 724.
  • IR cnrT 1 v max 3381, 3165, 3082, 2989, 2822, 2362, 2686, 2651, 1519, 1267, 1142, 841, 815, 748.
  • Anal. (Ci 3 Hi 2 N 2 -HCI-0.5 H 2 O) C, H, N.
  • IR OTT 1 v ma ⁇ 2971, 2901, 1612, 1578, 1550, 1449, 1329, 1261, 1065, 1048, 805.
  • Example 5 Enzyme assay systems for testing compounds for inhibition of CYP enzymes in vitro
  • CYP17 expressed recombinantly in E. coli
  • Human placental CYP19 Human placental CYP19
  • bovine adrenal CYPIII Hartmann, RW et al., J. Med. Chem. 38: 2103-2111 (1995)
  • E. coli strain pJL17 / 0R in which the human CYP17 and the rats NADPH-P450 reductase were coexpressed, was prepared according to the method of Ehmer et al. and stored (Ehmer, PB et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 75: 57-63 (2000)).
  • phosphate buffer 0.05 M, pH 7.4, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA and 0.1 mM DTT.
  • the bacteria were spun down and resuspended in 10 ml of ice-cold TES buffer (0.1 M Tris-acetate, pH 7.8, 0.5 mM EDTA, 0.5 M sucrose). 4 mg lysozyme in 10 ml ice-cold water was added to give a final concentration of 0.2 mg / ml. This was followed by a thirty minute incubation with continuous shaking on ice. The spheroplasts were recovered by a new centrifugation step at 12,000 g for 10 min and resuspended in 3 ml of ice-cold phosphate buffer (composition thus, plus 0.5 mM PMSF).
  • the cells were disrupted on ice with an ultrasonic wand.
  • the whole cells and cell debris were spun down at 3,000 g for 7 min.
  • the supernatant was again added at 50,000 g for 20 min 4 0 C centrifuged.
  • the membrane pellet which was resuspended in 2 ml of phosphate buffer (composition see above) with 20% glycerol with the aid of an Ultra-Turrax® stick, was deposited.
  • the protein concentration was determined by the method of Lowry et al. determined (Lowry, OH et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)). Aliquots having an approximate protein concentration of 5 mg / ml were stored until use at -70 0 C.
  • Placenta (St. Joseph's Hospital, Saarmaschinen-Dudweiler, Germany) according to the method of Thompson and Siiteri (Thompson, E.A. & Siiteri, P.K., J. Biol. Chem. 249: 5364-5372 (1974)).
  • the isolated microsomes were suspended in a minimal volume of phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4, 20% glycerol).
  • DTT (10 mM) and EDTA (1 mM) were added to protect the enzyme from degradation reactions.
  • the protein concentration was determined according to Lowry et al. determined (Lowry, O.H. et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)) and should be about 35 mg / ml after work-up.
  • Sucrose buffer (0.25 M sucrose, 0.05 M Tris, pH 7.4). After removing the attached fatty tissue, the adrenal medulla was carefully separated from the adrenal cortex with a pair of scissors. The pieces of adrenal cortices were roughly minced with scissors, washed with Tris-sucrose buffer, weighed and finely minced in the above buffer (2 ml per g of tissue) with a hand blender. Thereafter, the tissue was homogenized with an Ultraturrax rod. To separate coarse cell debris and cell nuclei, the homogenate was centrifuged twice at 900g and 4 ° C for 15 min. The supernatant was then centrifuged for 35 min at 11000 g to recover the mitochondria fraction.
  • the precipitate was resuspended in Tris-sucrose buffer and centrifuged again at 11000 g for 35 min. This washing step was carried out a total of twice. After the last centrifugation, the pellet was resuspended in Tris-sucrose buffer containing 0.001M EDTA was contained, resuspended and frozen at -70 0 C.
  • the mitochondrial suspension Prior to use of the enzyme in the CYPIIB inhibition assay, the mitochondrial suspension was adjusted to a protein concentration of 5 mg / ml with 18- Hydroxylase buffer diluted (0.05M Tris, 1.2mM MgCl 2 , 6.0mM KCl, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl 2 ) (Ayub, M. & Levell, MJ, J. Steroid Biochem. 32: 515-524 (1989)). Protein determination was carried out according to Lowry (Lowry, OH et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)). D) Determination of the percent inhibition of CYP17
  • a solution of 6.25 nmol of progesterone (in 5 ⁇ l of MeOH) was dissolved in 140 ⁇ l of phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4, 1 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA and 0.1 mM DTT) and combined with 50 ul NADPH regenerating system (phosphate buffer with 10 mM IMADP ® , 100 mM glucose-6-phosphate and 2.5 units of glucose-6-phosphate dehydrogenase) and inhibitor (in 5 ul DMSO) at 37 0 C for 5 min preincubated. Control incubations were performed in parallel with 5 ⁇ l of DMSO without inhibitor.
  • the reaction was started by adding 50 ⁇ l of a 1 to 5 diluted membrane suspension in phosphate buffer (0.8-1 mg protein per ml). After mixing the batch was incubated at 37 0 C for 30 min. The reaction was stopped by addition of 50 ⁇ l IN HCl.
  • the steroids were extracted with 1 ml EtOAc. After a centrifugation step (5 min at 2500 g), 900 ⁇ l of the organic phase were transferred to an Eppendorf vessel with 250 ⁇ l of the incubation buffer and 50 ⁇ l of 1 N HCl and shaken again. After centrifugation, 800 ⁇ l of the organic phase was taken, placed in a new vessel and evaporated to dryness. The samples were dissolved in 50 ⁇ l of a water-methanol mixture (1: 1) and analyzed by HPLC. The substrate turnover was calculated from the ratio of the areas of the product peaks (17 ⁇ -hydroxyprogesterone and 16 ⁇ -hydroxyprogesterone) to that of the substrate peak. The activity of the inhibitors was calculated from the reduced substrate conversion after addition of inhibitors according to the following formula:
  • the assay was performed approximately analogously to that of Foster et al. A detailed description can be found in Hartmann and Batzl 1986 (Foster, AB et al., J Med Chem 26: 50-54 (1983); Graves, PE & Salhanick, HA, Endocrinology 105: 52 - 57 (1979); Hartmann, RW & Batzl, C, J. Med. Chem. 29: 1362-1369 (1986)). The enzyme activity was monitored by measuring the 3 H 2 O formed during the aromatization from [l ⁇ - 3 H] androstenedione.
  • Each reaction vessel contained 15 nM radiolabeled [LSS 3 H] androstenedione (equivalent to 0.08 uCi) and 485 nM unlabelled androstenedione, 2 mM IMADP ®, 20 mM glucose-6-phosphate, 0.4 units glucose-6-phosphate dehydrogenase and inhibitor (0-100 ⁇ M) in phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4).
  • the compounds to be tested were dissolved in DMSO and diluted with buffer to the desired concentration. The final DMSO concentration of the control and inhibitor incubation was about 2%.
  • Each jar was preincubated for 5 min in a water bath at 30 0 C. Addition of the microsomal protein (0.1 mg) started the reaction.
  • the total volume of each batch was 200 ⁇ l.
  • 200 .mu.l ice-cold 1 mM HgCl 2 solution the reaction was stopped after 14 min.
  • 200 ⁇ l of a 2% aqueous suspension of dextran-coated charcoal (DCC) was added to absorb the steroids and the vessels were shaken for 20 minutes. Thereafter, the activated carbon was centrifuged off at 1,500 g for 5 min.
  • the radioactive water ( 3 H 2 O) in the supernatant was determined by scintillation measurement by means of a LKB-Wallac ⁇ -counter.
  • the IC 50 values were calculated by a semilogarithmic plot of percent inhibitor inhibition inhibition. From this, the molar concentration at which 50% inhibition occurs was read.
  • Corticosterone 200 ⁇ M was mixed with inhibitor (1 ⁇ M) and mitochondrial enzyme (0.5 mg / 0.5 ml) with the addition of a regenerating system consisting of NADP + (ImM), glucose-6-phosphate (7 mM) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (1 IU / 0.5 ml).
  • a regenerating system consisting of NADP + (ImM), glucose-6-phosphate (7 mM) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (1 IU / 0.5 ml).
  • ImM NADP +
  • glucose-6-phosphate 7 mM
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase 1 IU / 0.5 ml
  • the nulls were spiked with 250 ⁇ L of HCl prior to pipetting the enzyme.
  • the steroids were separated by shaking with 1 ml of ethyl acetate (10 min). After centrifugation (15,000 g, 10 min), 900 ⁇ l of the organic phase were shaken with 250 ⁇ l of 1 N NaOH (10 min) and 800 ⁇ l of supernatant were again washed with 250 ⁇ l of buffer.
  • the steroids were taken up in 20 ⁇ l of distilled methanol and 10 ⁇ l of the methanolic solution were separated by HPLC (stationary phase: Nucleosil 120-5 C18 column with a 1 cm long 7 ⁇ m precolumn; 50% methanol in water, flow: 1.1 ml / min, detection: UV detector).
  • HPLC stationary phase: Nucleosil 120-5 C18 column with a 1 cm long 7 ⁇ m precolumn; 50% methanol in water, flow: 1.1 ml / min, detection: UV detector.
  • 18-OH corticosterone (retention time: 10 minutes) and corticosterone (retention time: 21 minutes) were separated.
  • the height of the 18-OH corticosterone peak was used for the evaluation.
  • the percent inhibition of 18-hydroxylation of corticosterone by the inhibitors was based on the zero values on the mean values of the control incubations.
  • Each inhibitor was tested at least twice for its 18-hydroxylase inhibitory activity at a concentration of 1 ⁇ M.
  • the determination of the amounts of 18-OH corticosterone formed in the examination of the incubation time and the substrate saturation was carried out by means of a calibration line.
  • Example 6 Biological Assay Systems for Testing Compounds for Selective Inhibition of Human CYPIIB1 and CYP11B2 in vitro
  • a split yeast suspension (S.pombe PEI) with a cell density of 3-10 7 cells / ml was prepared from a freshly grown cuticle using fresh EMMG (pH 7.4), modified according to Ehmer et al. (Ehmer, PB et al., J. Steroid, Biochem., Mol. Biol. 81, 173-179 (2002)). 492.5 ⁇ l of this cell suspension were mixed with 5 ⁇ l of inhibitor solution (50 ⁇ M of the compound to be tested in ethanol or DMSO) and incubated at 32 ° C. for 15 min. Controls were added with 5 ⁇ l of ethanol.
  • the enzyme reaction was started by adding 2.5 ⁇ l of 11-deoxycorticosterone (20 ⁇ M, containing 1.25 nCi [4- 14 C] II deoxycorticosterone, in ethanol), then shaking horizontally at 32 ° C for 6 h.
  • the assay was stopped by extraction of the sample with 500 ⁇ l EtOAc. After centrifugation (10,000 g, 2 min), the EtOAc phase was removed and evaporated to dryness. The residue was taken up in 10 ⁇ l of chloroform. The conversion of the substrate to corticosterone was analyzed by HPTLC (see below).
  • Equation 2 The percentage inhibition caused by an inhibitor at the concentration used was calculated according to Equation 2. Equation 2:
  • V79 MZhIlBl and V79 MZhllB2 which recombinantly express the human aldosterone synthase or steroid 11-.beta.-hydroxylase and according to Denner et al. were prepared (Denner, K. et al, Pharmacogenetics 5:. 89-96 (1995)) was treated in a CO 2 incubator at 37 0 C and in water vapor saturated atmosphere with 5% CO 2 in cell culture dishes with 60 or 90 mm diameter cultured. Both cell lines were cultured in DMEM + containing 10% FCS and the antibiotics penicillin and streptomycin (1%) to protect against bacterial contamination.
  • the cells were passaged every 2-3 days after treatment with trypsin / EDTA, since the doubling density was 1 to 2 days, depending on the number of cells.
  • the cells were passaged a maximum of 12 - 15 times to exclude possible cell changes. If needed further, freshly thawed cells were used.
  • FCS Fetal Calf Serum
  • the pH of the medium was adjusted to 7 ', 2-7', 3.
  • FCS was added after sterile filtration.
  • V79 MZh HBl and V79 MZh 11B2 cells (8-10 5 cells per well) were grown on 24-well cell culture plates with 1.9 cm 2 culture area per well (Nunc. Roskilde, Denmark) until confluency. Prior to testing, the existing DMEM culture medium was removed and 450 ⁇ l of fresh DMEM with inhibitor added in at least three different concentrations to each well to determine the IC 50 value. After preincubation (60 min, 37 ° C), the reaction was terminated by addition of 50 ⁇ l DMEM with 2.5 ⁇ l solution of the substrate 11-deoxycorticosterone (20 ⁇ M, containing 1.25 nCi [4- 14 C] II-deoxycorticosterone) Ethanol) started.
  • V79 MZh HBl cells were incubated for 120 min, the V79 MZh 11B2 cells for 40 min. Controls without inhibitor were treated in the same way.
  • the enzyme reactions were stopped by extraction of the supernatant with 500 ⁇ l EtOAc.
  • the samples were centrifuged (10000 g, 2 min), the solvent was removed and evaporated. The residue was taken up in 10 ⁇ l of chloroform and analyzed by HPTLC (see below).
  • the conversion for V79 MZhIlBl was calculated in accordance with Equation 1 (Ex. 5A), where:
  • PSL B PSL for cortisol and corticosterone
  • Equation 3 Equation 3:
  • PSLD OC PSL for background 11-deoxycorticosterone (DOC) PSL HG PSL The percentage inhibition caused by an inhibitor in the particular concentration used was calculated according to Equation 2 (Example 5A).
  • the IC 50 value is defined as the concentration of the inhibitor at which the enzyme is inhibited to 50%. It was calculated by determining the percent inhibition at at least 3 different inhibitor concentrations, all of which must be within the linear range of the sigmoid IC 50 curve (log C /% inhibition).
  • imaging plates (BAS MS2340, for 14 C samples, Raytest, Straubenhardt, Germany) were exposed for 48 h to the HPTLC plates.
  • the imaging plates were scanned with the phosphoimager system Fuji FLA 3000 (Raytest, Straubenhardt, Germany) and the steroids quantified.
  • Example 7 Inhibition of adrenal CYPIIB enzymes in vitro by rdihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidenemethyl-3-pyridines [dihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidenemethyl] -3-pyridines were prepared as in Examples 5 and 6 described as inhibitors tested. The results of the tests are summarized in Tab. Tab. 1: [Dihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidenemethyl] -3-pyridines; Inhibition of adrenal CYPIIB enzymes, CYP17 and CYP19 in vitro
  • Fadrozole 68 9.7 1.0 7 0.0295 a Mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 10%.
  • S. pomöe cells expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM; Inhibitor, 500 nM.
  • c mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 20%.
  • e Haster fibroblasts expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 0 nM. f E.
  • Example 8 Inhibition of adrenal CYPIIB enzymes in vitro by rdihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidene-methyl-4-pyridines [dihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidenemethyl] -4-pyridines were prepared as in Examples 5 and 6 described as inhibitors tested. The results of the tests are summarized in Tab.
  • Fadrozole 68 9.7 1.0 7 0.0295 a Mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 10%.
  • S. pomöe cells expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM; Inhibitor, 500 nM.
  • c mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 20%.
  • Haster fibroblasts expressing human CYPIIBl; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM.
  • Hector fibroblasts expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM. f E. coli expressing the human CYP17; 5 mg / ml protein; Substrate progesterone, 2.5 ⁇ M; Inhibitor, 2.5 ⁇ M. 9 mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 5%; h human placental CYP19, 1 mg / ml protein; Substrate testosterone, 2.5 ⁇ M; (nd not determined)
  • Example 9 Inhibition of adrenal CYPIIB enzymes, CYP 17 and CYP 19 in vitro by further dihydroindan-1 (2H) -ylidene-methyll-heterocycles
  • Fadrozole 68 9.7 1.0 7 0.0295 a Mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 10%.
  • S. pomöe cells expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM; Inhibitor, 500 nM.
  • c mean of 4 determinations, standard deviation ⁇ 20%.
  • e Haster fibroblasts expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM. f E.
  • Example 10 Inhibition of adrenal CYPIIB enzymes and CYP17 and CYP19 in vitro by rDihydronaphthalene or dihydroindan-1 (2H) -ylidenemethyl-4-imidazoles
  • f Haster fibroblasts expressing human CYP11B2; Substrate deoxycorticosterone, 100 nM. (nd not determined)
  • Example 11 Inhibition of CYP enzymes in vitro by the reference compounds ketoconazole and fadrozole
  • Ketocoanzol or fadrozole were tested as inhibitors as described in Examples 5 and 6. The results of the tests are summarized in Tab. 6.
  • a percent inhibition of CYPIIBl in NCI-H295R, inhibitor concentration 2.5 ⁇ M (for IC 50 - determination at least 3 different concentrations); Preincubation 1 h, substrate: [ 3 H] -deoxycortisol (RSS, 500 nM); Incubation time: 48 h; Extraction with dichloromethane; Determination of cortisol after HPLC separation (methanol-water 50:50, RP18) b: percent inhibition of CYP11B2 in NCI-H295R, inhibitor concentration 2.5 ⁇ M (for IC 50 - determination at least 3 different concentrations); Stimulation with K + -containing saline [20 mM K + ] preincubation 1 h, substrate: [ 3 H] -corticosterone (B, 500 nM); Incubation time: 24 h; Extraction with dichloromethane; Determination of [ 3 H] -18-hydroxycorticosterone and [ 3 H] aldosterone after
  • To prepare a mixture of labeled and unlabeled substance 38 ⁇ l of unlabelled deoxycortisol (0.5 mM in ethanol) and 41.6 ⁇ l of [1,2- 3 H (N)] deoxycortisol (1 mCi / ml, 52 Ci / mmol NEN-Perkin-Elmer) in ethanol with 120.4 ⁇ l of ethanol.
  • the corticosterone substrate solution (final concentration in the assay 500 nM) consisted of 38.4 [1.2- 3 H (N)] -corticosterone (1 mCi / ml, 76.5 Ci / mmol NEN-Perkin-Elmer) in ethanol, 39.0 ⁇ l of unlabeled corticosterone solution (0.5 mM in ethanol) and 122.6 ⁇ l of ethanol.
  • Deoxycorticosterone which was also used at a final concentration of 500 nM, was composed of 18 ⁇ l of [ 14 C] -labeled deoxycorticosterone (60.0 mCi / mmol, 0.5 nCi / ⁇ l) in ethanol in admixture with 54 ⁇ l unlabeled substance (0.5 mM in ethanol) and 228 ⁇ l of ethanol.
  • the 24-well plate was then kept for 2 incubator at 37 0 C and 5% CO 2 in the CO.
  • the incubation period was 3 hours using deoxycorticosterone as substrate, 24 hours for corticosterone and 48 hours for deoxycortisol.
  • Test stop After the incubation times, the contents of the wells were removed as quantitatively as possible after a brief swirl and inactivated by mixing with 1000 ⁇ l of dichloromethane in a 2 ml Eppendorf tube. After shaking for 10 minutes, centrifugation was carried out for phase separation, and the upper organic phase was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube.
  • the residue was taken up in 10 ⁇ l of chloroform and applied in the middle of the concentration zone of an HPTLC plate.
  • the steroids were separated by double development with a flow agent composed of chloroform, methanol and water in a ratio of 300: 20: 1.
  • the separation was carried out by HPLC on a RP18 column with the eluent methanol: water 1: 1 and a flow rate of 0.25 ml / min, the detection was carried out using a Berthold Radiomonitor 509.
  • the exposed film was scanned in the Phosphoimager FLA 3000 after two days.
  • Equation 4 the conversion for the substrate deoxycortisol was calculated after HPLC separation: Equation 4: g / p _ ⁇ Jortisone ⁇ Jortison y, ir ⁇ ajortison + Ajortisol + ⁇ RSSl
  • Equation 5 For the substrate corticosterone, Equation 5 was: Equation 5:
  • Example 5A The percentage inhibition caused by an inhibitor in the particular concentration used was calculated according to Equation 2 (Example 5A). The determination of the IC 50 value was carried out as described in Example 5B.
  • Compound 50 was tested in V79 cells for inhibition of CYPIII and CYPl 1B2.
  • Compound 50 inhibits human aldosterone synthase in the deep nanomolar range and additionally shows only a very weak inhibition of the human CYPIIB.
  • the substance is not only highly potent but also very selective.
  • substances of the class of substituted in the 3-position 1,2-Dihydroacenaphthylenes are new lead structures that can lead to even more potent and simultaneously highly selective CYP11B2 inhibitors.
  • Deoxycorticosterone 100 nM.
  • c hamster fibroblasts expressing human CYP11B2 Substrate deoxycorticosterone, 100 nM.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verbindungen zur selektiven Hemmung der humanen Corticoidsynthasen CYP11B1 und CYP11B2, deren Herstellung und Verwendung zur Behandlung von Hypercortisolismus und Diabetes mellitus bzw. Herzinsuffizienz und Myokardfibrose.

Description

Selektive Hemmstoffe humaner Corticoidsynthasen
Die Erfindung betrifft Verbindungen zur selektiven Hemmung der humanen Corticoidsynthasen CYPIlBl und CYPl 1B2, deren Herstellung und Verwendung zur Behandlung von Hypercortisolismus und Diabetes mellitus bzw. Herzinsuffizienz und Myokardfibrose.
Hintergrund der Erfindung Die Nebennierendrüsen des Menschen sind in zwei Bereiche untergliedert, das Nebennierenmark und die Nebennierenrinde. Letztere sekretiert eine Reihe von Hormonen, die als Corticoide bekannt sind und in zwei Kategorien fallen. Glucocorticoide (vor allem Hydrocortison bzw. Cortisol) wirken primär auf den Kohlehydrat- und Glucosemetabolismus, sekundär können sie die Wundheilung durch Eingreifen in das Entzündungsgeschehen und die Bildung von fibrösem Gewebe verzögern. Die zweite Kategorie, die Mineralcorticoide, sind primär an der Retention von Natrium und der Exkretion von Kalium beteiligt. Das wichtigste und wirksamste Mineralcorticoid ist Aldosteron.
Die Glucocorticoidbiosynthese wird u. a. von Adrenocorticotropin (ACTH) gesteuert. Steroid-llß-Hydroxylase (CYPIlBl) ist das Schlüsselenzym der
Biosynthese der Glucocorticoide beim Menschen. In allen Erkrankungen, die mit erhöhter Cortisol-Bildung einhergehen, könnte diesem Enzym somit eine
Schlüsselrolle zukommen. Zu diesen Krankheitsbildern zählen
Hypercortisolismus, insbesondere das Cushing-Syndrom sowie eine spezielle Form des Diabetes mellitus, die durch einen extremen morgendlichen Anstieg des Cortisolplasmaspiegels gekennzeichnet ist.
Im Falle von Morbus Cushing erfolgt die Therapie in der Regel in Abhängigkeit von der Ursache der Erkrankung. Man unterscheidet zwischen hypophysär- hypothalämischem oder adrenal bedingtem Cushing-Syndrom, welches sich aufgrund von Corticoid-produzierenden Tumoren der Nebennierenrinde entwickelt.
Zur Therapie des hypophysär-hypothalämischem Cushing-Syndroms werden in der Regel neuromodulatorische Substanzen eingesetzt, wie Bromocriptin, Cyproheptin, Somastatin oder Valproinsäure, die durch ihren Einfluss auf die ACTH-Freisetzung die Cortisolproduktion reduzieren sollen. Diese Therapie erwies sich in der Vergangenheit als nur wenig effektiv.
Beim adrenalen Cushing-Syndrom erfolgt im besonderen dann, wenn eine chirurgische Entfernung des Primärtumors nicht möglich ist, eine Therapie mit Inhibitoren der Steroidbiosynthese. Zum Einsatz kommen die unspezifischen CYP-Enzym-Hemmstoffe Aminoglutethimid, Metyrapon, Ketoconazol und Mitotane, die häufig in Form einer Kombinationstherapie angewendet werden. Die Wirkung auf die Steroidogenese beruht jedoch im Falle von Aminoglutethimid auf einem Angriff an CYPIlAl, der Desmolase, bzw. im Falle von Ketoconazol auf der Inhibition von CYP17. Auch die weiteren genannten Verbindungen wirken unspezifisch. Sowohl die Kombination mehrerer unselektiver Inhibitoren der steroidogenen CYP-Enzyme als auch die hohen Dosen, die eingesetzt werden müssen, sind therapeutisch nicht unbedenklich. Dies ist vor allem in Hinblick darauf von Bedeutung, dass die Therapie lebenslang durchgeführt werden muss und aufgrund der mangelnden Selektivität der genannten Verbindungen mit schwerwiegenden Nebenwirkungen behaftet ist (Nieman, L K., Pituitary 5:77-82 (2002)). Ein Lösungsansatz stellt hier die Therapie mit hochselektiven Inhibitoren des Schlüsselenzyms der Glucocorticoidbiosynthese, CYPIlBl dar. Damit es nicht, wie in der Vergangenheit beschrieben, zu Nebenwirkung insbesondere auf die Androgenbildung beim Mann (Ketoconazol) oder auf die Mineralcorticoidbiosynthese kommt, ist auch hier eine Selektivität der Verbindungen erwünscht.
Erhöhte Cortisolspiegel werden auch mit neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht. Die Abnahme des Erinnerungs- und Lernvermögens nach Exposition mit erhöhten Konzentrationen sowohl exogen zugeführter als auch endogener Glucocorticoide (Cortisol) ist beschrieben (Heffelfinger et al., Dev. Psychopathol. 13:491-513 (2001)).
Bei einer speziellen Form des stressabhängigen Diabetes mellitus kommt es zu einem schnellen morgendlichem Anstieg der Plasma-Cortisolkonzentration. Weiterhin werden bei Diabetes mellitus erhöhte Cortisolwerte mit der Entstehung von Insulinresistenz und einer Beeinträchtigung der Glucosetoleranz in Verbindung gebracht (Phillips et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83:757-760 (1998)). Auch hier könnte die Inhibition der Glucocorticoid-Biosynthese durch direkte und selektive Hemmung des Schlüsselenzyms CYPIlBl eine therapeutische Alternative darstellen.
Die Aldosteron-Sekretion wird von einer Vielzahl von Signalen reguliert: den
Plasma-Konzentrationen von Natrium und Kalium und dem über mehrere Stufen verlaufenden Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). Bei diesem System wird als Antwort auf niedrigen Blutdruck von den Nieren Renin sekretiert, das aus einem Vorläuferpeptid Angiotensin I freisetzt. Angiotensin I wird wiederum zu
Angiotensin II gespalten, das 8 Aminosäuren umfasst und ein potenter
Vasokonstriktor ist. Außerdem wirkt es als Hormon zur Stimulierung der Freisetzung von Aldosteron (Weber, KT. & Brilla, CG., Circulation 83: 1849-1865
(1991)).
Das Schlüsselenzym der Mineralcorticoid-Biosynthese, CYP11B2 (Aldosteronsynthase), ein mitochondriales Cytochrom-P450-Enzym, katalysiert die Bildung des potentesten Mineralcorticoids Aldosteron aus seinem steroidalen Substrat 11-Deoxycorticosteron (Kawamoto, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 1458-1462 (1992)). Überhöhte Plasma-Aldosteron-Konzentrationen stehen im Zusammenhang mit Krankheitsbildern wie kongestivem Herzversagen und kongestiver Herzinsuffizienz, Myokardialfibrose, ventrikulärer Arrhythmie, Stimulierung kardialer Fibroblasten, kardialer Hypertrophie, renaler Minderperfusion und Hypertonie, und sie sind an der Progression dieser Erkrankungen beteiligt (Brilla, C. G., Herz 25:299-306 (2000)). Insbesondere bei Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz bzw. renaler Minderperfusion oder Nierenarterienstenosen kommt es im Gegensatz zur physiologischen Wirkung des Renin-Angiotensin-Systems (RAAS) zu dessen pathophysiologischer Aktivierung (Young, M., Funder, J. W., Trends Endocrinol. Metab. 11:224-226 (2000)). Angiotensin-II-vermittelte Vasokonstriktion und die aufgrund der erhöhten Aldosteronspiegel auftretende Wasser- und Natriumrestriktion führen zu einer zusätzlichen Mehrbelastung des primär schon insuffizienten Myokards. Im Sinne eines "Circulus vitiosus" resultiert eine weitere Verminderung der renalen Perfusion und eine erhöhte Renin-Sekretion. Zusätzlich induzieren sowohl die erhöhten Plasma-Aldosteron- und Angiotensin-II-Spiegel als auch kardial lokal sezerniertes Aldosteron fibrotische Strukturveränderungen des Myokards, in deren Folge die Ausbildung einer Myokard-Fibrose zu einer weiteren Reduktion der Herzleistung führt (Brilla, C. G., Cardiovasc. Res. 47: 1-3 (2000); Lijnen, P. & Petrov, V. J. Mol. Cell. Cardiol. 32:865-879 (2000)).
Fibrotische Strukturveränderungen sind gekennzeichnet durch die Entstehung von Gewebe, das durch eine abnormal hohe Menge von fibrotischem Material (v.a. Kollagensträngen) charakterisiert ist. Derartige Fibrosen sind in einigen Situation, wie z.B. der Wundheilung, nützlich, können jedoch schädlich sein, u.a. wenn sie die Funktion innerer Organe beeinträchtigen. Bei myokardialer Fibrose ist der Herzmuskel von fibrotischen Strängen durchzogen, die den Muskel steif und unflexibel machen und dadurch seine Funktion beeinträchtigen. Da selbst bei Patienten mit einer leichten Herzinsuffizienz die Mortalität 10-20 % beträgt, ist es dringend erforderlich, hier mit einer geeigneten medikamentösen Therapie einzugreifen. Trotz Langzeittherapie mit Digitalis-Glycosiden, Diuretika, ACE-Hemmern oder AT-II-Antagonisten bleiben die Plasma-Aldosteronspiegel bei den Patienten erhöht, und die Medikation hat keinen Effekt hinsichtlich der fibrotischen Strukturveränderungen.
Mineralcorticoid-Antagonisten, insbesondere Aldosteron-blockierende Wirkstoffe, sind bereits Gegenstand zahlreicher Patente bzw. Patentanmeldungen. So ist bekannt, daß der steroidale Mineralcorticoid-Antagonist Spironolacton (17- Hydroxy-7-alpha-mercapto-3-oxo-17-α-pregn-4-ene-21-carbonsäure-γ-lacton- acetat; Aldactone®) Aldosteron-Rezeptoren kompetitiv zu Aldosteron blockiert und so die Rezeptor-vermittelte Aldosteronwirkung verhindert. US 2002/0013303, US 6,150,347 und US 6,608,047 beschreiben die Dosierung von Spironolacton zur Therapie oder Vorbeugung von cardiovaskulären Erkrankungen und myokardialer Fibrose bei gleichzeitiger Erhaltung des normalen Elektrolyt- und Wasserhaushalts des Patienten.
Die "Randomized Aldactone Evaluation Study (RALES)" (Pitt, B. et al., New Engl. J. Med. 341:709-717 (1999)) zeigte eindrucksvoll, dass mit der Gabe des Aldosteronrezeptor-Antagonisten Spironolacton (Aldactone®) zusätzlich zur Basistherapie mit ACE-Hemmern und Schleifendiuretika die Überlebensrate schwer herzinsuffizienter Patienten signifikant verbessert werden konnte, da die Wirkung von Aldosteron in ausreichendem Maße inhibiert wurde (Kulbertus, H., Rev. Med. Liege 54:770-772 (1999)). Allerdings war die Anwendung von Spironolacton mit schwerwiegenden Nebenwirkungen wie Gynäkomastie, Dysmenorrhoe und Brustschmerzen verbunden, welche sich mit der steroidalen Struktur der Substanz und den sich daraus ergebenden Wechselwirkungen mit weiteren Steroidrezeptoren begründen (Pitt, B. et al., New Eng. J. Med. 341 :709- 717 (1999); MacFadyen, R. J. et al., Cardiovasc. Res. 35:30-34 (1997); Soberman, J.E. & Weber, KT., Curr. Hypertens. Rep. 2:451-456 (2000)). Mespirenon (15,16-methylene-17spirolactone) und seine Derivate galten als vielversprechende Alternativen zu Spironolacton, da sie nur einen niedrigen Prozentsatz der antiandrogenen Wirkung des Spironolaktons aufweisen (Losert, W. et al., Drug Res. 36: 1583-1600 (1986); Nickisch, K. et al., J Med Chem 30(8): 1403-1409 (1987); Nickisch, K. et al., J. Med. Chem. 34:2464-2468 (1991); Agarwal, M. K., Lazar, G., Renal Physiol. Biochem. 14:217-223 (1991)). Mespirenon blockiert die Aldosteron-Biosynthese als Teil einer vollständigen Mineralcorticoid-Biosynthese-Hemmung (Weindel, K. et al., Arzneimittelfor¬ schung 41(9):946-949 (1991)). Mespirenone hemmt wie Spironolacton die Aldo- steronbiosynthese allerdings nur in sehr hohen Konzentrationen. WO 01/34132 beschreibt Methoden zur Behandlung, Vorbeugung oder Blockierung von pathogenen Veränderungen infolge von Gefäßverletzungen (Restenosen) in Säugetieren durch Gabe eines Aldosteron-Antagonisten, nämlich Eplerenone (ein Aldosteron-Rezeptor-Antagonist) oder verwandter Strukturen, die teilweise epoxysteroidal sind und sich sämtlich aus 20-Spiroxanen herleiten lassen.
WO 96/40255, US 2002/0123485, US 2003/0220312 und US 2003/0220310 beschreiben therapeutische Methoden zur Behandlung von Kardiovaskularerkrankungen, Myokardfibrose oder kardialer Hypertrophie durch Nutzung einer Kombinationstherapie aus einem Angiotensin-II-Antagonisten und einem epoxy-steroidalen Aldosteron-Rezeptor-Antagonisten wie Eplerone oder Epoxymexrenone.
Die kürzlich veröffentlichte Studie EPHESUS ("Eplerenone 's Heart Failure Efficacy and Survival Study", 2003) konnte die Ergebnisse von RALES untermauern. Ergänzend zur Basistherapie appliziert, reduziert der erste selektive, steroidale Mineralcorticoid-Rezeptor-Antagonist Eplerone (Inspra®) deutlich Morbidität und Mortalität bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt sowie das Auftreten von Komplikationen, z.B. Abfall der linksventrikulären Auswurffraktion und Herzversagen (Pitt., B. et al., N. Eng. J. Med. 348: 1390-1382 (2003)). Durch RALES und EPHESUS wurde eindeutig belegt, dass Aldosteronantagonisten eine nicht zu unterschätzende Therapie-Option darstellen. Jedoch ergibt sich aus deren Nebenwirkungsprofil die Forderung nach Substanzen, welche sich in ihrer Struktur und ihrem Wirkungsmechanismus von Spironolacton unterscheiden. Eine viel versprechende Alternative stellen hier nichtsteroidale Inhibitoren der Mineralcorticoid-Biosynthese dar; denn es ist besser, die pathologisch erhöhte Aldosteronkonzentration zu reduzieren, als nur die Rezeptoren zu blockieren. CYP11B2 als Schlüsselenzym bietet sich in diesem Zusammenhang als Angriffspunkt für spezifische Hemmstoffe an und wurde bereits in früheren Untersuchungen als Target für spezifische Inhibitoren vorgeschlagen (Hartmann, R. et al., Eur. J. Med. Chem. 38:363-366 (2003); Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002)). So kann die überhöhte generalisierte Aldosteronfreisetzung und im besonderen die kardiale Aldosteronproduktion durch die gezielte Inhibition der Biosynthese vermindert werden, was wiederum strukturelle Veränderungen des Myokards reduziert.
Selektive Aldosteronsynthase-Inhibitoren könnten auch eine viel versprechende Stoffklasse darstellen, die nach einem Myokard -Infarkt die Abheilung des beeinträchtigten Myokard-Gewebes mit verringerter Narbenbildung fördert und damit das Auftreten schwerer Komplikationen reduziert. WO 01/76574 beschreibt ein Arzneimittel, welches einen Hemmstoff der Aldosteronbildung oder eines seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze, optional in Kombination mit anderen Wirksubstanzen umfasst. WO 01/76574 bezieht sich dabei auf die Verwendung von zum damaligen Zeitpunkt kommerziell erhältlichen nichtsteroidalen Hemmstoffe der Aldosteronbildung, insbesondere auf das (+)- Enantiomer von Fadrozol, ein 4-(5,6,7,8-tetrahydroimidazo(l,5-a)pyridin-5- yl)benzonitril, und auf dessen synergistische Wirkung mit Angiotensin II- Rezeptor-Antagonisten.
Anastrozole (Arimidex®) und Exemestane (Coromasin®) sind weitere non¬ steroidale Aromatase-Inhibitoren. Ihr Einsatzgebiet ist die Behandlung von Brustkrebs durch Hemmung der Aromatase, die Androstendion und Testosteron in Östrogen umwandelt.
Die humane Steroid-llß-Hydroxylase CYPIlBl zeigt eine Homologie von über 93 % zu humaner CYPl 1B2 (Kawamoto, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 1458-1462 (1992); Taymans, S. E. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83: 1033-1036 (1998)). Trotz der hohen strukturellen und funktionellen Ähnlichkeit dieser beiden Enzyme dürfen starke Hemmstoffe der Aldosteronsynthase die Steroid-llß-Hydroxylase nicht beeinflussen und müssen daher auf ihre Selektivität geprüft werden. Zudem sollten nonsteroidale Inhibitoren der Aldosteronsynthase bevorzugt als Therapeutika einsetzbar sein, da weniger Nebenwirkungen auf das endokrine System zu erwarten sind. Darauf wurde schon in früheren Untersuchungen hingewiesen, ebenso darauf, dass die Entwicklung selektiver CYP11B2-Inhibitoren, die CYPIlBl nicht beeinflussen, durch die hohe Ähnlichkeit der beiden Enzyme erschwert wird (Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002); Hartmann, R. et al., Eur. J. Med. Chem. 38:363-366 (2003)).
Die Inhibitoren sollten auch andere P450 (CYP)-Enzyme möglichst wenig beeinträchtigen. Der einzige heute bekannte Wirkstoff, der die Corticoidsynthese im Menschen beeinflusst, ist der Aromatase(Östrogensynthase, CYP19)-Inhibitor Fadrozol, der in der Brustkrebstherapie eingesetzt wird. Er kann auch Aldosteron- und Cortison-Pegel beeinflussen, allerdings erst bei Gabe der zehnfachen therapeutischen Dosis (Demers, LM. et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 70: 1162-1166 (1990)).
Für Inhibitoren der humanen Aldosteronsynthase CYPl 1B2 wurde bereits ein Testsystem zur Durchmusterung von chemischen Verbindungen mit
Schizosaccharomyces pombe-ZeWen, welche humane CYPl 1B2 stabil exprimieren, und zur anschließenden Prüfung der Selektivität mit V79MZ-Zellen, welche entweder CYPl 1B2 oder CYPIlBl stabil exprimieren, entwickelt (Ehmer,
P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002)). Mit Hilfe des S. pomόe-Systems wurden exemplarisch 10 Substanzen geprüft, von denen eine mit Hilfe des V79MZ-Systems als potenter und selektiver non-steroidaler
Inhibitor der humanen CYPl 1B2 (und starker Aromatasehemmstoff) und vier weitere als nicht selektive, jedoch gegenüber CYPIlBl stärkere Inhibitoren identifiziert wurden (A: CYP11B2-Inhibitor; B1D: nicht selektive CYPIlBl- Inhibitoren):
Diese Veröffentlichung hat sich jedoch auf die Bereitstellung eines effektiven
Testsystems zur Suche nach selektiven CYP11B2-Inhibitoren konzentriert und gibt außer dem sehr allgemeinen Verweis auf das aromatische N-Atom und die drei oben gezeigten Strukturen nur wenige Hinweise darauf, welche
Substanzklassen letztendlich besonders wirksam sein könnten. Des Weiteren sei darauf hingewiesen, dass die meisten in dieser Veröffentlichung vorgestellten
Strukturen starke CYPllBl-Inhibitoren waren und daher nicht zum unmittelbaren Einsatz als selektive CYP11B2-Inhibitoren in Betracht kommen sollten.
Die Durchmusterung einer P450-Inhibitor-Bibliothek von über 100 Substanzen nach Inhibitoren boviner Aldosteronsynthase (CYP18, CYPIlB) (z. T. veröffentlicht in Hartmann, R. W. et al., Arch. Pharm. Pharm. Med. 339, 251-61 (1996)) mit Hilfe des von Ehmer et al. (Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002)) vorgestellten Testsystems ergab eine hohe Zahl von Verbindungen, die inhibitorisch auf CYP11B2 wirkten, unter anderem auch die Verbindungen la/b und 2a/b (Hartmann, R. et al., Eur. J. Med. Chem. 38:363- 366 (2003)). Diese Stoffe wurden im Rahmen der zitierten Untersuchung auch auf ihre orale Verfügbarkeit und des Weiteren auf in vitro Inhibition von stabil in Hefe und, falls diese Tests starke Inhibition von CYP11B2 zeigten, in V79MZ- Zellen exprimierter humaner CYP11B2 geprüft. Es wurden hierbei auch Vergleiche mit der Inhibition anderer CYP, u.a. CYPIlBl, exprimiert in V79MZ- Zellen, durchgeführt, um die Selektivität der Testsubstanzen festzustellen. Durch Strukturvariation wurden schließlich CYP11B2-Inhibitoren gefunden, die IC50- Werte im niedrigen nanomolaren Bereich zeigten, nämlich Cyclopropatetrahydronaphthalin-Abkömmlinge und Arylmethyl-substituierte Indane. Es wurde festgestellt, dass die CYPllB-Inhibition durch den Substituenten am Benzolring und durch den Heteroaryl-Rest stark beeinflusst wird. Als vielversprechende Leitstrukturen wurden die Verbindungen E und F gefunden:
Die vorgenannten wissenschaftlichen Veröffentlichungen weisen darauf hin, dass das Vorhandensein eines aromatischen Stickstoff-Atoms wesentlich für die Komplexierung des Eisen-Atoms im Target-Enzym sei (Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002); Hartmann, R. et al., Eur. J. Med. Chem. 38:363-366 (2003)). Zudem müsse dieses N-Atom unsubstituiert und sterisch zugänglich sein (Ehmer, P. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 81: 173-179 (2002)). Einige wenige Heteroarylmethylen-substituierte Tetrahydronaphthaline und Indane wurden bereits im Vorfeld der hier vorgestellten Erfindung auf ihre Wirkung als Inhibitoren des unspezifischen bovinen CYPIlB geprüft. Sie erwiesen sich jedoch als zu unspezifisch, um als Therapeutika zur gezielten Hemmung von CYP11B2 in Frage zu kommen (Mitrenga, M., Dissertation Universität Saarbrücken 1996, Shaker-Verlag, Aachen (1997)). Zudem ist das bovine Enzym nicht optimal zur Evaluierung der therapeutischen Eignung von Verbindungen zur Hemmung humaner CYPBl 1-Enzyme, da die Homologie zwischen diesen bovinen und humanen Enzymen nicht hoch ist (75%) (Mornet, E. et. al., J. Biol. Chem. 264:20961-20967 (1989)). Alle bislang bekannten Hemmstoffe der Aldosteron- bzw. Glucocorticoidbildung haben erhebliche Nachteile: Etomidat und Metyrapon hemmen die Glucocorticoidbildung stärker als die Aldosteronbildung. Etomidat ist ein starkes Narkotikum und Metyrapon ein relativ unselektiver CYP-Hemmstoff, der deshalb nur als Diagnostikum eingesetzt wird. Bei Fadrozol ist beschrieben, dass es die Aldosteronbildung stärker hemmt als die Glucocorticoidbildung (Bhatnagar, A. S. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37: 1021-1027 (1990); Hausler, A. et al., J. Steroid Biochem. 34:567-570 (1989); Dowsett, M. et al., Clin. Endocrinol. (Oxf.) 32:623-634 (1990); Santen, RJ. et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 73:99-106 (1991); Demers, LM. et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 70: 1162-1166 (1990)). Auch diese Substanz kommt für eine Anwendung als Hemmstoff der Aldosteron- oder Glucocorticoidbildung nicht in Frage, da sie ein sehr starker Aromatasehemmstoff ist und daher hochpotent in die Geschlechtshormonbildung eingreift. Im Lichte des vorstehenden Standes der Technik bestand ein Bedürfnis nach potenten und selektiven Inhibitoren der llß-Hydrolase CYPIlBl und der Aldosteronsynthase CYP 11B2.
Andererseits sind 1-Heteroarylmethyliden substituierte Indane aus den folgenden Veröffentlichungen bekannt:
Aus der WO 97/12874 sind Verbindungen gemäß der nachfolgenden Formel (I) bekannt,
wobei drei von R1, R2, R4, R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-4 Alkyl, C2-4 Alkenyl, C3-6 Cycloalkyl, Hydroxy, Ci-4 Alkoxy, Ci-4 Hydroxyalkyl, Halogen, Nitro oder optional substituiertes Amino sind, und einer von R1, R2, R4, R5 Wasserstoff ist; R3 ein 4-Imidazolylrest; R6 Wasserstoff; R7 Wasserstoff oder Ci-4 Alkyl; R8
Wasserstoff, Ci-4 Alkyl, Hydroxy oder Ci-4 Alkoxy; R9 Wasserstoff oder Ci_4 Alkyl;
R10 Wasserstoff oder Ci_4 Alkyl; und n = 1 oder 2 ist. Diese Verbindungen besitzen Affinität für α2-Rezeptoren und sind u. a. für die Behandlung von
Hypertension, Glaukom, chronischem oder akutem Schmerz geeignet. Aus der WO 01/51472 sind Verbindungen gemäß der oben gezeigten Formel (I) bekannt, wobei R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff sind oder ein bis drei von R1, R2, R4, R5 unabhängig voneinander Halogen, Hydroxy, NH2, Halo-Ci-6-Alkyl, Ci_6- Alkyl, Ci-6-Alkoxy oder HO-(Ci-6)-Alkyl sind; R3 ein 4-Imidazolylrest ist; R6 und R7 Wasserstoff sind; einer der Reste R6, R7, R8 und R9 ein zyklischer Rest ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, C3-7-Cycloalkyl und C5-7- Cycloalkenyl ist, oder ein Methylrest ist, der solch einen zyklischer Rest und optional einen oder zwei Ci-6-Al ky I resten trägt, zwei der Reste R6, R7, R8 und R9 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, Ci-6-Alkyl, Halo-Ci-6-alkyl, Ci-6- Alkoxy oder Hydroxy-Ci-6-alkyl sind, und die übrigen Reste R6, R7, R8 und R9 Wasserstoff sind; R10 Wasserstoff oder Ci_6-Alkyl ist; und n = 1 oder 2 ist. Diese Verbindungen besitzen Affinität für α2-Adrenorezeptoren und zur Behandlung von Krankheiten des ZNS als auch von Krankheiten des peripheren Systems wie z. B. Diabetes und sexueller Dysfunktion geeignet. Aus der US 3 442 893 sind Verbindungen gemäß der oben gezeigten Formel (I) bekannt, wobei R1 Wasserstoff, Hydroxy, Methoxy oder Alkylcarbonyloxy; R2 Hydroxy, Alkylcarbonyloxy oder Methoxy; R3 4-Pyridyl oder 4-Piperidylrest ist; R4 bis R10 Wasserstoff sind; und n = 1 ist. Aus der DE 16 45 952 sind Verbindungen gemäß der oben gezeigten Formel (I) bekannt, wobei R1 Wasserstoff; R2 Hydroxy, Ci_4-Alkoxy oder Ci_4- Alkylcarbonyloxy; R3 ein 4-Pyridylrest oder 4- Piperidylrest ist; R4 bis R7, R8 und R9 Wasserstoff sind; R10 Wasserstoff oder Ci_2- Alkyl; und n = 2 ist. Diese Verbindungen sind als Wachstumsregulatoren für die Keimdrüsen von Warmblütern geeignet.
Kumler, P.L und Dybas, R.A., J. Org. Chem. 35(11), 3825-3831 (1970) untersuchen das Verhalten von Verbindungen gemäß der oben gezeigten Formel (I) in Photozyklisierungsreaktionen, wobei R1, R2, R4, R5, R8 bis R10 Wasserstoff sind; R3 ein 2-Pyridylrest ist; R6 und R7 beide Wasserstoff oder beide Methyl sind; und n = 1 oder 2 ist.
Reimann, E. und Hargasser, E., Arch. Pharm. 322, 159-164 (1989) beschreibt die Synthese von Verbindungen gemäß der oben gezeigten Formel (I), wobei R1 Wasserstoff; R2 Wasserstoff oder Methoxy; R3 ein 3-(4-Methyl)pyridylrest ist; R4 bis R10 Wasserstoff sind; und n = 2 ist. Schließlich beschreibt Vanelle, P. et al., Tetrahedron 47(28), 5173-5184 (1991) eine Verbindung gemäß der oben gezeigten Formel (I), wobei R1, R2, R4 bis R10 alle Wasserstoff sind; R3 3-Nitroimidazo[l,2-a]pyrid-2-yl ist; und n = 2 ist.
Die Synthese von 1-Heteroarylmethylen-substituierten Indanen durch Pd(PPh3)4- katalysierte Reaktion von 4-(o-Iodophenyl)-l-butin mit Heteroaryl-Zinkchlorid wurde bereits beschrieben (Luo, FT. & Wang, R.T., Heterocycles 31(8): 1543-
1548 (1990)). Allerdings wurde in dieser wissenschaftlichen Veröffentlichung lediglich das Grundgerüst in Z-Konfiguration ohne weitere Substituenten an den
C-Atomen des Indans oder des Heterozyklus vorgestellt. Weitere Beispiele mit N- Heterozyklen werden genannt: Z-2-(l-Undanylidenmethyl)pyridin, Z-3-(l-
Undanylidenmethyl)pyridin (CAS132819-71-7), Z-2-(l-Undanylidenmethyl)-r- methylpyrol und Z-2-(Undanylidenmethyl)benzothiazol.
Die Synthese der E-Isomere ist auf diesem Wege nicht möglich, des Weiteren werden für diesen Syntheseweg teure Chemikalien (Pd- und Zn-Derivate) benötigt. Eine für eine Vielzahl unterschiedlich substituierter Tetraline oder Indane geeignete Darstellung über die entsprechenden Tetralone bzw. Indanone ist bisher nicht bekannt.
Im Vorfeld der vorliegenden Anmeldung wurde eine Synthese zur Herstellung von Imidazolyl-substituierten Indanen entwickelt (Mitrenga, M., Dissertation Universität Saarbrücken 1996, Shaker-Verlag, Aachen (1997)), der das folgende Syntheseschema zugrunde liegt:
n=1 ,2
Reaktionsbedingungen: (a) NaBH4, MeOH/CH2CI2, 15 min bei O0C, Ih bei RT; (b) PPh3 HBr, Benzol, 12h, Rückfluss; (c) EtONa, 4(5)-Imidazolcarboxaldehyd, N2, 12h, Rückfluss; (d) Isomerentrennung durch Flash-Säulenchromatographie.
Es zeigte sich jedoch bei Vergleichsversuchen (s. Bsp. 3), dass diese Reaktion nicht für alle Imidazolderivate reproduzierbar ist. Die Schwierigkeit dieser
Reaktion liegt offenbar in der Bereitung des Imidazolyl-Anions durch NaOEt. Dieses Anion scheint nicht besonders stabil zu sein. Diese Synthese war überdies nur zur Herstellung von Imidazolylverbindungen geeignet, da der verwendete Imidazolylaldehyd als Base und gleichzeitig Reaktant eingesetzt wurde.
Es bestand daher ein Bedarf an einem Syntheseverfahren für Heteroarylmethylen-substituierte Indane und Tetraline, das auf ein breites Spektrum von Heteroarylen anwendbar ist und Zugang zu E- und Z-Isomeren der Methyliden-Verbindungen ermöglicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde gefunden, dass bestimmte aromatische Verbindungen zur selektiven Hemmung der llß-Hydroxylase CYPIlBl und/oder der Aldosteronsynthase CYPl 1B2 geeignet sind. Deren biologische Aktivität bezüglich der Hemmung von boviner CYPIlB und humaner CYP11B2, CYPIlBl, sowie zur Feststellung der Selektivität von humaner CYP17 (17α-Hydroxylase-C17,20-lyase, Schlüsselenzym der Androgenbiosynthese) und CYP19 wurde untersucht. Im Vergleich zu bereits beschriebenen CYP11B2-Inhibitoren (Hartmann, R.W. et al., Eur. J. Med. Chem. 38:363-366 (2003)) und zu bekannten Inhibitoren der Corticoidboisynthese (Fadrozol) bzw. Steroid biosynthese (Ketoconazol) sind die im folgenden vorgestellten Verbindungen potenter und selektiver.
Weiterhin wurde ein geeignetes Syntheseverfahren für diese aromatischen Verbindungen, deren Hauptvertreter Imidazolylmethylen-tetrahydronaphthaline und -indane sind, entwickelt.
Gegenstand der Erfindung sind somit
(1) die Verwendung einer Verbindung mit der Struktur der Formel (I)
I worin
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy, Nitro, Alkyl, Alkoxy, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonyloxy, Alkylsulfinyl und Alkylsulfonyl (worin die Alkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können), Aryl- und Heteroarylresten und deren partiell oder vollständig gesättigten Äquivalenten, welche mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können, Aryloxy- und Heteroaryloxyresten, wobei Aryl und Heteroaryl die vorstehend angegebene Bedeutung aufweist, -COOR11, -SO3R11, -CHO, -CHNR11, -N(Rn)2, -NHCOR11 und - NHS(O)2R11;
R3 ausgewählt ist aus stickstoffhaltigen monocyclischen oder bicyclischen Heteroarylresten und deren partiell oder vollständig gesättigten Äquivalenten, welche mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können und zumindest ein Stickstoffatom aufweisen, das nicht an das Methyliden-C-Atom gebunden und nicht substituiert ist;
R4, R5, R6, R7, R8, R9 und R10 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy, Nitro, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederalkylcarbonyloxy, Niederalkylcarbonylamino, Niederalkylsulfonylamino, Niederalkylthio, Niederalkylsulfinyl und Niederalkylsulfonyl (worin die Niederalkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können), -N(Rn)2, -COOR11 und - SO3R11, oder
R8 oder R9 mit R6 oder R7 und/oder mit R8 oder R9 des benachbarten C-Atoms eine oder zwei Doppelbindungen bilden, oder R8 (und R9) mit R6 (und R7) oder mit R8 (und R9) des benachbarten C-Atoms und den dazugehörigen C-Atomen einen gesättigten oder ungesättigten anellierten Aryl- oder Heteroarylring bilden, wobei die Atome des anellierten Aryl- oder Heteroaryl rings mit 1-3 Resten R12 substituiert sein können, oder R4 und R10 gemeinsam eine Methylen-, Ethylen- oder Ethylidenbrücke bilden, wobei die Atome der Brücke mit einem oder zwei Resten R12 substituiert sein können, oder ein Ringatom in ortho-Position des Heteroarylrestes von R3 direkt oder über eine Methylen- oder Methylidenbrücke eine Bindung mit R6 und/oder R7 bildet, wobei das Brückenatom mit ein oder zwei Resten R12 substituiert sein kann; R11 unabhängig vom Auftreten weiterer Rn-Reste ausgewählt ist aus H, Niederalkyl (das geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 R12 substituiert sein kann) und Aryl, das mit 1 bis 3 R12 substituiert sein kann; R12 unabhängig vom Auftreten weiterer R12-Reste ausgewählt ist aus H, Hydroxy, Halogen, -CN, -COOH, -CHO, Nitro, Amino, mono- und bis-(Niederalkyl)amino, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederalkylcabonyloxy, Niederalkylcarbonylamino, Niederalkylthio, Niederalkylsulfinyl,
Niederalkylsulfonyl, Hydroxy-Niederalkyl, Hydroxy-Niederalkoxy, Hydroxy- Niederalkylcarbonyl, Hydroxy-Niederylkylcarbonyloxy, Hydroxy- Niederalkylcarbonylamino, Hydroxy-Niederalkylthio, Hydroxy-Niederalkylsufinyl, Hydroxy-Niederalkylsufonyl, mono- und bis-(Hydroxy-Niederalkyl)amino und mono- und polyhalogeniertes Niederalkyl (worin die Niederalkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein können); n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes derselben zur Behandlung von Hypercortisolismus, Diabetes mellitus, Herzinsuffizienz und
Myocardfibrose;
(2) die Verbindung der Formel (I) oder deren pharmazeutisch wirksame Salze, wobei alle Variablen die in (1) angegebene Bedeutung haben, vorausgesetzt dass, wenn
(a) n = 1, R1, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl oder 4-Pyridyl;
(b) n = 2, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R1 Cl oder CN ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl; (C) n = 2, R1 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R2 CN ist, dann ist R3 nicht 4- Imidazolyl;
(d) n = 1, R1 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R2 F, Cl, Br oder CN ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl;
(e) n = 2, R1, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl, 4- Pyridyl, 4-Methyl-3-pyridyl oder 3-Nitroimidazo[l,2-a]pyrid-2-yl;
(f) n = 1 oder 2; drei der Reste R1, R2, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-4-Alkyl, C2-4-Alkenyl, C3-7-Cycloalkyl, Hydroxy, Ci-4-Alkoxy, Hydroxy-Ci-4-alkyl, Halogen, Trifluormethy, Nitro oder optional substituiertes Amino sind und der vierte Rest aus R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff ist, R6 Wasserstoff ist, R7 Wasserstoff oder Ci-4-Al ky I ist, R8 Wasserstoff, Ci-4-Al ky I, Hydroxy oder Ci-4-Alkoxy ist, R9 und R10 unabhängig voneinander Wasserstoff oder Ci-4-Alkyl sind, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl;
(g) n = 1 oder 2, drei der Reste R1, R2, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, Amino, Halo-Ci-6-alkyl, Ci-6-Alkyl, Ci-6-Alkoxy oder Hydroxy-Ci-6-alkyl sind und der vierte Rest aus R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff ist, einer der Reste R6, R7, R8 und R9 C3-7-Cycloalkyl, C5-7-Cycloalkenyl, C3-7-
Cycloalkylmethyl oder C3-7-Cycloalkenylmethyl ist, wobei der Methylrest mit einem oder zwei Ci-6-Al ky I resten substituiert sein kann, zwei der Reste R6, R7, R8 und R9 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, Ci-6-Alkyl, Halo-Ci-6-alkyl, Ci-6-AIkOXy oder Hydroxy-Ci-6-alkyl sind, und die übrigen Reste R6, R7, R8 und R9
Wasserstoff sind, R10 Wasserstoff oder Ci-6-Alkyl ist, dann ist R3 nicht 4-
Imidazolyl;
(h) n = 1, R1 Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy oder Alkylcarbonyloxy ist, R2
Hydroxy, Alkylcarbonyloxy oder Alkoxy ist, R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Pyridyl;
(i) n = 2, R1 Wasserstoff ist, R2 Hydroxy, Ci-4-Al koxy oder Ci-4-Al kylcarbonyloxy ist, R4 - R9 Wasserstoff ist, R10 Wasserstoff oder Ci-4-Alkyl ist, dann ist R3 nicht 4-
Pyridyl;
G) n = 1, R1, R2, R4, R5, R8 - R10 Wasserstoff ist, R6 und R7 beide Wasserstoff oder beide Methyl sind, dann ist R3 nicht 2-Pyridyl;
(k) n = 2, R1, R2, R4, R5 und R8 - R10 Wasserstoff ist, R6 und R7 beide Methyl sind, dann ist R3 nicht 2-Pyridyl ;
(I) n = 2, R1 Wasserstoff ist, R2 Wasserstoff oder Methoxy ist, R4 - R10
Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Methyl-3-pyridyl oder deren pharmazeutisch geeignete Salze;
(3) ein Verfahren zur Synthese der Verbindungen gemäß (2), umfassend die
Reduktion der Verbindung (II):
π zum entsprechenden Alkohol und eine daran anschließende Wittig-Reaktion mit der Verbindung (III)
R10
Cr ^R3 m wobei die Variablen die in (2) angegebene Bedeutung haben und funktionelle Gruppen in R^R10 optional mit geeigneten Schutzgruppen versehen sein können; (4) eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine wie in (2) definierte Verbindung; und (5) die Verwendung der in (1) definierten Verbindungen zur selektiven Hemmung von Säugetier-P450-Oxygenasen, zur Hemmung der humanen oder Säugetier- Aldosteronsynthase oder Steroid-llß-Hydroxylase, besonders zur Hemmung der humanen Steroid-llß-Hydroxylase CYPIlBl oder Aldosteron-Synthase CYP11B2, insbesondere zur selektiven Hemmung der CYPl 1B2 bei gleichzeitiger geringer Beeinträchtigung der humanen CYPIlBl.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In den Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) der Erfindung haben die Variablen und die zu ihrer Charakterisierung verwendeten Termini die folgende Bedeutung:
"Alkylreste" und "Alkoxyreste" im Sinne der Erfindung können geradkettig, verzweigt oder cyclisch sein und gesättigt oder (partiell) ungesättigt sein. Bevorzugte Alkylreste und Alkoxyreste sind gesättigt oder weisen eine oder mehrere Doppel- und/oder Dreifachbindungen auf. Hier sind bei geradkettigen oder verzweigten Alkylreste solche mit 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere solche mit 1 bis 6 C-Atomen besonders bevorzugt. Bei den cyclischen Alkyresten sind mono- oder bicyclische Alkylreste mit 3 bis 15 C-Atomen, insbesondere monocyclische Alkylreste mit 3 bis 8 C-Atomen besonders bevorzugt.
"Niederalkylreste" und "Niederalkoxyreste" im Sinne der Erfindung sind geradkettige, verzweigte oder cyclische gesättigte Niederalkylreste und Niederalkoxyreste oder solche mit einer Doppel- oder Dreifachbindung. Bei den geradkettigen sind solche mit 1 bis 6 C-Atomen, insbesondere mit 1 bis 3 C- Atomen besonders bevorzugt. Bei den cyclischen sind solche mit 3 bis 8 C- Atomen besonders bevorzugt. "Aryle" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen mono-, bi- und tricyclische Arylreste mit 3 bis 18 Ringatomen, die optional mit einem oder mehreren gesättigten Ringen anelliert sein können. Besonders bevorzugt sind Anthracenyl, Dihydronaphthyl, Fluorenyl, Hydrindanyl, Indanyl, Indenyl, Naphthyl, Naphthenyl, Phenanthrenyl, Phenyl und Tetralinyl. "Heteroarylreste" sind - falls nicht anders angeführt - mono- oder bicyclische Heteroarylyreste mit 3 bis 12 Ringatomen, die vorzugsweise 1 bis 5 Heteroatome ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel aufweisen und die mit einem oder mehreren gesättigten Ringen anelliert sein können. Die bevorzugten stickstoffhaltigen monocyclischen und bicyclischen Heteroaryle umfassen Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Chinazolinyl, Chinolyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Dihydroindolyl, Dihydroisoindolyl, Dihydropyranyl, Dithiazolyl, Homopiperidinyl, Imidazolidinyl, Imidazolinyl, Imidazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isochinolyl, Isoindolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolyl, Isoxazolidinyl, Isoxazolyl, Morpholinyl, Oxadiazolyl, Oxazolidinyl, Oxazolyl, Phthalazinyl, Piperazinyl, Piperidyl, Pteridinyl, Purinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazinyl, Pyrazolyl, Pyrazolinyl, Pyridazinyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolidin-2-onyl, Pyrrolinyl, Pyrrolyl, Tetrazinyl, Tetrazolyl, Tetrahydropyrrolyl, Thiadiazolyl, Thiazinyl, Thiazolidinyl, Thiazolyl, Triazinyl und Triazolyl. Besonders bevorzugt sind mono- oder bicyclische Heteroarylreste mit 5 bis 10 Ringatomen, die vorzugsweise 1 bis 3 Stickstoffatome aufweisen, ganz besonders bevorzugt sind Isochinolyl, Imidazolyl, Pyridyl und Pyrimidyl.
"Anellierte Aryl- oder Heteroarylringe" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen solche monocyclischen Ringe mit 5 bis 7 Ringatomen, die über zwei benachbarte Ringatome mit dem Nachbarring anelliert sind. Sie können gesättigt oder ungesättigt sein. Die anellierten Heterorarylringe umfassen dabei 1 bis 3 Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff-, Schwefel- oder Sauerstoffatome, besonders bevorzugt Sauerstoffatome. Bevorzugte anellierte Arylringe sind Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl und Benzyl, bevorzugte Heteroarylringe sind Furanoyl, Dihydropyranyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyridyl und Pyrimidyl.
"Pharmazeutisch geeignete Salze" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen dabei Salze der Verbindungen mit organischen Säuren (wie Milchsäure, Essigsäure, Aminosäure, Oxalsäure usw.), anorganischen Säuren (wie HCl, HBr, Phosphorsäure usw.) und, falls die Verbindungen Säuresubstituenten aufweisen, auch mit organischen oder anorganischen Basen. Bevorzugt sind Salze mit Oxalsäure und HCl. Bevorzugte Verbindungen der Ausführungsform (1) der Erfindung sind dabei solche mit den Formeln (Ia) bis (Ig), wobei die Verbindungen mit der Formel (Ia), (Ib), (Ic) und (Id) besonders bevorzugt sind:
wobei entweder eine Einfach- oder Doppelbindung, bevorzugt eine
Doppelbindung ist, und in Verbindung (If) und (Ig) der anellierte Ring R3 der Rest des mono- oder bicyclische Heterozyklus R3 ist, welcher vorstehend unter Ausführungsform (1) der Erfindung definiert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verbindungen (Ia), (Ib) und (Ic) sind dabei die Verbindungen der folgenden Formel (Ih):
Ih
worin R1 H, Halogen, CN, O-Alkyl, O-Alkenyl, O-Alkinyl, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, n 1-3 ist, und Het ein Heteroaromat mit 5 - 10 Ringatomen mit 1 - 3 Stickstoffatomen ist, und deren pharmazeutisch geeignete Salze.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Verbindungen (Ia), (Ib) und (Ic) sind die Verbindungen der folgenden Formel (Ii) :
Ii
worin R1 H, Halogen, CN, O-Alkyl, O-Alkenyl, O-Alkinyl, Alkyl, Alkenyl oder Alkinyl ist, n 1 oder 2 ist und die Doppelbindungen E- oder Z-Konfiguration aufweisen, und deren pharmazeutisch geeignete Salze.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), wie vorstehend unter (1) und (2) definiert bzw. der vorstehend gezeigten Formeln (Ia) bis (Ig), worin (i) R1 oder R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, CN, Hydroxy, Ci-io-Alkyl- und Ci-I0-Al koxyresten, wobei die Alkylreste oder Alkoxyreste geradkettig und gesättigt sind und mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können; und/oder
(ii) R3 ausgewählt ist aus stickstoffhaltigen monocyclischen Heteroarylresten mit 5 - 10 Ringatomen und 1 bis 3 Stickstoffatomen, insbesondere ausgewählt ist aus Isochinolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Pyrazinyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Triazinyl und Triazoyl; und/oder
(iii) R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy und Ci-6-Alkyl- und Ci-6-Al koxyresten, die mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können; und/oder
(iv) R12 ausgewählt ist aus H, Halogen, Hydroxyl, CN, Ci-3-Alkyl und Ci-3-AIkOXy; und/oder
(v) n 1 oder 2 ist.
Hieraus besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der Formeln (I) und (Ia) bis (Ig), insbesondere Verbindungen der Formeln (Ia) bis (Ic), in denen
(i) R1 oder R2 Wasserstoff ist;
(ii) der andere der Substituenten R1 oder R2 ausgewählt ist aus H, Fluor, Chlor,
CN, Hydroxy, Ci-3-Alkyl und Ci-3-AIkOXy;
(iii) R3 ausgewählt ist aus Isochinolyl, Pyridyl, Imidazolyl und Pyrimidyl; und (iv) R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 H sind.
Weiterhin bevorzugt hieraus sind Verbindungen der Formel (Id), in denen (i) R1 oder R2 Wasserstoff ist;
(ii) der andere der Substituenten R1 oder R2 ausgewählt ist aus H, Fluor, Chlor, CN, Hydroxy, Ci-3-Alkyl und Ci-3-Alkoxy; (iii) R3 ausgewählt ist aus Pyridyl, Imidazolyl, Isochinolyl und Pyrimidyl; (iv) R5, R6, R7, R8, R9 und R12 H sind; und (V) eine Doppelbindung ist.
Die Verbindungen der Formel (I) können in Abhängigkeit von der Position der Substituenten R3 und R10 in E- und Z-Konfiguration vorliegen. Die vorliegende Erfindung umfasst sowohl das Isomerengemisch als auch die isolierten E- und Z- Verbindungen. Auch weisen die Verbindungen (I) Chiralitätszentren auf (z. B. die mit R6/R7 und R8/R9 substituierten C-Atome). Auch hier sind sowohl die Gemische der Stereoisomeren als auch die isolierten Einzelverbindungen von der Erfindung eingeschlossen. Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) sind dabei die folgenden Verbindungen: E,Z-3-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(6-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(6-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(6-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(7-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(7-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(7-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(6-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(6-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(6-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(7-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(7-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(7-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(6-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(6-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(6-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(6-Nitril-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenπnethyl)-iπnidazol, E,Z-4-(7-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(7-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(7-Methoxy-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol, E,Z-3-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E^-S-CS-Chloro-l-indanylidenmethyO-pyridin, E,Z-3-(5-Bromo-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(5-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyιϊdin, E,Z-3-(5-Ethoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(6-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E^-S-Cβ-Chloro-l-indanylidenmethyO-pyridin, E,Z-3-(4-Methyl-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(4-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(4-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(7-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(6-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-4-(6-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-5-(l-Indanylidenmethyl)-pyrinnidin,
E,Z-5-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyιϊnnidin,
E^-S-CS-Chloro-l-indanylidenmethyO-pyriπnidin,
E^-S-CS-Methoxy-l-indanylidenmethyO-pyrinnidin, E,Z-5-(6-Fluoro-l-indanylidenπnethyl)-pyriπnidin,
E^-S-Cβ-Chloro-l-indanylidenmethyO-pyiϊmidin,
E^-S-Cβ-Methoxy-l-indanylidenπnethyO-pyriπnidin,
E,Z-4-(l-Indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(5-Bromo-l-indanylidennnethyl)-innidazol,
E,Z-4-(5-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(5-Nitril-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(6-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(6-Chloro-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(6-Bromo-l-indanylidennnethyl)-innidazol,
E,Z-4-(6-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(6-Nitril-l-indanylidenmethyl)-imidazol und
S-Cl^-Dihydroacenaphthylen-S-yOpyridin. Hieraus sind besonders bevorzugt
E,Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-innidazol,
E,Z-4-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(6-Nitril-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-innidazol, E,Z-4-(7-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-innidazol,
E^^-Cy-Chloro-l^^^-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyO-iπnidazol,
E,Z-3-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E^-S-CS-Chloro-l-indanylidenmethyO-pyridin, E,Z-3-(4-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(4-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(5-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(7-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(5-Fluoro-l-indanylidenπnethyl)-pyriπnidin und 3-(l,2-Dihydroacenaphthylen-3-yl)pyridin und insbesondere
Z-^CS-Chloro-l-IndanylidenmethyO-iπnidazol,
Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
Z-4-(6-Nitril-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E-3-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(5-Fluoro-l-indanylidenπnethyl)-pyridin,
E-3-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(5-Methoxy-l-indanylidenπnethyl)-pyridin,
E-3-(4-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(7-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(5-Fluoro-indanylidenmethyl)-pyrinnidin und
3-(l,2-Dihydroacenaphthylen-3-yl)pyridin.
Die erfindungsgemäßen chemischen Verbindungen können in dem Verfahren gemäß Ausführungsform (3) durch Reduktion der Verbindung (II) zum entsprechenden Alkohol und eine daran anschließende Wittig-Reaktion synthetisiert werden (vgl. Bsp. 1-3). Das Verfahren erfolgt bevorzugt gemäß dem folgenden allgemeinen Syntheseschema:
π IV
Reaktionsbedingungen: (a) NaBH4, MeOH/CH2CI2, 15 min bei O0C, 1 h bei RT; (b) PPh3«HBr, Benzol, 12 h Rückfluss; (c) heterocyclische Carbonylverbindung (III), Base (bevorzugt K2CO3 mit 18-Krone-6, oder EtONa), 12 h Rückfluss.
Schlüsselschritt der Synthese ist eine Wittig-Reaktion unter Einsatz verschiedener heterozyklischer Carbonylverbindungen, bevorzugt Aldehyde, und geeigneter Salze, insbesondere Phosphoniumsalze, der bicyclischen Komponente. Ausgehend von den entsprechenden Ketonen II, die mit einem geeigneten Reduktionsmittel, bevorzugt NaBH4, zum entsprechenden Alkohol reduziert werden, entstehen Alkohol-Zwischenstufen. Diese werden in ihre Phosphoniumsalze umgewandelt. Dann folgt eine modifizierte Wittig-Reaktion mit Phosphoniumsalz und heterozyklischer Carbonylverbindung als Reaktanden, einer geeigneten Base, insbesondere K2CO3, z.B. in trockenem CH2CI2, und einem geeigneten Phasentransfer-Katalysator, bevorzugt 18-Krone-6. Für die Herstellung von Imidazol-Verbindungen ist als geeignete Base NaOEt, z.B. in Ethanol, ohne Zusatz eines Phasentransferkatalysators bevorzugt.
Das nach der Wittig-Reaktion erhaltenen Gemisch aus E- und Z-Isomeren kann als Gemisch eingesetzt oder in seine Isomeren getrennt werden. Die Trennung erfolgt durch Kristallisieren oder chromatographische Methoden, bevorzugt durch
Säulenchromatographie oder Flash-Säulenchromatographie. Die Isomere können in ihre stabilen Salze überführt werden, bevorzugt in HCl- oder Oxalsäuresalze.
Für die spektroskopische Analyse sind dies bevorzugt stabile Hydrochloride oder Oxalate, für die erfindungsgemäße Verwendung nach Ausprägungsform (1) sind dies bevorzugt pharmazeutisch akzeptablen Salze.
Die erfindungsgemäße Synthese kann zur Herstellung der E- und Z-Isomere der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Die Ausbeuten können durch die erfindungsgemäße Synthese gegenüber bereits bekannten Verfahren zum Teil drastisch erhöht werden (bis zu 90%), insbesondere läßt sich der Anteil an Z-Isomer im Produkt deutlich steigern. Eine bevorzugte Anwendung der Synthese ist daher die Herstellung der Z-Isomere der Verbindungen gemäß Ausführungsform (3) der Erfindung.
Für die Synthese (3) zur Herstellung von Verbindungen mit unter den Bedingungen der Wittig-Reaktion deprotonierbaren Substituenten bzw. funktionellen Gruppen der heterozyklischen Carbonylverbindungen ist es erforderlich, diese mit geeigneten Schutzgruppen zu versehen. Geeignete Schutzgruppen und deren Entfernung sind dem Fachmann z.B. aus T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, Harvard University, John Wiley & Sons (1981) zugänglich. Die bedeutet selbstverständlich, dass bei Verwendung solcher Schutzgruppen in dem erfindungsgemäßen Verfahren (3) ein nachgeschalteter Entschützungsschritt notwendig ist. So erfolgt zum Beispiel die Synthese von Imidazolderivaten nach dem Reaktionsschema
in m SG i SG Reaktionsbedingungen: (a) Anbringen einer Schutzgruppe (SG), wobei SG bevorzugt SO2NMe2 ist, durch eine geeignete Reaktion, bevorzugt Me2NSO2CI, NEt3, CH2CI2, 12h bei RT; (b) Wittig-Reaktion mit Phosphoniumsalz (V), bevorzugt durch K2CO3, 18-Krone-6, CH2CI2, 12h Rückfluss; (c) Isomerentrennung durch Flash-Chromatographie; (d) Entfernung der Schutzgruppe, bevorzugt durch HCl (4N), Dioxan, 12h Rückfluss.
(vgl. Bsp. 3, "Alternative Synthese"). Dieses Syntheseverfahren ermöglicht die Herstellung von speziellen Imidazolderivaten und deren Hydrochloriden, die nach bislang bekannten Verfahren (Mitrenga, M., Dissertation Universität Saarbrücken 1996, Shaker-Verlag, Aachen (1997)) nur mit hohem Aufwand oder überhaupt nicht zugänglich sind. Bevorzugt werden dabei Schutzgruppen am Imidazol angebracht, die während der Isomerentrennung am Ring verbleiben und dadurch insbesondere die chromatographische Trennung, welche bei freien Imidazolgruppen oft schwierig ist, deutlich erleichtern. Diese Schutzgruppen können durch geeignete Reagenzien zur Gewinnung des Endprodukts abgespalten werden.
Die Verbindungen der Struktur (Id) können in einer vierstufigen Synthese ausgehend von Acenaphthen oder einem passenden Derivat desselben, gegebenenfalls gefolgt von einer Aufreinigung z.B. durch chromatographische Trennung, hergestellt werden (siehe auch nachfolgendes Reaktionsschema): Nitrierung des Acenapthens (Chen, M. et al., Ranliao Gongye 38:21-23 (2001)) und anschließende Hydrierung (Friedman, O. M. et al., J. Am. Chem. Soc. 71:3010-3013 (1949)) liefert u.a. 3-Aminoacenaphthen. Nach der folgenden Sandmeyer-Reaktion wird das Gemisch der erhaltenen Brom-Verbindungen isoliert und direkt in einer Suzuki-Kupplung mit 3-Pyridinborsäure zu dem gewünschten Produkt umgesetzt. Das gewünschte Produkt, das Acenaphthen- Derivat 50 wird anschließend z.B. mit Hilfe der Flash-Säulenchromatographie isoliert. Das so dargestellte Öl kann zur Erhöhung der Stabilität in das entsprechende Hydrochlorid überführt werden.
(C)
Reaktionsbedingungen: (a) HNO3, in Acetanhydrid, 20 h bei 1O0C; (b) H2, Pt/C (5%), in THF; (c) 1. NaNO2, in HBr, O0C, 2. CuBr, in HBr/Toluol, O0C, Zugabe des Diazonium- salzes, 10 min bei O0C, 2h bei 1000C; (d) Na2CO3-Lösung, 3-Pyridinborsäure, in Methanol, Tetrakis(triphenylphosphin)palladium, N2, Rückfluss, 12 h.
Die Prüfung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf Verwendung nach Ausführungsform (1) erfolgt an in wtro-Testsystemen, bevorzugt an mehr als einem in wtro-Testsystem. Die erste Stufe dieser erfindungsgemäßen Tests umfasst die Prüfung mit unspezifischem bovinem adrenalem CYPIlB aus Mitochondrien auf Wirkung der Testsubstanzen (Hartmann, R. et al., J. Med. Chem. 38:2103-2111 (1995)). Die zweite Stufe umfasst die Prüfung mit humanen CYPllB-Enzymen, bevorzugt humanen CYPIlBl und CYP11B2. Diese humanen Enzyme können entweder rekombinant exprimiert werden, insbesondere in Schizosaccharomyces pombe oder V79-Zellen, oder in einer getesteten Human-Zellinie, insbesondere der adrenocorticalen Tumorzelllinie NCI-H295R enthalten sein (vgl. Bsp. 5). Besonders bevorzugt werden Substanzen zur erfindungsgemäßen Verwendung nach (1) eingesetzt, welche eine Wirkung auf humane CYPllB-Enzyme zeigen, da zwischen Testdaten mit bovinen und humanen Enzymen keine oder nur eine sehr geringe Korrelation besteht (vgl. Bsp. 9). Zur Identifizierung neuer therapeutisch wirksamer Verbindungen gemäß Ausführungsform (1) für den Menschen sind insbesondere Spalthefe und V79MZh-Zellen, welche CYPIlBl und CYP11B2 rekombinant exprimieren, und NCI-H295R-Zellen geeignet.
Zur erfindungsgemäßen Hemmung von bovinem CYPIlB sind von den Imidazolderivaten besonders die Verbindungen 41b, 42b, 44b, 45a, 45b, 48b, 49 b geeignet, welche im Vergleich zum nicht-selektiven CYP-Inhibitor Ketoconazol (78%) eine prozentual hohe Inhibitionswirkung im Bereich von 90% zeigen (Tab. 4). Von den Imidazol-Verbindungen gemäß Ausführungsform (1) und (2) sind insbesondere die Z-Isomere zur Verwendung nach (5) geeignet, ganz besonders bevorzugt ist Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-imidazol 48 b (Bsp. 9); letzteres ist ein hochpotenter CYP11B2-Inhibitor (IC50:4 nM), der eine fünfache Selektivität im Vergleich mit CYPIlBl (IC50: 20 nM) aufweist.
Zur Bestimmung der Inhibition von humaner CYP11B2 durch die Testverbindungen kann ein Screening-Test in rekombinanter S. pombe, insbesondere CYPllB2-exprimierender S. pombe Pl, verwendet werden (Bsp. 5A). Für eine weitere Untersuchung auf den Einsatz gemäß Verwendung (5) werden danach besonders solche Verbindungen ausgewählt, die eine höhere inhibitorische Wirkung als die Referenz Fadrozol zeigen.
Überraschenderweise besteht eine niedrige oder gar keine Korrelation zwischen Inhibitionswerten der bovinen und humanen Enzyme.
In einer dritten Stufe können Verbindungen auf ihre Verwendung gemäß (5) in V79 MZh-Zellen (Hamsterlungen-Fibroblasten), die entweder CYPIlBl oder CYPl 1B2 exprimieren, auf ihre Aktivität und Selektivität getestet werden (Bsp. 5B). Es werden unterschiedliche Inhibitionsprofile gefunden: Inhibitoren, die entweder selektiv für CYPIlBl oder für CYPl 1B2 sind, und Inhibitoren die beide CYPllB-Enzyme hemmen können. Zur selektiven Inhibition von CYPIlBl gemäß Ausführungsform (1) und (2) sind besonders die Imidazolderivate 41b, 42b, 44b, 45a, 45b, 46a, 48a und 49a sowie die Verbindungen 6a, 8a, IQa, 13b geeignet, zur selektiven Inhibition von CYP11B2 die Imidazolderivate 48b und 49b sowie viele andere der hier vorgestellten Verbindungen (vgl. Bsp. 6-9). Auch das Acenaphthen-Derivat 50 ("Hybrid-Inhibitor") erwies sich als hoch aktiv gegenüber CYPl 1B2 (IC50 = 10 nM) und mit einer IC50 = 2452 nM zusätzlich selektiv gegenüber CYPIlBl.
Die Inhibition von CYP19 durch die Testverbindungen kann in vitro unter Verwendung von humanen placentalen Mikrosomen und [Iß, 2ß-3H]Testosteron als Substrat durchgeführt werden (modifiziert nach: Thompson, E.A. Jr. & Siterii, P.K., J. Biol. Chem. 249:5364-5372 (1974)) (Bsp. 4). Das Chlorderivat 48b, der stärkste CYP11B2-Inhibitor, war ein schwacher Inhibitor von CYP19 (IC50: 39 nM). Die Inhibition von CYP 17 durch die Testsubstanzen kann in vitro mit Mikrosomen aus E.coli, das CYP17 rekombinant exprimiert, und Progesteron als Substrat bestimmt werden (Bsp. 4). Fast alle getesteten Verbindungen zeigten keine oder nur eine schwache Inhibition im Vergleich zur Referenz Ketoconazol. Die NCI-H295R-Zellinie ist kommerziell erhältlich und wird häufig als Modell für den humanen adrenalen Kortex verwendet. Die Zellen wurden 1980 erstmals isoliert (Gazdar, A.F. et al., Cancer Res. 50:5488-5496 (1990)) und enthalten 5 steroidogene CYP450-Enzyme, darunter 17-alpha-Hydroxylase, CYPIlBl und CYP11B2. Da in dieser Zelllinie sämtliche steroidogenen CYP-Enzyme, die im adrenalen Cortex vorkommen, exprimiert werden, stellt sie ein wichtiges Instrument bei der Abschätzung der Selektivität von Hemmstoffen in vitro dar. Wesentlicher Unterschied zu den V79-Zellen ist folglich nicht nur, dass es sich bei NCI-H295R um humane Zellen handelt, sondern auch, dass in V79MZhllBl bzw. V79MZhllB2 jeweils nur ein Targetenzym rekombinant exprimiert in einem ansonsten völlig CYP-Enzym-freien System vorliegt, während NCI-H295R ein wesentlich komplexeres Modell darstellt. Mit Hilfe dieses neuen Modells kann die Voraussage von Wirkungen und Nebenwirkungen von Verbindungen auf die komplexen Enzyme der Nebennierenrinde deutlich präziser werden.
Die Beeinflussung von humanem CYPIlBl und CYP11B2 in NCI-H295R-Zellen durch die in vorliegender Erfindung gefundenen Substanzen wurde erstmals anhand einiger weniger Verbindungen exemplarisch getestet (Bsp. 10).
Die in wVo-Aktivität der hier vorgestellten Verbindungen konnte in ersten Versuchen am Rattenmodell gezeigt werden. Fadrozol senkt die Aldosteron- und Corticosteronkonzentrationen in ACTH-stimulierten Ratten ab (Häusler et al., J. Steroid Biochem. 34:567-570 (1989)). Einige der hier vorgestellten Verbindungen wie z.B. Ia, 5a und 48a zeigten in vivo ein ähnliches Verhalten wie Fadrozol.
Die Verbindung 50 wurde in V79 Zellen auf Hemmung des CYPIlBl und CYPl 1B2 getestet. Verbindung 50 hemmt die humane Aldosteronsynthase im tief nanomolaren Bereich und zeigt zusätzlich nur eine sehr schwache Hemmung des humanen CYPIlBl. Die Substanz ist nicht nur hoch potent, sondern auch sehr selektiv. Die zur Verwendung nach Ausführungsform (5) geeigneten Substanzen der Formel (I) können zur Entwicklung eines Arzneistoffs dienen, der die Lebensqualität von Patienten mit Herzinsuffizienz bzw. myokardialer Fibrose verbessert und die Mortalität entscheidend reduzieren kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen eindeutig, dass es möglich ist, für das Targetenzym CYPl 1B2 Inhibitoren zu entwickeln, die hochaktiv sind, die allerdings CYPIlBl, welches eine große strukturelle und funktionelle Homologie zu CYP11B2 aufweist, nur wenig beeinflussen, und umgekehrt.
Die zur Verwendung nach Ausführungsform (5) geeigneten Substanzen der Formel (I) können des weiteren zur Entwicklung eines Arzneistoffs dienen, der die Lebensqualität von Patienten mit Hypercortisolismus bzw. Diabetes mellitus verbessert und die Mortalität entscheidend reduzieren kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Erfindung zeigen eindeutig, dass es möglich ist, für das
Targetenzym CYPIlBl Inhibitoren zu entwickeln, die hochaktiv sind, die allerdings CYPl 1B2, welches eine große strukturelle und funktionelle Homologie zu CYPIlBl aufweist, nur wenig beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind als Einzelverbindungen und in Kombination mit anderen Wirkstoffen und Hilfsstoffen z. B. zur Hemmung von humanen und Säugetier-P450-Oxygenasen, besonders zur Hemmung der humanen oder Säugetier-Aldosteronsynthase, ganz besonders zur Hemmung der humanen Aldosteronsynthase CYPl 1B2 bei gleichzeitiger geringer Beeinträchtigung der humanen CYPIlBl sowie umgekehrt zur Hemmung der CYPIlBl bei gleichzeitiger geringer Beeinträchtigung der CYP11B2 in vitro und in vivo geeignet. Die für CYPl 1B2 selektiven Verbindungen können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie von Herzinsuffizienz, (myo)kardialer Fibrose, (kongestivem) Herzversagen, Hypertonie und primärem Hyperaldosteronismus beim Menschen und Säugetieren eingesetzt werden. Die für CYPIlBl selektiven Verbindungen können zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie von Hypercortisolismus und Diabetes mellitus eingesetzt werden. Diese Arzneimittel bzw. die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß Ausführungsform (4) der Erfindung können neben den erfindungsgemäßen Verbindungen noch weitere Wirkstoffe sowie geeignete Hilfs- und Trägerstoffe enthalten. Geeignete Hilfs- und Trägerstoffe werden vom Fachmann in Abhängigkeit von Anwendungsgebiet und Applikationsform bestimmt. Die Erfindung umfasst darüber hinaus ein Verfahren bzw. die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Vorbeugung, Verlangsamung des Verlaufs oder Therapie einer der folgenden Krankheiten oder Krankheitsbilder: Diabetes mellitus, Hypercortisolismus, Hypertonie, kongestives Herzversagen, Nierenversagen, insbesondere chronisches Nierenversagen, Restenose, Atherosklerose, Nephropathie, koronare Herzkrankheiten, vermehrte Bildung von Kollagen, Fibrose, jeweils verknüpft mit oder nicht verbunden mit Auftritt von Hypertonie, durch Gabe einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieses Verfahren zur Vorbeugung, Verlangsamung des Verlaufs oder Therapie der Myokardfibrose, des kongestiven Herzversagens oder der kongestiven Herzinsuffizienz geeignet und umfasst die Gabe einer wirksamen Dosis eines erfindungsgemäßen Aldosteronsynthase- Inhibitors oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an den betroffenen Menschen oder das betroffene Säugetier.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist dieses Verfahren zur Vorbeugung, Verlangsamung des Verlaufs oder Therapie der stressabhängigen therapieresistenten Diabetes mellitus oder des Hypercortisolismus geeignet und umfasst die Gabe einer wirksamen Dosis eines erfindungsgemäßen Steroidhydroxylase-Inhibitors, insbesondere Steroid-llß-Hydroxylase-Inhibitors, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon an den betroffenen Menschen oder das betroffene Säugetier.
Die bevorzugte Applikation für die vorstehend genannten Verfahren ist die orale Applikation, wobei der Gehalt an Wirkstoff vom Fachmann an die jeweilige Therapie und an den Patienten anzupassen ist.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch das erfindungsgemäße Verfahren nicht einschränken.
Beispiele Material und Analysenmethoden: Schmelzpunktmessungen wurden auf einem Mettler FPl oder einem Stuart Scientific SMP.3 Schmelzpunktapparat bestimmt und sind unkorrigiert. IR-Spektren aus Pulver wurden auf einem Bruker Vector 33 FT-Infrarotspektrometer aufgenommen, oder als KBr- bzw. NaCI-Presslinge auf einem Perkin-Elmer 398-Infrarotspektrometer. ^-NMR-Spektren wurden auf einem Bruker AW-80 (80 MHz)-, AM-400 (400 MHz)- oder auf einem DRX-500 (500 MHz)-Gerät aufgenommen. Chemische Verschiebungen werden in parts per million (ppm) angegeben, TMS war interner Standard für Aufnahmen in DMSO-d6 und CDCI3. Alle Kopplungskonstanten (J) sind in Hz angegeben. Elementaranalysen wurden am Lehrstuhl für Anorganische Chemie, Universität des Saarlandes, durchgeführt. Reagentien und Lösungsmittel stammten aus kommerziellen Quellen und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Flash- Säulenchromatographie (FCC) wurde über Silicagel 60 (40-63 μm) durchgeführt, der Reaktionsverlauf wurde mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie über ALUGRAM SIL G/U V254- Platten (Macherey-Nagel, Düren) nachgewiesen.
Beispiel 1: Synthese der Verbindungen 1 bis 38
1a/b, 5a/b, 7a/b, 9a/b, 11a/b, 2a/b, 6a/b, 8a/b, 10a/b, ZaJb, 13a/b, 17a 4a, 14a/b, 18a
15a, 19a/b, 20a, 21a/b, 23a/b, 12a/b, 16a/b, 22a/b
24a/b, 25a/b, 26a
Nr. X Isomer Nr. X Isomer Nr. X Isomer
Ia H E 9b 5-Br Z 19a 5-OEt E
Ib H Z 10a 5-BΓ E 19b 5-OEt Z
2a H E 10b 5-BΓ Z 20a 5-OBn E
2b H Z IIa 5-OCH3 E 21a 6-CH3 E
3a H E IIb 5-OCH3 Z 21b 6-CH3 Z
3b H Z 12a 5-OCH3 E 22a 6-CH3 E
4a H E 12b 5-OCH3 Z 22b 6-CH3 Z
5a 5-F E 13a 6-OCH3 E 23a 4-CH3 E
5b 5-F Z 13b 6-OCH3 Z 23b 4-CH3 Z
6a 5-F E 14a 6-OCH3 E 24a 4-F E 6b 5-F Z 14b 6-OCH3 Z 24b 4-F Z
7a 5-CI E 15a 6-OCH3 E 25a 4-CI E
7b 5-CI Z 16a 6-OCH3 E 25b 4-CI Z
8a 5-CI E 16b 6-OCH3 Z 26a 7-OMe E
8b 5-CI Z 17a 6,7-(OCH3)2 E
9a 5-Br E 18a 6,7-(OCH3)2 E
27a/b 28a/b 29a/b 30a/b 31a/b
Nr. X Isomer Nr. X Isomer Nr. X Isomer
7a 5-OMe E 30a 5-F E 34 - -
7b 5-OMe Z 30b 5-F Z 36a 3-CH3 E
8a 5-F E 31a 5-F E 36b 3-CH3 Z
8b 5-F Z 31b 5-F Z 37a 3-Phenyl E
9a 5-F E 32 - - 38a CH3 E
9b 5-F Z Die Synthese erfolgte gemäß dem allgemeinen Syntheseschema:
Reaktionsbedingungen: (a) NaBH4, MeOH/CH2CI2, 15 min bei O0C, 1 h bei RT; (b) PPh3«HBr, Benzol, 12 h Rückfluss; (c) heterocyclische Carbonylverbindung, K2CO3 und 18-Krone-6 in CH2CI2, 12 h Rückfluss.
Schlüsselschritt der Synthese war eine Wittig-Reaktion unter Einsatz verschiedener heterozyklischer Aldehyde und Phosphoniumsalze der bicyclischen Komponente. Ausgehend von den entsprechenden Ketonen, die mit NaBH4 zum entsprechenden Alkohol reduziert wurden, wurden die Indanol- und Tetra hydronaphthol-Zwischenstufen in ihre Phosphoniumsalze unter Einsatz von PPH3 HBr in Benzol umgewandelt. Dann folgte eine modifizierte Wittig-Reaktion mit Phosphoniumsalz und heterozyklischem Aldehyd als Reaktanden, K2CO3 als Base in trockenem CH2CI2 und einigen mg 18-Krone-6 als Phasentransfer- Katalysator. Das nach der Wittig-Reaktion erhaltenen Gemisch aus E- und Z-Isomeren wurde durch Flash-Säulenchromatographie getrennt. Die Isomere wurden in stabile Hydrochloride oder Oxalate überführt und durch NMR charakterisiert.
A) Synthese der nicht kommerziell erhältlichen Vorstufen: Die folgenden Verbindungen wurden nach bekannten Synthesemethoden hergestellt: 5-Ethoxyindan-l-on Q9i) und 5-(Benzyloxy)indan-l-on (2Oi):
19i 2Oi
Reaktionsbedigungen : (a) NaOEt, Ethylbromid, Ethanol, 2h Rückfluss; (b) NaOEt, Benzylbromid, Ethanol, 2h Rückfluss. (Donbrow, M., J. Chem. Soc. 1613-1615 (1959)) 6-Methylindan-l-on (2Ii) und 7-Methoxyindan-l-on (26i):
26i
Reaktionsbedingungen : (a) Polyphosphorsäure (PPA), 3h bei 950C; (b) PPA, 20 min bei 7O0C. (Budhram, R. S. et al., J. Org. Chem. 51 : 1402-1406 (1986))
Zur Herstellung der 4-substituierten Indanone wurde 3-(2- Fluorophenyl)propansäure (Houghton, R. P. et al., J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1 5:925-931 (1984)) als Startmaterial in zwei Schritten synthetisiert: Knoevenagel-Reaktion von Malonsäure mit 2-Fluorobenzaldehyd (Rabjohn, M., Org. Synth. Collective 327-329 (1963)) gefolgt von einer katalytischen Reduktion der erzeugten 3-(2-Fluorophenyl)acrylsäure (24Jy) (Luo, J. K et al., J. Heterocycl. Chem. 27:2047-2052 (1990)) mit PtO2 H2O (Musso, D. L. et al., J. Med. Chem. 46:399-408 (2003)). Die 3-(2-Fluorophenyl)propansäure (24UiI und die kommerziell erhältliche 3-(2-Chlorophenyl)propansäure wurden in die Säurechloride 3-(2-Fluorophenyl)propanoylchlorid (24M) und 3-(2- Chlorophenyl)propanoylchlorid (25ii) umgewandelt und schliesslich mit AICI3 zyklisiert (Musso, D. L et al., J. Med. Chem. 46:399-408 (2003)), so dass 4- Fluoroindan-1-on (24J) (Olivier, M. & Marechal, E., Bull. Soc. Chim. Fr., 3092- 3095 (1973)) und 4-Chloroindan-l-on (25J) (Takeuchi, R. & Yasue, H., J. Org. Chem. 58:5386-5392 (1993)) entstanden:
(b)
24iii 24M 24i
25ii 25i
Reaktionsbedingungen : (a) Pyridin, Piperidin, 1) 15 min bei 6O0C, 2) 45 min bei 850C, 3) 3h bei HO0C; (b) PtO2 H2O, MeOH, 12h bei RT; (c) Oxalylchlorid, DMF, 12h RT; (d) AICI3, O0C, 3,5h Rückfluss, dann 12h bei RT.
l,3-Thiazol-5-carbaldehyd (27i) wurde in zwei Schritten hergestellt (Dondoni, A. et al., Synthesis 11 :998-1001 (1987)) :
27i
Reaktionsbedingungen : (a) 1. n-BuLi in Et2O, 1,5 h bei -780C, 2. N-Formylmorpholin in Et2O, 45 min bei -780C; (b) HCl in THF, 2h bei RT.
Pyrimidin-5-carbaldehyd (28J)_wurde analog zu Rho et al. (leicht modifiziert) hergestellt (Rho, T. & Abuh, Y. F., Synth. Comm. 24:253-256 (1994)):
28i
Reaktionsbedingungen: (a) tert-BuLi in THF, 15 min bei -10O0C; (b) 1. Ethylformiat, 20 min bei -10O0C, 2. HCl in Diethylether (IM), Ih bei -10O0C, dann RT über Nacht. B) Synthese der Verbindungen 1-38: 50 mmol Keton wurden in einer Mischung aus Methanol (100 ml) und THF (100 ml) gelöst und 1,89 g NaBH4 (50 mmol) wurden unter Kühlung auf 00C portionsweise zugegeben. Nach 10 min bei 00C wurde die Lösung 1 h bei Raumtemperatur (RT) gerührt. Das Produkt wurde mit Wasser und Ethylether extrahiert. Die organische Phase wurde zuerst mit IN HCl, dann mit einer gesättigten NaHCO3-Lösung und zuletzt mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über MgSO4 wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
Der so erhaltene Alkohol wurde dann direkt in das Phosphoniumsalz überführt. Dazu wurden 40 mmol des Alkohols und 13,7 g Triphenylphosphoniumbromid (40 mmol) (Hercouet, A. & Le Corre, M., Synth. Comm. 157-158 (1988)) in 50 ml Benzol suspendiert und 12 h unter Stickstoffatmosphäre rückflussgekocht. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Der Feststoff wurde in trockenem Diethylether suspendiert und 10 min gerührt. Das Phosphoniumsalz wurde abfiltriert und mit Diethylether gewaschen. Zur Synthese der Titelverbindungen wurde eine Suspension aus 5 mmol Phosphoniumsalz, 5 mmol der heterocyclischen Carbonylverbindung (Nicotinaldehyd, Isonicotinaldehyd, 27i, 28J, Chinolin-4-carbaldehyd, Chinolin-5- carbaldehyd, Isoquinolin-4-carbaldehyd oder l-Pyridin-3-ylethanon), 50 mmol K2CO3 und 150-200 mg 18-Krone-6 in 25 ml trockenem CH2CI2 12h unter Stickstoffatmosphäre rückflussgekocht. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser geschüttet und mehrmals mit CH2CI2 extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Nach Reinigung mit chromatographischen Methoden wurde die freie Base entweder in Aceton gelöst und mit einem Überschuss an Oxalsäure in Aceton versetzt, um das Oxalat zu erhalten, oder sie wurde in trockenem Diethylether gelöst und mit einem Überschuss an HCl in Diethylether versetzt, um das Hydrochlorid zu erhalten.
Diese Synthese liefert in den meisten Fällen E- und Z-Isomere, lediglich bei Substituenten in 7-Position am aromatischen Ring des Indan- oder Tetralin- Gerüsts entstand nur das nicht sterisch gehinderte E-Isomer. Die Ausbeuten betrugen bis zu 90%. C) Reiniqunqsbedinqunqen, Ausbeute und Charakterisierung der Titelverbindunqen:
3-r(E)-2t3-Dihydro-lH-indan-l-ylidenennethyllpyridin-hydrochlorid (Ia).
Reinigung : Flash-Säulenchromatographie (FCC) (EtOAc:Hexan, 1 : 1). Ausbeute 53%, weisser Feststoff, Smp. 235°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,10-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 7,20 (s, IH, H-8); 7,33-7,35 (m, 2H, H-5, H-6); 7,39-7,41 (m, IH, H-4); 7,76-7,78 (m, IH, H-7); 7,89-7,92 (m, IH, H-13); 8,45 (d, 3J = 8,2 Hz, IH, H-14); 8,65 (dd, 3J = 5,4 Hz, 4J= 1,3 Hz, IH, H-12); 8,90 (s, IH, H- 10). IR OTT1: vmaχ 2411, 1636, 1551, 1471, 825, 806, 751. Anal. (Ci5H13N-HCI-0,3 H2O) C; H; N.
3-r(Z)-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidenennethyllpyridin-hydrochlorid (Ib).
Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 : 1). Ausbeute 22%, weisser Feststoff, Smp. 229°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,91-2,95 (m, 2H, H-2); 2,98-3,01 (m, 2H, H-3); 6,63 (s, IH, H-8); 7,00-7,06 (m, 2H, H-5, H-6); 7,25-7,40 (m, 2H, H- 4, H-7); 7,88 (dd, 3J= 5,5 Hz, 3J= 8,0 Hz, IH, H-13); 8,34 (d, 3J= 7,4 Hz, IH, H- 14); 8,73 (d, 3J = 5,4 Hz, IH, H-12); 8,81 (s, IH, H-IO). IR cπV1: vmax 3022, 2934, 2841, 2427, 1609, 1548, 1455, 1016, 902, 815, 760, 749. Anal. 4-r(E)-2t3-Dihydro-lH-indan-l-ylidenennethyllpyridin-oxalat (2a). Reinigung : FCC (Aceton : Petrolether, 3 : 10). Ausbeute 33%, gelber Feststoff, Smp. 167°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,10-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 7,10 (s, IH, H-8); 7,29-7,40 (m, 3H, H-4, H-5, H-6); 7,55 (d, 3J= 6,1 Hz, 2H, H-IO1 H-14); 7,78- 7,80 (m, IH, H-7); 8,59 (d, 3J= 6,1 Hz, 2H, H-Il1 H-13). IR (KBr) cπV1: vmax 1660, 1610, 1510, 900, 830, 810, 760, 750, 730, 710. Anal. (Ci5H13N-C2H2O4) C; H; N.
4-r(Z)-2,3-Dihydro-lH-indan-l-ylidenemethyllpyridin-oxalat (2b). Reinigung : FCC (Aceton : Petrolether, 3: 10). Ausbeute 22%, hellgelber Feststoff, Smp. 1400C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,88-2,91 (m, 2H, H-2); 2,95-2,99 (m, 2H, H-3); 6,58 (s, IH, H-8); 7,03 (t, 3J= 7,7 Hz, IH, H-5); 7,19-7,26 (m, 2H, H- 4, H-6); 7,35 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H-7); 7,40 (d, 3J= 6,0 Hz, 2H, H-IO1 H-14); 8,57 (d, 3J= 6,0 Hz, 2H, H-Il1 H-13). IR (KBr) cπV1: vmax 3080, 3040, 1610, 1500, 900, 840, 820, 760, 750, 700; Anal. (Ci5Hi3N-C2H2O4) C; H; N. 3-rfE')-3,4-Dihvdronaphthalin-lf2H')-ylidenemethyllPyridin-hvdrochlorid (3a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 : 1). Ausbeute 46%, weisser Feststoff, Smp. 2090C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,76-1,81 (m, 2H, H-3); 2,77-2,83 (m, 4H, H-2, H-4); 7,19-7,29 (m, 4H, H-5, H-6, H-7, H-8); 7,83-7,85 (m, IH, H-14); 7,97 (s, IH, H-9); 8,48 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-J.5); 8,73 (d, 3J= 5,7 Hz, IH, H- 13); 8,90 (s, IH, H-Il). IR cπV1: vmax 3056, 3019, 2953, 2278, 1621, 1569, 1460, 1351, 860, 818, 789, 756. Anal. (Ci6H15N-HCI) C; H; N. 3-rfZ')-3,4-Dihvdronaphthalin-lf2H')-ylidenennethyllPyridin-hvdrochlorid (3bO. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 18%, weisser Feststoff, Smp. 2060C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,98 (m, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-3); 2,55 (t, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-2); 2,88 (t, 3J= 6,7 Hz, 2H, H-4); 6,52 (s, IH, H-9); 6,88-6,96 (m, 2H, H-6, H-7); 7,18-7,24 (m, 2H, H-5, H-8); 7,74 (d, 3J= 8,1 Hz, IH, H-14); 8,31 (d, 3J= 8,3 Hz, IH, H-15); 8,59-8,62 (m, 2H, H-13, H-Il). IR cnrT1: vmax 3046, 2936, 1524, 1458, 813, 757. Anal. (Ci6H15N-HCI) C; H; N. 4-r(E)-3,4-Dihydronaphthalin-l(2H)-ylidenemethyHpyridin (4a). Reinigung: Umkristallisierung aus Hexan. Ausbeute 43%, hellgrüne Kristalle, Smp. 66°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,63-1,69 (m, 2H, H-3); 2,78-2,86 (m, 4H, H-2, H- 4); 6,92 (s, IH, H-9); 7,13-7,15 (m, IH, H-7); 7,20-7,26 (m, 4H, H-5, H-6, H- 11, H-15); 7,68-7,71 (m, IH, H-8); 8,58 (dd, 3J= 4,7 Hz, 4J= 1,4 Hz, 2H, H-12, H-14). IR (KBr) cnrT1: vmax 3080, 3040, 1610, 1500, 840, 820, 760, 750, 700; Anal. (Ci6Hi5N) C; H; N. 3-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (5a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:5). Ausbeute 24%, weisser Feststoff, Smp. 245°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,11-3,14 (m, 2H, H-2); 3,16-3,20 (m, 2H, H-3); 7,15-7,19 (m, 2H, H-8, H-6); 7,24 (dd, 3J= 8,9 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-4); 7,80 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 5,3 Hz, IH, H-7;. 7,94 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J = 5,3 Hz, IH, H-13); 8,49 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-14); 8,68 (d, 3J= 5,3 Hz, IH, H- 12); 8,90 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 3017, 2399, 1637, 1591, 1484, 1240, 936, 859. Anal. (Ci5Hi2NF-HCI-0,5 H2O) C; N; H: kalk. 5,21, gefunden 4,59. 3-r(Z)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (5b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:5). Ausbeute 19%, beiger Feststoff, Smp. 245°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,11-3,14 (m, 2H, H-2); 3,16-3,19 (m, 2H, H-3); 6,27 (s, IH, H-8); 7,08-7,13 (m, IH, H-6); 7,35 (dd, 3J= 8,7 Hz, 4J = 2,5 Hz, IH, H-4); 7,39 (dd, 3J= 8,3 Hz, 4J= 5,2 Hz, IH, H-7); 7,94 (m, IH, H- 13); 8,42 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-14); 8,77 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12), 8,91 (s, IH, H-IO). IR cm'1: vmax 3050, 3014, 2395, 1552, 1244, 1224, 933, 858, 813, 705. Anal. (Ci5Hi2NF-HCI) H; N; C: kalk. 68,84, gefunden 68,27. 4-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (6a1. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 2:3). Ausbeute 15%, gelber Feststoff, Smp. 224°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,17-3,19 (m, 2H, H-2); 3,27-3,30 (m, 2H, H-3); 7,24 (dt, 3J= 8,9 Hz, 4J=2,5 Hz, IH, H-6); 7,31 (dd, 3J= 8,9 Hz, 4J = 2,5 Hz, IH, H-4); 7,33 (s, IH, H-8); 7,94 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J (H,F)= 5,3 Hz, IH, H-7); 8,00 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,78 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-Il, H- 13). IR OTT1: vmaχ 2361, 1583, 1511, 1247, 1209, 833, 805. Anal. (Ci5H12NF-HCI-0,5 H2O) C; H; N. 4-r(Z)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (6b1. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 2:3). Ausbeute 18%, gelber Feststoff, Smp. 223°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,17-3,19 (m, 2H, H-2); 3,26-3,30 (m, 2H, H-3); 6,38 (s, IH, H-8); 7,10 (dt, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 7,33 (m, 2H, H-4, H-7); 7,98 (m, 2H, H-IO, H-14); 8,81 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR OTT1: vmaχ 3046, 2646, 1596, 1510, 1497, 1331, 1248, 1210, 860, 818, 808. Anal. (Ci5H12NF-HCI-0,3 H2O) C; H; N.
3-r(E)-(5-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (7a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 52%, weisser Feststoff, Smp. 234°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,11-3,18 (m, 4H, H-2, H-3); 7,25 (s, IH, H-8); 7,39 (dd, 3J= 8,4 Hz, 4J= 2,0 Hz, IH, H-6); 7,48 (s, IH, H-4); 7,78 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,97 (m, IH, H-13); 8,53 (d, 3J= 8,2 Hz, H-14); 8,70 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12); 8,93 (s, IH, H-10). IR cnrT1: vmax 3087, 2924, 2377, 1635, 1548, 1201, 1179, 1073, 919, 864, 825, 801. Anal. (Ci5H12NCI-HCI) C; H; N. 3-r(Z)-(5-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (7b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:5). Ausbeute 21%, weisser Feststoff, Smp. 238°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,08-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 6,91 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,4 Hz, IH, H-6); 6,97 (d, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,05 (s, IH, H-8); 7,68 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7). 7,96 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,6 Hz, IH, H- 13); 8,51 (d, 3J= 8,5 Hz, H-14); 8,65 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12); 8,88 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-10). IR cnrT1: vmax 3003, 2955, 2630, 1619, 1590, 1499, 1199, 1189, 1072, 875, 815, 790, 750. Anal. (Ci5H12NCI-HCI-0,3 H2O) C; H; N. 4-r(E)-(5-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (8a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 : 1). Ausbeute 29%, gelber Feststoff, Smp. 213°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,17-3,19 (m, 2H, H-2); 3,27-3,29 (m, 2H, H-3); 7,39 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,44 (m, IH, H-6); 7,55 (d, 4J = I, 6 Hz, IH, H-4); 7,91 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7). 7,02 (d, 3J= 6,8 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,79 (d, 3J= 6,8 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR cπV1: vmax 2359, 1589, 1498, 1268, 1198, 897, 877, 827, 803, 753. Anal. (CI5H12NCI HCI I, 6 H2O) C; H; N. 4-r(Z)-(5-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (8bO. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 19%, weisser Feststoff, Smp. 2000C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,96-3,04 (m, 4H, H-2, H-3); 6,76 (s, IH, H-8); 7,13 (dd, 3J= 8,4 Hz, 4J= 2,1 Hz, IH, H-6); 7,40 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-7); 7,50 (s, IH, H-4); 7,95 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,79 (d, 3J =
6.6 Hz, H-Il, H-13). IR cπV1: vmax 3066, 2955, 2630, 1619, 1590, 1499, 1199, 1189, 1072, 875, 815, 790, 750. Anal. (Ci5H12Nα-HCI-0,4 H2O) C; H; N.
3-r(E)-(5-Bronno-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (9a1. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 30%, weisser Feststoff, Smp. 241°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,10-3,17 (m, 4H, H-2, H-3); 7,26 (s, IH, H-8); 7,52 (dd, 3J= 8,2 Hz, 4J= 1,8 Hz, IH, H-6); 7,62 (d, 4J= 1,6 Hz, IH, H-4); 7,71 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-7); 7,94 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,3 Hz, IH, H- 13); 8,49 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-14); 8,69 (dd, 3J= 5,4 Hz, 4J= 1,3 Hz, IH, H- 12); 8,91 (d, 4J= 1,6 Hz, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 3086, 2389, 1635, 1548, 1529, 1065, 919, 861, 822, 802. Anal. (Ci5H12NBr-HCI) C; H; N. 3-r(Z)-(5-Bronno-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (9b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:5). Ausbeute 18%, weisser Feststoff, Smp. 243°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,41 (m, 2H, H-2); 4,08 (m, 2H, H- 3); 6,30 (s, IH, H-8); 7,34 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-7); 7,46 (dd, 3J= 8,0 Hz, 4J =
1.7 Hz, IH, H-6); 7,68 (d, 4J= 1,6 Hz, IH, H-4). 7,84 (dd, 3J= 8,0 Hz, 3J= 5,5 Hz, IH, H-13); 8,29 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-14); 8,72 (d, 3J= 5,3 Hz, IH, H-12); 8,84 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 3069, 3003, 2515, 2361, 1558, 965, 910, 844, 817. Anal. (Ci5H12NBr-HCI) C; H; N.
4-r(E)-(5-Bromo-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (IQaI. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 28%, gelber Feststoff, Smp.. 266°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,16-3,19 (m, 2H, H-2); 3,24-3,27 (m, 2H, H-3); 7,38 (t, 4J=2,2 Hz, IH, H-8); 7,57 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 1,9 Hz, IH, H-6); 7,69 (s, IH, H-4); 7,83 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-7); 7,97 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-10, H-14); 8,77 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR cnrT1: vmax 2702, 1608, 1586, 1509, 1199, 828, 807. Anal. (C15H12NBr-HCI) C; H; N. 4-r(Z)-(5-Bromo-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (IQbI. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 19%, gelber Feststoff, Smp. 256°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,96-2,98 (m, 2H, H-2); 3,01-3,04 (m, 2H, H-3); 6,75 (s, IH, H-8); 7,57 (m, IH, H-6); 7,65 (s, IH, H-4); 7,83 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-7); 7,91 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,78 (d, 3J= 6,8 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR OTT1: vmax 2481, 1625, 1608, 1587, 1507, 1497, 119, 864, 820. Anal. (Ci5H12NBr-HCI) C; H; N.
3-r(E)-(5-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (llai. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 42%, hellgelber Feststoff, Smp. 2300C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,08-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 3,80 (s, 3H, OCH3); 6,91 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 6,97 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-4); 7,05 (t, 4J= 2,2 Hz, IH, H-8); 7,68 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,96 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,7 Hz, H-13); 8,51 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-14); 8,65 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12); 8,89 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 2838, 2362, 1632, 1602, 1545, 1490, 1310, 1258, 1227, 1110, 833, 798. Anal. (Ci6H15ON-HCI) C; H; N. 3-r(Z)-(5-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid f llbi. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1:5). Ausbeute 18%, gelber Feststoff, Smp. 2200C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,08-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 3,80 (s, 3H, OCH3); 6,91 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 6,97 (d, 4J= 2,4 Hz, IH, H-4); 7,04 (s, IH, H-8); 7,68 (d, 3J= 8,8 Hz, IH, H-7); 7,94 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,7 Hz, H-13); 8,49 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,64 (d, 3J= 5,7 Hz, IH, H- 12); 8,87 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 2844, 2361, 1632, 1602, 1545, 1489, 1309, 1256, 1227, 1109, 1021, 832, 797. Anal. (Ci6Hi5ON-HCI-H2O) C; N; H: kalk. 6,22, gefunden 5,34.
4-r(E)-(5-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (Ylä). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 : 1). Ausbeute 25%, gelber Feststoff, Smp. 243°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,14-3,16 (m, 2H, H-2); 3,24-3,27 (m, 2H, H-3); 3,83 (s, 3H, OCH3); 6,96 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J=2,2 Hz, IH, H-6); 7,03 (d, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,19 (t, 4J= 2,2 Hz, IH, H-8); 7,81 (d, 3J= 8,8 Hz, IH, H-7); 7,92 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,71 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR cm'1: vmax 2834, 2427, 1580, 1501, 1249, 1092, 825, 802. Anal.
4-r(Z)-(5-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid f l2b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 18%, gelber Feststoff, Smp. 238°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,14-3,16 (m, 2H, H-2); 3,24-3,27 (m, 2H, H-3); 3,83 (s, 3H, OCH3); 6,97 (dd, 3J= 8,7 Hz, 4J=2,2 Hz, IH, H-6); 7,03 (d, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,19 (s, IH, H-8); 7,82 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,93 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-IO, H-14); 8,71 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR cm-1: vmaχ 2428, 1581, 1502, 1250, 1094, 869, 825, 802. Anal. (Ci6H15ON-HCI-CS H2O) C; H; N.
3-r(E)-(6-Methoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)nnethyllpyridin- hvdrochlorid (13a1). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 36%, gelber Feststoff, Smp. 163°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,75-1,78 (m, 2H, H-3); 2,73-2,77 (m, 2H, H-2); 2,79-2,81 (m, 2H, H-4); 3,78 (s, 3H, OCH3); 6,76 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-5); 6,84 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J= 2,8 Hz, IH, H-7); 7,10 (s, IH, H- 9); 7,79 (d, 3J= 8,8 Hz, IH, H-8); 7,90 (dd, 3J= 7,9 Hz, 3J= 5,7 Hz, IH, H-14); 8,40 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-15); 8,67 (dd, 3J= 5,6 Hz, 4J= 1,3 Hz, IH, H-13); 8,84 (d, 4J= 1,6 Hz, IH, H-Il). IR cnrT1: vmax 2386, 1602, 1586, 1543, 1502, 1236, 1124, 1035, 899, 848, 833, 801. Anal. (Ci7H17ON-HCI) C; H; N. 3-r(Z)-(6-Methoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)nnethyllpyridin- hvdrochlorid (13b'). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1:5). Ausbeute 4%, beiger Feststoff, Smp. 151°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,22-2,26 (m, 2H, H-3); 2,69-2,72 (m, 2H, H-2); 3,71 (s, 3H, OCH3); 5,80 (s, IH, H-9); 3,92 (m, 2H, H- 4); 6,67 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,7 Hz, IH, H-7); 6,77 (d, 3J=2,8 Hz, IH, H-8); 7,14 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-5); 7,76 (m, IH, H-13); 8,18 (m, IH, H-14); 8,65 (m, IH, H-12); 8,75 (s, IH, H-10). IR cnrT1: vmax 2360, 2342, 1609, 1554, 1496, 1249, 1139, 823, 804, 787. Anal. H2O) C; H; N.
4-r(E)-(6-Methoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)nnethyllpyridin- hvdrochlorid (14a~). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 79%, gelber Feststoff, Smp. 173°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,80 (m, 2H, H-3); 2,82 (t, 3J= 6,2 Hz, 2H, H-2); 2,89 (t, 3J= 5,4 Hz, 2H, H-4); 3,80 (s, 3, OCH3); 6,80 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-5); 6,87 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-7); 7,23 (s, IH, H-9); 7,89 (d, 3J= 8,8 Hz, IH, H-8); 7,94 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-Il, H-15); 8,75 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-12, H-14). IR cnrT1: vmax 3044, 1943, 2843, 2429, 1626, 1504, 1258, 1234, 1189, 1178, 1032, 881, 853, 831, 809. Anal. (Ci7Hi7ON HCI 0,3 H2O) C; H; N. 4-r(Z)-(6-Methoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)nnethyllpyridin- hvdrochlorid (14b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 : 1). Ausbeute 10%, gelber Feststoff, Smp. 198°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,28 (m, 2H, H-3); 2,74 (t, 3J= 8,0 Hz, 2H, H-2); 3,71 (s, 3H, OCH3); 4,06 (m, 2H, H-4); 5,91 (t, 4J= 4,5 Hz, IH, H-9); 6,65 (dd, IH, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, H-7); 6,77 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-5); 7,05 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-8); 7,82 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-Il, H-15); 8,73 (d, 3J= 6,3 Hz, 2H, H-12, H-14). IR cπV1: vmax 3041, 2935, 2823, 1631, 1595, 1565, 1494, 1253, 1139, 820, 797. Anal. (Ci7H17ON-HCI-0,6 H2O) C; H; N. 3-r(E)-(6-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (15a1). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 19%, weisser Feststoff, Smp. 222°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,02-3,05 (m, 2H, H-2); 3,14-3,17 (m, 2H, H-3); 3,82 (s, 3H, OCH3); 6,94 (dd, 3J= 8,4 Hz, 4J= 2,4 Hz, IH, H-6); 7,23 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,29 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-4); 7,32 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-7); 7,93 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,5 Hz, IH, H-13); 8,49 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,67 (d, 3J= 5,6 Hz, IH, H-12); 8,90 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-IO) IR cnrT1: Vmax 2980, 2846, 2643, 1636, 1606, 1555, 1489, 1298, 1283, 1222, 1026, 908, 867, 796. Anal. (Ci6H15ON HCI 0,4 H2O) C; H; N.
4-r(E)-(6-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid dβai. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 20%, gelber Feststoff, Smp. 2200C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,09-3,11 (m, 2H, H-2); 3,27-3,28 (m, 2H, H-3); 3,83 (s, 3H, OCH3); 7,04 (dd, 3J= 8,4 Hz, 4J= 2,4 Hz, IH, H-5); 7,36 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-4); 7,40 (s, IH, H-8); 7,45 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-7); 8,01 (d, 3J= 6,9 Hz, 2H, H-IO1 H-14); 8,79 (d, 3J= 8,5 Hz, 2H, H-Il, H-13). IR cnrT1: Vmax 3051, 3001, 2736, 1604, 1508, 1497, 1222, 1200, 1020, 893, 806. Anal. (Ci6H15ON HCI 0,8 H2O) C; H; N. 4-r(Z)-(6-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (161.0. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 13%, gelber Feststoff, Smp. 2070C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,03-3,05 (m, 2H, H-2); 3,20-3,27 (m, 2H, H-2); 3,78 (s, 3H, OCH3); 6,35 (s, IH, H-8); 6,73 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H- 5); 6,98 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-4); 7,30 (s, IH, H-7); 7,91-7,96 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H, H-IO1 H-14); 8,72-8,77 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H, H-Il1 H-13). IR cnrT1: vmaχ 3005, 2946, 2359, 1638, 1609, 1507, 1475, 1289, 1219, 1178, 1026, 808. Anal.
3-r(E)-(6,7-Dimethoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)methyllpyridin- hvdrochlorid (17a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 65%, gelber Feststoff, Smp. 197°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,74-1,79 (m, 2H, H-3); 2,73-2,77 (m, 4H, H-2, H-4); 3,78 (s, 3H, OCH3); 3,82 (s, 3H, OCH3); 6,77 (s, IH, H-9); 7,19 (s, IH, H-5); 7,37 (s, IH, H-8); 8,03 (m, IH, H-13); 8,55 (m, IH, H-14); 8,74 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12); 8,92 (s, IH, H-10). IR cnrT1: vmaχ 2931, 2835, 2419, 1714, 1603, 1586, 1550, 1514, 1466, 1454, 1254, 1215, 1139, 1028, 1016, 871, 855, 833, 800. Anal. H2O) C; H; N. 4-r(E)-(6,7-Dinnethoxy-3,4-dihydronaphthalin-l(2H)-ylidene)nnethyllpyridin- hvdrochlorid f lβai. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 68%, gelber Feststoff, Smp. 197°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,77-1,82 (m, 2H, H-3); 2,77-2,79 (m, 2H, H-2); 2,86-2,89 (m, 2H, H-4); 3,80 (s, 3H, OCH3); 3,83 (s, 3H, OCH3); 6,81 (s, IH, H-9); 7,09 (s, IH, H-5); 7,43 (s, IH, H-8); 8,00 (d, 3J = 6,8 Hz, 2H, H-Il, H-15); 8,78 (d, 3J= 6,8 Hz, 2H, H-12, H-14). IR cnrT1: vmax 3027, 2930, 2360, 1627, 1597, 1571, 1503, 1358, 1257, 1218, 1192, 1141, 1025, 872, 844, 786. Anal. (Ci8H19O2N HCI l,! H2O) C; H; N. 3-r(E)-(5-Ethoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (19aV Hergestellt aus (19J). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 43%, gelber Feststoff, Smp. 225°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,34 (t, 3J= 6,9 Hz, 3H, OCH2CH3); 3,07-3,14 (m, 4H, H-2, H-3); 4,06 (q, 3J= 6,9 Hz, 2H, OCH2CH3); 6,89 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J= 2,5 Hz, 3H, H-6); 6,95 (s, IH, H-8); 7,04 (t, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,67 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,94 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,4 Hz, IH, H-13); 8,49 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,64 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12); 8,88 (s, IH, H-10). IR OTT1: vmax 3057, 3031, 2984, 2595, 1632, 1590, 1550, 1475, 1247, 1093, 1044, 824, 805. Anal. H2O) C; H; N. 3-r(Z)-(5-Ethoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (19b1). Hergestellt aus (19J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 11%, gelber Feststoff, Smp. 219°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,34 (t, 3J= 6,9 Hz, 3H, OCH2CH3); 3,06-3,14 (m, 4H, H-2, H-3); 4,07 (q, 3J= 6,9 Hz, 2H, OCH2CH3); 6,89 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J= 2,2 Hz, 3H, H-6); 6,94 (s, IH, H-8); 7,02 (t, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,66 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,89 (dd, 3J= 8,5 Hz, 3J= 5,0 Hz, IH, H-13); 8,43 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-14); 8,62 (s, IH, H-12); 8,86 (s, IH, H- 10). IR cm'1: vmax 3032, 2984, 2921, 2880, 2595, 1632, 1590, 1552, 1475, 1247, 1092, 1045, 825, 806. Anal. (Ci7H17ON HCI 0,2 H2O) C; H; N. 3--f(E)-r5-(Benzyloxy)-2,3-dihydro-lH-indan-l-ylidenelmethyl>pyridin- hvdrochlorid (2OaI. Hergestellt aus (20J). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1 :3). Ausbeute 13%, gelber Feststoff, Smp. 2090C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,08-3,16 (m, 4H, H-2, H-3); 5,16 (s, 2H, OBn); 6,99-7,08 (m, 3H, H-4, H-6, H- 8); 7,33-7,47 (m, 5H, OBn); 7,69 (d, 3J= 8,8 Hz, IH, H-T); 8,02(dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,7 Hz, IH, H-13); 8,57 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-14); 8,68 (d, 3J= 5,7 Hz, IH, H-12); 8,91 (s, IH, H-10). IR cnrT1: vmax 3385, 3097, 3033, 2914, 2505, 1624, 1595, 1531, 1243, 1226, 1153, 1091, 996, 829, 774. Anal. (C22H19ON-HCI-0,2 H2O) C; H; N. 3-r(E)-(6-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (2IaI. Hergestellt aus (Hi). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:4). Ausbeute 37%, beiger Feststoff, Smp. 245°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,37 (s, 3H, CH3); 3,06-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 7,18 (d, 3J= 7,6 Hz, H-5); 7,23 (s, IH, H-8); 7,29 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-4); 7,59 (s, IH, H-7); 8,06 (dd, 3J= 8,2 Hz, 4J= 5,5 Hz, IH, H-13); 8,63 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,73 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-IZ); 8,95 (s, IH, H-IO). IR OTT1: vmax 2658, 1636, 1600, 1552, 888. Anal. (Ci6H15N-HCI-0,8 H2O) C; H; N. 3-r(Z)-(6-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (2IbV Hergestellt aus (2Ii). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1:5). Ausbeute 9%, weisser Feststoff, Smp. 241°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,36 (s, 3H, CH3); 3,40-3,16 (m, 4H, H-2, H-3); 7,16-7,29 (m, 3H, H-8, H-4, H-5); 7,58 (s, IH, H- 7); 7,96 (dd, 3J= 8,2 Hz, 3J= 5,7Hz, IH, H-13); 8,52 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-14); 8,68 (d, 3J= 5,0 Hz, IH, H-12); 8,92 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 2420, 1637, 1617, 1598, 1549, 895, 817, 786. Anal. (Ci6H15N-HCI-0,3 H2O) C; H; N.
4-r(E)-(6-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (22a1. Hergestellt aus (2Ii). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:4). Ausbeute 42%, hellgelber Feststoff, Smp. 2000C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (s, 3H, CH3); 3,11-3,15 (m, 2H, H-2); 3,24-3,28 (m, 2H, H-3); 7,27-7,35 (m, 2H, H-4, H-5); 8,03 (d, 3J= 6,7 Hz, 2H, H-IO1 H-14); 8,78 (d, 3J= 6,7 Hz, 2H, H-Il1 H- 13); 8,97 (d, 3J= 5,8 Hz, IH, H-7). IR cnrT1: vmax 1591, 1506, 1496, 887, 794. Anal. (Ci6H15N-HCI-2,6 H2O) C; H; N.
4-r(Z)-(6-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyridin-hydrochlorid (22b1. Hergestellt aus (2Ii). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1:4). Ausbeute 10%, gelber Feststoff, Smp. 228°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,38 (s, 3H, CH3); 3,11-3,14 (m, 2H, H-2); 3,24-3,27 (m, 2H, H-3); 6,69 (s, IH, H-8); 7,16-7,35 (m, 3H, H-4, H-5, H-7); 7,93 (d, 3J= 6,6 Hz, IH, H-14); 7,99 (d, 3J= 6,8 Hz, IH, H-10); 8,76 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-Il1 H-13). IR cnrT1: vmax 2917, 2460, 1596, 1510, 1204, 880, 813. Anal. (Ci6H15N-HCI-0,5 H2O) C; H; N. 3-r(E')-(4-Methyl-2,3-dihvdro-lH-indan-l-ylidene')methyllpyridin-hvdrochlorid
(23a1. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 48%, gelber Feststoff, Smp. 231°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,25 (s, 3H, CH3); 2,96-3,10 (m, 2H, H-2, H-3); 7,03 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,09 (d, 3J= 7,3 Hz, IH, H-5); 7,19 (t, 3J= 7,6 Hz, IH, H-6); 7,41 (dd, 3J= 7,8 Hz, 3J= 4,7 Hz, IH, H-13); 7,55 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H-7); 7,90 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,45 (dd, 3J= 4,7 Hz, 4J = 1,6 Hz, IH, H-12); 8,70 (d, 4J= 4,4 Hz, IH, H-JO). IR cm-1: vmax 3013, 2408, 1635, 1552, 938, 885, 825, 784. Anal. (Ci6H15N-HCI-0,3 H2O) H; N; C: kalk. 74,56, gefunden 75,52.
3-r(Z)-(4-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (23bO. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 43%, gelber Feststoff, Smp. 173°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,25 (s, 3H, CH3); 2,91 (m, 2H, H- 2, H-3); 6,59 (s, IH, H-8); 6,84 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-5); 6,92 (t, 3J= 7,8 Hz, IH, H-6); 7,05 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H-7); 7,35-7,40 (m, IH, H-13); 7,78 (d, 3J = 7,8 Hz, IH, H-14); 8,51 (d, 3J= 4,7 Hz, IH, H-12); 8,55 (d, 4J= 2,2 Hz, IH, H- 10). IR OTT1: vmax 2982, 2933, 1614, 1232, 856, 764. Anal. (Ci6H15N-HCI) C; H; N.
3-r(E)-(4-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (24a1. Hergestellt aus (24J). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 20%, gelber Feststoff, Smp. 246°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,07-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 7,14 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,31-7,36 (m, 2H, H-5, H-6); 7,43 (dd, 3J= 7,8 Hz, 3J= 4,7 Hz, IH, H-13); 7,72 (dd, 3J= 7,3 Hz, 4J= 1,6 Hz, IH, H-7); 7,91 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-14); 8,43 (dd, 3J= 4,7 Hz, 4J= 1,6 Hz, IH, H-12); 8,71 (d, 4J= 2,5 Hz, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 3097, 3062, 2405, 1639, 1551, 1130, 873, 786. Anal. (Ci6H15NF-HCI-l,4 H2O) C; H; N. 3-r(Z)-(4-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid
(24b1. Hergestellt aus (24J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 9%, gelber Feststoff, Smp. 213°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,94-3,01 (m, 4H, H-2, H-3); 6,68 (s, IH, H-8); 6,92 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H-5); 7,05 (t, 3J= 7,8 Hz, IH, H-6); 7,30 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-7); 7,41-7,44 (m, IH, H-13); 7,75 (d, 3J = 7,8 Hz, IH, H-14); 8,50-8,54 (m, 2H, H-IO1 H-12). IR cnrT1: vmax 3075, 2919, 2431, 1727, 1610, 1546, 1455, 1128, 780. Anal. (Ci6H15NF-HCI-l,4 H2O) C; H; N. 3-r(E)-(4-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (25a1. Hergestellt aus (25J). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 35%, weisser Feststoff, Smp. 244°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,86-2,94 (m, 4H, H-2, H-3); 6,87 (t, 3J= 8,8 Hz, IH, H-6); 6,92 (s, IH, H-8); 7,09-7,12 (m, IH, H-5); 7,21 (dd, 3J= 7,8 Hz, 3J= 4,7 Hz, IH, H-13); 7,38 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H- 7); 7,70 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-14); 8,21 (d, 3J= 4,7 Hz, IH, H-12); 8,50 (s, IH, H-10). IR cm'1: vmax 2403, 1553, 1474, 1240, 936, 785. Anal. (Ci5H12NCI-HCI) C; H; N. 3-r(Z)-(4-Chloro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (25bO. Hergestellt aus (25i). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 11%, gelber Feststoff, Smp. 2080C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,99 (m, 4H, H-2, H-3); 6,69 (s, IH, HS)) 6,81 (m, IH, H-6); 7,06-7,09 (m, 2H, H-5, H-7); 7,43- 7,45 (m, IH, H-13); 7,76 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-14); 8,52-8,55 (m, 2H, H-IO1 H- 12). IR OTT1: vmaχ 3042, 2394, 1638, 1551, 1473, 1239, 858, 781. Anal. (Ci5H12NCI-HCI) C; H; N.
3-r(E)-(7-Methoxy-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid (26a1. Hergestellt aus (26J). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 90%, gelber Feststoff, Smp. 238°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,06 (s, 3H, OCH3); 2,94 (s, 4H, H-2, H-3); 6,94 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-6); 6,97 (d, 3J= 7,3 Hz, IH, H-4); 7,30 (t, 3J= 7,7 Hz, IH, H-5); 7,54 (s, IH, HS)) 7,88 (m, IH, H- 13); 8,41 (d, 3J= 7,3 Hz, IH, H-14); 8,62 (d, 3J= 5,2 Hz, IH, H-12); 8,88 (s, IH, H-IO). IR OTT1: vmax 2917, 2460, 1596, 1510, 1204, 880, 813. IR cnrT1: vma 3003, 2839, 2363, 2083, 1605, 1584, 1481, 1468. 1455, 1303, 1067, 894, 794. Anal. (Ci6H15ON-HCI-1, 2 H2O) C; H; N.
5-rrEVr5-Methoxy-2,3-dihvdro-lH-indan-l-ylidene^methyll-l,3-thiazol- hvdrochlorid (27a1. Hergestellt aus (Z7J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1:3). Ausbeute 28%, beiger Feststoff, Smp. 199°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,90-2,93 (m, 2H, H-2); 3,07-3,10 (m, 2H, H-3); 3,78 (s, 3H, OCH3)) 6,85 (dd, 3J= 8,6 Hz, 4J= 2,4 Hz, IH, H-6); 6,92 (s, IH, H-4); 7,25 (s, IH, HS)) 7,62 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,94 (s, IH, H-IO)) 9,04 (s, IH, H-12). IR cnrT1: vmax 3087, 2924, 2377, 1635, 1548, 1201, 1179, 1073, 919, 864, 825, 801. Anal. (CI4HI3ONS-HCI) C; H; N. 5-rrzi-r5-Methoxy-2,3-dihvdro-lH-indan-l-ylidene')methyll-l,3-thiazol- hvdrochloride (27b1. Hergestellt aus (Z7J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1:3). Ausbeute 9%, weisser Feststoff, Smp. 211°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,89-2,93 (m, 2H, H-2); 3,07-3,10 (m, 2H, H-3); 3,78 (s, 3H, OCH3)) 6,85 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 6,92 (s, IH, H-4); 7,25 (s, IH, HS)) 7,62 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7); 7,93 (s, IH, H-IO)) 9,02 (s, IH, H-12). IR cnrT1: vmax 2940, 2361, 1598, 1549, 1492, 1318, 1298, 1253, 1110, 1032, 822, 798, 782, 770. Anal. (Ci4Hi3ONS-HCI-0,4 H2O) C; H; N.
5-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllpyrimidin-hydrochlorid (28a1. Hergestellt aus (28J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 44%, gelber Feststoff, Smp. 212 0C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,08-3,15 (m, 4H, H-2, H-3); 6,99 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,14 (m, IH, H-6); 7,21 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-4); 7,78 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 5,4 Hz, IH, H-7); 8,93 (s, 2H, H-IO, H-14); 9,03 (s, IH, H-12). IR cπV1: vmax 3074, 2970, 2322, 1638, 1569, 1528, 1483, 901, 859, 845. Anal. (Ci4H11N2F-HCI) C; H; N. 5-r(Z)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyrinnidin-hydrochlorid (28bO. Hergestellt aus (28J). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 13%, gelber Feststoff, Smp. 2040C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,96 (m, 4H, H-2, H-3); 6,51 (s, IH, H-8); 6,88 (m, IH, H-6); 6,98 (dd, 3J= 8,8 Hz, 4J= 5,4 Hz, IH, H-7); 1,18 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 8,77 (s, 2H, H-IO, H-14); 9,12 (s, IH, H-12). IR cnrT1: vmax 3102, 3055, 2955, 2923, 2854, 2244, 1729, 1637, 1586, 1476, 1411, 868, 830, 757, 702. Anal. (C14H11N2F-HCI) C; H; N. 5-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllchinolin-hydrochlorid (29a1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 28%, gelber Feststoff, Smp. 228°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,82 (m, 4H, H-2, H-3); 6,94 (dt, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,2 Hz, IH, H-6); 6,99 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-4); 7,36 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 4,1 Hz, IH, H-15); 7,46 (s, IH, H-8); 7,54-7,60 (m, 2H, H-7, H-IO); 1,13 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-16); 7,78 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 5,6 Hz, IH, H-Il); 8,49 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-12); 8,72 (m, IH, H-14). IR cnrT1: vmax 2925, 2854, 1578, 1356, 1244, 813. Anal. (C19H14NF-HCI-0,5 H2O) C; H; N. 5-r(Z)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllchinolin-hydrochlorid (29b1. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 12%, gelber Feststoff, Smp. 185°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,17-3,24 (m, 4H, H-2, H-3); 6,53 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 5,6 Hz, IH, H-7); 6,78 (dt, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H- 6); 7,05 (s, IH, H-8;; 7,28 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J=2,5 Hz, IH, H-4); 7,64 (dd, 3J = 8,5 Hz, 4J= 4,1 Hz, IH, H-15); 7,71 (d, 3J= 6,9 Hz, IH, H-IO); 7,93 (t, 3J= 7,3 Hz, IH, H-Il); 8,16 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-16); 8,52 (d, 3J= 9,1 Hz, IH, H-12); 9,07 (m, IH, H-14). IR cnrT1: vmax 2930, 2852, 1563, 1340, 1250, 979, 813. Anal. (C19H14NF-HCI) C; H; N. 5-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)methyllisochinolin-hydrochlorid (3OaI. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 28%, gelber Feststoff, Smp. 234°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,03 (s, 4H, H-2, H-3); 7,13 (dt, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,2 Hz, IH, H-6); 7,17 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,2 Hz, IH, H-4); 7,62 (s, IH, H-8;; 7,70 (t, 3J= 7,6 Hz, IH, H-Il); 7,91 (d, 3J= 7,3 Hz, IH, H- 10); 7,97-8,02 (m, 2H, H-7, H-12); 8,12 (d, 3J= 6,0 Hz, IH, H-16); 8,52 (d, 3J = 6,0 Hz, IH, H-15); 9,31 (s, IH, H-13). IR cπV1: vmax 3045, 2490, 1645, 1602, 1481, 1243, 825. Anal. H2O) C; H; N.
5-r(Z)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllisochinolin-hydrochlorid (3ObI. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 1: 1). Ausbeute 9%, gelber Feststoff, Smp. 2010C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,09-3,16 (m, 4H, H-2, H-3); 6,48 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J= 5,4 Hz, IH, H-7); 6,70 (dt, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 6,95 (s, IH, H-8); 7,21 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J=2,5 Hz, IH, H-4); 7,76-7,83 (m, 2H, H-IO1 U-Il)) 7,86 (d, 3J= 6,0 Hz, IH, H-16); 8,18 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-12); 8,53 (d, 3J= 6,0 Hz, IH, H-15); 9,43 (s, IH, H-13). IR cnrT1: vmax 3675, 2969, 2901, 2498, 1730, 1647, 1471, 1065, 818. Anal. (Ci9H14NF-HCI) C; H; N.
4-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllchinolin-hydrochlorid (3IaI. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 34%, gelber Feststoff, Smp. 241°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,29-3,38 (m, 4H, H-2, H-3); 7,41 (m, IH, H-6); 7,46 (d, 3J= 9,1 Hz, IH, H-4); 7,86-7,89 (m, 2H, H-7, H-15); 7,95 (s, IH, H-8); 8,01 (t, 3J= 8,2 Hz, IH, H-14); 8,26-8,31 (m, 2H, H-IO, H-16); 8,61 (d, 3J= 8,2 Hz, IH, H-13); 9,13 (d, 3J= 4,4 Hz, IH, H-Il). IR cnrT1: vmax 2929, 2360, 2341, 1574, 1244, 836, 759. Anal. H2O) C; H; N. 4-r(E)-(5-Fluoro-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllchinolin-hydrochlorid (3IbI. Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 24%, gelber Feststoff, Smp. 229°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,27-3,3819 (m, 4H, H-2, H-3); 6,71 (m, IH, H-7); 6,82 (dt, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 7,06 (s, IH, H-8); 7,32 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J=2,5 Hz, IH, H-4); 7,64 (d, 3J= 4,4 Hz, IH, H-IO); 7,72 (t, 3J= 7,3 Hz, IH, H-15); 7,94 (t, 3J= 8,5 Hz, IH, H-14); 8,19 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-16); 8,23 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-13); 9,05 (d, 3J= 4,4 Hz, IH, H-Il). IR cm'1: vmax 2928, 2593, 1581, 1244, 856, 829, 761. Anal. (Ci9Hi4NF-HCI-0,3 H2O) C; H; N.
3-(9H-Fluoren-9-ylidenemethyl)pyridin-hydrochlorid (32).
Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 35%, gelber Feststoff, Smp. 241°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,14 (m, IH, arom-H); 7,31 (m, IH, arom-H); 7,44 (m, 3H, H-6, arom-H); 7,89 (m, 3H, arom-H); 7,99 (m, 2H, arom-H, H-Il); 8,58 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-12); 8,88 (dd, 3J= 4,1 Hz, 4J= 1,2 Hz, IH, H-10); 9,08 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-8). IR cnrT1: vmax 3042, 3007, 2955, 2423, 1540, 1442, 809, 767, 722. Anal. (Ci9Hi3N-HCI) C; H; N. 4-(9H-Fluoren-9-ylidenennethyl)pyridin-hydrochlorid (34).
Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 57%, gelber Feststoff, Smp.
258°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,15 (m, IH, arom-H); 7,39-7,50 (m, 4H, arom-H, H-6); 7,89 (m, 2H, arom-H); 7,94 (s, IH, arom-H); 8,00 (m, 2H, arom- H); 8,16 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-8, H-12); 8,94 (d, 3J= 6,6 Hz, 2H, H-IO, H-H).
IR OTT1: vmaχ 3050, 3004, 2950, 1627, 1585, 1498, 1481, 807, 775, 727. Anal.
3-r(E)-(3-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid f36al. Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 2:3). Ausbeute 36%, gelber Feststoff, Smp.
191,3°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,28 (d, 3J= 6,8 Hz, 3H, CH3); 2,66 (m,
IH, H-3); 3,34-3,40 (m, 2H, H-2); 7,18 (s, IH, H-8); 7,30-7,40 (m, 3H, H-4, H-
5, H-6); 7,70 (d, 3J= 7,8 Hz, IH, H-7); 7,92 (m, IH, H-13); 8,48 (d, 3J= 8,6 Hz,
IH, H-14); 8,64 (d, 3J= 5,4 Hz, IH, H-12)8,88 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 2957, 2538, 1634, 1551, 1474, 762. Anal. (Ci6H15N-HCI) C; H; N.
3-r(Z)-(3-Methyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid f36bl.
Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 2:3). Ausbeute 14%, weisser Feststoff, Smp. n.d.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 1,32 (d, 3J= 6,8 Hz, 3H, CH3); 2,48 (m, IH, H-3); 3,06-3,32 (m, 2H, H-2); 6,60 (s, IH, H-8); 7,00 (m, 2H, H-5, H-6); 7,16-7,43
(m, 3H, H-4, H-7, H-13); 7,95 (m, IH, H-14); 8,42 (m, IH, H-12); 8,74-8,95
(m, IH, H-IO). .IR cnrT1: vmax 2955, 2865, 2424, 1610, 1546, 1454, 818, 765.
Anal. (Ci6Hi5N-HCI) C; H; N.
3-r(E)-(3-Phenyl-2t3-dihydro-lH-indan-l-ylidene)nnethyllpyridin-hydrochlorid f37al.
Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 2:8). Ausbeute 14%, gelber Feststoff, Smp.
188°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,05-3,10 (m, IH, H-2); 3,63-3,68 (m,
IH, H-2); 4,57-4,59 (m, IH, H-3); 7,00 (t, 4J= 2,4 Hz, IH, H-8); 7,10-7,40 (m,
8H, H-4, H-5, H-6, Phenyl); 7,57 (dd, 3J= 8,1 Hz, 3J= 5,1 Hz, IH, H-13); 7,71 (d, 3J= 7,3 Hz, IH, H-7); 8,07 (d, 3J= 8,3 Hz, IH, H-14); 8,46 (d, 3J= 6,3 Hz,
IH, H-12); 8,74 (s, IH, H-IO). IR cnrT1: vmax 3024, 2863, 2471, 1639, 1542, 811,
766, 757. Anal. (C2iHi7N-HCI) H; N; C: kalk. 78,86, gefunden 80,00.
3-rf lE')-l-f2,3-Dihvdro-lH-indan-l-ylidene')ethyllpyridin-hvdrochlorid (38a1.
Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute 6%, gelber Feststoff, Smp. 187°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,33 (t, 4J= 1,9 Hz, 3H, CH3); 2,63-2,84 (m, 4H, H-2, H-3); 7,10 (dt, 3J= 9,5 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-4); 7,17 (dd, 3J= 9,1 Hz, 4J= 2,5 Hz, IH, H-6); 7,41 (m, IH, H-13); 7,70-7,76 (m, 2H, H-7, H-J.4); 8,46 (dd, 3J= 5,0 Hz, 4J= 1,6 Hz, IH, H-12); 8,55 (dd, 4J= 2,5 Hz, 4J= 0,6 Hz, IH, H-IO). IR cm-1: vmax 3029, 2961, 2925, 2360, 1730, 1547, 1475, 1250, 1084, 1019, 933, 859, 825, 816. Anal. (Ci6H15N-HCI-0,6 H2O) C; H; N.
Beispiel 2: Synthese von Imidazolylmethylen-tetrahydronaphthalinen und -in- danen
41a, 41b, 43a, 43b, 42a, 42b, 45a, 45b, 47a, 47b, 44b, 46a 48a, 48b, 49a, 49b
Nr. X Isomer Nr. X Isomer Nr. X Isomer
41a H E 43b 7-CN Z 47a 5-F E
41b H Z 44b 6-CN Z 47b 5-F Z
42a H E 45a 5-CN E 48a 5-CI E
42b H Z 45b 5-CN Z 48b 5-CI Z
43a 7-CN E 46a 7-CI E 49a 5-Br E
49b 5-BΓ Z
Die generelle Synthese erfolgte gemäß dem allgemeinen Syntheseschema:
n=1 ,2
Reaktionsbedingungen: (a) NaBH4, MeOH/CH2CI2, 15 min bei O0C, 1 h bei RT; (b) PPh3«HBr, Benzol, 12 h Rückfluss; (c) EtONa, 4(5)-Imidazolcarboxaldehyd, N2, 12 h Rückfluss; (d) Isomerentrennung durch Flash-Säulenchromatographie. A) Synthese der nicht kommerziell erhältlichen Vorstufen: Die folgenden Verbindungen wurden nach bekannten Synthesemethoden hergestellt:
7-Hydroxy-l-tetralon (43iii), 6-Hydroxytetralon (44m), 5-Hydroxyindan-l-on (45Mi) (alle nach: Woo, L.W. et al., J. Med. Chem. 41: 1068-1083 (1998)), 8- Oxo-5, 6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl-trifluoromethylsulfonat (43M) (Almansa, C. et al., Synth. Commun. 23:2965-2971 (1993); Gerlach, U. & Wollmann, T., Tetrahedron Letters 33:5499-5502 (1992)), 5-Oxo-5,6,7,8-tetrahydronaphth-2- yl-trifluoromethylsulfonat (44ü), l-Oxo-2,3-dihydro~lhHnden-5~yRrifluoro~ methylsulfonat (45ü) (Almansa, C. et al., Synth. Commun. 23:2965-2971 (1993)), 8-Oxo-5,6,7,8-tetrahydronaphtalin-2-carbonitril (43J), 5-0x0-5,6,7,8- tetrahydronaphtalin-2-carbonitril (44J) (Almansa, C. et al., Synth. Commun. 23:2965-2971 (1993)), l-Oxoindan-5-carbonitril (45J) (Almansa, C. et al., Synth. Commun. 23:2965-2971 (1993); Arnold, D. R. et al., Can. J. Chem. 73:307-318 (1995)), 7-Chloro-3,4-dihydro-2H-naphth-l-on (46J) (Kerr, CA. & Rae, I.D., Aust. J. Chem. 31:341-346 (1978); Skraup, S. & Schwamberger, E., Liebigs Ann. Chem. 462: 135-158 (1928); Martin, E.L., J. Am. Chem. Soc. 58: 1438-1442 (1936); Koo, J., J. Am. Chem. Soc. 75: 1891-1895 (1953)).
Die Synthese erfolgte gemäß folgender Reaktionsschemata:
43iv, 44iv, 45iv 43iii, 44iii, 45iii 43ii, 44ii, 45ii 43i, 44i, 45i n=1 ,2
Ri R2 n Ri R2 n Ri R2 n Ri R2 n
43 H OMe 2 43 H OH 2 43 H OTf 2 43i H CN 2 iv iii ii
44 OMe H 2 44 OH H 2 44 OTf H 2 44i CN H 2 iv iii ii
45 OMe H 1 45 OH H 1 45 OTf H 1 45i CN H 1 iv iii ii
Reaktionsbedingungen: (a) AICI3, Benzol, 3h Rückfluss; (b) Trifluormethansulfon- säureanhydrid, trockenes Pyridin, 15 min bei 0-5 0C, dann 2h bei RT; (c) Zn, PPh3, KCN, Ni(PPh3)2CI2, MeCN, 2h bei 6O0C.
Reaktionsbedingungen: (a) AICI3, 40-500C; (b) HgCI2ZZn, H2O, Toluol, 24h Rückfluss, Zugabe von HCl alle 6h; (c) PPA, 40 min bei 7O0C.
Reiniqunqsbedinqunqen, Ausbeute und Charakterisierung von Vorstufen: l-Oxo-2,3-dihydro-lH-inden-5-yl-trifluoromethylsulfonat (45ii). Reinigung: Kugelrohrdestillation. Ausbeute 82%, gelbes Öl. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 2,50-2,81 (m, 2H, H-2); 3,00-3,40 (m, 2H, H-3); 7,20-7,50 (m, 2H, H-4, H-6); 7,95 (d, 3J=8,5 Hz, IH, H-7). IR (NaCI) cnrT1: vmax 3060, 2920, 1720, 1610, 1590, 1210, 1140, 1090, 930.
8-0x0-5, 6, 7,8-tetrahydronaphtalin-2-carbonitril (43i). Reinigung: Kristallisation aus Ligroin. Ausbeute 67%, gelbe Kristalle, Smp. 154°C. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 2,16-2,22 (m, 2H, H-3); 2,71 (t, 3J= 6,2 Hz, 2H, H-4); 3,05 (t, 3J= 6,2 Hz, 2H, H-2); 7,42 (d, 3J=8,0 Hz, IH, H-5); 7,71 (dd, 3J= 8,0 Hz, 4J= 1,8 Hz, IH, H-6); 8,29 (d, 4J= 1,8 Hz, IH, H-8). IR (KBr) cnrT1: vmax 3060, 3020, 2220, 1680, 1600, 1490, 1430, 1420, 1320, 1280, 1170, 1140, 1030, 920, 830.
B) Allgemeine Synthesemethode für die Verbindungen 41-49: In einer Mischung aus Methanol (110 ml) und Dichlormethan (55 ml) wurden 50 mmol des Ketons gelöst. 1,89 g NaBH4 (50 mmol) wurden portionsweise zugegeben, wobei die
Reaktionsmischung auf 00C gekühlt wurde. Nach 15 min bei 00C wurde die
Mischung 1 h bei Raumtemperatur gerührt, dann mit Wasser verdünnt und mit
Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde erst mit IN HCl, dann mit einer gesättigten NaHCO3-Lösung und schliesslich mit Wasser gewaschen. Sie wurde über MgSO4 getrocknet, anschliessend wurde das Lösungsmittel im
Vakuum entfernt.
Der entstandene Alkohol wurde in das Phosphoniumsalz überführt. Dazu wurden 40 mmol des Alkohols und 13,7 g Triphenylphosphoniumbromid (40 mmol) in 25 ml Benzol suspendiert und 12 h unter Stickstoff rückflussgekocht. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocket, dann in trockenem Diethylether aufgenommen und 10 min gerührt. Das Phosphoniumsalz wurde schliesslich abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Durch Lösen von 0,5 g Natrium (22 mmol) in 20 ml Ethanol wurde eine Natrium- ethanolat-Lösung hergestellt. 2,1 g Imidazol-4(5)-carbaldehyd (22 mmol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde einige Minuten erwärmt, bis sie klar wurde. In einem zweiten Kolben wurden 20 mmol Phosphoniumsalz in 14 ml Ethanol suspendiert und unter Stickstoffatmosphäre rückflussgekocht. Die Imidazolid- Lösung wurde portionsweise durch ein Septum innerhalb von 2 h zugegeben und die Reaktionsmischung wurde weitere 12 h rückflussgekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Feststoff abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde eingeengt, der Rückstand in 100 ml Wasser aufgenommen und mehrmals mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Celite abfiltriert, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum eingeengt. Nach Reinigung mit chromatographischen Methoden wurde die freie Base entweder in Aceton gelöst und mit einem Überschuss an Oxalsäure in Aceton versetzt, um das Oxalat zu erhalten, oder sie wurde in trockenem Diethylether gelöst und mit einem Überschuss an HCl in Diethylether versetzt, um das Hydrochlorid zu erhalten.
C) Reiniqunqsbedinqunqen, Ausbeute und Charakterisierung der
Titelverbindunqen:
5-r(E1-3,4-Dihvdronaphth-l(2H1-ylidenmethvH-lH-imidazol (4IaI. Reinigung: FCC (Aceton) und Umkristallisation (Aceton); Ausbeute 14%, farblose Kristalle,
Smp. 136-138°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, freie Base) δ 1,72-1,82 (m, 2H,
H-3); 2,68-2,73 (m, 2H, H-2); 2,77-2,82 (m, 2H, H-4); 6,94 (s, IH, H-9); 7,10-
7,22 (m, 4H, H-5, H-7, H-14); 7,66 (d, 3J=7,8 Hz, IH, H-8); 7,69 (s, IH, H-J.2).
IR (KBr, freie Base) cπV1: vmax 3110, 3055, 3020, 2935, 2865, 2830, 1666, 1621, 1597, 1481, 1453, 1441, 1430, 951, 943, 765. Anal. (Ci4H14N2, freie Base) C; H;
N.
5-r(Z1-3,4-Dihvdronaphth-l(2H1-ylidenmethvH-lH-imidazoliumoxalat (4IbI.
Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 5%, weisser Feststoff, Smp. 187°C.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,87-1,94 (m, 2H, H-3); 2,46-2,50 (m, 2H, H-2); 2,81-2,84 (m, 2H, H-4); 6,24 (s, IH, H-9); 7,00-7,20 (m, 4H, H-5, H-6, H-7, H-
14); 7,37 (d, 3J=7,8 Hz, IH, H-8); 8,31 (s, IH, H-J.2). IR (KBr) cnrT1: vmax 1610,
1480, 1450, 920, 850, 760. Anal. (Ci4H14N2-C2H2O4) C; H; N.
5-rfE1-2,3-Dihvdro-lH-indan-l-ylidenmethyll-lH-imidazol (42a1. Reinigung: FCC
(Aceton); Ausbeute 28%, weisser Feststoff, Smp. 148-151°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, freie Base) δ 2,89-2,96 (m, 2H, H-2); 3,00-3,08 (m, 2H, H-3); 6,92 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,13-7,25 (m, 3H, H-5, H-6, H-J.3); 7,30 (d, 3J= 6,5 Hz, IH, H-4); 7,57 (d, 3J= 6,8 Hz, IH, H-7); 7,69 (s, IH, H-Il). IR (KBr, freie Base) cnrT1: vmax 3055, 3020, 2960, 2920, 2840, 1643, 1601, 1460, 985, 757. Anal. (C13H12N2-C2H2O4) C; H; N. 5-rfZ1-2,3-Dihvdro-lH-ind-l-ylidenmethyll-lH-imidazoliumoxalat (42r/).
Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 10%, weisser Feststoff, Smp. 196°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,85-2,94 (m, 4H, H-2, H-3); 6,36 (s, IH, H-8); 7,14 (t, 3J= 7,4 Hz, IH, H-5); 7,24 (t, 3J=7,4 Hz, IH, H-6); 7,31 (d, 3J = 7,4 Hz, IH, H-4); 7,37 (s, IH, H-13); 8,13 (d, 3J= 7,4 Hz, IH, H-7); 8,30 (s, IH, Imidazol-H-ii). IR (KBr) cnrT1: vmax 1610, 1450, 750, 720. Anal. (C13H12N2-0,75 C2H2O4) C; H; N.
(8E)-8-(lH-Imidazol-5-ylmethylen)-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin-2-carbonitril- Hvdrochlorid (43a1. Aus Verbindung 43J. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 11%, grüne Kristalle, Smp. 217°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,80-1,84 (m, 2H, H-2); 2,71-2,74 (m, 2H, H-2); 2,81-2,84 (m, 2H, H-4); 7,10 (s, IH, H-9); 7,42 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-5); 7,68 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-6); 7,82 (s, IH, H-14); 8,13 (s, IH, H-8); 9,11 (s, IH, H-12). IR (KBr, freie Base) cnrT1: Vmax 2940, 2220, 1620, 1600,1490, 1000, 900, 880, 840, 820. Anal. (C15H13N3, freie Base) C; H; N. f8Z1-8-f lH-Imidazol-5-ylnnethylen')-5,6,7,8-tetrahvdronaphthalin-2-carbonitril- Oxalat (43b1. Aus Verbindung 43J. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 3%, weisser Feststoff, Smp. 197°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,90-1,92 (m, 2H, H-3); 2,47-2,51 (m, 2H, H-2); 2,88-2,90 (m, 2H, H-4); 6,37 (s, IH, H- 9); 7,19 (s, IH, H-14); 7,36 (d, 3J=8,0 Hz, IH, H-5); 7,58 (dd; 3J= 8,0 Hz, 4J = 1,6 Hz, IH, H-6); 7,95 (s, IH, H-8); 8,13 (s, IH, H-12). IR (KBr) cnrT1: vmax 2840, 2240, 1600, 1600, 1000, 940, 930, 850, 820, 710. Anal. (C15H13N3-C2H2O4) C; H; N.
(5Z)-5-(lH-Imidazol-5-ylmethylen)-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin-2-carbonitril- Oxalat (44b1. Aus Verbindung 44J. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 3%, weisser Feststoff, Smp. 2060C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 1,86-1,93 (m, 2H, H-3); 2,47-2,50 (m, 2H, H-2); 2,83-2,86 (m, 2H, H-3); 6,41 (s, IH, H- 9); 7,18 (s, IH, H-14); 7,45 (dd, 3J=8,1 Hz, 4J= 1,6 Hz, IH, H-7); 7,66-7,68 (m; 2H, arom-H5, H-8); 8,12 (s, IH, H-12). IR (KBr) cπV1: vmax 2220, 1610, 850, 710. Anal. (C15H13N3-C2H2O4) C; H; N. (lE)-l-(lH-Imidazol-5-ylnnethylen)indan-5-carbonitril-Oxalat (45a). Aus Verbindung 45i. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 39%, weisser Feststoff, Smp. 217°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,96-2,99 (m, 2H, H-2); 3,14-3,17 (m, 2H, H-3); 7,16 (s, IH, H-8); 7,72-7,79 (m, 3H, H-4, H-6, H-7); 7,83 (s, IH, H-13); 9,17 (s, IH, H-Il). IR (KBr) cπV1: vmax 3080, 2220, 1600, 830. Anal. (Ci4H12N3-HCI) C; H; N: kalk. 16,31; gef. 15,71.
(lZ)-l-(lH-Imidazol-5-ylmethylen)indan-5-carbonitril-Oxalat (45b). Aus Verbindung 45L Reinigung: FCC (CHCI3=DMF, 9:2). Ausbeute 10%, weisser Feststoff, Smp. 2070C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,89-2,99 (m, 4H, H-2, H- 3); 6,57 (s, IH, H-8); 7,36 (s, IH, H-4); 7,60 (d, 3J=8,2 Hz, IH, H-6); 7,72 (s, IH, H-13); 8,02 (s, IH, H-Il); 9,13 (d; 3J=8,2 Hz, IH, H-7). IR (KBr) cnrT1: vmax 2220, 1620, 890, 830, 780, 720. Anal. (Ci4H12N3-0,8 C2H2O4) C; H; N. 5-rfE')-f6-Chloro-3,4-dihvdronaphth-lf2H')-yliden')nnethyll-lH-imidazoliumchlorid (46a1. Aus Verbindung 46J. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 35%, perlmuttfarbene Kristalle, Smp. 2030C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, freie Base) δ 1,73-1,80 (m, 2H, H-3); 2,67-2,70 (m, 2H, H-2); 2,80-2,84 (m, 2H, H-4); 6,99 (s, IH, H-9); 7,16-7,25 (m, 3H, H-5, H-6, H-14); 7,67 (s, IH, H-8); 7,76 (s, IH, H-12). IR (KBr, freie Base) cπV1: vmax 3060, 2940, 2840, 1590, 1120, 950, 870, 850, 840, 800. Anal. (Ci4H13CIN2-0,2 H2O) C; H; N. 5-rfE')-f5-Fluor-2,3-dihvdro-lH-inden-l-yliden')methyll-lH-imidazoliumchlorid (47a1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 49%, beige Kristalle, Smp. 245°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,96-3,01 (m, 2H, H-2); 3,10-3,13 (m, 2H, H-3); 6,91 (s, IH, H-8); 7,11-7,16 (m, IH, H-6); 7,21 (d, 3J(H,F)= 9,0 Hz, IH, H-4); 7,64 (dd, 3J= 8,5 Hz, 4J(H,F)= 5,3 Hz, IH, H-7); 7,69 (s, IH, H-13); 9,14 (s, IH, H-Il). IR (KBr) cnrT1: vmax 3080, 1600, 1590, 1090, 940, 870. Anal. (Ci3H11FN2-HCI) C; H; N.
5-r(Z)-(5-Fluor-2,3-dihydro-lH-inden-l-yliden)methyll-lH-imidazoliumoxalat (47b1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 15%, weisser Feststoff, Smp. 2050C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,88-2,93 (m, 4H, H-2, H-3); 6,33 (s, IH, H-8); 6,98 (m, IH, H-6); 7,14 (d, 3J(H,F)= 9,1 Hz, IH, H-4); 7,39 (s, IH, H-13); 8,27-8,31 (m, 2H, H-7, H-Il). IR (KBr) cnrT1: vmax 1600, 1480, 1220, 930, 860, 830, 720. Anal. (C13H11FN2-C2H2O4) H; N; C: kalk. 59,21; gef. 59,70. 5-r(E)-(5-Chlor-2t3-dihydro-lH-inden-l-yliden)methyll-lH-imidazoliumchlorid (48a1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 37%, weisser Feststoff, Smp. 238°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,95-2,97 (m, 2H, H-2); 3,10-3,13 (m, 2H, H-3); 6,94 (s, IH, H-8); 7,34 (d, 3J=8,3 Hz, IH, H-6); 7,46 (s, IH, H-4);
7,64 (d, 3J=8,3 Hz, IH, H-7); 7,72 (s, IH, H-13); 9,11 (s, IH, H-Il). IR (KBr) cπV1: vmaχ 3080, 1600, 1470, 1290, 1200, 1110, 1070, 830, 610. Anal.
(Ci3H11CIN2-HCI) C; H; N. 5-r(Z)-(5-Chlor-2t3-dihydro-lH-inden-l-yliden)nnethyll-lH-imidazoliunnoxalat
(48bO. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 17%, weisser Feststoff, Smp.
218°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,87-2,96 (m, 4H, H-2, H-3); 6,39 (s, IH,
H-8); 7,20 (dd, 3J=8,4 Hz, 4J= 2,0 Hz, IH, H-6); 7,37-7,38 (m, 2H, H-4, H-13);
8,24 (s, IH, H-Il); 8,50 (d, 3J= 8,4 Hz, IH, H-7). IR (KBr) cπV1: vmax 1600, 1470, 1210, 880, 860, 830, 710. Anal. (C13H11CIN2-C2H2O4) C; H; N.
5-r(E)-(5-Bronn-2t3-dihydro-lH-inden-l-yliden)nnethyll-lH-innidazoliunnchlorid
(49a1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 47%, weisser Feststoff, Smp.
228°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,42-2,61 (m, 2H, H-2); 3,10-3,12 (m,
2H, H-3); 7,00 (s, IH, H-8); 7,47 (d, 3J= 8,3 Hz, IH, H-6); 7,54-7,59 (m, 2H, H- 4, H-7); 7,71 (s, IH, H-13); 9,15 (s, IH, H-Il). IR (KBr) cπV1: vmax 3080, 1600,
1590, 1470, 830. Anal. (C13H11BrN2-HCI) H; N; C: kalk. 50,11; gef. 49,69.
5-r(Z)-(5-Brom-2,3-dihydro-lH-inden-l-yliden)nnethyll-lH-innidazoliunnoxalat
(49b1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 11%, weisser Feststoff, Smp.
218°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,87-2,95 (m, 4H, H-2, H-3); 6,40 (s, IH, H-8); 7,32-7,35 (m, 2H, H-6, H-13); 7,50 (s, IH, H-4); 8,12 (s, IH, H-Il); 8,53
(d, 3J= 8,4 Hz, IH, H-7). IR (KBr) cπV1: vmax 1620, 1460, 1400, 1100, 1070,
820, 780, 720. Anal. (C13H11BrN2-O^ C2H2O4) C; H; N.
Beispiel 3: Alternative Herstellmethode für Imidazol-Verbindunqen A) Verqleichssynthese: Synthese von Imdazolyl-substituierten Indanen nach Mitrenga (Mitrenga, M., Dissertation Universität Saarbrücken 1996, Shaker- Verlag, Aachen (1997))
Die Synthese erfolgte wie unter Bsp. 2B ("allgemeine Synthese") beschrieben nach dem Reaktionsschema
n=1 ,2 Reaktionsbedingungen: (a) NaBH4, MeOH/CH2CI2, 15 min bei O0C, 1 h bei RT; (b) PPh3«HBr, Benzol, 12 h Rückfluss; (c) EtONa, 4(5)-Imidazolcarboxaldehyd, N2, 12 h Rückfluss; (d) Isomerentrennung durch Flash-Säulenchromatographie.
Diese Synthese war jedoch erstens nur zur Herstellung von Imidazolylverbindungen geeignet, da der verwendete Imidazolylaldehyd als Base und gleichzeitig Reaktant eingesetzt wurde. Die Ausbeuten für das Z-Isomer waren stets kleiner als 20%, meist sogar kleiner als 10%.
Zweitens eignete sich diese Synthese überraschend nicht zur routinemäßigen Herstellung von 42a/b und 48a/b: es konnte bei Vergleichsversuchen kein Produkt isoliert werden. Die Schwierigkeit dieser Reaktion liegt vermutlich in der Bereitung des Imidazolyl-Anions durch NaOEt. Dieses Anion scheint nicht besonders stabil zu sein. Zur stets erfolgreichen Durchführung der Reaktion wären daher sehr trockene und Schutzgas-Bedingungen erforderlich, da das Anion schon beim halbinerten Überführen von einem in den anderen Kolben zerfällt.
Überdies waren die Ausbeuten nach der unter B) dargestellten alternativen Herstellmethode Verfahren in der Regel deutlich höher als nach dem generellen Verfahren.
BI Alternative Herstellmethode für Verbindungen f42a,42b,48a,48b') als Hydrochloride Die alternative Synthese erfolgte nach dem Syntheseschema
Reaktionsbedingungen: (a) Me2NSO2CI, NEt3, CH2CI2, 12h bei RT; (b) K2CO3, 18-Krone-6, CH2CI2, 12h Rückfluss; (c) Isomerentrennung durch Flash-Chromatographie; (d) HCl (4N), Dioxan, 12h Rückfluss.
Die Reaktion hat den Vorteil, daß der Imidazolsubstituent geschützt ist und die
Trennung der Isomere mittels Flash-Chromatographie einfacher erfolgen kann als bei ungeschützten Imidazolen (diese "schmieren" auf der Säule, kompliziertere Laufmittelgemische sind nötig, um die Produkte sauber voneinander zu trennen). Die Abtrennung der Schutzgruppen erfolgt problemlos und quantitativ durch HCl, das gewünschte Salz fällt am Ende der Reaktion direkt aus. Durch diese Methode konnte die Ausbeute gegenüber der generellen Methode deutlich gesteigert werden.
Durchführung: 4-Formyl-N,N-dimethyl-lH-imidazolyl-l-sulfonamid (419) wurde wie beschrieben hergestellt (Kim, J. et al., J. Heterocycl. Chem. 32:611-620 (1995); Chadwick, DJ. & Ngochindo, R.I., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 3:481- 486 (1984)). Eine Suspension aus 5 mmol Phosphoniumsalz (siehe generelle Synthesemethode), 5 mmol des entsprechenden Alkohols, 50 mmol K2CO3, und 150-200 mg 18-Krone-6 in 25 ml trockenem Dichlormethan wurde 12 h unter Stickstoff rückflussgekocht. Die Reaktionsmischung wurde dann in Wasser gegossen und mehrmals mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösemittel im Vakuum entfernt. Nach Reinigung wurden 2,5 mmol des Sulfonamids (42ia/42ib, 48ia/48ib) in einigen ml Dioxan aufgenommen und 75 ml 4N HCl zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht unter Rühren rückflussgekocht. Bei Abkühlung auf Raumtemperatur fiel das Hydrochlorid aus und konnte abfiltriert und mit trockenem Diethylether gewaschen werden (Ausbeute quantitativ bezogen auf das Sulfonsäureamid).
C) Reiniqunqsbedinqunqen, Ausbeute und Charakterisierung der Titelverbindunqen bei Herstellung nach der alternativen Methode B): 5-rfE1-2,3-Dihvdro-lH-inden-l-ylidenmethyll-lH-imidazolyl-l- sulfonsäuredimethylamid (42ia). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 3:2). Ausbeute 43%, gelber Feststoff, Smp. 122-123°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,92 (s, 6H, H-methyl); 3,12 (m, 4H, H-2, H-3); 6,97 (s, IH, H-8); 7,28-7,32 (m, 2H, H- 4, H-6); 7,38-7,40 (m, IH, H-5); 7,61 (s, IH, H-13); 7,70-7,73 (m, IH, H-7); 8,28 (d, 4J= 1,3 Hz, IH, H-Il). IR (Pulver) cπV1: vmax 3122, 2929, 2360, 1684, 1469, 1384, 1169, 1082, 724. Anal. (Ci5H17N3SO2) C; H; N. 5-rrzV2,3-Dihvdro-lH-inden-l-ylidenmethyll-lH-imidazolyl-l- sulfonsäuredimethylamid (42ib). Reinigung: FCC (EtOAc:Hexan, 3:2). Ausbeute 16%, gelber Feststoff, Smp. 81°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,82 (s, 6H, H-methyl); 2,83-2,93 (m, 4H, H-2, H-3); 6,37 (s, IH, H-8); 7,14-7,22 (m, 2H, H-4, H-6); 7,26 (m, IH, H-5); 7,61 (s, IH, H-13); 8,25 (s, IH, H-Il); 8,82 (d, 3J= 7,6 Hz, IH, H-7). IR (Pulver) cπV1: vmax 3122, 2929, 2361, 1461, 1388, 1176, 1081, 962, 725. Anal. (Ci5H17N3SO2) H; N; C: kalk. 59,38; gef. 60,06. S-rfEMS-Chlor^^-dihvdro-lH-inden-l-ylidenlmethvIl-lH-imidazolyl-l- sulfonsäuredimethylamid (48ia). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 3:2). Ausbeute 47%, gelber Feststoff, Smp. 159°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,84 (s, 6H, H-methyl); 3,06 (m, 4H, H-2, H-3); 6,92 (s, IH, H-8); 7,27 (dd, 3J=8,2 Hz, 4J = 1,9 Hz, IH, H-6); 7,39 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-4); 7,56 (s, IH, H-13); 7,66 (d, 3J = 8,5 Hz, IH, H-7); 8,22 (s, IH, H-Il). IR (Pulver) cnrT1: vmax 3133, 2939, 2360, 1467, 1379, 1165, 1088, 726. Anal. (Ci5H16N3SO2CI) C; H; N. 5-rrzyr5-Chlor-2,3-dihvdro-lH-inden-l-yliden^methyll-lH-imidazolyl-l- sulfonsäuredimethylamid (48ib). Reinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 3:2). Ausbeute 20%, gelber Feststoff, Smp. 135°C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,83 (s, 6H, H-methyl); 2,88-2,97 (m, 4H, H-2, H-3); 6,42 (s, IH, H-8); 7,24 (dd, 3J=8,5 Hz, 4J= 1,9 Hz, IH, H-6); 7,36 (d, 4J= 1,9 Hz, IH, H-4); 7,66 (s, IH, H-13); 8,28 (d, 4J= 1,3 Hz, IH, H-Il); 9,00 (d, 3J= 8,5 Hz, IH, H-7). IR (Pulver) cnrT1: vmax 3124, 2923, 2361, 1465, 1386, 1174, 1080, 962, 724. Anal. (Ci5Hi6N3SO2CI) C; H; N.
5-r(E1-2,3-Dihvdro-lH-indan-l-ylidenmethvH-lH-imidazol hvdrochlorid (42a-als Hydrochloridi. Dargestellt aus 5-[(E)-2,3-Dihydro-lH-indan-l-ylidenmethyl]-lH- imidazol-l-sulfonsäuredimethylamid (42ai). Aufreinigung: Fällung des Salzes mit 4N HCl, waschen des Filtrats mit trockenem Diethylether. Ausbeute: Quantitativ, bezogen auf (42ai). Beige Nadeln, Schmp. 247°C; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 2,99-3,02 (m, 2H, H-2); 3,17-3,20 (m, 2H, H-3); 6,97 (s, IH, H-8); 7,35-7,40 (m, 2H, H-5, H-6); 7,46 (d, 3J= 6,6 Hz, IH, H-7); 7,70 (d, 3J= 7,9 Hz, IH, H-4); 7,78 (s, IH, H-13); 9,17 (s, IH, H-Il); 14,60 (s, 2H, NH). IR cnrT1: vmax 3381, 3165, 3082, 2989, 2822, 2362, 2686, 2651, 1519, 1267, 1142, 841, 815, 748. Anal. (Ci3Hi2N2-HCI-0,5 H2O) C; H; N.
5-rfZ1-2,3-Dihvdro-lH-indan-l-ylidenmethyll-lH-imidazolhvdrochlond (42b-als Hydrochloridi. Dargestellt aus 5-[(Z)-2,3-Dihydro-lH-indan-l-ylidenmethyl]-lH- imidazol-1-sulfonsäuredimethylamid (42bi). Aufreinigung: Fällung des Salzes mit 4N HCl, waschen des Filtrats mit trockenem Diethylether.Ausbeute: Quantitativ, bezogen auf (42bJ); Weisser Feststoff, Schmp. 244°C; 1H NMR (500 MHz, DMSO- d6) δ 3,10-3,13 (m, 2H, H-2); 3,29-3,32 (m, 2H, H-3); 7,09 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,47-7,52 (m, 2H, H-5, H-6); 7,56-7,58 (m, IH, H-7); 7,81-7,83 (m, IH, H-4); 7,90 (s, IH, H-13); 9,28 (s, IH, H-Il); 14,75 (s, 2H, NH). IR (KBr) cnrT1: vmaχ 3080, 2818, 1651, 1605, 1479, 1178, 1097, 840. Anal. (Ci3H12N2-HCI-HCI)
C; H; N: calcd, 11,17; found, 11,95.
5-rfE1-f5-Chlor-2,3-dihvdro-lH-inden-l-yliden')nnethyll-lH-imidazol hvdrochlorid
(48a-als Hydrochloridi. Dargestellt aus 5-[(E)-2,3-Dihydro-lH-indan-l- ylidenmethyl]-lH-imidazol-l-sulfonsäuredimethylamid (48ai). Aufreinigung:
Fällung des Salzes mit 4N HCl, waschen des Filtrats mit trockenem Diethylether.
Ausbeute: Quantitativ, bezogen auf (48aO. Gelber Feststoff, Schmp. 245°C; 1H
NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3,01-3,05 (m, 2H, H-2); 3,10-3,13 (m, 2H, H-3);
6,96 (t, 4J=2,5 Hz, IH, H-8); 7,43 (dd, 3J=8,2 Hz, 4J= 1,9 Hz, IH, H-6); 7,54 (d, 4J= 1,6 Hz, IH, H-4); 7,74 (d, 3J=8,2 Hz, IH, H-7); 7,79 (s, IH, H-13); 9,13 (s,
IH, H-Il). IR cm'1: vmax 3080, 1600, 1470, 1290, 1200, 1110, 1070, 830, 610.
IR (KBr) cm'1: vmax 3087, 2998, 2931, 2772, 2615, 1603, 1467, 1069, 831, 816.
Anal. (Ci3H11CIN2-HCI) C; H; N.
5-r(Z)-(5-Chlor-2t3-dihydro-lH-indan-l-yliden)methyll-lH-imidazolhydrochlorid f48b-als Hvdrochlorid^ Dargestellt aus 5-[(Z)-2,3-Dihydro-lH-indan-l- ylidenmethyl]-lH-imidazol-l-sulfonsäuredimethylamid (48bi). Aufreinigung:
Fällung des Salzes mit 4N HCl, waschen des Filtrats mit trockenem Diethylether;
Ausbeute: Quantitativ, bezogen auf (48ai); Gelber Feststoff, Schmp. 243°C; 1H
NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,81-2,84 (m, 2H, H-2); 2,98-3,00 (m, 2H, H-3); 6,76 (t, 4J=2,5 Hz, IH, H-8); 7,22 (dd, 3J=8,5 Hz, 4J= 1,9 Hz, IH, H-6); 7,34 (d,
4J= 1,6 Hz, IH, H-4); 7,53 (d, 3J=8,5 Hz, IH, H-7); 7,60 (s, IH, H-13); 8,96 (s,
IH, H-Il). IR (KBr) cm'1: vmax 3086, 2998, 2931, 2771, 2614, 1601, 1467,
1068, 830, 816. Anal. (C13H11CIN2-HCI) C; H; N.
D) Reiniqunqsbedinqunqen, Ausbeute und Charakterisierung der Titelverbindun- qen bei Herstellung nach Verqleichssynthese A):
5-rfE1-2,3-Dihvdro-lH-indan-l-ylidenmethyll-lH-imidazol (42a1. Reinigung: FCC (Aceton); Ausbeute 28%, weisser Feststoff, Smp. 148-151°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, freie Base) δ 2,89-2,96 (m, 2H, H-2); 3,00-3,08 (m, 2H, H-3); 6,92 (t, 4J= 2,5 Hz, IH, H-8); 7,13-7,25 (m, 3H, H-5, H-6, H-13); 7,30 (d, 3J= 6,5 Hz, IH, H-4); 7,57 (d, 3J= 6,8 Hz, IH, H-7); 7,69 (s, IH, H-Il). IR (KBr, freie Base) cnrT1: vmaχ 3055, 3020, 2960, 2920, 2840, 1643, 1601, 1460, 985, 757. Anal. (C13H12N2-C2H2O4) C; H; N. 5-rfZ1-2,3-Dihvdro-lH-ind-l-ylidenmethyll-lH-imidazoliumoxalat (42b1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 10%, weisser Feststoff, Smp. 196°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,85-2,94 (m, 4H, H-2, H-3); 6,36 (s, IH, H-8); 7,14 (t, 3J= 7,4 Hz, IH, H-5); 7,24 (t, 3J=7,4 Hz, IH, H-6); 7,31 (d, 3J = 7,4 Hz, IH, H-4); 7,37 (s, IH, H-13); 8,13 (d, 3J= 7,4 Hz, IH, H-7); 8,30 (s, IH, Imidazol-H-ii). IR (KBr) cπV1: vmax 1610, 1450, 750, 720. Anal. (Ci3H12N2-0,75 C2H2O4) C; H; N.
5-rfE')-f5-Chlor-2,3-dihvdro-lH-inden-l-yliden')nnethyll-lH-imidazoliumchlorid (48a1. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 37%, weisser Feststoff, Smp. 238°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,95-2,97 (m, 2H, H-2); 3,10-3,13 (m, 2H, H-3); 6,94 (s, IH, H-8); 7,34 (d, 3J=8,3 Hz, IH, H-6); 7,46 (s, IH, H-4); 7,64 (d, 3J=8,3 Hz, IH, H-7); 7,72 (s, IH, H-13); 9,11 (s, IH, H-Il). IR (KBr) cπV1: Vmax 3080, 1600, 1470, 1290, 1200, 1110, 1070, 830, 610. Anal. (Ci3H11CIN2-HCI) C; H; N.
5-rfZ1-f5-Chlor-2,3-dihvdro-lH-inden-l-yliden')nnethyll-lH-imidazoliumoxalat (48bO. Reinigung: FCC (CHCI3:DMF, 9:2). Ausbeute 17%, weisser Feststoff, Smp. 218°C. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2,87-2,96 (m, 4H, H-2, H-3); 6,39 (s, IH, H-8); 7,20 (dd, 3J=8,4 Hz, 4J= 2,0 Hz, IH, H-6); 7,37-7,38 (m, 2H, H-4, H-13); 8,24 (s, IH, H-Il); 8,50 (d, 3J= 8,4 Hz, IH, H-7). IR (KBr) cπV1: vmax 1600, 1470, 1210, 880, 860, 830, 710. Anal. (C13H11CIN2-C2H2O4) C; H; N.
Beispiel 4: Allgemeine Arbeitsvorschrift zur Synthese der Verbindung 50
Eine Lösung aus 20 g 1,2-Dihydroacenaphthylen (130 mmol) in 250 ml Acetanhydrid wurde bei 100C gerührt (Kryostat). Nach langsamem Zutropfen von 10,4 ml (150 mmol) konzentrierte Salpetersäure wurde das Reaktionsgemisch weitere 20 h bei 100C gerührt. Nach Beendigung der Reaktion und Filtration des gelben Niederschlags erfolgte die Umkristallisation in Ethanol/Ethylacetat. Das 3- Nitro-l,2-dihydro-acenaphthylen enthaltene Nitrierungsprodukt wurde mittels Säulenchromatographie von dem Edukt gereinigt (FCC: EtOAc/Hexan, 1: 1). Ausbeute des Nitrierungsprodukts: 71%, gelber Feststoff. Im Anschluss an die Nitrierung erfolgte direkt die Hydrierung des Nitrierungsprodukts. Dazu wurden 13,8 g des Nitrierungsprodukts (69,3 mmol) mit 1,3 g (10 Gewichtsprozent) Platin auf Aktivkohle (5%) in 250 ml THF suspendiert und mit H2 bei Raumtemperatur so lange begast, bis kein Wasserstoffverbrauch mehr festzustellen war. Nach Filtration der Lösung wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Die Reaktionskontrolle erfolgte durch präparative DC (zwei Mal im Gemisch EtOAc/Hexan 1: 1 entwickelt) und die beiden stark fluoreszierenden Spots konnten mit Hilfe des 1H-NMR analysiert werden. Der Rest des Ansatzes wurde mittels FCC in EtOAc/Hexan (1: 1) gesäult. Wiederum konnte nur ein Gemisch enthaltend l,2-Dihydro-acenaphthylen-3-amin erhalten werden. Ausbeute des Gemisches: 88%, brauner Feststoff. l,2-Dihydro-acenaphthylen-3-amin. Aufreinigung: FCC (EtOAc: Hexan, 1: 1). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 3.09-3.12 (m, 2H, H-I); 3.29-3.32 (m, 2H, H-2); 5.10 (s, 2H, NH2); 6.95-6.97 (d, 3J= 8.5 Hz, IH, H-7); 7.06-7.11 (m, 2H, H-3, H-4); 7.39-7.41 (m, 2H, H-5, H-6). In der nachfolgenden Sandmeyer-Reaktion wurden 2,5 g des Amin-Gemisches (15,7 mmol) in 8,3 ml HBr konz. gelöst und auf 00C gebracht. Unter starkem Rühren wurden ca. 7 ml einer 2,5 molaren NaNO2-Lösung (17,25 g in 100 ml Wasser) langsam zugetropft ohne eine Temperatur von 5°C zu überschreiten und bis die Reaktion der Lösung mit Iod-Stärke-Papier positiv ausfiel. Überschüssige salpetrige Säure musste mit einigen Spatelspitzen Harnstoff zerstört werden. In einem zweiten Kolben wurden bei 00C 3,0g Kupferbromid (21 mmol) in 15 ml HBr konz. gelöst und mit 30 ml Toluol überschichtet. Die zuvor hergestellte Lösung des Diazoniumsalzes musste schnell zu der Kupferbromid-Lösung zugegeben und die Mischung unter starkem Rühren 10 min bei 00C belassen werden. Nach Erhitzen der Reaktionslösung auf 1000C und zweistündiger Reaktion unter Rückfluss wurde der Ansatz mit Toluol und Wasser verdünnt und mehrmals extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Das entstandene 3-Bromo-l,2-dihydro- acenaphthylen enthaltende Produktgemisch konnte als braunes Öl isoliert werden. Ausbeute des Produktgemisches: 53%, braunes Öl.
In der folgenden Suzuki-Kupplung wurden 0,425 g des Gemisches (4,3 mmol), 15 ml einer 2-molaren Na2CO3-Lösung, 0,268 g 3-Pyridinborsäure (5,148 mmol) und 0,106 g Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0,215 mmol) in Methanol suspendiert und unter Stickstoffatmosphäre im Rückfluss 12 h gekocht. Nach Extraktion des Ansatzes mit Dichlormethan und Wasser und Trocknen der organischen Phase über MgSO4 wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Aus dem so erhaltenen Rohprodukt wurde 3-(l,2-Dihydroacenaphthylen-3-yl)pyridin (50) mittels FCC (EtOAc/Hexan 1: 1 als Laufmittel) isoliert. Das erhaltene hellbraune Öl wurde in wasserfreiem Ether gelöst und mit HCl in Ether versetzt. Das Hydrochlorid fiel quantitativ aus und konnte abfiltriert werden. 3-(l,2-Dihydroacenaphthylen-3-yl)pyridin (50). Aufreinigung: FCC
(EtOAc: Hexan, 1: 1). Ausbeute: 36%, beiger Feststoff, Smp. 2080C. 1H NMR (500 MHz, DMSO-Cl6): δ= 3.38-3.41 (m, 2H, H-2); 3.51-3.53 (m, 2H, H-3); 7.37-7.79 (m, 6H, H-3, W-4, H-5, H-6, H-7, H-13); 8.07 (dt, 3J= 7.9 Hz, 4J= 1.5 Hz, IH, H- 14); 8.58 (dd, 3J= 4.8 Hz, 3J= 1.5 Hz, IH, H-IZ); 8.88 (d, 4J= 2.4 Hz, IH, H- 10). IR OTT1: vmaχ 2971, 2901, 1612, 1578, 1550, 1449, 1329, 1261, 1065, 1048, 805. Anal. (C2iH17N*HCI): 232.16 [MH-H]+.
Beispiel 5: Enzym-Testsysteme zum Test von Verbindungen auf Inhibition von CYP-Enzymen in vitro
Es wurden folgende CYP-Enzyme nach beschriebenen Methoden hergestellt und getestet: humane CYP17 (rekombinant exprimiert in E. coli) (Hutschenreuter, T.U. et al., J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 19: 17-32 (2004)), humane placentale CYP19 (Hartmann, R. W. & Batzl, C, J. Med. Chem. 29: 1362-1369 (1986)) und bovine adrenale CYPIlB (Hartmann, R.W. et al., J. Med. Chem. 38:2103-2111 (1995)).
A) Isolation der CYP 17-haltiqen Membranfraktion aus E. coli pJL17/0R
Der rekombinant veränderte E. co/Z-Stamm pJL17/0R, in dem das humane CYP17 und die Ratten NADPH-P450-Reduktase coexprimiert wurden, wurde nach der Methode von Ehmer et al. angezogen und aufbewahrt (Ehmer, P. B. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 75:57-63 (2000)). Für die Isolation der Membranfraktion wurden 5 ml der Bakterienzellsuspension mit einer OD578 von 50 mit Phosphatpuffer (0,05 M; pH 7,4; 1 mM MgCI2; 0,1 mM EDTA und 0,1 mM DTT) gewaschen. Die Bakterien wurden abzentrifugiert und in 10 ml eiskaltem TES-Puffer (0,1 M Tris-Acetat; pH 7,8; 0,5 mM EDTA; 0,5 M Saccharose) resuspendiert. Es wurden 4 mg Lysozym in 10 ml eiskaltem Wasser zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml erhalten wurde. Es folgte eine dreißigminütige Inkubation unter andauerndem Schütteln auf Eis. Die Spheroplasten wurden durch einen erneuten Zentrifugationsschritt bei 12.000 g für 10 min gewonnen und erneut in 3 ml eiskaltem Phosphatpuffer resuspendiert (Zusammensetzung s.o., zusätzlich 0,5 mM PMSF).
Nach Einfrieren und Auftauen wurden die Zellen auf Eis mit einem Ultraschallstab aufgeschlossen. Die ganzen Zellen und die Zelltrümmer wurden bei 3.000 g für 7 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde nochmals bei 50.000 g für 20 min bei 4 0C zentrifugiert. Dabei setzte sich das Membranpellet ab, das in 2ml Phosphatpuffer (Zusammensetzung s.o.) mit 20 % Glycerol mit Hilfe eines Ultra- Turrax-Stabes resuspendiert wurde. Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry et al. bestimmt (Lowry, O. H. et al., J Biol Chem 193:265- 275 (1951)). Aliquots mit einer ungefähren Proteinkonzentration von 5 mg/ml wurden bis zum Gebrauch bei -70 0C aufbewahrt.
B) Isolierung der CYP19 (Aromatase1)
Das Enzym wurde aus der Mikrosomenfraktion von frischer menschlicher
Plazenta (St. Josephs Krankenhaus, Saarbrücken-Dudweiler, Deutschland) nach der Methode von Thompson und Siiteri gewonnen (Thompson, E. A. & Siiteri, P. K., J. Biol. Chem. 249:5364-5372 (1974)). Die isolierten Mikrosomen wurden in einem minimalen Volumen an Phosphatpuffer (0,05 M; pH 7,4; 20% Glycerol) suspendiert. Zusätzlich wurde DTT (10 mM) und EDTA (1 mM) hinzugegeben, um das Enzym vor Abbaureaktionen zu schützen. Die Proteinkonzentration wurde nach Lowry et al. bestimmt (Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem. 193:265-275 (1951)) und sollte nach der Aufarbeitung etwa 35 mg/ml betragen.
O Aufarbeitung des bovinen CYPIlB
Schlachtfrische Rindernebennieren wurden bis zur Aufarbeitung in eiskaltem Tris-
Saccharose-Puffer (0,25 M Saccharose, 0,05 M Tris; pH 7,4) aufbewahrt. Nach Entfernen des anhängenden Fettgewebes wurde das Nebennierenmark mit einer Schere sorgfältig von der Nebennierenrinde abgetrennt. Die Nebennierenrinden- Stücke wurden mit einer Schere grob zerkleinert, mit Tris-Saccharose-Puffer gewaschen, gewogen und in obigem Puffer (2 ml pro g Gewebe) mit einem Handmixer fein zerkleinert. Danach wurde das Gewebe mit einem Ultraturrax- Stab homogenisiert. Zur Abtrennung grober Zelltrümmer und der Zellkerne wurde das Homogenat zwei Mal für 15 min bei 900g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend zur Gewinnung der Mitochondrienfraktion für 35 min bei 11000 g zentrifugiert. Zur Reinigung der Mitochondrienfraktion wurde der Niederschlag in Tris-Saccharose-Puffer resuspendiert und erneut für 35 min bei 11000 g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde insgesamt zwei Mal durchgeführt. Nach der letzten Zentrifugation wurde das Pellet in Tris- Saccharose-Puffer, der 0,001M EDTA enthielt, resuspendiert und bei -700C eingefroren. Vor dem Einsatz des Enzyms im CYPllB-Hemmassay wurde die Mitochondriensuspension auf eine Proteinkonzentration von 5 mg/ml mit 18- Hydroxylase-Puffer verdünnt (0,05 M Tris, 1,2 mM MgCI2, 6,0 nM KCl, 140 mM NaCI, 2,5 mM CaCI2) (Ayub, M. & Levell, M. J., J. Steroid Biochem. 32: 515-524 (1989)). Die Protei nbestimmung wurde nach Lowry durchgeführt (Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem. 193:265-275 (1951)). D) Bestimmung der prozentualen Hemmung von CYP17
Eine Lösung von 6,25 nmol Progesteron (in 5 μl MeOH) wurde in 140 μl Phosphatpuffer (0,05 M; pH 7,4; 1 mM MgCI2; 0,1 mM EDTA und 0,1 mM DTT) gelöst und zusammen mit 50 μl NADPH-regenerierendem System (Phosphatpuffer mit 10 mM IMADP®, 100 mM Glucose-6-phosphat und 2,5 Units Glucose-6-phosphat-dehydrogenase) und Inhibitor (in 5 μl DMSO) bei 37 0C für 5 min präinkubiert. Kontrollinkubationen wurden parallel mit 5 μl DMSO ohne Hemmstoff durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl einer 1 zu 5 verdünnten Membransuspension in Phosphatpuffer (0,8 - 1 mg Protein pro ml) gestartet. Nach Durchmischen des Ansatzes wurde für 30 min bei 37 0C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl IN HCl abgestoppt.
Die Steroide wurden mit 1 ml EtOAc extrahiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (5 min bei 2.500 g) wurden 900 μl der organischen Phase in ein Eppendorfgefäß mit 250 μl des Inkubationspuffers und 50 μl 1 N HCl überführt und erneut geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurden 800 μl der organischen Phase abgenommen, in ein neues Gefäß gegeben und zur Trockne eingedampft. Die Proben wurden in 50 μl einer Wasser-Methanol-Mischung (1 : 1) gelöst und per HPLC analysiert. Der Substratumsatz wurde aus dem Verhältnis der Flächen der Produktpeaks (17α-Hydroxyprogesteron und 16α- Hydroxyprogesteron) gegenüber der des Substratpeaks berechnet. Die Aktivität der Inhibitoren wurde aus dem verminderten Substratumsatz nach Zugabe von Hemmstoffen nach folgender Formel berechnet:
∑ Peakflächen (Hemmstoff! nkubation )
%Hemmung = - 1 (-100) ∑ Peakflächen (Kontrollin kubation ) El Bestimmung des IC^n-Wertes von CYP19
Der Assay wurde annähernd analog zu den von Foster et al. und Graves und Salahanick beschriebenen Testverfahren durchgeführt, eine detaillierte Beschreibung findet sich in Hartmann und Batzl 1986 (Foster, A. B. et al., J Med Chem 26:50-54 (1983); Graves, P. E. & Salhanick, H. A., Endocrinology 105:52- 57 (1979); Hartmann, R. W. & Batzl, C, J. Med. Chem. 29: 1362-1369 (1986)). Dabei wurde die Enzymaktivität durch Messung des bei der Aromatisierung aus [lß-3H]Androstendion gebildeten 3H2O verfolgt. Jedes Reaktionsgefäß enthielt 15 nM radioaktiv markiertes [lß-3H]Androstendion (entspricht 0,08 μCi) und 485 nM unmarkiertes Androstendion, 2mM IMADP®, 20 mM Glucose-6-phosphat, 0,4 Units Glucose-6-phosphatdehydrogenase und Hemmstoff (0 - 100 μM) in Phosphatpuffer (0,05 M; pH 7,4). Die zu testenden Verbindungen wurden in DMSO gelöst und mit Puffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Die endgültige DMSO-Konzentration der Kontroll- und der Hemmstoffinkubation betrug ca. 2 %. Jedes Gefäß wurde für 5 min in einem Wasserbad bei 30 0C präinkubiert. Durch die Zugabe des mikrosomalen Proteins (0,1 mg) wurde die Reaktion gestartet. Das Gesamtvolumen jedes Ansatzes betrug 200 μl. Durch Zugabe von 200 μl eiskalter 1 mM HgCI2-Lösung wurde die Reaktion nach 14 min abgestoppt. Es wurden 200μl einer 2 %-igen wässrigen Suspension von mit Dextran überzogener Aktivkohle (dextran-coated charcoal, DCC) zur Absorbtion der Steroide zugegeben, und die Gefäße wurden 20 min geschüttelt. Danach wurde die Aktivkohle bei 1.500 g für 5 min abzentrifugiert. Das im Überstand befindliche radioaktive Wasser (3H2O) wurde durch Scintillationsmessung mittels eines LKB-Wallac ß-Counters bestimmt. Die Berechnung der IC50-Werte erfolgte durch eine halblogarithmische Auftragung der prozentualen Hemmung gegen die Inhibitorkonzentration. Hieraus wurde die molare Konzentration, bei der 50% Hemmung auftritt, abgelesen.
F) Bestimmung der prozentualen Hemmung von bovinem CYPIlB Das Substrat Corticosteron wurde in Methanol gelöst und mit Tris-Puffer auf eine Endkonzentration von 200 μM verdünnt. Die Hemmstoffe wurden ebenfalls in Methanol gelöst und mit Puffer auf eine Endkonzentration von 1 μM verdünnt. Die Konzentration an Methanol in der Inkubation betrug 2,4 % in einem Inkubationsvolumen von 0,5 ml. Corticosteron (200 μM) wurde mit Hemmstoff (lμM) und mitochondrialem Enzym (0,5 mg/0,5 ml) unter Zusatz eines regenerierenden Systems bestehend aus NADP+ (ImM), Glucose-6-phosphat (7mM) und Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (1 IU / 0,5ml) inkubiert. Pro Test konnten bis zu 5 Hemmstoffe zweifach nebeneinander inkubiert werden. 4 Kontroll- sowie 2 Nullansätze enthielten statt der Hemmstofflösung das entsprechende Volumen an Puffer und Methanol (2%). Nach 5-minütiger Präinkubation (300C; Wasserbad) wurde die Reaktion durch Zugabe von Mitochondrien-Suspension gestartet. Die enzymatische Reaktion wurde nach einer Inkubationszeit von 10 min durch Zugabe von 250 μl IN HCl gestoppt. Die Nullwerte wurden vor dem Einpipettieren des Enzyms mit 250 μl HCl versetzt. Die Steroide wurden durch Schütteln mit 1 ml Ethylacetat (10 min) abgetrennt. Nach Zentrifugation (15000g, 10 min) wurden 900μl der organischen Phase mit 250 μl IN NaOH geschüttelt (10 min) und 800 μl Überstand nochmals mit 250 μl Puffer gewaschen. Nach Abdampfen von 700 μl der organischen Phase wurden die Steroide in 20 μl destilliertem Methanol aufgenommen und je 10 μl der methanolischen Lösung wurden mittels HPLC getrennt (Stationäre Phase: Nucleosil 120-5 C18-Säule mit einer 1 cm langen 7 μm Vorsäule; Fliessmittel: 50% Methanol in Wasser; Fluss: 1,1 ml/min; Detektion: UV-Detektor). Es wurden 18-OH-Corticosteron (Retentionszeit: 10 min) und Corticosteron (Retentionszeit: 21 min) getrennt. Zur Auswertung wurde die Höhe des 18-OH- Corticosteron-Peaks herangezogen. Die prozentuale Hemmung der 18- Hydroxylierung von Corticosteron durch die Inhibitoren wurde unter Berücksichtigung der Nullwerte auf die Mittelwerte der Kontrollinkubationen bezogen. Jeder Hemmstoff wurde mindestens zwei Mal auf seine 18- Hydroxylase-Hemmaktivität in einer Konzentration von 1 μM getestet. Die Bestimmung der gebildeten Mengen an 18-OH-Corticosteron bei der Überprüfung der Inkubationszeit sowie der Substratsättigung erfolgte mittels einer Eichgeraden.
Beispiel 6: Biologische Testsysteme zum Test von Verbindungen auf selektive Inhibition von humaner CYPIlBl und CYP11B2 in vitro
A) Screening-Test in transgener Spalthefe: Eine Spalthefesuspension (S. pombe PEl) mit einer Zelldichte von 3-107 Zellen/ml wurde aus einer frisch gewachsenen Kutur hergestellt unter Verwendung von frischem EMMG (pH 7,4), modifiziert nach Ehmer et al. (Ehmer, P. B. et al., J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 81, 173-179 (2002)). 492,5 μl dieser Zellsuspension wurden mit 5 μl Inhibitorlösung (50 μM der zu testenden Verbindung in Ethanol oder DMSO) versetzt und 15 min bei 32 0C inkubiert. Kontrollen wurden mit 5 μl Ethanol versetzt. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 2,5 μl 11- Deoxycorticosteron (20 μM, enthaltend 1,25 nCi [4-14C]ll-Deoxycorticosteron, in Ethanol) gestartet, dann wurde horizontal bei 32°C 6 h geschüttelt. Der Test wurde durch Extraktion der Probe mit 500 μl EtOAc gestoppt. Nach Zentrifugation (10.000 g, 2 min), wurde die EtOAc-Phase abgenommen und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 10 μl Chloroform aufgenommen. Die Umsetzung des Substrats zu Corticosteron wurde durch HPTLC (siehe unten) analysiert.
Die Quantifizierung der Spots für das Substrat Deoxycorticosteron und der gebildeten Produkte Corticosteron (und, sofern nachweisbar, 18- Hydroxycorticosteron und Aldosteron) erfolgte mit dem zugehörigen Auswerteprogramm AIDA. Für die in S. pombe exprimierte humane Aldosteronsynthase wurde als Produkt nur Corticosteron sowie das Substrat Deoxycorticosteron erfasst. 18-Hydroxycorticosteron und Aldosteron wurden bei einer Inkubationszeit von 6 Stunden nicht in nachweisbaren Konzentrationen gebildet und gingen daher nicht in die Auswertung mit ein. Die Berechnung der Konversion erfolgte gemäß Gleichung 1.
Gleichung 1:
%P Konversion (prozentualer Anteil des Produktes an Gesamtsteroid)
PSL Phospho Stimulated Luminescence (Lumineszenzwert)
PSLB PSL für Corticosteron (B)
PSLDOC PSL für Deoxycorticosteron (DOC)
PSLHG PSL des Hintergrundes Die prozentuale Hemmung, die durch einen Hemmstoff in der jeweils eingesetzten Konzentration verursacht wurde, errechnete sich nach Gleichung 2. Gleichung 2:
0ZoP
%H = 1 - H1 x lOO
0ZoP K1
%H prozentuale Hemmung 0ZoP Prozentwert der Konversion des Substrates zu Produkten
0ZOPH Prozentuale Konversion in Anwesenheit eines Hemmstoffs
0ZOPK Prozentuale Konversion der Kontrolle
Bl Test auf selektive CYPIlBl- und CYP11B2-Inhibitoren:
Erhaltung der Zellen: V79 MZhIlBl und V79 MZhllB2, welche die humane Aldosteronsynthase bzw. Steroid- 11-ß-Hydroxylase rekombinant exprimieren und nach Denner et al. hergestellt wurden (Denner, K. et al., Pharmacogenetics 5:89-96 (1995)), wurden in einem CO2-Inkubator bei 37 0C und in wasserdampfgesättigter Atmosphäre mit 5 % CO2 in Zellkulturschalen mit 60 oder 90 mm Durchmesser kultiviert. Beide Zelllinien wurden in DMEM+ kultiviert, welches 10 % FCS und zum Schutz vor bakterieller Kontamination die Antibiotika Penicillin und Streptomycin (1%) enthielt. Die Zellen wurden alle 2 - 3 Tage nach Behandlung mit Trypsin/EDTA passagiert, da die Verdopplungsdichte je nach Zellzahl 1 - 2 Tage betrug. Die Zellen wurden maximal 12 - 15 mal passagiert, um mögliche Zellveränderungen auszuschließen. Bei weiterem Bedarf wurden frisch aufgetaute Zellen eingesetzt.
DMEM+ - Medium
DMEM-Pulvermedium 13,4 g
NaHCO3 3,7 g
L-Glutamin (200 mM) 20,0 ml Penicillin (100 Einheiten /ml)/Streptomycin (0,1 mg/ml) 10,0 ml
Natriumpyruvat (100 mM) 10,0 ml
Fetales Kälberserum (FCS) 100 ml
H2O bidest. ad 11
Der pH-Wert der Mediums wurde auf 7 ',2-7 ',3 eingestellt. FCS wurde erst nach der Sterilfiltration zugesetzt.
Inhibitionstest: V79 MZh HBl- und V79 MZh 11B2-Zellen (8-105 Zellen pro well) wurden auf 24-well Zellkulturplatten mit 1,9 cm2 Kulturfläche pro well (Nunc, Roskilde, Dänemark) bis zur Konfluenz angezogen. Vor dem Test wurde das vorhandene DMEM Kulturmedium entfernt, und es wurden 450 μl frisches DMEM mit Inhibitor in mindestens drei verschiedenen Konzentrationen in jedes well zugegeben, um den IC50-Wert zu bestimmen. Nach Präinkubation (60 min, 37°C) wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl DMEM mit 2,5 μl Lösung des Substrats 11-Deoxycorticosteron (20 μM, enthaltend 1,25 nCi [4-14C]Il- Deoxycorticosteron, in Ethanol) gestartet. Danach wurde die Platte bei 37°C und 5% CO2 im CO2-Inkubator aufbewahrt. Die V79 MZh HBl-Zellen wurden 120 min inkubiert, die V79 MZh 11B2-Zellen 40 min. Kontrollen ohne Inhibitor wurden in derselben Weise behandelt. Die Enzymreaktionen wurden durch Extraktion des Überstands mit 500 μl EtOAc gestoppt. Die Proben wurden zentrifugiert (10000-g, 2 min), das Lösungsmittel wurde abgenommen und evaporiert. Der Rückstand wurde in 10 μl Chloroform aufgenommen und durch HPTLC (siehe unten) analysiert. Die Konversion bei V79 MZhIlBl wurde analog Gleichung 1 (Bsp. 5A) berechnet, wobei:
PSLB PSL für Cortisol bzw. Corticosteron
PSLDOC PSL für Deoxycortisol (RSS) bzw. Deoxycorticosteron
Für V79 MZhllB2 ergab sich die Konversion entsprechend Gleichung 3: Gleichung 3:
o/ p _ [PSLB + PSLn0HB + PSLAldo \ - 3 x PSLHG χ ioθ
[PSL D0C + PSL B + PSLlWHB + PSLAld0 ] - 4 x PSL J 1HG
0ZoP Konversion (Anteil des Produktes an Gesamtsteroid PSL Phospho Stimulated Lumineszence (Lumineszenzwert)
PSLB PSL für Corticosteron (B)
PSL180HB PSL für 18-Hydroxycorticosteron (18OHB)
PSLAido PSL für Aldosteron
PSLDOC PSL für 11-Deoxycorticosteron (DOC) PSLH G PSL des Hintergrundes Die prozentuale Hemmung, die durch einen Hemmstoff in der jeweils eingesetzten Konzentration verursacht wurde, errechnete sich nach Gleichung 2 (Bsp. 5A).
Bestimmung des IC50-Wertes: Der IC50-Wert ist definiert als die Konzentration des Hemmstoffes, bei der das Enzym zu 50 % gehemmt wird. Er wurde durch Bestimmung der prozentualen Hemmung bei mindestens 3 verschiedenen Hemmstoff-Konzentrationen, die alle im linearen Bereich der sigmoiden IC50- Kurve (log C/% Hemmung) liegen müssen, berechnet.
Die Kalkulation erfolgte durch lineare Regression. Die bestimmten Werte wurden nur verwendet, wenn sie mit einer Wahrscheinlichkeit von r < 0,95 eine Gerade bildeten.
C) HPTLC Analyse und Phospho-Imaqinq der radioaktiv markierten Steroide: Der resuspendierte Rückstand aus Beispiel 6A oder 6B - enthaltend die radioaktiv markierten Steroide - wurde auf eine HPTLC-Platte (20 x 10 cm, Silicagel 60F254) mit Konzentrationszone (Merck, Darmstadt, Germany) aufgetragen. Die Platte wurde zweimal mit dem Laufmittel Chloroform: Methanol: Wasser (300:20: 1) entwickelt. Unmarkiertes 11-Deoxycorticosteron und Corticosteron wurden als Referenz für die CYPllBl-Reaktion aufgetragen. Für die CYP11B2-Reaktion wurden 11-Deoxycorticosteron, Corticosteron, 18-Hydroxycorticosteron und Aldosteron als Referenz verwendet. Die Detektion der unmarkierten Referenzen erfolgte bei 260 nm. Anschliessend wurden Imaging-Platten (BAS MS2340, für 14C-Proben, Raytest, Straubenhardt, Deutschland) 48 h mit den HPTLC-Platten belichtet. Die Imaging-Platten wurden mit dem Phosphoimager-System Fuji FLA 3000 (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) gescannt und die Steroide quantifiziert.
Beispiel 7: Inhibition adrenaler CYPllB-Enzyme in vitro durch rDihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyll-3-pyridine [Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyl]-3-pyridine wurden wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben als Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tab. 1 zusammengefasst. Tab. 1: [Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-i(2H)-ylidenmethyl]-3-pyridine; Inhibition adrenaler CYPllB-Enzyme, CYP17 und CYP19 in vitro
1a/b, 5a/b, 7a/b, 9a/b, 3a/b, 13a/b 11a/b, 19a/b, 21a/b, 23a, 24a, 25a/b, 26a
% Inhibition3 ICso-Wert (nM)c % Inhibition3 ICso-Wert (μM)9
Verbindung X Isomer humane" V79 HBld V79 HB2d humanef humaneh hCYPHB2 hCYPHBl hCYPHB2 CYP17 CYP19
Ia H E 82 888,2 10,6 14 2,04
Ib H Z 83 86,6 92,0 33 3,55
3a H E 70 715,4 21,6 9 6,58
3b H Z 68 1424,1 141,4 24 3,79
5a 5-F E 88 310,7 6,8 17 2,54
5b 5-F Z 89 125,0 10,8 16 2,49
7a 5-CI E 75 1472,0 26,2 26 4,26
7b 5-CI Z 68 269,5 72,7 28 4,05
9a 5-Br E 60 1936,9 37,4 16 7,83
9b 5-BΓ Z 58 319,9 170,9 24 7,37
IIa 5-OMe E 79 1448,3 34,2 36 4,31
IIb 5-OMe Z 81 790,4 26,4 49 5,57
13a 6-OMe E 52 903,1 56,6 20 1,13
13b 6-OMe Z 53 206,0 877,6 17 4,00
19a 5-OEt E 67 2368,3 79,4 13 7,08
19b 5-OEt Z 52 2696,9 248,3 6 7,68
23a 4-Me E 52 763,1 108,0 40 4,72
24a 4-F E 84 773,5 20,9 42 1,81
25a 4-CI E 92 303,5 8,7 14 0,13
25b 4-CI Z 83 657,3 30,6 32 0,23
26a 7-OMe E 76 954,8 26,7 5 9,74
Ketoconazol 36 n.d. 80,5 40 n.d.
Fadrozol 68 9,7 1,0 7 0,0295 a Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %. S. pomöe-Zellen, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM; Inhibitor, 500 nM. c Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 20 %. d Hasterfibroblasten, die humane CYPIlBl exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. e Hasterfibroblasten, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 0 nM. f E. coli, die humane CYP17 exprimieren; 5 mg/ml Protein; Substrat Progesteron, 2,5 μM; Inhibitor, 2,5 μM. 9 Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 5 %; h humane placentale CYP19, 1 mg/ml Protein; Substrat Testosteron, 2,5 μM; (n.d. = nicht bestimmt) 5 Beispiel 8: Inhibition adrenaler CYPllB-Enzyme in vitro durch rDihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidennnethyll-4-pyridine [Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyl]-4-pyridine wurden wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben als Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tab. 2 zusammengefasst.
Tab. 2: [Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyl]-4-pyridine; Inhibition von adrenalen CYPIlB- Enzymen, CYP17 und CYP19 in vitro
2a/b, 6a/b, 8a, 10a
% Inhibition3 ICso-Wert (nM)c % Inhibition3 ICso-Wert (μM)9
Verbindung X Isomer humane" V79 HBld V79 HB2d humanef humaneh hCYPHB2 hCYPUBl hCYPHB2 CYP17 CYP19
2a H E 55 n.d. n.d. 8 6,70
2b H Z n.d. 1315,4 931,2 18 12,73
6a 5-F E 37 379,7 1098,1 15 1,55
6b 5-F Z 77 257,4 34,0 29 0,80
8a 5-CI E 38 243,1 1515,3 18 5,43
10a 5-Br E 17 947,5 2640,1 24 >36
Ketoconazol 36 n.d. 80,5 40 n.d.
Fadrozol 68 9,7 1,0 7 0,0295 a Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %. S. pomöe-Zellen, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM; Inhibitor, 500 nM. c Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 20 %. d Hasterfibroblasten, die humane CYPIlBl exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. e
Hasterfibroblasten, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. f E. coli, die humane CYP17 exprimieren; 5 mg/ml Protein; Substrat Progesteron, 2,5 μM; Inhibitor, 2,5 μM. 9 Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 5 %; h humane placentale CYP19, 1 mg/ml Protein; Substrat Testosteron, 2,5 μM; (n.d. = nicht bestimmt)
Beispiel 9: Inhibition adrenaler CYPllB-Enzvme, CYP 17 und CYP 19 in vitro durch weitere Dihydroindan-l(2H)-ylidennnethyll-heterozyklen
Weitere Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyl]-heterozyklen wurden wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben als Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tab. 3 zusammengefasst. Tab. 3: Weitere Dihydroindan-l(2W)-ylidenmethyl]-Heterozyklen : Inhibition von adrenalen CYPllB-Enzymen, CYP17 und CYP19 in vitro
28a/b 30a/b 38a
% ICso-Wert (nM)c % ICso-Wert
Inhibition8 Inhibition8 (μM)9
Verbindung humaneb V79 V79 humanef humaneh
HBld HB2d hCYPHB2 hCYPHBl hCYPHB2 CYPl 7 CYP19
28a 72 3178,5 27,4 6 7,45
30a 60 1129,0 58,1 57 0,72
30b 91 374,1 26,1 65 1,94
38a 67 159,3 96,1 n.d. n.d.
Ketoconazol 36 n.d. 80,5 40 n.d.
Fadrozol 68 9,7 1,0 7 0,0295 a Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %. S. pomöe-Zellen, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM; Inhibitor, 500 nM. c Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 20 %. d Hasterfibroblasten, die humane CYPIlBl exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. e Hasterfibroblasten, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. f E. coli, die humane CYP17 exprimieren; 5 mg/ml Protein; Substrat Progesteron, 2,5 μM; Inhibitor, 2,5 μM. 9 Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 5 %; h humane placentale CYP19, 1 mg/ml Protein; Substrat Testosteron, 2,5 μM; (n.d. = nicht bestimmt)
Beispiel 10: Inhibition adrenaler CYPllB-Enzvme und von CYP17 und CYP19 in vitro durch rDihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyll-4- imidazole
[Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2H)-ylidenmethyl]-4-imidazole wurden wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben als Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tab. 4 und 5 zusammengefasst. Tab. 4: Inhinbition adrenaler CYPllB-Enzyme in vitro durch [Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2W)-ylidenmethyl]-4-imidazole
41a, 41b, 44b, 46a 42a, 42b, 45a, 45b, 47a, 47b, 48a, 48b, 49a, 49b
% Inhibition a ICso-Wert (nM) d bovine b humane c V79 HBl e V79 11B2 f
Verbindung X Isomer bCYPHB hCYPHB2 hCYPHBl hCYPHB2
41a H E 40 80 31,4 24,8
41b H Z 95 82 3,3 9,6
42a H E 62 77 25,9 41,0
42b H Z 94 81 6,1 11,0
44b 6-CN Z 97 54 6,90 22,7
45a 5-CN E 81 49 15,0 35,9
45b 5-CN Z 100 65 12,3 35,7
46a 7-CI E 66 48 18,7 47,3
47a 5-F E 67 59 20,6 16,7
47b 5-F Z 64 58 11,17 13,9
48a 5-CI E 45 79 28,7 88,8
48b 5-CI Z 87 80 19,5 3,7
49a 5-Br E 63 68 26,2 92,8
49b 5-Br Z 88 76 23,5 10,3
Fadrozol n.d. 68 9,7 1,0
Ketoconazol 78 36 n.d. 80,5
Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %. b bovine adrenale Mitochondrien, lmg/ml Protein; Substrat Corticosteron, 200 μM; Inhibitor, 1 μM (R. Hartmann et al., J. Med. Chem. 38, 2103-2111 (1995)). c S. pomöe-Zellen, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM; Inhibitor, 500 nM. d Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 20 %. e Hasterfibroblasten, die humane CYPIlBl exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. f Hasterfibroblasten, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. (n.d. = nicht bestimmt)
Tab. 5: Inhibition von CYP 17 und CYP 19 in vitro durch [Dihydronaphthalin- oder Dihydroindan-l(2W)-ylidenmethyl]-4-imidazole
% Inhibition ICso-Wert (μM)
Verbindung X Isomer CYP 17a CYP19b
41a H E 13 0,226
41b H Z 13 0,190
42a H E 11 0,955
42b H Z 1 0,130
44b 6-CN Z 4 0,125
45a 5-CN E 21 0,119
45b 5-CN Z 4 0,015
46a 7-CI E 24 0,120
47a 5-F E 16 0,218
47b 5-F Z 11 0,020
48a 5-CI E 37 0,330
48b 5-CI Z 26 0,039
49a 5-Br E 13 0,027
49b 5-Br Z 15 0,100
Fadrozol 7 0,005c
Ketoconazol 40 n.d. a Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %; E. coli, die humane CYP17 exprimieren; 5 mg/ml Protein; Substrat Progesteron, 2,5 μM; Inhibitor, 2,5 μM. b Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 5 %; humane placentale CYP19, 1 mg/ml Protein; Substrat Testosteron, 2,5 μM; c nach Bhatnagar, A. S. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37:363-367 (1990); (n.d. = nicht bestimmt) Beispiel 11: Inhibition von CYP-Enzymen in vitro durch die Referenzverbindunqen Ketoconazol und Fadrozol
Ketocoanzol oder Fadrozol wurden wie in Beispiel 5 und 6 beschrieben als Inhibitoren getestet. Die Ergebnisse der Tests sind in Tab. 6 zusammengefasst.
Tab. 6: Ketoconazol und Fadrozol: Inhibition von adrenalen CYPllB-Enzymen,
CYP17 und CYP19 in vitro
Fadrozol
% Inhibition8 ICso-Wert (nM)c % Inhibition ICso-Wert (nM) humaneb V79 HBld V79 HB2e humanef humane9
Verbindung hCYPHB2 hCYPUBl hCYPHB2 CYPl 7 CYP19
Ketoconazol 36 n.d. 80,5 40 n.d. Fadrozol 68 9,7 1,0 7 29,5 a Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %; b S. pomöe-Zellen, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM; Inhibitor, 500 nM. c Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 20 %. d Hasterfibroblasten, die humane CYPIlBl exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. e Hasterfibroblasten, die humane CYP11B2 exprimieren; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. f Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 10 %; E. coli, die humane CYP17 exprimieren; 5 mg/ml Protein; Substrat Progesteron, 2,5 μM; Inhibitor, 2,5 μM. 9 Mittelwert aus 4 Bestimmungen, Standardabweichung < 5 %; humane placentale CYP19, 1 mg/ml Protein; Substrat Testosteron, 2,5 μM; (n.d. = nicht bestimmt)
Beispiel 12: Test ausgewählter Verbindungen mit NCI-H295R-Zellen
Von den unter Bsp. 6 und 7 vorgestellten Verbindungen wurde eine am NCI- H295R-System untersucht. Zum Vergleich wurde Fadrozol als Referenz verwendet. Die erzielten exemplarischen Ergebnisse sind nicht direkt mit den IC50-Werten und prozentualen Hemmwerten, die in V79-Zellen erzielt wurden, vergleichbar, da für die Hemmstoffassays an NCI-H295R u.a. andere Testparameter sowie ein anderes Substrat verwendet wurden (Erläuterung siehe Tab. 7). Im Vergleich mit Fadrozol konnte eine grobe Korrelation zwischen den beiden Testsystemen ermittelt werden.
Tab. 7: Vergleich Hemmdaten NCI-H295R, S. pombe PEl, V79 MZ
Fadrozol 5b
a: prozentuale Hemmung von CYPIlBl in NCI-H295R, Hemmstoff-Konzentration 2,5 μM (für IC50- Bestimmung mindestens 3 verschiedene Konzentrationen); Präinkubation 1 h, Substrat: [3H]- Deoxycortisol (RSS, 500 nM); Inkubationszeit: 48 h; Extraktion mit Dichlormethan; Bestimmung von Cortisol nach HPLC-Trennung (Methanol-Wasser 50: 50; RP18) b: prozentuale Hemmung von CYP11B2 in NCI-H295R, Hemmstoff-Konzentration 2,5 μM (für IC50- Bestimmung mindestens 3 verschiedene Konzentrationen); Stimulation mit K+-Ionenhaltiger Salzlösung [20 mM K+] Präinkubation 1 h, Substrat: [3H]-Corticosteron (B,500 nM); Inkubationszeit: 24 h; Extraktion mit Dichlormethan; Bestimmung von [3H]-18- Hydroxycorticosteron und [3H]-Aldosteron nach HPTLC-Trennung (Chloroform-Methanol-Wasser 300:20: 1; Phosphoimager) c: prozentuale Hemmung von CYP11B2 in NCI-H295R, Hemmstoff-Konzentration 2,5 μM (für IC50- Bestimmung mindestens 3 verschiedene Konzentrationen); Präinkubation 1 h, Substrat: [14C]- Deoxycorticosteron (DOC,500 nM); Inkubationszeit: 3 h; Extraktion mit Dichlormethan; Bestimmung von [14C]-Corticosteron, [14C]-18-Hydroxycorticosteron und [14C]-Aldosteron nach HPTLC-Trennung (Chloroform-Methanol-Wasser 300:20: 1; Phosphoimager) d: prozentuale Hemmung von CYP11B2 in S. Pombe PEl, Hemmstoff-Konzentration 500 nM; Präinkubation 1 h; Substrat: [14C]-Deoxycorticosteron (DOC, 100 nM); Inkubationszeit: 6 h; Extraktion mit Ethylacetat; Bestimmung von [14C]-Corticosteron nach HPTLC-Trennung (Chloroform-Methanol-Wasser 300:20: 1; Phosphoimager) e: IC50-Wertbestimmung für CYPIlBl in V79MZhllBl; IC50-Bestimmung in mindestens 3 verschiedenen Hemmstoff-Konzentrationen; Präinkubation 1 h, Substrat: [14C]-Deoxycorticosteron (DOC, 100 nM); Inkubationszeit: 140 min; Extraktion mit Ethylacetat; Bestimmung von [14C]- Corticosteron nach HPTLC-Trennung (Chloroform-Methanol-Wasser 300:20: 1; Phosphoimager) f: IC50-Wertbestimmung für CYPl 1B2 in V79MZhllB2; IC50-Bestimmung in mindestens 3 verschiedenen Hemmstoff-Konzentrationen; Präinkubation 1 h, Substrat: [14C]-Deoxycorticosteron (DOC, 100 nM); Inkubationszeit: 40 min; Extraktion mit Ethylacetat; Bestimmung von [14C]- Corticosteron, [14C]-18-Hydroxycorticosteron und [14C]-Aldosteron nach HPTLC-Trennung (Chloroform-Methanol-Wasser 300:20: 1; Phosphoimager) Zur Untersuchung der Wirkung verschiedener Hemmstoffe auf NCI-H295R wurde ein Testverfahren im 24-well-Format entwickelt. Zur Hemmstofftestung wurde zunächst eine einstündige Prä-Inkubation durchgeführt, bevor die Enzym reaktionen durch Substratzugabe (500 nM) gestartet wurden. A) Aussaat: Anzucht und Passagieren der Zelllinien erfolgte, bis ein konfluenter Zellrasen ausgebildet worden war. Durch Trypsinbehandlung wurde das Zellmaterial von mindestens zwei Kulturschalen gewonnen und die Zellzahl mit Hilfe eines CASY TT-Zellzählgerätes (150 μl-Kapillare) bestimmt. Durch Verdünnen der Zellsuspension mit DMEM:Ham's F12 wurde eine Zelldichte von 1 x 106 Zellen/ml eingestellt. Von der so erhaltenen Zellsuspensionen wurde jeweils 1 ml auf ein well einer 24-well-Platte gegeben, so dass jedes well mit 1 x 106 Zellen beschichtet war. Mit dem Zellmaterial von zwei konfluent bewachsenen Kulturschalen konnten zwei 24-well-Platten beschichtet werden. Nach 24 Stunden waren die Zellen angewachsen und nach einer weiteren 24- stündigen Stimulationsphase mit Kaliumionenhaltiger Lösung (Endkonzentration: 20 mM KCl) zum Test einsetzbar.
B) Substratlösunqen: Für die Testung des Einflusses der Hemmstoffe auf CYPIlBl wurde als Substrat Tritium-markiertes Deoxycortisol eingesetzt ([3H]- RSS = 17-Hydroxy-ll-deoxycorticosteron, 41,9 Ci/mmol). Zur Herstellung einer Mischung aus markierter und unmarkierter Substanz wurden 38 μl unmarkiertes Deoxycortisol (0,5 mM in Ethanol) und 41,6 μl [1,2-3H (N)]-Deoxycortisol (1 mCi/ml, 52 Ci/mmol; NEN-Perkin-Elmer) in Ethanol mit 120,4 μl Ethanol verdünnt. Von dieser Lösung wurden 2,5 μl pro Probe eingesetzt, was bei einem Testvolumen von 500 μl einer Endkonzentration von 500 nM im Test entsprach. Bei den Substratlösungen für die Untersuchungen an CYP11B2 bestand die Corticosteron-Substratlösung (Endkonzentration im Test 500 nM) aus 38,4 μl [1,2-3H (N)]-Corticosteron (1 mCi/ml, 76,5 Ci/mmol; NEN-Perkin-Elmer) in Ethanol, 39,0 μl unmarkierter Corticosteronlösung (0,5 mM in Ethanol) und 122,6 μl Ethanol. Deoxycorticosteron, welches ebenfalls in einer Endkonzentration von 500 nM eingesetzt wurde, setzte sich zusammen aus 18 μl [14C]-markiertem Deoxycorticosteron (60,0 mCi/mmol; 0,5 nCi/μl) in Ethanol im Gemisch mit 54 μl unmarkierter Substanz (0,5 mM in Ethanol) und 228 μl Ethanol. C) Henri mstofflösunqen: Die für die Bestimmung der IC50-Werte erforderlichen Konzentrationen wurden durch l:40-Verdünnen der Stammlösung (10 mM) mit Ethanol eingestellt. Von dieser Lösung wurden den Proben jeweils 5 μl zugesetzt.
D) Durchführung des Tests: Prä-Inkubation: Das vorhandene Medium wurde abgesaugt und durch 450 μl DMEM:Ham's F12 ersetzt, in dem der Hemmstoff in der entsprechenden Konzentration zugesetzt war (Endkonzentration des Hemmstoffes im Endvolumen (500 μl) des Tests: 2,5 μM), danach wurde 1 h prä-inkubiert. Teststart: Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl DMEM:Ham's F12, 2,5 μl des jeweiligen Substratmixes (Endkonzentration des Substrats: 0,5 μM) enthaltend, eingeleitet.
Die 24-well-Platte wurde dann bei 37 0C und 5 % CO2 im CO2-Inkubator aufbewahrt. Die Inkubationszeit betrug 3 Stunden bei Verwendung von Deoxycorticosteron als Substrat, bei Corticosteron 24 Stunden und bei Deoxycortisol 48 Stunden.
Teststop: Nach Ablauf der Inkubationszeiten wurde nach kurzem Schwenken der Inhalt der wells möglichst quantitativ entnommen und durch Mischen mit 1000 μl Dichlormethan in einem 2ml-Eppendorfgefäß inaktiviert. Nach 10-minütigem Schütteln wurde zur Phasentrennung zentrifugiert und die obere organische Phase in ein I,5ml-Eppendorf-Gefäß überführt.
Nach Abdampfen des Lösungsmittel über Nacht unter dem Abzug wurde der Rückstand in 10 μl Chloroform aufgenommen und in der Mitte der Aufkonzentrierungszone einer HPTLC-Platte aufgetragen. Die Steroide wurden durch zweifaches Entwickeln mit einem Fließmittel, das sich aus Chloroform, Methanol und Wasser in Verhältnis 300:20: 1 zusammensetzte, aufgetrennt. Im Falle von Deoxycortisol als Substrat erfolgte die Auftrennung per HPLC über eine RP18-Säule mit dem Fließmittel Methanol: Wasser 1: 1 und einer Flussrate von 0,25 ml/min, die Detektion erfolgte mit Hilfe eines Berthold Radiomonitors 509. Zur Detektion der Steroide auf der TLC wurde nach zwei Tagen der strahlenexponierte Film im Phosphoimager FLA 3000 gescannt.
Nach Gleichung 4 wurde die Konversion für das Substrat Deoxycortisol nach HPLC-Trennung berechnet: Gleichung 4: g/ p _ ^Jortison ^Jortison y, i r\r\ lAjortison+ Ajortisol+ ^RSSl
0ZoP Konversion (Anteil des Produktes an Gesamtsteroid in %) A Area (Fläche) in [Units ■ sec]
Acortisoi Fläche für Cortisol
Acortison Fläche für Cortison
ARss Fläche für Deoxycortisol (RSS)
Für das Substrat Deoxycorticosteron ergab sich die Konversion entsprechend Gleichung 3 (Bsp. 5B).
Für das Substrat Corticosteron galt Gleichung 5: Gleichung 5:
o/üp _ \PSLn0HB + PSLAldo J - 2 x PSL HG ^ ^ ^ [PSL B + PSLn0HB + PSLAldo J - 3 x PSL HG
0ZoP Konversion (Anteil des Produktes an Gesamtsteroid in %
PSL Phospho Stimulated Lumineszence (Lumineszenzwert)
PSLB PSL für Corticosteron (B)
PSL180HB PSL für 18-Hydroxycorticosteron (18OHB) PSLAld0 PSL für Aldosteron
PSLHG PSL des Hintergrundes
Die prozentuale Hemmung, die durch einen Hemmstoff in der jeweils eingesetzten Konzentration verursacht wurde, errechnete sich nach Gleichung 2 (Bsp. 5A). Die Bestimmung des IC50-Wertes erfolgte wie in Bsp. 5B beschrieben.
Beispiel 13: Test von Verbindung 50
Die Verbindung 50 wurden in V79 Zellen auf Hemmung des CYPIlBl und CYPl 1B2 getestet. Verbindung 50 hemmt die humane Aldosteronsynthase im tief nanomolaren Bereich und zeigt zusätzlich nur eine sehr schwache Hemmung des humanen CYPIlBl. Die Substanz ist nicht nur hoch potent, sondern auch sehr selektiv. Somit stellen Substanzen der Klasse der in 3-Stellung substituierten 1,2-Dihydroacenaphthylene neue Leitstrukturen dar, die zu noch potenteren und gleichzeitig hoch selektiven CYP11B2-Inhibitoren führen können.
Tab. 8: Hemmdaten des Acenaphthen-Derivats 50
ICso-Wert (nM) a
Verbindung V79 HBl b V79 11B2 c Selektivitäts- CYPHBl CYPl 1B2 Faktor01
50 2452 10 245 a Mittelwert von vier Messungen, Standardabweichung < 20 %. b Hamster
Fibroblasten, exprimieren humanes CYPIlBl; Substrat
Deoxycorticosteron, 100 nM. c Hamster Fibroblasten, exprimieren humanes CYP11B2; Substrat Deoxycorticosteron, 100 nM. d IC50 (CYPl 1B1)/IC5O (CYP11B2).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Verbindung mit der Struktur der Formel (I)
worin
R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy, Nitro, Alkyl, Alkoxy, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonyloxy, Alkylsulfinyl und Alkylsulfonyl (worin die Alkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 R12 substituiert sein können), Aryl- und Heteroarylresten und deren partiell oder vollständig gesättigten Äquivalenten, welche mit 1 bis 3 R12 substituiert sein können, Aryloxy- und Heteroaryloxyresten, wobei Aryl und Heteroaryl die vorstehend angegebene Bedeutung aufweist, -COOR11, -SO3R11, -CHO, -CHNR11, -N(Rn)2, -NHCOR11 und - NHS(O)2R11; R3 ausgewählt ist aus stickstoffhaltigen monocyclischen oder bicyclischen Heteroarylresten und deren partiell oder vollständig gesättigten Äquivalenten, die mit 1 bis 3 R12 substituiert sein können und zumindest ein Stickstoffatom aufweisen, das nicht an das Methyliden-C-Atom gebunden und nicht substituiert ist; R4, R5, R6, R7, R8, R9 und R10 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy, Nitro, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederalkylcarbonyloxy, Niederalkylcarbonylamino, Niederalkylsulfonylamino, Niederalkylthio, Niederalkylsulfinyl und Niederalkylsulfonyl (worin die Niederalkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können), -N(Rn)2, -COOR11 und - SO3R11, oder
R8 oder R9 mit R6 oder R7 und/oder mit R8 oder R9 des benachbarten C-Atoms eine oder zwei Doppelbindungen bilden, oder R8 (und R9) mit R6 (und R7) oder mit R8 (und R9) des benachbarten C-Atoms und den dazugehörigen C-Atomen einen gesättigten oder ungesättigten anellierten Aryl- oder Heteroarylring bilden, wobei die Atome des anellierten Aryl- oder Heteroarylrings mit 1-3 Resten R12 substituiert sein können, oder R4 und R10 gemeinsam eine Methylen-, Ethylen- oder Ethylidenbrücke bilden, wobei die Atome der Brücke mit einem oder zwei Resten R12 substituiert sein können, oder ein Ringatom in ortho-Position des Heteroarylrestes von R3 direkt oder über eine Methylen- oder Methylidenbrücke eine Bindung mit R6 und/oder R7 bildet, wobei das Brückenatom mit ein oder zwei Resten R12 substituiert sein kann;
R11 unabhängig vom Auftreten weiterer Rn-Reste ausgewählt ist aus H, Niederalkyl (das geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt und mit 1 bis 3 R12 substituiert sein kann) und Aryl, das mit 1 bis 3 R12 substituiert sein kann; R12 unabhängig vom Auftreten weiterer R12-Reste ausgewählt ist aus H, Hydroxy, Halogen, -CN, -COOH, -CHO, Nitro, Amino, mono- und bis-(Niederalkyl)amino, Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkylcarbonyl, Niederalkylcarbonyloxy, Niederalkylcarbonylamino, Niederalkylthio, Niederalkylsulfinyl,
Niederalkylsulfonyl, Hydroxy-Niederalkyl, Hydroxy-Niederalkoxy, Hydroxy- Niederalkylcarbonyl, Hydroxy-Niederylkylcarbonyloxy, Hydroxy-
Niederalkylcarbonylamino, Hydroxy-Niederalkylthio, Hydroxy-Niederalkylsufinyl, Hydroxy-Niederalkylsufonyl, mono- und bis-(Hydroxy-Niederalkyl)amino und mono- und polyhalogeniertes Niederalkyl (worin die Niederalkylreste geradkettig, verzweigt oder cyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein können); n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; oder eines pharmazeutisch geeigneten Salzes derselben zur Behandlung von Hypercortisolismus, Diabetes mellitus, Herzinsuffizienz und
Myocardfibrose.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (I) eine Verbindung der nachfolgenden Formeln (Ia) bis (Ig) ist
Ia Ib Ic
Id Ie
If 1S wobei alle Variablen die vorstehend angegebene Bedeutung haben, entweder eine Einfach- oder Doppelbindung ist, und eine Verbindung der
Formel (Ia), (Ib), (Ic) oder (Id) besonders bevorzugt ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei in der Verbindung der Formeln (I) und (Ia) bis (Ig)
(i) die Alkylreste und Alkoxyreste gesättigt sind oder eine oder mehrere Doppel- und/oder Dreifachbindungen aufweisen, die geradkettigen oder verzweigten Alkylreste insbesondere 1 bis 10 C-
Atome, besonders bevorzugt 1 bis 6 C-Atome aufweisen, und die cyclischen Alkylreste mono- oder bicyclische Alkylreste mit 3 bis 15 C-Atomen, besonders bevorzugt monocyclische Alkylreste mit 3 bis 8 C-Atomen sind;
(ii) Aryl ein mono-, bi- und tricyclischer Arylrest mit 3 bis 18
Ringatomen ist, der optional mit einem oder mehreren gesättigten Ringen anelliert sein kann, insbesondere Anthracenyl,
Dihydronaphthyl, Fluorenyl, Hydrindanyl, Indanyl, Indenyl,
Naphthyl, Phenanthrenyl, Phenyl, Tetralinyl ist;
(iii) die Heteroarylreste mono- oder bicyclische Heteroarlyreste mit 3 bis
12 Ringatomen sind, die vorzugsweise 1 bis 5 Heteroatome aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel aufweisen und die mit einem oder mehreren gesättigten Ringen anelliert sein können; und/oder (iv) die Niederalkylreste und Niederalkoxyreste gesättigt sind oder eine
Doppel- oder Dreifachbindung aufweisen, die geradkettigen insbesondere 1 bis 6 C-Atome, besonders bevorzugt 1 - 3 C-Atome aufweisen, die cyclischen insbesondere 3 bis 8 C-Atome aufweisen; und/oder
(v) die stickstoffhaltigen monocyclischen oder bicyclischen
Heteroarylreste ausgewählt sind aus Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzoxazolyl, Chinazolinyl, Chinolyl, Chinoxalinyl, Cinnolinyl, Dihydroindolyl, Dihydroisoindolyl, Dihydropyranyl, Dithiazolyl,
Homopiperidinyl, Imidazolidinyl, Imidazolinyl, Imidazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isochinolyl, Isoindolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolyl, Isoxazolidinyl, Isoxazolyl, Morpholinyl, Oxadiazolyl, Oxazolidinyl, Oxazolyl, Phthalazinyl, Piperazinyl, Piperidyl, Pteridinyl, Purinyl, Pyrazolidinyl, Pyrazinyl, Pyrazolyl, Pyrazolinyl, Pyridazinyl, Pyridyl,
Pyrimidyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolidin-2-onyl, Pyrrolinyl, Pyrrolyl,
Tetrazinyl, Tetrazolyl, Tetrahydropyrrolyl, Thiadiazolyl, Thiazinyl,
Thiazolidinyl, Thiazolyl, Triazinyl und Triazolyl; und/oder
(vi) anellierte Aryl- oder Heteroarylringe monocyclische Ringe mit 5 bis 7 Ringatomen sind, die über zwei benachbarte Ringatome mit dem
Nachbarring anelliert sind, gesättigt oder ungesättigt sein können und als Heteroarylringe 1 bis 3 Heteroatome, bevorzugt Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome umfassen können, und besonders bevorzugt ausgewählt sind aus Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Benzyl, Furanoyl, Dihydropyranyl, Pyranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyridyl und Pyrimidyl.
4. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei in der Verbindung der Formeln (I) und (Ia) bis (Ig)
(i) R1 oder R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, CN, Hydroxy, Ci-io-Alkyl- und Ci-I0-Al koxyresten, wobei die Alkylreste oder Alkoxyreste geradkettig und gesättigt sind und mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können; und/oder (ii) R3 ausgewählt ist aus stickstoffhaltigen mono- und bicyclischen Heteroarylresten mit 5 bis 10 Ringatomen und 1 bis 3 Stickstoffatomen, insbesondere ausgewählt ist aus Isochinolyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Pyrazinyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Pyrrolyl, Thiazolyl, Triazinyl und Triazoyl; und/oder (iii) R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus H, Halogen, CN, Hydroxy und Ci-6-Alkyl- und Ci-6-Al koxyresten, die mit 1 bis 3 Resten R12 substituiert sein können; und/oder
(iv) R12 ausgewählt ist aus H, Halogen, Hydroxy, CN, Ci-3-Alkyl und Ci-3-AIkOXy; und/oder (v) n 1 oder 2 ist.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei in der Verbindung der Formeln (I) und (Ia) bis (Ig), bevorzugt in der Verbindung der Formeln (Ia) bis (Ic)
(i) R1 oder R2 Wasserstoff ist;
(ii) der andere der Substituenten R1 oder R2 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Fluor, Chlor, CN, Hydroxy, Ci-3-Alkyl und Ci-3-Alkoxy;
(iii) R3 ausgewählt ist aus Pyridyl, Imidazolyl, Isochinolyl und Pyrimidyl; und (iv) R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 und R12 Wasserstoff sind.
6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei in der Verbindung der Formel (Id) (i) R1 oder R2 Wasserstoff ist;
(ii) der andere der Substituenten R1 oder R2 ausgewählt ist aus H, Fluor, Chlor, CN, Hydroxy, Ci-3-Alkyl und Ci-3-Alkoxy;
(iii) R3 ausgewählt ist aus Pyridyl, Imidazolyl, Isochinolyl und Pyrimidyl; (iv) R5, R6, R7, R8, R9 und R12 H sind; und (v) eine Doppelbindung ist.
7. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung der Formel (I) E,Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-imidazol, E,Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(6-Nitril-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(7-Fluoro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-4-(7-Chloro-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E,Z-3-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(4-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(4-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E,Z-3-(5-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E,Z-3-(7-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin oder
E,Z-3-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyrimidin, entweder als Isomerengemisch oder eines der beiden Isomere ist, und insbesondere
Z-4-(5-Chloro-l-Indanylidenmethyl)-imidazol, Z-4-(l,2,3,4-Tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
Z-4-(6-Nitril-l,2,3,4-tetrahydronaphth-l-ylidenmethyl)-imidazol,
E-3-(l-Indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(5-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-pyridin, E-3-(5-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(4-Fluoro-l-indanylidenmethyl)-pyridin,
E-3-(7-Methoxy-l-indanylidenmethyl)-pyridin
E-3-(5-Fluoro-indanylidenmethyl)-pyrimidin oder
3-(l,2-Dihydroacenaphthylen-3-yl)pyridin ist.
8. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung der Formel (I) Z-4-(5-Chloro-l-indanylidenmethyl)-imidazol ist.
9. Verbindung der Formel (I)
worin
R1, R2, R3, R4, R5, R6,R7, R8, R9, R10, R11 und R12 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung aufweisen, vorausgesetzt dass, wenn
(a) n = 1, R1, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl oder 4-Pyridyl;
(b) n = 2, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R1 Cl oder CN ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl; (C) n = 2, R1 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R2 CN ist, dann ist R3 nicht 4- Imidazolyl;
(d) n = 1, R1 und R4 - R10 Wasserstoff ist und R2 F, Cl, Br oder CN ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl;
(e) n = 2, R1, R2 und R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl, 4- Pyridyl, 4-Methyl-3-pyridyl oder 3-Nitroimidazo[l,2-a]pyrid-2-yl;
(f) n = 1 oder 2; drei der Reste R1, R2, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Ci-4-Alkyl, C2-4-Alkenyl, C3-7-Cycloalkyl, Hydroxy, Ci-4-Alkoxy, Hydroxy-Ci-4-alkyl, Halogen, Trifluormethy, Nitro oder optional substituiertes Amino sind und der vierte Rest aus R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff ist, R6 Wasserstoff ist, R7 Wasserstoff oder Ci-4-Al ky I ist, R8 Wasserstoff, Ci-4-Al ky I, Hydroxy oder Ci-4-Alkoxy ist; R9 und R10 unabhängig voneinandetr Wasserstoff oder Ci-4-Alkyl sind, dann ist R3 nicht 4-Imidazolyl;
(g) n = 1 oder 2, drei der Reste R1, R2, R4 und R5 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, Amino, Halo-Ci-6-alkyl, Ci-6-Alkyl, Ci-6-Alkoxy oder Hydroxy-Ci-6-alkyl sind und der vierte Rest aus R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff ist, einer der Reste R6, R7, R8 und R9 C3-7-Cycloalkyl, C5-7-Cycloalkenyl, C3-7- Cycloalkylmethy oder C3-7-Cycloalkenylπnethy ist, wobei der Methylrest mit einem oder zwei Ci-6-Al ky I resten substituiert sein kann, zwei der Reste R6, R7, R8 und R9 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, Ci-6-Alkyl, Halo-Ci-6-alkyl, Ci-6- Alkoxy oder Hydroxy-Ci-6-alkyl sind, und die übrigen Reste R6, R7, R8 und R9
Wasserstoff sind, R10 Wasserstoff oder Ci-6-Alkyl ist, dann ist R3 nicht 4-
Imidazolyl;
(h) n = 1, R1 Wasserstoff, Hydroxy, Alkoxy oder Alkylcarbonyloxy ist, R2 Hydroxy, Alkylcarbonyloxy oder Alkoxy ist, R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Pyridyl;
(i) n = 2, R1 Wasserstoff ist, R2 Hydroxy, Ci-4-Alkoxy oder Ci-4-Alkylcarbonyloxy ist, R4 - R9 Wasserstoff ist, R10 Wasserstoff oder Ci-4-Alkyl ist, dann ist R3 nicht 4-
Pyridyl; (j) n = 1, R1, R2, R4, R5, R8 - R10 Wasserstoff ist, R6 und R7 beide Wasserstoff oder beide Methyl sind, dann ist R3 nicht 2-Pyridyl;
(k) n = 2, R1, R2, R4, R5 und R8 - R10 Wasserstoff ist, R6 und R7 beide Methyl sind, dann ist R3 nicht 2-Pyridyl ;
(I) n = 2, R1 Wasserstoff ist, R2 Wasserstoff oder Methoxy ist, R4 - R10 Wasserstoff ist, dann ist R3 nicht 4-Methyl-3-pyridyl oder deren pharmazeutisch geeignete Salze.
10. Verbindungen nach Anspruch 9, wobei die Variablen R1 bis R12 und n die in Anspruch 4 oder 5 angegebene Bedeutung haben und vorzugsweise die in Anspruch 6 oder 7 definierten Verbindungen sind.
11. Verfahren zur Synthese der Verbindungen gemäß Anspruch 9, umfassend die Umsetzung der Verbindung (II)
π zum entsprechenden Alkohol und eine daran anschließende Wittig-Reaktion mit der Verbindung (III) R10
Cr ^R3 m wobei die Variablen die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben, und funk¬ tionelle Gruppen in R^R10 optional mit geeigneten Schutzgruppen versehen sein können.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine wie in Anspruch 9 oder 10 definierte Verbindung.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, die zur Therapie von Herzinsuffizienz, myokardialer Fibrose, Hypercortisolismus oder Diabetes mellitus bei Säugetieren und Menschen geeignet ist.
14. Verwendung der in den Ansprüchen 1 bis 8 definierten Verbindungen zur selektiven Hemmung von Säugetier-P450-Oxygenasen, zur Hemmung der humanen oder Säugetier-Aldosteronsynthase oder Steroid-llß-Hydroxylase, besonders zur Hemmung der humanen Steroid-llß-Hydroxylase CYPIlBl oder Aldosteron-Synthase CYP11B2, insbesondere zur selektiven Hemmung der CYP11B2 bei gleichzeitiger geringer Beeinträchtigung der humanen CYPIlBl.
15. Verwendung nach Anspruch 1 bis 8 und 14, wobei die genannten Verbindungen
(i) als Einzelverbindungen oder
(ii) als Bestandteil von Mischungen, enthaltend eine oder eine Kombination von zwei und mehr der unter Anspruch 1 bis 7 genannten Verbindungen oder (iii) in Kombination mit weiteren pharmakologisch aktiven Verbindungen eingesetzt werden.
16. Verfahren zur Vorbeugung, Verlangsamung des Verlaufs oder Therapie von Diabetes mellitus, Hypercortisolismus, Hypertonie, kongestives Herzversagen, Nierenversagen, insbesondere chronisches Nierenversagen, Restenose, Atherosklerose, Nephropathie, koronare Herzkrankheiten, vermehrte Bildung von Kollagen, Fibrose, jeweils verknüpft mit oder nicht verbunden mit Auftritt von Hypertonie in einem Individuum, umfassend die Gabe einer Verbindung wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 definiert an das Individuum.
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