EP1706504A1 - Verfahren zur identifizierung und herstellung von effektoren calmodulin-abh ngiger peptidyl-prolyl cis/trans isomerasen - Google Patents

Verfahren zur identifizierung und herstellung von effektoren calmodulin-abh ngiger peptidyl-prolyl cis/trans isomerasen

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Publication number
EP1706504A1
EP1706504A1 EP05706982A EP05706982A EP1706504A1 EP 1706504 A1 EP1706504 A1 EP 1706504A1 EP 05706982 A EP05706982 A EP 05706982A EP 05706982 A EP05706982 A EP 05706982A EP 1706504 A1 EP1706504 A1 EP 1706504A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
camap
calm
effector
calmodulin
activity
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05706982A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gunter Fischer
Frank Edlich
Matthias Weiwad
Franziska Jarczowski
Gerhard KÜLLERTZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1706504A1 publication Critical patent/EP1706504A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/533—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving isomerase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying and producing effectors of peptidyl-prolyl cis / trans isomerases which can be activated by calmodulin. Furthermore, the invention relates to the use of the identified effectors for the production of medicaments, as well as screening methods and kits.
  • PPIases Peptidyl-prolyl cis / trans isomerases
  • PPIases are classified according to the recommendations of the "Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" ("Enzyme Nomenclature", Academic Press, 1992) under EC number 5.2.1.8 summarized.
  • the main representatives of this class of enzymes were discovered and defined by their enzymatic activity against suitable substrates, e.g. Cyclophilin (Fischer et al, Nature. 337 (1989): 476-8); FKBP12 (Harding et al. Nature. 341 (1989): 758-60) or Parvulin (Rahfeld et al. FEBS Letters.
  • PPIases can cis / trans isomerize prolyl peptide bonds in oligopeptides and Catalyze proteins.
  • Internationally, previously unclassified proteins are often assigned to this enzyme class by comparing primary sequences using constantly updated databases such as SwissProt, TrEMBL (e.g.: Nucleic Acids Res. 31: 365-370 (2003) or CELERA (cds@celera.com) and the use of suitable comparison algorithms (such as Bioinformatics 15: 219-227 (1999) or US6023659). The quality this assignment is assessed with the help of suitable netting values (scores).
  • a further possibility of assigning unknown proteins to the class of PPIases is to determine the PPIase activity by means of suitable PPIase activity tests, for example by means of isomer-specific proteolysis (Fischer et al. Biochim. Biophys Aacta 43 (1984), 1101; Fischer et al. Nature. 337 (1989): 476-8), nuclear magnetic resonance spectroscopy (Kern et al. Biochemisti34 34 (12995) 13598, Reimer et al. Biochemical J. 326 (1997) 181), or other spectroscopic determination methods known to the specialist (such as: Janowski et al. Analytical Biochemistry 252 (1997), 299; Garcia-Echeverria et al. Biochem.
  • PPIase activity reports listed above it can be seen that some of the enzymes assigned to the PPIases, such as, for example, FKBP38 (Shirane Nature Cell Biology 5 (2003) 1), are only slight or less than known PPIase representatives such as cyclophilin, FKBP12 or parvulin have hardly detectable PPIase activity compared to typical PPIase substrates.
  • Typical PPIase substrates have a peptidyl-prolyl peptide bond, are known to the person skilled in the art and are described in numerous references accessible to the person skilled in the art, for example: Clinical Chemistry.
  • Calmodulin occurs in animal and plant cells as a widespread intracellular Ca 2+ receptor, which mediates a variety of Ca 2+ -regulated processes.
  • cytoplasmic calcium level rises, caused by the opening of calcium channels in the plasma membrane or a membrane of intracellular storage vesicles, calmodulin is activated.
  • Many enzymes, pumps, membrane transport proteins and other target proteins are regulated by Ca 2+ / Calmodulin, most of them. Effects are not triggered directly by calmodulin, but via Ca 2+ / calmodulin-dependent protein kinases.
  • calmodulin is also an independent regulatory subunit of an allosteric enzyme (e.g. phosphorylase kinase).
  • Calmodulin apparently recognizes the different target proteins from positively charged, amphipathic alpha helices, since both lobes of the Ca 2+ -calmodulin have hydrophobic sequence regions which are surrounded by negatively charged regions and thus have complementarity with positively charged amphiphilic alpha helices (P. Cohen and CB Klee (ed.) Calmodulin. Elsevier, Amsterdam, 1988). Although parts of the primary sequence appear conserved, there are considerable differences between individual species, so. eg between the human protein and that from yeast:
  • the problem underlying the present invention was to provide means for a method for identifying and / or producing an effector of a calmodulin-dependent peptidyl prolyl cis / trans. Isomerase. By solving this technical problem, specifically acting drugs are to be provided.
  • the present invention thus relates to a method for identifying and / or producing an effector of a calmodulin-dependent peptidyl-prolyl cis / trans isomerase (CaMAP) consisting of steps (a) mixing suitable amounts of a CaMAP or a CaMAP peptide fragment / derivative with one suitable amount of calmodulin or a calmodulin fragment / derivative in a suitable reaction solution with and without the effector; ⁇ . , ... (b) adding an appropriate amount of a suitable CaMAP substrate; , (c) measuring CaMAP activity; and (d) evidence that the effector.
  • CaMAP calmodulin-dependent peptidyl-prolyl cis / trans isomerase
  • (i) is an inhibitor if the CaMAP activity in the reaction solution with the effector is less than in the reaction solution without the effector; or (ii) is an activator if the CaMAP activity is greater in the reaction solution with the effector than in the reaction solution without the effector.
  • effector defines molecules which have the enzymatic activity of the peptidyl-prolyl cis / trans isomerases modulate (modulators). According to the invention, this definition includes inhibitors and activators. "Inhibitors” are defined here as molecules that inhibit specific enzymatic activity. The term “activators” defines molecules that enhance a certain enzymatic activity.
  • the effectors that can be analyzed by the present method belong to all known classes of substances that are suitable for the method due to their physicochemical properties.
  • the analyzable effectors include both inorganic and organic molecules.
  • the effectors can be chemical, synthesized, or provided by isolation from natural sources such as living things.
  • the effectors are preferably peptides or polypeptides, sugar molecules, lipids or combinations of these groups of molecules.
  • the analyzable effectors are particularly preferably peptides or polypeptides or derivatives thereof.
  • the effectors particularly preferably comprise molecules which are known to interact with peptidyl-prolyl cis / trans isomerases, such as, for example, peptide inhibitors, antibodies, lectins or fragments or derivatives thereof, the inhibiting or activating activity of which can be tested in the present method according to the invention.
  • CaMAPs Calmodulin-dependent peptidyl prolyl cis / trans.
  • isomerases CaMAPs
  • CaMAP isomerases
  • the term CaMAP also includes" Cal AP peptide fragments / derivatives ", including shortened or different ones known to the person skilled in the art Methods to understand modified CaMAPs that have a peptidyl-prolyl cis / trans isomerase activity.
  • Motif search For example, databases accessible to the specialist, such as SwissProt; TrEMBL; Trenew; Trest; Trgen; Trome etc. are searched for PPIases with motifs that are typical for binding of calmodulin. Typical motifs are known to the person skilled in the art and have been described in several ways, for example in Journal of Biological Chemistiy 277 (2002) 14681; Journal of Biological Chemistiy. 276 (10): 7129-35, 2001; Journal of Biological Chemistry. 273 (18): 10819-22, 1998; Journal of Biological Chemistiy. 269 (42). -26431-7, 1994 .; Journal of Biological Chemistry. 276 (10): 7129-35, 2001; Plant Physiology.
  • Example 4 shows an example of such a search strategy according to the invention with the helical calmodulin motif KHAAQRSTETALYRKM in order to find potential CaMAPs in databases known to the person skilled in the art. A clear assignment to CaMAPs is then carried out using one or more activity tests known to the person skilled in the art.
  • the potential binding protein or the active calmodulin can preferably be bound to a macroscopic matrix, for example agarose (for example, calmodulin-agarose for affinity studies is commercially available; for example: Sigma order number: P4385) and then freed of unbound substances by washing, in order to then identify the interaction partners using suitable strategies, such as SDS-PAGE and mass spectrometry.
  • a macroscopic matrix for example agarose (for example, calmodulin-agarose for affinity studies is commercially available; for example: Sigma order number: P4385) and then freed of unbound substances by washing, in order to then identify the interaction partners using suitable strategies, such as SDS-PAGE and mass spectrometry.
  • SDS-PAGE mass spectrometry
  • the conformation and properties of proteins are determined by their primary sequence, the goal is essentially the planned modification of amino acid sequences of existing proteins.
  • small proteins can be synthesized chemically (peptide synthesis). The chemical synthesis enables further regulation of the secondary structure of the protein, since unnatural amino acids can be emitted, such as 2,2-dimethylglycine, the conformation of which is restricted and therefore enables a stable selo structure.
  • a chemical modification of native enzymes can also be carried out with the aim of maintaining normal properties (eg enzyme activity) while achieving greater stability.
  • a commonly used method is to synthesize genes that code for a polypeptide sequence.
  • Hybrid genes can be chemically synthesized by adding segments of natural genes to chemically synthesized DNA sequences.
  • new primary sequences can be formed by using synthetic DNA sequences to expand natural genes or to replace segments of natural genes. The resulting synthetic or hybrid DNA is then inserted into a plasmid to synthesize the planned protein.
  • the primary sequence can be changed by a CaMAP using methods known to those skilled in the art in such a way that single or more amino acids of the primary sequence are replaced by other amino acids.
  • a glycine in position 2 is replaced by an arginine.
  • a genetically modified CaMAP or CaMAP peptide fragments / derivatives which are particularly suitable for the search for effectors of CaMAPs can be recognized from the activating effect of calmodulin in the sense of the invention on the PPIase activity of the CaMAP. These are activated CaMAPs or peptide fragments / derivatives preferred according to the invention.
  • the protein can be produced from the nucleotide sequence using customary methods known to those skilled in the art.
  • CDNA clone databases and genome libraries are available as DNA sources for cloning.
  • DNA vectors are used, into which the desired sequences are inserted.
  • restriction endonucleases With the help of restriction endonucleases of different specificity, the DNA vectors and cellular genomes can be cleaved at selected sites. If the vector and donor DNA are cleaved with the same enzyme, the ends are complementary and can be hybridized and then linked by a DNA ligase (polynucleotide ligase).
  • Application example 10 shows the molecular biological production of a CaMAP as an example.
  • CaMAPs according to the invention can also be changed post-translationally.
  • CaMAPs can. be acetylated, metliylated, ubiquitinated or phosphorylated.
  • Proteins can also be carried out in vitro by a person skilled in the art.
  • the CaMAP can be phosphoryherized at least in vitro by means of • different protein serine threonine and protein tyrosine kinases.
  • different post-translationally modified CaMAP can be obtained. Overviews of post-translational modifications of proteins are that.
  • Application example 10 shows an example of the radioactive labeling of a CaMAP.
  • a post-translationally modified CaMAP or CaMAP peptide fragment / derivative which is particularly suitable for the search for effectors of CaMAPs is recognized the activating effect of calmodulin in the sense of the invention on the PPIase activity of the CaMAP.
  • These activated CaMAPs or peptide fragments / derivatives are preferred according to the invention.
  • Protein chemical change It can also be advantageous according to the invention to chemically modify the CaMAP.
  • the methods and processes required for this are known to the person skilled in the art as protein chemical processes.
  • the modification of lysines Journal of Biological Chemistry. 273 (43): 28516-28523, 1998; Biochimica et Biophysica Acta. 844 (2): 265-9, 1985
  • the oxidation or carbethoxylation (Pharmacology. 26 (5): 249-57, 1983; Biochemistry. 17 (19): 3924-8, 1978)
  • Known techniques for chemical change are described, for example, in Current Opinion in Biotechnology. 10 (4): 324-30, 1999; Current Opinion in Chemical Biology.
  • Application example 10 shows an example of the radioactive labeling of a CaMAP.
  • a suitable particularly for finding effectors of CaMAPs chemically modified CaMAP recognizes "one of the activating effect of inventive calmodulin to the PPIase activity of .CaMAP.
  • CaMAP or peptide fragment / derivative recognizes "one of the activating effect of inventive calmodulin to the PPIase activity of .CaMAP.
  • CaMAP or peptide fragment / derivative are preferred according to the invention.
  • Calmodulin in the sense of the invention comprises all polypeptides of this molecular class known to the person skilled in the art which are suitable for activating the CaMAP activity.
  • calmodulin fragments and / or calmodulin derivatives are included which lead to an activation of the peptidyl-prolyl cis / trans isomerase activity in the process according to the invention.
  • the detection of the increase in peptidyl-prolyl cis / trans isomerase activity can be carried out by means of methods known to the person skilled in the art and described above.
  • Calmodulin according to the invention can be very different.
  • the targeted modification of a protein can be achieved by genetic or chemical means or the direct chemical synthesis of a protein with new properties.
  • the goal of such changes is to tailor proteins for specific roles in technology and medicine. This includes the production of enzymes with: 1) increased Stability to heat, extreme pH values, oxidizing atmospheres and organic solvents; 2) improved or new substrate specificity and 3) changed properties which facilitate the recovery in subsequent processes. Since the conformation and properties of the proteins are determined by their primary sequence, the goal is essentially the planned modification of amino acid sequences of existing proteins. Alternatively, small proteins can be synthesized chemically (peptide synthesis). Chemical synthesis enables further regulation of the protein's natural structure, since unnatural amino acids can be introduced, such as 2,2-dimethylglycine, the conformation of which is restricted and therefore enables a stable natural structure.
  • a chemical modification of native enzymes can also be carried out with the aim of maintaining normal properties (eg enzyme activity) while achieving greater stability.
  • the tissue plasminogen activator used for the treatment of thrombosis was given resistance to proteolytic degradation in the body by modifying the surface lysine residues by reaction with an acid anhydride.
  • a commonly used method is to synthesize genes that code for a polypeptide sequence of interest. It is possible to chemically synthesize synthetic genes from up to 100 nucleotides.
  • Hybrid genes can be chemically synthesized by adding segments of natural genes to chemically synthesized DNA sequences. Alternatively, new primary sequences can be formed by using synthetic DNA sequences to expand natural genes or to replace segments of natural genes. The resulting synthetic or Hybf id DNA is then inserted into a plasmid to synthesize the planned protein.
  • the primary sequence of calmodulin can be changed using methods known to those skilled in the art in such a way that single or more amino acids of the primary sequence are replaced by other amino acids. It is also possible to extend the primary sequence N- or C-terminal by means of individual amino acids, oligopeptides or whole proteins. It can also be advantageous to produce only partial areas of the natural protein or protein modified by means of molecular biological methods, as shown in Example 9. Genetically modified calmodulin or a calmodulin fragment or calmodulin derivative which is suitable for the activation of the CaMAPs and which is based on the activating action is particularly preferred for the purposes of the invention recognizes the PPIase activity of the CaMAP.
  • Calmodulin can be changed post-translationally. For example, it can be acetylated, methylated, ubiquitinated or phosphorolyzed. Numerous post-translational changes in proteins occurring in vivo can also be carried out in vitro by a person skilled in the art. For example, calmodulin can be phosphorylated in vitro and in vivo using different protein serine / threonine and protein tyrosine kinases and dephosphorylated using pleiotropic protein phosphatases such as PPlgamma or PP2A (Eur. J. Biochem 269 (2002) 3619).
  • calmodulin In addition to the targeted in vitro phosphorylation, with defined phosphorylation of individual serines, tlireonins or tyrosines, of genetically engineered calmodulin (e.g. Zhcmg JG. Biochemical & Biophysical Research Communications. 222 (2): 439-444, 1996 or West et al. Protein Engineering. 2 (4): 307-ll, 1988) can also calmodulin according to numerous regulations (such as: Ho et al. Preparative Biochemistry. 16 (4): 29> 7-308, 1986; or Caldwell and Haug in Analytical Biochemistry. 116 (2): 325-30, 1981) can be made from a wide variety of materials such as, for example, beef him, beef heart or testicles.
  • Protein chemical changes It can also be advantageous according to the invention to chemically modify the CaMAP-activating calmodulin.
  • the methods and processes required for this are known to the person skilled in the art as protein chemical processes.
  • the modification of lysines Journal of Biological Chemistry. 273 (43): 28516-28523, 1998; Biochimica et Biophysica Acta. 844 (2): 265-9, 1985
  • the oxidation or Carbethoxylation of calmodulin Pharmacology. 26 (5): 249-57, 1983; Biochemistiy. 17 (19): 3924-8, 1978
  • the most varied chemical changes on proteins are possible.
  • Known chemical change techniques are described, for example, in Current Opinion in Biotechnology.
  • suitable CaMAP substrates encompasses all substrates of the peptidyl-prolyl cis / trans isomerases. In particular, these are substances which have a peptidyl-prolyl peptide bond.
  • Suitable CaMAP substrates in the sense of the invention are numerous literature references available to the person skilled in the art are described, for example: Clinical Chemistry. 44 (3): 502-8, 1998; Analytical biochemistry. 252 (2). -299-307, 1997; Biochemistry. 34 (41) :! 3594-602, 1995; Biochemistry. 30 (25): 6127-34, 1991; Biochemistry. 30 (25): 6127-34, 1991; Journal of Molecular Biology.
  • CaMAP substrates "within the meaning of the invention are peptides having an Xaa- Pro-Yaa - moiety, wherein Xaa preferably of the amine acids Glu, Phe or Leu, such as Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-NHNp or Suc Ala-Ala-Glu-Pro-Arg-NHNp.
  • Suitable amounts of the specified components of the method according to the invention can be found, inter alia, in the exemplary embodiments and are in a range of 0.0 l ⁇ M for the CaMAP according to the invention or the CaMAP peptide fragment / derivative, calmodulin or calmodulin fragment / derivative and the CaMAP substrate to 10 ⁇ m in the reaction solution, a range from 0.1 ⁇ m to 10 M. is preferred. A value of 1 ⁇ m is particularly preferred.
  • suitable reaction solution according to the invention is defined as a buffer system, which besides Water, buffer components can also contain further components, for example those specified below, and the identification of an effector of the calmodulin-dependent peptidyl-prolyl cis / trans isomerases is ensured.
  • the components contained in the reaction solution after mixing together are preferably in dissolved form.
  • the components must be added with thorough mixing.
  • the mixing can already be achieved by suitable pipetting techniques which are familiar to the person skilled in the art.
  • the mixing effect can be improved by mechanical action, for example by vortexing, swiveling or shaking.
  • CaMAPs can be easily identified in the sense of the method according to the invention. According to the invention, either a constitutively active CaMAP can be used or. CaMAP can be activated by calmodulin or corresponding fragments or derivatives. Through this . Activation changes the catalytic center of the CaMAP so that. the catalysis of typical CaMAP substrates under optimal catalytic conditions is increased at least twice.
  • This increase in CaMAP activity by at least 1.5 times, preferably at least 2 times, is also a characteristic of optimal catalytic conditions.
  • a wide range of buffers can be used to achieve optimal catalytic conditions.
  • a buffer with a pH in the range of 5-10, more preferably in the range of 6-8 and in particular in the range between 6.5-8.0 can be used.
  • An example of a suitable buffer system is 20 mM HEPES buffer with a pH of 7.8.
  • Other buffer solutions according to the invention include, inter alia, TRIS HC1, HEPES / NaOH or ammonium carbonate buffer in a final concentration of 5 mM to 200 mM.
  • the reaction temperature of the process according to the invention can be selected, for example in the range from 0 ° C. to 30 ° C., preferably between 5 ° C. and 15 ° C., the temperature being particularly preferably 8 ° C.
  • a higher temperature can lead to denaturation of proteins, while a lower temperature will lead to a decrease in the reaction rate.
  • the reaction mixture can additionally contain protein-stabilizing agents, such as sucrose, sorbitol or ethylene glycol, preferably in an amount of 200 to 500 mM and in particular in an amount of 250 to 300 mM. It may also be advantageous to add proteinase inhibitors, for example the “PI Complete” mixture available from Roche R , to the reaction solution in the quantity range specified by the manufacturer.
  • calmodulin according to the invention can be obtained by adding divalent ions such as Ca 2+
  • the reaction mixture may be used added chemicals only mask the divalent ion required for activating the calmodulin to such an extent that the formation of an effective calmodulin is not prevented
  • the exemplary embodiment 11 shows how the activation of a CaMAP is achieved by adding a mixture of calcium ions and calmodulin to the test mixture and how by chelation calcium ions can prevent this activation. Effectors of activated CaMAPs can significantly influence PPIase catalysis, " as shown in Example 5. There is a significant influence if the activation of the CaMAP is changed by at least 50%, the activation of calmodulin being able to be reversed when inhibitors are used, as shown in Example 5.
  • Effectors of CaMAPs can influence the conformational change caused by calmodulin on the CaMAP (embodiment example 11) in such a way that the PPIase activity of the “activated CaMAP” is changed despite otherwise optimal reaction conditions CaMAP binding site to the active calmodulin, or act on the calmodulin binding site to the CaMAP .
  • Inhibitors can also act on the binding sites for divalent metal ions, such as the binding sites for calcium ions, which may be necessary to activate effective calmodulin. However, inhibitors can also act directly on PPIase catalysis center work.
  • the active ingredient cyclosporin A can significantly inhibit the CaMAP Cyp40 (Swiss-Prot nomenclature: CY7P4_HUMAN), as listed in Example 8.
  • the active ingredient FK506 in turn can significantly inhibit the CaMAP FKB38 (Swiss-Prot nomenclature: FKB8_HUMAN), as listed in Example 5.
  • Effectors of CaMAPs can be found using affinity assays known to those skilled in the art. Such affinity assays for detecting the binding of a ligand can have very different structures.
  • Activity assays for the detection of effectors of activated CaMAPs Optimal methods for the detection of effect furnaces of the CaMAP activity can be recognized by the already known effectors Cyclosporin A and FK506. The activity of the CaMAP. by a sufficient. Amount of an effective calmodulin compared to a suitable CaMAP substrate activated using a suitable PPIase activity test so that a significant reduction in the CaMAP activity can be observed by adding a minimal amount of a known CaMAP inhibitor. In order to activate CaMAPs by effective calmodulin, it may be advantageous to incubate the CaMAP with this protein or protein fragment for up to 20 minutes at 20 ° C.
  • the incubation times of the effector with activated CaMAP should be at least 1 second, preferably 300 seconds, but may or may be much longer in order to be able to observe an effect.
  • Suitable CaMAP assays are all PPIase activity assays which allow a preincubation of effector and activated CaMAP and which allow the measurement of the effect by CaMAP effectors.
  • Effects of CaMAP inhibitors are not limited to the PPIase activity of activated CaMAPs.
  • cyclosporin A inhibits PPIases belonging to the family of cyclophilins and FK506 inhibits PPIases belonging to the group of FKBPs (European Journal of Biochemistry. 216 (3): 689-707, 1993; Annual Review of Immunology. 10: 519-60, 1992).
  • Cyclosporin A and FK506 are currently used as hnmunpharmaka to prevent graft rejection in human medicine. Both drugs can cause considerable side effects (eg: Seminars in Nephrology. 17 (1): 34-45, 1997).
  • a possible side effect of these therapeutic agents at the cell level is the influencing of programmed cell death, referred to by the person skilled in the art as apoptosis.
  • Apoptosis is necessary for proper embryo genesis and metamorphosis, tissue homeostasis and the function of the immune system in Metazoe ⁇ .
  • Sk ⁇ pische level of the cell apoptosis leads to loss of cell connections and microvilli, to chromatin condensation, DNA fragmentation, cytoplasmic contraction and tight packing of mitochondria and ribosomes.
  • Membrane vesicles form in which the endoplasmic reticulum fuses with the cell plasma membrane and divides the cell into several membrane-bound vesicles, which are referred to as apoptotic bodies. The latter are generally taken up and broken down by neighboring cells. So far, a number of factors have been identified that activate apoptosis. Apoptosis can be induced by cytotoxic agents. However, natural, genetically propagated apoptosis appears to depend on the initiation of a signaling pathway through ligand binding to specific receptors on the cell surface. [RE Ellis et al. Annu. Rev. Cell Biol. 7 (1991) 663-698; S.
  • Such means and therapies are important in all diseases that can be treated by targeted cell destruction. These include, in particular, door complications.
  • the targeted therapeutic induction of apoptosis can, however, also be advantageous in order to influence the immunogenicity of cells, as is described, for example, in US Pat. No. 5,922,598.
  • a method for screening and / or producing an effector of a CaMAP is likewise comprised of steps (a) mixing suitable amounts of a CaMAP or a CaMAP peptide fragment / derivative with a suitable amount of calmodulin or a calmodulin fragment / derivative a suitable reaction solution with and without a sample containing a single or a plurality of compounds that are candidates for an inhibitor or activator; (b) adding an appropriate amount of a suitable CaMAP substrate; (c) measuring CaMAP activity; and (d) demonstrating that the sample (i) has inhibitory activity when the CaMAP activity in the reaction solution with the sample is less than in the reaction solution without the sample; or (ii) has activating activity if the CaMAP activity in the reaction solution with the sample is greater than in the reaction solution without the sample.
  • the method according to the invention includes the implementation descriptions for steps (a) to (d) of the method for determining whether an effector is an inhibitor or an activator, with a sample being examined instead of an effector.
  • Sample is to be understood to mean all natural or artificial samples which contain candidates for inhibitors or activators of the given enzyme and which can be tested in the method according to the invention. This includes both homogeneous solutions of one molecule and mixtures of several molecules. Among molecules that can be screened in the method, the molecules of the aforementioned embodiments, which are identified as effectors, are included.
  • the samples can be taken from natural sources or synthetically manufactured. For example, the samples can be taken from molecular libraries, such as exist for oligopeptides or natural products.
  • samples can also be taken by digestion of biological material, for example living material or formerly living material, or culture supernatants from microorganism cultures.
  • the samples can be in the form of a crude extract or supernatant or can be in a freely selectable cleaning form.
  • the extracts or supernatants can be fractionated for cleaning. Numerous techniques are available to the person skilled in the art for this purpose, such as, for example, differential precipitation, gradient centrifugation, chromatography techniques, etc.
  • the biological material comprises all of them Organism areas, where the material can either be cultivated or taken from nature.
  • screening means the screening of a large number of samples which contain a single or a large number of compounds which are candidates for inhibitors or activators of the given enzyme with the aim of identifying inhibitors or activators of the CaMAP.
  • screening means a method in which a large number of samples are examined for a specific property, of which it is generally not previously known how they react to the property to be tested.
  • CaMAP effectors can be found in biological materials for a variety of reasons. In addition to gene-coded effectors that occur intrinsically in cells, effectors can also come into biological materials in which these effectors can be detected due to contamination with other biological materials, such as, for example, an infection by bacteria or through food intake, particularly in the case of disturbed intestinal absorption. However, effectors can also be used as a drug, either directly as an active ingredient or indirectly as a precursor active ingredient in biological materials. The quantification of these CaMAP effectors in biological materials can be useful in order to achieve an optimal therapy regimen through the determined bioavailability when these effectors are administered therapeutically.
  • the invention relates to a method which comprises the aforementioned steps (a) to (d) and additionally the step:
  • step (e) fractionating the sample for which inhibitory or activating activity was determined in step (d) and repeating steps (a) to (d) until the inhibitor or activator contained in the sample is present in purified form.
  • the CaMAPs of the method according to the invention are selected from the group consisting of the human CaMAPs such as FKBP36, FKBP37.7, FKBP44, FKBP51, FKBP52 and Cyp40, and enzymes which are found in the "Swissprof database, e.g.
  • the calmodulin or calmodulin fragment / derivative of the process according to the invention which is accessible to the person skilled in the art in the “Swissprof database in accordance with the designation listed below”, is selected from. the.
  • CALM_ACHKL P15094
  • CALMJ3LAEM Q9HFY6
  • CALM_CANAL P23286
  • CALM_C ⁇ PAN P93087)
  • CALM_CHLRE P04352
  • CALM_DICDI P02599
  • CALM_DROME P07M933
  • CALM_DROME P07M9251
  • CALMJHELAN P93171
  • CALM_HORVU P13565)
  • CALMJHUMAN P02593
  • CALM_KLULA O60041
  • CALM_LYCES P27161)
  • CALM_LY00M03MM04M0MM04M04M04M04M03M04M03M04M02M04M05 P48976
  • CALM_MEDSA CALM_MEDSA
  • the suitable reaction solution of the process according to the invention contains divalent ions, selected from the group consisting of Zn 2+ , Cu 2+ , Co 2+ , Ni 2+ , Mn 2 "1" , Ca 2+ and / or Mg 2+ .
  • the suitable reaction solution contains the divalent ions according to the invention in a concentration of 0.1 to 20 mM.
  • a concentration of the divalent ions in a concentration of 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6 or 6.5 mM is particularly preferred.
  • the divalent ions can be present individually or in any combination in the reaction solution.
  • the addition of further ions such as Na + , K + , Li + in a concentration of 0.5 to 100 mM of the reaction solution is optional.
  • the suitable reaction solution of the process according to the invention has a pH between pH 5 and pH 10.
  • a pH of 6, 6.25, 6.5, 6.75, 7, 7.25, 7.5, 7.75, 8 or 8.25 is particularly preferred.
  • the invention additionally relates to a method for Identification and / or production of an effector of a CaMAP consisting of the steps (a) mixing suitable amounts of a constitutively active CaMAP in a suitable reaction solution with and without the effector; (b) adding an appropriate amount of a suitable CaMAP substrate; (c) measuring CaMAP activity; and (d) demonstrating that the effector (i) is an inhibitor if the CaMAP activity in the reaction solution with the effector is less than in the reaction solution without the effector; or (ii) is an activator if the CaMAP activity is greater in the reaction solution with the effector than in the reaction solution without the effector.
  • the term “constitutively active” includes, for example by using one or more of the methods listed above, changing a CaMAP so that it achieves the enzymatic activity of a CaMAP without the presence of calmodulin. According to the invention, these methods can increase the activity of a CaMAP under optimal conditions by at least 1.5 times, particularly preferably at least 2 times according to the invention. Strategies for obtaining a constitutively active enzyme are known to the person skilled in the art and have been described several times, for example in Journal of Biological Chemistry 272 (6) : 3223-3230, 1997; Journal of Neurobiology. 52 (l): 24-42, 2002 and FEBS Letters. 503 (2-3): 185-188, 2001.
  • the use of a constitutively activated CaMAP is special for the method according to the invention Furthermore, as a preferred embodiment, the invention relates to a method in which the sequence of steps (a) and (b) is interchanged.
  • the method according to the invention further enables the detection of the effector by spectroscopic or radioactive methods.
  • Spectroscopic methods in the sense of the invention are familiar to the person skilled in the art and include, inter alia, CD spectroscopy, fluorescence spectroscopy, absorption spectroscopy.
  • mass-spectrometric methods such as MS-MALDI, ligand binding methods such as Biacore or structural methods such as NMR Techniques are used.
  • Radioactive methods for detecting the effector are familiar to the person skilled in the art and are listed in Examples 6, 7 and 10.
  • the method according to the invention is preferably a high-throughput method.
  • n is an integer from 1 to 20;
  • R 12 independently represents a hydrogen atom, an alkyl radical or an aryl radical,
  • R 1 is selected from an oxygen atom, a sulfur atom or the groups NR 2 , NOR 2 and N-NR 2 R 3 , where a) R 2 and R 3 independently of one another are a hydrogen atom, aryl or alkyl, which may be replaced by O, S , NH, NR 5 , aryl, heteroaryl, cycloallcyl, heterocycloalkyl may be interrupted or optionally substituted by R 6 , or b) R 2 and R 3 together are C 1 -C 6 -alkylene, which may be substituted by O, S, NH , NR 5 , aryl, heteroaryl, cycloallcyl, or heterocycloalkyl may be interrupted or may optionally be substituted by R 6 , where R 5 represents an alkyl radical or an aryl radical, R 6 represents a hydrogen atom, alkyl, aryl, OR 5 , C (O ) OR 5 , CN, F or Cl, where R 5 is as
  • R 9 represents an aryl radical which can optionally be interrupted by O, S, NH or NR 5 or can optionally be substituted by R 6 as defined above,
  • R 10 is a radical -NHR 2 , -NR 2 R 3 , -C (O) OR 2 , -C (S) OR 2 , -C (O) NR 2 R 3 , -CN, -NR : 2 C (O ) NR 2 R 3 ,
  • R 11 represents an amino acid residue or oligopeptide residue
  • R, 14 is an alkyl group or aryl group.
  • Alternative compounds according to the invention of general formula 1 differ from the above compounds in that they form a hydrogen atom in position R 1 and an ether between the adjacent carbon atom to R 15 in the following manner (formula 2), where R 15 is selected from alkyhest , Aryl radical or hydrogen atom:
  • Preferred embodiments of the inventive compound of the aforementioned Formula (1) are compounds for which:
  • Preferred compounds according to the present invention are the following compounds 1 to 39 according to formula 1:
  • alkyl denotes a straight-chain or branched alkyl radical, in particular C 1 -C 8 -alkyl or by alkyl, aryl, heteroaryl, halogen, particularly preferably F, CN, NO 2 , S, O, C (O) substituted alkyl.
  • cycloalkyl means in particular C 4 -C 7 -cycloalkyl or bi- and tricyclic systems which are alkyl, aryl, heteroaryl, halogen, in particular F, CN, NO 2 , S, O , C (O) may be substituted.
  • Aryl means in particular phenyl or by alkyl, aryl, heteroaryl, halogen, in particular F, CN, N0 2 , C (O) substituted aryl and heteroaryl in particular six-membered aromatics which contain nitrogen or five-membered aromatics which contain nitrogen, oxygen or Release sulfur.
  • Oligopeptide residues mean residues from 2-5 condensed amino acids.
  • Halogen means F, Cl, Br and or I.
  • the compounds according to the invention are prepared, for example, by a) cycloheximide and suitable derivatives in a suitable solvent, such as, for example, anhydrous dimethylformamide, at room temperature with haloalkyl compounds and a suitable base, such as K 2 CO 3, to give the corresponding N -Alkyl- or N, O-bisalkyl compounds are implemented.
  • a suitable solvent such as, for example, anhydrous dimethylformamide
  • cycloheximide and suitable derivatives in a suitable solvent such as, for example, anhydrous dimethylformamide
  • a suitable solvent such as, for example, anhydrous dimethylformamide
  • carrier materials customary resins for solid phase reactions
  • a suitable base such as K 2 CO 3
  • crown ethers such as, for example, 18-crown-6-ether
  • cycloheximide derivatives in a suitable solvent such as a mixture of Pvri ⁇ _in / H 2 O (2: 1), are reacted at room temperature with hydroxylamine hydrochlorides to give the corresponding oximes.
  • a suitable solvent such as anhydrous methanol
  • hydrazines at room temperature to give the corresponding hydrazones.
  • cycloheximide derivatives in a suitable solvent, such as anhydrous methanol are reacted with primary amines at room temperature to give the corresponding azomethines.
  • cycloheximide derivatives are reacted in a suitable solvent, such as methylene chloride, at room temperature with isocyanates and a suitable catalyst, such as HO, to give the corresponding urethanes.
  • the invention relates to a method which comprises the aforementioned steps (a) to (e) and additionally the step:
  • the effector identified and / or produced according to the invention is optionally formulated in combination with a “pharmacologically acceptable carrier” and / or solvent.
  • pharmacologically acceptable carriers include buffered saline solutions, water, emulsions such as eg oil / water emulsions, various types of detergents, sterile solutions, etc.
  • the present invention also includes the use of the invention identified and / or manufactured effector for the manufacture of a medicinal agent for the treatment of tumor diseases.
  • Tumor diseases which are treated with the medicament according to the invention include breast carcinomas, ovarian carcinomas, bronchial carcinomas, colon carcinomas, melanomas, bladder carcinomas, gastric carcinomas, head and neck tumors, brain tumors, cervical tumors, prostate carcinomas, kidney cancer, malignant cancer, scrotum carcinomas, scrotum carcinomas, lumbar cancer, scrotum carcinomas Lymphomas, Hodgki ⁇ lymphomas and thyroid lymphomas.
  • Medicaments within the meaning of the invention can be prepared using known conventional; Methods are formulated. These drugs can be administered to an individual in an appropriate dose. Administration can be oral or parenteral, for example. intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, locally, intranasally, intrabronchially or intradermally, or via a catheter at one location in an artery.
  • Administration can be oral or parenteral, for example. intravenously, intraperitoneally, subcutaneously, intramuscularly, locally, intranasally, intrabronchially or intradermally, or via a catheter at one location in an artery.
  • the treating doctor determines the type of dosage according to the clinical factors. It is then known to the person skilled in the art that the type of dosage depends on various factors, such as, for example, the body size or weight, the body surface, the age, gender or general health of the patient, but also on the agent to be administered specifically , the duration and nature of.
  • a typical dose can be, for example, in the range eixiem intermediate 0.01 and '10000 ug lie, wherein, doses below or above this exemplary type region, especially considering the factual factors mentioned above, are conceivable, generally the dose should be in a range between 10 ng and 10 mg units per day or per application interval with regular administration of the pharmaceutical formulation according to the invention. If the composition should be administered intravenously the dose is in a range between 1 ng and 0.1 mg units per kilogram of body weight per minute.
  • the composition of the invention can be administered locally or systemically. Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • non-aqueous solvents examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, uncL organic ester compounds such as ethyl oleate, which are suitable for injections.
  • Watery carriers include water, alcoholic aqueous solutions, emulsions, suspensions, saline solutions and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solutions, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, Ringer's lactate, and bound oils.
  • Intravenous carriers include, for example, liquid, nutrient and electrolyte supplements (such as those based on Ringer's dextrose).
  • the pharmaceutical composition of the invention may also include preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • preservatives and other additives such as antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • compounds such as eg uterleutane, growth factors, differentiation factors, hferferons, chemotactic proteins or an unspecific immunomodulatory agent can be included.
  • CaMAP effectors identified ie substances which are suitable for aldivating, inhibiting or stabilizing CaMAPs and whose specific effect on the CaMAP activity present in biological objects, after application, lead to a predominantly therapeutic influence on pathobiochemical processes in these biological objects suitable as therapeutic agents for such processes.
  • therapeutically usable CaMAP effectors are gene-coded, it can be advantageous to introduce the sequence information necessary for synthesis in the organism to be treated into this organism itself, using gene therapy methods known to the person skilled in the art.
  • it can also be useful to produce the active substance (CaMAP effector) useful for therapy as a substance precursor, from which the active substance (active substance) only forms at the actual site of action or on the way to the site of action.
  • the reasons for this procedure can be varied in nature.
  • the administration of the active ingredient as a substance precursor can increase the stability and thus the bioavailability of the active ingredient.
  • Certain modifications of the substance can, however, also be suitable for changing the solubility properties in the desired manner, or else make it possible to make biological barriers, which can prevent penetration of the active substance to the site of action, consistent for the modified substance or its precursor.
  • the effector identified by the method according to the invention is further modified to include a modified organ specificity, an improved activity, an increased toxicity for tumor cells (an improved therapeutic index), reduced side effects, a temporal offset onset of therapeutic effectiveness or length of therapeutic effectiveness, changed pharmacokinetic parameters (absorption, distribution, metabolism or excretion), modified physicochemical parameters (solubility, hygroscopic properties, color, taste, smell, stability, condition), improved general specificity, organ - / Tissue specificity, and / or an optimized administration form and route, which by the esterification of carboxyl groups, hydroxyl groups with carboxylic acids, hydroxyl groups, for example phosphates, pyrophosphates, sulfates, "hemisuccinates" or the formation of pharmaceutically acceptable salts, pharmaceutically acceptable complexes or the synthesis of pharmacologically active polymers or the introduction of hydrophilic groups, the introduction or exchange of substituents
  • the invention includes the use of the present invention identified and / or prepared for effector r manufacture of a medicament for preventing or Vermmderuhg transplant rejection.
  • the use of the effector identified and / or produced according to the invention comprises the production of a medicament for influencing neurodegenerative diseases / diseases, such as, for example, Alpers, Alzheimer's, Batten's disease, Cockayne syndrome, corticobasal ganglion degeneration, Huntington's disease, idiopathic Parkinsonism, Lewy Bodie Disease, Motor Neuron Disease, Multiple Systemic Atrophy, Multiple Sclerosis, Olivopontocerebelle Atrophy, Parkinson, Postpoliomyelitic Syndrome, Prion Release, Progressive Supranuclear Paralysis, Rett Syndrome, Shy-Drager Syndrome and Tuberose Sclerosis.
  • neurodegenerative diseases / diseases such as, for example, Alpers, Alzheimer's, Batten's disease, Cockayne syndrome, corticobasal ganglion degeneration, Huntington's disease, idiopathic
  • the present invention relates to a kit comprising the CaMAP according to the invention or a CaMAP peptide fragment / derivative which calmodulin according to the invention or a calmodulin fragment / derivative one or more buffer solutions and or one or more substrates.
  • instructions for performing one or more of the methods described above contain the detailed descriptions contained in the present description of the invention, which allow the user to use the method (s) according to the invention.
  • the instructions can contain information from the state of the art which makes it easier for the user to carry out certain techniques.
  • FIG. 1 Fig.la shows the isomer-specific pNitroanilide release at 390 ⁇ m in the presence (a) and absence (b) of 2 ⁇ M calmodulin and without FKBP38 (c).
  • the reaction curves b and c are almost identical and correspond to the uncatalyzed spontaneous cis / trans isomerization.
  • Fig. Lb 94- / shows the dependence of the CaMAP activity on the Ca calmodulin concentration.
  • the experimental procedure is described in embodiment 1. At concentrations> 5 mM of calcium chloride, precipitation of the sample was observed.
  • FIG. 2 shows an overview image of the chromatographically purified GaMAP FKBP38 prepared according to Example 10, obtained by means of SDS-PAGE and phosphoimager.
  • FIG. 3 shows the structural change (CD spectra) according to exemplary embodiment 11, which was verified by CD spectroscopy.
  • the solid line in FIG. 3a corresponds to the total spectral change of solution A (5 mM CaCl 2 , 10 ⁇ M FKBP38 in CD buffer) and B (20 ⁇ M calmodulin (bovine brain, Sigma) in CD buffer) in the different halves of the chamber.
  • a solution of 10 mM HEPES buffer and 5 mM calcium chloride at a pH of 7.5 was used as the CD buffer.
  • the dotted line in Fig. 3a shows a typical spectrum which occurs after mixing both solutions.
  • the following exemplary embodiment shows the typical dose-dependent activation of the PPIase activity of a CaMAP by calmodulin.
  • the human CaMAP FKBP38 (synonyms: FKBP8_humän; Swiss-Prot-Nr.:Q14318) was produced according to molecular biological methods, as described in exemplary embodiment 9, and in aliquotes of 100 * ⁇ l at a concentration of 0.83 mg / ml protein at -80 ° C stored. Immediately ⁇ before the activity measurement, such an aliquot was thawed and then stored at 4 ° C.
  • Solution A 55 mM HEPES buffer, pH 7.8; lmM DTT, 0.5% glycerol
  • Solution B 20 mg of the peptide substrate dissolved in 1 ml DMSO solution
  • C 20 mg chymotrypsin dissolved in 200 ⁇ l solution
  • Solution D FKBP38 (100 ⁇ M, diluted in solution A)
  • Solution E Calmodulin (300 ⁇ M, diluted in solution A)
  • solution F Calcium chloride (1 M in solution A)
  • a computer-assisted diode array spectrometer (Hewlett Packard) with a cuvette temperature control at 4 ° C. is used for the kinetic determination of the CaMAP activity.
  • a typical measurement approach contained 1 ⁇ l solution B; 1 ⁇ M FKBP38, 2 ⁇ M calmodulin and 0 to 10 mM calcium chloride. The total volume was adjusted to 1200 ⁇ l with solution A. After preincubation for 5 minutes to form the activated CaMAP, the activity measurement was started by adding 3 ⁇ l of solution C. Fig.
  • La shows the isomer-specific pNitroanilide release at 390 nm in the presence (a) and absence (b) of 2 ⁇ M calmodulin, as well as without FKBP38 (c).
  • the reaction curves b and c are almost identical and correspond to the uncatalyzed spontaneous cis / trans isomerization.
  • Fig. Lb shows the dependence of the CaMAP activity on the Ca 2+ / calmodulin concentration. At concentrations> 5 mM of calcium chloride, precipitation of the sample was observed.
  • Embodiment 2 Screening using a fluorescence assay
  • excitation of the fluorescence with a UV lamp with an excitation spectral range between 250 and 330 nm in each single reaction chamber register the increase in visible light at 420 nm.
  • the visual comparison of the registration curves obtained can be used to find an effector.
  • Exemplary embodiment 3 Screening by means of isomer-specific hydrolysis
  • 20 ⁇ l substrate solution, 1 ⁇ l effector solution and 20 ⁇ l enzyme solution are pipetted into a commercially available titer plate with 96 reaction chambers.
  • a commercially available titer plate with 96 reaction chambers To reduce pipetting errors, it is advantageous to produce such a mixture from the appropriate amounts of enzyme and substrate solution that the same concentrations are achieved in pipetting 40 ⁇ l of this mixture per chamber as in pipetting the individual volumes.
  • the plate is then stored at 4 ° C for 20 minutes so that each of the reaction chambers has a temperature of 4 ° C after 20 minutes.
  • the actual reaction is started by adding 80 ⁇ l of starting solution.
  • Embodiment 4 Search for CaMAPs in databases
  • sw CYP4_BOVIN
  • sw FKB4JHUMAN
  • sw FKB5_ OUSE
  • sw FKB4_MOUSE
  • sw FKB4_RABIT
  • sw CYP4__HUMAN
  • sw FKB7_WHEAT
  • r Q9XT11
  • r Q9C65 .
  • Solution H DMSO
  • Solution 1 15 mM solution on FK506 (Fujisawa GmbH) in DMSO.
  • two cuvettes with 1 ⁇ l of solution B (substrate); 0.5 ⁇ M FKBP38, 0.5 ⁇ M calmodulin and 5 mM calcium chloride.
  • 1 ⁇ l of solution H are then added to cuvette 5a and 1 ⁇ l of solution l for comparison to cuvette 5b. After mixing the solutions, the cuvettes are kept at 6 ° C for 20 minutes.
  • the PPIase activity determination is then started as indicated in Example 1 by pipetting in solution C (chymotrypsin).
  • solution C chymotrypsin
  • the computational evaluation of the isomerization rate of the batch in cuvette 5a gives a value of 0.0071 s "1 and the batch in cuvette 5b a value of 0.0105 s " 1 .
  • the value of 0.0071 corresponds to the uncatalyzed reaction in Fig. Ib.
  • the value of 0.0105 corresponds to the catalyzed reaction in Fig. La.
  • the progression curve ld corresponds to the uncatalyzed reaction. It follows that the PPIase activity of the CaMAP FKBP38 can be inhibited by the FKBP integrator FK506. Plotting the inhibitor concentration against the determined enzyme activity gives an IC50 value of about 4.3 ⁇ M.
  • Embodiment 6 Search for effectors using an affinity assay
  • This screening approach enables the search for effectors which disrupt the interaction between effective calmodulin and activatable CaMAP.
  • This assay is carried out as a radioactive assay.
  • the following preparations must be made: a) Production of the radioactively labeled calmodulin: Using human SrC tyrosine kinase (Sigma: order number 5439), calmodulin (recombinant human calmodulin, produced according to embodiment 2) is specifically phosphorylated.
  • 10 ⁇ l tyrosine kinase, 50 ⁇ l calmodulin (1.2 mg / ml), 10 ⁇ l 32 P g am m a ATP (Amersham, freshly delivered) are incubated in a total volume of 80 ⁇ l for 3 hours at 30 ° C., the Gesa
  • the mixture also contains 2 mM calcium chloride, 50 mM Tris buffer, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1% glycerol and 0.01% Tween.
  • the mixture is then taken up in 500 ⁇ l of a solution of 30% ammonium sulfate and 50 mM Tris buffer pH 7.5 and onto a chromatography column (Pierce, mini columns) which is filled with 2 ml of phenylsepharose (Sigma) and equilibrated with the application buffer given. After application, the column is washed with about 50 column volumes. Thereafter, the radioactively labeled calmodulin is detached from the column by gradually adding a solution consisting of 50 mM Tris buffer / 30% glycerol at a pH of 7.5 in aliquots of 100 ⁇ l and collected separately in vessels.
  • the fractions containing calmodulin can be detected by their ⁇ -radiation by means of scintillation measurement and combined into a common fraction, usually about 500 ⁇ l.
  • a calmodulin / FKBP38 solution is produced which has a concentration of 5 ⁇ M calmodulin and 2.5 ⁇ M FKBP38.
  • Preparation of the antibody-labeled titer plates A solution of IgG-purified antibodies (obtained by immunizing rabbits against HPLC-purified FKBP38) is in 12 dilution steps (1 + 9; 1 + 99.1 + 999) in steps of 10 with 20 mM Tris -Buffer pH 7.5 diluted. 50 ⁇ l of the dilution is pipetted into the 12 columns of a 96-well titer plate, so that the first dilution is in the first column and the solution with the 12th dilution is in the 12th column. The plate is covered with foil and incubated at 4 ° C for 12 hours.
  • the unbound portion of the antibody is then removed by careful washing 5 times with washing solution (50 mM Tris buffer, pH 7.5; 0: 1% Tween) and the titer plate is finally provided with 50 ⁇ l washing solution.
  • washing solution 50 mM Tris buffer, pH 7.5; 0: 1% Tween
  • the calmodulin / FKBP38 solution obtained under a is now also diluted 8 times in 10-fold dilution steps with working buffer (10 ⁇ M calcium chloride 50 mM Tris buffer, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 1% glycerol and 0.01% Tween). Then 1 ⁇ l of these dilutions are pipetted into the titer plate in such a way that row 1 contains the 1 + 9, row two the 1 + 99 etc. dilutions.
  • the plate After incubation of the titer plate for 1 hour at 4 ° C., the plate is washed again 5 times with washing solution and then sensitive to a 32 P for 1 hour Screen (Amersham) placed and measured using phosphoimager (FUJI diagnostics) and associated software evaluated.
  • Optimal concentrations of CaMAP and antibody for carrying out the assay are to be assigned to the wells of the titer plate which have a high radioactivity. The sensitivity of the assay is greatest near the transition from high to low radioactivity.
  • Embodiment 7 onipetition assay with radiolabelled ligands
  • Radiolabeled ligands such as these are available as tritium-labeled FK506 (Transplantation. 63 (2). -293-298, 1997; Fujisawa GmbH) or tritium-labeled cyclosporin A (Amersham).
  • the streptavidin-coated microtiter plates eg: Roche Diagnostics; Cat.No: 1734776) and biotin-labeled Calmodulin (Calbiochem; Cat.No: 208697) are commercially available, as well as a commercially available microtiter plate reader (Dynatech, MR7000) with an automatic dispensing unit and washer.
  • the coated titer plates are mixed with calmodulin (0.5 ⁇ M solution, 30 ⁇ l per cavity) for 30 min at room temperature.
  • the plate After rinsing 5 times with washing solution (see exemplary embodiment 6), the plate is ready and can be stored at 4 ° C. for at least 8 hours.
  • 0.5 ⁇ M solution of FKBP38 50 mM Tris buffer, pH 7.5; 5 mM CaCl 2 ; 1 mM DTT; 0.5 mM glycerol
  • 30 ⁇ l per well are added for 30 minutes at room temperature , Then the plate is gently washed again 5 times.
  • the CaMAP used can be inhibited by cyclosporin A
  • the tritium-labeled cyclosporin A is subsequently used as the radioactive ligand
  • FK506 like FKBP38 FK506 labeled with tritium is used as the radioactive ligand.
  • a concentration of 50 ⁇ M 0.5 ⁇ l of active ingredient (mg / ml in DMSO) and 30 ⁇ l of buffer solution (50 mM Tris buffer, pH 7.5; 5 mM CaCl 2 ; 1 mM DTT; 0.5 mM glycerol), which are radioactive at a concentration of 50 ⁇ M, are used for each cavity contains labeled ligand, incubated for 60 minutes at room temperature. Subsequently, 20 ⁇ l are taken from each cavity, 1 ml of scintillation solution (Roth) is added, and a Quickzint Flow Counter is used. (Zinsser Analytic). Potential ligands are recognized by an increased radioactivity signal.
  • buffer solution 50 mM Tris buffer, pH 7.5; 5 mM CaCl 2 ; 1 mM DTT; 0.5 mM glycerol
  • Cyp40 is mole ulärbiö strig according to the Acta Crystallographica Section D- Biological Crystallography. 55 (Part 5): 1079-1082, 1999. It. is carried out analogously to embodiment 3. 1 ⁇ M Cyp4 ⁇ as well as 5 ⁇ M calmodulin and 5 mM CaC12 are used as the enzyme solution. dissolved in 50 mM HEPES buffer pH 7.5 used. As an effector solution, 1 mg cyclosporin A (Sigma C3662) is dissolved in 50% ethanol. 50% ethanol solution serves as the control solution.
  • Embodiment 9 Molecular biological production of the CaMAP FKBP38
  • IRALp962N1726Q2 RZPD-Ressourcentechnik GmbH, Berlin
  • the primers were used 38BspHI5 and h383-ma carried out a PCR approach at an annealing temperature of 50 ° C. with 1.5 mM MgCl and 1 ⁇ l enhancer with Pfx polymerase, the glycine in position 2 being exchanged for an arginine.
  • the PCR product was purified and cloned into the pSTBlue-1 vector using blunt end ligation.
  • the product of the ligation was transformed into E. Coli DH5 cells.
  • Positively selected transformants were transferred to an agar plate with kanamycin and their cell material was used as a template for a colony PCR.
  • the PCR products of the positively selected clones were isolated and digested analytically with the restriction endonucleases Ncol and Sacl.
  • the hFKBP381-336 sequence was then cloned into pET28a.
  • the resulting construct was transformed into Rosetta cells.
  • Embodiment 10 Radioactive notification of the CaMAP FKBP38
  • Embodiment 11 Spectroscopically detectable structural change
  • CD buffer stands for a solution of 10 mM HEPES buffer and 5 mM calcium chloride at a pH of 7.5.
  • the solid line corresponds to the total spectral change of solutions A and B in different chamber halves.
  • the dotted line shows a typical spectrum that occurs after mixing both solutions. After adding 1 M EGTA to the mixture, the spectrum is obtained, which is typical for the non-interacting proteins calmodulin and FKBP38 (solid line).
  • FIG. 3b The conditions leading to FIG. 3b correspond to those of FIG. 3a: the dotted line shows the typical spectrum after mixing both solutions.
  • the solid line spectrum was obtained after increasing the calcium chloride concentration to 10 mM. This spectrum is typical for the precipitation of proteins.

Landscapes

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Herstellung von Effektoren der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen die durch Calmodulin aktivierbar sind. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Effektoren zur Herstellung von Arzneimitteln, sowie Screening-Verfahren und Kits.

Description

Verfahren zur Identifizierung und Herstellung von Effektoren Calmodulin-abhängiger Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Herstellung von Effektoren der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen die durch Calmodulin aktivierbar sind. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der identifizierten Effektoren zur Herstellung von Arzneimitteln, sowie Screening- Verfahren und Kits.
Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen, im weiteren als PPIasen bezeichnet, werden entsprechend den Empfehlungen des „Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" („Enzyme Nomenclature", Academic Press, 1992) unter der EC Nummer 5.2.1.8 zusammengefaßt. Die Hauptvertreter dieser Enzymklasse wurden mittels ihrer enzymatischen Aktivität gegenüber geeigneten Substraten entdeckt und definiert, wie z.B. Cyclophilin (Fischer et al, Nature. 337(1989):476-8); FKBP12 (Harding et al. Nature. 341 (1989): 758-60) oder Parvulin (Rahfeld et al. FEBS Letters. 352(1994):180- 4)., PPIasen können die cis/trans Isomerisierung von Prolylpeptidbindungen in Oligopeptideii und Proteinen katalysieren. International erfolgt die Zuordnung bisher nicht klassifizierter Proteine zu dieser Enzymklasse oft durch Primärsequenzvergleich mittels ständig aktualisierter Datenbanken wie z.B. SwissProt, TrEMBL (z.B.: Nucleic Acids Res. 31:365- 370(2003) oder CELERA (cds@celera.com) und der Nutzung geeigneter Vergleichsalgorithmen (wie z.B. Bioinformatics 15:219-227(1999) oder US6023659). Die Güte dieser Zuordnung wird mit Hilfe geeigneter Verrechnungswerte (Scores) beurteilt.
Eine weitere Möglichkeit der Zuordnung unbekannter Proteine zur Klasse der PPIasen besteht in der Bestimmung der PPIase Aktivität mittels geeigneter PPIase Alctivitätstests wie z.B. mittels isomerspezifischer Proteolyse (Fischer et al. Biochim. Biophys Aacta 43 (1984), 1101; Fischer et al. Nature. 337 (1989) :476-8), magnetischer Kernresonanzspektroskopie (Kern et al. Biochemistiγ 34(12995)13598, Reimer et al. Biochemical J. 326(1997)181), oder anderer dem Fachmami bekannter spektroskopischer Bestimmungsmethoden (wie z.B.: Janowski et al. Analytical Biochemistry 252(1997), 299; Garcia-Echeverria et al. Biochem. Biophys Res. Commun. 191(1992),2758). Trotz Anwendung der oben aufgeführten unterschiedlichsten PPIase- Aktivitätsnachweise zeigt sich, daß einige den PPIasen zugeordnete Enzyme, wie z.B. FKBP38 (Shirane Nature Cell Biology 5(2003)1) eine im Vergleich zu bekannten PPIase- Vertretern wie Cyclophilin, FKBP12 oder Parvulin nur geringe oder kaum nachweisbare PPIase- Aktivität gegenüber typischen PPIase Substraten aufweisen. Typische PPIase Substrate weisen eine Peptidyl- Prolyl Peptidbindurig auf, sind dem Fachmann bekannt und sind in zahlreichen dem Fachmann zugänglichen Literaturstellen beschrieben, so z.B.: Clinical Chemistry. 44(3): 502- 8, 1998; Analytical Biochemistry. 252(2) :299-307, 1997; Biochemistry. 34(41): 13594-602, 1995; Biochemistry. 30(25):6127-34, 1991; Biochemistry. 30(25):6127-34, 1991; Journal of Molecular Biology. 271(5):827-37, 1997, oder in Patentschriften aufgeführt, wie z.B. in CA2334812; EP0647713; WO0142245; EP0360029.
Seit 1986 wurden feiner Proteinkomplexe beschrieben die sich aus jeweils einem Molekül einer PPIase, einem, niedermolekularen Wirkstoff wie Cyclosporin A oder FK506, der Proteinphosphatase Calcineurin, dem ' Calmodulin und bis zu 4 Kalziumionen zusammensetzen: so z.B: Cell Biochemistry & Biophysics. 30(1):115-51, 1999; Bioorganic & Medicinal Chemistry. 5(2):217-32, 1997; Current Opinion in Structural Biology. 6(6):770-5, 1996; KASEB Journal. 9(1): 63-72, 1995. Transplantation Proceedings. 18(6 Suppl 5):219-37, 1986; Science. 233(4767):987 -9, 1986. In keinem Fall konnte jedoch für diese Komplexe der Nachweis einer Aktivierung der PPIase Aktivität erbracht werden. Einige Untersuchungen weisen sogar- auf eine liihibierung der PPIase-Aktivität in diesem Komplex hin.
Calmodulin kommt Ln tierischen und pflanzlichen Zellen als weitverbreiteter intrazellulärer Ca2+-Rezeptor vor, der eine Vielzahl Ca2+-regulierter Prozesse vermittelt. Bei Anstieg des cytoplasmatischen Kalziumspiegels, verursacht durch Öffnung von Kalziumkanälen in der Plasmamembran oder einer Membran von intrazellulären Speichervesikeln, wird Calmodulin aktiviert. Viele Enzyme, Pumpen, Membrantransportproteine und andere Zielproteine werden durch Ca2+/Calmodulin reguliert, wobei die meisten. Wirkungen nicht direkt durch Calmodulin, sondern über Ca2+/Calmodulin abhängige Protein-Kinasen ausgelöst werden. In einigen Fällen ist Calmodulin auch eine selbständige regulatorische Untereinheit eines allosterischen Enzyms (z.B. Phosphorylase-Kinase). Calmodulin erkennt die verschiedenen Zielproteine offenbar an positiv geladenen, amphipathischen alpha-Helices, da beide Lappen des Ca2+-Calmodulin hydrophobe Sequenzbereiche aufweisen, die von negativ geladenen Regionen umgeben sind, und damit Komplementarität zu positiv geladenen amphiphilen alpha-Helices aufweisen (P. Cohen u. C.B. Klee (Hrsg.) Calmodulin. Elsevier, Amsterdam, 1988). Obwohl Teilbereiche der Primärsequenz konserviert erscheinen, gibt es doch beträchtliche Unterschiede zwischen einzelnen Spezies, so. z.B. zwischen dem humanen Protein und dem aus Hefe:
Die Interaktion von Calmodulin mit Enzymen führt bekanntermaßen nicht zwangsläufig zu deren Aktivitätssteigerung. So sind Beispiele beschrieben in denen entweder keine Beeinflussung der Enzymaktivität, so z.B: Biochemical Journal. 368(Part 1): 145-157, 2002; Biochemical Journal. 365(Part 3):659-667, 2002 oder sogar eine inhibitorische Wirkung (z.B.: Biochemistry. 42(9). -2740-2747, 2003; National Academy of Sciences of the United States of America. 99(12):8424-8429, 2002; Biochemistry.. 40(41):12430-12435, 2001; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98(6):3168-3173, 2001) beobachtet wurde.
Des weiteren gelang es unterschiedlichsten Gruppen ab 1992, unabhängig von oben beschriebenen „ ultimeren Komplexen", eine direkte Interaktion von PPIasen mit Calmodulin entweder vorherzusagen oder direkt nachzuweisen, ohne jedoch eine Aktivierung der PPIase-Aktivität durch Calmodulin nachzuweisen. So z.B.: Plant Molecular Biology: 48(4) :369-381, 2002; Mini-Reviews in Medicinal Chemistiy. l(4):377-97, 2001; Planta. 215(1): 119.-26, 2ϋ02; Plant Molecular Biology. 48(4): 369-81, 2002; Journal of Cellular . Biochemistry. 84(3):460-71, . 2002; Journal of 'Biological Chemistiy. 276(42) :38762-73, 2001; Trends in Plant Science. 6(9):426-31, 2001; Structure. 9(5):431-8, 2001; Developmental Biology. 225(1): 101-11, 2000; Plant Physiology.. 119 (2): 693-7 4 s 1999; Planta. 205(1): 121-31, 1998; Journal of Biological Chemistry. 272(51):32463-71, 1997; Plant Molecular Biology. 32(3):493-504, 1996; Molecular & General Genetics. 252(5):510-7, 1996; Biochemical & Biophysical Research Communications. 209(1): 117-25, 1995; Journal of Biological Chemistry. 268(18): 13187-92, 1993; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89(22): 10974-8, 1992; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (14) :627 -4, 1992. In keinem Fall konnte jedoch in einer dieser Arbeiten die Aktivierung einer der untersuchten PPIase-Aktivitäten durch den Zusatz von Calmodulin beschrieben werden. Bisher bekannte Effektoren von PPIasen wie Cyclosporin A (z.B. US4722999), FK506 (z.B.: US5457182) oder Rapa ycin (z.B.: US4885171) gelten als hochwirksame Medikamente der Humanmedizin.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Problem war die Bereitstellung von Mitteln für ein Verfahren zur Identifizierung und /oder Herstellung eines Effektors einer Calmodulin-abhängigen Peptidyl-Prolyl cis/trans. Isomerase. Durch Lösung dieses technischen Problems sollen spezifisch wirkende Medikamente bereitgestellt werden.
Das technische Problem wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst und basiert unter anderem auf der unerwarteten und der Offenbarung im Stand der Technik entgegenstehenden Lehre, daß die PPIase-Aktivität von Calmodulin bindenden PPIasen unter bestimmten Bedingungen durch Calmodulin aktiviert werden kann.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Effektors einer Calmodulin-abhängigen Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase (CaMAP) bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer CaMAP oder eines CaMAP- Peptidfragments/derivats mit einer geeigneten Menge Calmodulin oder eines Calmodulinfragments/derivats in einer geeigneteil Reaktionslösung mit und ohne den Effektor; ■ . . .. . (b) , Zugabe einer .geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; . (c) Messen der CaMAP -Aktivität; und (d) Nachweis, daß der Effektor . (i) ein Inhibitor ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor; oder (ii) ein Aktivator ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor größer ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor.
Der Begriff "Effektor" definiert in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung Moleküle, welche die enzymatische Aktivität der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen modulieren (Modulatoren). Erfindungsgemäß umfasst diese Definition Inhibitoren und Aktivatoren. "Inhibitoren" sind hierbei definiert als Moleküle, die eine bestüxtmte enzymatische Aktivität hemmen. Der Begriff "Aktivatoren" definiert Moleküle, die eine bestimmte enzymatische Aktivität verstärken. Die nach dem vorliegenden Verfahren analysierbaren Effektoren gehören zu allen bekannten Stoffklassen, die sich aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften für das Verfahren eignen. Zu den analysierbaren Effektoren gehören sowohl anorganische als auch organische Moleküle. Die Effektoren können chemisch, synthetisiert oder durch Isolierung aus natürlichen Quellen, wie beispielsweise Lebewesen bereitgestellt werden. Bevorzugt handelt es sich bei den Effektoren um Peptide oder Polypeptide, Zuckermoleküle, Lipide oder Kombinationen aus diesen Molekülgruppen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den analysierbaren Effektoren um Peptide oder Polypeptide oder Derivate davon. Insbesondere bevorzugt umfassen die Effektoren Moleküle, die bekanntermaßen mit Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen interagieren, wie beispielsweise Peptidinhibitoren, Antikörper, Lektine oder Fragmente oder Derivate davon, deren inhibierende oder aktivierende Aktivität in dem vorliegenden erfiαdungsgemäßen Verfahren getestet werden kann.
„Calmodulin-abhängige Peptidyl-Prolyl cis/trans . Isomerasen (CaMAPs)" im Sinne der Erfindung lassen sich mittels unterschiedlicher Methoden für den Fachmann erhalten, wie z.B.. die nachfolgend beschriebenen. Dabei umfasst der Begriff CaMAP erfindungsgemäß gleichfalls „Cal AP-Peptidfragmente/derivate", worunter verkürzte oder durch unterschiedliche dem Fachmann bekannte Verfahren, modifizierte CaMAPs zu verstehen sind, die eine Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität aufweisen.
Motivsuche: So kann beispielsweise in dem Fachmann zugänglichen Datenbanken wie z.B. SwissProt; Trembl; Trenew; Trest; Trgen; Trome usw. nach PPIasen mit Motiven gesucht werden, die typisch für eine Bindung von Calmodulin sind. Typische Motive sind dem Fachmann bekannt und wurden melirfach beschrieben, so z.B. in Journal of Biological Chemistiy 277(2002)14681; Journal of Biological Chemistiy. 276(10) :7129-35, 2001; Journal of Biological Chemistry. 273(18):10819-22, 1998; Journal of Biological Chemistiy. 269 (42). -26431-7, 1994.; Journal of Biological Chemistry. 276(10):7129-35, 2001; Plant Physiology. 123(4): 1495-506, 2000; Journal of Biological Chemistry. 275(28):21121-9, 2000 ; FEBS Letters. 455(3): 367-71, 1999; Chinese Journal of Biotechnology. 14(3): 165-71, 1998), FASEB J 1997 Apr;l l(5):331-40; Nature 410(2001)1120-1124. Das nachstehende Beispiel 4 zeigt exemplarisch eine solche erfindungsgemäße Suchstrategie mit dem helicalen Calmodulin-Motiv KHAAQRSTETALYRKM, um potentielle CaMAPs in dem Fachmann bekannten Datenbanken aufzufinden. Eine eindeutige Zuordnung zu CaMAPs erfolgt dann mittels eines oder mehrerer dem Fachmann bekannten Aktivitätstests. Einige geeignete Aktivitätsnachweisverfahren im Sinne der Erfindung sind die bereits oben beschriebene isomerspezifische Proteolyse, magnetische Kernresonanzspektroskopie, oder andere dem Fachmann bekannte spektroskopische Bestimmungsmethoden. Ferner wird in diesem Zusammenhang auf die Anwendungsbeispiele 1-3 verwiesen, die typische PPIase- AMvitätsbestirnmungen zeigen.
Interaktion mit Calmodulin: Andere Strategien im Sinne der Erfindung zur Ermittlung erfindungsgemäßer CaMAPs nutzen die B dungsaffinitäten zwischen Calmodulin und Bindeprotein. Wie bereits ausgeführt, gelang es in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren überraschenderweise durch Zusatz geeigneter Mengen von Calmodulin die PPIase-Aktivität verschiedener PPIasen gegenüber geeigneten Substraten und unter geeigneten Bedingungen um mindestens eine Größenordnung zu steigern, wobei diese Steigerung bei optimalen Bedingungen mehrere Größenordnungen betragen kann, z.B. wie in den Beispielen 1-3 beschrieben das zehntausendfache. Wie in Beispiel 1 gezeigt ist, kann die CaMAP Aktivität durch Calmodulin dosisabhängig aktiviert werden. Für die Aktivierung der CaMAP. kann Cahnoduliii unterschiedlichster Tief spezies genutzt werden. Wie im Beispiel 1 aufgeführt, z.B. aus Rinder-Hirn gewonnenes Calmodulin, oder molekularbiologisch hergestelltes humanes Calmodulin (Beispiel 2).
Zum Interaktionsnachweis gibt es derzeit unzählige Methoden und Verfahren, die auch automatisierte Suchstrategien mittels für Screening entwickelten Geräten (z.B. Biosensor [Vaccine. 18(3-4): 362-70, 1999; Journal of Biological Chemistiy. 273(31):1969 8, 1998], Kalorimetrie [Biochimica et Biophysica Acta. 386(1): 155-67, 1975; Yao Hsueh Hsueh Pao - Acta Pharmaceutica Sinica. 35(10):774-7, 2000]; Korrelationsspektroskopie [Current Opinion in Chemical Biology. 2(3):397-403, 1998; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95(4):1421-6, 1998]) einschließen. So kann bevorzugt im Sinne der Erfindung das potentielle Bindeprotein oder das wirksame Calmodulin an eine makroskopische Matrize, z.B. Agarose (Calmodulin- Agarose für Affintiätsstudien ist z.B. kommerziell erhältlich; z.B.: Sigma Bestellnr.: P4385), gebunden und anschließend von nicht gebundenen Stoffen durch Waschen befreit werden, um danach die Interaktionspartner mittels geeigneter Strategien, wie z.B. SDS-PAGE und Massenspektrometrie, zu identifizieren. Die so durchgeführte Identifikation von Calmodulin- Interaktionspartnern war mehrfach erfolgreich, wie z.B. in folgenden Arbeiten beschrieben: Plant Physiology. 116(2). -845-851, 1998; Plant Journal. 24(3): 317-326, 2000; Molecular & Cellular Biochemistry. 183(1-2):183-191, 1998; Planta. 205(1):121-131, 1998; Journal of Biological Chemistiy. 273 (2). -677-680, 1998. Eine andere Möglichkeiten des Interaktionsnachweises ist die Stabilisierung der Interaktion durch chemische Modifikation, dem Fachmann unter dem Begriff „Crosslinken" bekannt, wie z.B. in folgenden Arbeiten beschrieben: Biochemistry. 40(26):7903-7913, 2001; Biochemistry. 37 (23). -8378-8384, 1998; Biochemistry. 35 ' (14): 43 r 5-4386, 1996; Journal of Biological Chemistry. 271(5):2651-2657, 1996. Mit dieser Technik wurde z.B. auch das in Arabidopsis für einen Phänotyp erantwortliche AtFKBP42 (Plant Journal. 32(3). -263-276, 2002), in Anwendungsbeispiel 4 in der Datenbank als tr:Q9LDC0 bezeichnet, gefunden. Strukturänderung: Eine "weitere Strategie im Sinne der Erfindung zur Ermittlung erfindungsgemäßer CaMAPs basiert auf der Tatsache, dass durch Bindung von Calmodulin an CaMAP die Molekülgeometrie der CaMAP oft so verändert wird, daß dies mittels spektroskopischer Methoden erfaßbar ist. Spektroskopische Verfahren zum Nachweis dieser Strukturänderung sind dem Fachmann vertraut. Eine solche typische Veränderung ist in Anwendungsbeispiel 11 aufgeführt.
* Aktivitätsänderung: Vorzugsweise kann die Interaktion von Calmodulin mit CaMAP anhand der durch diese h teraktioi hervorgerufenen PPIase- Aktivitätssteigerung erkannt werden. Typische Anwendungen sind in den nachfolgenden Beispielen 1, 2, 3, 5 und 8 zusammengefaßt. Mit dieser Technik konnten in der vorliegenden Erfindung z.B. MzFKBP- 66 und _4tFKBP42 als CaMLAPs identifiziert werden. Erfindungsgemäß können durch Cahnodulin aktivierbare PPIasen von den in Datenbanken vorhandenen Nukleotidsequenzen abweichen. So kann durch gezielte Veränderung mittels gentechnischer oder chemischer Mittel bzw. durch direkte chemische Synthese ein Protein mit neuen Eigenschaften erhalten werden. Ziel solcher Veränderungen kann es sein, CaMAPs für spezifische R-θllen in Technik und Medizin zuzuschneiden. Hierzu gehört die Herstellung von CaMAPs mit: 1) erhöhter Stabilität gegenüber Hitze, extremen pH-Werten, oxidierenden Atmosphären und organischen Lösungsmitteln; 2) verbesserter oder neuer Substratspezifität; 3) veränderten Eigenschaften, welche die Rückgewinnung bei Folgeverfahren erleichtert. 4) veränderten Eigenschaften, welche eine konstitutive Aktivität der CaMAP bewirkt. Da Konformation und Eigenschaften von Proteinen durch ihre Primärsequenz bestimmt werden, ist das Ziel im wesentlichen die geplante Veränderung von Aminosäuresequenzen existierender Proteine. Alternativ können kleine Proteine chemisch synthetisiert werden (Peptidsynthese). Die chemische Synthese ermöglicht eine weitere Regulierung der Sekundärstruktur des Proteins, da unnatürliche Aminosäuren emgeführt werden können, wie z.B. 2,2-Dimethylglycin, dessen Konformation eingeschränkt ist und deshalb eine stabile Selo därstruktur ermöglicht. Es kann auch eine chemische Modifizierung nativer Enzyme durchgeführt werden, mit dem Ziel, die normalen Eigenschaften zu erhalten (z.B. Enzymaktivität), während eine größere Stabilität erreicht wird. Eine allgemein angewandte Methode besteht darin, Gene zu synthetisieren, die für eine gesuchte Polypeptidseq enz codieren. Hybridgene können chemisch synthetisiert werden, indem Segmente von natürlichen Genen chemisch synthetisierten DNA-Sequenzen hinzugefügt werden. Alternativ können neue Primärsequenzen gebildet werden, indem synthetische DNA-Sequenzen dazu verwendet werden, natürliche Gene zu erweitern oder Segmente natürlicher Gene zu ersetzen. Die entstandene synthetische oder Hybrid-DNA wird dann in ein Plasmid inseriert, um das geplante Protein zu synthetisieren.
Molekularbiolosische Veränderung: So. läßt sich die Primärsequenz von einer CaMAP mittels dem Fachmann bekannter Methoden so verändern, daß einzelne oder mehrere Aminosäuren der Primärsequenz durch andere Aminosäuren ersetzt werden. So wird zur Verbesserung der Löslichkeit einer CaMAP in Ausfül rungsbeispiel 9 ein Glycin in Position 2 durch ein Arginin ersetzt. Es ist auch erfindungsgemäß umfasst, die Primärsequenz N- oder C-terminal mittels einzelner Aminosäuren, Oligopeptiden oder ganzer Proteine zu verlängern. Es ist femer erfindungsgemäß umfasst, nur (Peptid-)Teilbereiche der natürlichen oder mittels molekularbiologischer Methoden veränderten CaMAPs herzustellen. So wird in Ausführungsbeispiel 9 die Herstellung einer CaMAP mit verkürztem N-Terminus beschrieben. Eine besonders für die Suche nach Effektoren von CaMAPs geeignete gentechnisch veränderte CaMAP bzw. CaMAP-Peptidfragmente/derivate, erkennt man an der aktivierenden Wirkung von Calmodulin im Sinne der Erfindung auf die PPIase- Aktivität der CaMAP. Diese aktivierten CaMAPs bzw. Peptidfragmente/derivate sind erfindungsgemäß bevorzugt.
Nach Auffinden potentieller CalVLAP Sequenzen in Datenbanken kann das Protein mittels üblicher, dem Fachmann bekannter Verfahren aus der Nukleotidsequenz hergestellt werden. Als DNA-Quellen für die Klonierung stehen cDNA-Klondatenbanken und Genombibliotheken zur Verfügung. Zur Übertragung und zum Einbau fremder DNA- Sequenzen in eine Wirtszelle werden DNA- Vektoren benutzt, in welche die gewünschten Sequenzen eingefügt werden. Mit Hilfe von Restriktionsendonucleasen unterschiedlicher Spezifität können die DNA- Vektoren und zellulären Genome an ausgewählten Stellen gespalten werden. Wenn Vektor und Donor-DNA mit dem gleichen Enzym gespalten werden, sind die Enden komplementär und können hybridisiert und dann durch eine DNA- Ligase (Polynucleotid-Ligase) ko^valent verknüpft werden. In Abhängigkeit von Vektor- und Wirtssystem sind eine Vielzahl von Methoden entwickelt worden, die dem Fachmann zugänglich und bekannt sind um die gentechnisch hergestellte rekombinante DNA in eine Wirtszelle einzuführen, hl Anwendungsbeispiel 10 wird die molekularbiologische Herstellung einer CaMAP exemplarisch aufgeführt.
Posttranslationale Veränderungen: Neben oben aufgeführter Änderung der Primärsequenz können erfindungsgemäße CaMAPs auch • posttranslational verändert sein. So können CaMAPs z.B. . acetyliert, metliyliert, ubiquitiniliert oder phosphoryliert sein. Wobei zahlreiche in vivo ablaufende _ posttranslatipnale Veränderungen von. Proteinen vom Fachmann auch in vitro durchgeführt werden könnend So läßt sich die CaMAP zumindest in vitro mittels • unterschiedlicher Protein-Serin Threonin und Prote -Tyrosin-Kinasen phosphoryheren. Je nach Herkunftsart und Isolationsprozedur kann unterschiedlich posttranslational modifizierte CaMAP erhalten werden. Übersichten posttranslationaler Modifikationen von Proteinen sind dem . Fachmann bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben, so z.B.: Annais of the New York Academy of Sciences. 663:48-62, 1992; Advances in Protein Chemistry. 37:247-334, 1985; Science. 198(4320):890-6, 1977; Current Opinion in Rheumatology. ' 14(3): 244-9, 2002; Biomolecular Engineering. 18(5):213-20, 2001; International Journal of Biochemistry. 24(1): 19-28, 1992). Anwendungsbeispiel 10 zeigt exemplarisch die radioaktive Markierung einer CaMAP. Eine besonders für die Suche nach Effektoren von CaMAPs geeignete posttranslational veränderte CaMAP, bzw. CaMAP-Peptidfragment/derivat, erkennt man an der aktivierenden Wirkung von Calmodulin im Sinne der Erfindung auf die PPIase- Aktivität der CaMAP. Diese aktivierten CaMAPs bzw. Peptidfragmente/derivate sind erfindungsgemäß bevorzugt.
Proteinchemische Veränderung: Es kann auch erfindungsgemäß von Vorteil sein, die CaMAP chemisch zu modifizieren. Die dazu notwendigen Methoden und Verfahren sind dem Fachmann als proteinchemische Verfahren bekannt. Neben der Modifikation von Lysinen (Journal of Biological Chemistry. 273(43):28516-28523, 1998; Biochimica et Biophysica Acta. 844(2):265-9, 1985) der Oxidation oder Carbethoxylation (Pharmacology. 26(5):249-57, 1983; Biochemistry. 17(19):3924-8, 1978) sind die unterschiedlichsten chemischen Veränderungen möglich. Bekannte Techniken zur chemischen Veränderung werden z.B. in Current Opinion in Biotechnology. 10(4):324-30, 1999; Current Opinion in Chemical Biology. 5(6): 696-704, 2001; Biochemistry-Russia. 63(3):334-44, 1998; Biotechnology & Applied Biochemistry. 26 (Pt 3):143-51, 1997; Biological Research. 29(1): 127-40, 1996; Methods in Molecular Biology. 35:171-85, 1994; Methods in Molecular Biology. 32:311-20, 1994; Nature Cell Biology. 5(l):28-37, 2003) beschrieben. Anwendungsbeispiel 10 zeigt exemplarisch die radioaktive Markierung einer CaMAP. Eine besonders für die Suche nach Effektoren von CaMAPs geeignete chemisch modifizierte CaMAP, erkennt "man an der aktivierenden Wirkung von erfindungsgemäßem Calmodulin auf die PPIase- Aktivität der .CaMAP . oder des CaMAP-Peptidfragments/derivats. Diese aktivierten CaMAPs bzw. Peptidfragmente/derivate sind erfindungsgemäß bevorzugt. •
Calmodulin im Sinne der Erfindung umfasst sämtliche dem Fachmann bekannte Polypeptide dieser Molekülklasse, die zur Aktivierung der CaMAP-Aktivität geeignet sind. Gleichfalls sind erfindungsgemäß Calmodulinfragmente und/oder Calmodulinderivate eingeschlossen, die zu einer Aktivierumg der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase-Aktivität im erfmdungsgemäßen Verfahren führen. Der Nachweis der Steigerung der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase-Aktivität kann mittels dem Fachmann bekannten und oben beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Erfindungsgemäßes Calmodulin kann sehr unterschiedlich sein. So kann die gezielte Veränderung eines Proteins durch genetische oder chemische Mittel bzw. die direkte chemische Synthese eines Proteins mit neuen Eigenschaften erreicht werden. Ziel solcher Veränderungen ist es, Proteine für spezifische Rollen in Technik und Medizin zuzuschneiden. Hierzu gehört die Herstellung von Enzymen mit: 1) erhöhter Stabilität gegenüber Hitze, extremen pH-Werten, oxidierenden Atmosphären und organischen Lösungsmitteln; 2) verbesserter oder neuer Substratspezifität und 3) veränderten Eigenschaften, welche die Rückgewinnung bei Folgeverfahren erleichtert. Da Konformation und Eigenschaften der Proteine durch ihre Primärsequenz bestimmt werden, ist das Ziel im wesentlichen die geplante Veränderung von Aminosäuresequenzen existierender Proteine. Alternativ können kleine Proteine chemisch synthetisiert werden (Peptidsynthese). Die chemische Synthese ermöglicht eine weitere Regulierung der Sel mdärstr ctur des Proteins, da unnatürliche Aminosäuren eingeführt werden können, wie z.B. 2,2-Dimethylglycin, dessen Konformation eingeschränkt ist und deshalb eine stabile Sel undärstruktur ermöglicht. Es kann auch eine chemische Modifizierung nativer Enzyme durchgeführt werden, mit dem Ziel, die normalen Eigenschaften zu erhalten (z.B. Enzymaktivität), während eine größere Stabilität erreicht wird. So wurde dem Gewebsplasminogenaktivator, der für die Behandlung von Thrombose eingesetzt wird, Resistenz gegen proteolytischen Abbau im Körper verliehen, indem die Oberflächenlysinreste durch Reaktion mit einem Säureanhydrid modifiziert -wurden. Eine allgemein angewandte Methode besteht darin, Gene zu synthetisieren, die für eine gesuchte Polypeptidsequenz codieren. Es ist möglich, synthetische Gene aus bis zu 100 Nucleotiden chemisch zu synthetisieren. Hybridgene können chemisch synthetisiert werden, indem Segmente von natürlichen Genen chemisch synthetisierten DNA-Sequenzen hinzugefügt werden. Alternativ können neue Primärsequenzen gebildet werden, indem synthetische DNA-Sequenzen dazu verwendet werden, natürliche Gene zu erweitern oder Segmente natürlicher Gene zu ersetzen. Die entstandene synthetische oder Hybf id-DNA wird dann in ein Plasmid inseriert, um das geplante Protein zu synthetisieren.
Molekularbiolosische Veränderung: So lässt sich die Primärsequenz von Calmodulin mittels dem Fachmann bekannter Methoden so verändern, daß einzelne oder mehrere Aminosäuren der Primärsequenz durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Es ist auch möglich die Primärsequenz N- oder C-terminal mittels einzelner Aminosäuren, Oligopeptiden oder ganzer Proteine zu verlängern. Es kann auch von Vorteil' sein, nur Teilbereiche des natürlichen oder mittels molekularbiologischer Methoden veränderten Proteins herzustellen, wie dies in Beispiel 9 dargestellt ist. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung ist für die Aktivierung - der CaMAPs geeignetes, gentechnisch verändertes Calmodulin oder Calmodulinfragment oder Calmodulin-Derivat, die man an der aktivierenden Wirkung auf die PPIase-Aktivität der CaMAP erkennt.
Posttranslationale Ver-änderungen: Neben oben aufgeführter Änderung der Primärsequenz kann Calmodulin posttranslational verändert sein. So kann es z.B. acetyliert, methyliert, ubiquitiniliert oder phosphorolyiert sein. Wobei zahlreiche in vivo ablaufende posttranslationale Veränderungen von Proteinen vom Fachmann auch in vitro durchgeführt werden können. So laßt sich Calmodulin in vitro und in vivo mittels unterschiedlicher Protein Serin/Threonin und Protein-Tyrosin Kinasen phosphorylieren und durch pleiotrope Proteinphosphatasen wie z.B. PPlgamma oder PP2A dephosphorylieren (Eur. J. Biochem 269(2002)3619). Neben der gezielten in vitro Phosphorylierung, mit definierter Phosphorylierung einzelner Serine, Tlireonine oder Tyrosine, von gentechnisch hergestelltem Calmodulin (z.B. Zhcmg JG. Biochemical & Biophysical Research Communications. 222(2):439-444, 1996 oder West et al. Protein Engineering. 2(4):307-ll, 1988) kann Calmodulin auch entsprechend zahlreicher Vorschriften (wie z.B.: Ho et al. Preparative Biochemistry. 16(4):29>7-308, 1986; oder Caldwell und Haug in Analytical Biochemistry. 116(2):325-30, 1981) aus unterschiedlichsten Materialien wie z.B. Rinder-Him, Rinder-Herz oder Hoden hergestellt werden. Je nach Herkunftsart und Isolationsprozedur wird unterschiedlich posttranslational modifiziertes Calmodulin erhalten. Übersichten posttranslationaler Modifikationen von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und in zahlreichen Zeitschriftenbeiträgen beschrieben, so zB.: Arinals pfthe New York Academy of Sciences. 663:48-62, 1992; Advances in Protein Chemistry. 37:247-334, 1985; Science. Ϊ98(4320):890-6, -1977; Current Opinion in Rheumatology. . 14(3):244-9, 2002; Biomoleculάr Engineering. 18(5):213τ20, 2001; International Journal of Biochemistiy. 24(1): 19-28, 1992). Besonders im Sinne der Erfindung für die Aktivierung der CaMAPs geeignetes posttranslational verändertes Calmodulin bzw. Calmodul nfragment oder Calmodulin-Derivat erkennt man an seiner aktivierenden Wirkung auf die PPIase-Aktivität der CaMAP.
Proteinchemische Veränderungen: Es kann, erfindungsgemäß auch von Vorteil sein, das CaMAP aktivierende Calmodulin chemisch zu modifizieren. Die dazu notwendigen Methoden und Verfahren sind dem Fachmann als proteinchemische Verfahren bekannt. Neben der Modifikation von Lysinen (Journal of Biological Chemistry. 273(43):28516- 28523, 1998; Biochimica et Biophysica Acta. 844(2):265-9, 1985) oder der Oxidation oder Carbethoxylation von Calmodulin (Pharmacology. 26(5):249-57, 1983; Biochemistiy. 17(19):3924-8, 1978) sind die unterschiedlichsten chemischen Veränderungen an Proteinen möglich. Bekannte Techniken zur chemischen Veränderung werden z.B. in Current Opinion in Biotechnology. 10(4):324-30, 1999; Current Opinion in Chemical Biology. 5(6):696-704, 2001; Biochemistry-Russia. 63 (3): 334-44, 1998; Biotechnology & Applied Biochemistiy. 26 ( Pt 3):143-51, 1997; Biological Research. 29(l):127-40, 1996; Methods in Molecular Biology. 35:171-85, 1994; Methods in Molecular Biology. 32:311-20, 1994; Nature Cell Biology. 5(1) :28-37, 2O03) beschrieben. Besonders für das erfindungsgemäße Verfahren für die Aktivierung der CaMAPs geeignetes chemisch modifiziertes Calmodulin bzw. Calmodulinfragment Calmodulin-Derivat ist bevorzugt und kann an seiner aktivierenden Wirkung auf die PPIase-Aktivität einer CaMAP erkannt werden.
Der Begriff „geeignete CaMAP-Substrate" umfasst im Sinne der Erfindung alle Substrate der Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen. Insbesondere sind dies Substanzen, die eine Peptidyl- Prolyl Peptidbindung aufweisen. „Geeignete CaMAP-Substrate" im Sinne der Erfindung sind in zahlreichen dem Fachmann zugänglichen Literaturstellen beschrieben, so z.B.: Clinical Chemistry. 44(3): 502-8, 1998; Analytical Biochemistry. 252(2). -299-307, 1997; Biochemistry. 34(41):! 3594-602, 1995; Biochemistry. 30(25):6127-34, 1991; Biochemistry. 30(25):6127-34, 1991; Journal of Molecular Biology. 271(5): 827 -37, 1997, oder in Patentschriften aufgeführt, wie z.B. in CA23348J2; EP0647713; Wθ0i42245; EP0360029. Besonders bevorzugte CaMAP-Substrate' im Sinne der Erfindung sind Peptide mit einer Xaa- Pro-Yaa - Gruppierung, wobei Xaa vorzugsweise für die Aminsäuren Glu, Phe oder Leu steht, wie z.B. Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-NHNp oder Suc-Ala-Ala-Glu-Pro-Arg-NHNp.
„Geeignete Mengen" der angegebenen Komponenten des erfindungsgemäßen Verfahrens sind unter anderem ans den Ausführungsbeispielen zu entnehmen und liegen für die erfindungsgemäße CaMAP oder das CaMAP-Peptidfragment/derivat, Calmodulin oder Calmodulinfragment/derivat sowie dem CaMAP-Substrat in einem Bereich von 0,0 lμM bis lOmM in der Reaktionslösung. Bevorzugt ist ein Bereich von 0,lμM bis l M. Besonders bevorzugt ist ein Wert von 1 μM.
Die erfindungsgemäße „geeignete" Reaktionslösung ist definiert als Puffersystem, das neben Wasser, Pufferbestandteile auch weitere, z.B. nachstehend spezifizierte Komponenten enthalten kann und die Identifizierung eines Effektors der Calmodulin-abhängigen Peptidyl- Prolyl cis/trans Isomerasen gewährleistet.
Der Nachweis der Aktivierung von CaMAPs durch Calmodulin ist für den Fachmann nicht naheliegend (siehe Beispiel 1). Die CaMAP FKBP38 neigt z.B. zum Präzipitieren. Dadurch können Aktivitätsbestimmungen verfälscht oder unmöglich werden. So führt der Zusatz von Kalziumionen, die üblicherweise zur Calmodulinaktivierung genutzt werden, bei Konzentrationen größer 5 mM zum Ausfallen der Proteine im Meßansatz. Wie in den Beispielen 1,2 und 3 gezeigt, kann es vorteilhaft sein in den Aktivitätsassays ein Protein ohne hydrophoben Bindungsanker (beschrieben in Beispiel 9) zu verwenden. Der Nachweis von CaMAP-Aktivität mit dem kompletten Protein, gestaltet sich wegen der auftretenden Präzipitationsprobleme schwieriger.
Die nach Zusammenmischen in der Reaktionslösung enthaltenen Komponenten liegen vorzugsweise in gelöster Form vor. Zur Herstellung der Reaktionsansätze in geeigneten Reaktionsgefäßen sind die Komponenten unter Durchmischung zuzugeben. Die Mischung kann bereits durch geeignete, dem Fachmann geläufige Pipettiertechniken erreicht werden. Zusätzlich kann durch mechanische Einwirkung, beispielsweise durch Vortexen, Schwenken oder Schütteln der Mischeffekt verbessert werden.
Ferner kann es vorteilhaft sein, nach Mischung aller notwendigen Komponenten über eine gewisse Zeit, beispielsweise 5 sec, 10 sec, 30 sec, 1 min, 2 min, 5 min, 10 min oder 20. min die Reaktionslösung zu inlcubieren, bevor die Reaktion gestartet wird. Effektoren von CaMAPs lassen sich im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens einfach identifizieren. Erfindungsgemäß kann dazu ' entweder eine konstitutiv aktive CaMAP verwendet werden oder . die Aktivierung der CaMAP kann durch Calmodulin bzw. entsprechende Fragmente oder Derivate erfolgen. Durch diese . Aktivierung wird das katalytische Zentrum der CaMAP so verändert, daß. die Katalyse typischer CaMAP Substrate unter optimalen Katalysebedingungen mindestens um das 2-fache gesteigert wird. Diese Steigerung der CaMAP Aktivität um mindestens das 1,5 -fache, bevorzugt mindestens das 2-fache ist auch ein Kennzeichen optimaler Katalysebedingungen. Um optimale Katalysebedingungen zu erreichen, kann ein breiter Bereich von Puffern verwendet werden. Insbesondere kann ein Puffer mit einem pH- Wert im Bereich von 5-10, stärker bevorzugt im Bereich von 6-8 und insbesondere im Bereich zwischen 6.5-8.0 verwendet werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Puffersystem ist 20 mM HEPES-Puffer mit einem pH von 7.8. Weitere erfindungsgemäße Pufferlösungen umfassen unter anderem TRIS HC1, HEPES/NaOH oder A-mmoniumcarbonatpuffer in einer Endkonzentration von 5 mM bis 200 mM.
Die Reaktionstemperatur des erfindungsgemäßen Verfahrens kann gewählt werden z.B. im Bereich von 0 °C bis 30 °C vorzugsweise zwischen 5 °C und 15 °C, besonders bevorzugt liegt die Temperatur bei 8 °C. Eine höhere Temperatur kann zur Denaturierung von Proteinen führen, während eine niedrigere Temperatur zu einer Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit führen wird. Das Reaktionsgemisch kann zusätzlich Proteinstabilisierende Mittel, wie z.B. Saccharose, Sorbitol oder Ethylenglykol, vorzugsweise in einer Menge von 200 bis 500 mM und insbesondere in einer Menge von 250 bis 300 mM enthalten. Ferner kann es von Vorteil sein, der Reaktionslösung Proteinaseinhibitoren, z.B. das von RocheR erhältliche „PI Complete"-Gemisch in dem vom Hersteller angegebenen Mengenbereich zuzusetzen. Da erfindungsgemäßes Calmodulin durch Zusatz von zweiwertigen Ionen wie Ca2+ erhalten werden kann, dürfen dem Reaktionsansatz zugesetzte Chemikalien das zur Aktivierung des Calmodulin erforderliche zweiwertige Ion nur soweit maskieren, das die Bildung eines wirksamen Calmodulins nicht verhindert wird. Das Ausführungsbeispiel 11 zeigt, wie durch Zusatz eines Gemischs von Kalziumionen und Calmodulin zum Testansatz die Aktivierung einer CaMAP erreicht wird und wie durch Chelatierύng der Kalziumionen diese -Aktivierung verhindert werden kann. Effektoren aktivierter CaMAPs können die PPIase-Katalyse, "wie in Beispiel 5 gezeigt, signifikant beeinflussen. Eine signifikante Beeinflussung liegt vor, wenn die Aktivierung der CaMAP um mindestens 50% verändert wird, wobei bei Verwendung von Inhibitoren die Calmodulin- Aktivierung aufgehoben werden kann, wie dies in Beispiel 5 dargestellt ist.
Affinitätsassavs zum Nachweis von CaMAP-Effektoren: Effektoren von CaMAPs können die durch Calmodulin an der CaMAP bewirkte Konformationsänderung (Ausführungsbeispiel 11) so beeinflussen, das die PPIase-Aktivität der „Aktivierten CaMAP" trotz sonst optimaler Reaktionsbedingungen verändert wird. So können Effektoren z.B. auf die CaMAP Bindungsstelle zum wirksamen Calmodulin, oder auf die Calmodulin Bindungsstelle zur CaMAP wirken. Inhibitoren können auch auf die zur Aktivierung von wirksamen Calmodulin gegebenenfalls notwendigen Bindungsstellen für zweiwertige Metallionen, wie z.B. der Bindungsstellen für Klalziumionen wirken. Inhibitoren können aber auch direkt am PPIase-Katalysezentrum wirken. So kann z.B. der Wirkstoff Cyclosporin A die CaMAP Cyp40 (Swiss-Prot Nomenklatur: CY7P4_HUMAN) signifikant inhibieren, wie dies in Beispiel 8 aufgeführt ist. Der Wirkstoff FK506 wiederum kann signifikant die CaMAP FKB38 (Swiss-Prot Nomenklatur: FKB8_HUMAN) inhibieren, wie dies in Beispiel 5 aufgeführt ist. Effektoren von CaMAPs können mittels dem Fachmann bekannten Affinitätsassays gefunden werden. Solche Affinitätsassays zum Nachweis der Bindung eines Liganden können sehr unterschiedlich aufgebaut sein. Beispiele sind in den Patentschriften WO03018846; EP1202056; US6281006; WO0122084; CA2162568; US5434052; GB2300260; DE10030798A1; US5773225; NZ504112; HU0201142; HK1029376 aufgeführt. Prinzipiell lassen sich diese Nachweisverfahren in zwei verschiedene Typen einteilen. In solche (A), bei denen der Effektor die Aktivierung der CaMAP beeinflußt. Typisch ist hier der Einfluß auf die Stärke der Interaktion zwischen wirksamen Calmodulin und CaMAP, wie dies in den Ausführungsbeispielen 6 und 11 gezeigt ist. Und in solche (B), bei denen der Effektor am oder in der Nähe des katalytischen Zentrums bindet. Typisch sind hier Bindungsassays, bei denen Liganden aktivierter CaMAPs dadurch gefunden werden, in dem diese schon bekannte Liganden vom katalytischen Zentrum verdrängen. Eine solche Ausführungsform ist in Ausführungsbeispiel 7 angegeben.
Aktivitätsassavs zum Nachweis von Effektoren aktivierter CaMAPs: Optimale Verfahren zum Nachweis von Effektofen der CaMAP Aktivität sind mittels der bereits bekannten Effektoren Cyclosporin A und FK506 zu erkennen. Dazu wird die Aktivität der CaMAP . urch eine hinreichende. Menge eines wirksamen Calmodulin gegenüber einem geeignetem CaMAP Substrates bei Nutzung eines geeigneten PPIase- Aktivitätstestes so aktiviert, daß durch Zusatz einer minimalen Menge eines bekannten CaMAP Inhibitors eine signifikante Verminderung der CaMAP Aktivität beobachtbar ist. Um eine Aktivierung von CaMAPs durch wirksames Calmodulin zu erreichen, kann es von Vorteil sein, die CaMAP für bis zu 20 Minuten bei 20 °C mit diesem Protein- oder Proteinfragment zu inkubieren. Es kann aber auch von Vorteil sein, eine größere Menge durch Zusatz einer geeigneten Menge an wirksamen Calmodulin bereits aktivierter CaMAP nach ihrer Herstellung in Aliquots so zu lagern, daß diese so aktivierte CaMAP zur CaMAP Aktivitätsmessung schon zur Verfügung steht. Um eine Hemmung der CaMAP-Aktivität durch Effektoren zu erreichen kann es von Vorteil sein, in einem ersten Schritt die CaMAP mit einer geeigneten Konzentration an wirksamen Calmodulin zu inkubieren um nach dieser ersten Inkubation den Effektor zuzugehen und diesen mit dem Gemisch weiter zu inkubieren. Es kann aber auch von Vorteil sein, die Reihenfolge der Zugabe ujmzukehren oder eine gleichzeitige Inkubation vorzunehmen. Bei Verwendung von konstitutiv aktiver CaMAP kann der Zusatz von wirksamem Calmodulin unterbleiben Die Inkubationszeiten des Effektors mit aktivierter CaMAP sollen mindestens 1 Sekunde, vorzugsweise 300 Sekunden betragen, können aber oder auch weitaus größer sein, um eine Effektuierung beobachten zu können. Geeignete CaMAP Assays sind alle PPIase-Aktivitätsassays, die eine Vorinkubation von Effektor und aktivierter CaMAP erlauben und welche die Messung der Effektuierung durch CaMAP Effektoren ermöglichen.
Wirkuns von CaMAP Inhibitoren: Die Wirkung von Effektoren wie FK506 oder CsA sind nicht auf die PPIase-Aktivität von aktivierten CaMAPs beschänkt. So inhibiert Cyclosporin A PPIasen, die zur Familie der Cyclophiline gehören und FK506 hemmt PPIasen die zur Gruppe der FKBPs gehören (European Journal of Biochemistry. 216(3): 689-707, 1993; Annual Review of Immunology. 10:519-60, 1992). Sowohl Cyclosporin A als auch FK506 werden gegenwärtig als hnmunpharmaka zur Verhinderung von Transplantatabstoßungen in der Humanmedizin genutzt. Beide Pharmaka können beträchtliche Nebenwirkungen verursachen (z.B.: Seminars in Nephrology. 17(1): 34-45, 1997). Eine mögliche Nebenwirkung dieser Therapeutika auf Zellebene ist die Beeinflussung des programmierten Zelltods, vom Fachmann als Apoptose bezeichnet. Apoptose ist für eine ordnungsgemäße Embryo genese und Metamorphose, Gewebehomöostase und die Funktion des Immunsystems in Metazoeή notwendig. Auf der. rnikrς>skόpischen Ebene der Zelle kommt es bei der Apoptose zum Verlust von Zellverbindungen und Mikrovilli, zu Chromatinkondensation, DNA-Fragmentierung, cytoplasmatischer Kontraktion und dichter Packung von Mitochondrien und Ribosomen. Es bilden sich Membranbläschen, in denen das endoplasmatische Reticulum mit der Zellplasmamembran verschmilzt und die Zelle in mehrere membrangebundene Vesikel unterteilt, die als apoptotische Körper bezeichnet werden. Letztere werden im Allgemeinen von benachbarten Zellen aufgenommen und abgebaut. Bisher wurden eine Reihe von Faktoren identifiziert, die die Apoptose aktivieren. Apoptose kann durch cytotoxische Agenzien induziert werden. Die natürliche, genetisch prograirr ierte Apoptose scheint jedoch von der Initiierung eines Signalstoff- Stoffwechselwegs durch Ligandenbindung an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche abzuhängen. [R.E. Ellis et al. Annu. Rev. Cell Biol. 7 (1991) 663-698; S. Cory Nature 367 (1994) 317-318; S.J. Martin u. D.R. Green Cell 82 (1995) 349-352; M. Tewari et al. J. Biol. Chem. 270 (1995) 18.738-18.741; CD. Gregoiy (Hrsg.) Apoptosis and the Immune Response Wiley-Liss., New York, 1995/. Es sind aus der Literatur Beispiele bekannt, in denen die bereits bekannten Hemmstoffe der CaMAP-Aktivität Apoptose auslösen (Cyclosporin A: International Journal of Molecular Medicine. 7(4):431-437, 2001; Anticancer Research. 20(5B). -3363-3373 , 20001; Scandinavian Journal of Immunology. 56(4):353-360, 2002; FK506: Life Sciences. 66(23). -2255-2260, 2000; Clinical & Experimental Immunology. 125(l):19-24, 2001) aber auch Apoptose verhindern (Scandinavian Journal of Immunology. 56(4): 353-360, 2002; American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 165(4):449-455, 2002; Carcinogenesis. 21(11):2027- 2033, 2000; FEBS Letters. 447(2-3)274-276, 1999;FK506 Brain Research. 826(2). -210-219, 1999; British Journal of Pharmacology. 126(5):1139-1146, 1999; NeuroReport. 9(9):2077- 2080, 1998). Eine Ursache der widersprüchlichen Wirkung beider Hemmstoffe auf Zellebene kann mit der Beeinflussung weiterer PPIasen, die nicht durch wirksames Calmodulin aktivierbar sind, erklärt werden. In humanen Zellen sind mehr als 5 verschiedene PPIasen Cyclosporin A-sensitiv und mehr als 5 verschiedene PPIasen FK506-empfindlich. Daß spezifische CaMAP Inhibitoren bei humanen Zellen Apoptose hervorrufen sollten zeigt ein publiziertes Depletionsexperiment der CaMAP FKBP38 mittels siRNA (Nature Cell Biology 5(2003)1). Deshalb stellt das erfindungs gemäße Verfahren ferner eine neue Methode zur Identifizierung und Herstellung von Effektoren zur Entwicklung von Therapien zur gezielten Auslösung der Apoptose bereit, an denen CaMAPs beteiligt sind. Solche Mittel und Therapien sind wichtig bei all den Erkrankungen, die durch gezielte Vernichtung von Zellen therapierbar sind. Dazu gehören insbesondere T norerlrankungen. Die gezielte therapeutische Induktion von Apoptose kann aber auch von Vorteil sein, um die hnmunogenität von Zellen zu beeinflussen, wie dies z.B. in US5,922,598 beschrieben wird.
In der erfmdungsgemäßen Ausführungsform ist gleichfalls ein Verfahren zum Screening und/oder Herstellung eines Effektors einer CaMAP, bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer CaMAP oder eines CaMAP- Peptidfragments/derivats mit einer geeigneten Menge Calmodulin oder eines Calmodulinfr agment/derivats in einer geeigneten Reaktionslösung mit und ohne eine Probe, die eine einzelne oder eine Vielzahl von Verbindungen enthält, die Kandidaten für einen Inhibitor oder Aktivator sind; (b) Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; (c) Messen der CaMAP-Aktivität; und (d) Nachweis, daß die Probe (i) inhibitorische Aktivität besitzt, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit der Probe kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne die Probe; oder (ii) aktivierende Aktivität besitzt, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit der Probe größer ist als in der Reaktionslösung ohne die Probe, umfaßt.
Das erfmdungsgemäße Verfahren schließt die Ausführungsbeschreibungen für die Schritte (a) bis (d) des Verfahrens zur Bestimmung, ob ein Effektor ein hihibitor oder ein Aktivator ist mit ein, wobei hierbei anstelle eines Effektors eine Probe untersucht wird. Unter "Probe" sind sämtliche natürlichen oder künstlichen Proben zu verstehen, die Kandidaten für Inhibitoren oder Aktivatoren des vorgegebenen Enzyms enthalten und in dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden können. Darunter fallen sowohl homogene Lösungen eines Moleküls als auch Gemische mehrerer Moleküle. Unter Molekülen, die in dem Verfahren durchmustert werden können, sind die als Effektoren gekennzeichneten Moleküle der vorgenannten Ausfuhrungsforrn eingeschlossen. Die Proben können, natürlichen Quellen entnommen sein oder synthetisch hergestellt sein. Beispielsweise können die Proben Molekülbibliotheken entnommen werden, wie sie beispielsweise für Oligopeptide oder Naturstoffe existieren. Desweiteren können Proben auch durch Aufschlüsse biologischen Materials, beispielsweise Lebendmaterial oder ehemals lebendiges Material, entnommen werden oder Kulturüberständen von Mikroorganismen-kulturen entstammen. Die Proben können als Rohextrakt oder -Überstand vorliegen oder können in einer frei zu wählenden Reinigungsfonn vorliegen. Zur Reinigung können die Extrakte oder Überstände fraktioniert werden. Hierfür stehen dem Fachmann zahlreiche Techniken zur Verfügung, wie beispielsweise differenzielle Fällung, Gradientenzentrifugation, Chromatographietechniken, etc. Das biologische Material umfaßt sämtliche Organismenbereiche, wobei das Material entweder kultiviert oder der Natur entnommen sein kann.
"Screening" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die Durchmusterung einer Vielzahl von Proben, die eine einzelne oder eine Vielzahl von Verbindungen enthalten, die Kandidaten für Inhibitoren oder Aktivatoren des vorgegebenen Enzyms darstellen, mit dem Ziel, Inhibitoren oder Aktivatoren der CaMAP zu identifizieren. Im allgemeinen bedeutet "Screening" ein Verfahren, bei dem eine Vielzahl von Proben auf eine bestimmte Eigenschaft hin untersucht wird, von denen im allgemeinen zuvor nicht bekannt ist, wie sie auf die zu testende Eigenschaft reagieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung erlaubt die Quantifizierung von Effektoren in biologischen Materialien oder Proben. CaMAP -Effektoren können in biologischen Materialien aus unterschiedlichsten Ursachen zu finden sein. Neben intrinsisch in Zellen vorkommenden Gen-kodierten Effektoren, können Effektoren auch durch Kontamination mit anderen biologischen Materialien, wie z.B. eine Infektion durch Bakterien oder durch die Nahrungsaufnahme, insbesondere bei gestörter Darmresorption in biologische Materialien kommen, in denen sich diese Effektoren nachweisen lassen. Effektoren können aber auch als Medikament, entweder direkt als Wirkstoff, oder indirekt als Vorläuferwirkstoff beabsichtigt in biologische Materialien verbracht werden. Die Quantifizierung dieser CaMAP -Effektoren in biologischen Materialien kann nützlich sein, um bei therapeutischer Gabe dieser Effektoren über die ermittelte Bioverfügbarkeit ein optimales Therapieregime zu erreichen. Sind bestimmte Konzentrationen intrinsisch in Zellen vorkommender CaMAP-Effektoren Kennzeichen bestimmter Zustände dieser biologischen Objekte, und kann aus diesen besonderen Zuständen dieser Materialien eine Kenntnis erhalten werden, die nützlich ist, ist es von Vorteil deren Konzentration zu quantifizieren. Bei der Quantifizierung von CaMAP- Effektoren kann es von Vorteil sein, deren Konzentration in Form eines Schwellentestes zu ermitteln. Nach Definition eines Normbereiches, der die Konzentration des CaMAP- Effektors in der biologischen Probe des Zustandes (A) beschreibt, kann aus einer signifikanten Abweichung der Konzentration des Ca AP-Effektors von diesem Normwert auf eine Änderung des Zustandes (A) in den Zustand (B) der biologischen Probe geschlossen werden. Ausfuhrungsbeispiele 6 und 7 zeigen typische erfindungsgemäße Anwendungen. Zusätzlich betrifft die Erfindung als bevorzugte Ausfuhrungsform ein Verfahren, das die vorgenannten Schritte (a) bis (d) umfaßt und zusätzlich den Schritt:
(e) Fraktionieren der Probe, für die in Schritt (d) inhibitorische oder aktivierende Aktivität festgestellt wurde, und Wiederholen der Schritte (a) bis (d), bis der in der Probe enthaltene Inhibitor oder Aktivator gereinigt vorliegt.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform sind die CaMAPs des erfindungsgemäße Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den humanen CaMAPs wie FKBP36, FKBP37.7, FKBP44, FKBP51, FKBP52 und Cyp40, und Enzymen, welche in der „Swissprof-Datenbank, die z.B. über die folgende Internetadresse http://us.expasy.org/sprot/ zugänglich sind, entsprechend der dort vorgenommenen Bezeichnungen FKBP66, FKBP42, ArP_HUMAN, AXP_CERAE, AlP_MOUSE, AΓPL1_HUMAN, AILP1_RAT; AJLPl_MOUSE, AILP1_RABIT, FKB8_HUMAN, FKB8_MOUSE, FKB5_HUMAN, FKB5_MOUSE, FKB4JHUMAN, FKB4_MOUSE, FKB4_RABIT, FKB7_WHEAT, CYP4_BOVrN und CYP4_HUMAN aufgeführt sind.
hl einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Calmodulin oder Calmodulinfragment/derivat des erfindungsgemäße Verfahren, welches in der „Swissprof- Datenbank entsprechend der dort vorgenommenen, nachfolgend aufgeführten Bezeichnung 'für den Fachmann zugänglich, ist, ausgewählt aus . der. Gruppe bestehend aus: CALM_ACHKL (P15094), CALMJ3LAEM (Q9HFY6), CALM_CANAL (P23286), CALM_CÄPAN (P93087), CALM_CHLRE (P04352), CALM_DICDI (P02599), CALM_DROME (P07181), CALM_ELEEL (P02594), CALM_EMENI (P19533), CALM_EUGGR (P11118), CALM_FAGSY (Q39752), CALMJHELAN (P93171), CALM_HORVU (P13565), CALMJHUMAN (P02593), CALM_KLULA (O60041), CALM_LYCES (P27161), CALM_LYTPI (P05935), CALM_MAGGR (Q9UWF0), CALM_MAIZE (P41040), CALM_MALDO (P48976), CALM_MEDSA
(P17928),CALM_METSE (P02596), CALM_NEUCR (Q02052), CALM_ORYSA (P29612), CALM_PARTE (P07463), CALM_PATSP (P02595), CALM ΗYTN (P27165), CALM_PLAFA (P24044), CALM_PLECO (P11 120), CALM_PNECA (P41041), CALM_PYUSP (P11121), CALM_SCHPO (P05933), CALM_SOLTU (P13868), CALM_SPIOL (P04353), CALM_STIJA (P21251), CALM_STRPU (P05934), CALM_STYLE (P27166), CALM_TETPY (P02598), CALM_TETTH (Q05055), CALM_TRYBB (P04465>, CALM TRYCR (P18061), CALM_WHEAT (P04464), CALM_YEAST (P06787), Q9UWF0, Q02Ö52, P19533, AAL89686, Q7M510, Q96TN0, P27165, AAG01043, P02593, Q7T3T2, Q40302, O02367, Q95NR9, Q9UB37, AAH54805 AAH54973, AAL02363, AAH59427, AAH59500, AAH5460O, AAH53150, AAH50926, AAH45298, AAH44434, AAP88918, AAP35501, AAP35464, BAC56543, AAC83174, AAD55398, AAC63306, A-AD45181, AAH21347, BAC40168, BAB28631, BAB28319, BAB28116, BAB23462, AAvH58485, AAH51444, AAH47523, P07181, Q7QGY7, Q8STF0, AAO25039, AAM50750, AAK61380, BAB89360, 094739, P02594, Q9D6G4, O16305, Q96HK3, P11120, O96102, P21251, Q9U6D3, Q8X187, O93410, AAR10240, P11121, Q9XZP2, Q42478, AAQO1510, P17928, P93171, 097341, O96081, AAD10244, AAM81203, AAA34238, AAA34014, AAA34013, P02596, P93087, Q43699, CAD20351, BAB61916, BAB61915, AA7F65511, P02595, P59220, P27162, Q93VL8, Q39447, Q94801, AAQ63462, AAQ63461, AAM81202, BAB61918, BAB61917, BAB61914, BAB61913, BAB61912, BAB61911, BAJB61910, BAB61909, AAG27432, AAG11418, wobei sich diese oder- ähnlich geeignete Sequenzen mittels Sequenzvergleichsprogrammen wie z.B. dem BLAST-Programm in biochemischen Datenbanken, welche ständig durch Neueinträge aktualisiert und erweitert werden, leicht auffinden lassen. h einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die geeignete Reaktionslösung des erfindungsgemäßen Verfahrens zweiwertige Ionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Mn2"1", Ca2+ und/oder Mg2+. In einer bevorzugten Ausfuhfungsform enthält die geeignete Reaktionslösung die erfindungsgemäßen zrweiwertigen Ionen in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mM. Besonders bevorzugt ist ein Konzentration der zweiwertigen Ionen in einer Konzentration von 2.5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6 oder 6,5 mM. Die zweiwertigen Ionen können erfindungsgemäß einzeln oder in jedweder Kombination in der Reaktionslösung vorliegen. Optional ist die Zugabe weiterer Ionen wie z.B. Na+, K+, Li+ in einer Konzentration von 0,5 bis 100 mM der Reaktionslösung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die geeignete Reaktionslösung des erfindungsgemäßen Verfahrens einen pH- Wert zwischen pH 5 und pH 10 auf. Besonders bevorzugt ist ein pH-Wert von 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8 oder 8,25. Zusätzlich betrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Effektors einer CaMAP bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer konstitutiv aktiven CaMAP in einer geeigneten Reaktionslösung mit und ohne den Effektor; (b) Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; (c) Messen der CaMAP -Aktivität; und (d) Nachweis, daß der Effektor (i) ein Inhibitor ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor; oder (ii) ein Aktivator ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor größer ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor.
Der Begriff „konstitutiv aktiv" beinhaltet durch beispielsweise Anwendung einer oder mehrere der oben aufgeführten Methoden, eine CaMAP so zu verändern, daß diese die enzymatische Aktivität einer CaMAP ohne die Gegenwart von Calmodulin erreicht. Durch diese Methoden kann erfindungsgemäß eine Aktivitätssteigerung einer CaMAP unter optimalen Bedingungen um mindestens das 1,5-fache, erfindungsgemäß besonders bevorzugt das mindestens 2-fache erreicht wird. Strategien um zu einem konstitutiv aktiven Enzym zu kommen sind dem Fachmann bekannt und wurden mehrfach beschrieben, so z.B. in Journal of Biological Chemistry. 272(6):3223-3230, 1997; Journal of Neurobiology. 52(l):24-42, 2002 und FEBS Letters. 503(2-3):185-188, 2001. Die Verwendung einer konstitutiv aktivierten CaMAPs ist für das erfindungsgemäße Verfahren besonders bevorzugt. Des weiteren betrifft die Erfindung als bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren, bei dem die Abfolge der Schritte (a) und (b) vertauscht ist.
Das erfindungsgemäße Verfalirens ermöglicht weiter den Nachweis des Effektors durch spektroskopische oder radioaktive Methoden. Spektroskopische Methoden im Sinne der Erfindung sind dem Fachmann geläufig und umfassen u.a. CD-Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Absorptionsspektroskopie. Ferner können zum Nachweis der erfindungsgemäßen Effektoren massenspe trometrische Verfahren wie z.B. MS-MALDI, Liganden-Bindungsverfahren wie z.B. Biacore oder Strukturverfahren wie z.B. NMR- Techniken zum Einsatz kommen. Radioaktive Methoden zum Nachweis des Effektors sind dem Fachmann vertraut und sind in den Beispielen 6, 7 und 10 aufgeführt. Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren ein Hochdurchsatzverfahren.
Erfindungsgemäße Effektoren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden können, sind z. B. Cycloheximid-Derivate mit der allgemeinen Fonnel 1 :
Formel 1 in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet; R12 unabhängig ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder Arylrest bedeutet,
R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N- NR2R3 ausgewählt wird, wobei a) R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Aryl bzw. Alkyl, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloallcyl, Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 substituiert sein kann, oder b) R2 und R3 zusammen Cι-C6-Alkylen ist, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloallcyl, oder Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 substituiert sein kann, wobei R5 einen Alkylrest oder einen Arylrest darstellt, R6 für ein Wasserstoffatom, Alkyl, Aryl, OR5, C(O) OR5, CN, F oder Cl steht, wobei R5 wie vorstehend definiert ist, R7einen Rest -OH, -OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9 oder -OC(S)NHR9 darstellt, wobei R9 einen Alkylrest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH, NR-5, Aryl, Heteroaryl, Cycloallcyl oder Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann, oder alternativ
R9 einen Arylrest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH oder NR5 unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann,
R10 einen Rest -NHR2, -NR2R3, -C(O)OR2, -C(S)OR2, -C(O)NR2R3, -CN, -NR:2C(O)NR2R3,
-OC(O)NR2R3, -NR2C(S)NR2R3, -OC(S)N R2R3, oder OR2, C(O)NHRu darstellt, wobei R2 und R3 wie vorstehend definiert sind,
R11 für einen Aminosäurerest oder Oligopeptidrest steht und
R , 14 ein Alkylrest oder Arylrest ist.
Alternative erfindungsgemäße Verbindungen der allgemeinen Fonnel 1 unterscheiden sich von den vorstehenden Verbindungen dadurch, dass sie in der Position R1 ein Wasserstoffatom und zwischen dem benachbarten Kohlenstoffatom zu R15 einen Ether in folgender Weise (Formel 2) ausbilden, wobei R15 ausgewählt ist aus Alkyhest, Arylrest oder Wasserstoffatom:
Formel 2 Die erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen R , 114* ein Alkyhest ist, haben z.B. gegenüber den in WO 00/26188 beschriebenen Substanzen den Vorteil einer verbesserten Lipophilität und im Falle des Äthers gemäß Formel 2 eine verbesserten Stabilität.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen der erfindungsgemäßen Verbindung der vorgenannten Formel (1) sind Verbindungen für die gilt:
(a) n = 1, 2, 3; R*= O; R7= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)CH3; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2.
(b) n = 3-10; R*= O; R7= OH; R10= C(O)NHRn, R1 - Aminosäurerest, Oligopeptidrest.
(c) n = 1, 2, 3; R!= O; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2Fr5, CN, C(O)NH2.
(d) n = 1, 2, 3; R**= NOH, N-NHPh, N-NHCH3, N-Alkyl, N-Benzyl; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2.
(e) n = 1 , 2, 3 ; Rl= O; R7= OH, O(CHR12)nI .10, OC(O)NH- Alkyl, OC(O)NH-Cycloalkyl, OC(O)NH-Aryl; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2.
Bevorzugte Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind die folgenden Verbindungen 1 bis 39 gemäß Formel 1:
In den vorstehenden Formeln der erfindungsgemäßen Verbindungen und im Folgenden bedeuten Alkyl einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest, insbesondere Cι-C8-Alkyl bzw. durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, dabei besonders bevorzugt F, CN, NO2, S, O, C(O) substituiertes Alkyl. In den vorstehenden Formeln der erfindungsgemäßen Verbindungen und im Folgenden bedeuten Cycloalkyl insbesondere C4-C7-Cycloalkyl bzw. bi- und tricyclische Systeme, die durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, dabei insbesondere F, CN, NO2, S, O, C(O) substituiert sein können. Aryl bedeutet insb esondere Phenyl bzw. durch Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Halogen, dabei insbesondere F, CN, N02, C(O) substituiertes Aryl und Heteroaryl insbesondere sechsgliedrige Aromaten, die Stickstoff enthalten bzw. fünfgliedrige Aromaten, die Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel entbalten. Oligopetidreste bedeuten besonders Reste aus 2-5 kondensierten Aminosäuren. Halogen bedeutet F, Cl, Br und oder I.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden zum Beispiel hergestellt, indem in für den Fachmann bekannter Weise a) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Dimethylformamid, bei Raumtemperatur mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 zu den entsprechenden N-Alkyl- bzw. N,O-Bisalkylverbindungen umgesetzt werden. b) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel, wasserfreien Aceton, bei Raumtemperatur mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz katalytischer Mengen an Krόnenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-.Alkyl- bzw. N,O- Bisalkylverbindungen umgesetzt werden. c) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösrrngsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Aceton, bei Siedehitze mit Halogenalkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz katalytischer Mengen an Kronenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-Alkyl- bzw. N,0-J3isalkylverbindungen umgesetzt werden. d) Cycloheximid und geeignete Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Dimethylformamid, bei Raumtemperatur mit an Trägermaterialien (übliche Harze für Festphasenreaktionen) gebundenen HalogenaLkylverbindungen und einer geeigneten Base, wie K2CO3 unter Zusatz katalytischer Mengen an Kronenethern, wie z.B. 18-Krone-6-ether zu den entsprechenden N-Alkylverbindungen umgesetzt und in gewohnter Weise vom Träger abgespalten werden. e) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Pyridin, bei Raumtemperatur mit Carbonsäureanhydriden zu den entsprechenden Estern umgesetzt werden. f) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel einem Gemisch aus Pvri<_in/H2O (2:1), bei Raumtemperatur mit Hydroxylamin-Hydrochloriden zu den entsprechenden Oximen umgesetzt werden. g) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Methanol, bei Raumtemperatur mit Hydrazinen zu den entsprechenden Hydrazonen umgesetzt werden. h) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel wasserfreien Methanol, bei Raumtemperatur mit primären Aminen zu den entsprechenden Azomethinen umgesetzt werden. i) Cycloheximid-Derivate in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methylenchlorid, bei Raumtemperatur mit Isocyanaten und einem geeigneten Katalysator, wie zum Beispiel HO, zu den entsprechenden Urethanen umgesetzt werden.
Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Verfahren, das die vorgenannten Schritte (a) bis (e) umfaßt und zusätzlich den Schritt:
(f) Formulieren des. identifizierten und/oder hergestellten Effektors mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Lösungsmittel.
Der erfindungsgemäß identifizierte und/oder hergestellte Effektor wird in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gegebenenfalls in Kombination mit einem „pharmakologisch akzeptablen Träger" und/oder Lösungsmittel formuliert. Beispiele für besonders geeignete pharmakologisch verträgliche Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z.B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäß identifizierten und/oder hergestellten Effektors zur Herstellung eines Arznennittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen. Tumorerkrankungen, die mit dem erfind ingsgemäßen Arzneimittel behandelt werden umfassen Mammakarzinome, Ovarialkarzinome, Bronchialkarzinome, Kolonkarzinome, Melanome, Blasenkarzinome, Magenkarzinome, KopfHalstumore, Gehirntumore, Gebärmutterhalstumore, Prostatakarzinome, Hodenkarzinome, Knochentumore, Nierenkarzinome, Bauchspeicheldrüsentumore, Speiseröhrentumore, maligne Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, Hodgkiα-Lymphome und Schilddrüsenlymphome.
Arzneimittel im Sinne der Erfindung, die die oben aufgeführten pharmakologisch akzeptablen Träger umfassen, können mittels bekannter konventioneller; Methoden formuliert werden. Diese Arzneimittel können einem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B- . intravenös, intraperitoneal, subcutan, intramuskulär, lokal, intranasal, intrabronchial oder intradermal, oder über einen Katheter an einer Stelle in einer Arterie. Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist denn Fachmann bekannt, daß die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren abhängig ist, "wie z.B. der Körpergröße bzw. dem Gewicht, der Köfperoberfläche, dem Alter, dem Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der. Verabreichung, und von anderen Medikaαnenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Eine typische Dosis kann z.B. in eixiem Bereich zwischen- 0,01 und' 10000 μg liegen, wobei , Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften -Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktofen, vorstellbar sind, hn allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittelformulierung die Dosis in einem Bereich zwischen 10 ng- und 10 mg-Einheiten pro Tag bzw. pro Applikationsintervall befinden- Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht sollte sich die Dosis in einem Bereich., zwischen 1 ng- und 0,1 mg-Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute befinden. Die Zusammensetzung der Erfindung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wäßrige oder n cht-wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wäßrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, uncL organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wäl3rige Träger umfassen Wasser, alkoholisch-wäßrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer- Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff- und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Arzneimittel -kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Des weiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Ihterleütane, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, h terferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatoriscb.es Agens enthalten sein.
Erfindungsgemäß identifizierte CaMAP-Effektoren, i.e. Substanzen die zur Aldivierung, Inhibierung oder Stabilisierung von CaMAPs geeignet sind und deren spezifische Wirk-ung auf die in biologischen Objekten vorhandene CaMAP Aktivität, nach Applikation, zu überwiegender therapeutischer Beeinflussung pathobiochemischer Vorgänge in diesen biologischen Objekten führt, sind als Therapeutika solcher Vorgänge geeignet. Sind therapeutisch nutzbare CaMAP-Effektoren Gen-kodiert, kann es vorteilhaft sein, die zur Synthese im zu therapierenden Organismus notwendige Sequenzinformation selbst in diesen Organismus, mittels dem Fachmann bekannten gentherapeutischer Methoden, einzubringen. Es kann aber auch von Nutzen sein, den für die Therapie nützlichen Wirkstoff (CaMAP Effektor) als Substanz- Vorstufe herzustellen, aus der sich erst am eigentlichen Wirkort, oderauf dem Weg zum Wirkort die wirksame Substanz (Wirkstoff) bildet. Die Gründe für diese Verfahrensweise können vielfältiger Natur sein. So kann z.B. bei instabilen Wirkstoffen durch die Verabreichung des Wirkstoffes als Substanz- Vorstufe eine Erhöhung der Stabilität und damit der Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes erreicht werden. Bestimmte Modifizierungen der Substanz können aber auch geeignet sein, Löslichkeitseigenschaftem in gewünschter Weise zu verändern, oder aber es ermöglichen gerichtet biologische Barrieren, die ein Penetrieren des Wirkstoffes zum Wirkort verhindern können, für die geänderte Substanz oder ihre Vorstufe durchgängig zu machen. Ferner ist umfasst, dass zur Verbesserung der phannakologischen Eigenschaften des nach dem erfindungsgem-äßes Verfahren identifizierten Effektors dieser weiter modifiziert wird, um eine modifizierte Organspezifizität, eine verbesserte Aktivität, eine gesteigerte Toxizität für Tumorzellen (einen verbesserten therapeutischen Index), verminderte Nebenwirkungen, einen zeitlich versetzten Beginn der therapeutischen Wirksamkeit oder der Länge der therapeutischen Wirksamkeit, veränderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Distribution, Metabolismus oder Exkretion), modifizierte physikochemische Parameter (Löslichlceit, hygroskopische Eigenschaften, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustandsform), verbesserte generelle Spezifizität, Organ-/Gewebespezifitität, und/oder eine optimierte Verabreichungsform und -route aufweist, was durch die Veresterung von Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen mit Carbonsäuren, Hydroxylgruppen zu bespielweise Phosphaten, Pyrophosphaten, Sulfaten, „Hemisukzinaten" oder die Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen, pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder die Synthese von pharmakologisch aktiven Polymeren oder die Einführung von hydrophilen Gruppen, die Emführung bzw. den Austausch von Sübstituenten in Aromaten oder .Seitenketten, die Veränderung des Substituentenmusters oder der Modifikation durch die Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Gruppen oder die Synthese von homologen Verbindungen, bzw. der Einfuhrung von verzweigten Seitenketten, der Konversion von Alkylsubstituenten zu zyklischen Analogen, der Derivatisierung von Hydroxylgruppen zu Ketalen oder Acetalen, der N-Acetylierung zu Amiden, Phenylcarban atert, der Synthese von Mannich-Basen bzw. ninen oder durch die Umwandlung von Ketonen, Aldehyden in Schiffschen-Basen, Oxime, Acetale, Ketale, Enolester, Oxaholidine, Thiozolidine oder deren Kombinationen erreicht wird.
Die Erfindung umfasst die Verwendung des erfindungsgemäß identifizierten und/oder hergestellten Effektors zur r Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Vermmderuhg von Transplantatabstoßung. Weiterhin umfasst die Verwendung des erfindungsgemäß identifizierten und/oder hergestellten Effektors die Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflussung neurodegenerativer Kranlcheiten/Erkrankungen, wie z.B. Alpers, Alzheimer, Batten-Erkrankung, Cockayne Syndrom, Corticobasale Ganglion Degeneration, Huntington'schen Krankheit, idiopathischen Parkinsonismus, Lewy-Bodie Erkrankung, Motor Neuron Disease, Multiple systemische Atrophie, Multiple Sklerose, Olivopontocerebelle Atrophie, Parkinson, Postpoliomyelitisches Syndrom, Prionen- Erlσanlcung, Progressive supranucleäre Paralyse, Rett-Syndrom, Shy-Drager Syndrom und Tuberose Sklerose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit umfassend die erfindungsgemäße CaMAP oder ein CaMAP-Peptidftagment/derivat, das erfindungsgemäße Calmodulin oder ein Calmodulinfragment/derivat eine oder mehrere Pufferlösungen und oder ein oder mehrere Substrate. Optional ferner eine Anleitung zur Durchführung eines oder mehrerer der oben beschriebenen Verfahren. Eine solche Anleitung enthält die in der vorliegenden Erfindungsbeschreibung enthaltenen Ausführungsbeschreibungen, die es dem Anwender erlauben, das oder die erfindungsgemäße(n) Verfahren zu nutzen. Zusätzlich kann die Anleitung Angaben aus dem Stand der Technik enthalten, die dem Anwender die Durchführung bestimmter Techniken erleichtern.
Im vorliegenden Anmeldungstext werden mehrere Dokumente zitiert. Jedes der hier zitierten Dokumente (unter Einschluß jeglicher Beschreibungen von Herstellern, Anleitungen und dergleichen) wird hiermit mit Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht; es wird jedoch nicht eingeräumt, dass irgendein zitiertes Dokument tatsächlich zum Stand der Technik für die vorliegende Erfindung gehört.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 Fig.la zeigt die isomerspezifische pNitroanilid-Freisetzung bei 390 um in Gegenwart (a) und Abwesenheit (b) von 2 μM Calmodulin, sowie ohne FKBP38 (c). Die Reaktionskurven b und c sind nahezu identisch und entsprechen der unkatalysierten spontanen cis/trans Isomerisierung. Fig. lb 94-/ zeigt die Abhängigkeit der CaMAP Aktivität von ■ der Ca Calmodulin- Konzentration. Die Versuchsdurchführung ist in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben. Bei Konzentrationen > 5 mM an Kalziumchlorid wurde ein Ausfallen der Probe beobachtet.
Figur 2 zeigt ein mittels SDS-PAGE und Phosphoimager erhaltenes Übersichtsbild der nach Beispiel 10 hergestellten chromatographisch aufgereinigten GaMAP FKBP38.
Figur 3 zeigt die CD-spektroskopisch nachgewiesene Strukturänderung (CD- Spektren) nach Ausführungsbeispiel 11. Die durchgezogene Linie in Fig. 3a entspricht der summarischen spektralen Änderung von Lösung A (5 mM CaCl2, 10 μM FKBP38 in CD-Puffer) und B (20 μM Calmodulin (Rinderhirn, Sigma) in CD-Puffer) in den verschiedenen Kammerhälften. Als CD-Puffer wurde eine Lösung aus 10 mM HEPES-Puffer und 5 mM Kalziumchlorid bei einem pH von 7.5 verwendet. Die gepunktete Linie in Fig. 3a zeigt ein typisches Spektrum welches nach Mischen beider Lösungen auftritt. Nach Zugabe von 1 M EGTA zur Mischung, wird das Spektrum erhalten, welches typisch für die nicht miteinander wechselwirkenden Proteine Calmodulin und FKBP38 ist (durchgezogene Linie). Die gepunktete Linie in Fig. 3b zeigt das typische Spektrum nach Mischen beider Lösungen. Das Spektrum der durchzogenen Line wurde nach Erhöhen der Kalziumchloridkonzentration auf 10 mM erhalten.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne diese auf die beschriebenen Beispiele einzuengen: Ausführungsbeispiel 1; Aktivierung der CaMAP durch Calmodulin
Folgendes Ausführungsbeispiel zeigt die typische dosisabhängige Aktivierung der PPIase- Aktivität einer CaMAP durch Calmodulin. Die- humane CaMAP FKBP38 (Synonyme: FKBP8_humän; Swiss-Prot-Nr.:Q14318) wurde mόiekularbiologisch, wie in Ausfuhrungsbeispiel 9 beschrieben, hergestellt und in Aliquotes zu 100* μl bei einer Konzentration von 0.83 mg/ml Protein bei -80 °C gelagert. Unmittelbar ■ vor der Aktivitätsmessung wurde ein solches Aliquot aufgetaut und anschließend bei 4 °C gelagert. Weiterhin wurde käufliches (Sigma; Bestellnummer P2277) aus Rinderhirn isoliertes Calmodulin, welches bei -80 °C gelagert war, unmittelbar vor der Aktivitätsmessung aufgetaut und bei 4 °C gelagert. Als Substrat der CaMAP wurde Suc-Ala- Phe-Pro-Phe-pNA (Bachern; Bestellnummer L-1400) verwendet. Als isomerspezifisches Hilfsenzym wurde alpha-Chymotrypsin welches aus Rinderpankreas isoliert wurde (Merc KG; Bestellnummer: 102307) verwendet. Folgende Gebrauchslösungen wurden unmittelbar vor der Messung hergestellt und bei 4 °C gelagert: Lösung A: 55 mM HEPES Puffer, pH 7.8; lmM DTT, 0.5% Glycerol Lösung B: 20 mg des Peptidsubstrates gelöst in 1 ml DMSO Lösung C: 20 mg Chymotrypsin in 200 μl LösungA gelöst Lösung D: FKBP38 (100 μM, verdünnt in Lösung A) Lösung E: Calmodulin (300 μM, verdünnt in Lösung A) Lösung F: Kalziumchlorid (1 M in Lösung A)
Zur kinetischen Bestimmung der CaMAP-Aktivität wird ein rechnergestütztes Diodenarray- Spektrometer (Hewlett Packard) mit einer Küvettentemperierung bei 4 °C verwendet. Ein typischer Meßansatz enthielt 1 μl Lösung B; 1 μM FKBP38, 2 μM Calmodulin und 0 bis 10 mM Kalziumchlorid. Das Gesamtvolumen wurde mit Lösung A auf 1200 μl eingestellt. Nach Vorinkubation für 5 Minuten zur Bildung der aktivierten CaMAP wurde die Aktivitätsmesung durch Zugabe von 3 μl Lösung C gestartet. Abb. la zeigt die isomerspezifische pNitroanilid-Freisetzung bei 390 nm in Gegenwart (a) und Abwesenheit (b) von 2 μM Calmodulin, sowie ohne FKBP38 (c). Die Reaktionskurven b und c sind nahezu identisch und entsprechen der unkatalysierten spontanen cis/trans Isomerisierung. Abb. lb zeigt die Abhängigkeit der CaMAP Aktivität von der Ca2+/Calmodulin- Konzentration. Bei Konzentrationen > 5 mM an Kalziumchlorid wurde ein Ausfallen der Probe beaobachtet.
Ausfühnmgsbeispiel 2: Screening mittels Fluoreszenzassay
Zur Durchfuhrung des Assays wird eine in Patentschrift WO0188178 beschriebene Ausfuhrungsvofschrift und die in : Patentschrift WO0102837 beschriebene Gerätekombination genutzt und wie folgt abgewandelt: Folgende Lösungen werden hergestellt: Substratlösung: 2 mg/ml disulfidverhrücktes Abz-Cvs-Phe-Pro-Ala-Cvs-Phe- NHNp in DMSO; Enzymlösung: 1 μM Lösung von humanem FKBP38; 5 μM Calmodulin (Herstellung siehe Beispiel 9), 5 mM CaCl2 in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7.5; Effektorlösungen: 0.1 mg/ml Substanz in DMSO; Startlösung: 100 mM DTT in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7.5 hi eine handelsübliche Titerplatte mit 384 Reaktionskammern werden je Kammer 2 μl Substratlösung, 1 μl Effektorlösung und 20 μl Enzymlösung pipettiert. Zur Minderung von Pipettierfehlern wurde, aus den entsprechenden Mengen Enzym- und Substratlösung eine solche Mischung zu erzeugen, daß bei Pipettieren von 40 μl dieser Mischung je Kammer die gleichen Konzentrationen erreicht werden, wie beim Pipettieren der Einzelvolumina. Die Platte wird dann bei 6° C für 20 Minuten so gelagert, daß jede der Reaktionskammem nach 20 Minuten eine Temperatur von 6 °C aufweist. Die eigentliche Reaktion wird durch Zugabe von jeweils 20 μl Startlösung gestartet.
Bei sachgemäßer Temperaturkonstanz von 6 °C während der Meßzeit und dem Erreichen einer homogenen Durchmischung der Lösungen von Substrat-, Enzym- und Effektorlösung mit der Startlösung lassen sich bei Anregung der Fluoreszenz mit einer UV-Lampe mit einem Anregungsspektralbereich zwischen 250 und 330 nm in jeder einzelnen Reaktionskammer die Zunahme von sichtbarem Licht bei 420 nm registrieren. Der visuelle Vergleich der erhaltenen Registrierkurven kann zum Auffinden eines Effektors dienen.
Ausführungsbeispiel 3: Screening mittels isomerspezifischer Hydrolyse
Zur Durchführung des Assays wird eine in Clinical Chemistry 44(1998)502-508 veröffentlichte Ausführungsvorschrift wie folgt abgewandelt: Folgende Lösungen werden hergestellt: Substratlösung: 30 mg/ml Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-NHNp in DMSO; Enzymlösung: 1 μM Lösung von humanem FKBP38; 5μM Calmodulin (Sigma: Rinderherz- Calmodulin; Best. Nr.:P0270), 5 mM CaCl2 in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7.5; Effektorlösungen: 0.5 mg/ml Substanz in DMSO; Startlösung: 20mg/ml Chymotrypsin in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7.5
Ln eine handelsübliche Titerplatte mit 96 Reaktionskammern werden je Kammer 20 μl Substratlösung, 1 μl Effektorlösung und 20 μl Enzymlösung pipettiert. Zur Minderung von Pipettierfehlern ist es von Vorteil, aus den entsprechenden Mengen Enzym- und Substratlösung eine solche Mischung zu erzeugen, daß bei Pipettieren von 40 μl dieser Mischung je Kammer die gleichen Konzentrationen erreicht werden, wie beim Pipettieren der Einzelvolumina. Die Platte wird dann bei 4 °C für 20 Minuten so gelagert, daß jede der Reaktionskammern nach 20 Minuten eine Temperatur von 4 °C aufweist. Die eigentliche Reaktion wird durch Zugabe von jeweils 80 μl Startlösung gestartet.
Bei sachgemäßer Temperaturkonstanz von 4 °C während der Meßzeit und dem Erreichen einer homogenen Durchmischung der Lösungen von Substrat-, Enzym- und Effektorlösung mit der Startlösung lassen sich mit der in Clinical Chemistry 44(1998)502-508 publizierten Versuchsanordnung 96 Registrierkurven innerhalb von ca. 12 Minuten erhalten. Der visuelle Vergleich der erhaltenen Registrierkurven kann zum Auffinden eines Effektors dienen.
Ausführungsbeispiel 4: Suche nach CaMAPs in Datenbanken
In dem Fachmann zugänglichen Datenbanken, wie z.B. Swiss; Trembl; Trenew; Trest; Trgen; Trome usw., die z.B. unter http//WWW.expasy.com zugänglich sind, kann nach CaMAPs relativ einfach durch Eingabe von Calmodulin-Sequenzmotifen (z.B: FASEB J 1997 Apr;ll(5):331-40; Nature 410(2001)1120-1124) gesucht werden. So ergibt die Suche mit dem helicalen CaM-Motif KHAAQRSTETALYRKM folgende Treffer: s :AIP_CERAE, sw:AIP_HUMAN, sw:AIPL1_HUMAN, sw:AILPl_RAT, s :AI Pl_MOUSE, s :AI LP1_RABIT, sw: KB5_HUMAN, sw:AIP .OÜSE, sw:CYP4_BOVIN, sw: FKB4JHUMAN, sw: FKB5_ OUSE,sw:FKB4_MOUSE,sw:FKB4_RABIT,sw:CYP4__HUMAN, sw: FKB7_WHEAT, r:Q9XT11, r: Q9C65.0,tr:Q95L05,tr:Q9XSI2,tr:Q9LSF3,tr:Q38949,tr:Q07617,tr:Q9ü4Nl,tr:Q9VL78,tr:Q9LDC0,tr:O04843,tr:Q38931,tr:Q9XSH5,tr:Q9QZJ4,tn:AAM13008,tn:AAH152 60, te:Hs_75305_4,te:Os_10593_l,te:BJ463801, te:BJ467593, te:BQ481189,te:BQ57' 4171,te:W78674,te:At_5664_l,te:Dr_5498_2,te:Hs_153057_2,te:Hv_2313_l,te:Zm _2379_l,te:BJ468073,te:BJ463557,te:BJ466276,te:BQ458668,te:BQ425486,te:BG8 33626, te:Hs_75305_6,te:Hs_153057_3,te:Hv__6100_l,te:BI839989,te:BE222983,te :BG056407,te:At_25402_l,te:Bt_4797_l,te:Ta_6047_l,te:AV925548,te:BJ467976, te:BE455629,te:BQ287799,te:BQ205586,te:M_154390_2,te:Ta_65_l,te:Ta_639_l, te:BJ462559,te:BJ465793,te:AW473479,te:BG115973,te:BQ417256,te:At_36868_l, te:Bt_7221_l,te:Hs_7557_4,te:Ta_639_2,te:BJ463904, te:BF921901,te:Mm_75161_ l,te:BQ238312,te:BJ467770, e:BJ485644,te:BJ468521, te:BI563211,te:BM034859, te:BQ421312,te:BQ575087,te:BQ574529,te:.Dm_1764_l,te:Mm._12758_3,te:Pviι_8187_ 2,te:Rn_23741_2,te:Zm_3457_l,te:BJ483495,te:BJ462661,te:BJ465277,te:BJ4601 15,te:BJ4.52568,te:BQ'575306,tg:Apθ93196 37,tg:ACθ20203_5,tg:AC025647_4,tg::A L590962__2,.tg:AC082643_3,-tg:AB'026647_15,tg:AB077822_10,tg:AP001184_15,tg:AB 019232_10,tg:AC005135_13,tg:AP003474_7,tg:AC005841_4,tg:AE003626_64,tg:ALO 33519_4,tg:AL355494_2,to:NT_009759_3_6,to:NT_007978_123_l,to:NT_007978_123 _2,to:NT_009759_3_0,to:NT_007592_1412_0,to:NT_007592_1412_l,to:NT_007592_l
412_2,to:NT_009759_3_4,to:NT_007978_123_0.
Die Besclrränkung des Suchalgorithmus auf PPIasen, die in der Datenbank „Swissprot" zusamnengefaßt sind, ergibt folgende Enzyme:AIP_HUMAN, AIP_CERAE, AIP_MOUSE, AIPL1_HUMAN, AΓLP1_RAT, AILPl_MOUSE, AILP1_RABIT, FKB8_HUMAN, FKB8_MOUSE, FKB5_HUMAN, FKB5_MOUSE, FKB4 TUMAN, FKB4_MOUSE, FKB4_RABIT, FKB7_WHEAT, CYP4_BOVIN, CYP4_HUMAN. Ausführungsbeispiel 5: FKBP38 Inhibition mit FK506
Zum Nachweis der Inhibition der PPIase-Aktivität der CaMAP FKBP38 werden folgende Lösungen hergestellt: LösungH: DMSO; Lösungl: 15 mM Lösung an FK506 (Fujisawa GmbH) in DMSO. Entsprechend Ausfuhrungsbeispiel 1 werden zwei Küvetten mit 1 μl LösungB (Substrat); 0.5 μM FKBP38, 0.5μM Calmodulin und 5 mM Kalziumchlorid beschickt. Anschließend werden zu Küvette 5a 1 μl LösungH gegeben und zum Vergleich zu Küvette 5b 1 μl Lösungl. Nach Mischen der Lösungen werden die Küvetten jeweils für 20 Minuten bei 6 °C aufbewahrt. Danach erfolgt der Start der PPIase- Aktivitätsbestimmung wie in Beispiel 1 angegeben durch Zupipettieren von LösungC (Chymotrypsin). Bei Verwendung des Substrates Suc-Ala-Phe-Pro-Phe-NHNp ergibt die rechnerische Auswertung der Isomerisierungsgeschwindigkeit des Ansatzes in Küvette 5a einen Wert von 0.0071 s"1 und der Ansatz in Küvette 5b einen Wert von 0.0105 s"1. Der Wert von 0.0071 entspricht der unkatalysierten Reaktion in Abb. Ib. Der Wert von 0.0105 entspricht der katalysierten Reaktion von Abb. la. Die Progreßkurve ld entspricht der unkatalysierten Reaktion. Daraus folgt, die PPIase-Alctivität der CaMAP FKBP38 kann durch den FKBP-Inliibitor FK506 inhibiert werden. Eine Auftragung der hihibitorkonzentration gegen die ermittelte Enzymaktivität ergibt einen IC50-Wert von etwa 4.3 μM.
Ausführungsbeispiel 6: Suche nach Effektoren mittels Affinitätsassay
Dieser Screeningansatz, ausgeführt in Titerplatten (96 Wells, Flachboden'; Firnia Nunc- Diagnostik) ermöglicht die Suche nach Effektoren, welche die Interaktion zwischen wirksamen Calmodulin und aktivierbarer CaMAP stören. Dieser Assay wird als radioaktiver Assay durchgeführt. Folgende Vorbereitungen sind zu treffen: a) Herstellung des radioaktiv markierten Calmodulins: Mittels humaner SrC-Tyrosin- Kinase (Sigma: Bestellnummer 5439) wird Calmodulin (rekombinantes humanes Calmodulin, hergestellt entsprechend Ausführungsbeispiel 2) gezielt phosphoryliert. Dazu werden 10 μl Tyrosin-Kinase, 50 μl Calmodulin (1.2 mg/ml), lOμl 32Pgamma ATP (Amersham, frisch geliefert) in eine Gesamtvolumen von 80 μl für 3 Stunden bei 30 °C inlcubiert, wobei der Gesa tansatz bei einem pH von 7.5 neben Calmodulin und Tyrosinkinase noch 2 mM Kalziumchlorid, 50 mM Trispuffer, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, lOmM MgCl2, 1% Glycerol und 0.01% Tween enthält. Anschließend wird die Mischung in 500 μl einer Lösung aus 30%-igem Ammoniumsulfat und 50 mM Tris-Puffer pH 7.5 aufgenommen und auf eine Chromatografiesäule (Pierce, Minisäulen), welche mit 2 ml Phenylsepharose (Sigma) gefüllt ist und mit dem Auftragspuffer äquilibriert wurde gegeben. Nach dem Auftragen wird die Säule mit ca 50 Säulenvolumen gewaschen. Danach wird das radioaktiv markierte Calmodulin durch schrittweises versetzen der Säule mit einer Lösung bestehend aus 50 mM Trispuffer/30% Glycerin bei einem pH von 7.5 in Aliquotes von 100 μl abgelöst und getrennt in Gefäßen aufgefangen. Die Calmodulin enthaltenden Fraktionen können durch ihre ß-Strahlung mittels Scintillationsmessung detektiert werden und zu einer gemeinsamen Fraktion, üblicherweise ca 500 μl vereinigt werden. Mittels nicht-radioaktiv markiertem Calmodulin und FKBP38 (Herstellung siehe Ausführungsbeispiel 9) wird eine Calmodulin/FKBP38-Lösung hergestellt, welche eine Konzentration von 5 μM Calmodulin und 2.5 μM FKBP38 aufweist.
Herstellung der Antikörper markierten Titerplatten: Eine Lösung von IgG- gereinigten Antikörpern (erhalten durch Immunisierung von Kaninchen gegenüber HPLC gereinigtem FKBP38) wird in 12 Verdünnungsstufen (1+9; 1+99,1+999) in 10-er Schritten mit 20 mM Tris-Puffer pH 7.5 verdünnt. Von der Verdünnung wird in die 12 Spalten einer 96-er Titerplatte jeweils 50 μl pipettiert, so daß in der ersten Spalte die erste Verdünnung und in der 12. Spalte sich die Lösung mit der 12. Verdünnung befindet. Die Tif erplatte wird mittels Folie abgedeckt und für 12 Stunden bei 4 °C inkubiert. Danach wird der nichtgebundene Anteil des Antikörpers durch vorsichtiges 5 maliges Waschen mit Waschlösung (50 mM Tris-Puffer, pH 7.5; 0:1% Tween) entfernt und die Titerplatte zuletzt mit 50μl Waschlösung versehen. Die unter a erhaltene Calmodulin/FKBP38-Lösung wird nun ebenfalls in 10-er Verdünnungsschritten 8 mal mit Arbeitspuffer (lOμM Kalziumchlorid 50 mM Trispuffer, 1 mM DTT, 100 mM NaCl, 1% Glycerol und 0.01% Tween) verdünnt. Dann werden jeweils 1 μl dieser Verdüimungen so zur Titerplatte pipettiert, daß in Reihe 1 sich die 1+9, in Reihe zwei die 1+99 usw. Verdünnungen befinden. Nach Inkubation der Titerplatte für 1 Stunde bei 4 °C wird die Platte wiederum 5 mal mit Waschlösung gewaschen und anschließend für 1 Stunde auf einen 32P empfindlichen Screen (Amersham) gelegt und mittels Phosphoimager (FUJI-Diagnostik) vermessen und zugehöriger Software ausgewertet. Optimale Konzentrationen von CaMAP und Antikörper zur Durchf hrung des Assays sind den Kavitäten der Titerplatte zuzuordnen, welche eine hohe Radioaktivität aufweisen. Die Sensitivität des Assays ist in der Nähe des Übergangs von hoher zu niedriger Radioaktivität am größten.
c) Durchführung des Assays/Qualitätskontrόlle: Mit der unter b) ermittelten optimalen Konzentration an Antikörper und Calmodulin werden eine gewünschte Anzahl von Titerplatten, wie unter b) angegeben, präpariert. Fehlerhaft präparierte Platten oder Kavitäten können mittels angegebener Phosphoimaging-Prozedur herausgefunden werden. Der eigentliche Screening wird wie folgt durchgeführt: zu den 50 μl Waschlösung je Kavität werden 5 μl zu testender Wirkstoff pipettiert. Zur Qualitätskontrolle wird in 2 Kavitäten 5 μl einer 500 μM Lösung an EDTA pipettiert. Nach Inkubation der Platte bei 4 °C für 1 Stunde wird die Platte wiederum 5 mal mit Waschpuffer gewaschen um abgelöstes radioaktives Calmodulin abzuwaschen. Anschließend wird die verbliebene Radioaktivität mittels Phosphoimaging vermessen. Effektoren, die wie das unspezifische EDTA zur Verdrängung des aktivierenden Calmodulins von der CaMAP führen, erkennt man an der verminderten . Radioaktivität in diesen Kavitäten.
Ausführungsbeispiel 7: onipetitionsassay mit radioaktiv markiertem Liganden
Kompetationsassays für CaMAPs lassen sich unter Nutzung bereits bekannter Inhibitoren von CaMAPs wie Cyclosporin A oder FK506 aufbauen. Eine einfache Möglichkeit besteht in der Verwendung radioaktiv markierter Liganden, wie diese als Tritium markiertes FK506 (Transplantation. 63 (2). -293-298, 1997; Fujisawa GmbH) oder Tritium markiertes Cyclosporin A (Amersham) zugänglich sind. Eine mögliche Vorgehensweise, welche die Bindung von Calmodulin ah Titerplatten einbezieht, soll hier beschrieben werden: Genutzt wird, das Streptavidin gecoatete Mikrotiterplatten (z.B.:Roche-Diagnostik;Cat.No: 1734776) und Biotin-gelabeltes Calmodulin (Calbiochem; Cat.No:208697) kommerziell erhältlich sind, sowie ein handelsüblicher Mikrotiterplattenreader (Dynatech, MR7000) mit automatischer Dispensiereinheit und Wascher. In einem ersten Schritt wird nach den Vorschriften des Herstellers die gecoateten Titerplatten mit Calmodulin (0.5 μM Lösung, 30μl je Kavität) für 30 min bei Raumtemperatur versetzt. Nach 5-maligen Spülen mit Waschlösung (siehe Ausfuhrungsbeispiel 6) ist die Platte fertig und kann für mindestens 8 Stunden bei 4 °C gelagert werden. Unmittelbar vor Beginn des Kompetitionsassays wird die Platte mit 0.5 μM Lösung an FKBP38 (50 mM Trispuffer, pH 7.5; 5 mM CaCl2; 1 mM DTT; 0.5 mM Glycerol), wobei 30 μl je Kavität pipettiert werden, für 30 Minuten bei Raumtemperatur versetzt. Anschließend wird die Platte wiederum 5-mal schonend gewaschen. Ist die verwendete CaMAP durch Cyclosporin A inhibierbar, wird nachfolgend als radioaktiver Ligand das Tritium markiertes Cyclosporin A, wird die CaMAP wie FKBP38 durch FK506 inhibiert, wird als radioaktiver Ligand Tritium markiertes FK506 verwendet. Zur Durchführung des Assays werden je Kavität 0.5 μl Wirkstoff (lmg/ml in DMSO), sowie 30 μl Pufferlösung (50 mM Trispuffer, pH 7.5; 5 mM CaCl2; 1 mM DTT; 0.5 mM Glycerol), welche eine Konzentration von 50μM radioaktiv markiertem Liganden enthält, für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden jeweils 20 μl je Kavität entnommen, mit 1 ml Szintillationslösung (Roth) versetzt und mittels Quickzint Flow Counter. (Zinsser Analytic) vermessen. Potentielle Liganden werden an einem erhöhten Radioaktivitätssignal erkannt.
Ausftihruήgsbeispiel 8; Inhibition von Cyp40 durch Cyclosporin A
Cyp40, wird mole ulärbiölogisch entsprechend der in Acta Crystallographica Section D- Biological Crystallography. 55(Part 5):1079-1082, 1999 beschriebenen Weise hergestellt. Es. wird analog Ausführungsbeispiel 3 gearbeitet. Als Enzymlösung werden 1 μM Cyp4θ sowie 5 μM Calmodulin und 5 mM CaC12. gelöst in 50 mM HEPES-Puffer pH 7.5 verwendet. Als Effektorlösung werden 1 mg Cyclosporin A (Sigma C3662) in 50 %-igem Ethanol gelöst. Als Kontrollösung dient 50 %-ige Ethanollösung.
Der Vergleich der Messung mit und ohne Cyclosporin zeigt die für eine Inl ibierung typische Umsatzkurve.
Ausführungsbeispiel 9: Molekularbiologische Herstellung der CaMAP FKBP38
Nach Identifizierung der potentiellen CaMAP entsprechend Ausführungsbeispiel 5, wurde mittels IRALp962N1726Q2 (RZPD-Ressourcenzentrum GmbH, Berlin) und den Primern 38BspHI5 und h383-ma bei einer Annealing-Temperatur von 50 °C mit 1,5 mM MgCl und lμl Enhancer mit Pfx Polymerase ein PCR-Ansatz durchgeführt, wobei das Glycin in Position 2 gegen ein Arginin ausgetauscht wurde. Das PCR Produkt wurde gereinigt und mittels blunt end-Ligation in den pSTBlue-1 -Vektor kloniert. Das Produkt der Ligation wurde in E. Coli DH5 -Zellen transformiert. Positiv-selektierte Transformanten wurden auf eine Agarplatte mit Kanamycin übertragen und ihr Zellmaterial als Template einer Kolonie- PCR genutzt. Die PCR-Produkte der positiv selektierten Klone wurden isoliert und mit den Restriktionsendonucleasen Ncol und Sacl analytisch verdaut. Anschließend wurde die hFKBP381-336 Sequenz in pET28a kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde in Rosetta- Zellen transformiert.
Zur Herstellung von ca. 100 mg FKBP38 wurden sechs 1 1 Kulturen des Klons angezogen. Abweichend von den Standardbedingungen (Clontech/pET28a-Vector) wurden die Kulturen bei 20 °C angezogen. Weiterhin wurde 20 min vor Induktion durch Zugabe von Äthanol eine Endkonzentration von 2 % eingestellt. Nach Ernten und Aufschluß des Zellmaterials mittels French® Press, und nachfolgender Ultrazentrifugation wurde der Überstand mit 200 ml 10 mM MES-Puffer (pH 6,0) versetzt und nachfolgend verschiedenen chromatografischen .Reinigungsschritten wie Ionenaustausch- (DEAE, SO3 ") und Gelverteilungschromatografie (Sephadex G75) unterworfen.
Ausführungsbeispiel 10: Radioaktive Marlderung der CaMAP FKBP38
10 μl einer FKBP38-Lösung (0.2 mg/ml, Herstellung entsprechend Beispiel 9) werden mit 1 μl Proteinkinase A^ NΕB; Bestellnummer P6000L; Proteinmenge 1 mg/ml) bei einem pH von 7.5 (50 mM Trispuffer) und 200μM gamma32P-ATP (Amersham, 8 Curie per rnmol) für 1 Stunde bei 30 °C inkubiert. 32P markiertes FKBP38 wird mittels Gelfiltration von weiteren radioaktiven Bestandteilen gereinigt. Fig. 2 zeigt ein mittels SDS-PAGE und Phosphoimager erhaltenes Übersichtsbild der so hergestellten chromatografisch sauberen CaMAP.
Ausführungsbeispiel 11; Spektroskopisch nachweisbare Strukturänderung
CD-Spektren der Fig. 3a wurden bei 20 °C mit einem CD-Spektrometer (Jasco J-710 )und einer gekammerten 1 cm Küvette aufgenommen. Folgende Bedingungen wurden gewählt: Lösung A: 5 mM CaCl2, 10 μM FKBP38 in CD-Puffer; Lösung B: 20 μM Calmodulin (P nderhirn, Sigma) in CD-Puffer. CD-Puffer steht für eine Lösung aus 10 mM HEPES- Puffer und 5 mM Kalziumchlorid bei einem pH von 7.5. Die durchgezogene Linie entspricht der summarischen spektralen Änderung von Lösung A und B in verschiedenen Kammerhälften. Die gepunktete Linie zeigt ein typisches Spektrum welches nach Mischen beider Lösungen auftritt. Nach Zugabe von 1 M EGTA zur Mischung, wird das Spektrum erhalten, welches typisch für die nicht miteinander wechselwirkenden Proteine Calmodulin und FKBP38 ist (durchgezogene Linie).
Die Bedingungen die zu Fig. 3b führen, stimmen mit denen der Fig. 3a überein: Die gepunktete Linie zeigt das typische Spektrum nach Mischen beider Lösungen. Das Spektrum der durchzogenen Line wurde nach Erhöhen der Kalziumchloridkonzentration auf 10 mM erhalten. Diese Spektrum ist typisch für die Präzipitation von Proteinen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Effektors einer Calmodulin- abhängigen Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerase (CaMAP) bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer CaMAP oder eines CaMAP- Peptidfragments/derivats mit einer geeigneten Menge Calmodulin oder eines Calmodulinfragments/derivats in einer geeigneten Reaktionslösung mit und ohne den Effektor; (b) Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; (c) Messen der CaMAP-Aktivität; und (d) Nachweis, daß der Effektor (i) ein Inhibitor ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor; oder (ii) ein Aktivator ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektof größer ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor.
2. Verfahren zum Screening und/oder Herstellung eines Effektors einer CaMAP, bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer CaMAP oder eines CaMAP- Peptidfragments/derivats mit einer geeigneten Menge Calmodulin oder eines Calmodulinfragment/derivats in einer geeigneten Reaktionslösung mit und ohne eine Probe, die eine einzelne oder eine Vielzahl von Verbindungen enthält, die Kandidaten für einen Inhibitor oder Aktivator sind; (b) Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; (c) Messen der CaMAP-Aktivität; und (d) Nachweis, daß die Probe (i) inhibitorische Aktivität besitzt, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit der Probe kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne die Probe; oder (ii) aktivierende Aktivität besitzt, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit der Probe größer ist als in der Reaktionslösung ohne die Probe.
3. Verfahren nach Anspruch 2, zusätzlich umfassend den Schritt (e) Fraktionieren der Probe, für die in Schritt (d) inhibitorische oder aktivierende Aktivität festgestellt wurde, und Wiederholen der Schritte (a) bis (d), bis der in der Probe enthaltene Inhibitor oder Aktivator gereinigt vorliegt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die CaMAP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den humanen CaMAPs FBKP36, FKBP37.7, FKBP44, FKBP51, FKBP52 und Cyp40, und Enzymen, welche in de „Swissprof-Datenbank entsprechend der dort vorgenommenen Bezeichnung unter FKBP66, FKBP42, AIP_HUMAN, AΓP_CERAE, AΓP_MOUSE, AΓPLI_HUMAN, AILP1_RAT5 AILPl_MOUSE, AILPlJRABiT, FKB8 IUMAN, FKB8JMOUSE, FKB5_HUMAN, FKB5_MOUSE, FKB4_HUMAN, FKB4_MOUSE, FKB4_RABIT, FKB7_WHEAT, CYP4_BOVIN, und CYP4_HUMAN aufgeführt sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Calmodulin oder Calmodulinfragment/derivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CALM_ACHKL (P 15094), CALMJ3LAEM (Q9HFY6), CALM ANAL (P23286), CALM_CAPAN (P93087), CALM_CHLRE (P04352), CALM 3ICDI (P02599), CALM_DROME (P07181), CALM_ELEEL (P02594), CALM_EMENI (P19533), CALM_EUGGR (P11118), CALM_FAGSY (Q39752), CALM_HELAN (P93171), CALM_HORVU (P13565), CAL HUMAN (P02593), CALM_KLULA (O6Ö041), CALM_LYCES (P27161), CALM_LYTPI (P05935), CALM_MAGGR (Q9UWF0), CALM_MAIZE (P41040), CALM_MALDO (P48976), CALM_MEDSA (P17928),CALM_METSE (P02596), CALM_NEUCR (Q02052), CALM_ORYSA (P29612), CALM ARTE (P07463), CALM_PATSP (P02595), CALM_PHYIN (P27165), CALM_PLAFA (P24044), CALM_PLECO (PH 120), CALM_PNECA (P41041), CALMJPYUSP (PH 121), CALM_SCHPO (P05933), CALM_SOLTU (P13868), CALM_SPIOL (P04353), CALM_STIJA (P21251), CALM_STRPU (P05934), CALM_STYLE (P27166), CALM_TETPY (P02598), CAL TETTH (Q05055), CALM_TRYBB (P04465), CALM_TRYCR (P18061), CALM_WHEAT (P04464), CALM_YEAST (P06787), Q9UWF0, Q02052, P 19533, AAL89686, Q7M510, Q96TN0, P27165, AAG01043, P02593, Q7T3T2, Q40302, O02367, Q95NR9, Q9UB37, AAH54805 AAH54973, AAL02363, AAH59427, AAH59500, AAH54600, AAH53150, AAH50926, AAH45298, AAH44434, AAP88918, AAP35501, AAP35464, BAC56543, AAC83174, AAD55398, AAC63306, AAD45181, AAH21347, BAC40168, BAB28631, BAB28319, BAB28116, BAB23462, AAH58485, AAH51444, AAH47523, P07181, Q7QGY7, Q8STF0, AAO25039, AAM50750, AAK61380, BAB89360, 094739, P02594, Q9D6G4, O16305, Q96HK3, P11120, O96102, P21251, Q9U6D3, Q8X187, O93410, AAR10240, P11121, Q9XZP2, Q42478, AAQ01510, P17928, P93171, 097341, O96081, AAD10244, AAM81203, AAA34238, AAA34014, AAA34013, P02596, P93087, Q43699, CAD20351, BAB61916, BAB61915, AAF65511, P02595, P59220, P27162, Q93VL8, Q39447, Q94801, AAQ63462, AAQ63461, AAM81202, BAB61918, BAB61917, BAB61914, BAB61913, BAB61912, BAB61911, BAB61910, BAB61909, AAG2743.2, AAG11418.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die geeignete Reaktionslösung zweiwertige Ionen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zn , Cu , Co , Ni , Mh2+, Ca2+ und/oder Mg2+ in einer Konzentration von 0.1-20 mM enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Reaktionslösung einen pH- Wert zwischen pH 5 und pH 10 hat.
8. Verfahren zur Identifizierung und/oder Herstellung eines Effektors einer CaMAP bestehend aus den Schritten (a) Mischen geeigneter Mengen einer konstitutiv aktiven CaMAP in einer geeigneten Reaktionslösung mit und ohne den Effektor; (b) Zugabe einer geeigneten Menge eines geeigneten CaMAP-Substrates; (c) Messen der CaMAP -Aktivität; und (d) Nachweis, daß der Effektor (i) ein Inhibitor ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor kleiner ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor; oder (ii) ein Aktivator ist, wenn die CaMAP-Aktivität in der Reaktionslösung mit dem Effektor größer ist als in der Reaktionslösung ohne den Effektor.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche .1 bis 8, wobei die Abfolge von Schritt (a) und Schritt (b) vertauscht ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Nachweis durch spektroskopische oder radioaktive Methoden erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren als Hochdurchsatzverfahren durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiterhin umfassend den Schritt: (f) Formulieren des identifizierten und/oder hergestellten Effektors mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Lösungsmittel.
13. Verbindung identifiziert nach einem der Verfahren 1 bis 11, wobei der Effektor ein Cycloheximid-Derivate mit der allgemeinen Formel (1) ist:
in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet; R12 unabhängig ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest oder Arylrest bedeutet,
R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N-NR R ausgewählt wird, wobei a) R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Aryl bzw. Alkyl, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 substituiert sein kann, oder b) R2 und R3 zusammen Cι-C6-Alkylen ist, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, oder Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 substituiert sein kann, wobei R5 einen Alkylrest oder einen Arylrest darstellt, R6 für ein Wasserstoffatom, Alkyl, Aryl, OR5, C(O) OR5, CN, F oder Cl steht, wobei R5 wie vorstehend definiert ist, R7einen Rest -OH, -OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9 oder -OC(S)NHR9 darstellt, wobei
R9 einen Alkyhest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloallcyl oder Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann, oder alternativ
R9 einen Arylrest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH oder NR5 unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann, R?0 einen Rest -NHR2, -NR2R3, -C(O)OR2, -C(S)OR2, -C(O)NR2R3, -CN, - NR2C(O)NR2R3, -OC(O)NR2R3, -NR2C(S)NR2R3, -0C(S)N R2R3, oder OR2, C(O)NΗR*" ** darstellt, wobei R2 und R3 wie vorstehend definiert sind, R11 für einen Aminosäurerest oder Oligopeptidrest steht und R14 ein Alkyhest oder Arylrest ist.
14. Verbindung identifiziert nach einem der Verfahren 1 bis 11, wobei der Effektor ein Cycloheximid-Derivate mit der allgemeinen Formel (1) ist, in der n eine ganze Zahl von 1 bis 20 bedeutet und zwischen R15 und dem Gesamtmolekül eine Ethergruppierung besteht, wie in untenstehender Formel (2) ausgeführt,
R 15
R1 aus einem Sauerstoffatom, einem Schwefelatom oder den Gruppen NR2, NOR2 und N-NR2R3 ausgewählt wird, wobei a) R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Aryl bzw. Alkyl, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R substituiert sein kann, oder b) R2 und R3 zusammen Ci-C6-Alkylen ist, das gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl, oder Heterocycloalkyl- unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 substituiert sein kann, wobei R5 einen Alkyhest oder einen Arylrest darstellt, R6 für ein Wasserstoffatom, Alkyl, Aryl, OR5, C(O) OR5, CN, F oder Cl steht, wobei R5 wie vorstehend definiert ist, R7einen Rest -OH, -OR9, -OC(O)R9, -OC(S)R9, -OC(O)NHR9 oder -OC(S)NHR9 darstellt, wobei R9 einen Alkylrest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH, NR5, Aryl, Heteroaryl, Cycloalkyl oder Heterocycloalkyl unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann, oder alternativ R9 einen Arylrest darstellt, der gegebenenfalls durch O, S, NH oder NR5 unterbrochen sein kann oder gegebenenfalls durch R6 wie vorstehend definiert substituiert sein kann, Ru für einen Aminosäurerest oder Oligopeptidrest steht, R14 ein Wasserstoffatom ist, und R15 ein Wasserstoffatom, Alkylrest oder Arylrest ist.
15. Verbindung nach Anspruch 13 oder 14 mit der vorgenannten Formel (1) für die gilt: (a) n = 1, 2, 3; R = O; R7*= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)CH3; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2. (b) n = 3-10; R = O; R7= OH; R10= C(O)NHRπ, Rπ= Aminosäurerest, Oligopeptidrest. (c) n = 1, 2, 3; Rl= O; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2. (d) n = 1, 2, 3; Rl= NOH, N-NHPh, N-NHCH3, N-Alkyl, N-Benzyl; R7= OH, O(CHR12)nR10; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2. (e) n = 1, 2, 3; R*-= O; R7= OH, O(CHR12)nR10, OC(O)NH- Alkyl, OC(O)NH- Cycloalkyl, OC(O)NH-Aryl; R10= C(O)OCH3, C(O)OC2H5, CN, C(O)NH2.
6. Verbindung nach Anspruch 13 bis 15 mit der vorgenannten Formel:
17. Effektor nach einem der Ansprüche 1 bis 16 optional mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Lösungsmittel.
18. Verwendung eines Effektors nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumorerkrankungen.
19. Verwendung eines Effektors nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder Verminderung von Transplantatabstoßung oder zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen.
20. Kit umfassend die CaMAP oder ein Peptidfragment/derivat wie beschrieben in Anspruch 1 oder 4, und Calmodulin oder ein Cahnodulinfragment/derivat wie beschrieben in Anspruch 1 oder 5, eine oder mehrere Pufferlösungen und/oder ein oder mehrere Substrate.
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