EP1685384A1 - Verfahren und vorrichtung zur erfassung von verschiedenen zelltypen von zellen in einer biologischen probe - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur erfassung von verschiedenen zelltypen von zellen in einer biologischen probe

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Publication number
EP1685384A1
EP1685384A1 EP04797673A EP04797673A EP1685384A1 EP 1685384 A1 EP1685384 A1 EP 1685384A1 EP 04797673 A EP04797673 A EP 04797673A EP 04797673 A EP04797673 A EP 04797673A EP 1685384 A1 EP1685384 A1 EP 1685384A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
image
cells
biological sample
color information
color
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04797673A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heiko Volk
Thomas Wittenberg
Robert Coronne
Matthias Grobe
Christian MÜNZENMAYER
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Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP1685384A1 publication Critical patent/EP1685384A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1468—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle
    • G01N2015/1472—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry with spatial resolution of the texture or inner structure of the particle with colour

Definitions

  • FIG. 3 shows the steps for color normalization according to a preferred exemplary embodiment of the present invention.
  • FIG. 1B schematically shows the microscope hardware 110 used according to the invention, which, as indicated schematically by the arrow 112, receives the smeared and stained blood on the slide 108.
  • the hardware of the microscope 110 includes a movable cross table, not shown, on which the slide 108 is arranged, controllable optics and lighting, and a CCD color camera with a frame grabber.
  • the slide 108 which is arranged on the movable cross table, is displaced by means of the same under the microscope, in order to carry out a digitization 114 of the blood sample arranged on the slide 108.
  • a cell classification 140 according to which it is decided on the basis of the features obtained to which cell type the individual cell belongs. All results of the cell classification 140 of the entire sample, that is to say all the processed individual images 120 1 to 120 n, form the differential blood count 142 which is output at the end.
  • the color standardization 128 ensures that differently colored samples 109 are standardized to a “standard sample” with a defined color distribution and optionally defined illumination.
  • the images 120 1 to 120 n received at the input 126 have a certain and always the same color distribution in order to ensure that the classification of the individual blocks can be carried out correctly.
  • Conventional methods use methods, such as the color calibration of cameras, to ensure stable and constant recording of the images.
  • the disadvantage of this approach is that it is static and is calculated only once. These methods are therefore inflexible, especially if something changes in the color of the sample material. In this case, the known color calibration no longer matches the situation and must be recalculated.
  • the disadvantage is obvious, since a time expenditure and possibly an additional user interaction are required here, which is not practical for an automatic system as is aimed at according to the invention.
  • the histogram can be recalculated for each image and each color channel. For this purpose, the locations measured in the actual image for a color channel are shifted to the locations previously defined and defined for this channel, and values in the histogram between the three extremes are linearly interpolated. This is carried out for each channel, so that a standardized image with a known and defined color distribution results.
  • the pixel block classification 130 a plurality of pixels in the received digital image are combined to form a block and the corresponding block is assigned to a class.
  • the possible classes are the background, red blood cells (erythrocyte), white blood cells (leukocyte) and the nucleus of white blood cells.
  • this method can also be used for other classes and other problems, in which case a corresponding adjustment of the color distribution in color normalization step 128 must then be carried out.
  • FIG. 2 and 3 again show the main steps of the color normalization 128 and the pixel block classification 130 just described.
  • the individual steps of the pixel block classification are shown again in FIG. 2, the step 130a, as mentioned, here
  • the digital color image is broken down into blocks of 8 x 8 pixels.
  • block 130b the mean color value per channel is calculated for each block, and then at 130c, depending on the color value calculated for each channel, the block is classified as a background, erythrocyte, leukocyte or leukocyte nucleus.
  • a cell group determination 132 is carried out, in which the classified blocks are combined into two classes according to the preferred exemplary embodiment.
  • the first class is referred to as "background” and comprises the blocks which were classified as background or as red blood cells in step 130.
  • the second class is the "white blood cells” class and comprises those in step 130 as white blood cells or nuclei of the white blood cells classified blocks. This information is in the form of a binary image which is made available to the subsequent cell separation.
  • the individual cells 136 present in this way are fed to the feature calculation 138 in order to acquire predetermined features which are characteristic of individual cell types, in order to then determine at 140 corresponding cell types for the single cell based on the so-called features.
  • the color image data can thus also be described in the HSV color frame or in the L * u * v * color space. For this, the RGB data obtained can be converted into the corresponding color spaces. The RGB data can also be transferred to other known color spaces.
  • the present invention is not limited to the recording of a 3-channel image, and the image can be generated by an n-channel, n ⁇ 2, recording.
  • the channels can also contain other multi-spectral data / information, such as Information based on the IR rays, UV rays and X-rays, etc.
  • the steps described therein in connection with the color normalization and the pixel block classification can also be used individually in the detection of other cell types.
  • the color standardization described above can also be used in isolation from the other steps in other classification methods in which it is necessary to provide images with a uniform color distribution.

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Abstract

Bei einem Verfahren und einer Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biologischen Probe wird ein Bild (1201 - 120n) der biologischen Probe (109) bereitgestellt. Dieses Bild (1201 - 120n) wird bezüglich einer Verteilung der Bildwerte normiert und das normierte Bild wird anschließend in eine Mehrzahl von Bildabschnitte zerlegt. Jeder Bildabschnitt wird einer vorbestimmten Klasse, abhängig von vorbestimmten Eigenschaften des Bildabschnitts, zugeordnet. In jedem Bildabschnitt werden die Einzelzellen erfaßt und Merkmale dieser Einzelzellen bestimmt. Anschließend werden die Einzelzellen basierend auf den erfaßten Merkmalen einem bestimmten Zelltyp zugeordnet.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zeil ypen von Zellen in einer biologischen Probe
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zell- typen von Zellen in einer biologischen Probe, und hier insbesondere auf ein Verfahren und auf eine Vorrichtung für die automatische Erstellung eines Differential-Blutbildes basierend auf digitalisierten mikroskopischen Aufnahmen von Blutausstrichen mit Hilfe von Bildverarbeitungsverfahren.
Bei fast jedem Patient, der in eine Klinik eingewiesen wird, wird eine Blutprobe entnommen, welche der Diagnostik des Patienten dienen soll. Je nach Diagnosevermutung werden dabei von dem betreuenden Arzt unterschiedliche Blutunter- suchungs-Methoden angeordnet. Eine solche Blutuntersuchung stellt das sogenannte Differential-Blutbild dar. Mit Hilfe des Differential-Blutbildes lassen sich unterschiedliche Ursachen einer gegebenen Krankheit, wie z.B. Entzündungen, Infektionen, allergische Reaktionen, HIV, Leukämien, etc. diagnostizieren.
Als Diagnosegrundlage dient hier das Differential-Blutbild, welches genau angibt, welche Untergruppe der Leukozyten (weiße Blutkörperchen) wie oft im Blut vorkommen. Unter- schiedliche, von der normalen Verteilung abweichende Ergebnisse lassen dann auf die einzelnen Ursachen schließen. Die Auswertung, sprich die Zählung von Untergruppen der Leukozyten wurde lange Zeit manuell unter dem Mikroskop von einer ausgebildeten Fachkraft durchgeführt. Um diese ermüden- de Arbeit zu erleichtern, wurden nach und nach spezielle, sogenannte Blutbildautomaten entwickelt, welche diese Zählung übernehmen. Der Stand der Technik im Bereich automatisierter Blutbildautomaten beschränkt sich auf Automaten, denen ein chemisch-physikalisches Prinzip zugrunde liegt. Gemäß diesem Prinzip wird eine Blutprobe durch ein flüssigkeits- basiertes Verfahren soweit verdünnt, das jeweils nur eine einzige Zelle durch eine Meßkapillare zieht. Während des Durchflusses durch diese Meßkapillare werden von jeder Zelle charakteristische Informationen gewonnen, die es erlauben, die Zelle einer bestimmten Untergruppe zuzuordnen. Im Laufe der Jahre hat sich die Durchflußzytometrie in der Erstellung eines automatischen Differential-Blutbildes in den Labors vieler Krankenhäuser und Praxen bewährt und etabliert. Die meisten dieser durchflußzytometrischen Automaten erlauben es, Differential-Blutbilder von normalen und auf- fälligen Blutproben robust und reproduzierbar zu erstellen.
Jedoch treten in Kliniken, neben den normalen, vor allem auch aufwendige, durch unterschiedliche physiologische und biologische Prozesse veränderte Blutbilder auf, welche von den erwähnten durchflußzytometrischen Automaten nicht präzise genug analysiert werden können. In der Regel wird eine solche Probe von einem solchen bekannten Automaten als auffällig eingestuft und eine manuelle Untersuchung des Objektträgers unter dem Mikroskop durch eine geschulte Fach- kraft vorgenommen. Die Größenordnung für die manuell zu untersuchenden Proben liegt hier bei etwa 50 % der dem Automaten zugeführten Proben. Die manuelle Auszählung der Leukozyten unter dem Mikroskop stellt eine für die Fachkraft ermüdende Arbeit dar, die sich, bedingt durch die Arbeit am Mikroskop, auch in gesundheitlicher Weise auswirken kann.
Neben der oben erwähnten Erzeugung eines Differential- Blutbildes sind ähnliche Schritte, nämlich eine anfängliche automatisierte Probenuntersuchung gepaart mit einer nach- folgenden manuellen Untersuchung von auffälligen Proben auch in anderen Bereichen bekannt, so beispielsweise bei der Untersuchung von anderen menschlichen Zellen, vor allem bei der Lokalisation und Klassifikation bzw. Erkennung von dysplastischen (tumorartigen Vorstadien) Zellen der Zervix (Gebärmutterhals) von Frauen und anderen, auf der Zellanalyse basierenden Diagnoseverfahren.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der vorliegen- den Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Ver¬ fahren und eine verbesserte Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biologischen Probe zu schaffen, das basierend auf einer Aufnahme einer beispielsweise als auffällig eingestuften Probe eine Aus- ertung derselben durchführt und die verschiedenen Zellty¬ pen und deren Häufigkeit in der Probe ausgibt, ohne daß weitere manuelle Schritte durch eine Fachkraft erforderlich wären.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und durch eine Vorrichtung nach Anspruch 13 gelöst.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biolo- gischen Probe, mit folgenden Schritten:
(a) Bereitstellen eines Bildes der biologischen Probe;
(b) Normieren des Bildes der biologischen Probe bezüglich einer Verteilung von Bildwerten in dem Bild, um ein normiertes Bild zu erhalten;
(c) Zerlegen des normierten Bildes in eine Mehrzahl von Bildabschnitte ;
(d) Zuordnen jedes Bildabschnitts der Mehrzahl von Bildabschnitte zu einer vorbestimmten Klasse, abhängig von vorbestimmten Eigenschaften des entsprechenden Bildab¬ schnitts;
(e) Erfassen der Einzelzellen oder der Zellgruppen durch Zusammenfassen von Bildabschnitten der gleichen Klas¬ se; (f) Erfassen vorbestimmter Merkmale aus den Einzelzellen oder den Zellgruppen; (g) Zuordnen der Einzelzellen zu verschiedenen Zelltypen basierend auf den erfaßten Merkmalen.
Im Schritt (e) wird z.B. das Leukozytplasma und der Kern weißer Blutkörperchen zu einer Einzelzelle „weißes Blutkör- perchen" bzw. zu einer Zellgruppe „weiße Blutkörperchen" zusammengefasst . Alternativ oder zusätzlich wird das Plasma und der Kern roter Blutkörperchen zu der Einzelzelle „rotes Blutkörperchen" bzw. zu dem Zellbereich „rote Blutkörperchen" zusammengefasst. Hintergrund ist und bleibt (uninte- ressanter) Hintergrund.
Nach dem Schritt (e) kann gemäß einem Ausführungsbeispiel vorgesehen sein, Einzelzellen aus den Zellgruppen zu erfassen, z.B. durch Teilung der Zellgruppe in Bildabschnitts- gruppen. Sollte der zusammengefasste Bereich zu groß sein (oder anderen Kriterien unterliegt) , wird davon ausgegangen, dass es sich um eine Gruppe von sich berührenden Zellen handelt und dann wird dieser Bereich in Einzelzellen getrennt.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird das Bild durch eine mehrkanalige Aufnahme erzeugt, wobei die Kanäle unterschiedliche Farbinformationen oder andere multispektrale Informationen enthalten. Wenn die Kanäle Farbinformationen enthalten, kann es sich hierbei um Informationen bezüglich der Farbe des Bildes, bezüglich der Luminanz und der Chrominanz des Bildes oder bezüglich des Farbtons, der Sättigung und des Wertes des Bildes handeln. Die multispektralen Informationen können auf Aufnahmen durch IR-Strahlen, UV-Strahlen und Röntgenstrahlen basieren.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel ist für den Fall, daß die Kanäle unterschiedliche Farbinformationen enthalten, vorgesehen, daß im Schritt (b) für jeden Bildabschnitt ein Farbinformationswert für jeden Kanal erfaßt wird, ein Mittelwert für jeden Kanal basierend auf den erfaßten Farb- informationswerten gebildet wird, und der Bildabschnitt ba- sierend auf den für jeden Kanal bestimmten Mittelwert zu der Klasse zugeordnet wird. Ferner kann vorgesehen sein, die Klassifikation bzw. Zuordnung eines Bildausschnitts zu einer Klasse basierend auf einem oder mehreren Bildabschnitten, die den betreffenden Bildabschnitt umgeben, zu verifizieren.
Vorzugsweise wird das Bild als digitales Bild bereitgestellt, und die Zerlegung erfolgt durch Festlegung der Bildabschnitte basierend auf einer vorbestimmten Anzahl von Pixeln. Weiterhin vorzugsweise werden für die Zuordnung zu den Klassen die Farbwerte (RGB) des Bildes herangezogen.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung erfolgt die Normierung des ' Bildes vor der Unterteilung bzw. Zerlegung des Bildes in die Bildabschnitte basierend auf einer statistischen Verteilung verschiedener Bildwerte in dem Bild, wobei es sich hier vorzugsweise um Farbinformationen des Bildes handelt. In diesem Fall erfolgt die Summierung basierend auf einem Histogramm der Farbinformationen. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind jedem Kanal für eine zugeordnete Farbinformation mindestens zwei Maxima und ein von denselben eingeschlossenes Minimum an jeweils vorbestimmten Orten zugeordnet. Die Normierung erfolgt derart, daß zunächst die in dem Histogramm eines Farbkanals des Bildes enthaltenen Maxima und das Minimum bezüglich deren Ortes berechnet wird und anschließend eine Verschiebung der berechneten Orte an die Orte durchgeführt wird, die dem betrachteten Kanal zu- geordnet sind. Farbinformationen zwischen den Extremwerten werden durch Interpolation zwischen den Maxima und dem Minimum erhalten. Bei digitalen Aufnahmen von Blutzellen erhält man ein "typisches" Histogramm mit zwei deutlichen Maxima und folglich einem Minimum dazwischen.
Bei einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zusätzlich, vor dem Schritt des Erfassens der Einzelzellen, die Zusammenfassung einzel- ner Bildabschnitte in bestimmte Klassen, um entsprechende Bildbereiche festzulegen. Weiterhin vorzugsweise kann das erfindungsgemäße Verfahren die zusätzlichen Schritte des Bestimmens der Anzahl von Einzelzellen pro Zellentyp und das Ausgeben dieser Anzahl umfassen.
Die vorliegende Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biologischen Probe, mit
einem Eingang zum Empfangen eines Bildes der biologischen Probe;
einer Signalverarbeitungseinrichtung, die angepaßt ist, um das an dem Eingang anliegende Bild der biologischen Probe zu empfangen, das empfangene Bild bezüglich einer Verteilung der Bildwerte zu normieren, das normierte Bild in eine Mehrzahl von Bildabschnitte zu zerlegen, die Bildabschnitte abhängig von vorbestimmten Eigenschaften jeweils vorbestimmten Klassen zuzuordnen, Einzelzellen in den Bildab- schnitten zu erfassen, vorbestimmte Merkmale der Einzelzellen zu bestimmen, und die Einzelzellen verschiedenen Zelltypen zuzuordnen, basierend auf den bestimmten Merkmalen und der Klasse des zugeordneten Bildausschnitts, in dem die Einzelzelle enthalten ist;
einem Ausgang zum Bereitstellen der von der Signalverarbeitungseinrichtung festgelegten Zelltypen. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt die Vorrichtung ferner einen Probeneingang zum Empfangen der biologischen Probe und ein Mikroskop mit einer zugeordneten digitalen Kamera, z.B. einer CDD-Kamera, zum Erzeugen eines digitalen Bildes der biologischen Probe und eines Ausschnitts derselben. Die Signalverarbeitungseinrichtung, beispielsweise ein Personalcomputer, ist ferner angepaßt, um das digitale Bild zu empfangen und entsprechend zu verarbeiten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird somit ein System geschaffen, das die Vorgehensweise der im Stand der Technik erforderlichen Fachkraft „nachahmt" und mittels digitaler Bildverarbeitung die Analyse der Probe unter dem Mikroskop übernimmt und die Zellen automatisch klassifiziert und auszählt.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird für die Pixel-Block-Klassifikation das gesamte Bild in Blöcke aufgeteilt, im bevorzugten Ausfüh- rungsbeipsiel in Blöcke mit der Größe 8x8 Pixel. Diese Blöcke sind vorzugsweise nicht überlappend, was seinen Vorteil in der dadurch erreichbaren, höheren Verarbeitungsgeschwindigkeit hat, da letztendlich weniger Pixel betrachtet wer- den. Außerdem erhält das Verfahren so eine gewisse Stabilität gegen Rauschen (sog. "Pixelrauschen" verursacht durch die Digitalkamera, deren Signale immer etwas schwanken, auch wenn die aufgenommene Szene vollkommen gleich bleibt) . Insgesamt ist diese Verringerung der Auflösung des Bildes akzeptabel, da die Vergrößerung des Mikroskops und die physikalische Pixelauflösung der Kamera hoch genug sind, um auch in 8 x 8 Pixel großen Blöcken die entscheidenden Strukturen (Blutzellen, weiß und rot) erkennen zu können (ein relevantes Objekt enthält mehrere solcher Pixelblö- cke) . Für Fälle, bei denen eine noch präzisere Bestimmung der Ränder der Zellen nötig ist, lässt sich an der Grenze zweier unterschiedlich klassifizierter Blöcke (z.B. "Hintergrund" / "Leukozytplasma") das Verfahren in der originalen Vergrößerung wiederholen, um eben auch innerhalb der 8 x 8 Blöcke feiner abzugrenzen. Diese Vorgehensweise mit den unterschiedlichen Auflösungen wird in der Bildverarbeitung auch als "Hierarchischer Ansatz" bezeichnet. Grundsätzlich ist aber die Gruppierung in 8 x 8 Pixel große Blöcke ausreichend.
Für jeden der 8 x 8 Blöcke wird der mittlere Farbwert aus den vorliegenden Farbkanälen berechnet, im bevorzugten Ausführungsbeispiel RGB und anhand dessen wird jeder Block in die erforderlichen Klassen im bevorzugten Ausführungsbei- spiel der Blutzellen "Hintergrund", "Leukozytplasma", "Leukozytkern", "Erythrozytplasma" klassifiziert.
Erfindungsgemäß wird somit eine mehrfache Klassifikation durchgeführt: zuerst werden Pixelblöcke klassifiziert, qua- si in Hintergrund und Teile von Objekten, danach werden die relevanten Objekte (Plasma plus Kern der weißen Blutkörperchen) segmentiert (Zusammenfassung von Pixelblöcken und ggf wieder Teilung wenn sich Zellen berühren) , anschließend werden von diesen Merkmale berechnet (z. B. Größe, Form, Farbe der Objekte = Zellen, Fläche, Umfang, Rundheit, Granulation, und/oder Texturierung - jeweils von Zellkern und Plasma) und anschließend werden diese wieder klassifiziert in die durch die Medizin vorgegebenen Zelltypen der Leukozyten. Deren Vorkommen werden gezählt und als Histogramm präsentiert (z.B. "13 Leukozyten des Typs Promyelozyt, 42 des Typs..."). Es wird jedoch keine Diagnose erstellt. Es wird ein Ausdruck mit einem Histogramm erzeugt, welche Zelltypen der Leukozyten wie oft vorkommen (prozentual betrachtet) .
Neben dem oben beschriebenen „weißen" Blutbild existieren noch weitere "Blutbilder", die angefertigt werden können, z.B. "das rote Blutbild", "das große Blutbild", etc.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand der beiliegenden Zeichnungen nä- her erläutert. Es zeigen:
Fig. 1A bis IC ein Blockdiagramm, welches die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines bevorzugten Ausfüh- rungsbeispiels betreffend einen Differential-Blutbild-Automaten näher erläutert;
Fig. 2 die einzelnen Schritte zur Pixel-Block- Klassifikation gemäß einem bevorzugten Aus- führungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 3 die Schritte zur Farbnormierung gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorlie- genden Erfindung.
In Fig. 1 wird nachfolgend anhand einer schematischen Darstellung die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren anhand des Beispiels eines Differen- tial-Blutbild-Automaten näher erläutert.
Fig. 1A zeigt einen ersten Abschnitt 100 zur Proben- Separation. Hier wird durch an sich bekannte Maßnahmen eine Aufbereitung der biologischen Probe, einer Blutprobe, durchgeführt. Die Proben-Präparation 100 umfaßt die Blutentnahme 102. Das entnommene Blut wird, wie durch den Pfeil 104 verdeutlicht ist, einer weiteren Bearbeitung 106 be- reitgestellt, gemäß der ein Blutausstrich durchgeführt wird und eine Einfärbung desselben erfolgt. Die Proben- Präparation beinhaltet somit beispielsweise das Ausstreichen 106 des venösen Bluts auf einem Objektträger 108, so- wie das anschließende Färben des Objektträgers 108, beispielsweise unter Verwendung der bekannten May-Giemsa- Färbung. Auf dem Objektträger 108 ist schematisch die ausgestrichene und gefärbte Blutprobe 109 gezeigt.
Anhand der Fig. 1B ist schematisch die erfindungsgemäß verwendete Mikroskop-Hardware 110 gezeigt, die, wie schematisch durch den Pfeil 112 angedeutet ist, das ausgestrichene und gefärbte Blut auf dem Objektträger 108 empfängt. Die Hardware des Mikroskops 110 beinhaltet einen nicht näher gezeigten, verschiebbaren Kreuztisch, auf dem der Objektträger 108 angeordnet wird, eine steuerbare Optik und Beleuchtung, sowie eine CCD-Farbkamera mit einem Frame- Grabber. Der Objektträger 108, der auf dem verschiebbaren Kreuztisch angeordnet ist, wird mittels desselben unter dem Mikroskop verschoben, um so eine Digitalisierung 114 der auf dem Objektträger 108 angeordneten Blutprobe durchzuführen.
Die Digitalisierung 114 der Blutprobe 109 erfolgt derart, daß das Objekt mäanderförmig an der Blutprobe 109 vorbeigeführt wird, wie dies in Fig. 1A schematisch bei 116 gezeigt ist. Tatsächlich wird dieser Durchlauf dadurch erreicht, daß mittels des verschiebbaren Kreuztisches der Objektträger 108 mit der darauf angeordneten Blutprobe 109 entspre- chend an dem Objektiv vorbei bewegt wird. In der Regel werden während der Digitalisierung jeweils verschiedene Abschnitte der Blutprobe 109 digitalisiert und, wie dies schematisch durch den Pfeil 118 dargestellt ist, wird eine Mehrzahl von Einzelbildern 120χ bis 120n ausgegeben. Für den Fall, daß die Blutprobe 109 sehr klein ist, kann die Digitalisierung auch in einem Durchgang erfolgen und nur ein Einzelbild ausgegeben werden. Am Ausgang der Mikroskop- Hardware 110 wird, wie durch den Pfeil 122 schematisch dar- gestellt ist, das eine Einzelbild oder die mehreren Einzelbilder 120ι bis 120n für eine weitere Bearbeitung bereitgestellt.
Anhand der Figur IC wird nachfolgend die erfindungsgemäße Signalverarbeitungseinrichtung bzw. Bildverarbeitungseinrichtung, die beispielsweise in einem Computer implementiert ist, näher beschrieben. In dem Computer 124 ist die Bildverarbeitung implementiert, die an einem Eingang 126 das von der Mikroskop-Hardware 110 bereitgestellte Einzelbild oder eine Mehrzahl der Einzelbilder 120ι bis 120n aufeinanderfolgend empfängt.
Die Bildverarbeitung besteht aus Unterschritten Farbnormie- rung, Pixel-Block-Klassifikation, Zeilgruppenbildung, Zelltrennung, Bereitstellen der Einzelzellen, Merkmalsberechnung, Zeil-Klassifikation und Ausgabe des Differential- Blutbilds.
Die Farbnormierung 128 ist vorgesehen, um zu gewährleisten, daß unterschiedlich gefärbte Proben 109 auf eine „Standard- Probe" mit definierter Farbverteilung und gegebenenfalls definierter Beleuchtung normiert werden. Die anschließende Pixel-Block-Klassifikation 130 dient zur Zusammenfassung mehrerer Pixel des Bildes zu einem Block und die Zuordnung dieser Blöcke zu einer oder mehreren Klassen. Im Zusammenhang mit dem bevorzugten Ausführungsbeispiel betreffend die Differential-Blutbild-Analyse sind bevorzugte und mögliche Klassen der Hintergrund oder weiße Blutkörperchen. Nachfol- gend zu der Pixel-Block-Klassifikation erfolgt die Zuordnung der Blöcke zu bestimmten Zellgruppen 132, woran sich eine Zelltrennung 134 anschließt, um alle Zellen sicher zu vereinzeln, da es durchaus vorkommen kann, daß manche Zellen überlappend angeordnet sind oder aneinander angrenzen. Nachfolgend zu der Zelltrennung 134 liegen als Zwischenergebnis nur noch die Einzelzellen 136 vor. Für jede Einzelzelle 136 erfolgt eine Merkmalsberechnung 138, um aus den vorliegenden Einzelzellen entsprechende Merkmale zu gewin- nen, die für einzelne Zelltypen charakteristisch sind. Anschließend erfolgt eine Zeil-Klassifikation 140 gemäß der anhand der gewonnenen Merkmale entschieden wird, zu welchem Zelltyp die Einzelzelle gehört. Alle Ergebnisse der Zell- Klassifikation 140 der gesamten Probe, also aller verarbeiteten Einzelbilder 120ι bis 120n bilden das am Ende ausgegebene Differential-Blutbild 142.
Nachfolgend werden die gerade anhand der Fig. IC im Über- blick beschriebenen einzelnen Abschnitte des erfindungsgemäßen Ansatzes zur Erfassung von Zelltypen in einer biologischen Probe näher erläutert.
Die Farbnormierung 128 gewährleistet, daß unterschiedlich gefärbte Proben 109 auf eine „Standard-Probe" mit definierter Farbverteilung und gegebenenfalls definierte Beleuchtung normiert werden.
Für die anschließende Pixel-Block-Klassifikation 130 ist es notwendig, daß die am Eingang 126 empfangenen Bilder 120ι bis 120n eine bestimmte und stets gleiche Farbverteilung aufweisen, um sicherzustellen, daß die Klassifikation der einzelnen Blöcke korrekt durchgeführt werden kann. Herkömmliche Verfahren benutzen Methoden, wie z.B. die Farbkalib- rierung von Kameras, um eine stabile und gleichbleibende Aufnahme der Bilder zu gewährleisten. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, daß derselbe statisch ist und nur einmal berechnet wird. Diese Methoden sind somit unflexibel, insbesondere dann, wenn sich an der Färbung des Pro- benmaterials etwas ändert. In diesem Fall stimmt die bekannte Farbkalibrierung nicht mehr mit der Situation überein und muß neu berechnet werden. Der Nachteil liegt auf der Hand, da hier ein zeitlicher Aufwand und gegebenenfalls eine zusätzliche Benutzerinteraktion erforderlich ist, die für ein automatisches System wie es erfindungsgemäß angestrebt wird, nicht praktikabel ist. Das erfindungsgemäße Verfahren umgeht diese aus der Literatur bekannte Schwäche, indem jedes Bild 120ι bis 120n einzeln behandelt wird und einer bekannten und vorab definierten Farbverteilung angepaßt wird. Hierdurch wird sicherge- stellt, daß Änderungen in der Färbung und in der Aufnahme- technik auf einfache Art und Weise und präzise ausgeglichen werden können.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegen- den Erfindung wird für die Normierung der gefärbten Blutausstriche 109 eine auf den Farbwerten der empfangenen Einzelbilder 120ι bis 120n basierten Histogramm-Anpassung vorgenommen. Ein Farbhistogramm, welches auf dem roten Kanal, dem grünen Kanal und dem blauen Kanal der digitalen Kamera basiert, weist für einen typischen Ausschnitt eines digitalisierten Blutausstrichs zwei charakteristische Maxima und ein von diesen beiden Maxima eingeschlossenes Minimum in jedem Farbkanal (RGB) auf. Die Orte, an denen diese Extremstellen auftauchen, sind für jeden Kanal verschieden. Um eine Normierung eines Farbbildes in diesem Sinne zu erreichen, müssen für jeden Farbkanal des Bildes die Orte der Extrema berechnet werden und dem Verfahren bereitgestellt werden. Sobald diese Orte für alle Farbkanäle bekannt sind, kann das Histrogramm für jedes Bild und jeden Farbkanal neu berechnet werden. Hierzu werden die in dem tatsächlichen Bild für einen Farbkanal gemessenen Orte an die zuvor festgelegten und für diesen Kanal definierten Orte verschoben und Werte im Histogramm zwischen den drei Extrema werden linear interpoliert. Dies wird für jeden Kanal durchge- führt, so daß sich ein normiertes Bild mit bekannter und definierter Farbverteilung ergibt.
Bei der Pixel-Block-Klassifikation 130 werden mehrere Pixel in dem empfangenen digitalen Bild zu einem Block zusammen- gefaßt und der entsprechende Block wird einer Klasse zugeordnet. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel sind die möglichen Klassen der Hintergrund, rote Blutkörperchen (E- rythrozyt) , weiße Blutkörperchen (Leukozyt) und der Kern des weißen Blutkörperchens. Allgemein kann dieses Verfahren auch für andere Klassen und andere Problemstellungen benutzt werden, wobei hier dann eine entsprechende Anpassung der Farbverteilung im Farbnormierungsschritt 128 durchge- führt werden muß .
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein digitalisiertes Farbbild 120ι bis 120n eines Blutausschnitts 109 in Blöcke der Größen 8 x 8 Pixel unterteilt. Für jeden Block wird der mittlere Farbwert pro Kanal (R,G,B) berechnet. Die so erhaltenen drei Mittelwerte werden einem Klas- sifikator zugeführt, der den jeweiligen Block basierend auf den drei Mittelwerten einer der vier obengenannten Klassen zuordnet. Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist ein Verifikationsschritt vorgesehen, um eventuelle Fehlklassifikationen eines Blocks zu vermeiden. Eventuelle Fehlklassifikationen eines Blocks werden durch einen Vergleich mit der Umgebung des Blocks identifiziert und korrigiert, so daß das erfindungsgemäße Verfahren robuster gegen Beleuchtungsschwankungen ist.
Fig. 2 und 3 zeigen nochmals die gerade beschriebenen Hauptschritte der Farbnormierung 128 und der Pixel-Block- Klassifikation 130. In Fig. 2 sind die einzelnen Schritte der Pixel-Block-Klassifikation nochmals dargestellt, wobei hier, wie erwähnt, im Schritt 130a die Zerlegung des digitalen Farbbildes in Blöcke der Größe 8 x 8 Pixel erfolgt. Im Block 130b wird für jeden Block der mittlere Farbwert pro Kanal berechnet und anschließend wird bei 130c abhängig von dem für jeden Kanal berechneten Farbwert der Block als Hintergrund, Erythrozyt, Leukozyt oder Leukozytkern klassifiziert. In Fig. 3 sind die zwei Hauptschritte der Farbnormierung 128 noch mal dargestellt, wobei hier gemäß 128a zunächst für jeden Kanal des erzeugten Bildes ein Farb- histogramm erzeugt wird und anschließend bei 128b die Orte der Maxima und des Minimums in dem Histogramm an vorab festgelegte Orte eines Farb anals verschoben werden. Der Pixel-Block-Klassifikation 130 folgend wird eine Zell- gruppenfestlegung 132 durchgeführt, in der die klassifizierten Blöcke gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel zu zwei Klassen zusammengefaßt werden. Die erste Klasse wird als „Hintergrund" bezeichnet und umfaßt die Blöcke, welche im Schritt 130 als Hintergrund oder als rote Blutkörperchen klassifiziert wurden. Die zweite Klasse ist die Klasse „weiße Blutkörperchen" und umfaßt die im vorhergehenden Schritt 130 als weiße Blutkörperchen oder Kerne der weißen Blutkörperchen klassifizierten Blöcke. Diese Information liegt in Form eines Binärbildes vor, welches der nachfolgenden Zelltrennung bereitgestellt wird. Abhängig von der Art der zu erfassenden Zelltypen können nur einzelne oder alle der klassifizierten Blöcke der weiteren Verarbeitung zugeführt werden. Im Fall der Auswertung der Probe hinsichtlich der weißen Blutkörperchen ist es ausreichend nur die für die als „weißes Blutkörperchen" und „Kern eines weißen Blutkörperchen" klassifizierten Blöcke zu verwenden, wobei diese vorab noch einem gemeinsamen Zellgruppe zuge- ordnet werden.
Im Schritt der Zelltrennung 134 werden alle Zellen vereinzelt, da es vorkommen kann, daß manche Zellen aneinander stoßen oder überlappen. Um zu gewährleisten, daß auch sich berührende Zellen, also Einzelzellen erkannt werden, muß eine Zelltrennung vorgenommen werden. Hierzu wird das Binärbild aus dem Schritt 132 mit Hilfe der im Stand der Technik bekannten Abstands-Transformation behandelt. Nachfolgend zu dieser Transformation ist es möglich, die be- kannte sogenannte Wasserscheiden-Transformation anzuwenden, die mehrere berührende Zellen an der Berührungslinie auseinanderschneiden kann. Nach der Zelltrennung erfolgt eine Zusammenhangsanalyse des Primärbildes, um die Einzelzellen zu lokalisieren. Solchen Transformationen werden z.B. in den nachfolgend genannten Veröffentlichungen genannt.
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"Eine Erweiterung der Wasserscheiden-Transformation für die Farbbildsegmentierung (An Extension of the Watershed Transform for Color Image Segmentation)" In Proc. 6th German Workshop on Color Image Processing", A. Koschan and T. Harms, G. Stanke, M. Pochanke, Eds., Berlin, ISBN 3- 9807029-4-4, Seiten 5-12, Oktober 2000.
Die so vorliegenden Einzelzellen 136 werden der Merkmalsberechnung 138 zugeführt, um vorbestimmte Merkmale, die für einzelne Zelltypen charakteristisch sind, zu erfassen, um anschließend bei 140 basierend auf den sogenannten Merkmalen entsprechende Zellentypen für die Einzelzelle festzulegen.
Alle Ergebnisse der Zeil-Klassifikation der gesamten Probe formen das Differential-Blutbild 142, wobei hier vorzugsweise dem Benutzer die Anzahl der Zellen pro Zelltyp in einer medizinisch leicht verständlichen Art präsentiert werden. Gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden hier nur Zellsorten gezählt, also eine Art Meßsystem implemen- tiert. Die Interpretation dieser Ergebnisse bleibt einem fachkundigen Arzt überlassen.
Obwohl oben anhand der Figuren bevorzugte Ausführungsbeispiele beschrieben wurden, welche ein Farbbild als 3- kanaliges Bild verwendeten, ist die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt. Anstelle der RGB-Werte zur Cha- rakterisierung des Farbbildes können auch Informationen betreffend die Luminanz und die Chrominanz, L*u*v* oder Informationen bezüglich des Farbtons (H = Hue) der Sättigung (S = Saturation) und des Werts (V = Value) des Bildes zugrundegelegt werden. Die Farbbilddaten können somit auch im HSV-Farbrahmen oder im L*u*v* Farbraum beschrieben werden. Hierfür können die erhaltenen RGB-Daten in die entsprechenden Farbräume umgewandelt werden. Die RGB-Daten können auch in andere bekannte Farbräume übertragen werden.
Die vorliegende Erfindung ist ferner nicht auf die Aufnahme eines 3-kanaligen Bildes beschränkt, und das Bild kann durch eine n-kanalige, n ≥ 2, Aufnahme erzeugt werden. Neben den Farbdaten können die Kanäle auch andere multispekt- rale Daten/Informationen beinhalten, wie z.B. Informationen basierend auf den IR-Strahlen, UV-Strahlen und Röntgenstrahlen, etc.
Ferner ist hinsichtlich des oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsbeispiels darauf hinzuweisen, daß die dort beschriebenen Schritte im Zusammenhang mit der Farbnormierung und der Pixel-Block-Klassifikation jeweils für sich genommen auch bei der Erfassung von anderen Zelltypen eingesetzt werden können. Ferner kann die oben beschriebene Farbnor- mierung auch isoliert von den übrigen Schritten bei anderen Klassifikationsverfahren, bei denen eine Bereitstellung von Bildern mit gleichmäßiger Farbverteilung erforderlich ist, eingesetzt werden. Gleiches gilt für die Pixel-Block- Klassifikation, die unabhängig von den oben beschriebenen Verfahrensschritten auch bei anderen Klassifikationsverfahren eingesetzt werden kann.
Obwohl das bevorzugte Ausführungsbeispiel anhand der Verarbeitung eines einzelnen Bildes beschrieben wird, ist offen- sichtlich, daß abhängig von den Gegebenheiten auch mehrere Bilder sequenziell bearbeitet werden, wenn die Probe durch eine Mehrzahl von Bildern dargestellt ist, um so eine Analyse der Gesamtprobe sicherzustellen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biologischen Probe (109), mit folgenden Schritten:
(a) Bereitstellen eines Bildes (120χ bis 120n) der biologischen Probe (109) ;
(b) Normieren (128) des Bildes der biologischen Probe (109) bezüglich einer Verteilung von Bildwerten in dem Bild, um ein normiertes Bild zu erhalten; (c) Zerlegen (130a) des normierten Bildes in eine Mehrzahl von Bildabschnitte;
(d) Zuordnen (130, 130b, 130c) jedes Bildabschnitts der Mehrzahl von Bildabschnitten zu einer vorbe- stimmten Klasse, abhängig von bestimmten Eigenschaften des entsprechenden Bildabschnitts;
(e) Erfassen (132, 134, 136) der Einzelzellen oder der Zellgruppe durch Zusammenfassen von Bildab- schnitten der gleichen Klasse;
(f) Erfassen (138) vorbestimmter Merkmale aus den Einzelzellen oder den Zellgruppen; und (g) Zuordnen (140) der Einzelzellen zu verschiedenen Zelltypen basierend auf den erfaßten Merkmalen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Bild (120x bis 120n) im Schritt (a) durch eine mehrkanalige Aufnahme erzeugt wird, wobei die Kanäle unterschiedliche Farbinformationen (RGB, HSV, L*u*v*) oder andere multispektrale Informationen enthalten, wobei, wenn die Kanäle Farbinformationen enthalten, in den Kanälen In- formationen bezüglich der Farbe RGB des Bildes (120χ bis 120n) , bezüglich der Luminanz und der Chrominanz (L*u*v*) des Bildes (120ι bis 120n) oder bezüglich des Farbtons, der Sättigung und des Wertes (HSV) des Bil- des (120χ bis 120n) zugeordnet sind, und wobei die weiteren multispektralen Informationen auf Aufnahmen durch die R-Strahlen, UV-Strahlen und Röntgenstrahlen basieren.
3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Kanäle unterschiedliche Farbinformationen enthalten, und bei dem der Schritt (d) folgende Teilschritte für jeden Bildabschnitt umfaßt: (d.l) Erfassen von Farbinformationswerten für jeden Kanal;
(d.2) Bilden eines Mittelwerts (130b) für jeden Kanal basierend auf den im Schritt (d.l) er- faßten Farbinformationswerten, und
(d.3) Zuordnen des Bildabschnitts (130c) zu einer Klasse, basierend auf den für jeden Kanal bestimmten Mittelwerten.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Schritt (d) das Verifizieren einer Zuordnung eines Bildabschnitts zu einer Klasse basierend auf einem o- der mehreren Bildabschnitten, die den betroffenen Bildabschnitt umgeben, umfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem im Schritt (a) ein digitales Bild erzeugt wird, und bei dem im Schritt (c) eine vorbestimmte Anzahl von Pixeln zur Festlegung eines Bildabschnitts ausgewählt wird (130a) .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die im Schritt (d) für die Zuordnung zu den Klassen herangezogene Eigenschaft Farbwerte des Bildes umfaßt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem im Schritt (b) das Bild basierend auf einer statistischen Verteilung der verschiedenen Bildwerte in dem Bild normiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Bildwerte Farbinformationen für das Bild umfassen, und bei dem die Normierung auf einem Histogramm der Farbinformationen basiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem jeder Kanal für eine zugeordnete Farbinformation an vorbestimmten Orten zumindest zwei Maxima der Farbinformationen und ein von denselben eingeschlossenen Minimum der Farbinformationen umfaßt, und bei dem der Schritt (b) für jeden Kanal folgende Teilschritte umfaßt:
(b.l) Berechnen (128a) der Orte der Maxima und des Minimums in dem Bild, und (b.2) Verschieben (198b) der im Schritt (b.l) berechneten Orte an die dem betrachteten Kanal zugeordneten Orte.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem Farbinformationen zwischen den verschobenen Orten durch Interpolation zwischen den Maxima und dem Minimum bestimmt wurden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem vor dem Schritt (e) die Bildabschnitte zu bestimmten Klassen zusammengefaßt werden, um entsprechende Bildbereiche festzulegen (132) .
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, mit folgendem Schritt nach dem Schritt (e)
Erfassen von Einzelzellen aus den im Schritt (e) fest- gelegten Zellgruppen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, mit folgenden Schritten: (h) Bestimmen (142) der Anzahl von Einzelzellen pro Zellentyp; und
(i) Ausgeben der Anzahl.
14. Vorrichtung zur Erfassung von verschiedenen Zelltypen von Zellen in einer biologischen Probe (109), mit einem Eingang (126) zum Empfangen eines Bildes (120ι bis 120n) der biologischen Probe (109) ; einer Signalverarbeitungseinrichtung (124), die angepaßt ist, um das in dem Eingang anliegende Bild (120χ bis 120n) der biologischen Probe (109) zu empfangen, das empfangene Bild bezüglich einer Verteilung der Bildwerte zu normieren (128), das normierte Bild in eine Mehrzahl von Bildabschnitte zu zerlegen (130) , die Bilddaten abhängig von vorbestimmten Eigenschaften jeweils vorbestimmten Klassen zuzuordnen, Einzelzellen in den Bildabschnitten zu erfassen (132, 134, 136), vorbestimmte Merkmale der Einzelzellen zu bestimmen (138) , und die Einzelzellen verschiedenen Zelltypen zuzuordnen (140) , basierend auf den bestimmten Merkmalen und der Klasse der zugeordneten Bildabschnitts, in dem die Einzelzelle enthalten war; und einem Ausgang zum Bereitstellen der von der Signalverarbeitungseinrichtung (124) festgestellten Zelltypen.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, mit einem Probeneingang (112) zum Empfangen der biologischen Probe (109) ; und einem Mikroskop (110) mit einer zugeordneten digitalen Kamera zum Erzeugen eines digitalen Bildes (120ι bis 120n) , der biologischen Probe (109) oder eines Ausschnitts derselben; wobei die Signalverarbeitungseinrichtung (124) angepaßt ist, um das digitale Bild zu empfangen.
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