EP1658090A2 - Mittel und verfahren zur behandlung und prävention von tse sowie verfahren zur herstellung des mittels - Google Patents

Mittel und verfahren zur behandlung und prävention von tse sowie verfahren zur herstellung des mittels

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Publication number
EP1658090A2
EP1658090A2 EP04762583A EP04762583A EP1658090A2 EP 1658090 A2 EP1658090 A2 EP 1658090A2 EP 04762583 A EP04762583 A EP 04762583A EP 04762583 A EP04762583 A EP 04762583A EP 1658090 A2 EP1658090 A2 EP 1658090A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
thr
ser
pro
trp
leu
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04762583A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Willbold
Jörg SMOLINSKI
Karen Olga HÄNEL
Michael Andreas Wolff
Detlev Riesner
Carsten Korth
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1658090A2 publication Critical patent/EP1658090A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the invention relates to an agent and a method for the treatment and prevention of TSE and a method for producing the agent.
  • Prions have been identified as the main pathogen. Prions mainly consist of prion protein (PrP) in a pathogenic conformation (PrP Sc ). The healthy organism also produces prion protein, but in a non-pathogenic, harmless conformation (PrP c ). PrP c and PrP Sc have the same amino acid sequence, but show a significant difference in the secondary structure. PrP c contains a relatively high ⁇ -helical component and almost no ⁇ -sheet elements.
  • PrP Sc has a secondary structure that is different from PrP c , with a higher proportion of ß-leaflets and a lower proportion of o! Accordingly, PrP c and PrP Sc are structural isomers. In addition, unlike PrP, PrP is resistant to Protemase K digestion. PrP Sc seems to be formed post-translationally from PrP c . The emergence and development of the disease depend on the continued transformation development of PrP c in PrP Sc . The factors responsible for converting PrP c to PrP Sc are not all known yet.
  • the PrP Sc formation can be slowed down and even inhibited if certain peptides are supplied to prion-infected cells. It is assumed here that the peptides according to the invention attach to the PrP c and thus prevent the conversion of naturally occurring PrP c into the pathogenic PrP Sc . According to the invention, various peptides with partially characteristic amino acid sub-sequence blocks were identified which result in a relief of the symptoms or even a cure of the disease TSE. Exemplary peptides are given in sequences 1 to 27. The following sequences were identified as peptides which can be used according to the invention and can be read in the direction of amino to carboxyl terminus, one of which Component or a mixture of at least two components can be used for treatment:
  • G at least two components from at least one of groups A) to F);
  • Sequences 1-27 of the sequence listing which comprise or contain all 12 amino acids with positions 1-12. These sequences can have any length, preferably a length of 6-40, particularly preferably 8-30, 10-20 or even more preferably 10-12 amino acids. In some specific embodiments, the following sequences may be present, which are preferably 12 amino acids long.
  • amino acid sequences which contain the amino acids Leu, Lys, Ala, and Thr in positions 1, 2, 3 and 4;
  • K amino acid sequences which contain a combination of features I) and J); L) amino acid sequences which have the amino acids Gin, Trp and Thr in positions 4, 5 and 6;
  • N amino acid sequences which have the amino acids Thr and Tyr in positions 11 and 12;
  • Sequence sections I) -R) can be contained in sequences which, for example, have a length of 6-40, preferably 8-30, 30-20 and particularly preferably 10-12 amino acids.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequences (in the one-letter code) of the four active peptides which were identified in the phage display screening:
  • VDMINDVQPLTP Seq.Nr.2
  • VYSSTTRPLPSP Seq.Nr.10
  • the peptides according to the invention which bring about a healing of TSE or a relief can be produced by known processes.
  • SUBSTITUTE SHEET Synthesis in liquid medium can be used.
  • the amino acids are linked together in the sequence of the sequence in accordance with the sequence listing and the listings A) - R).
  • Solid phase peptide synthesis consists of three main steps:
  • the peptides can also be produced by expressing the nucleotide sequences coding for them, for example in chromosomes, plasmids or other information carriers, naked DNA or RNA in organisms, in cells or cell-free systems.
  • the invention therefore also relates to the nucleic acids which code for the peptides according to the amino acid sequences A) -R), including all allelic variations and the nucleotide sequences of the sequence sequences 1-27 including all allelic variations.
  • all mammals including humans can be treated or cured and the peptides can also be used for prevention. Treatment of humans is particularly preferred, but cattle and sheep can also be treated.
  • the peptides according to the invention accumulate the PrP c of all mammals so that the effect according to the invention can take place. The effect according to the invention also takes place when at least two of the peptides mentioned bind to the PrP c .
  • the peptides according to the invention can be used to treat the disease TSE both in humans and in animals.
  • Human diseases include Creutzfeld-Jakob syndrome, Kuru, Gerstmann-St Hurssler-Scheinker syndrome and FFI (Fatal Familial Insomnia).
  • TSE diseases are also known in animals, e.g. B. in sheep scrapie, in cattle bovine spongiform encephatlopathy (BSE) in wild animals chronic wasting disease (CWD).
  • BSE cattle bovine spongiform encephatlopathy
  • CWD chronic wasting disease
  • the peptides according to the invention must be applied in such a way that they reach their site of action. This place of action can be the brain, the spinal cord and / or the entire nervous system, but also any other part of the organism.
  • the peptides according to the invention can be introduced into the body in solid form or dissolved in a solvent, preferably water.
  • the peptides can be introduced into the nose as a solid, for example orally, rectally or as a powder.
  • the active ingredient according to the invention and the pharmaceutical composition can be in the form of liquid, semi-solid or solid pharmaceutical forms and in the form of, for. B. injection solutions, drops, juices, syrups, spray, suspensions, granules, tablets, pellets, transdermal therapeutic systems, capsules, plasters, suppositories, ointments, creams, lotions, gels, emulsions or aerosols are present and administered and contain the inventions 10
  • Peptides according to the invention in a physiologically compatible form and depending on the route of application pharmaceutical auxiliaries, such as. B. carrier materials, fillers, solvents, diluents, surface-active substances, dyes, preservatives, disintegrants, lubricants, lubricants, flavors and / or binders.
  • pharmaceutical auxiliaries such as. B. carrier materials, fillers, solvents, diluents, surface-active substances, dyes, preservatives, disintegrants, lubricants, lubricants, flavors and / or binders.
  • auxiliaries can be, for example: water, ethanol, 2-propanol, glycerin, fructose, lactose, sucrose, dextrose, molasses, starch, modified starch, gelatin, sorbitol, inositol, mannitol, microcrystalline cellulose, methyl cellulose, Carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, shellac, cetyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, paraffins, waxes, natural and synthetic rubbers, acacia gum, alginates, dextran, saturated and unsaturated
  • Fatty acids Fatty acids, stearic acid, magnesium stearate, zinc stearate, glyceryl stearate, sodium lauryl sulfate, edible oils, sesame oil, coconut oil, peanut oil, soybean oil, lecithin, sodium lactate, polyoxyethylene and propylene fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, sorbate
  • excipients and the amounts to be used depends on whether the medication is oral, subcutaneous, parenteral, intravenous, pul onal, intraperitoneal, transdermal, intramuscular, nasal, 11
  • the active ingredient can be in a depot in dissolved form or in a plaster, if necessary with the addition of skin penetrations, to promote skin penetration
  • Formulations which can be used rectally, transmucosally, parenterally, orally or percutaneously can release the peptides according to the invention in a delayed manner.
  • the peptides according to the invention can be administered in liquid form, for example, intravenously, orally, as a nasal spray, subcutaneously, intramuscularly, by inhalation or in or next to the spinal cord.
  • the active compounds according to the invention can be applied by means of ointments or creams.
  • the peptides according to the invention can arise at the site of action or at other locations in the organism after nucleic acids (DNA and RNA or a combination thereof) which code for the peptides according to the invention are introduced into the organism.
  • viral vectors naked nucleic acid (DNA, RNA), plasmids, artificial virus particles, liposomes, which are introduced into the body intravenously, intranasally, orally, rectally, subcutaneously, intramuscularly, in or on the spinal cord. 12
  • the peptides according to the invention can also be used to prevent the above-mentioned diseases.
  • the peptides according to the invention must be applied in such a way that they reach their site of action. This place of action can be the brain, the spinal cord and / or the entire nervous system, but also any other part of the organism.
  • the peptides according to the invention can be introduced into the body in solid form or dissolved in a solvent (preferably water).
  • the peptides can be introduced into the nose as a solid, for example orally, rectally or as a powder.
  • the peptides according to the invention can, for example, intravenously, orally, as a nasal spray, subcutaneously, intramuscularly, by inhalation or in or in addition to that
  • the active compounds according to the invention can be applied by means of ointments or creams.
  • the peptides according to the invention can arise at the site of action or at other locations in the organism after nucleic acids (DNA and RNA or a combination thereof) which code for the peptides according to the invention are introduced into the organism. This can be achieved by viral vectors, naked nucleic acids (DNA, RNA), plasmids, artificial virus particles, liposomes, which are introduced into the body intravenously, intranasally, orally, rectally, subcutaneously, intramuscularly, in or on the spinal cord.
  • the peptides according to the invention can also be modified so that the water solubility, 13
  • peptides according to the invention can be linked to antibodies or fragments thereof in the usual way in order to activate components of the immune system when the protein according to the invention is used therapeutically.
  • diseases to be treated include Creutzfeld-Jakob syndrome, Kuru, Gerstmann-St Hurssler-Scheinker syndrome and Fatal Familia Insomnia (FFI).
  • Phage display is a technique that makes it possible to construct peptide libraries with randomized amino acid sequences and to search them for ligands for a specific target molecule.
  • the peptide library is presented as a fusion of peptide and a phage coat protein on the surface of bacteriophages ("phage display").
  • the diversity of the peptides presented is achieved by inserting a combinatorially mutated DNA as a peptide-coding part of the fusion gene. An extremely large number of phages are generated in this way, each phage presenting a different peptide.
  • biopanning The construction, propagation and selection is referred to as "biopanning”.
  • the library comes with an immobilized target 14
  • the enriched population of phages that present a peptide interacting with the target molecule are amplified by infecting them with bacteria.
  • the screening amplification procedure can be repeated several times to further enrich the library members who have a relatively higher affinity for the target molecule. The result is a peptide population that is dominated by the amino acid sequences that bind best to the target molecule.
  • a commercial phage library with 12 randomized amino acids (New England Biolabs, Frankfurt) was used.
  • the grp3 gene coding for the phage coat protein is inserted at the N-terminal according to the signal sequence. This consists of 1.9 x 10 9 independent clones and is amplified and concentrated in such a way that on average 10 ⁇ l each sequence is present in 55 copies.
  • recombinantly produced hamster prion protein in a concentration between 0.01 ⁇ g / ml and 0.1 ⁇ g / ml in PBS with 0.2% SDS, pH 7.2 using the "Protein Immobilizer Kit” (Exiqon) immobilized in a microtiter plate well.
  • 100 ⁇ l protein solution were incubated for 2 hours with gentle shaking. After removing the solution, it was washed 3 times with 200 ⁇ l PBS.
  • 10 ⁇ l phages from the commercial phage library were incubated in 100 ⁇ l PBST with 0.1% BSA for 10 minutes with gentle shaking in an rPrP-coated microtiter plate well. The unbound phages were discarded and then washed 10 times with 300 ⁇ l PBST. Elution was carried out with 100 ⁇ l of 0.2 M glycine-HCl, pH 2.2 for 10 minutes with gentle shaking. The eluate was neutralized in 15 ⁇ l Tris-HCl, pH 9.1.
  • the eluate was placed in 20 ml of E. coli culture and incubated for 4.5 hours at 37 ° C. and 200 rpm. The culture was then centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes. The supernatant was transferred and 1/6 volume of PEG / NaCl was added. The mixture was then precipitated at 4 ° C. overnight. The mixture was then centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes, the supernatant was discarded and the pellet was resuspended in 1 ml of PBS. The mixture was then centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was transferred and 1/6 volume of PEG / NaCl was added. The mixture was precipitated on ice for 1 hour.
  • Prion infected cells are cultured for a week and then examined for the formation of PrP Sc .
  • This works by lysing the cells and treating them with 20 ⁇ g / ml Proteinase K (PK).
  • PK Proteinase K
  • the PK-treated cell lysate is subjected to denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and blotted onto a membrane and then stained with a PrP-specific antibody ("Western blot").
  • Figure 1 shows the band pattern of the PK-treated cell lysate.
  • the peptides W1, W2, W3 and W4 correspond to the sequences 8,2,10 and 1 according to the sequence listing. This creates a typical band pattern (see track 1 in the figure below).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mittel bzw. einen pharmazeutischen Wirkstoff und ein Verfahren zur Behandlung, Prävention und Diagnose von TSE, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Mittels bzw. pharmazeutischen Wirkstoffes. Erfindungsgemäss werden Peptide bzw. für diese Peptide kodierende Nukleotidsequenzen zur Verfügung gestellt, welche in den Sequenzprotokollen 1 bis 27 sowie Teilsequenzen davon offenbart sind. Mit den erfindungsgemäsen Peptiden kann eine Behandlung oder Prävention der Krankheit TSE zum Beispiel beim Menschen Creutzfeld-Jakob-Syndrom, Kuru, GerstmannSträussler-Scheinker-Syndrom und FFI (Fatal Familial Insomnia) vorgenommen werden. Beim Tiere sind TSE Erkrankungen bekannt, beim Schaf Scrapie, beim Rind BSE und bei Wildtieren CWD.

Description

Mittel und Verfahren zur Behandlung und Prävention von TSE sowie Verfahren zur Herstellung des Mittels
Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur Behandlung und zur Prävention von TSE sowie ein Verfahren zur Herstellung des Mittels.
Das Auftreten der transmissiblen spongiformen Enzepha- lopathie (TSE) wird nach Ergebnissen der jüngeren medizinischen Forschung ursächlich mit Prionen in Verbindung gebracht. Die Krankheit zeichnet sich durch schwammartige Veränderungen im Gehirn aus. Als Haupt- Krankheitserreger wurden Prione identifiziert. Prione bestehen überwiegend aus Prionprotein (PrP) in einer pathogenen Konformation (PrPSc) . Auch der gesunde Organismus produziert Prionprotein, allerdings in einer nicht pathogenen, ungefährlichen Konformation (PrPc) . PrPc und PrPSc besitzen die gleiche Aminosäuresequenz, zeigen jedoch einen erheblichen Unterschied in der Sekundärstruktur. PrPc enthält einen relativ hohen α-helikalen Anteil und fast keine ^-Faltblatt-Elemente. PrPSc hingegen weist mit einem erhöhten ß-Faltblatt- Anteil und geringeren o!-Helix-Anteil eine von PrPc ver- schiedene SekundärStruktur auf. Demnach handelt es sich bei PrPc und PrPSc um Strukturisomere. Außerdem ist PrP im Gegensatz zu PrP resistent gegen Protemase- K-Verdau. Dabei scheint PrPSc posttranslational aus PrPc gebildet zu werden. Entstehung und Entwicklung der Krankheit sind abhängig von der fortgesetzten Umwand- lung von PrPc in PrPSc. Die Faktoren die für die Umwandlung von PrPc in PrPSc verantwortlich sind, sind noch nicht alle bekannt.
Alle bisher verfolgten Ansätze zu einer TSE-Therapie haben die Suche nach Wirkstoffen zum Ziel, die gezielt und spezifisch an PrPSc binden oder dessen Bindung an PrPc blockieren sollen, wie es in der Veröffentlichung von C.Soto Biochem. Soc . Trans. 2002 Aug. 30(4): 569- 574 zusammengefasst wird.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung einen pharmazeutischen Wirkstoff und ein alternatives Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen die Krankheit TSE geheilt, gelindert oder präventiv behandelt werden kann.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine Verlang- samung und sogar Inhibierung der PrPSc-Bildung bewirkt werden kann, wenn prioninfizierten Zellen bestimmte Peptide, zugeführt werden. Hierbei wird angenommen, dass sich die erfindungsgemäßen Peptide an das PrPc anlagern und so die Umwandlung von natürlich vorkommendem PrPc in das pathogene PrPSc verhindern. Es wurden erfindungsgemäß verschiedene Peptide mit teilweise charakteristischen Aminosäure - Untersequenzblöcken identifiziert, die eine Linderung der Symptomatik oder sogar eine Heilung der Krankheit TSE zur Folge haben. Bei- spielhafte Peptide sind in den Sequenzen 1 bis 27 angegeben. Als erfindungsgemäß einsetzbare Peptide wurden folgende Sequenzen identifiziert, die in Richtung Ami- no- zu Carboxylterminus zu lesen sind, von denen eine Komponente oder ein Gemisch aus mindestens zwei Komponenten zur Behandlung eingesetzt werden können:
Alle Sequenzen die mindestens eine Komponente aus mindestens einer der Gruppen bestehend aus
A) Val und Asp, Met und Ile, Asp und Val, Gin und Pro, Thr und Pro, Leu und Asp, Asp und Ser, Arg und His, Thr und Tyr, Val und Tyr, Arg und Pro, Pro und Leu, Leu und Pro, Pro und Ser, Ser und Pro, Leu und Lys, Lys und Ala, Ala und Thr, Thr und Thr, Thr und Asn, Asn und Ser, Ser und Lys, Lys und Leu, Leu und Met, Met und Met, Met und Tyr, Trp und His, His und Trp, Trp und Gin, Gin und Trp, Trp und Thr, Thr und Pro, Pro und Trp, Trp und Ser, Ser und Ile, Ile und Gin, Gin und Pro;
B) Leu und Asp und Ser, Val und Asp und Met, Asp, Met und Ile, Met, und Ile und Asn, Asp und Val und Gin, Val und Gin und Pro, Gin und Pro und Leu, Gin und Pro und Met, Pro und Leu und Thr, Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser, Asp und Ser und Ser, Asp und Ser und Cys, Arg und His und Ala, His und Ala und Thr, Ala und Thr und Tyr, Val und Tyr und Ser, Tyr und Ser und Ser, Arg und Pro und Leu, Pro und Leu und Pro, Leu und Pro und Ser, Pro und Ser und Pro, Leu und Lys und Ala, Lys und Ala und Thr, Ala und Thr und Thr, Thr und Thr und Asn, Thr und Asn und Ser, Asn und Ser und Lys, Ser und Lys und Leu, Lys und Leu und Met, Leu und Met und Met, Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp, His und Trp und Gin, Trp und Gin und Trp, Gin und trp und Thr, Trp und Thr und Pro, Thr und Pro und Trp, Pro und Trp und Ser, Trp und Ser und Ile, Ser und Ile und Gin, Ile und Gin und Pro;
C) Val und Asp und Met und Ile, Asp und Val und Ile und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser, Arg und His und Ala und Thr, His und Ala und Thr und Tyr, Val und Tyr und Ser und Ser, Arg und Pro und Leu und Pro, Pro und Leu und Pro und Ser, Leu und Pro und Ser und Pro, Leu und Lys und Ala und Thr, Lys und Ala und Thr und Thr, Ala und Thr und Thr und Asn, Thr und Thr und Asn und Ser, Thr und Asn und Ser und Lys, Asn und Ser und Lys und Leu, Ser und Lys und Leu und Met, Lys und Leu und Met und Met, Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin, His und Trp und Gin und Trp, Trp und Gin und Trp und Thr, Gin und Trp und Thr und Pro, Trp und Thr und Pro und Trp, Thr und Pro und Trp und Ser, Pro und Trp und Ser und Ile, Trp und Ser und Ile und Gin, Ser und Ile und Gin und Pro;
D) Val und Asp und Met und Ile und Asn, Asp und Met und Ile und Asn und Asp, Met und Ile und Asn und Asp und Val, Ile und Asn und Asp und Val und Gin, Asn und Asp und Val und Gin und Pro, Asp und Val und Gin und Pro und Leu, Asn und Asp und Val und Gin und Pro, Asp und Val und Gin und Pro und Leu, Val und Gin und Pro und Leu und Thr, Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser und Arg, Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Asn und Ser und Lys und Leu und Met, Ser und Lys und Leu und Met und Met, Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp, His und Trp und Gin und Trp und Thr, Trp und Gin und Trp und Thr und Pro, Gin und Trp und Thr und Pro und Trp, Trp und Thr und Pro und Trp und Ser, Trp und Thr und Pro und Trp und Ile, Thr und Pro und Trp und Ile und Gin, Pro und Trp und Ile und Gin und Pro;
E) Val und Asp und Met und Ile und Asn und Asp, Val und Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, His und Ser und Pro und Leu und Asp und Ser, Ser und Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr und Asn, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met, Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met, Ser und Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp und Thr, Trp und Gin und Trp und Thr und Pro und Trp, Trp und Thr und Thr und Pro und Trp und Ser und Ile, Pro und Trp und Ser und Ile und Gin und Pro;
F) Asp und Val und Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser und Arg uns His und Ala, Ser und Ser und Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met, Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met, Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp und Thr und Pro, Gin und Trp und Thr und Pro und Trp und Ser und Ile, Thr und Pro und Trp und Ser und Ile und Gin und Pro;
G) Mindestens zwei Komponenten aus mindestens einer der Gruppen A) bis F) ;
H) Sequenzen 1 - 27 des Sequenzprotokolls, welche alle 12 Aminosäuren mit den Positionen 1 - 12 umfassen, sind oder enthalten. Diese Sequenzen können eine beliebige Länge haben, vorzugsweise eine Länge von 6 - 40, besonders bevorzugt 8 - 30, 10 - 20 oder noch bevorzugter 10-12 Aminosäuren lang sein. In einigen speziellen Ausführungsformen können die folgenden Sequenzen vorliegen, die vorzugsweise 12 Aminosäuren lang sind.
I) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 1, 2, 3 und 4 die Aminosäuren Leu, Lys, Ala, und Thr bein- halten;
J) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 6, 7, 8 und 9 die Aminosäuren Asn, Ser, Lys und Leu besitzen;
K) Aminosäuresequenzen, die eine Kombination der Merk- male I) und J) beinhalten; L) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 4, 5 und 6 die Aminosäuren Gin, Trp und Thr besitzen;
M) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 8 und 9 die Aminosäuren Arg und His besitzen;
N) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 11 und 12 die Aminosäuren Thr und Tyr besitzen;
O) Alle Unterkombinationen mit 2 oder 3 Elementen der Gruppen L) , M) und N) ;
P) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 1 und 2 die Aminosäuren Val und Tyr besitzen;
Q) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 7, 8, 9, 10, 11, 12 die Aminosäuren Arg, Pro, Leu, Pro, Ser und Pro besitzen;
R) Aminosäuresequenzen, die eine Kombination aus N) und O) darstellen.
Die Sequenzabschnitte I) - R) können in Sequenzen enthalten sein, die beispielsweise eine Länge von 6 - 40, bevorzugt 8 - 30,10 - 20 und besonders bevorzugt 10 - 12 Aminosäuren umfassen.
Figur 1 zeigt die Aminosäuresequenzen (im Einbuchstabencode) der vier wirksamen Peptide, die im Phagen- display-Screening identifiziert wurden:
ERSATZBLATT 7a
"Wl" HSPLDSSRHATY = Seq.Nr.8
"W2" VDMINDVQPLTP = Seq.Nr.2
"W3" VYSSTTRPLPSP = Seq.Nr.10
"W4" LKATTNSKLMMY = Seq.Nr.1
Die erfindungsgemäßen Peptide, welche eine Heilung von TSE oder eine Linderung bewirken, können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. So kann zur Herstellung eines chemisch-synthetischen Verfahrens zum Beispiel Festphasensynthesen oder eine
ERSATZBLATT Synthese in flüssigem Medium herangezogen werden. Bei der Festphasensynthese werden die Aminosäuren in der Abfolge der Sequenz entsprechend den Sequenzprotokollen und der Auflistungen A) - R) miteinander verbunden. Die Festphasenpeptidsynthese besteht aus drei wesentlichen Schritten:
1) Aufbau der Aminosäurekette zum Peptid,
2) Spaltung des synthetisierten Peptids vom Harz und
3) gegebenenfalls Reinigung und Charakterisierung. Für die Synthese der Aminosäurekette sind unterschiedliche Kopplungsmethoden bekannt, wie Sie beispielsweise in „Beyer Walter* 22. Auflage ISBN 3-7776-0485-2, Seiten 829 - 834 beschrieben werden.
Die Peptide können auch durch Expression der für sie kodierenden Nukleotidsequenzen, zum Beispiel in Chromosomen, Plasmiden oder anderen Informationsträgern, nackte DNA oder RNA in Organismen, in Zellen oder zell- freien Systemen, hergestellt werden.
Gegenstand der Erfindung sind daher auch die Nuklein- säuren, welche für die Peptide gemäß den Aminosäuresequenzen A) - R) kodieren, einschließlich aller Allelva- riationen sowie die Nukleotidsequenzen der Sequenzfolgen 1 - 27 einschließlich aller Allelvariationen.
Mit den erfindungsgemäßen Peptiden können alle Säuge- tiere einschließlich Menschen behandelt bzw. geheilt werden und die Peptide können auch zur Prävention eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist die Behandlung des Menschen es können aber auch Rinder und Schafe behandelt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide lagern an das PrPc aller Säuger an, so dass die erfindungsgemäße Wirkung stattfinden kann. Der erfindungsgemäße Effekt findet auch statt, wenn mindestens zwei der genannten Peptide an das PrPc binden.
Mit den erfindungsgemäßen Peptiden kann eine Behandlung der Krankheit TSE sowohl beim Menschen als auch bei Tieren vorgenommen werden. Zu den humanen Erkrankungen gehören das Creutzfeld-Jakob-Syndrom, Kuru, Gerstmann- Sträussler-Scheinker-Syndrom und FFI (Fatal Familial Insomnia) . Beim Tier sind ebenfalls TSE- Erkrankungen bekannt, z. B. beim Schaf Scrapie, beim Rind bovine spongiforme encephatlopathie (BSE) bei Wildtieren chro- nic wasting disease (CWD) . Hierzu müssen die erfindungsgemäßen Peptide so appli- ziert werden, dass sie ihren Wirkort erreichen. Dieser Wirkort kann das Gehirn, das Rückenmark und/oder das gesamte Nervensystem sein, aber auch jeder andere Teil des Organismus. Hierzu können die erfindungsgemäßen Peptide in fester oder in einem Lösungsmittel, vorzugs- weise Wasser gelöster Form in den Körper eingebracht werden. Als Feststoff können die Peptide beispielsweise oral, rektal oder als Pulver in die Nase eingeführt werden. Der erfindungsgemäße Wirkstoff und die pharmazeutische Zusammensetzung können als flüssige, halbfeste oder feste Arzneiformen und in Form von z. B. Injektionslösungen, Tropfen, Säften, Sirupen, Spray, Suspensionen, Granulaten, Tabletten, Pellets, transdermalen therapeutischen Systemen, Kapseln, Pflastern, Zäpfchen, Salben, Cremes, Lotionen, Gelen, Emulsionen oder Aerosolen vorliegen und verabreicht werden und enthalten die erfin- 10
dungsgemäßen Peptide in einer physiologisch verträglichen Form und in Abhängigkeit des Applikationsweges pharmazeutische Hilfsstoffe, wie z. B. Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, o- berflächenaktive Stoffe, Farbstoffe, Konservierungs- stoffe, Sprengmittel, Gleitmittel, Schmiermittel, Aromen und/oder Bindemittel. Diese Hilfsmittel können beispielsweise sein: Wasser, Ethanol, 2-Propanol, Glyce- rin, Fructose, Laktose, Saccharose, Dextrose, Melasse, Stärke, modifizierte Stärke, Gelatine, Sorbitol, Inosi- tol, Mannitol, mikrokristalline Cellulose, Methylcellu- lose, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetat , Schellack, Cetylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Paraffine, Wachse, natürliche und synthetische Gummis, Akaziengum- mi, Alginate, Dextran, gesättigte und ungesättigte
Fettsäuren, Stearinsäure, Magnesiumstearat , Zinkstea- rat, Glycerylstearat, Natriumlaurylsulfat , genießbare Öle, Sesamöl, Kokosnussöl, Erdnussöl, Sojabohnenöl , Le- citin, Natriumlactat , Polyoxyethylen- und -propylen- fettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Sorbinsäure,
Benzoesäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Tanninsäure, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Calci- umchlorid, Magnesiumoxid, Zinkoxid, Siliciumoxid, Titanoxid, Titandioxid, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Cal- ciumsulfat, Pottasche, Calciumphosphat , Dicalci- umphosphat, Kaliumbromid, Kaliumjodid, Talkum, Kaolin, Pectin, Crospovidon, Agar und Bentonit .
Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie der einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Medikament oral, subkutan, parenteral, intravenös, pul onal , intraperitoneal , transdermal, intramuskulär, nasal, 11
buccal, rektal oder auf andere geeignete Weise appli- ziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich u. a. Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstruierbare Pulver zur Inhalation sowie Sprays. In geeigneten perkuta- nen Applikationsformen kann der Wirkstoff in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenen- falls unter Zusatz von Hautpenetrationen fördernden
Mitteln, vorliegen. Rektal, transmucosal, parenteral, oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Peptide verzögert freisetzen.
In flüssiger Form können die erfindungsgemäßen Peptide beispielsweise intravenös, oral, als Nasenspray, subkutan, intramuskulär, inhalativ oder in oder neben das Rückenmark appliziert werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe mittels Salben oder Cremes aufgebracht werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können am Wirkort oder an anderen Orten des Organismus entstehen, nachdem Nukleinsäuren (DNA und RNA oder eine Kombination davon) , die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren, in den Organismus eingebracht werden. Dies kann durch virale Vektoren, nackte Nukleinsäure (DNA, RNA) , Plasmide, künstliche Viruspartikel, Liposomen erreicht werden, die intravenös, intranasal, oral, rektal, subkutan, intramuskulär, in oder an das Rückenmark in den Körper eingebracht werden. 12
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch zur Prävention der oben genannten Krankheiten verwendet werden. Hierzu müssen die erfindungsgemäßen Peptide so appli- ziert werden, dass sie ihren Wirkort erreichen. Dieser Wirkort kann das Gehirn, das Rückenmark und/oder das gesamte Nervensystem sein, aber auch jeder andere Teil des Organismus. Hierzu können die erfindungsgemäßen Peptide in fester oder in einem Lösungsmittel, (vorzugsweise Wasser) gelöster Form in den Körper einge- bracht werden. Als Feststoff können die Peptide beispielsweise oral, rektal oder als Pulver in die Nase eingeführt werden.
In flüssiger Form können die erfindungsgemäßen Peptide beispielsweise intravenös, oral, als Nasenspray, subku- tan, intramuskulär, inhalativ oder in bzw. neben das
Rückenmark appliziert werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Wirkstoffe mittels Salben oder Cremes aufgebracht werde . Die erfindungsgemäßen Peptide können am Wirkort oder an anderen Orten des Organismus entstehen, nachdem Nukleinsäuren (DNA und RNA oder eine Kombination davon) die für die erfindungsgemäßen Peptide kodieren in den Organismus eingebracht werden. Dies kann erreicht werden durch virale Vektoren, nackte Nukleinsäuren (DNA, RNA), Plasmide, künstliche Viruspartikel, Liposomen, die intravenös, intranasal, oral, rektal, subkutan, intramuskulär, in oder an das Rückenmark in den Körper eingebracht werden.
Zur Verbesserung der Bindungs-, Lösungs-, und Wirkei- genschaften können die erfindungsgemäßen Peptide noch modifiziert werden, so dass die Wasserlöslichkeit, de- 13
ren Stabilität, die Bioverfügbarkeit und die Affinität zum Anhaften am PrPc vergrößert wird. Diese Modifikationen können beispielsweise Zuckerreste, Glukoronsäuren, Sulfatreste, Serin, Glycin oder Aspartat sein.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide mit Antikörpern oder Fragmenten davon auf übliche Weise verknüpft werden, um bei einer therapeutischen Anwendung des erfindungsgemäßen Proteins Bestandteile des Immunsystems zu aktivieren.
Als zu behandelnde Krankheitsbilder können das Creutz- feld-Jakob-Syndrom, Kuru, das Gerstmann-Sträussler- Scheinker-Syndrom sowie Fatal Familia Insomnia (FFI) beispielhaft genannt werden.
Methodisches:
Phagendisplay ist eine Technik, die es ermöglicht Pep- tid-Bibliotheken mit randomisierten Aminosäuresequenzen zu konstruieren und diese nach Liganden für ein bestimmtes Zielmolekül zu durchsuchen. Die Peptidbiblio- thek ist dabei als Fusion aus Peptid und einem Phagen- hüllprotein auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert ("phage display"). Die Diversität der präsentierten Peptide wird durch die Insertion einer kombinatorisch mutierten DNA als Peptid-kodierender Teil des Fusionsgens erreicht . Auf diese Weise wird eine extrem große Zahl von Phagen erzeugt, wobei jeder Phage ein anderes Peptid präsentiert. Das Konstruieren, Vermehren und Selektieren wird als "Biopanning" bezeichnet. Die Bibliothek wird mit einem immobilisierten Zielmolekül 14
inkubiert, wobei der nicht-bindende Teil der Peptid- Bibliothek weggewaschen und der bindende Teil anschließend eluiert wird. Die dadurch angereicherte Population von Phagen, die ein mit dem Zielmolekül interagierendes Peptid präsentieren, werden amplifiziert , indem man mit ihnen Bakterien infiziert. Die Screening-Amplifika- tions-Prozedur kann mehrmals wiederholt werden, um die Bibliotheks-Mitglieder weiter anzureichern, die eine relativ höhere Affinität zum Zielmolekül besitzen. Das Ergebnis ist eine Peptid-Population, die dominiert wird von den Aminosäuresequenzen, die das Zielmolekül am besten binden.
Verwendet wurde eine kommerzielle Phagenbibliothek mit 12 rando isierten Aminosäuren (New England Biolabs, Frankfurt) . Hier ist an das Phagenhüllprotein kodierende grp3-Gen nach der Signalsequenz N-terminal die Bibliothek inseriert. Diese besteht aus l,9xl09 unabhängigen Klonen und ist so amplifiziert und konzentriert, dass in 10 μl durchschnittlich jede Sequenz in 55 Ko- pien vorliegt.
Zur Durchführung der Selektion gegen das rekombinante Prionprotein (rPrP) aus Hamster wurde rekombinant hergestelltes Hamster-Prionprotein in einer Konzentration zwischen 0,01μg/ml und 0,lμg/ml in PBS mit 0,2% SDS, pH 7,2 mit Hilfe des "Protein Immobilizer Kit" (Exiqon) in einer Mikrotiterplattenvertiefung immobilisiert. Hierfür wurden jeweils 100 μl Proteinlösung für 2 Stunden unter sanftem Schütteln inkubiert. Nach Entfernen der Lösung wurde 3 mal mit 200 μl PBS gewaschen. 15
Für die Selektion wurden 10 μl Phagen der kommerziellen Phagenbibliothek in 100 μl PBST mit 0,1% BSA 10 Minuten unter leichtem Schütteln in einer rPrP-beschichteten Mikrotiterplattenvertiefung inkubiert. Die nicht gebun- denen Phagen wurden verworfen und anschließend 10 mal mit 300 μl PBST gewaschen. Die Elution erfolgte mit 100 μl 0,2 M Glycin-HCl, pH 2 , 2 für 10 Minuten unter leichtem Schütteln. Das Eluat wurde in 15 μl Tris-HCl, pH 9, 1 neutralisiert.
Das Eluat wurde in 20 ml E. coli-Kultur gegeben und für 4, 5 Stunden bei 37 °C und 200 rpm inkubiert. Anschließend wurde die Kultur 10 Minuten bei 5000 rpm zentrifu- giert . Der Überstand wurde überführt und 1/6 Volumen PEG/NaCl zugegeben. Der Ansatz wurde nun über Nacht bei 4 °C gefällt. Danach wurde 20 Minuten bei 5000 rpm zentrifugiert , der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert. Anschließend wurde 5 Minuten bei 10000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde überführt und 1/6 Volumen PEG/NaCl zugegeben. Der Ansatz wurde 1 Stunde auf Eis gefällt. Abschließend wurde 60 Minuten zentrifugiert und das Pellet in 100 μl TBS resuspendiert . Die so erhaltenen Phagen konnten nun in der nächsten Runde eingesetzt werden. Ingesamt wurden fünf Selektionsrunden durchgeführt. Anschließend wurden willkürlich ausgewählte Phagenklone isoliert und die Aminosäuresequenz der auf diesen Phagen präsentierten Peptide über den Umweg der DNA-Sequenzierung des im Phagengenom kodierten Peptids bestimmt. Das Ergebnis sind die insgesamt 27 verschiedenen Aminosäuresequenzen im Sequenzprotokoll . 16
In einem Zellkulturessay mit infizierten N2a- ellen wurde gezeigt, dass alle untersuchten Peptide in der Lage waren, die Menge an gebildetem PrPSc zu verringern.
Beispiel :
Versuchsbeschreibung
Prion infizierte Zellen werden eine Woche lang kultiviert und dann auf die Bildung von PrPSc hin untersucht. Dies funktioniert so, dass man die Zellen ly- siert und mit 20 μg/ml Proteinase K (PK) behandelt. Dadurch wird PrPc verdaut und nur das PK-resistente PrPSc bleibt übrig. Das PK-behandelte Zelllysat wird einer denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) unterworfen und auf eine Membran geblottet und anschließend mit einem PrP-spezifischen Antikörper angefärbt ( "Western-Blot" ) . Figur 1 zeigt das Bandenmuster des PK-behandelten Zelllysats. Die Peptide Wl, W2 , W3 und W4 entsprechen dabei den Sequenzen 8,2,10 und 1 gemäß dem Sequenzprotokoll. Dabei entsteht ein typi- sches Bandenmuster (siehe Spur 1 in der unteren Abbildung) .
In Anwesenheit von Substanzen, die die Vermehrung von Prionen inhibieren (Quinacrine als positive Kontrolle) ist kein oder ein deutlich schwächeres Bandenmuster zu sehen (Spur 2 und 3) .
Bei Behandlung der Prion infizierten N2a-Zellen mit den Peptiden Wl, W2, W3 und W4 ist eine konzentrationsabhängige Abnahme der PrP-Banden im Westernblot zu sehen (übrige Spuren) . Das bedeutet, dass die Peptide inhi- bierend auf die Replikation der Prionen wirken.

Claims

17P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Komponente aus mindestens einer der Gruppen A) bis R) ist oder umfasst: A) Val und Asp, Met und Ile, Asp und Val, Gin und Pro, Thr und Pro, Leu und Asp, Asp und Ser, Arg und His, Thr und Tyr, Val und Tyr, Arg und Pro, Pro und Leu, Leu und Pro, Pro und Ser, Ser und Pro, Leu und Lys, Lys und Ala, Ala und Thr, Thr und Thr, Thr und Asn, Asn und Ser, Ser und Lys, Lys und Leu, Leu und Met, Met und Met, Met und Tyr, Trp und His, His und Trp, Trp und Gin, Gin und Trp, Trp und Thr, Thr und Pro, Pro und Trp, Trp und Ser, Ser und Ile, Ile und Gin, Gin und Pro.
B) Leu und Asp und Ser, Val und Asp und Met, Asp, Met und Ile, Met, und Ile und Asn, Asp und Val und Gin, Val und Gin und Pro, Gin und Pro und Leu, Gin und Pro und Met, Pro und Leu und Thr, Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser, Asp und Ser und Ser, Asp und Ser und Cys, Arg und His und Ala, His und Ala und Thr, Ala und Thr und Tyr, Val und Tyr und Ser, Tyr und Ser und Ser, Arg und Pro und Leu, Pro und Leu und Pro, Leu und Pro und 18
Ser, Pro und Ser und Pro, Leu und Lys und
Ala, Lys und Ala und Thr, Ala und Thr und
Thr, Thr und Thr und Asn, Thr und Asn und
Ser, Asn und Ser und Lys, Ser und Lys und Leu, Lys und Leu und Met, Leu und Met und
Met, Met und Met und Tyr, Trp und His und
Trp, His und Trp und Gin, Trp und Gin und
Trp, Gin und trp und Thr, Trp und Thr und
Pro, Thr und Pro und Trp, Pro und Trp und Ser, Trp und Ser und Ile, Ser und Ile und
Gin, Ile und Gin und Pro.
Val und Asp und Met und Ile, Asp und Val und Ile und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser, Arg und His und Ala und Thr, His und Ala und Thr und Tyr, Val und Tyr und Ser und Ser, Arg und
Pro und Leu und Pro, Pro und Leu und Pro und Ser, Leu und Pro und Ser und Pro, Leu und Lys und Ala und Thr, Lys und Ala und Thr und Thr, Ala und Thr und Thr und Asn, Thr und Thr und Asn und Ser, Thr und Asn und Ser und Lys, Asn und Ser und Lys und Leu, Ser und Lys und Leu und Met, Lys und Leu und Met und Met, Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin, His und Trp und Gin und Trp, Trp und Gin und Trp und Thr, Gin und Trp und Thr und Pro,
Trp und Thr und Pro und Trp, Thr und Pro und Trp und Ser, Pro und Trp und Ser und Ile, Trp und Ser und Ile und Gin, Ser und Ile und Gin und Pro. 19
D) Val und Asp und Met und Ile und Asn, Asp und Met und Ile und Asn und Asp, Met und Ile und Asn und Asp und Val, Ile und Asn und Asp und Val und Gin, Asn und Asp und Val und Gin und Pro, Asp und Val und Gin und Pro und Leu, Asn und Asp und Val und Gin und Pro, Asp und Val und Gin und Pro und Leu, Val und Gin und Pro und Leu und Thr, Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser und Arg, Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Asn und Ser und Lys und Leu und Met, Ser und Lys und Leu und Met und Met, Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp, His und Trp und Gin und Trp und Thr, Trp und Gin und Trp und Thr und Pro, Gin und Trp und Thr und Pro und Trp, Trp und Thr und Pro und Trp und Ser, Trp und Thr und Pro und Trp und Ile, Thr und Pro und Trp und Ile und Gin, Pro und Trp und Ile und Gin und Pro.
E) Val und Asp und Met und Ile und Asn und Asp, Val und Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, His und Ser und Pro und Leu und Asp und Ser, Ser und Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr und Asn, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, 20
Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met, Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met, Ser und Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp und Thr, Trp und Gin und Trp und Thr und Pro und Trp, Trp und Thr und Thr und Pro und Trp und Ser und Ile, Pro und Trp und Ser und Ile und Gin und Pro .
F) Asp und Val und Gin und Pro und Leu und Thr und Pro, Leu und Asp und Ser und Ser und Arg uns His und Ala, Ser und Ser und Arg und His und Ala und Thr und Tyr, Leu und Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser, Lys und Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys, Ala und Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu, Thr und Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met , Thr und Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met , Asn und Ser und Lys und Leu und Met und Met und Tyr, Trp und His und Trp und Gin und Trp und Thr und Pro, Gin und Trp und Thr und Pro und Trp und Ser und Ile, Thr und Pro und Trp und Ser und Ile und Gin und Pro.
G) Mindestens zwei Komponenten aus mindestens einer der Gruppen A) bis F) .
H) Sequenzen 1 - 27 des Sequenzprotokolls, welche alle 12 Aminosäuren mit den Positionen 1 - 12 umfassen. 21
I) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 1, 2, 3 und 4 die Aminosäuren Leu, Lys, Ala, und Thr beinhalten.
J) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 6, 7, 8 und 9 die Aminosäuren Asn, Ser, Lys und Leu besitzen.
K) Aminosäuresequenzen, die eine Kombination der Merkmale I) und J) beinhalten.
L) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 4, 5 und 6 die Aminosäuren Gin, Trp und Thr besitzen.
M) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 8 und 9 die Aminosäuren Arg und His besitzen.
N) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 11 und 12 die Aminosäuren Thr und Tyr besitzen.
O) Alle Unterkombinationen mit 2 oder 3 Elementen der Gruppen L) , M) und N) .
P) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 1 und 2 die Aminosäuren Val und Tyr besitzen.
Q) Aminosäuresequenzen, die in den Positionen 7, 8, 9, 10, 11, 12 die Aminosäuren Arg, Pro, Leu, Pro, Ser und Pro besitzen. 22
R) Aminosäuresequenzen, die eine Kombination aus N) und 0) darstellen.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in fester, halbflüssiger oder flüssiger Form vorliegt.
3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass es in Form von Injektionslösungen, Tropfen, Säften, Sirupen, Spray, Suspensionen, Granulaten, Tabletten, Pellets, transdermalen therapeutischen Systemen, Kapseln, Pflastern, Zäpfchen, Salben, Cremes, Lotionen, Gelen, Emulsionen oder Aerosolen vorliegt.
4. Mittel nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichnet , dass es Hilfsstoffe, wie z. B. Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, oberflächenaktive Stoffe, Farbstoffe, Konservierungs- stoffe, Sprengmittel, Gleitmittel, Schmiermittel, Aromen und/oder Bindemittel enthält .
5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass es mit mindestens einer Komponente aus der Gruppe Zuckerreste, Glukoronsäuren, Sulfatreste, Serin, Glycin oder Aspartat modifiziert bzw. substituiert sind. 23
6. Nukleinsäure, kodierend für die Peptide nach Anspruch 1.
7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine DNA, eine RNA, eine mRNA oder eine Mischung aus mindestens zwei Komponenten davon ist.
8. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie als nackte Nukleinsäure oder verpackte Nukleinsäure, als Vektor, Plasmid, in Liposomen eingebunden oder als Phage vorliegt.
9. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Festphasensynthese oder eine Synthese in flüssiger Phase eingesetzt wird.
10. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Peptid nach Anspruch 1 aus einer für diese Peptidsequenz kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird.
11. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels.
12. Heil- und Behandlungsverfahren sowie Verfahren zur Prävention der Krankheit TSE, dadurch gekennzeichnet, 24
dass an den Patienten ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 6 bis 8 verabreichet wird.
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