EP1620729A1 - Support de biopuce utilisant des couches minces de materiau sol gel et procede de realisation - Google Patents
Support de biopuce utilisant des couches minces de materiau sol gel et procede de realisationInfo
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- EP1620729A1 EP1620729A1 EP04742650A EP04742650A EP1620729A1 EP 1620729 A1 EP1620729 A1 EP 1620729A1 EP 04742650 A EP04742650 A EP 04742650A EP 04742650 A EP04742650 A EP 04742650A EP 1620729 A1 EP1620729 A1 EP 1620729A1
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- C03C2218/11—Deposition methods from solutions or suspensions
- C03C2218/113—Deposition methods from solutions or suspensions by sol-gel processes
Definitions
- the invention relates to the field of biological microsystems. More particularly, it relates to the production of a biochip support, the detection of which is based on the collection of a fluorescence signal.
- This biochip or biosensor support can be used in the context of the production of biochip supports compatible with the grafting of nucleic acids (DNA biochips, RNA biochips), amino acids (protein chips, immunological chips), as well than cellular biochips used in particular in studies of transfection or studies of chemotaxis.
- the invention also relates to a method for grafting biological molecules into the support according to the invention.
- microarrays or DNA biosensors are widely used in biomedical analyzes, such as for example in gene expression, detection of mutations or polymorphism, sequencing and discovery of genes (see document [1] referenced at the end of this description).
- biochips are made up of microscopic networks of biological molecules immobilized on solid supports.
- Several approaches can be used for the preparation of these microarrays.
- biological molecules can be directly synthesized on a substrate
- oligonucleotides are obtained which have lengths lying in a range from 10 to 60 mothers. Limiting the maximum length of the probes thus synthesized constitutes the main problem of this technology.
- Biological molecules can also be pre-synthesized, then deposited on delimited areas of the support by means of microrobots which will either be passive (“pin” type) or active (piezoelectric type or inkjet type) (see document [6]).
- a wide range of molecules can thus be deposited by this method, such as, for example, oligonucleotides, products derived from DNA amplification PCR and proteins.
- Bio molecules can also be coupled to the support using covalent bonds. This approach makes it possible to better optimize the hybridization conditions and therefore the sensitivity of the microarrays, since the molecules are grafted onto the support in a covalent and irreversible manner (documents [9], [10],
- A. Mirzabekov proposed to use polyacrylamide gels and to graft the molecules in three dimensions in the volume of this material (documents [14], [15], [16]). This principle is also used for localized in situ enzymatic reactions, antigen / antibody recognition (document [17]), PCR amplifications of immobilized oligonucleotides (document [18]) or the detection of the production of bacterial toxins.
- the polyacrylamide monolayer has no optical function.
- this monolayer is thick: it has a thickness of about 30 micrometers.
- sol-gel materials proper, a number of them have already been used, mainly for the encapsulation of proteins and the study of their functionality. Many works are currently published on the influence of this encapsulation on the structure, function, accessibility, conformation and thermodynamic stability of proteins (documents [20], [21], [22]). In particular, it is known that the appropriate chemical modification of the sol-gels allows a higher rate of covalent grafting of proteins and / or the improvement of the stability properties. Comparative studies of the stability of immobilized antibodies have shown better results on sol-gel compared to a covalent grafting on glass (see document [23]). For example, sol-gels modified with chloropropyl or aminopropyl functions have made it possible to obtain protein levels grafted two to three times higher than on glass (document [24]).
- the number of materials tested is very limited.
- the materials tested are generally limited to thick silica matrices (> 1 mm) prepared on the basis of tetraethoxysilane (TEOS) or tetramethoxysilane (TMOS).
- TEOS tetraethoxysilane
- TMOS tetramethoxysilane
- the object of the invention is to provide a biochip support which can have a high local density of grafted biological molecules compared to the prior art, but also making it possible to obtain an improved fluorescence detection signal (more precisely, a ratio improved fluorescence detection noise signal).
- a biochip support comprising a substrate supporting, on a first face, at least one porous layer of material, said layer being intended to ensure the attachment of biological molecules. on said layer and in its volume, said support being characterized in that said layer is an optical thin layer of material prepared by sol-gel route and whose refractive index is lower than the refractive index of the substrate.
- the layers of materials obtained by the sol-gel route have a large developed surface of grafting, due to their very high porosity compared to a layer of the same nature obtained by deposition according to other conventional techniques (PVD, IBS, CVD).
- the thickness of sol-gel material to be deposited on the substrate is less than that of the gels conventionally used in the prior art.
- the thickness of the layers used by the invention can thus vary, depending on the nature of the layer deposited and the density of probes to be grafted there, from 0.1 to 5 ⁇ m. These layers can be deposited in one or more steps according to the techniques described below. We are therefore in the field of thin layers, unlike the prior art which used thick layers (greater than 20 ⁇ m, nominally 30 ⁇ m).
- optical characteristics of the thin sol-gel layers deposited on the substrate will also be able to be optimized so as to increase the fluorescence signal detected after grafting of the labeled molecule on or in the sol-gel layer in question.
- optical characteristics of the thin layers will also be able to be optimized so as to increase the fluorescence signal detected after grafting of the labeled molecule on or in the sol-gel layer in question.
- precursors and of the synthesis route of the layer thin of sol-gel material one can obtain an intrinsic fluorescence of the very weak layer at the wavelengths of interest, ie at the excitation wavelengths which will be sent later on the device to study the fluorescence of fluorophores fixed in or on the surface of the thin layer.
- the layer of sol-gel material can have a low absorption in the UV and in the visible range, which makes it possible to limit the contribution of the non-radiative losses. This results in an improvement in the energy balance in favor of the emission of fluorescence in free space. With this characteristic, the amount of light emitted is greater compared to the prior art.
- the signals collected by the biochip reading scanners resulting from the invention will therefore benefit from an improved signal to noise ratio.
- the sol-gel layer can advantageously have a low surface roughness, which makes it possible to limit the diffusion of fluorescent light.
- the thin sol-gel layers used by the present invention provide an improvement in performance compared to the prior art. By placing a thin layer of sol-gel material on the substrate, the fluorescence signal is therefore increased.
- the support according to the invention further comprises at least an optical thin layer of material prepared by the sol-gel route supported by a second face of the substrate opposite to the first face, said thin layer supported by the second face having a refractive index lower than that of the substrate.
- the device according to the invention comprises one or more thin layers on one face of the substrate and one or more thin layers on the opposite face.
- the support according to the invention comprises a stack of thin dielectric layers forming a Bragg mirror interposed between the substrate and the thin layer of material prepared by sol-gel route.
- This particular configuration will make it possible to increase the excitation field inside the thin layer of sol-gel material. This is particularly interesting when we want to study the fluorescence of fluorophores grafted into or on the surface of the sol-gel layer, because this configuration has the effect of increasing the excitation of said fluorophores and therefore increasing the amount of light emitted. in the superstrate.
- a Bragg mirror is a successive stack of several thin dielectric layers with different refractive indices ni and n 2 . The thickness of each of these layers is equal to ⁇ / (4n), with n being able to take the value ni or n 2 .
- the variable ⁇ corresponds to the wavelength at which one wishes to have a maximum reflection for the Bragg mirror.
- the layers of material prepared by the sol-gel route are compatible with most substrates, mineral or organic, whatever their chemical nature and their optical, mechanical or thermal properties.
- the substrate will be formed from a material chosen from the group comprising glasses, polymers and semiconductors. We can therefore consider making biochip supports on a glass, silicon or plastic substrate. It is of course possible to choose any other material, provided that the layers of sol-gel material are compatible with the chosen substrate.
- the material prepared by the sol-gel route has a purely inorganic composition. According to a second embodiment, it is composed of an inorganic fraction and an organic fraction.
- the inorganic fraction will advantageously be in majority compared to the organic fraction.
- said fraction will give its cohesion to the sol-gel material.
- this material will advantageously comprise at least one compound chosen from:
- M x 0 y an oxide M x 0 y , with M chosen from the group consisting of Si, Al, Zr, Ti and Ta, - a compound of type -MO-M'-, with M and M 'chosen from the group consisting of Si , Al, Zr, Ti and Ta.
- M chosen from the group consisting of Si, Al, Zr, Ti and Ta
- M 'chosen from the group consisting of Si , Al, Zr, Ti and Ta.
- the material prepared by the sol-gel route comprises a compound of type - M-O-M'-, M is Si and M 'is Zr or Ti.
- the organic fraction is a polymer, said polymer remaining free or being weakly bonded to the elements constituting the inorganic fraction.
- the organic fraction results from the addition of an organic polymer to the inorganic colloidal suspension intended to form the sol-gel material. By doing so, and after the steps of depositing and gelling the material on the substrate, the polymer is trapped in the meshes of the inorganic network.
- This polymer can have several functionalities which are in particular the partial filling of the natural porosity of the layer, thus making it possible to modulate the natural porosity of the layer and / or the size of the pores, and the incorporation into the layer of reactive organic groups allowing grafting of oligonucleotide probes.
- the organic fraction results from the incorporation of a silane XR 2 -Si (ORi) n into the inorganic fraction.
- this incorporation takes place during the synthesis of the soil and the silane binds to the metal salts or alkoxides of the inorganic fraction (it is recalled that the soil designates a colloidal suspension of particles in a liquid).
- Ri will be chosen from the group comprising -CH 3 , -C 2 H 5 , nPr, iPr or tBu
- R 2 will be an aliphatic chain of length p-CH 2 , preferably without ether function -CH 2 -0-CH 2 -, and with p between 2 and 10
- the length of the aliphatic chain can be used to modulate the size of the network cavities, with the aim of accommodating an oligonucleotide probe of determined length.
- the X group can allow the grafting of an oligonucleotide which is itself functionalized.
- sol-gel material it is possible to use the conventional steps of hydrolysis and of condensation of the precursors in solution, followed by a sol / gel transition.
- the sol-gel layer is deposited from a liquid product which is a colloidal suspension of compounds mentioned above, that is to say made up of species of size between 5 nm and 100 nm.
- This colloidal suspension is prepared by hydrolysis followed by a controlled condensation of salts or alkoxides of metals or metalloids M.
- the carrier medium is an organic solvent in order to facilitate the step of depositing and drying the film.
- the elements present may be particles in quasi-spherical or platelet form, oligomers or a mixture of particles on which oligomers will be grafted.
- the particles and / or the oligomers will have a relatively monodisperse characteristic dimension and in the range of sizes specified above.
- the sol-gel material By manufacturing the sol-gel material, it is possible to control the size of the pores of the thin layer of material prepared by the sol-gel route.
- the thin layer of material prepared by the sol-gel route will have pores of sizes between 5 nm and 100 nm, and a total porosity between 1% and 50%. There are different methods to optimize the pore size and the total porosity of the sol-gel layer.
- the size of the particles determined by the conditions of synthesis of the material (concentration, rate of hydrolysis, time of curing of the soil), - the shape of the particles, determined according to the precursor (nature of the metal M, nature of the salt or alkoxide) and conditions for the synthesis of the material,
- sol-gel layers with oligomeric structure we can play on the following parameters:
- the layer of sol-gel material may thus have a refractive index in the range 1.2 to 2.1. This makes it possible to optimize the fluorescence signal detected according to the detection technique used (near or far field microscopy, ellipsometry, etc.) and according to the grafting mode (surface or volume). In the case of the present invention, conditions for developing the layer are obtained which make it possible to lower its refractive index (n) relative to the refractive index of the bare substrate. In the context of the present invention, it is advantageous to check the relationship: H f sol-gel layer) ⁇ r l (substrate)
- the purpose of the support according to the invention is to produce biochips or any other biological analysis system. To achieve this, it is necessary that biological molecules or biomolecules are grafted onto and into the thin layer (s) obtained by the sol-gel route according to the invention. For this, one proceeds to the grafting of biological molecules, or bio-molecules, onto and into the thin layer of material prepared by the sol-gel route on the first face of the biochip support according to the invention by performing the following steps: prepares a soil intended to supply the solified material,
- the thin layer of sol-gel material is obtained from the thin layer of soil.
- the bio-molecules incorporated into the material during its preparation are silanized bio-molecules with a view to their grafting.
- the incorporation of the biomolecules can be done in different ways.
- the incorporation of the biomolecules is carried out by diffusion into said thin layer when the latter is in the form of a dry gel.
- the incorporation of the bio-molecules is carried out in said thin layer when the latter is in the form of a wet gel, the grafting of the bio-molecules taking place during the drying of the gel (it is recalled that the gel denotes a solid three-dimensional network trapping liquid (in its meshes)).
- the incorporation of the bio-molecules is carried out in the sol-gel material in the liquid state, the grafting of the biomolecules taking place in the soil. The grafted soil will then only have to gel and dry during deposition.
- the incorporation of the biomolecules is carried out in the sol-gel material when the latter is in the form of a sol, the grafting of the bio-molecules takes place in the sol before depositing the thin layer in the liquid state.
- the Soil preparation step includes a step of functionalization for obtaining a functionalized sol-gel material for grafting biomolecules after incorporation 'in the thin layer.
- the incorporation of the biomolecules can be done in different ways.
- the bio-molecules are incorporated into the thin layer when the latter is in the form of a dry gel.
- a dry gel To proceed with the grafting of biological molecules onto and into the thin layer of material prepared by the sol-gel route on the first face of the biochip support, it is possible to proceed as follows: - synthesize the sol-gel material by including its functionalization by view of the grafting of biomolecules,
- the biomolecules are incorporated into the thin layer when the latter is in the form of a wet gel. In this case, it will be possible to proceed with the grafting of the bio-molecules during the drying of the gel.
- the bio-molecules are incorporated into the sol-gel material when the latter is in the form of a sol, the grafting of the bio-molecules taking place in the sol before deposition of the thin layer. In this case, the grafting of the biomolecules will therefore be done before the soil gels and then the layer will be deposited and dried.
- the bio-molecules also being functionalized, their incorporation and their grafting are carried out in the soil before its deposition in a thin layer on the support.
- this particular grafting it is possible to proceed as follows: - synthesizing the sol-gel material, including its functionalization with a view to grafting the biomolecules,
- the layer of sol-gel material can be structured and given a particular configuration.
- these studs or bowls will be circular or square.
- the studs or cuvettes will have a characteristic dimension of between 10 and 200 micrometers, and will be spaced from 50 to 200 micrometers.
- the network of studs or cuvettes is produced using at least one of the techniques chosen from chemical attack, peeling, micro-machining of the layer of material prepared by sol-gel route or by direct deposition of a layer. structure of material prepared by sol-gel route by local micro-distributions.
- the choice of the structuring technique will preferably be made according to the characteristics of the sol-gel layer. We will look in particular:
- the layer has a high organic photo-crosslinkable fraction, direct shaping or revelation by chemical attack after photo-crosslinking can be used through a mask. If you are using a chemical attack, you could for example use a lift-off type protocol. If the layer of sol-gel material is weakly bound to the substrate, preferably use the peeling technique. If the layer is of low to moderate mechanical strength, a micromachining of the layer of material prepared by sol-gel is preferably carried out. If one proceeds to a direct deposition of the structured layer by local micro-distributions, one could for example use the inkjet technique ("ink-jet" in English) or crossing a needle in a film liquid (“pin and ring” in English).
- the present invention makes it possible to deposit on substrates of different natures (glass, polymer or semiconductor) thin layers based on Si0 2 , Ti0 2 , Ta 2 0 5 , Zr0 2 by sol-gel route.
- substrates of different natures glass, polymer or semiconductor
- sol-gel route Taking into account the particular optical properties of these thin sol-gel layers (low refractive index and extinction coefficient) and their physicochemical properties (porosities, interface state), fluorescence signals are obtained which differ from state of the art.
- the low thickness of the sol-gel layer deposited on the substrate, combined with a low refractive index and absorption coefficient provide the layer with its particular optical functionality, in addition to an increased grafting ability.
- FIG. 1 is a graph showing the evolution of the fluorescence signal coming from a biochip consisting of a support according to the invention, as a function of the thickness of the thin layer of sol-gel material placed on said support,
- FIG. 2 is a diagram of a support according to a particular case of the invention, said support consisting of a substrate of which two opposite faces support a thin layer of sol-gel material,
- FIG. 3 is a diagram showing a substrate supporting, on one side, a multilayer on which is deposited a thin layer of sol-gel material.
- This thin layer of low-index sol-gel material of a hundred nanometers thick when deposited on both sides of a substrate, makes it possible to obtain a reinforcement of the transmitted signal.
- the waves coupled by the fluorophores inside the cone of acceptance undergo a propagation according to the laws of Descartes. But the waves undergo a reflection of Fresnel attenuated due to the presence of a low refractive index on the surface. It can be seen in FIG. 2 that, when a light beam 6 is sent on a face of the substrate 5 having fluorphores on its surface, an emission 7 is obtained in the superstrate and an emission 8 in the substrate.
- the thin layer 29 of low refractive index on an optical multilayer 28 of the Bragg mirror type (see in FIG. 3). It is then noted that the excitation field inside the thin layer of sol-gel is increased when an incident beam 26 is sent on the support. There is indeed E1 ⁇ E2, with E1 and E2 the respective excitation field of the substrate and the thin layer. This particular configuration therefore makes it possible to increase the fluorescence emitted in the superstrate since the emission 37 in the superstrate is greater than the emission 27 in the superstrate without multilayer.
- - case 1 is a single substrate
- - case 2 is a substrate and a stack of thin layers of type 5 (HB) where H is Ti0 2 and B is Si0 2 ,
- CY 3 fluorophores situated at an altitude of 2 nm and oriented 90 ° relative to the surface of the support.
- the excitation and emission wavelengths of the laser sent to the samples are 543nm and 580nm respectively. It is specified that the refractive indices of Si0 2 and Ti0 2 are respectively 1.46 and 2.2, the index of the superstrate (that is to say the index of the medium of arrival of the light) is of 1 and the substrate index is 1.52.
- the digital aperture (ON) of the microscope used to observe the fluorescence of the microscope is 0.5.
- the sol-gel material is first produced by applying the conventional steps of hydrolysis and condensation of the precursors in solution, followed by a sol / gel transition as explained above.
- the sol-gel material being produced from a liquid treatment solution, it can be applied in a thin layer and homogeneously over the entire substrate by any of the following techniques:
- the low viscosity and the homogeneity of the treating solutions also make it possible to implement the micro-distribution techniques called “spotting”, that is to say depositing drops of liquid with a volume of between a few tens and a few hundred picoliters .
- Another applicable technique is an adaptation of the ink jet coating. It is therefore also possible to produce the pads of sol-gel material directly on the substrate by local distribution. This procedure is particularly advantageous if the grafting route is used according to the principle of the micro-reactor. In addition, it eliminates the step of structuring a layer deposited on the whole of the biochip and can make it possible to deposit locally on well plates.
- the thin layer has been deposited on the substrate, it may be necessary to structure said thin layer, the aim being ultimately to create studs or cuvettes on the biochip, of circular or square geometry, of dimensions between 10 and 200 ⁇ m and spaced 50 to 200 ⁇ m apart.
- the structuring of the thin layer results directly from the deposition.
- the conditions of the deposition such as the preparation of the substrate, the size and the spacing of the microdroplets, the drying and the gelation are studied so that the droplets do not coalesce before gelation and so that they have the desired dimension when gelled .
- the structuring will be obtained, according to the physicochemical nature of the layer and according to its mechanical properties, by l one of the following techniques: a chemical attack, for example according to a lift-off type protocol using an insolation mask, optionally a sacrificial layer, an acid or a mineral base, and an aqueous or organic solvent, -
- a simple mechanical peeling of the layer is carried out using an adhesive mask making it possible to obtain, in one operation, a network of micro- studs all over the chip,
- the silane S is grafted onto the probe N via the reactive group Y.
- This reactive group Y can be electrophilic or nucleophilic, and it reacts with a reactive group present on the probe.
- the silanized N probe can then be grafted onto the sol-gel matrix by condensation of the terminal part -Si (OR ') n with the residual silanols present in the preformed network of the sol-gel matrix.
- This grafting can be carried out by incorporating the silanized biomolecule into the deposited and dried layer (dry gel).
- dry gel we are dependent on the diffusion of the biomolecule in the gel.
- the strong porosity of the layer nevertheless allows a relatively rapid diffusion and grafting density.
- An alternative embodiment is to first silanize the sol-gel material during the preparation of the colloidal suspension or after deposition of the layer, then to incorporate the probe into the dry gel, the wet gel or the colloidal suspension. The grafting is then carried out by an organic condensation reaction.
- the probe on the silanized sol-gel matrix In the case of grafting to the probe of an organic sequence RI, this must include two reactive groups Yl and Y2.
- the reactive group Y2 will react with a reactive group XI of the probe, while the reactive group Y2 will react with a reactive group X2 of the sol-gel material.
- the organic sequence RI thus thus serves as a coupling agent between the sol-gel matrix and the biomolecule.
- the reactive group X2 will be one of those mentioned above in the description of the inorganic / organic composite sol-gel layers.
- silanization we can choose the method of grafting RI to the biomolecule and the sol-gel matrix which optimizes the yield and the final density.
- the grafting of the N oligonucleotide probes onto a layer of sol-gel comprises several steps. First of all, the hydroxylation of the N oligonucleotide probes is carried out in basic solution. Then they are silanized with a compound derived from a triethoxy silane which allows the formation of Si-O-Si bonds between the substrate and the silane of the probe. The terminal function of the silane is chosen so as to be able to covalently bind an oligonucleotide modified in 5 ′ by an amino group for example (an aldehyde can be chosen for example). Finally, the oligonucleotides are covalently grafted onto the layer of sol-gel material. In this exemplary embodiment, probes of 20 mothers modified in position 5 ′ by an arm NH 2 are deposited in solution in a 0.3M phosphate buffer with a concentration of 10 ⁇ m.
- the probes deposited on the sol-gel layers are hybridized with 0.1 ⁇ M concentration targets of complementary sequence carrying the fluorophore group CY 3 in the 5 ′ position.
- the biochip being now carried out, its fluorescence is observed on a confocal GS 3000 scanner.
- the fluorescence signal coming, on the one hand, from probes hybridized on glass of the state of the art and, on the other hand , of the biochip produced according to the invention that is to say a glass substrate comprising a thin layer of sol-gel
- the glass slides treated with a sol layer -gel have a gain of 1.5 to 2 compared to the glass of the state of the art.
- Patent W09427719A1 issued on 08/12/1994.
- Patent FR9902819 filed on 03/08/1999.
- Patent US598173 "Methods for immobilizing nucleic acids on a gel substrate”.
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Abstract
L'invention concerne un support pour biopuce comprenant un substrat supportant, sur une première face, au moins une couche poreuse de matériau, ladite couche étant destinée à assurer la fixation de molécules biologiques sur ladite couche et dans son volume, ledit support étant caractérisé en ce que ladite couche est une couche mince optique de matériau préparé par voie sol-gel et dont l'indice de réfraction est inférieur à l'indice de réfraction du substrat. L'invention concerne également un procédé de greffage de molécules biologiques sur et dans la couche mince de matériau préparé par voie sol-gel sur la première face du support pour biopuce. Ce procédé comprend les étapes suivantes :- préparation d'un sol destiné à fournir le matériau sol-gel,- incorporation des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation,- greffage des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation,- dépôt d'une couche mince dudit sol sur la première face du substrat, - obtention de la couche mince de matériau sol-gel à partir de la couche mince de sol. Enfin, un mode de réalisation particulier du procédé de greffage comprend en outre une étape de structuration de la couche mince de matériau sol-gel pour obtenir un réseau de plots ou de cuvettes sur tout ou partie du support de biopuce.
Description
SUPPORT DE BIOPUCE UTILISANT DES COUCHES MINCES DE MATERIAU SOL GEL ET PROCEDE DE REALISATION
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention a trait au domaine des microsystèmes biologiques. Plus particulièrement, elle concerne la réalisation d'un support de biopuce dont la détection est basée sur la collection d'un signal de fluorescence.
Ce support de biopuce ou biocapteur peut être utilisé dans le cadre de la réalisation de supports biopuces compatibles avec le greffage d'acides nucléiques (biopuces à ADN, biopuces à ARN) , d'acides aminés (puces à protéines, puces immunologiques) , ainsi que les biopuces cellulaires utilisées notamment dans les études de la transfection ou les études du chimiotactisme .
Le domaine de l'invention s'étend aussi à tous types de réactions de reconnaissance moléculaires
(anticorps/antigène, protéines-sucres...) .
L' invention concerne également un procédé de greffage de molécules biologiques dans le support selon l'invention.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
La technologie des biopuces ou biocapteurs à ADN est très utilisée dans les analyses biomédicales, comme par exemple dans l'expression des gènes, la détection de mutations ou de polymorphisme, le
séquençage et la découverte de gènes (voir le document [1] référencé à la fin de cette description) .
Ces biopuces sont constituées de réseaux microscopiques de molécules biologiques immobilisées sur des supports solides. Plusieurs approches peuvent être utilisées pour la préparation de ces microréseaux.
Tout d'abord, les molécules biologiques peuvent être directement synthétisées sur un substrat
(voir les documents [2] , [3] , [4] , [5] ) . Cependant, en opérant de cette manière, on obtient des oligonucléotides qui présentent des longueurs se situant dans un domaine de 10 à 60 mères. La limitation de la longueur maximale des sondes ainsi synthétisées constitue le principal problème de cette technologie. Les molécules biologiques peuvent également être pré-synthétisées, puis déposées sur des zones délimitées du support par l'intermédiaire de microrobots qui seront soit passifs (type « pin ») , soit actifs (type piézoélectrique ou type à jet d'encre) (voir le document [6]). Une grande gamme de molécules peut ainsi être déposée par cette méthode, comme par exemple les oligonucléotides, les produits issus d'amplification PCR d'ADN et les protéines.
De la même manière, différentes approches sont possibles pour coupler les molécules biologiques avec le support.
On peut utiliser le couplage électrostatique sur polyLysine (document [7] ) ou les interactions hydrophobes (document [8] ) . Cependant, ce type de liaison ne permet pas une analyse précise dans
certaines conditions de température ou de stringence des solutions d'hybridation.
On peut aussi coupler les molécules biologiques au support à l'aide de liaisons covalentes. Cette approche permet de mieux optimiser les conditions d'hybridation et donc la sensibilité des microréseaux, puisque les molécules sont greffées sur le support de manière covalente et irréversible (documents [9] , [10] ,
[11], [12]). On peut également effectuer ce couplage avec des oligonucléotides modifiés en 5' par un groupement pyrrole que l'on dépose par électrocopolymérisation avec du pyrrole sur des électrodes (document [13] ) . Cependant, quelles que soient les méthodes décrites précédemment, le greffage se fait en deux dimensions sur un support plan.
Afin d'augmenter la densité locale des molécules biologiques sur les biopuces, A. Mirzabekov a proposé d'utiliser des gels de polyacrylamides et de greffer les molécules en trois dimensions dans le volume de ce matériau (documents [14] , [15] , [16] ) . Ce principe est aussi utilisé pour des réactions enzymatiques in situ localisées, des reconnaissances antigènes/anticorps (document [17] ) , des amplifications PCR d' oligonucléotides immobilisées (document [18]) ou la détection de la production de toxines bactériennes.
En utilisant les gels de polyacrylamides tels que décrit dans le brevet déposé par A. Mirzabekov
(document [19] ) , on peut obtenir une densité de
biomolécules greffées plus importante que dans l'art antérieur. Mais, dans ce procédé, seules les réactions de la chimie organique sont utilisées pour coupler les biomolécules. En particulier, aucun agent de couplage de type silane n'est utilisé pour greffer les biomolécules sur le gel .
Par ailleurs, on ne cherche pas à améliorer le signal de fluorescence émanant de la biopuce, ou plus particulièrement, le rapport [signal de fluorescence/bruit] . En particulier, la monocouche de polyacrylamide n'a pas de fonction optique. En outre, cette monocouche est épaisse : elle a en effet une épaisseur d'environ 30 micromètres.
En ce qui concerne les matériaux sol-gel proprement dit, un certain nombre d'entre eux ont déjà été utilisés, principalement pour 1 ' encapsulâtion de protéines et l'étude de leur fonctionnalité. Beaucoup de travaux sont actuellement publiés sur l'influence de cette encapsulation sur la structure, la fonction, l'accessibilité, la conformation et la stabilité thermodynamiques des protéines (documents [20] , [21] , [22] ) . En particulier, on sait que la modification chimique appropriée des sol-gels permet un taux de greffage covalent de protéines plus important et/ou l'amélioration des propriétés de stabilité. Des études comparées de stabilité d'anticorps immobilisés ont montré de meilleurs résultats sur sol -gel par rapport à un greffage covalent sur verre (voir le document [23] ) . Par exemple, des sol-gels modifiés par des fonctions chloropropyl ou aminopropyl ont permis d'obtenir des
taux de protéines greffées deux à trois fois plus élevées que sur verre (document [24] ) .
Concernant ces études déjà publiées, on peut faire quelques constats.
Tout d'abord, on remarque que le nombre de matériaux testés est très limité. En effet, les matériaux testés se limitent généralement à des matrices de silice épaisses (>lmm) préparées à base de tétraéthoxysilane (TEOS) ou de tétraméthoxysilane (TMOS) . Les variantes concernent plutôt la modification de la matrice par :
- l'introduction de polymère (PVA, PEG à bas poids moléculaire) (document [21]) ou la diffusion d'ions pour jouer sur la polarité locale dans les pores,
- l'introduction de ligands pour fixer les biomolécules ,
- la diffusion de solvant (par exemple le glycérol (document [22])) pour moduler la viscosité locale. L'état de l'art n'a donc pas exploité pleinement la versatilité des propriétés microstructurales et physico-chimiques des matériaux sol-gel, ainsi que les différentes voies d'introduction et de greffage des biomolécules sur ou dans une couche sol-gel.
Par ailleurs, l'intérêt potentiel des couches minces (c'est à dire, des couches d'une épaisseur de l'ordre de 0,1 μm) est évoqué plusieurs fois mais n'a été prouvé jusqu'ici, semble-t-il, que par Zink et al. (document [25]). Néanmoins, cet intérêt
n'est aucunement motivé par la fonction optique de la couche. En particulier, les propriétés optiques des couches sol-gel utilisées pour l' encapsulation des protéines, qu'elles soient modifiées chimiquement ou pas, épaisses (>1 μm) ou minces, n'ont pas été étudiées ni quantifiées. Les auteurs se sont en effet contentés d'une transparence des gels suffisante pour permettre des mesures comparatives de signaux de fluorescence. L'idée de contribution des caractéristiques optiques de ces couches pour l'optimisation du signal de détection de la fluorescence n'est pas évoquée.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
Le but de l'invention est de fournir un support de biopuce pouvant avoir une densité locale de molécules biologiques greffées élevée par rapport à l'art antérieur, mais également permettant d'obtenir un signal de détection par fluorescence amélioré (plus précisément, un rapport signal à bruit de détection par fluorescence amélioré) .
Ce but et d'autres encore sont atteints, conformément à l'invention, par un support pour biopuce comprenant un substrat supportant, sur une première face, au moins une couche poreuse de matériau, ladite couche étant destinée à assurer la fixation de molécules biologiques sur ladite couche et dans son volume, ledit support étant caractérisé en ce que ladite couche est une couche mince optique de matériau préparé par voie sol-gel et dont l'indice de réfraction est inférieur à l'indice de réfraction du substrat.
Les couches de matériaux obtenus par voie sol -gel présentent une surface développée de greffage importante, du fait de leur très forte porosité par rapport à une couche de même nature obtenue par dépôt selon d'autres techniques classiques (PVD, IBS, CVD) . Cette forte porosité permet de greffer en trois dimensions de fortes concentrations de molécules biologiques, et par là même, d'augmenter significativement le signal de fluorescence. De plus, compte tenu de l'efficacité du greffage volumique des couches de matériau sol -gel, l'épaisseur de matériau sol-gel à déposer sur le substrat est inférieure à celle des gels classiquement employés dans l'art antérieur. L'épaisseur des couches mises en œuvre par l'invention peut ainsi varier, selon la nature de la couche déposée et la densité de sondes à y greffer, de 0,1 à 5 μm. Ces couches peuvent être déposées en une ou plusieurs étapes selon les techniques décrites plus loin. On se situe donc dans le domaine des couches minces, contrairement à l'art antérieur qui utilisait des couches épaisses (supérieures à 20 μm, nominalement 30 μm) .
On va donc pouvoir exploiter les caractéristiques optiques des couches minces sol -gel déposées sur le substrat. Ces caractéristiques optiques des couches minces vont également pouvoir être optimisées de manière à augmenter le signal de fluorescence détecté après greffage de la molécule marquée sur ou dans la couche sol -gel en question. Avantageusement, par le choix des précurseurs et de la voie de synthèse de la couche
mince de matériau sol-gel, on peut obtenir une fluorescence intrinsèque de la couche très faible aux longueurs d'onde d'intérêt, c'est à dire aux longueurs d'onde d'excitation que l'on enverra plus tard sur le dispositif pour étudier la fluorescence des fluorophores fixés dans ou à la surface de la couche mince .
De plus, la couche de matériau sol-gel peut présenter une faible absorption dans l'UV et dans le domaine visible, ce qui permet de limiter la contribution des pertes non-radiatives . Il en découle une amélioration du bilan énergétique en faveur de l'émission de fluorescence dans l'espace libre. Avec cette caractéristique, la quantité de lumière émise est supérieure par rapport à l'art antérieur. Les signaux recueillis par les scanners de lecture des biopuces issus de l'invention vont donc bénéficier d'un rapport signal à bruit amélioré.
Par ailleurs, la couche sol-gel peut avoir avantageusement une faible rugosité de surface, ce qui permet de limiter la diffusion de la lumière de fluorescence .
Pour ces trois premiers points, les couches minces sol-gel utilisées par la présente invention apportent une amélioration des performances par rapport à l'art antérieur. En disposant une couche mince de matériau sol-gel sur le substrat, on augmente donc le signal de fluorescence.
Selon un mode de réalisation particulier, le support selon l'invention comprend en outre au moins
une couche mince optique de matériau préparé par voie sol-gel supportée par une deuxième face du substrat opposée à la première face, ladite couche mince supportée par la deuxième face ayant un indice de réfraction inférieur à celui du substrat. En d'autres termes, le dispositif selon l'invention comprend une ou plusieurs couches minces sur une face du substrat et une ou plusieurs couches minces sur la face opposée.
Selon un autre mode de réalisation, le support selon l'invention comprend un empilement de couches minces diélectriques formant un miroir de Bragg intercalé entre le substrat et la couche mince de matériau préparé par voie sol-gel. Cette configuration particulière va permettre d'augmenter le champ excitateur à l'intérieur de la couche mince de matériau sol-gel. Cela est particulièrement intéressant quand on veut étudier la fluorescence de fluorophores greffés dans ou à la surface de la couche de sol -gel, car cette configuration a pour effet d'augmenter l'excitation desdits fluorophores et donc d'augmenter la quantité de lumière émise dans le superstrat. On précise qu'un miroir de Bragg est un empilement successif de plusieurs couches minces diélectriques d'indices de réfraction ni et n2 différents. L'épaisseur de chacune de ces couches est égale à λ/ (4n) , avec n pouvant prendre la valeur ni ou n2. La variable λ correspond à la longueur d'onde à laquelle on souhaite avoir une réflexion maximale pour le miroir de Bragg.
Les couches de matériau préparé par voie sol-gel sont compatibles avec la plupart des substrats,
minéraux ou organiques, quelles que soient leur nature chimique et leurs propriétés optiques, mécaniques ou thermiques. Avantageusement, le substrat sera formé d'un matériau choisi parmi le groupe comprenant les verres, les polymères et les semi-conducteurs .On peut donc envisager de réaliser des supports de biopuces sur un substrat de verre, de silicium ou de plastique. On pourra bien entendu choisir tout autre matériau, à condition que les couches de matériau sol-gel soient compatibles avec le substrat choisi.
Selon un mode de réalisation particulier, le matériau préparé par voie sol-gel a une composition purement inorganique. Selon un deuxième mode de réalisation, il est composé d'une fraction inorganique et d'une fraction organique.
Si on se trouve dans le cas où le matériau est composé à la fois d'une fraction inorganique et d'une fraction organique, la fraction inorganique sera avantageusement majoritaire par rapport à la fraction organique. Avantageusement, que la fraction inorganique soit majoritaire ou non, ladite fraction donnera sa cohésion au matériau sol-gel.
Que le matériau soit de composition purement inorganique ou à la fois inorganique et organique, ce matériau comportera avantageusement au moins un composé choisi parmi:
- un oxyde Mx0y, avec M choisi parmi le groupe constitué de Si, Al, Zr, Ti et Ta, - un composé de type -M-O-M'-, avec M et M' choisis parmi le groupe constitué de Si, Al, Zr, Ti et Ta.
On pourra ainsi avoir, par exemple, des matériaux tels que Si02, Ti02, Ta205, Zr02 et/ou des mélanges de deux ou plus de ces oxydes.
Avantageusement, lorsque le matériau préparé par voie sol -gel comporte un composé de type - M-O-M'-, M est Si et M' est Zr ou Ti .
Dans ce type de couche, on pourra utiliser par exemple les sites M-OH libres comme sites réactifs pour le greffage ultérieur de sondes oligonucléotides, après silanisation de ces sites ou des sondes.
Lorsque le matériau sol -gel est composé d'une fraction inorganique et d'une fraction organique, ledit matériau a des caractéristiques particulières. Selon un mode de réalisation particulier, la fraction organique est un polymère, ledit polymère restant libre ou étant faiblement lié aux éléments constituant la fraction inorganique. En particulier, la fraction organique résulte de l'adjonction d'un polymère organique dans la suspension colloïdale inorganique destinée à former le matériau sol-gel. En procédant ainsi, et après les étapes de dépôt et de gélification du matériau sur le substrat, le polymère est emprisonné dans les mailles du réseau inorganique. Ce polymère peut avoir plusieurs fonctionnalités qui sont notamment le remplissage partiel de la porosité naturelle de la couche, permettant ainsi de moduler la porosité naturelle de la couche et/ou la taille des pores, et l'incorporation dans la couche de groupements organiques réactifs permettant le greffage des sondes oligonucléotides .
Selon un autre mode de réalisation, la fraction organique résulte de l'incorporation d'un silane X-R2-Si (ORi) n dans la fraction inorganique. En particulier, cette incorporation se fait lors de la synthèse du sol et le silane se lie aux sels ou alcoxydes métalliques de la fraction inorganique (on rappelle que le sol désigne une suspension colloïdale de particules dans un liquide) . On a alors création d'un réseau composite de type M-O-Si (R2X) -O-M- . Avantageusement, Ri sera choisi parmi le groupe comprenant -CH3, -C2H5, nPr, iPr ou tBu, R2 sera une chaîne aliphatique de longueur p-CH2, de préférence sans fonction éther -CH2-0-CH2-, et avec p compris entre 2 et 10, et X sera un groupement organique terminal réactif choisi parmi le groupe comprenant -OH, -COOH, - CH=0, -NH2, -Cl, -époxy, -glycidoxy, -CH=CH2, -acryl ou -méthalcryl .
Notons que la longueur de la chaîne aliphatique peut servir à moduler la taille des cavités du réseau, dans le but d'accueillir une sonde oligonucléotide de longueur déterminée. Le groupement X quant à lui peut permettre le greffage d'un oligonucléotide lui-même fonctionnalisé.
Pour synthétiser les couches de matériau sol-gel selon l'invention, on peut utiliser les étapes classiques d'hydrolyse et de condensation des précurseurs en solution, suivie d'une transition sol/gel . La couche sol -gel est déposée à partir d'un produit liquide qui est une suspension colloïdale des
composés cités ci-dessus, c'est-à-dire constituée d'espèces de taille comprise entre 5 nm et 100 nm.
Cette suspension colloïdale est préparée par hydrolyse suivie d'une condensation contrôlée de sels ou d' alcoxydes de métaux ou de métalloïdes M. Au final, le milieu porteur est un solvant organique afin de faciliter l'étape de dépôt et de séchage du film.
Dans la suspension colloïdale, les éléments présents pourront être des particules sous forme quasi- sphérique ou de plaquettes, des oligomères ou un mélange de particules sur lesquelles seront greffés des oligomères. Dans tous les cas, les particules et/ou les oligomères auront une dimension caractéristique relativement monodisperse et dans la gamme de tailles précisées ci-dessus.
En fait, ce sont la nature, la taille et la forme de ces espèces en suspension qui donneront, après dépôt et gélification, la microstructure de la couche de matériau sol-gel. En effet, ce sont ces espèces qui vont déterminer la porosité totale et la taille des pores de la couche sol-gel. Généralement, la structure de la couche sera de type oligomérique.
En fabriquant le matériau sol-gel, on peut maîtriser la taille des pores de la couche mince de matériau préparé par voie sol-gel. Avantageusement, la couche mince de matériau préparé par voie sol-gel possédera des pores de tailles comprises entre 5 nm et 100 nm, et une porosité totale comprise entre 1% et 50%.
Il existe différentes méthodes pour optimiser la taille des pores et la porosité totale de la couche sol -gel.
Tout d'abord, pour les couches sol -gel ayant une structure particulaire, on peut jouer sur les paramètres suivants :
- la taille des particules, déterminée par les conditions de synthèse du matériau (concentration, taux d'hydrolyse, temps de mûrissement du sol), - la forme des particules, déterminée en fonction du précurseur (nature du métal M, nature du sel ou de l'alcoxyde) et des conditions de synthèse du matériau,
- la compacité de l'empilement des particules dans la couche (empilement compact de type sphères dures ou chapelet de particules formant un réseau ménageant des cavités d'une certaine dimension permettant d'accueillir les sondes à greffer),
- l'emploi d'un agent de remplissage intimement mélangé ou lié de manière covalente aux particules. Pour les couches sol-gel à structure oligomèrique, on pourra jouer sur les paramètres suivants :
- la taille des oligomères,
- la compacité de l'empilement des oligomères et/ou la taille naturelle du réseau après gélification,
- la densification éventuelle de la couche après son dépôt par une méthode thermique ou autre,
- l'incorporation dans le réseau de greffons latéraux organiques plus ou moins longs servant d'espaceurs. En jouant sur ces paramètres, on peut maîtriser la taille des pores et la porosité totale de
la couche mince obtenue par voie sol-gel dans les gammes précisées plus haut. Cela permet ainsi de maîtriser la densité de sondes greffées dans une gamme de concentrations très large. On rend donc possible, pour de nombreuses applications spécifiques, la fabrication industrielle de puces étalons ainsi que de puces « sur mesure » permettant de normaliser des signaux de fluorescence entre sondes de natures et/ou de longueurs différentes. Par ailleurs, en fonction du choix de la matrice sol-gel constituant la couche de matériau sol- gel, on pourra moduler l'indice de réfraction de ladite couche. La couche de matériau sol-gel pourra ainsi avoir un indice de réfraction compris dans la plage 1,2 à 2,1. Cela permet d'optimiser le signal de fluorescence détecté selon la technique de détection employée (microscopie en champ proche ou en champ lointain, ellipsométrie...) et selon le mode de greffage (surfacique ou volumique) . Dans le cas de la présente invention, on obtient des conditions d'élaboration de la couche qui permettent de baisser son indice de réfraction (n) par rapport à l'indice de réfraction du substrat nu. Dans le cadre de la présente invention, il est avantageux de vérifier la relation : H fcouche sol-gel) <rl (substrat)
Dans le cas particulier de l'utilisation d'une couche mince de sol-gel sur un multicouche optique (miroir de Bragg) , cette relation se généralisera sous la forme suivante : Y(couche sol-gel) <Y (multicouche)
où Y représente l'admittance optique de l'onde dans la couche mince de matériau sol-gel ou le miroir de Bragg.
Le but du support selon l'invention est de réaliser des biopuces ou tout autre système d'analyse biologique. Pour y arriver, il faut que des molécules biologiques ou bio-molécules soient greffées sur et dans la (les) couche (s) mince (s) obtenue (s) par voie sol-gel selon l'invention. Pour cela, on procède au greffage de molécules biologiques, ou bio-molécules, sur et dans la couche mince de matériau préparé par voie sol -gel sur la première face du support pour biopuce selon l'invention en exécutant les étapes suivantes : - on prépare un sol destiné à fournir le matériau sol- gei,
- on incorpore des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation,
- on greffe des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation,
- on dépose une couche mince dudit sol sur la première face du substrat,
- on obtient la couche mince de matériau sol -gel à partir de la couche mince de sol . Selon un cas particulier, les bio-molécules incorporées dans le matériau au cours de sa préparation sont des bio-molécules silanisées en vue de leur greffage.
Dans ce cas, l'incorporation des bio- molécules peut se faire de différentes manières.
Selon un premier mode de réalisation, , l'incorporation des bio-molécules est effectuée par diffusion dans ladite couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel sec. Pour procéder au greffage de molécules biologiques sur et dans la couche mince de matériau préparé par voie sol-gel sur la première face du support pour biopuce, on pourra procéder de la manière suivante :
- synthétiser le matériau sol-gel destiné à constituer la couche mince,
- silaniser ou fonctionnaliser les bio-molécules à greffer,
- déposer le matériau sol-gel sur le substrat sous forme d'une couche mince, - incorporer les bio-molécules dans le gel sec par diffusion,
- et greffer les bio-molécules sur la matrice sol-gel.
Selon un deuxième mode de réalisation, l'incorporation des bio-molécules est effectuée dans ladite couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel humide, le greffage des bio-molécules se réalisant lors du séchage du gel (on rappelle que le gel désigne un réseau solide tridimensionnel emprisonnant du liquide (dans ses mailles) ) . Selon un troisième mode de réalisation, l'incorporation des bio-molécules est effectuée dans le matériau sol-gel à l'état liquide, le greffage des biomolécules se réalisant dans le sol. Le sol greffé n'aura alors plus qu'à gélifier et à sécher lors du dépôt. En d'autres termes, l'incorporation des biomolécules est effectuée dans le matériau sol-gel
lorsque celui-ci est sous forme de sol, le greffage des bio-molécules se réalisant dans le sol avant dépôt de la couche mince à l'état liquide.
Selon un autre cas particulier, l'étape de préparation du sol inclut une étape de fonctionnalisâtion destinée à obtenir un matériau sol- gel fonctionnalisé permettant le greffage des biomolécules après leur incorporation' dans la couche mince.
Dans ce cas, l'incorporation des biomolécules peut se faire de différentes manières.
Selon un premier mode de réalisation, les bio-molécules sont incorporées dans, la couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel sec. Pour procéder au greffage de molécules biologiques sur et dans la couche mince de matériau préparé par voie sol- gel sur la première face du support pour biopuce, on pourra procéder de la manière suivante : - synthétiser le matériau sol-gel en incluant sa fonctionnalisation en vue du greffage des biomolécules,
- déposer le matériau sol-gel sur le substrat sous forme d'une couche mince, - incorporer les bio-molécules dans le gel sec,
- et greffer les bio-molécules.
Selon un deuxième mode de réalisation, les bio-molécules sont incorporées dans la couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel humide. Dans ce cas, on poura procéder au greffage des bio-molécules pendant le séchage du gel .
Selon un troisième mode de réalisation, les bio-molécules sont incorporées dans le matériau sol-gel lorsque celui-ci est sous forme de sol, le greffage des bio-molécules se réalisant dans le sol avant dépôt de la couche mince. Dans ce cas, le greffage des biomolécules se fera donc avant que le sol ne gélifie et on procédera ensuite au dépôt et au séchage de la couche .
Selon un quatrième mode d réalisation, les bio-molécules étant également fonctionnalisées, leur incorporation et leur greffage sont effectués dans le sol avant son dépôt en couche mince sur le support . Pour procéder à ce greffage particulier, on pourra procéder de la manière suivante : - synthétiser le matériau sol-gel, incluant sa fonctionnalisation en vue du greffage des biomolécules,
- fonctionnaliser les bio-molécules,
- incorporer les bio-molécules dans le sol liquide, - greffer les bio-molécules,
- déposer le sol contenant les bio-molécules greffées sur le support,
- attendre la gélification du sol puis sécher le gel.
Selon un mode particulier de l'invention, on peut structurer la couche de matériau sol-gel et lui donner une configuration particulière. Pour cela, on utilise le procédé de greffage tel que décrit précédemment en lui ajoutant une étape de structuration de la couche mince de matériau sol-gel pour obtenir un réseau de plots ou de cuvettes sur tout ou partie du
support de biopuce. Avantageusement, ces plots ou cuvettes seront de forme circulaire ou carrée.
Avantageusement, les plots ou cuvettes seront de dimension caractéristique comprise entre 10 et 200 micromètres, et seront espacés de 50 à 200 micromètres .
Avantageusement, le réseau de plots ou de cuvettes est réalisé en utilisant au moins une des techniques choisies parmi une attaque chimique, un pelage, un micro-usinage de la couche de matériau préparé par voie sol-gel ou par dépôt direct d'une couche structurée de matériau préparé par voie sol-gel par micro-distributions locales. Le choix de la technique de structuration se fera de préférence en fonction des caractéristiques de la couche sol-gel. On regardera en particulier :
- le couplage de la couche sol-gel au substrat et sa tenue mécanique,
- la proportion de la fraction inorganique et de la fraction organique,
- la résistance chimique de la fraction inorganique, principalement aux acides et aux bases minéraux, et de la fraction organique, principalement aux solvants organiques . Si la couche comporte une forte fraction organique photo-réticulable, on pourra utiliser une mise en forme directe ou une révélation par attaque chimique après photo-réticulation à travers un masque. Si l'on utilise une attaque chimique, on pourra par exemple utiliser un protocole de type lift-off. Si la couche de matériau sol-gel est faiblement liée au
substrat, on utilisera de préférence la technique du pelage. Si la couche est de résistance mécanique faible à modérée, on procédera de préférence à un microusinage de la couche de matériau préparé par voie sol- gel. Si l'on procède à un dépôt direct de la couche structurée par micro-distributions locales, on pourra utiliser par exemple la technique de jet d'encre (« ink-jet » en anglais) ou de traversée d'une aiguille dans un film liquide (« pin and ring » en anglais) .
En résumé, la présente invention permet de déposer sur des substrats de différentes natures (verre, polymère ou semi-conducteur) des couches minces à base de Si02, Ti02, Ta205, Zr02 par voie sol-gel. Compte tenu des propriétés optiques particulières de ces couches minces sol-gel (faibles indice de réfraction et coefficient d'extinction) et de leurs propriétés physico-chimiques (porosités, état d'interface), on obtient des signaux de fluorescence qui se distinguent de l'état de l'art. La faible épaisseur de la couche sol-gel déposée sur le substrat, combinée avec un indice de réfraction et un coefficient d'absorption faibles apportent à la couche sa fonctionnalité optique particulière, en plus d'une faculté de greffage accrue.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre
d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels :
- la figure 1 est un graphique présentant l'évolution du signal de fluorescence provenant d'une biopuce constitué d'un support selon l'invention, en fonction de l'épaisseur de la couche mince de matériau sol -gel disposé sur ledit support,
- la figure 2 est un schéma d'un support selon un cas particulier de l'invention, ledit support étant constitué d'un substrat dont deux faces opposées supportent une couche mince de matériau sol-gel,
- la figure 3 est un schéma représentant un substrat supportant, sur une face, un multicouche sur lequel est déposé une couche mince de matériau sol-gel.
EXPOSE DETAILLE D'UN MODE DE REALISATION PARTICULIER
Tout d'abord, le comportement en fluorescence d'une monocouche de sol-gel déposée sur une lame de microscope va être optimisé. Pour cette expérience, on considère un substrat de verre d'indice 1,52 comportant une couche mince sur laquelle est greffé un fluorophore. Le fluorophore pris en compte est le CY3 (excitation = 543 nm, émission = 580 nm) . Notons que le moment dipolaire de ce type de molécules a tendance à s'orienter de manière parallèle à la surface (voir le document [26] ) .
L'expérience a été menée pour deux valeurs d'indices de réfraction de la couche mince (1,2 et
1,4), les deux indices étant choisis inférieurs à l'indice du substrat, et pour une ouverture numérique du microscope de 0,5.
On envoie un faisceau laser d'excitation d' intensité lex sur la couche mince à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore et on observe la fluorescence . Dans ces conditions, le comportement en fluorescence du dispositif selon l'invention en fonction de l'épaisseur de la couche mince suit l'évolution présentée dans la figure 1. Les courbes 1 et 2 représentent respectivement l'intensité totale et l'intensité obtenue pour une ouverture numérique de 0,5 avec un indice n=l,2 ; les courbes 3 et 4 représentent quant à elles respectivement l'intensité totale et l'intensité obtenue pour une ouverture numérique de 0,5 avec un indice n=l,4. Conformément à ce qui a été pressenti, la figure 1 indique qu'en choisissant un matériau d'indice plus faible, (n=l,2), on favorise l'émission de la fluorescence "dans le superstrat
(milieu incident) . On obtient ainsi, dans le cas n=l,2 et par rapport à une lame de microscope d'indice n=l,52 un rendement amélioré d'un facteur 3,5 avec une monocouche de sol-gel d'une centaine de nanometres d' épaisseur.
Cette couche mince de matériau sol-gel bas indice d'une centaine de nanometres d'épaisseur, lorsqu'elle est déposée sur les deux faces d'un substrat, permet d'obtenir un renforcement du signal transmis. En effet, les ondes couplées par les fluorophores à l'intérieur du cône d'acceptance subissent une propagation suivant les lois de Descartes. Mais les ondes subissent une réflexion de
Fresnel atténuée en raison de la présence d'un faible indice de réfraction en surface. On peut voir sur la figure 2 que, lorsque l'on envoie un faisceau de lumière 6 sur une face du substrat 5 présentant à sa surface des fluorphores, on obtient une émission 7 dans le superstrat et une émission 8 dans le substrat. Lorsque les fluorophores sont greffés dans une couche mince 9 de matériau sol-gel d'indice inférieur à celui du substrat et déposé sur une des faces du substrat, on obtient une émission 17 dans le superstrat supérieure à l'émission 7 et une émission 18 dans le substrat supérieure à l'émission 8. Dans cette figure et de manière avantageuse, on a déposé une deuxième couche mince 9 de matériau sol-gel sur la face opposée à la face du substrat 5 comportant déjà une première couche 9. La présence de cette couche mince 9 de faible indice par rapport au substrat va entraîner l'apparition d'un phénomène de diminution de la réflexion du faisceau lumineux 6.
Selon un autre mode de réalisation, on peut également déposer la couche mince 29 de faible indice de réfraction sur un multicouche optique 28 de type miroir de Bragg (voir sur la figure 3) . On remarque alors que le champ excitateur à l'intérieur de la couche mince de sol-gel est augmenté lorsque l'on envoie un faisceau incident 26 sur le support. On a en effet E1<E2, avec El et E2 le champ excitateur respectif du substrat et de la couche mince. Cette configuration particulière permet donc d'augmenter la fluorescence émise dans le superstrat car l'émission 37
dans le superstrat est supérieure à l'émission 27 dans le superstrat sans multicouche.
Pour illustrer l'intérêt du dispositif selon l'invention et de ses différentes variantes, on réalise des modélisations en comparant quatre types d'empilements :
- le cas 1 est un substrat seul,
- le cas 2 est un substrat et un empilement de couches minces du type 5 (HB) où H est Ti02 et B est Si02,
- le cas 3 est un substrat et un empilement de couches minces du type 4 (HB) (HB' ) où B' est un matériau sol-gel d'indice de réfraction n = 1,3,
- le cas 4 est un substrat et un empilement de couches minces du type 4 (HB) (HB' ) où B' est un matériau sol-gel d'indice de réfraction n = 1,22.
Pour réaliser cette étude, on utilise des fluorophores CY3 situés à une altitude de 2 nm et orientés de 90° par rapport à la surface du support. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission du laser envoyées sur les échantillons sont respectivement de 543nm et de 580nm. On précise que les indices de réfraction de Si02 et de Ti02 sont respectivement de 1,46 et de 2,2, l'indice du superstrat (c'est à dire l'indice du milieu d'arrivée de la lumière) est de 1 et l'indice du substrat est de 1,52. L'ouverture numérique (ON) du microscope utilisé pour l'observation de la fluorescence du microscope est de 0,5.
26
Les simulations sur le logiciel « fluoplus » du CEA- LETI donnent les résultats suivants :
Si l'on compare ces résultats en prenantle cas 1 comme référence, on obtient :
De ces résultats, on en conclut qu'avec un sol-gel d'indice plus faible que la silice, on augmente l'émission totale de fluorescence sans modifier l'intensité d'excitation (« bleaching » en anglais), et que ce phénomène est encore accentué si on intercale un traitement optique de type miroir de Bragg entre le substrat et la couche bas indice de surface . Cela constitue un élément important par rapport à l'art antérieur.
Pour illustrer la présente invention, nous allons maintenant détailler un mode de réalisation basé sur le greffage covalent de sondes d' oligonucléotides sur une couche mince de silice réalisée par voie sol- gel.
On réalise dans un premier temps le matériau sol-gel en appliquant les étapes classiques d'hydrolyse et de condensation des précurseurs en solution, suivie d'une transition sol/gel tel qu'explicité précédemment.
Le matériau sol-gel étant réalisé à partir d'une solution traitante liquide, on pourra l'appliquer en une couche mince et de manière homogène sur la totalité du substrat par l'une quelconque des techniques suivantes :
- trempé ou trempage-retrait,
- centrifugation,
- enduction à l'horizontale de type « meniscus coating », c'est à dire par dépôt par tirage, - pulvérisation.
La faible viscosité et l'homogénéité des solutions traitantes permettent également de mettre en œuvre les techniques de micro-distribution dites de « spotting », c'est à dire de dépôt de gouttes de liquide de volume compris entre quelques dizaines et quelques centaines de picolitres. Une autre technique applicable est une adaptation de l'« ink jet coating ». On pourra donc également réaliser les plots de matériau sol-gel directement sur le substrat par distribution locale. Cette procédure est particulièrement intéressante si on utilise la voie de greffage selon le
principe du micro-réacteur. De plus, elle supprime l'étape de structuration d'une couche déposée sur l'ensemble de la biopuce et peut permettre de déposer localement sur des plaques à puits.
Une fois la couche mince déposée sur le substrat, on peut avoir à structurer ladite couche mince, le but étant au final de créer sur la biopuce des plots ou des cuvettes, de géométrie circulaire ou carrée, de dimensions comprises entre 10 et 200 μm et espacées de 50 à 200 μm.
Dans le cas d'une micro-distribution locale selon les techniques de « spotting » ou « d' ink jet coating », la structuration de la couche mince résulte directement du dépôt. Les conditions du dépôt telles que la préparation du substrat, la taille et l'espacement des micro-gouttelettes, le séchage et la gélification sont étudiées pour que les gouttelettes ne coalescent pas avant gélification et pour qu'elles aient la dimension souhaitée une fois gélifiées.
Dans le cas où la couche sol-gel est d'abord déposée sur l'intégralité du substrat, selon une des techniques énumérées précédemment, la structuration sera obtenue, selon la nature physico- chimique de la couche et selon ses propriétés mécaniques, par l'une des techniques suivantes : - une attaque chimique, par exemple selon un protocole de type lift-off utilisant un masque d'insolation, éventuellement une couche sacrificielle, un acide ou une base minérale, et un solvant aqueux ou organique,
- dans le cas d'une couche peu dense et/ou faiblement liée au substrat, on effectue un simple pelage mécanique de la couche à l'aide d'un masque adhésif permettant d'obtenir, en une opération, un réseau de micro-plots sur toute la puce,
- un micro-usinage automatisé, dans le cas d'une couche de résistance mécanique faible à modérée,
- dans le cas d'une couche comportant une forte fraction organique photo-réticulable, on pourra utiliser une mise en forme directe ou une révélation par attaque chimique après photo-réticulation à travers un masque .
Passons maintenant à l'étape de préparation de la sonde. Sur la sonde d' oligonucléotide N, on va greffer le fluorophore F et le greffon G qui peut être un silane S ou une séquence organique RI.
Dans le cas du greffage d'un silane s' écrivant Y-R2-Si (OR' ) n, le silane S se greffe sur la sonde N via le groupement réactif Y. Ce groupement réactif Y peut être électrophile ou nucléophile, et il réagit avec un groupement réactif présent sur la sonde.
La sonde N silanisée peut ensuite être greffée sur la matrice sol -gel par condensation de la partie terminale -Si(OR')n avec les silanols résiduels présents dans le réseau préformé de la matrice sol-gel.
Ce greffage peut être réalisé par incorporation de la biomolécule silanisée dans la couche déposée et séchée (gel sec) . Dans ce cas, on est tributaire de la diffusion de la biomolécule dans le gel. La forte
porosité de la couche permet néanmoins une diffusion et une densité de greffage relativement rapide.
Pour augmenter la vitesse de diffusion et la densité de sondes greffées, on peut opérer avant que le gel ne soit trop sec, le solvant encore emprisonné dans les cavités facilitant la répartition de la sonde dans tout le volume de la matrice sol-gel.
Enfin, on peut tenter d'incorporer la sonde silanisée à l'état liquide dans la suspension colloïdale, puis réaliser le dépôt de cette substance sur le substrat. Cette technique permet d'avoir un mélange intime, à l'échelle moléculaire, entre la suspension colloïdale et les sondes, d'optimiser la quantité de sondes greffées et de garantir une densité de sondes greffées homogène dans tout le volume de la couche .
Une variante de réalisation est de silaniser d'abord le matériau sol-gel lors de la préparation de la suspension colloïdale ou après dépôt de la couche, puis d'incorporer la sonde dans le gel sec, le gel humide ou la suspension colloïdale. Le greffage se fait alors par une réaction de condensation organique .
Le choix entre les deux variantes dépendra, au cas par cas, de la facilité de greffage:
- du silane sur la sonde,
- du silane ou de la sonde silanisée sur la matrice sol-gel,
- de la sonde sur la matrice sol-gel silanisée.
Dans le cas du greffage sur la sonde d'une séquence organique RI, celle-ci doit comporter deux groupements réactifs Yl et Y2. Le groupement réactif Y2 réagira avec un groupement réactif XI de la sonde, tandis que le groupement réactif Y2 réagira avec un groupement réactif X2 du matériau sol-gel. La séquence organique RI sert donc ainsi d'agent de couplage entre la matrice sol-gel et la biomolécule. Le groupement réactif X2 sera l'un de ceux cités plus haut dans la description des couches sol-gel composites inorganique/organique .
De même que pour la silanisation, on pourra choisir la méthode de greffage de RI à la biomolécule et à la matrice sol-gel qui optimise le rendement et la densité finale.
Le greffage des sondes d'oligonucléotides N sur une couche de sol-gel comporte plusieurs étapes. Tout d'abord, on procède à l'hydroxylation des sondes d'oligonucléotides N en solution basique. Puis on les silanise avec un composé dérivé d'un triéthoxy silane qui permet la formation de liaisons Si-O-Si entre le substrat et le silane de la sonde. La fonction terminale du silane est choisie de manière à pouvoir lier de façon covalente un oligonucléotide modifié en 5' par un groupement amino par exemple (on pourra choisir un aldéhyde par exemple) . Enfin, on procède au greffage covalent des oligonucléotides sur la couche de matériau sol-gel. Dans cet exemple de réalisation, des sondes de 20 mères modifiées en position 5' par un bras
NH2 sont déposées en solution dans un tampon phosphate 0,3M avec une concentration de 10 μm.
Les sondes déposées sur les couches de sol-gel sont hybridées avec des cibles de concentration 0,1 μM de séquence complémentaire portant le groupement fluorophore CY3 en position 5'.
La biopuce étant maintenant réalisée, on observe sa fluorescence sur un scanner confocal GS 3000. En mesurant le signal de fluorescence provenant, d'une part, de sondes hybridées sur du verre de l'état de l'art et, d'autre part, de la biopuce réalisée selon l'invention (c'est à dire un substrat de verre comportant une couche mince de sol-gel) , on constate que, d'un point de vue quantitatif, les lames de verre traitées avec une couche sol-gel présentent un gain de 1,5 à 2 par rapport au verre de l'état de l'art.
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Claims
1. Support pour biopuce comprenant un substrat (5,25) supportant, sur une première face, au moins une couche poreuse de matériau, ladite couche étant destinée à assurer la fixation de molécules biologiques sur ladite couche et dans son volume, ledit support étant caractérisé en ce que ladite couche est une couche mince (9,29) optique de matériau préparé par voie sol-gel et dont l'indice de réfraction est inférieur à l'indice de réfraction du substrat (5,25).
2. Support pour biopuce selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une couche mince (9,29) optique de matériau préparé par voie sol-gel supportée par une deuxième face du substrat (5,25) opposée à la première face, ladite couche mince supportée par la deuxième face ayant un indice de réfraction inférieur à celui du substrat.
3. Support pour biopuce selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un empilement (28) de couches minces diélectriques formant un miroir de Bragg intercalé entre le substrat (25) et la couche mince (29) de matériau préparé par voie sol- gel.
4. Support pour biopuce selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le substrat (5,25) est formé d'un matériau choisi parmi le groupe comprenant les verres, les polymères et les semi-conducteurs .
5. Support pour biopuce selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le matériau préparé par voie sol-gel a une composition purement inorganique .
6. Support pour biopuce selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le matériau préparé par voie sol-gel est composé d'une fraction inorganique et d'une fraction organique.
7. Support pour biopuce selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fraction inorganique est majoritaire par rapport à la fraction organique .
8. Support pour biopuce selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que la fraction inorganique donne sa cohésion au matériau sol-gel.
9. Support pour biopuce selon 1 ' une quelconque des revendications 5 ou 6 , caractérisé en ce que ledit matériau comporte au moins un composé choisi parmi :
- un oxyde Mx0y, avec M choisi parmi le groupe constitué de Si, Al, Zr, Ti et Ta, - un composé de type -M-O-M'-, avec M et M' choisis parmi le groupe constitué de Si, Al, Zr, Ti et Ta.
10. Support pour biopuce selon la revendication précédente, caractérisé en ce que, lorsque le matériau préparé par voie sol-gel comporte un composé de type -M-O-M'-, M est Si et M' est Zr ou Ti.
11. Support pour biopuce selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fraction organique est un polymère, ledit polymère restant libre ou étant faiblement lié aux éléments constituant la fraction inorganique.
12. Support pour biopuce selon la revendication 6, caractérisé en ce que la fraction organique résulte de l'incorporation d'un silane X-R2- Si(0R)n dans la fraction inorganique.
13. Support pour biopuce selon la revendication précédente, caractérisé en ce que : - Ri est choisi parmi le groupe comprenant -CH3, -C2H5, nPr, iPr ou tBu,
- R2 est une chaîne aliphatique de longueur p-CH2, de préférence sans fonction ëther -CH2-0-CH2-, et avec p compris entre 2 et 10, - X est un groupement organique terminal réactif choisi parmi le groupe comprenant -OH, -COOH, -CH=0, -NH2, - Cl, -époxy, -glycidoxy, -CH=CH2, -acryl ou -méthalcryl.
14. Support pour biopuce selon 1 ' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite couche mince (9,29) de matériau préparé par voie sol-gel possède des pores de tailles comprises entre 5 nm et 100 nm, et une porosité totale comprise entre 1% et 50%.
15. Procédé de greffage de molécules biologiques, ou bio-molécules, sur et dans la couche mince (9,29) de matériau préparé par voie sol-gel sur la première face du support (5,25) pour biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- préparation d'un sol destiné à fournir le matériau sol-gel,
- incorporation des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation, - greffage des bio-molécules dans le matériau au cours de sa préparation,
- dépôt d'une couche mince dudit sol sur la première face du substrat,
- obtention de la couche mince de matériau sol-gel à partir de la couche mince de sol.
16. Procédé de greffage selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les bio-molécules incorporées dans le matériau au cours de sa préparation sont des bio-molécules silanisées en vue de leur greffage.
17. Procédé de greffage selon la revendication précédente, caractérisé en ce que l'incorporation des bio-molécules est effectuée par diffusion dans ladite couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel sec .
18. Procédé de greffage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'incorporation des bio-molécules est effectuée dans ladite couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel humide, le greffage des bio-molécules se réalisant lors du séchage du ge1.
19. Procédé de greffage selon la revendication 16, caractérisé en ce que l'incorporation des bio-molécules est effectuée dans le matériau sol- gel lorsque celui-ci est sous forme de sol, le greffage des bio-molécules se réalisant dans le sol avant dépôt de la couche mince à l'état liquide.
20. Procédé de greffage selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'étape de préparation du sol inclut une étape de fonctionnalisation destinée à obtenir un matériau sol- gel fonctionnalisé permettant le greffage des biomolécules après leur incorporation dans la couche mince .
21. Procédé de greffage selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les bio-molécules sont incorporées dans la couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel sec.
22. Procédé de greffage selon la revendication 20, caractérisé en ce que les biomolécules sont incorporées dans la couche mince lorsque celle-ci est sous forme de gel humide.
23. Procédé de greffage selon la revendication 20, caractérisé en ce que les biomolécules sont incorporées dans le matériau sol-gel lorsque celui-ci est sous forme de sol, le greffage des bio-molécules se réalisant dans le sol avant dépôt de la couche mince.
24. Procédé de greffage selon la revendication 20, caractérisé en ce que, les bio- molécules étant également fonctionnalisées, leur incorporation et leur greffage sont effectués dans le sol avant son dépôt en couche mince .
25. Procédé de greffage selon l'une quelconque des revendications 15 à 24, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de structuration de la couche mince de matériau sol-gel pour obtenir un réseau de plots ou de cuvettes sur tout ou partie du support de biopuce .
26. Procédé de greffage selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdits plots ou cuvettes sont de dimension caractéristique comprise entre 10 et 200 micromètres, et sont espacés de 50 à 200 micromètres.
27. Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que le réseau de plots ou de cuvettes est réalisé en utilisant au moins une des techniques choisies parmi une attaque chimique, un pelage, un micro-usinage de la couche de matériau préparé par voie sol-gel ou par dépôt direct d'une couche structurée de matériau préparé par voie sol-gel par microdistributions locales.
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