CN117730396A - 利用三维衬底的测序系统和方法 - Google Patents

Abstract

核酸测序系统可以包括含有三维图案化表面的衬底。三维图案化表面可以限定纳米孔，每个纳米孔包含用于结合到核酸模板分子的衍生化区域。纳米孔的直径可以是100nm，中心到中心间距为350nm。衬底可以包含反射层和等离子体增强层用于在核酸测序期间增加荧光信号。

Description

利用三维衬底的测序系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年8月4日提交的美国临时申请号63/229,268的权益和优先权，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及用于核酸测序和其他生化分析的系统。

背景技术

核酸测序包括许多不同的成本，例如与测序设备的购买和维护相关的成本，以及试剂的成本。与现有测序设备相比，减少产生相同量的测序数据的时间量和/或减少所用试剂的量可以降低产生测序数据的总成本。

一些当前可用的测序系统检测流动池的基本上矩形的二维平面衬底上的测序事件。光学检测系统的物镜和流动池相对于彼此移动，使得物镜的视场在衬底上多次通过，其中每次通过对衬底的一部分进行成像，使得整个衬底被成像。

由于当前与平面衬底一起使用的成像和结合技术，这些系统具有与平面衬底上可能的单个核酸位点的最大密度相关的限制。因此，与用于平面衬底的现有技术相比，需要增加单个核酸位点的密度。

发明内容

本发明的技术涉及与用于检测测序事件的系统一起使用的衬底。系统可用于例如对置于衬底上的核酸分子进行测序，其中衬底可包括数百万至数十亿个单独的凹部，每个凹部限定一个核酸位点。衬底可包括限定凹部阵列的三维表面，即非平面表面，并且可被称为三维图案化衬底。每个凹部(也称为纳米孔)可以限定用于在测序事件期间容纳测序核酸分子的单独核酸位点。衬底可以相对于检测系统的视场(FOV)(例如光学检测系统的物镜)移动，使得FOV经过衬底以便对每个凹部中的测序事件进行成像。所公开的与用于检测测序事件的系统一起使用的衬底的优点包括与平面衬底相比允许封闭核酸位点的间距，这是因为凹部防止相邻测序核酸分子向每个相邻核酸位点扩散并交叉污染。核酸位点间距更近还允许检测系统的FOV中有更多核酸位点，因此可以使得通量提高，从而产生显著的成本节省，如本文将讨论的那样。

附图说明

图1A至图1C示出了平面衬底的实施方案。

图2A至图2C示出了包含纳米孔的衬底的实施方案。

图3A至图3C示出了包含限定光致抗蚀剂的纳米孔的衬底的实施方案。

图4示出了包含用弯曲底部和侧壁限定的纳米孔的衬底的实施方案。

图5示出了包括用成角度的侧壁限定的纳米孔的衬底的实施方案。

图6A至图6C示出了在衬底中形成纳米孔的方法。

图7A至图7C示出了在衬底中形成纳米孔的方法。

图8A和8B示出了在衬底中形成纳米孔的方法。

图9和图10示出了包含纳米孔的多层衬底的实施方案。

根据惯例，所描述的特征和元件不是按比例绘制的，而是为了强调与本公开相关的特征和元件而绘制的。

具体实施方式

本公开描述了与可用于检测测序事件的测序检测系统一起使用的衬底。例如，测序检测系统可以是用于例如核酸测序的光学成像系统。在实施方案中，模板核酸分子可以结合至或以其他方式设置在三维图案化衬底的凹部(也称为纳米孔)内，然后通过检测系统(例如光学成像系统)成像。

核酸(例如DNA)测序有多种方法。参见例如sKumar,K.,2019,“Next-GenerationSequencing and Emerging Technologies,”Semin Thromb Hemost45(07):661-673。最流行的方法使用平面衬底上离散位点的阵列。阵列可以包括单个平面衬底上的大量(例如，1亿至10亿或更多个)离散位点。通常，位点很小(例如，其特征是直径或对角线小于1微米，通常小于500纳米，并且通常在50纳米到500纳米的范围内)并且以大于～～10⁶个位点/cm²的密度存在。例如，位点可以具有200nm的直径和700nm的中心到中心的间距。核酸模板直接或间接固定在平面衬底上的各个位点以进行测序。一般来说，每个位点都包含模板序列的克隆群，例如DNA纳米球(Complete Genomics,Inc.)或PCR产物或扩增子(Illumina,Inc.)。为了说明而非限制，在这些方法中，在一系列测序“循环”中一次确定一个碱基的核酸序列。每个循环包括(i)将试剂引入固定化模板分子阵列上的每个位点；(ii)在位点同时进行一系列生化或酶促反应(“测序反应”)；(iii)检测每个位点处的信号(每个循环每个位点零、一或多于一个信号)，这可以称为“图像采集”；以及(iv)在阵列上每个位点进行酶促、洗涤或再生步骤，以便可以进行另一个测序循环。(iii)中收集的“信号”可以是而不限于光学信号，例如荧光信号或发光信号。平面衬底的测序阵列通常包含在“流动池”中，引物、试剂、洗涤液等可以流过其中。通常，测序运行由～400个循环组成，这意味着需要～400个或更多成像事件，每个成像事件都涉及从数百万个位点中的每个位点单独获取信号。图像采集的速度和精度影响成本、效率和测序数据质量。

如本文所用，“测序事件”是指由测序过程产生的光信号(例如，荧光或发光信号)的发射。示例性测序过程是合成测序过程的循环。在该方法中，将核苷酸掺入引物延伸产物中(例如使用可逆终止子核苷酸)。在该方法中，可以用例如荧光染料或发光信号源(例如荧光素酶或荧光素酶底物)来标记核苷酸。发光信号包含化学发光和生物发光。核苷酸可以直接用荧光染料或发光信号源标记，或者可以与用信号产生部分标记的抗体、适体或其他试剂缔合。在测序过程中，通过例如用激发波长照射荧光染料，在阵列中的每个位点产生限定的光学信号，并且记录信号和相应的位置。

尽管是在核酸测序的背景下构建的，但是应当认识到，本文公开的设备和方法不限于核酸测序用途。所述设备和方法可以用于例如除测序之外的核酸分析(例如，SNP分析、实时PCR分析)或用于使用除核酸之外的底物或分析物的化学或生物化学过程的分析。

图1A示出了衬底100或其一部分。如图所示，衬底100包括平坦表面101，该平坦表面101包括多个衍生化区域102(“点”或离散间隔开的区域)。衍生化区域102可以以图案化阵列(例如以行和列)定位，如图1A所示。衍生化区域102可适合于包含核酸模板分子。例如，衍生化区域102可以由被配置用于结合核酸模板分子的衬底100的表面化学品来限定。用于结合核酸模板分子的表面化学品的示例包含(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)CVD胺化。衍生化区域102周围的衬底部分可包含被配置为不与核酸模板分子结合的表面化学品。衍生化区域102可以与衬底100的顶表面(包含衍生化区域周围的非结合表面)基本共面，如图1B所示。形成衍生化区域和非结合表面的工艺可以包含HMDS气相沉积、光刻、O2等离子体蚀刻、氨基硅烷化(CVD)和抗蚀剂剥离。这些工艺可能导致平坦表面的表面变化，例如氨基硅烷和光致抗蚀剂的交联的不均匀和/或不连续部分可能在衍生化区域的周边形成，并且可以被称为“结壳”。不均匀和/或不连续结壳的部分在衍生化区域的基本平坦的表面之上可以具有衍生化区域直径的约5％的高度，例如直径200nm的衍生化区域周围～10nm的高度。由于结壳的均匀和/或不连续特征，以及相对较小的高度，例如<～5％，如上所述的包含结壳的衍生化区域阵列被认为是本文所使用的“平面衬底”。出于说明性目的，示例性衬底100或其部分被示出为包含十六个衍生化区域102，在实施方案中，衬底可包含多于10⁵个、多于10⁶个、多于10⁷个位点、多于10⁸个位点、多于10⁹个位点，或多于10¹⁰个衍生化区域，例如10⁵至10¹¹个位点或10⁶至10¹⁰个衍生化区域。衍生化区域可以是衬底表面101的经衍生化以结合核酸分子(例如，DNA纳米球(DNB)、通过桥式扩增产生的模板簇或其他模板)的区域。

图1B示出了在两个其他衍生化区域102之间结合至衍生化区域102的核酸分子(具体是DNB 103)的示例的侧面剖视图。可以将DNB 103以溶液形式引入包含衬底100的流动池中。漂浮在溶液中的DNB 103可以是基本上球形的，如图1B所示。一旦结合到衍生化区域102，DNB 103就趋于变平，如图1C所示，并且在变平的配置中，DNB可以延伸超出衍生化区域102到衬底100的非衍生化区域上。图1C出于说明性目的示出了DNB的示例性变平和扩散量，并且在一些实施方案中，变平和/或扩散的程度可以比所示的更多和/或更少。在一些实施方案中，在DNB结合之后可以引起DNB 103的核酸分子的拷贝数增加，并因此增加已结合的DNB的体积。增加结合的DNB的体积可以导致变平DNB的外周甚至更远离衍生化区域102扩散到衬底100的非衍生化区域上。

在实施方案中，衍生化区域102紧密地间隔在一起是有益的，这可以导致检测系统能够在检测系统的每个FOV捕获更多的测序事件和/或减少测序过程期间使用的试剂量。然而，由于平面衬底上的DNB变平，如果相邻衍生化区域102之间的间距接近变平的DNB的外径，则DNB可能朝相邻衍生化区域扩散并且在相邻衍生化区域上扩散，例如如图1C中所示。扩散到邻近的衍生化区域被称为非特异性结合。非特异性结合可能导致负载不足并影响测序信号强度，也称为串扰，这可能导致测序数据损坏。例如，在测序事件的成像期间，来自与第一衍生化区域结合的第一DNB的荧光信号可能无意中被检测为与由于检测系统的分辨率而导致第一DNB向其扩散的相邻第二衍生化区域相关联。来自未与衍生化区域结合的DNB的荧光信号的无意检测称为串扰。因此，本技术的实施方案涉及减少或消除串扰同时减少衍生化区域之间的间距的衬底。当减小衍生化区域之间的间距时，DNB的尺寸可以保持相同或小于用于平面衬底的DNB。

在一些实施方案中，衬底100包含用于每个衍生化区域的纳米孔200，例如如图2A至图2C中所示。图2A示出了包含纳米孔200的衬底100的俯视图。衬底100限定顶表面201，并且纳米孔200凹入顶表面201下方，如图2B所示。如本文所用，“纳米孔”是指所有尺寸均小于1000纳米的孔，即凹部。如图所示，纳米孔200可以以有序阵列定位，类似于图1A至图1C的有序阵列。纳米孔可具有介于100nm和300nm之间(例如150nm)的直径/宽度。纳米孔的中心到中心间距可以介于250和500nm之间，例如350nm。纳米孔可具有大于其直径25％的深度，例如100-150nm的深度。纳米孔可以具有5.0×10^-13至8.5×10^-13mm³的体积。衬底可以包括直径为150nm、深度为100nm、中心到中心间距为350nm从而导致边缘到边缘间距为200nm的纳米孔的有序阵列。纳米孔的这种布置与直径为150nm、中心到中心间距为350nm的衍生化区域的有序二维阵列相比是有利的，因为衍生化区域的二维阵列会导致串扰。相邻纳米孔的中心到中心间距和/或边缘到边缘间距可以基于检测系统的光学分辨率，以便防止相邻纳米孔200之间的串扰。在实施方案中，纳米孔可具有在顶表面201下方介于50nm和300nm之间(例如100nm)的深度。

每个纳米孔200可以包含用于结合样品核酸分子的衍生化区域102，如上面关于图1A至图1C所讨论的那样。如图2B所示，衍生化区域102可以限定在纳米孔200的底表面上。在实施方案中，衍生化区域102可以包围纳米孔200的整个底表面或仅其一部分。在实施方案中，衍生化区域102可包含纳米孔200侧壁上的一个或多个部分。

衍生化区域102和纳米孔200的物理结构都可以防止DNB扩散到纳米孔之外。例如，如上文所讨论的，DNB一旦结合到衍生化区域就可能变平。如图2C所示，虽然变平的DNB 103可以接触纳米孔200的侧壁204，而不是继续径向扩散超出衍生化区域，如图1C和图1D中的平面衬底上所示，但DNB约束在纳米孔内，因此与平面衬底相比，纳米孔增加了相邻衍生化区域之间的表面距离。即使DNB在与衍生化区域结合后生长，这种约束也能防止相邻的DNB接触。因此，纳米孔防止污染和串扰，如上面关于图1A至图1D所讨论的。在实施方案中，每个纳米孔200的体积被选择为大于生长的DNB的预定最大体积。

在实施方案中，纳米孔200可以利用多种制造方法中的一种或多种形成为衬底100的一部分，所述方法包括但不限于：微光刻、光刻、软光刻和纳米压印光刻。在实施方案中，如图3A至图3C所示，纳米孔200可以在衬底基材顶部上形成有一层或多层材料的晶格。在实施方案中，晶格可以部分或完全由一层或多层形成，例如金属氧化物或氮化物层。在实施方案中，晶格由一层或多层形成，包含有机材料层，例如光致抗蚀剂301，其在用于结合到衬底基材302上的光致抗蚀剂的层的顶部。衬底基材可由单一材料或多层不同材料形成。晶格可以通过在衬底基材302顶部上施加有机材料层(例如光致抗蚀剂)，随后将有机材料暴露于图案化的光并对暴露的有机材料进行显影以去除光致抗蚀剂的部分以限定纳米孔来形成。如图3B和图3C所示，纳米孔的底部可以由基材衬底302限定，并且侧壁可以由有机材料限定。在实施方案中，可以在纳米孔图案化之前或之后限定(例如使用表面化学品限定)每个纳米孔的衍生化区域。

在实施方案中，纳米孔200可以至少部分地形成在基材衬底中。例如，如图4所示，可以通过将基材衬底顶表面上的有机材料暴露于图案化的光来形成纳米孔，然后使有机材料显影以去除在纳米孔位置上方的有机材料(例如光致抗蚀剂)的部分，然后可以蚀刻先前在去除的有机材料下方的未覆盖的基材衬底，以去除基材衬底的部分从而限定纳米孔的至少一部分。

在实施方案中，例如如图3C所示，纳米孔的底表面可以基本上是平坦的，并且在实施方案中，纳米孔的底表面可以是弯曲的，例如如图4所示。在实施方案中，例如如图3C所示，纳米孔的侧壁可以基本上垂直于顶表面，并且在实施方案中，纳米孔的侧壁可以相对于顶表面弯曲或成角度，例如如图5所示。可选择底部表面和侧壁的形状以最大化光信号向检测系统的反射以检测纳米孔中的测序事件。在实施方案中，底表面和/或侧壁可以是抛物线形状，以将光信号从DNB反射并聚焦到检测系统。

在一些实施方案中，例如如图6A和图6B所示，可以使用光刻在称为非结合BARC-结合氮化硅/APTMS的过程中形成纳米孔。在此过程中，纳米孔结构可以用光致抗蚀剂(有机材料)在硅基层上的SiO2/铝反射层上的氧化物/氮化硅结合层上制造，如图6A所示。图6A的顶表面结构可以通过APTMS胺化，随后剥离光致抗蚀剂以去除顶部光致抗蚀剂，从而产生图6B所示的结构。该过程导致每个纳米孔的底表面涂有APTMS作为结合材料。如图6A所示，BARC层(有机材料)可以存在于光致抗蚀剂和氮化硅顶部上的HMDS层之间。剥离光致抗蚀剂后，BARC层(有机材料)将保留为每个纳米孔周围暴露的顶部。BARC层是一种“非结合”材料。BARC层代表底部抗反射涂层，其优点在于它可用于高密度特征的光刻工艺以降低曝光期间的反射率，并且作为DNB的非粘合材料。图6C示出了对应于图6B(使用氮化硅/APTMS作为结合表面和BARC层作为非结合表面)的具有360nm节距的纳米孔的AFM图像。

在一些实施方案中，例如如图7A所示，纳米孔可以使用光刻在被称为非结合抗蚀剂结合氧化硅的过程中形成。在此过程中，纳米孔是在基材(在示例中所示的玻璃)上的反射层上的结合SiOx层上使用非结合抗蚀剂(有机材料)制造的。在该方法中，不存在光致抗蚀剂的剥离，因为纳米孔的结合层在添加光致抗蚀剂之前形成，并且光致抗蚀剂本身形成纳米孔的侧壁。该过程与图6A和图6B中的过程不同，其中光致抗蚀剂用于形成纳米孔侧壁的氮化硅的图案化以及在纳米孔底部但不在纳米孔周围顶表面上形成结合表面的一部分过程。

图7B和7C示出了包含纳米孔的衬底的原子力显微镜(AFM)图像，纳米孔由对应于图7A的基材衬底顶部的材料(例如光致抗蚀剂)的具有360nm节距的晶格形成。

在一些实施方案中，例如如图8A和图8B所示，纳米孔可以使用纳米压印光刻在称为非结合HMDS/结合APTMS的过程中形成。纳米压印光刻可以包含两个独立的步骤：制造图案化的硬模具以及使用该模具将图案转移到聚合物膜中以进行纳米级图案化。通过直接穿过透明模具背面施加宽带紫外光辐射从而导致抗蚀剂单体交联形成刚性聚合物，可以将纳米孔结构压印在SiO2上的紫外固化抗蚀剂(有机材料)中。脱模后，可以对SiO2进行干法蚀刻，形成纳米孔，如图8A所示。在纳米孔的所述形成之后，图8A的结构的顶表面(包含光致抗蚀剂)可以通过APTMS胺化。在胺化之后，光致抗蚀剂可以是条带，从而产生图8B所示的结构。光致抗蚀剂被剥离后，纳米孔的底面仍涂有APTMS作为粘合材料。HMDS层(有机材料)可能存在于SiO2顶部，并且在剥离每个纳米孔结构周围光致抗蚀剂后作为“非粘合”材料进行曝光。在该方法中，作为纳米孔的节距可以在250nm至300nm的高密度范围内。

例如如图1A至图6B所示，衬底和/或基材衬底可以由一层或多层形成。在实施方案中，基材衬底可以包含以下一层或多层的组合：硅、六甲基二硅氮烷(HMDS)、铝、氧化物、有机材料(例如光致抗蚀剂)。诸如氧化钛(TiOx)、氧化硅(SiO2)、硅酸四乙酯(TEOS)之类的氧化物可以在纳米孔底部形成结合表面。铝、钛或铬层可以充当反射涂层，用于从作为信号增强层的表面反射DNB荧光信号。如上所述，光致抗蚀剂可以包含在最终的纳米孔结构中并用作纳米孔外部的非结合表面。

在实施方案中，检测到的DNB亮度对应于包括DNB的核酸分子的拷贝数，拷贝数对应于DNB的体积。本发明的纳米孔技术除了通过允许相邻衍生化区域相对于平面衬底更紧密的间距来增加每个衬底面积的衍生化区域的数量之外，还可以通过具有相对于平面衬底更小的衍生化区域来增加每个衬底面积的衍生化区域的数量。由于衍生化区域处的DNB的亮度对应于核酸分子的拷贝数，而核酸分子的拷贝数对应于DNB的体积，因此在实施方案中，通过包含衬底上一个或更多反射部分，例如基材衬底中的反射层，或每个纳米孔的反射壁(例如金属化壁)，增加衬底上检测到的DNB亮度是有益的。反射部分可以由诸如铝、铬和钛之类的金属或金属氧化物构成。在一些实施方案中，反射部分可以是具有交替折射率的材料(至少2或4)的介电叠层，使得该叠层形成介电镜。除了用相长干涉代替相消干涉之外，这可类似于应用于某些衬底或透镜的抗反射涂层。在实施方案中，衬底201或基材衬底302，例如如图1A至图6B所示，可以包含在衍生化区域下方或在纳米孔下方的反射层1001，例如如图9所示。在实施方案中，每个纳米孔的一个或多个侧壁和/或底表面可以包含反射表面1101，例如如图10所示。由于到达DNB的输入激发激光增加，反射部分可以增加检测到的DNB亮度。增加的输入激发激光是由于输入激发激光的部分，否则这些部分将穿过DNB并且不会导致发射被反射回DNB而导致发射增加。由于与没有反射部分的衬底相比，反射部分将来自DNB的更多发射聚焦到检测系统，因此反射部分可以进一步增加检测到的DNB亮度。在实施方案中，包含反射层的衬底可导致检测到的DNB亮度相对于没有反射表面的衬底增加2-3倍。

在实施方案中，衬底的一层或多层可以包含等离子体激元增强结构。例如，纳米孔下方的SiO2层可包含金属颗粒，这些金属颗粒经调谐以将光子耦合到表面等离子体激元中，从而产生强光信号。在一些实施方案中，等离子体激元增强结构导致在测序成像期间绿色通道中亮度增加4X并且红色通道中亮度增加14X。在一些实施方案中，用于信号增强材料的等离子体涂层可以被添加到纳米孔衬底结构。一般来说，等离子体激元是金属纳米粒子(例如银和金)中自由电子的集体激发。当自由电子受到激光等能源刺激时，纳米颗粒在金属原子中产生表面电荷的简谐振动。

如本文所公开的包含纳米孔的三维图案化衬底可以是测序系统流动池的一部分，其中核酸模板分子(例如DNB)可以在将衬底掺入流动池之前或之后固定在纳米孔中。在测序工序过程中，洗涤缓冲液可以分别流过流动池并流过衬底。由于包含纳米孔的衬底中衍生化区域的间距更近，流入流动池的试剂将在比无纳米孔的流动池更多的衍生化区域与核酸模板分子反应，因此每个衍生化区域可以使用更少的试剂。

应当理解，本文描述的示例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将根据其提出各种修改或改变，并且这些修改或改变将被包含在本申请的精神和范围以及所附权利要求范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

应当理解，以上描述旨在是说明性的而非限制性的。在审阅以上描述后，许多实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，本发明的范围不应参考上述描述来确定，而是应参考所附权利要求及其等同物的完整范围来确定。

虽然前述公开示出了本公开的说明性方面，但是应当注意，在不脱离由所附权利要求限定的本公开的范围的情况下，可以在本文中做出各种改变和修改。根据本文描述的本公开各方面的方法权利要求的功能、步骤和/或动作不需要以任何特定顺序执行。此外，尽管可以以单数形式描述或要求保护本公开的元素，但是可以设想有复数形式，除非明确说明限于单数。

Claims (48)

1.一种为核酸测序制备三维图案化衬底的方法，所述方法包括：

提供平面衬底；

限定凹入所述平面衬底的顶表面下方的多个纳米孔，其中所述纳米孔排列成阵列，

限定表面化学，使得每个纳米孔包括结合表面，所述结合表面包括被配置为结合至模板核酸分子的表面化学；以及

将模板核酸分子结合至所述结合表面。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述平面衬底包括反射部分。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述反射部分包括铝、铬或钛部分。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述反射部分包括反射层，所述反射层定位在所述多个纳米孔的底表面与所述平面衬底的包括硅的层之间。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述反射部分包括每个所述纳米孔的反射壁。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述反射壁包括金属化壁。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述反射部分被配置为将激发光朝向所述模板核酸分子反射，并将来自所述模板核酸分子的发射光朝向检测所述纳米孔中的测序事件的检测系统反射。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述平面衬底包括含有等离子体激元增强结构的层。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述等离子体激元增强结构包括在所述平面衬底的顶表面下方的金属晶粒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述等离子体激元增强结构被配置为经调谐以将光子耦合到表面等离子体激元中。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬底包括基材衬底和在所述基材衬底的顶表面上的有机材料层，并且

其中限定所述多个纳米孔包括去除所述有机材料的部分。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述有机材料包括光致抗蚀剂，并且去除所述有机材料的部分包括对所述光致抗蚀剂执行光刻工艺。

13.根据权利要求11和12中任一项所述的方法，其中去除所述有机材料的所述部分包括形成所述有机材料的晶格，并且其中所述晶格中的空隙限定所述纳米孔。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬底包括基材衬底和在所述基材衬底的顶表面上的有机材料层，并且

其中限定所述多个纳米孔包括去除所述有机材料和所述基材衬底的部分。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述基材衬底包括硅或玻璃，并且所述有机材料包括光致抗蚀剂。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔中的每一个被限定为包括平坦的底表面。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔中的每一个被限定为包括弯曲底表面，并且其中所述弯曲底表面中的每一个被配置为将来自所述模板核酸分子的发射朝向用于检测测序事件的检测系统聚焦。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述弯曲底表面为抛物线的形状。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个纳米孔限定小于300nm的直径。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个纳米孔限定小于150nm的直径。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列中的所述多个纳米孔的中心到中心间距小于500nm。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述阵列中的所述多个纳米孔的中心到中心间距小于350nm。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔各自限定小于200nm的深度。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔各自限定小于100nm的深度。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔各自限定在60nm与100nm之间的深度。

26.一种检测三维图案化衬底上的核酸测序事件的方法，其中所述三维图案化衬底限定凹入所述衬底的顶表面下方的多个纳米孔，并且其中所述多个纳米孔中的每一个包括配置成结合到模板核酸分子的结合表面，所述方法包括：

将所述模板核酸分子结合至所述结合表面；

使得所述多个纳米孔中的每一个中的所述模板核酸分子发生测序事件；

用激光激发所述模板核酸分子以引起所述多个纳米孔中每一个纳米孔的荧光发射；以及

检测所述多个纳米孔中的每一个中的所述荧光发射以便检测所述测序事件。

27.根据权利要求26所述的方法，其中每个纳米孔限定小于300nm的直径。

28.根据权利要求26至27中任一项所述的方法，其中每个纳米孔限定小于150nm的直径。

29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述阵列中的所述多个纳米孔的中心到中心间距小于500nm。

30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述阵列中的所述多个纳米孔的中心到中心间距小于350nm。

31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔各自限定小于200nm的深度。

32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔各自限定小于100nm的深度。

33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述衬底包括基材衬底和在所述基材衬底的顶表面上的有机材料层，并且

其中所述多个纳米孔被限定在所述有机材料的部分之间。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述有机材料包括光致抗蚀剂，并且其中通过利用光刻工艺去除部分来限定所述多个纳米孔。

35.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中所述有机材料包括所述有机材料的晶格，并且其中所述晶格中的空隙限定所述纳米孔。

36.根据权利要求33和34中任一项所述的方法，其中去除所述有机材料的所述部分包括形成所述有机材料的多个环形部分，并且其中所述多个环形部分中的每一个限定所述纳米孔中的单个纳米孔。

37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔中的每一个被限定为包括平坦的底表面。

38.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中所述多个纳米孔中的每一个被限定为包括弯曲底表面，并且其中所述弯曲底表面中的每一个将所述荧光发射朝向用于检测测序事件的检测系统聚焦。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述弯曲底表面为抛物线的形状。

40.根据权利要求26至38中任一项所述的方法，其中所述平面衬底包括反射部分。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述反射部分包括铝、铬或钛。

42.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中所述反射部分包括定位在所述多个纳米孔的底表面与所述平面衬底的包括硅的层之间的反射层。

43.根据权利要求40至41中任一项所述的方法，其中所述反射部分包括每个所述纳米孔的反射壁。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述反射壁包括金属化壁。

45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述反射部分将所述激光朝向所述模板核酸分子反射，并将来自所述模板核酸分子的所述荧光发射光朝向所述检测系统反射。

46.根据权利要求26至45中任一项所述的方法，其中所述平面衬底包括含有等离子体激元增强结构的层。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述等离子体激元增强结构包括在所述平面衬底的顶表面下方的金属晶粒。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述等离子体激元增强结构将光子耦合到表面等离子体激元中。