EP1539321A1 - Verfahren zum auffinden geeigneter chromatographiebedingungen zur trennung biologischer moleküle - Google Patents

Verfahren zum auffinden geeigneter chromatographiebedingungen zur trennung biologischer moleküle

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Publication number
EP1539321A1
EP1539321A1 EP03757672A EP03757672A EP1539321A1 EP 1539321 A1 EP1539321 A1 EP 1539321A1 EP 03757672 A EP03757672 A EP 03757672A EP 03757672 A EP03757672 A EP 03757672A EP 1539321 A1 EP1539321 A1 EP 1539321A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
chromatography
biological sample
buffer
protein
chromatography media
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03757672A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hartmut SCHLÜTER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of EP1539321A1 publication Critical patent/EP1539321A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/86—Signal analysis
    • G01N30/8658—Optimising operation parameters
    • G01N30/8662—Expert systems; optimising a large number of parameters
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Rigid containers without fluid transport within
    • B01L3/5085—Rigid containers without fluid transport within for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N2030/009—Extraction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/38—Flow patterns
    • G01N30/46—Flow patterns using more than one column
    • G01N30/461—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns
    • G01N30/463—Flow patterns using more than one column with serial coupling of separation columns for multidimensional chromatography
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Definitions

  • the invention relates to a multiparallel method for quickly finding suitable chromatography parameters for the separation of biological molecules.
  • the invention relates in particular to a multiparallel chromatography system for developing methods for the purification of proteins and other biomolecules.
  • the system uses cavities from multi-well plates (e.g. 96-well plates) that are filled with chromatographic gels and consists of various start buffers in which the samples to be chromatographed are dissolved and with which the gels are equilibrated and solutions for desorbing ( Eluting) of the biomolecules bound to the gels.
  • WO 99/24138 A1 describes a method in which one in the cavities
  • Multiwell plate different chromatography media are arranged. These media are used for the analysis of biological substances in the context of so-called “asays”.
  • biological sample means purified or unpurified proteins, peptides, nucleic acids of all kinds, carbohydrates, lipids, low molecular weight metabolites or mixtures thereof. This includes - but not exclusively - complex protein mixtures of human, animal or vegetable Tissues or cells as well as cells of microorganisms.
  • biomolecules The “biological sample” is also referred to below as “biomolecules”.
  • chromatography media are understood to mean two types:
  • ion exchangers anion ion exchangers, cation exchangers
  • metal affinity chromatography media reversed-phase materials
  • gels for hydrophobic interaction chromatography (HIC), hydroxyl pathite media (HAP) affinity chromatography media with all kinds of ligands but also gels with magnetic properties (magneto -Beads, coated or uncoated).
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • HAP hydroxyl pathite media
  • a special feature of such gels is the ability to bind the biological sample, which must also be able to be freed from the binding substance again by means of suitable elution agents (solutions).
  • elution solutions are the ability to desorb (elute) the biological sample from the chromatography gel, that is to say to shift the equilibria of the binding of the biological sample to the chromatography gel in the Such that the biomolecules bound to the chromatography gel have no or only low affinities for the chromatography gel after addition of the elution solution.
  • the invention is suitable for the automated search for suitable chromatography media and the associated buffer and elution conditions for the purification of peptides and proteins, but also other biomolecules from homogenates (raw extracts).
  • the invention is based on the absorption of biomolecules on gel particles, on the so-called stationary phase.
  • a biological sample consisting of biomolecules such as proteins, peptides, etc., dissolved in the start buffer (mobile phase)
  • gel particles so-called batch process
  • the liquid supernatant in which the biomolecules are found, which are not Have affinity for the chosen gel under the chosen conditions, removed from the gel particles.
  • the gel particles are then with
  • the invention can be carried out automatically, so that the results from e.g. from a 96-well chromatography can be evaluated manually or by means of a computer program, clearly presented and prepared for interpretation.
  • the data obtained are interpreted in such a way that the results of the interpretation result in suggestions for the chromatographic purification of (for example) proteins from protein extracts of a biological sample.
  • Frontal chromatography, displacement chromatography or gradient chromatography are possible as chromatographic modes.
  • Purification of the target protein can also include several different, contiguous chromatographies (combinations of chromatographies).
  • the invention further provides a kit in which the method according to the invention
  • the multi-well plates can already be prefabricated with chromatography media for binding the biological sample (group B materials) and a set of different chromatography media (solutions of any composition) for elution (group NB materials).
  • the system contains protocols for carrying out the experiments in multi-well format with n cavities (n> 1), commercially available chromatography media distributed on multi-well plates, and eluents distributed on multi-well plates are adapted to the respective chromatography media.
  • the system is used for the systematic search for reproducible chromatographic purification steps for biomolecules.
  • the system is designed for the combination of pipetting robots, but can also be used manually. Due to the selected different chromatography parameters (e.g. pH value, ion concentration, etc.) different populations of biomolecules will bind to the gels in the different cavities. If, for example, an anion exchange gel is used as the chromatographic gel, biomolecules which are still sufficient at pH 4 are bound to the gel in B1 (FIG. 1, the solution in the cavity B1 has a pH of 4 and an NaCl concentration of 50 mmol / l) have many negative charges, so they have a low isoelectric point.
  • the low NaCI concentration means that biomolecules with low affinity for the
  • Bind gel In the G11 cavity (FIG. 1, the solution in the G11 cavity has a pH of 7 and a NaCl concentration of 750 mmol / l), biomolecules with a significantly higher isoelectric point can be expected. At the same time, due to the high NaCI concentration, only biomolecules with very high affinity will bind to the gel particles, the vast majority of the biomolecules will remain in solution.
  • the system will also contain protocols to further analyze the biomolecules concentrated on the gel particles, e.g. about protein determination or electrophoresis.
  • the invention enables the finding in the multi-well format of the parallel suitable chromatography media and the associated eluents in a much shorter time than before.
  • the system can be used for the development of chromatographic purification steps of biomolecules.
  • the data obtained with the system can be used for the development of chromatography steps in frontal chromatography mode, in displacement chromatography mode or in gradient chromatography mode.
  • the system can be used (e.g. in combination with mass spectrometry) for comparative studies of the biomolecule profiles ("profiling") of two different states (“differential display”) in order to be able to identify molecules that are relevant to a defined state (e.g. sick ) are characteristic.
  • the system can be used as sample preparation for 2D electrophoresis strategies.
  • Figure 1 is a schematic representation of a 96 well
  • FIG. 2 shows the results of a multiparallel chromatography of a protein mixture to find suitable parameters for the chromatographic purification of 4 different target proteins.
  • the graphic shows the absolute yields of the various target proteins (in%, based on the amount of the respective protein used), namely ribonuclease A (top left), cytochrome C (top right), lysozyme (bottom left) and myoglobin ( bottom right), in the eluates of the multiparallel
  • FIG. 3 shows the results of a multiparallel chromatography of a protein mixture to find suitable parameters for the chromatographic purification of 4 different target programs. teinen.
  • the graphic shows the specific yields of the various target proteins (in%, based on the total amount of all proteins in each cavity).
  • Protein concentration of ribonuclease A, cytochrome C, lysozyme and myoglobin dependence of the peak area detected on the amount of protein injected.
  • FIG. 6 a chromatogram of the cation exchange
  • FIG. 7 a chromatogram of the cation exchange
  • FIG. 8 a chromatogram of the cation exchange
  • Lysozyme and myoglobin dissolved in a sample application buffer with pH 6 and 0 mM NaCI (parameter set from the experiments with the multiparallel chromatography system).
  • Enzymes with angiotensin conversion enzyme-like activity from a protein extract of porcine kidney tissue Specific enzyme activities (quotient of absolute enzyme activity (determined
  • FIG. 11 shows the results of a
  • FIG. 12 shows a chromatogram of a hydrophobic
  • FIG. 13 shows the protein concentrations of the fractions
  • FIG. 1 shows an example of a 96-well plate (multi-well plate), which is defined as a matrix by columns (X direction) and rows (Y direction), with different chromatography media depending on the location of those defined by the matrix Matrix points of the plate are arranged, the individual cavities of which are each coated with the same amount of chromatography gel (eg with a cation exchange gel), but have individual combinations of pH values and saline concentrations.
  • cavity B1 shows a pH of 4.5 and an NaCl concentration of 0.05 mol / l.
  • Cavity G12 would have a pH of 7.0 and a NaCI concentration. of 1 mol / l.
  • FIG. 4 shows a typical reversed-phase HPLC separation of the system with which the quantification was carried out.
  • the chromatogram comes from the separation of the protein mixture before processing with the multiparallel chromatography system.
  • the system creates a calibration line for each protein ( Figure 5).
  • To determine the calibration line for quantifying the individual proteins different defined amounts of the individual proteins are injected.
  • To create the calibration line the peak areas of the proteins are plotted against the protein concentrations.
  • some parameter sets for the sample loading buffer are selected (pH 3 mM + NaCI; pH 3 + 0 mM NaCI; pH 4 + 0 mM NaCI; pH 6 + 0 mM NaCI; pH 7 + 200 mM NaCI) and the protein mixture was chromatographed under these conditions (Fig. 6-
  • the yield can be obtained if the protein mixture is applied to the cation exchanger in a pH 3 and 0 mM NaCl buffer.
  • a look at the result in FIG. 2 reveals that a co-elution of cytochrome C and lysozyme can be expected under these conditions.
  • FIG. 7 shows the chromatogram of the separation of the protein mixture with a pH 4 buffer and 500 mM NaCl as start and sample application buffer. Under this
  • Well plate distributed in the cavities each equal amounts of a cation exchange gel.
  • the individual cavities differ in terms of pH and ionic strength.
  • the result of the separation is obtained by determining the protein concentration of the proteins of the individual cavities bound to the gel.
  • FIG. 10 shows the results of the determination of the specific activity of the
  • the chosen chromatography (here cation exchange chromatography) can then be used as a favorable initial step for concentration if the protein sought, here detected via its enzymatic activity, elutes in a fraction in which a protein concentration which is low compared to the other fractions can be found is (for example, Fig. 10 in the fraction pH 3, 500 mmol / l NaCl;), if the specific activity reaches a particularly high value.
  • FIG. 11 shows specific enzyme activities of the third embodiment
  • FIG. 12 shows the chromatogram of a hydrophobic interaction (HIC) gradient chromatography, which was derived from the parameter sets of the multiparallel chromatography of the experiment shown in FIG. 11 (phenyl-HIC chromatography).
  • HIC hydrophobic interaction
  • the enzymatically active fraction elutes in the region of the gradient, which shows that the prediction is correct that the target enzyme sought can be bound to a phenyl-HIC column and chromatographed under the conditions described in FIG. 11.
  • FIG. 13 shows protein concentrations of the fractions of a multi-well cation exchange chromatography with step gradient elution. Gradient level 1: 0.5 mol / l NaCl; Gradient level 2: 2 mol / l NaCl. UCE: Urotensin-generating activity.
  • urotensin-forming activity was only detectable in the fraction in which the protein extract was applied to the gel at pH 8 and which was eluted with 2 mol / l NaCl. It can be clearly seen that the highest protein amounts can be eluted at 0.5 mol / l (at pH 4.5 to 8). However, the UCE activity eluted in chromatography with the pH 8 buffer only after elution with a 2 molar salt concentration. This result is of great advantage for the purification of the UC enzyme, since the UCE elutes in a fraction with a low protein concentration and in this way a large amount of the accompanying proteins (approx. 95% of the originally applied amount of protein) can be separated off.
  • Multiparallel cation exchange chromatography of a mixture of 4 model proteins in 32 wells with different starting conditions variation of the pH values (row of numbers, “rows") and the salt concentration (rows of letters, “columns”)) and one-stage elution.
  • Ribonuclease A, cytochrome C, lysozyme and myoglobin are mixed together as model proteins (1250 ⁇ g per protein).
  • 100 ⁇ l of cation exchange gel (Fractogel EMD (M) SO 4 " (Merck) are distributed over 32 cavities.
  • the following buffers are prepared as the equilibration buffer (40 mM each) for the cation exchanger (X direction of the deep well matrix ):
  • NaCL NaCL is added to the buffers in the Y direction of the deep well matrix, so that NaCI concentrations of 0 mM NaCI, 100 mM NaCI, 200 mM NaCI, 500 mM NaCI are formed in the cavitates.
  • a 32-well matrix buffer plate with the corresponding buffers without gel is set up in parallel. The gels are washed 3 times with 300 ⁇ L of the respective equilibration buffer (from the 32-well matrix buffer plate, Table 1). Aliquots of the protein mixture are dissolved in the respective (200 ⁇ l) sample application buffer (Table 1) and applied to the gels in the different cavities. After washing with the appropriate buffers (Table 1), the proteins are eluted with 3 ⁇ 100 ⁇ l of a 2 M NaCl solution.
  • the composition of the eluates is quantified using a reversed phase HPLC system (FIG. 4 and FIG. 5).
  • a reversed phase HPLC system 100 ⁇ l of the protein mixture (50 ⁇ g each protein), dissolved in 0.1% TFA, was passed through a reversed phase column (TSKgel Super-Octyl 4.6 mm ID x 5.0 cm L; Tosohaas Biosep) separated.
  • a SMART system (from Amersham) is used as the HPLC system.
  • the mobile phase consists of 0.1% TFA in distilled water (solution A) and 0.1% TFA in acetonitrile (solution B). Chromatography is performed with a flow of 1 ml / min and a gradient of 23% to 44% solution
  • Fig. 5 shows the calibration lines for determining the protein concentration of ribonuclease A, cytochrome C, lysozyme and myoglobin.
  • the mixtures are chromatographed using the same cation exchange gel used for multiparallel chromatography in gradient chromatography mode.
  • a self-packed cation exchange column (HR10 / 30 with 2 ml Fractogel EMD SO 3 " (M), Merck) was used.
  • the mobile phase consisted of 40 mM citric acid buffer, pH 3 without NaCl (buffer A) and 40 mM citric acid buffer, pH3 with 2 M NaCI (Buffer B). matography was performed at a flow rate of 2.0 ml / min. The gradient had a gradient of 0% to 75% buffer B in 90 min.
  • Multi-well cation exchange chromatography with different starting conditions variation of the pH values (row of digits, "rows") and the salt concentration (rows of letters, “columns”)) and single-stage elution.
  • Pig kidneys are used for the production of protein extracts.
  • kidney tissue is cut (at temperatures from 4 to 6 ° C) into approximately 1 cm 3 large pieces, filled into pre-cooled lyophilization tubes, frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C overnight.
  • the lyophilization plant type 2040 from Snijders Tilbug, Holland
  • the tissue pieces are completely dried for about a week 1 week.
  • the water-free tissue pieces are then pulverized with a grain mill (Varius, Messerschmidt) at the finest level. 2 g of the powder are dissolved in 20 ml of buffer (10 mM phosphate buffer, pH 7.3).
  • a homogenizer Ultra Turrax T 25 from Jahnke-Kunkel
  • the gel (300 ⁇ l / cavity) is distributed over 32 cavities of a 96 deep well plate (2.2 ml) and 1000 ⁇ l buffer (40 mmol / l) each with A to H in Table 2, in the cavities from rows 1 to 8 are added, so that one row (labeled with a letter) of the 96-well plate contains one and the same buffer with an identical pH value.
  • 400 ⁇ l of the salt solutions (NaCl, in mmol / l (final concentration): 1: 0; 2: 100; 3: 200 and 4: 500) are then pipetted into the cavitates, so that, for example, all cavitates with the designation 2 have the salt concentration of Contain 100 mmol / l.
  • one or more copies of the buffers are created according to the above-mentioned pipetting scheme, with which the individual cavities are later washed.
  • the sample and gel are suspended and incubated for 10 minutes.
  • the 96-well plate is then centrifuged (Speed-Vac centrifuge: 1 min).
  • the supernatant is copied to a 96-well plate and saved for analysis (protein concentration, activity, etc.).
  • the 32 different individual sample gel suspensions in the 96-well plate are combined with the corresponding, individual
  • Buffer solutions 300 ⁇ l each, the buffers are copied from a 96 deepwell plate (in which the individual solutions are located according to the scheme given above), to wash the 32 gels, then centrifuged and the supernatant solution pipetted off and discarded) to remove the non-binding proteins. This process is repeated 2 times. After this
  • the binding proteins are eluted by washing by adding a 2 molar NaCl solution (100 ⁇ l per cavity) to the cavities. After centrifugation (1 min), the eluates are copied onto one or more 96-well plates in order to make the individual samples available for subsequent analysis.
  • the protein extract was then chromatographed on a cation exchange column using the self-displacement method.
  • the parameters determined in FIG. 10 were used as equilibration and sample application buffers: the pobe was dissolved in a 40 mM buffer with a pH of 3 and an addition of 500 mM NaCl and applied to the self-
  • the gels (50 ⁇ l / cavity) are then divided into cavities 1A to 4A (HIC gels), 5A (HAP gel) and 6A-12A (chelate gel) of a 96 deep well plate (2, 2 ml) distributed.
  • 1000 ⁇ l buffer (Table 2) are added to the cavities of the rows 1A to 12A to the gels, so that the buffers according to Table 2 are located in the cavities of the 96-well plate, numbered 1 to 12.
  • 50 ⁇ l of the protein-containing sample protein concentration 0.3 ⁇ g / ⁇ l; protein extract extraction, see above under A.) are added to each of the 8 cavities.
  • the gels are washed twice with the equilibration buffer and then the binding proteins are eluted with 3 times the gel volume of the elution buffer.
  • the eluates are copied onto a 96-well plate and used for analyzes (protein concentration, activity, etc.).
  • the angiotensin conversion enzyme-like enzyme activity was determined as in Jankowski et al. 2001 (Jankowski, J. et al. (2001) Anal Biochem. 290, 324-9). The results are shown in Figure 3.
  • additives to stabilize the biomolecules such as: glycerol, sucrose, sodium molybdate, ethylene glycol, urea, guanidinium chloride, betaine, taurine, DTE, DTT, monothioglycerol, detergents, polyethylene glycol (PEG), chloroform, methanol, H 2 O, protease inhibitors (EDTA , EGTA, PMSF, DFP, Benzamidine, Aprotinin, Pefabloc SC, TLCK, TPCK, Phosphoramidon, Antipain, Leupeptin, Pepstatin A, Hirudin).
  • hydrophobicity of the gel e.g. butyl Sepharose ⁇ octyl Sepharose ⁇ phenyl Sepharose
  • chelate complexing group of the gel
  • imino-diacetic acid IDA
  • tris carboxymethyl ethylenediamine
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • start buffer e.g.: 0.5 to 2 M NaCI.
  • Variation of the gel matrix • Variation of the elution: a) pH gradient (variation of the pH values in the direction of decreasing pH values), b) elution with a competitive ligand (eg ammonium chloride, sulfate, imidazole, or histamine). c) Elution with chelates (EDTA, EGTA).
  • a competitive ligand eg ammonium chloride, sulfate, imidazole, or histamine.
  • Elution with chelates EDTA, EGTA.
  • TFA triethylammonium acetate
  • TEAA triethylammonium acetate
  • the homogenization of the freeze-dried kidney extract was carried out here in the respective start buffer:
  • the start buffer (20 mmo / l each) was used: (1) citrate buffer, pH 3; (2) citrate buffer pH 3.5; (3) formate buffer pH 4; (4) succinate buffer pH 4.5; (5) acetic acid pH 5; (6) malonate buffer pH 5.5; (7) malonate buffer pH 6; (8) phosphate buffer pH 7; (9) HEPES buffer pH 7.5; (10) HEPES buffer pH 8.
  • Approx. 200 mg kidney tissue powder was dissolved in 3 ml buffer for each batch.
  • Suspensions in the 96-well plate are suspended with the corresponding, individual buffer solutions (500 ⁇ l each, the buffers are copied from a 96-deepwell plate in which the individual solutions are located according to the scheme given above) to the gels wash in the 10 cavities, then centrifuged and the supernatant solution pipetted off and discarded to remove the non-binding proteins. This process is repeated 5 times.
  • the binding proteins are eluted by pipetting 600 ⁇ l of a 0.5 molar NaCl solution into the cavities. After centrifugation (1 min), the eluates are copied onto a 96-well plate to determine the individual
  • the still binding proteins are eluted by pipetting 600 ⁇ l of a 2 molar NaCl solution into the cavities. After centrifugation (1 min), the eluates are copied onto a 96-well plate in order to make the individual samples available for subsequent analysis.
  • a protocol has been developed for this purpose to enable samples.
  • a 96 deepwell plate with a filter (20 ⁇ m, Macherey & Nagel) is filled with a size exclusion gel (1000 ⁇ l / cavity, Biogel P6, BioRad).
  • the size exclusion gel should be equilibrated with a buffer that prevents electrostatic interactions between proteins and the gel.
  • a salting of a protein solution from 2 mol / l NaCI to 0.29 mol / l NaCI succeeds when 350 ⁇ l sample is applied to the cavities filled with 1000 ⁇ l gel. Desalination is done by centrifuging the sample through the size exclusion gel. With this test approach, a protein yield of 79% was achieved.
  • the salt concentration in the eluate can be reduced to 0.2 mol / l if the sample volume of the sample to be buffered is reduced to 300 ⁇ l. In this case, however, the protein yield drops to 67%.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein multiparalleles Chromatographie-System zur Methodenentwicklung zur Reinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen. Das System nutzt Kavitäten von Multi-Well-Platten (z.B. 96-Well-Platten), die mit Chromatographiegelen befüllt sind und besteht aus diversen Startpuffern, in dem die zu chromatographierenden Proben gelöst werden und mit denen die Gele equilibriert sind und Lösungen zum Desorbieren (Eluieren) der an die Gele gebundenen Biomoleküle. Das System umfasst Hilfen zur Interpretation der Ergebnisse, die aus den sich an die Chromatographie anschließenden Analysen (z.B. Proteinkonzentrationsbestimmungen, Bioassays, etc.) der Überstände der nicht gebundenen Biomoleküle und/oder der Eluate hervorgehen. Diese Hilfen können auch aus Programmen bestehen, in die die Ergebnisse eingegeben werden und die nach Prozessierung der Ergebnisse Interpretationen und Vorschläge zur Gestaltung der Schritte zur Reinigung eines Biomoleküls liefern.

Description

Verfahren zum Auffinden geeigneter Chromatographiebedingungen zur Trennung biologischer Moleküle
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein multiparalleles Verfahren zum schnellen Auffinden geeigneter Chromatographieparameter zur Trennung biologischer Moleküle.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein multiparalleles Chromatographie-System zur Methodenentwicklung zur Reinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen. Das System nutzt Kavitaten von Multi-Well-Platten (z.B. 96-Well-Platten), die mit Chromatographiegelen befüllt sind und besteht aus diversen Startpuffern, in dem die zu chromatographierenden Proben gelöst werden und mit denen die Gele equilibriert sind und Lösungen zum Desorbieren (Eluieren) der an die Gele gebundenen Biomoleküle.
Für die Entwicklung von chromatographischen Fraktionierungsschritten zur Reinigung von Biomolekülen werden gegenwärtig im wesentlichen drei verschiedene Chromatographie-Systeme von den Firmen Amersham Bioscience (Äkta-Systeme: http://www1.amershambiosciences.com), Applied-Biosystems (BioCAD® 700E Workstation, www.appliedbiosystems.com) und BioRad (BioLogic DuoFlow, www.bio-rad.com) verwendet. Mit diesen Systemen können nacheinander eine Rei- he von Parametern variiert werden, um geeignete Bedingungen für die Reinigung von Biomolekülen zu finden. Diese Suche nach den geeigneten Parametern zur Reinigung und Fraktionierung von beispielsweise Biomolekülen wie Proteinen, Pep- tiden, Nukleinsäuren etc. ist zeitintensiv und in der Regel ineffektiv. So lehren Erfahrungswerte aus der biotechnologischen / medizinischen / chemischen Praxis, dass bei der Suche nach geeigneten Chromatographiebedingungen eine Vielzahl von chromatographischen Medien sowie eine Vielzahl von chromatographischen Eluti- onsparametern in möglichst kurzer Zeit auf ihre Brauchbarkeit getestet werden müssen, um aus den gewonnenen Daten effektive Reinigungs- bzw. Fraktionie- rungsschritte abzuleiten. Hierbei stellte sich heraus, dass diese Ziele sich mit den oben genannten Systemen (Versuche mit dem Äkta-System) nur mit einem hohen zeitlichen und finanziellen Aufwand erreichen lassen.
Aus der WO 01 / 77662 A2 ist ein Verfahren zum Auffinden von geeigneter Chromatographiebedingungen bekannt, bei dem keine Multiwell-Platten zum Einsatz kommen.
Die WO 99 / 24138 A1 beschreibt ein Verfahren, bei dem in den Kavitaten einer
Multiwell-Platte unterschiedliche Chromatographie-Medien angeordnet sind. Diese Medien werden zur Analyse biologischer Substanzen im Rahmen sogenannter „As- say" genutzt.
Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es daher Aufgabe der Erfindung eine effektivere und leicht zu handhabendere Methode zur geeigneten Auswahl von Chromatographieparametern zum Aufbau von Reinigungs- bzw. Fraktionierungsschritten von biologischen Proben zu schaffen. Ferner ist es Ziel der Erfindung ein geeignetes Computer-Programm zur Erfassung und Interpretation der Ergebnisse der Chromatographie zur Verfügung zu stellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale. Im Sinne der Erfindung werden unter „biologischer Probe" gereinigte oder ungereinigte Proteine, Peptide, Nukleinsäuren aller Art, Kohlenhydrate, Lipide, niedermolekulare Metaboliten oder Gemische derselben verstanden. Dies beinhaltet insbesondere - aber nicht ausschließlich - komplexe Proteingemische von humanem, tieri- sehen oder pflanzlichen Geweben oder Zellen sowie Zellen von Mikroorganismen.
Die „biologische Probe" wird im folgenden auch mit „Biomolekülen" bezeichnet.
Im Sinne der Erfindung werden unter Chromatographiemedien zweierlei Arten verstanden:
a) Materialien, Verbindungen oder Substanzen, die die biologische Probe zu binden vermögen. Dies sind beispielsweise (aber nicht ausschließlich) alle
Arten von Ionenaustauscher (Anionionenaustauscher, Kationenaustauscher), Metallaffinitätschromatographiemedien, Reversed-Phase-Materialien, Gele für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC), Hydroxyla- pathit-Medien (HAP) Affinitätchromatographie-Medien mit Liganden jeglicher Art, aber auch Gele mit magnetischen Eigenschaften (Magneto-Beads, beschichtet oder unbeschichtet). Besonderes Merkmal derartiger Gele ist die Fähigkeit, die biologische Probe zu binden, wobei diese durch geeignete Elutionsmittel (Lösungen) von der bindenden Substanz auch wieder befreit werden können muss.
b) Materialien, Verbindungen, Substanzen oder Lösungen, die die biologische
Probe nicht zu binden vermögen. Dies sind beispielsweise (aber nicht ausschließlich) organische und/oder anorganische Säuren, Basen, Salze, deren Derivate oder Lösungsmittel aller Art einschließlich wäßriger Lösungen. Besonderes Merkmal derartiger Lösungen und Substanzen (im weiteren Eluti- onslösungen genannt) ist die Fähigkeit zur Desorption (Elution) der biologischen Probe von dem Chromatographie-Gel, das heißt, zur Verschiebung der Gleichgewichte der Bindung der biologischen Probe an das Chromatographie-Gel in der Weise, dass die an das Chromatographie-Gel gebundenen Biomoleküle nach Zugabe der Elutionslösung keine bzw. nur noch ge- ringe Affinitäten zum Chromatographie-Gel haben. Die Erfindung ist für die automatisierte Suche nach geeigneten Chromatographiemedien und den zugehörigen Puffer- und Elutionsbedingungen zur Reinigung von Peptiden und Proteinen, aber auch anderen Biomolekülen aus Homogenaten (Rohextrakten) geeignet. Die Erfindung basiert auf der Absorption von Biomolekülen an Gelpartikel, an die sogenannte stationäre Phase. Eine biologische Probe, bestehend aus Biomolekülen wie Proteinen, Peptiden etc., gelöst im Startpuffer (mobile Phase), wird mit Gelpartikeln vermischt (sogenanntes Batch-Verfahren) und nach definierten Inkubationszeiten wird der flüssige Überstand, in dem sich die Biomoleküle befinden, die keine Affinität zum gewählten Gel unter den gewählten Bedingungen haben, von den Gelpartikeln entfernt. Die Gelpartikel werden anschließend mit
Startpuffer gewaschen, um die nicht bindenden Moleküle möglichst weitgehend zu entfernen. Im nachfolgenden Schritt werden die an die Gelpartikel absorbierten Biomoleküle durch ein geeignete Elutionslösung (mobile Phase) von den Gelpartikeln wieder in Lösung gebracht, um nach Eintritt in die mobile Phase (Desorption bzw. Elution) und Abtrennung von den Gelpartikeln diversen Analysen- und Nachweissystemen (Photometer, Bioassays, etc.) zugeführt werden zu können. Auf diese Weise lassen sich unterschiedlichste Chromatographieparameter wie z.B. Gelmedien, Puffer, pH, Lösungsmittelzusätze oder Substanzen zur Stabilisierung von Biomolekülen ermitteln.
Die Erfindung kann automatisiert durchgeführt werden, so dass die Ergebnisse aus der z.B. aus einer 96-Well-Chromatographie manuell oder mittels einem Computerprogramm ausgewertet, übersichtlich dargestellt und für die Interpretation vorbereitet werden können. Die gewonnenen Daten werden in der Weise interpretiert, dass als Resultate der Interpretation Vorschläge für die chromatographische Reinigung von (beispielsweise) Proteinen aus Proteinextrakten einer biologischen Probe hervorgehen. Als chromatographische Modi sind Frontal-Chromatographie, Displace- ment-Chromatographie oder Gradienten-Chromatographie möglich. Die Reinigung des Zielproteins kann auch mehrere verschiedene, sich aneinander anschließende Chromatographien (Kombinationen von Chromatographien) einschließen.
Die Erfindung sieht ferner einen Kit vor, in dem das erfindungsgemäße Verfahren
Anwendung findet. Dieser dient der wirtschaftlichen Verwertung und kann bestimmte Chromatographiemuster in Form ausgewählter Chromatographiemedien für unterschiedlichste Anwendungszwecke (in Abhängigkeit der zu untersuchenden biolo- gischen Probe) beinhalten und dementsprechend ausgerüstet sein. Hierzu können die Multi-Well-Platten bereits vorgefertigt sein mit Chromatographiemedien zur Bindung der biologischen Probe (Gruppe B-Materialien) und einem Set von unterschiedlichsten Chromatographiemedien (Lösungen jeglicher Zusammensetzung) zur Elution (Gruppe NB-Materialien).
Das System (Kit) beinhaltet Protokolle zur Durchführung der Experimente im Multi- Well-Format mit n Kavitaten (n > 1), auf Multi-Well-Platten verteilte, kommerziellverfügbare Chromatographiemedien, sowie auf Multi-Well-Platten verteilte Eluti- onsmittel, die an die jeweiligen Chromatographiemedien angepasst sind. Das Sys- tem dient der systematischen Suche nach reproduzierbaren chromatographischen Reinigungsschritten für Biomoleküle. Das System ist auf die Kombination von Pipet- tier-Roboter ausgelegt, kann aber auch manuell genutzt werden. Bedingt durch die gewählten verschiedenen Chromatographie-Parameter (z.B. pH-Wert, lonenkon- zentration, etc.) werden unterschiedliche Populationen von Biomolekülen an die Gele in den verschiedenen Kavitaten binden. Wird beispielsweise als Chromatographiegel ein Anionenaustauschergel benutzt, werden an das Gel in B1 (Fig. 1 , die Lösung in der Kavität B1 hat einen pH von 4 und eine NaCI-Konzentration von 50 mmol/l) Biomoleküle binden, die bei pH 4 noch ausreichend viele negative Ladungen besitzen, also einen niedrigen isoelektrischen Punkt haben. Die niedrige NaCI-Konzentration bewirkt, das bereits Biomoleküle mit niedriger Affinität an das
Gel binden. In der Kavität G11 (Fig. 1 , die Lösung in der Kavität G11 hat einen pH von 7 und eine NaCI-Konzentration von 750 mmol/l) können Biomoleküle mit einem wesentlich höheren isoelektrischen Punkt erwartet werden. Gleichzeitig werden, bedingt durch die hohe NaCI-Konzentration nur Biomoleküle mit sehr hoher Affinität an die Gelpartikel binden, die überwiegende Mehrzahl der Biomoleküle wird in Lösung bleiben. Das System wird auch Protokolle enthalten, um die an den Gelpartikeln konzentrierten Biomoleküle weiter analysieren zu können, z.B. über die Proteinbestimmung oder die Elektrophorese.
Vorteile der Erfindung mithin bestehen in folgendem:
• Im Vergleich zu den kommerziell verfügbaren Methoden ermöglicht die Erfindung durch den Parallel-Ansatz im Multi-Well-Format das Auffinden ge- eigneter Chromatographiemedien und der zugehörigen Elutionsmittel in sehr viel kürzerer Zeit als bisher.
• Die Suche nach geeigneten Bedingungen zur chromatographischen Reinigung bzw. Fraktionierung von Biomolekülen kann auch mit Rohextrakten durchgeführt werden. Für die Versuche müssen die Biomoleküle durch Homogenisierungsschritte lediglich in Lösung gebracht werden und die Hom- genate durch einfache Zentrifugation von Partikeln befreit werden. In diesem Punkt ist die Erfindung anderen Methoden wie der Festphasen-Extraktion oder der Säulen-Chromatographie deutlich überlegen, da in beiden Fällen ein Verstopfen der Säulen droht.
• Die bei Festphasen-Extraktionssystemen nachteiligen, in der Regel sehr kurzen Zeiten, in denen die Biomoleküle mit der stationären Phase des Chromatographiemediums in Kontakt treten können, können zur Folge haben, dass keine vollständige Adsorption der Biomoleküle an das Chroma- tographiemedium stattfindet. Diese Gefahr herrscht bei dem hier vorgestellten System nicht, da längere Inkubationszeiten gewählt werden können.
• Das System bedarf nicht, wie die Festphasen-Extraktion einer Vakuumquelle zum Entfernen der Elutionsmittel. Die mit der Vakuumtechnik verbundenen Probleme wie unvollständiges Absaugen der Elutionsmittel haben deshalb keine Bedeutung.
• Das System kann zur Entwicklung von chromatographischen Reinigungsschritten von Biomolekülen eingesetzt werden. Die mit dem System gewonnenen Daten können für die Entwicklung von Chromatographie-Schritten im Frontal-Chromatographie-Modus, im Displacement-Chromatographie-Modus oder im Gradienten-Chromatographie-Modus genutzt werden.
• Das System kann (z.B. in Kombination mit der Massenspektrometrie) für vergleichende Untersuchungen der Biomolekül-Profile ("Profiling") zweier verschiedener Zustände ("Differential Display") herangezogen werden, um Moleküle identifizieren zu können, die für einen definierten Zustand (z.B. krank) charakteristisch sind. • Das System kann als Probenvorbereitung für 2D-Elektrophorese-Strategien genutzt werden.
Es ergeben sich mithin Vorteile für die biotechnologische Industrie und für die Pharma-Industrie durch schnelle Methoden-Entwicklung zur chromatographischen Aufreinigung technologisch / therapeutisch / diagnostisch relevanter Proteine. Für die Proteomforschung (Pharma-Industrie, Biotechnologie, Biomedizinische Forschung) bestehen Vorteile in der Vorfraktionierung von Proteinen für die Proteoma- nalyse; grundsätzlich aber wird eine schnelle Methoden-Entwicklung zur chromatographischen Aufreinigung interessierender Proteine geschaffen.
Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung ist in den anliegenden Zeichnungen dargestellt und wird nachfolgend näher beschrieben; es zeigt
Figur 1 die schematische Darstellung einer 96 Well
Platte, hier belegt mit 96 diversen Startpuffern für die multiparallele Kationenaustausch-Chromatographie;
Figur 2 die Darstellung der Ergebnisse einer multiparallelen Chromatographie eines Proteingemisches zum Auffinden geeigneter Parameter für die chromatographische Reinigung von 4 verschiedenen Zielpro- teinen. Die Grafik gibt die absoluten Ausbeuten der verschiedenen Zielproteine wieder (in %, bezogen auf die eingesetzte Menge des jeweiligen Proteins), nämlich von Ribonuclease A (oben links), Cytochrom C (oben rechts), Lysozym (unten links) and Myoglo- bin (unten rechts), in den Eluaten des multiparallelen
Chromatographie-Systems.
Figur 3: die Darstellung der Ergebnisse einer multiparallelen Chromatographie eines Proteingemisches zum Auffinden geeigneter Parameter für die chroma- tographische Reinigung von 4 verschiedenen Zielpro- teinen. Die Grafik gibt die spezifischen Ausbeuten der verschiedenen Zielproteine wieder (in %, bezogen auf die Gesamtmenge aller Proteine in jeweils einer Kavität.
5 Figur 4: ein typisches Chromatogramm einer analytischen Reversed-Phase-Chromatographie zur Quantifizierung der individuellen Proteine des Proteingemisches, bestehend aus Ribonuklease A (Rib), Cytoch- rom C (Cyt C), Lysozym (Lys) und Myoglobin (Myo). 10 Abs. Ausb.: Absolute Ausbeute bzw. Wiederfindungs- rate: Dieser Wert bezieht sich auf die ursprünglich auf die Kationenaustauch-Säule injizierte Menge des jeweiligen Proteins (= 100 %).
Figur 5: eine Eichgerade, erstellt mit dem Reversed-
15 Phase-HPLC-System (Figur 4), zur Bestimmung der
Proteinkonzentration von Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin: Abhängigkeit der detek- tierten Peakfläche von der injizierten Proteinmenge.
Figur 6: ein Chromatogramm der Kationenaustausch-
20 Gradienten-Chromatographie eines Proteingemisches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in dem Probenauftragpuffer mit pH 3 und 0 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chroma- 25 tographie-System).
Figur 7: ein Chromatogramm der Kationenaustausch-
Gradienten-Chromatographie eines Proteingemisches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauf- 30 tragpuffer mit pH 4 und 500 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chromatographie-System).
Figur 8: ein Chromatogramm der Kationenaustausch-
Gradienten-Chromatographie eines Proteingemi- 5 sches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C,
Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauf- tragpuffer mit pH 6 und 0 mM NaCI (Parametersatz aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chromatographie-System).
10 Figur 9: ein Chromatogramm der Kationenaustausch-
Gradienten-Chromatographie eines Proteingemisches bestehend aus Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin gelöst in einem Probenauftragpuffer mit pH 7 und 200 mM NaCI (Parametersatz
15 aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chromatographie-System).
Figur 10 eine Darstellung der Ergebnisse eines
32-Well-Matrix-multiparallelen Kationenaustausch- Chromatographie-Experiments zur Ermittlung von Pa-
20 rametern zur chromatographischen Reinigung von
Enzymen mit Angiotensin-Konversions-Enzym- ähnlicher Aktivität aus einem Proteinextrakt von Nierengewebe vom Schwein: Spezifische Enzymaktivitäten (Quotient aus absoluter Enzymaktivität (bestimmt
25 mit der MES-Methode: Anal Biochem. 290, 324-9,
2001 ) und der Proteinkonzentration) der Eluate (Einstufenelution mit 2 mol/l NaCI) der 32 Fraktionen eines 32-Well-Matrix- Kationenaustausch-
Chromatographie-Experiments in einer 96-Deep-
30 Well-Platte; zum schnellen Erkennen der Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität ist dieser Fraktion einer schwarzer Hintergrund zugeordnet.
Figur 11 eine Darstellung der Ergebnisse eines
12-Well-Matrix-Chromatographie-Experiments zur
5 Ermittlung von Parametern zur chromatographischen
Reinigung von Enzymen mit Angiotensin- Konversions-Enzym-ähnlicher Aktivität aus einer aktiven Fraktion aufgereingt aus Nierengewebe vom Schwein: Spezifische Enzymaktivitäten (bestimmt mit
10 der MES-Methode; berechnet aus Proteinkonzentrationen und absoluter Enzymaktivität) der Eluate der 12 Fraktionen verschiedener Chromatographie- Medien (HAP: Hydroxyl-Apathit-Gel, HIC: Hydropho- be-Interaktionschromatographie-Gel, Chelat: Gel für
15 die Immobilisierte-Metal-Affinitäts-Chromatographie).
Zum schnellen Erkennen der Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität ist dieser Fraktion ein schwarzer Balken zugeordnet.
Figur 12 ein Chromatogramm einer Hydrophoben-
20 Interaktions-Chromatographie einer aktiven Fraktion aufgereingt aus Nierengewebe vom Schwein entsprechend dem in Figur 11 gezeigten Parametersatz. Dargestellt sind Profile der Proteinkonzentrationen und der spezifischen Enzymaktivitäten von ACE- 25 ähnlichen Enzymen.
Figur 13 die Proteinkonzentrationen der Fraktionen einer
Multi-Well-Kationenaustausch-Chromatographie mit
Stufengradienten-Elution. Gradientenstufe 1: 0,5 mol/l NaCI; Gradientenstufe 2: 2 mol/l NaCI. UCE:
30 Urotensin-generierende Aktivität. Die Erfindung wird anhand von verschiedenen Fraktionierungsversuchen von Proteingemischen dargestellt.
Die Figur 1 zeigt beispielhaft eine 96 Well-Platte (Multi-Well-Platte), die durch Spalten (X-Richtung) und Zeilen (Y-Richtung) als Matrix definiert ist, wobei unterschiedli- ehe Chromatographiemedien ortsabhängig auf den durch die Matrix definierten Matrizenpunkten der Platte angeordnet sind, deren einzelne Kavitaten mit jeweils gleichen Mengen Chromatographiegel belegt sind (z.B. mit einem Kationenaustauschergel), aber individuelle Kombinationen von pH-Werten und Kochsalz- Konzentrationen besitzen. Kavität B1 zeigt im Beispiel der Fig. 1 einen pH von 4,5 und eine NaCI-Konzentration von 0,05 mol/l. Kavität G12 hätte einen pH von 7,0 und eine NaCI-Konz. von 1 mol/l.
Im ersten Fraktionierungsexperiment wird mit dem multiparallelen Chromatographiesystem ein Gemisch bekannter Proteine (Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin) fraktioniert (Fig. 2 und Fig. 3) und die Übertragbarkeit der gewonnenen Ergebnisse auf die Gradientenchromatographie gezeigt (Fig. 6 - 9). Dargestellt sind die absoluten Ausbeuten (Fig. 2) bzw. die spezifischen Ausbeuten (Fig. 3) der verschiedenen Proteine, die in den Eluaten nach paralleler Chromatographie mit den unterschiedlichen Parametern gemessen werden. Um die Zu- sammensetzung der an das Gel gebundenen Proteine zu quantifizieren, werden die
Eluate des multiparallelen Chromatographiesystems mit einer Reversed-Phase- Chromatographie analysiert. Figur 4 zeigt eine typische Reversed-Phase-HPLC- Trennung des Systems, mit der die Quantifizierung durchgeführt wurde. Das Chromatogramm stammt von der Trennung des Proteingemisches vor der Prozessierung mit dem multiparallelen Chromatographie-System. Mit dem Reversed-Phase-HPLC
System wird für jedes Protein eine Eichgerade erstellt (Figur 5). Zur Bestimmung der Eichgeraden zur Quantifizierung der individuellen Proteine werden verschiedene definierte Mengen der individuellen Proteine injiziert. Zur Erstellung der Eichgerade werden die Peakflächen der Proteine gegen die Proteinkonzentrationen aufgetra- gen. Um die Übertragbarkeit der mit dem multiparallelen Chromatographie-System ermittelten Parameter auf die Gradienten-Chromatographie zu zeigen, werden einige Parameter-Sätze (für den Probenbeladungs-Puffer) herausgesucht (pH 3 mM + NaCI; pH 3 + 0 mM NaCI; pH 4 + 0 mM NaCI; pH 6 + 0 mM NaCI; pH 7 + 200 mM NaCI) und das Proteingemisch unter diesen Bedingungen chromatographiert (Fig. 6-
9). Die resultierenden Fraktionen der verschiedenen Gradienten-Chromatographien werden wiederum mit der Reversed-Phase-HPLC (Fig. 4) untersucht, um die Ausbeuten der individuellen Proteine des Gemisches zu bestimmen.
Der Fig. 3 ist zu entnehmen, dass die Ribonuklease A mit der höchsten spezifischen
Ausbeute zu gewinnen ist, wenn das Proteingemisch in einem Puffer pH 3 und 0 mM NaCI auf den Kationenaustauscher aufgetragen wird. Ein Blick auf das Ergebnis in Fig. 2 verrät, dass unter diesen Bedingungen mit einer Koelution von Cytochrom C und Lysozym zu rechnen ist. Das Chromatogramm der Gradientenchroma- tographie der Proteinmischung, betrieben mit einem Puffer pH 3 und 0 mM NaCI als
Start- und Probenaufgabepuffer, bestätigt die Erwartung. Ribonuklease eluiert zusammen mit Lysozym, unter dem Einfluß des Gradienten konnte Cytochrom C sogar noch von den anderen Proteinen abgetrennt werden.
Fig. 7 zeigt das Chromatogramm der Trennung des Proteingemisches mit einem Puffer pH 4 und 500 mM NaCI als Start- und Probenaufgabepuffer. Unter diesem
Parametersatz wurde die höchste spezifische Ausbeute im Eluat des multiparallelen Chromatographie-Experiments für Myoglobin gefunden. Auf den ersten Blick scheinen die Ergebnissen in Fig. 3 und Fig. 7 widersprüchlich. Erwartet wird nach Blick auf Fig. 3, dass Myoglobin mit höherer spezifischer Ausbeute auch durch die Gra- dientenchromatographie gewonnen werden kann. Stattdessen wurde Myoglobin während der Gradientenchromatographie komplett verloren. Die Ursache kann zum Teil der Fig. 2 entnommen werden sowie der Analyse der Myoglobin-Konzentration im Überstand der multiparallelen Chromatographie nach dem Auftragen des Proteingemisches. Hier zeigte sich eine signifikante Differenz zwischen der aufgetrage- nen Menge Myoglobin und der Summe aus der Menge des im Eluat wiedergefundenen Myoglobins und des Myoglobins im Überstand. Diese Differenz deutet auf eine irreversible Bindung des Myoglobins an das Gel. Die irreversible Bindung des Myoglobins konnte durch die Beobachtung verifiziert werden, dass das Gel nach Eluti- on mit NaCI rötlich gefärbt bleibt und erst durch intensives Waschen mit Natronlau- ge wieder entfärbt werden kann. In der Gradientenchromatographie kommt dieser Effekt noch deutlicher zum Tragen, da für diese Trennungen typischerweise Gelmengen eingesetzt werden, die das ca. 10 fache der aufgetragenen Probe binden können. Aus diesem Beispiel leitet sich die Grundregel ab, dass chromatographi- sehe Parameter zu vermeiden sind, bei denen im multiparallelen Chromatographie-
Experiment größere Differenzen zwischen aufgetragener Menge und der Summe der Ausbeuten im Eluat und im Überstand berechnet wurden. Die absoluten Ausbeuten in Fig. 2 weisen darauf hin, dass der Parametersatz pH 4 und 500 mM NaCI für die Reinigung der übrigen Proteine ebenfalls ungeeignet ist, was aus dem Gra- dientenchromatgramm (Fig. 7) ebenfalls hervorgeht.
Unter dem Parametersatz von pH 6 und 0 mM NaCI ergeben sich für die Reinigung für Myoglobin über die Gradientenchromatographie weitaus bessere Ergebnisse (Fig. 8), die sich auch aus den Versuchen mit dem multiparallelen Chromatographie- System vorhersagen lassen: Bei pH 6 ist kein Myoglobin im Eluat nachweisbar (Fig. 2), im Gegensatz zu den anderen Proteinen der Mischung, die unter pH 6 mit relativ hoher Affinität binden. Aus den Daten ergibt sich, dass Myoglobin sich mit hoher spezifischer Ausbeute über eine Frontal-Chromatographie über den im Experiment eingesetzten Kationenaustauscher mit einem Puffer von ph 6 reinigen läßt. Diese Schlußfolgerung wird von dem Chromatogramm in Fig. 8 bestätigt. Myoglobin eluiert in einer homogenen Fraktion im Durchbruch der Säule.
Eine hohe spezifische Ausbeute für Lysozym versprechen die Ergebnisse der multiparallelen Chromatographie bei einem Puffer mit einem pH von 7 und 200 mM NaCI (Fig. 3). Die mit diesem Parametersatz durchgeführte Gradientenchromatographie bestätigt die Erwartung. Kurz nach dem Anstieg des Gradienten ist eine Fraktion zu finden, die fast zu 100 % reines Lysozym enthält.
Um zu zeigen, dass die Methode auch für komplexe Proteinmischungen unbekannter Zusammensetzung geeignet ist, wurde eine Fraktionierungsversuchsreihe mit einem Proteinextrakt aus Schweine-Nieren durchgeführt. Wie in den unten genann- ten Beispielen gezeigt, werden hierzu Aliquots des Gewebeextrakts auf eine Multi-
Well-Platte verteilt, in deren Kavitaten sich jeweils gleiche Mengen eines Kationene- naustauschergels befinden. Die einzelnen Kavitaten unterscheiden sich in Bezug auf den pH-Wert und in Bezug auf die lonenstärke. Das Ergebnis der Trennung wird über eine Bestimmung der Proteinkonzentration der an das Gel gebundenen Proteine der einzelnen Kavitaten erhalten.
Die Figur 10 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der spezifischen Aktivität der
Fraktionen der Multi-Well-Kationenaustauschchromatographie entsprechend dem Ausführungsbeispiel 2. Für das Finden geeigneter Bedingungen für die Aufreinigung eines gesuchten Proteins können die Daten, die in Fig. 10 dargestellt sind, nach folgenden Regeln genutzt werden:
1. Die gewählte Chromatographie (hier Kationenaustauschchromatographie) kann dann als günstiger initialer Schritt zum Konzentrieren genutzt werden, wenn das gesuchte Protein, hier detektiert über seine enzymatische Aktivität, in einer Fraktion eluiert, in der eine im Vergleich zu den anderen Fraktionen niedrige Proteinkonzentration zu finden ist (z.B. Fig. 10 in der Fraktion pH 3, 500 mmol/l NaCI;), wenn also die spezifische Aktivität einen besonders hohen Wert erreicht.
2. Sollte die absolute Aktivität eines gesuchten Proteins in einer Fraktion zu finden sein, in der eine im Vergleich zu den anderen Fraktionen sehr hohe Proteinkonzentration vorkommt , sollten andere Chromatograpiemedien wie Anionenaustauscher darauf geprüft werden, ob das gesuchte Protein sich mit höherer spezifischer Aktivität wiederfinden lässt.
3. Liegt der unter Punkt 2 beschriebene Fall vor und es ist kein anderer Parametersatz zu finden, die die unter Punkt 1 beschriebenen Kriterien erfüllt, dann sollte der 2. Ansatz (Multi-Well-Chromatographie mit Stufengradienten- Elution) genutzt werden, um geeignete Bedingungen zur Reinigung des gesuchten Proteins zu finden.
Neben dem Vorteil der Multi-Well-Chromatographie, in sehr kurzer Zeit eine große
Zahl verschiedener Chromatographie-Parameter auf ihre Brauchbarkeit prüfen zu können, wird in der Fig. 10 ein weiterer Vorteil sichtbar, der mit bisherigen Gradien- ten-Chromatographie-Techniken nur mit großem Aufwand aufspürbar wäre, nämlich die Phänomene, die bei dem Puffer mit dem pH Werte 3. Hier sind bei Salzkonzentrationen von jeweils 500 mmol/l NaCI Maxima in der spezifischen Aktivität zu sehen, die hier nicht erwartet werden. Der Erwartung entspricht, dass die Konzentration der an den Kationenaustauscher gebundenen Proteine bei einer Startkonzentration von 0 mmol/l Salz am höchsten ist und die Konzentration der gebundenen Proteine mit steigender Salzkonzentration der Startlösung abnimmt. Das Auftreten der oben beschriebenen Maxima kann damit erklärt werden, dass die höheren Salzkonzentrationen hydrophobe Wechselwirkungen (unabhängig von den elektrostatischen Wechselwirkungen) zwischen Proteinen und dem Gel begünstigen, was zu einer verstärk- ten Absorption von Proteinen an das Gel führt. Es handelt sich hier also um Phänomene, die mit nicht-idealen Chromatographie-Mechanismen (Schlüter H, Zidek W. J. Chromatogr. 639. 17-23 (1993)) bezeichnet werden können, was bedeutet, dass (in diesem Fall) nicht nur elektrostatische Wechselwirkungen auf die Bindung der Proteine an die stationäre Phase sondern auch andere Wechselwirkungen (hier hydro- phobe Wechselwirkungen) einen maßgeblichen Einfluss haben und damit vorteilhaft für die Trennung genutzt werden können. Phänomene dieser Art lassen sich durch empirische Strategien finden, das heißt, je mehr Parameter variiert werden können, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, die notwendigen Parameter zu finden und vorteilhaft nutzen zu können.
Die Figur 11 zeigt zum 3. Ausführungsbeispiel spezifische Enzymaktivitäten von
Renin-ähnlichen Enzymen der Fraktionen der Multi-Well-Chromatographie mit verschiedenen HIC-, Hdroxylapathit- und IMAC- (Immobilisierte Metall- Affinitätschromatographie-) Gelen. Gesucht wurde nach einem Parametersatz, mit dem eine aufgereinigte aktive Protein-Fraktion aus Schweinenierenextrakt mit einer Gradientenchromatographie weiter gereinigt werden kann. Figur 12 gibt das Chromatogramm einer Hydrophoben-lnteraktions-(HIC)-Gradientenchromatographie wieder, die aus den Parametersätzen der multiparallelen Chromatographie des Experiments, dargestellt in Figur 11 , abgeleitet wurde (Phenyl-HIC-Chromatographie). Die enzymatisch aktive Fraktion eluiert im Bereich des Gradienten, was zeigt, dass die Vorhersage zutrifft, dass das gesuchte Zielenzym sich unter den in Fig. 11 beschriebenen Bedingungen an eine Phenyl-HIC-Säulen binden und chroma- tographieren läßt. Die Figur 13 zeigt Proteinkonzentrationen der Fraktionen einer Multi-Well- Kationenaustausch-Chromatographie mit Stufengradienten-Elution. Gradientenstufe 1 : 0,5 mol/l NaCI; Gradientenstufe 2: 2 mol/l NaCI. UCE: Urotensin-generierende Aktivität. Es ist erkennbar, dass eine Urotensin-bildende Aktivität (UCE-Aktivität) lediglich in der Fraktion nachweisbar war, bei der der Proteinextrakt bei pH 8 auf das Gel aufgetragen wurde und die mit 2 mol/l NaCI eluiert wurde. Es ist deutlich zu erkennen, dass mit 0,5 mol/l (bei pH 4,5 bis 8) die höchsten Proteinmengen eluier- bar sind. Die UCE-Aktivität eluiert in der Chromatographie mit dem pH 8-Puffer jedoch erst nach Elution mit einer 2 molaren Salzkonzentration. Dieses Ergebnis ist für die Aufreinigung des UC-Enzyms von großem Vorteil, da das UCE in einer Fraktion mit niedriger Proteinkonzentration eluiert und auf diese Weise eine große Menge der begleitenden Proteine (ca. 95 % der ursprünglich aufgetragenen Proteinmenge) abgetrennt werden können.
1. Ausführunqsbeispiel:
Multiparallele Kationenaustausch-Chromatographie eines Gemisches von 4 Modell- Proteinen in 32 Wells mit verschiedenen Startbedingungen (Variation der pH-Werte (Ziffernreihe, „Zeilen") und der Salzkonzentration (Buchstabenreihen, „Spalten")) und einstufiger Elution.
Als Modellproteine werden Ribonuclease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin zusammengemischt (1250 μg pro Protein). Pro Kavität werden je 100 μl Kationenaustauscher-Gel (Fractogel EMD (M) SO4 " (Merck) auf 32 Kavitaten verteilt. Als Aquilibrierungspuffer (je 40 mM) werden für den Kationenaustauscher die folgenden Puffer vorbereitet (X-Richtung der Deep Well-Matrix):
Tabelle 1 : Puffer für die miltiparallele Kationenaustausch-Chromatographie
NaCL wird in Y-Richtung der Deep Well-Matrix den Puffern zugemischt, so dass in den Kavitaten NaCI-Konzentrationen von 0 mM NaCI, 100 mM NaCI, 200 mM NaCI, 500 mM NaCI entstehen. Parallel wird eine 32-Well-Matrix-Pufferplatte mit den entsprechen Puffern ohne Gel angesetzt. Die Gele werden 3mal mit je 300 μL des jeweiligen Aquilibrierungspuffer (aus der 32-Well-Matrix-Pufferplatte, Tabelle 1) gewa- sehen. Aliquots des Proteingemisches werden in dem jeweiligen (200 μl) Proben- aufgabepuffer (Tabelle 1 ) gelöst und auf die Gele in den verschiedenen Kavitaten aufgetragen. Nach dem Waschen mit den passenden Puffern (Tabelle 1 ) werden die Proteine mit 3 x 100 μl einer 2 M NaCI Lösung eluiert. Die Zusammensetzung der Eluate wird mit einem Reversed-Phase-HPLC-System quantifiziert (Figur 4 und Fi- gur 5). In der Abb. 4 wurden 100 μl des Proteingemisches (je Protein 50 μg), gelöst in 0,1% TFA, über eine Reversed-Phase-Säule (TSKgel Super-Octyl 4,6 mm ID x 5,0 cm L; Tosohaas Biosep) getrennt. Als HPLC-System wird eine SMART-Anlage benutzt (Fa. Amersham). Die mobile Phase besteht aus 0,1% TFA in destilliertem Wasser (Lösung A) und 0,1% TFA in Acetonitril (Lösung B). Die Chromatographie wird mit einem Fluss von 1 ml/min und einem Gradienten von 23 % bis 44 % Lösung
B in 12,3 min durchgeführt. Die Absorption wird in Abhängigkeit von der Zeit bei 214 nm gemessen. In Abb. 5 sind die Eichgeraden zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Ribonuklease A, Cytochrom C, Lysozym und Myoglobin dargestellt.
Zur Demonstration der Übertragbarkeit der Parameter, gewonnen mit der multiparal- lelen Chromatographie, werden die Gemische mit dem gleichen Kationenaustauschergel, das für die multiparallele Chromatographie eingesetzt wurde, im Gradientchromatographiemodus chromatographiert. Es wurde eine selbst gestopfte Kationenaustauschersäule (HR10/30 mit 2 ml Fractogel EMD SO3" (M), Merck) verwendet. Die mobile Phase bestand aus 40 mM Zitronensäurepuffer, pH 3 ohne NaCI (Puffer A) und 40 mM Zitronensäurepuffer, pH3 mit 2 M NaCI (Puffer B). Die Chro- matographie wurde bei einer Flussrate von 2,0 ml/min. Der Gradient hatte eine Steigung von 0% bis 75% Puffer B in 90 min. Die Zusammensetzung der Fraktionen mit UV-Absorption wurden mit der Reversed-Phase-HPLC analysiert (Figur 4). Die Ergebnisse sind in den Tabellen in der Figur 4 gelistet. In den Figuren 7 bis 9 werden folgende Äquilibrierungs- und Probenaufgabe-Puffer (jeweils Puffer A) eingesetzt.
40 mM Ameisensäure, pH 4 und 500 mM NaCI (Fig. 7), 40 mM Malonsäure, pH 6 und 0 mM NaCI (Fig. 8), 40 mM Phosphatpuffer, pH 7 und 200 mM NaCI. Als Puffer B werden jeweils den Puffern A 2 M NaCI zugesetzt.
2. Ausführunqsbeispiel:
Multi-Well-Kationenaustausch-Chromatographie mit verschiedenen Startbedingun- gen (Variation der pH-Werte (Ziffernreihe, „Zeilen") und der Salzkonzentration (Buchstabenreihen, „Spalten")) und einstufiger Elution.
A. Probengewinnung: Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen:
Für die Herstellung von Proteinextrakten werden Nieren von Schweinen verwendet.
Direkt nach ihrer Entnahme im Schlachthof werden diese in physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCI-Lösung) bis zur weiteren Verarbeitung gekühlt. Das Nierengewebe wird (bei Temperaturen von 4 bis 6°C) in ca. 1 cm3 große Stücke geschnitten, in vorgekühlte Lyophilisationsgefäße gefüllt, in Flüssigstickstoff eingefroren und über Nacht bei -80°C gelagert. In der Lyophilisationsanlage (Typ 2040 der Fa. Snij- ders Tilbug, Holland ) werden die Gewebestücke ca. eine Woche 1 Woche vollständig getrocknet. Die wasserfreien Gewebestücke werden dann mit einer Getreidemühle (Varius, der Fa. Messerschmidt) auf feinster Stufe pulverisiert. 2 g des Pulvers werden in 20 ml Puffer (10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,3) gelöst. Hierfür wird ein Homogenisator (Ultra Turrax T 25 der Fa. Jahnke-Kunkel) verwendet.
B. Vorbereitung des Kationenaustauscher-Gels (Fractogel EMD-SO3; Merck, Darmstadt) und Durchführung der Multi-Well-Kationenaustausch- Chromatographie mit einstufiger Elution: Das Gel (bei einer Befüllung von 300 μl / Kavität: ca. 0,3 ml x 100 = 30 ml) wird mit dem 5-fachen Gelvolumen mit 2 molarer wässriger NaCI-Lösung und anschließend mit dem 10fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Die Leitfähigkeit nach dem letzten Waschvorgang sollte dem des Wassers entsprechen.
Anschließend wird das Gel (300 μl / Kavität) auf 32 Kavitaten einer 96-Deep-Well- Platte (2,2 ml) verteilt und je 1000 μl Puffer (40 mmol/l) bezeichnet mit A bis H in der Tabelle 2, in die Kavitaten der Reihen 1 bis 8 zugegeben, so dass sich jeweils in einer Reihe (bezeichnet mit einem Buchstaben) der 96-Well-Platte ein und derselbe Puffer mit identischem pH-Wert befindet. Anschließend werden in die Kavitaten jeweils 400 μl der Salzlösungen (NaCI, in mmol/l (Endkonzentration): 1 : 0; 2: 100; 3: 200 und 4: 500) pipettiert, so dass beispielsweise alle Kavitaten der Bezeichnung 2 die Salzkonzentration von 100 mmol/l beinhalten. Parallel werden eine oder mehrere Kopien der Puffer gemäß des oben genannten Pipettierschemas angelegt, mit dem später die individuellen Kavitaten gewaschen werden.
Nach dem Equilibrieren werden in jede der 32 Kavitaten jeweils 300 μl der protein- haltigen Probe (Proteinextrakt, siehe oben unter A.) gegeben.
Tabelle 2: Puffer für den Kationenaustauscher
Nach der Zugabe der Probe werden Probe und Gel suspendiert und 10 min inkubiert. Danach wird die 96-Well Platte zentrifugiert (Speed-Vac Zentrifuge: 1 min). Der Überstand wird auf eine 96-Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz. Best., Aktivität, etc.) aufgehoben. Die 32 verschiedenen individuellen Proben-Gel- Suspensionen in der 96-Well-Platte werden mit den entsprechenden, individuellen
Pufferlösungen Qeweils 300 μl, die Puffer werden aus einer 96-Deepwell-Platte kopiert, in der sich entsprechend dem oben angegebenen Schema die individuellen Lösungen befinden) suspendiert, um die 32 Gele zu waschen, anschließend zentrifugiert und die überstehende Lösung abpipettiert und verworfen, um die nicht- bindenden Proteine zu entfernen. Dieser Vorgang wird 2 mal wiederholt. Nach dem
Waschen werden die bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitaten eine 2 molare NaCI-Lösung (pro Kavität 100 μl) zupipetiert wird. Nach der Zentrifugation (1 min) werden die Eluate auf ein oder mehrere 96-Well-Platten kopiert, um die individuellen Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.
Die Analytik der Fraktionen der Multi-Well-Chromatographie-Fraktionen kann die
Bestimmung der Protein-Konzentration, der Enzymaktivität, dem Nachweis einer Proteineigenschaft, z.B. mit einem Antikörper, sowie die Zusammensetzung der Fraktion (Elektrophorese, 2D- Elektrophorese) umfassen.
Die Vorteile dieser Versuchsausführung liegen darin, auf diese Weise im Idealfall (d.h. wenn das gesuchte Protein eine hohe Affinität zum Säulenmaterial hat) Chromatographie-Bedingungen zu finden, unter denen das gesuchte Protein bindet, jedoch ein Großteil der begleitenden Proteine nicht binden und auf diese Weise deren Abtrennung gelingt. Hat das gesuchte Protein lediglich eine schwache Affinität, lassen sich Bedingungen finden, bei denen das gesuchte Protein nicht bindet, jedoch ein großer Teil der nicht interessierenden Proteine. Die Resultate können dann für eine Frontal-Chromatographie benutzt werden. Auf diese Weise lassen sich somit Chromatographie-Parameter (Chromatographiemedien, pH, Puffer, Salzkonzentrationen, Zusätze) zum Konzentrieren von Proteinen auffinden, insbesondere aus Rohextrakten, ferner kann das chromatographische Verhalten eines unbekannten, ge- suchten Proteins ermittelt werden und letztlich können Bindungskapazitäten bestimmt werden.
3. Ausführunqsbeispiel: Multi-lNe//-CΛromafograp/./'e mit verschiedenen Chromatographiegelen (Hydropho- be-lnteraktions-(HIC)-Gele, Hydroxylapathit-Gele, Metallaffinitätschromatographie- Gele) und einstufiger Elution.
A. Probengewinnung: Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen:
Siehe hierzu oben unter 1. Ausführungsbeispiel, Ziffer A.. Der Proteinextrakt wurde anschließend über eine Kationenaustauschersäule im Self-Displacementverfahren chromatographiert. Als Äquilibrierungs- und Probenaufgabe-Puffer wurden die in Fig. 10 ermittlelten Parameter genutzt: Die Pobe wurde in einem 40 mM Puffer mit einem pH von 3 und einem Zusatz von 500 mM NaCI glöst und auf die Self-
Displacement-Säulen aufgetragen. Die resultierenden Fraktionen wurden nach An- giotensin-ll generierenden Aktivitäten durchsucht. Die Fraktion mit der höchsten spezifischen Aktivität wurde als Probe für den nun folgenden Versuch eingestezt.
B. Vorbereitung der HIC-Gele (Fractogel EMD Phenyl (S) Merck; Fractogel EMD Propyl 650 (S), Merck; Octyl Sepharose 4 Fast Flow Amersham
Bioscience; Butyl Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Bioscience), HAP-Gele (Hydroxyl-Apathit-Gel, BioRad) und des Chelat-Gels (Gel für die Immobili- sierte-Metal-Affinitäts-Chromatographie, Amersham Bioscience), Durchführung der Multi-Well-HIC-Chromatographie:
Die Gele (bei einer Befüllung von 500 μl / Kavität: ca. 0,5 ml x 8 = 4 ml) werden mit dem 10-fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Anschließend werden die Gele (50 μl / Kavität) in die Kavitaten 1A bis 4A (HIC-Gele), 5A (HAP-Gel) und 6A-12A (Che- lat-Gel) einer 96-Deep-Well-Platte (2,2 ml) verteilt. Zu den Gelen werden je 1000 μl Puffer (Tabelle 2) in die Kavitaten der Reihen 1A bis 12A zugegeben, so dass sich jeweils in den Kavitaten der 96-Well-Platte beziffert mit 1 bis 12 die Puffer entsprechend der Tabelle 2 befinden. Parallel werden eine oder mehrere Kopien der Puffer gemäß Tabelle 2 angelegt, mit dem später die individuellen Kavitaten gewaschen werden. In jede der 8 Kavitaten werden jeweils 50 μl der proteinhaltigen Probe (Proteinkonzentration 0,3 ug/ul; Proteinextraktgewinnung, siehe oben unter A.) gegeben.
Tabelle 2: Puffer für die Multiparallele-Chromatographie
Nach dem Probenauftrag (15 μg, gelöst im Aquilibrierungspuffer) werden die Gele 2malig mit Aquilibrierungspuffer gewaschen und anschließend die bindenden Proteine mit 3fachen Gelvolumen Elutionspuffer eluiert. Die Eluate werden auf eine 96- Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz. Best., Aktivität, etc.) eingesetzt.
Die Bestimmung der Angiotensin-Konversionsenzym-ähnlichen Enzymaktivität erfolgte wie in Jankowski et al. 2001 beschrieben (Jankowski, J. et al. (2001) Anal Biochem. 290, 324-9). Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt.
Der Vorteil dieser Anwendung liegt u.a. darin, dass für die Planung einer Gradiente- nelution (kontinuierlicher bzw. Stufen-Gradient), einer Frontalchromatographie oder einer Displacement-Chromatographie mit diesem System die Parameter 'erkundet werden können, unter denen das Zielprotein mit hohen absoluten bzw. spezifischen Ausbeuten chromatographisch aufgereinigt werden kann. Für dieses Ausführungsbeispiel kann es ferner vorteilhaft sein, Ergebnisse aus dem Ausführungsbeispiel 1 in den experimentellen Ansatz einfließen zu lassen, z.B. das dort ermittelte optimale
Gel oder eine geeignete Startbedingung zu verwenden.
Die Überprüfung der Übertragbarkeit der Ergebnisse aus dem oben beschriebenen multiparallelen Chromatographie-Experiment auf die Gradienten-Chromatographie wird mit dem folgenden Experiment überprüft. Eine Säule wird mit einem HIC-Gel gefüllt (Fractogel EMD Phenyl (S) Merck. Säulenvolumen: 2.5 mL, Durchmesser: 1 cm, Höhe: 3 cm) und mit dem Puffer A (0.1 M NaHC03 pH 8.3) mit einer Flußrate von 1 ml/min equilibriert. Als Probe wird nach der Equilibrierung einer enzymatisch- aktiven Fraktion aus Schweine-Nieren-Protein-Extrakt, gewonnen über eine Katio- nenaustausch-Displacement-Chromatographie, mit einer Proteinmenge von 3 mg, in 1 ml Puffer A gelöst und auf die Säule injiziert. Puffer B besteht aus Puffer A, dem
2 M NaCI zugesetzt sind. Der Gradient wird von 0 auf 100 % B in 10 Säulenvolumina entwickelt.
4. Ausführungsbeispiel: lm folgenden werden einige Beispiele für unterschiedliche Parameter und deren Variationen gegeben, die bei der Auswahl geeigneter Chromatographiebedingungen von Bedeutung sind (für verschiedene Multi-Well-Chromatographien)
1. Variation der Salz-Anionen zum Eluieren der Biomoleküle vom Anionenaus- tauscher: CIO4 ", SCN, p-tosyl, I", Br", NO3 ", CI", H2PO4 ", CHsCOO" , F
Variation der Zusätze zur Stabilisierung der Biomoleküle wie z.B.: Glycerol, Sucrose, Natriummolybdat, Ethylenglycol, Urea, Guanidiniumchloride, Betain, Taurin, DTE, DTT, Monothioglycerol, Detergentien, Polyethylenglykol (PEG), Chloroform, Methanol, H2O, Proteaseinhibitoren (EDTA, EGTA, PMSF, DFP, Benzamidine, Aprotinin, Pefabloc SC, TLCK, TPCK, Phosphoramidon, Antipain, Leupeptin, Pepstatin A, Hirudin).
3. lonenaustausch-Chromatographie-Medien (Beispiele):
Tabelle 3
4. Hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC):
• Variation der Hydrophobizität des Gels (z.B. Butyl-Sepharose < Octyl- Sepharose < Phenyl-Sepharose)
• Variation der Gelmatrix
• Variation von pH Werten
• Variation von Salzen gemäß der Hofmeister-Reihe
• Zusätze von organischen Lösungsmitteln zum Startpuffer bzw. zur Eluti- onslösung
5. Metallaffinitätschromatographie (IMAC):
Variation der Metallionen: Ca2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, La3+, Mn2+, Ni2+, Zn2+
Variation der komplexierenden Gruppe (Chelat) des Gels (z.B.): Imino- diessigsäure (IDA), Tris(carboxymethyl)ethylendiamin (TED), Nitrilotries- sigsäure (NTA).
Variation des Startpuffers (z.B.): 0,5 bis 2 M NaCI.
Variation der Gelmatrix. • Variation der Elution: a) pH Gradient (Variation der pH-Werte in Richtung sinkender pH-Werte), b) Elution mit einem kompetitiven Liganden (z.B. Ammonium Chloride, Sulfat, Imidazol, oder Histamin). c) Elution mit Che- laten (EDTA, EGTA).
6. Hydroxylapatit : Variation des Startpuffers (Phosphatpuffer)
7. Reversed-Phase (RP):
• Variation des Startpuffers:
a) Variation der Konzentration organischer Lösungsmittel (A- cetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol),
b) Variation von lonenpaarreagenzien (z.B. Trifluoressigsäure
(TFA), Triethylammoniumacetat (TEAA), etc.)
• Variation der Elutionsparameter
a) Art der organischen Lösungsmittel (Acetonitril, Methanol, Ethanol, Isopropanol)
b) Konzentrationen der organischen Lösungsmittel
c) Zusammensetzung der organischen Lösungsmittel
• Variation der Geleigenschaften
a) Hydrophobizität des Gels (z.B. C4, C8, C18)
b) Matrix des Gels (Silica oder Polymer)
c) poröse Gele, nicht poröse Gele
8. Affinitätschromatographie: • Variation der Gele (Gele mit Farbstoffliganden, Gele mit immobilisierten Biomolekülen (Coenzymen etc.)
• Variation der Startpufferbedingungen (pH, lonenstärke)
• Variation der Elutionsbedingungen (Elution mit kompetitiven Liganden, Elution durch Variation der lonenstärke oder des pHs)
5. Ausführunqsbeispiel:
Uu\t\-Well-Kationenaustauch-Chromatographie mit Stufengradienten-Elution
A. Probengewinnung: Herstellung von Proteinextrakten aus der Niere von Schweinen:
Siehe hierzu oben unter 1. Ausführungsbeispiel, Ziffer A.. Die Homogenisation des gefriergetrockneten Nierenextrakts wurde hier im jeweiligen Startpuffer durchgeführt: Als Startpuffer (je 20 mmo/l) wurden verwendet: (1 ) Citrat-Puffer, pH 3; (2) Citrat-Puffer pH 3,5; (3) Formiat-Puffer pH 4; (4) Succinat-Puffer pH 4,5; (5) Essigsäure pH 5; (6) Malonat-Puffer pH 5,5; (7) Malonat-Puffer pH 6; (8) Phosphat-Puffer pH 7; (9) HEPES-Puffer pH 7,5; (10) HEPES-Puffer pH 8. Für jeden Ansatz wurden ca. 200 mg Nierengewebe-Pulver in 3 ml Puffer gelöst.
B. Vorbereitung des Kationenaustauscher-Gels (Fractogel EMD-SO3; Merck, Darmstadt) und Durchführung der Multi-Well-Kationenaustausch- Chromatographie mit Stufengradienten-Elution:
Das Gel (bei einer Befüllung von 500 μl / Kavität : ca. 0,5 ml x 100 = 50 ml) wird mit dem 5-fachen Gelvolumen mit 2 molarer wässriger NaCI-Lösung und anschließend mit dem 10-fachen Gelvolumen Wasser gewaschen. Die Leitfähigkeit nach dem letzten Waschvorgang sollte dem des Wassers entsprechen. Anschließend wird das Gel (500 μl / Kavität) auf die 10 Kavitaten einer 96-Deep-Well-Platte (2,2 ml) verteilt und je 1000 μl Puffer (20 mmol/l) der unter A. angegebenen Puffer ((1) Citrat-Puffer, pH 3; (2) Citrat-Puffer pH 3,5; (3) Formiat-Puffer pH 4; (4) Succinat-Puffer pH 4,5; (5) Essigsäure pH 5; (6) Malonat-Puffer pH 5,5; (7) Malonat-Puffer pH 6; (8) Phos- phat-Puffer pH 7; (9) HEPES-Puffer pH 7,5; (10) HEPES-Puffer pH 8.) in die Kavitaten der Reihen 1 bis 10 zugegeben. Parallel werden die Puffer gemäß des oben genannten Pipettierschemas in Deepwell-Platten gefüllt, mit dem später die Gele gewaschen werden.
In jede der 96 Kavitaten werden jeweils 10 mg der proteinhaltigen Proben, gelöst im jeweiligen Startpuffer (1 bis 10; Proteinextrakt, siehe oben unter A.) gegeben. Nach der Zugabe der Probe werden Probe und Gel suspendiert und 10 min inkubiert. Danach wird die 96-Well Platte zentrifugiert (Speed-Vac Zentrifuge: 1 min). Der Überstand wird auf eine 96-Well Platte kopiert und für Analysen (Proteinkonz. Best., Ak- tivität, etc.) aufgehoben. Die 10 verschiedenen individuellen Proben-Gel-
Suspensionen in der 96-Well-Platte werden mit den entsprechenden, individuellen Pufferlösungen (jeweils 500 μl, die Puffer werden aus einer 96-Deepwell-Platte kopiert, in der sich entsprechend dem oben angegebenen Schema die individuellen Lösungen befinden) suspendiert, um die Gele in den 10 Kavitaten zu waschen, an- schließend zentrifugiert und die überstehende Lösung abpipettiert und verworfen, um die nicht-bindenden Proteine zu entfernen. Dieser Vorgang wird 5 mal wiederholt.
Nach dem Waschen werden die bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitaten 600 μl einer jeweils 0,5 molaren NaCI-Lösung zupipetiert wird. Nach der Zentrifuga- tion (1 min) werden die Eluate auf eine 96-Well-Platten kopiert, um die individuellen
Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.
Nach der Elution mit der 1. Gradientenstufe werden die noch bindenden Proteine eluiert, indem in die Kavitaten 600 μl einer jeweils 2 molaren NaCI-Lösung zupipetiert wird. Nach der Zentrifugation (1 min) werden die Eluate auf eine 96-Well- Platten kopiert, um die individuellen Proben der nachfolgenden Analytik zugänglich zu machen.
Für den Enzymassay werden aus den Eluaten 470 μl abgenommen und mit 100 μl eines 100 mM NaHCO3 "Kopplungspuffers gemäß der Vorschrift zur Immobilisierung von Proteinen an BrCN-aktivierte Sepharose (Amersham-Bioscience) gemischt, so dass ein pH-Wert von 8,3 erreicht wird. Dieses Gemisch zu 200 μl BrCN-aktivierten
Sepharose Beads geben, und diese bei 4°C über Nacht inkubiert. Anschließend folgten Deaktivierungsschritte mit Glycin sowie Wasch-Schritte, gemäß der Vorschrift zur Immobilisierung von Proteinen an BrCN-aktivierte Sepharose (Amersham-Bioscience). Der Nachweis der Enzymaktivität eines Urotensin generierenden Enzyms (UCE) erfolgte nach Jankowski et al. 2001. Für die Bestimmung der Prote- in-Konzentration (nach Bradford; Kit von Pierce) der Eluate werden jeweils 10 μl abgenommen.
6. Ausführunqsbeispiel:
Entsalzung bzw. Umpufferung von Fraktionen der MULTI-Well-Chromatographie
Verschiedene Analyse-Techniken erfordern Protein-Fraktionen, die in definierten Puffern vorliegen. Um eine schnelle Entsalzung bzw. Umpufferung von maximal 96
Proben zu ermöglichen wurde ein Protokoll für diese Zwecke entwickelt. Ein 96- Deepwell-Platte mit einem Filter (20 μm, Macherey & Nagel) wird mit einem Größe- nausschlußgel (je 1000 μl/Kavität, Biogel P6, BioRad) gefüllt. Das Größe- nausschlußgel sollte mit einem Puffer equilibriert sein, der elektrostatische Wech- selwirkungen zwischen Proteinen und dem Gel unterbindet. In einer Versuchsreihe wurde festgestellt, dass eine Umsalzung einer Proteinlösung von 2 mol/l NaCI auf 0,29 mol/l NaCI gelingt, wenn auf die mit 1000 μl Gel gefüllten Kavitaten 350 μl Probe aufgetragen werden. Die Entsalzung geschieht durch Zentrifugation der Probe durch das Größenausschlußgel. Bei diesem Versuchsansatz wurde eine Protein- ausbeute von 79 % erzielt. Die Salzkonzentration im Eluat kann auf 0,2 mol/l reduziert werden, wenn das Probenvolumen der umzupuffernden Probe auf 300 μl reduziert wird. Die Proteinausbeute sinkt in diesem Fall jedoch auf 67 %.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Auffinden geeigneter Chromatographieparameter zur Trennung biologischer Moleküle, bestehend aus folgenden Verfahrensschritten
a) auf einer Multi-Well-Platte, die durch Spalten (X-Richtung) und Zeilen (Y-Richtung) als Matrix definiert ist, werden unterschiedliche Chroma- tographiemedien ortsabhängig auf den durch die Matrix definierten
Matrizenpunkten der Platte in den jeweiligen dortigen Kavitaten angeordnet, wobei die Chromatographiemedien einerseits aus die- biologische-Probe-bindenden Materialien (B) und andererseits aus die-biologische-Probe-nicht-bindenden Materialien (NB) besteht,
b) in den jeweiligen Kavitaten werden die unterschiedlichen Chromatographiemedien mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht,
c) wobei die Chromatographiemedien derart in den einzelnen Kavitaten der Multi-Well-Platte angeordnet sind, dass in jeder einzelnen Kavität zum einen ein Chromatographiemedium der Gruppe B und der Grup- pe NB vorhanden ist, zum anderen aber sich diese Chromatographiemedium der Gruppe B und der Gruppe NB wenigstens in einem einzigen Parameter unterscheiden,
d) die in den jeweiligen Kavitaten befindliche biologische Probe wird in an-bindende-Materialien-gebundene und nicht-gebundene Biomole- küle separiert,
e) die gebundenen und nicht-gebundenen Moleküle der biologischen Probe werden für jede einzelne Kavität in Abhängigkeit des in der jeweiligen Kavität befindlichen Chromatographiemediums analysiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich bei der biologischen Probe um gereinigte oder ungereinigte Proteine, Peptide, Nukleinsäuren aller Art, Kohlenhydrate, Lipide und andere Biomolekülstoffklassen oder niedermolekulare Stoffwechselprodukte oder Gemische derselben handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Chromatographiemedien der die biologische Probe bindenden Materialien (Gruppe B) ausgewählt sind aus Fest- stoffpartikel, die die Eigenschaft besitzen, Biomoleküle zu absorbieren, wie z.B. Affinitäts-Chromatographie-Medien, Anionenaustauscher, Hydrophobe- Interaktions-Chromatographie-Medien, Hydroxylapathit-Chromatographie- Medien, Kationenaustauscher, Metallaffinitäts-Chromatographie-Medien,
Reversed-Phase Materialien.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Chromatographiemedien der die biologische Probe nicht-bindenden Verbindungen (Gruppe NB) ausgewählt sind aus organischen und/oder anorganischen Säuren, Basen, Salzen, deren De- rivaten oder Lösungsmitteln aller Art sowie deren wäßrigen Lösungen.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei Mittel zur Stabilisierung der biologischen Probe ausgewählt werden aus zum Beispiel: Glycerol, Sucrose, Natriummo- lybdat, Ethylenglycole, Harnstoff, Guanidiniumchlorid, Betain, Taurin, DTE, DTT, EDTA, EGTA, Monothioglycerol, Detergentien, Polyethylenglykol (FΕG), Chloroform, Methanol, H2O, Proteaseinhibitoren
6. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Zeitdauer des Inkontaktbringens der biologischen Probe mit den Chromatographiemedien frei wählbar ist.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Verfahren automatisiert ist.
8. Kit zum Auffinden geeigneter Chromatographiebedingungen bei der Trennung biologischer Moleküle nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 7, bestehend aus zumindest a) einer Multi-Well-Platte, die durch Spalten (X-Richtung) und Zeilen (Y- Richtung) als Matrix definiert ist, wobei unterschiedliche Chromatographiemedien ortsabhängig auf den durch die Matrix definierten Matrizenpunkten der Platte angeordnet sind,
b) unterschiedlichen Chromatographiemedien zur Bestückung der Matrizenpunkte.
9. Kit nach Anspruch 8, wobei dieser eine Software zur Auswertung, Identifizierung und Interpretation der durch das Verfahren gem. Anspruch 1 bis 6 enthält.
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