EP1537148A1 - Antikörper zur isolierung und/oder idenfifizierung neuronaler stammzellen und verfahren zur isolierung und/oder identifizierung neuronaler vorläuferzellen - Google Patents

Antikörper zur isolierung und/oder idenfifizierung neuronaler stammzellen und verfahren zur isolierung und/oder identifizierung neuronaler vorläuferzellen

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Publication number
EP1537148A1
EP1537148A1 EP03794994A EP03794994A EP1537148A1 EP 1537148 A1 EP1537148 A1 EP 1537148A1 EP 03794994 A EP03794994 A EP 03794994A EP 03794994 A EP03794994 A EP 03794994A EP 1537148 A1 EP1537148 A1 EP 1537148A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
antibody
dsm
fragment
antibodies
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03794994A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hans-Jörg BÜHRING
Wichard Vogel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Original Assignee
Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard Karls Universitaet Tuebingen, Universitaetsklinikum Tuebingen filed Critical Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Publication of EP1537148A1 publication Critical patent/EP1537148A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to monoclonal antibodies for the isolation and / or identification of neuronal progenitor cells.
  • the central nervous system In contrast to many other tissues, the central nervous system has only a limited regeneration potential. Mature nerve cells that have died do not regenerate. Although neuronal stem cells even in the adult central nervous System (CNS) are present, they have only a limited capacity to generate new, functionally active nerve cells after injuries.
  • CNS central nervous System
  • immature precursor cells are used in cell replacement strategies in the nervous system, which have to be built into the existing structures and only differentiate there.
  • Multipotent stem cells with the capacity to differentiate into neuronal cells have been found in the human central nervous system.
  • Such neuronal progenitor cells express nestin as a typical surface marker and can, for example, differentiate into neurons, oligodendrocytes and astrocytes.
  • Rao MS. Multipotent and restricted precursors in the central nervous system
  • Anat. Rec. 257: 137-148 (1999) was able to Isolate potent progenitor cells from adult human brain regions, including the temples, forehead, tonsils and hippocampus.
  • Barami et al. "An efficient method for the culturing and generation of neurons and astrocytes from second trimester human central nervous system tissue", Neurol. Res.
  • neural progenitor cells from the central nervous system of human fetal tissue were CD133 positive and also with the epidermal growth factor (EGF), the fibroblast growth factor and the leukemia-inhibiting factor could be differentiated in vitro in neurons and astrocytes.
  • EGF epidermal growth factor
  • the CD133 cell surface marker was originally found on hematopoietic stem and progenitor cells, but recent studies have shown that this marker is also expressed in various neuronal and skeletal muscle tissues. For these reasons, this marker alone is not suitable for differentiating between different stem or progenitor cells.
  • neuronal progenitor cells and mesenchymal stem cells represent homogeneous populations in terms of morphology and phenotype. This is particularly due to the limited number of antigens examined and identified to date.
  • Mesenchymal stem cells can be obtained from the bone marrow of adult humans and isolated. They are multipotent and contribute to the regeneration of bones, cartilage, tendons, muscles, fat tissue and stroma. Kopen et al. , "Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differenciate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains", Proc. Nat. Acad. Be.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • BME ß-mercaptoethanol
  • stromal bone marrow cells by means of the epidermal growth factor and the "brain-derived neurotrophic factor” (BDNF) in nerve cells, the nestin, the glial fibrillary acidic protein (“glial fibrillary acedic protein", GFAP) and the neuron expressed specific nuclear protein (Neu-N).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • Neu-N neuron expressed specific nuclear protein
  • mesenchymal stem cells can also differentiate into nerve cells under certain conditions entails the need to be able to distinguish neuronal progenitor cells from mesenehymal stem cells.
  • neuronal progenitor cells Despite the great interest, research on these neuronal progenitor cells is severely impaired by the lack of clearly defined markers for these cells: it is precisely the ability to identify relevant cell types that makes it possible to analyze how the various cell populations of the central nervous system are generated.
  • Antibodies against the protein nestin which is typically expressed by neuronal progenitor cells, are used in particular as markers for neuronal progenitor lines.
  • this protein is also derived from other cells, such as astrocytes (see Clarke et al., "Reactive astrocytes express the embryonic intermediate neurofilament nestin", Neuroreport 5: 1885-1888 (1994)) and muscle cells (see Sejersen and Lendahl , “Transient expression of the intermediate neurofilament nestin during skeletal muscle development", J. Gell Sei. 106: 1291-1300 (1993)).
  • this object is achieved by an antibody or a fragment thereof which binds to the same antigen as an antibody which is produced by a hybridoma cell line which is selected from the group of the following, am 14.08.2002 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) according to the Budapest under the numbers DSM ACC2571, DSM ACC2570 and DSM ACC2568 deposited hybridoma cell lines W4A5, W8C3 and 57D2.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • the inventors were able to show in their own experiments that it is possible with the novel antibodies according to the invention to selectively isolate and characterize neuronal precursor cells.
  • the inventors have also succeeded in using the new antibodies to distinguish neuronal progenitor cells from mesenchymal stem cells, for example.
  • the invention relates in particular to an antibody or a fragment thereof which is produced by the hybridoma cell line W4A5, which was deposited on August 14, 2002 with the DSMZ under the Budapest Treaty under the number DSM ACC2571.
  • the invention further relates to an antibody or a fragment thereof which is produced by the hybridoma cell line W8C3, which was deposited on August 14, 2002 with the DSMZ under the Budapest Treaty under the number DSM ACC2570.
  • the invention further relates to an antibody or a fragment thereof which is produced by the hybridoma cell line 57D2, which was deposited on August 14, 2002 with the DSMZ under the Budapest Treaty under the number DSM ACC2568.
  • the inventors were able to generate the antibodies W8C3 and W4A5 using the WERI-RB-1 cell line.
  • This cell line is a cell line isolated from a retinoblastoma, which is listed, for example, by the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures under the number DSMZ ACC 90. It was not to be expected - and in the field also was no evidence to - that- using this cell line Antikör- 'by can be generated to identify neural progenitor cells.
  • Antibody 57D2 was generated using the TF-1 cell line.
  • This cell line is an erythroleukemia cell line which e.g. at the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures under the number DSMZ ACC 334. There is no indication in the literature that antibodies can be generated using this cell line which are specific for neuronal progenitor cells and are therefore suitable for their identification and / or isolation.
  • the antibodies W8C3, W4A5 and 57D2 bind to antigens which are so characteristic of neuronal progenitor cells that they offer an excellent possibility to selectively identify neuronal progenitor cells from a sample containing different cell populations.
  • the cell lines used for immunization are already differentiated, which is why it was not to be expected that a multipotent neuronal progenitor cell due to its different Surface markers would be recognized by the antibodies according to the invention.
  • the inventors were able to show in their own experiments that the abovementioned antibodies are specific for neuronal precursor cells.
  • the inventors were also able to show in their own experiments that neuronal progenitor cells which had a known immunophenotype (each positive for CD15, CD56, CD90, CD133, CD164, CDI72a, NGFR (receptor for the neuronal growth factor)) with the new Antibodies could be fractionated in subpopulations.
  • a fragment of the antibody can also be used instead of the respectively addressed antibody, without this being specifically mentioned.
  • “Fragment” is understood to mean any fragment of an antibody that retains the antigen binding function of the antibody. Such fragments are, for example, F ab , F (ab , ) 2 , F v and other fragments such as CDR fragments.
  • the fragments mentioned have the binding specificity of the antibody and can also be produced, for example, using known methods.
  • the antibodies according to the invention now also make it possible to produce further antibodies which bind to the same antigen.
  • the antibody according to the invention makes it possible to isolate the corresponding antigen structure using generally known methods and to develop further monoclonal antibodies against the same antigen structure, the known methods also being used here.
  • the invention further relates to hybridoma cell lines capable of producing and releasing such antibodies, and more particularly to the W8C3, W4A5 and 57D2 hybridoma cell lines.
  • the inventors have for the first time produced monoclonal antibodies as well as hybridoma cell lines that produce and release them, which enable targeted recognition of neuronal stem cells.
  • the antibodies thus represent a hitherto unique means for the doctor and researcher, on the one hand to detect such cells and, on the other hand, to manipulate these cells, if necessary, either by the antibody itself or by reagents coupled to it.
  • the invention further relates to a method for isolating and / or identifying neuronal stem cells, in which an antibody or a fragment thereof is used which binds to the same antigen as an antibody which is produced by a hybridoma cell line which is selected from the group the following hybridoma cell lines 57D2, W8C3 and W4A5 deposited at the DSMZ on August 14th, 2002 with the Budapest Treaty under the numbers DSM ACC2571, DSM ACC2570 and DSM ACC2568.
  • Antibodies or fragments thereof which are produced by a hybridoma cell line which is selected from the group of the following hybridoma cell lines 57D2 deposited with the DSMZ on 14.08.2002 under the Budapest Treaty under the numbers DSM ACC2571, DSM ACC2570 and DSM ACC2568, are used in particular. W8C3 and W4A5.
  • the inventors have recognized that the method according to the invention makes it possible, in particular, to identify neuronal progenitor cells and, for example, to differentiate them from mesenchymal stem cells.
  • the invention relates in particular to a method for identifying neuronal progenitor cells with an antibody, which comprises the following steps:
  • the invention further relates to a method for isolating neuronal progenitor cells with an antibody, comprising the following steps:
  • the sample can be selected from any source that contains neuronal stem cells, for example a sample from the bone marrow or peripheral blood. These cells are obtained by laboratory methods known in the art and are commercially available in many cases.
  • FACS fluorescent-activated cell sorter
  • cells are loaded with antibodies that are, on the one hand, specific for a surface marker and, on the other hand, are coupled with a fluorescent dye. Those cells that are marker positive fluoresce while the negative cells remain dark. It can thus be determined which portion of a cell population is marker positive.
  • a flow cytometer allows the size and granularity of cells to be recorded.
  • a method for magnetic cell separation can also be used.
  • the cells are labeled with magnetic beads, which beads can be coupled to the antibodies, for example.
  • the connection can also be carried out by immobilizing the monoclonal antibody on a support, as is the case, for example, in column chromatography.
  • the cell suspension can be any solution with bone marrow cells, blood or tissue cells.
  • those cells After mixing the cell suspension with the antibody, those cells bind the antibody which express the antigen in question, whereupon these cells can be identified and / or isolated from the cells which have not bound an antibody by the method described.
  • neuronal progenitor cells identified / isolated in this way can then be used, for example, for a transplant to achieve the regeneration of neurological damage.
  • the invention further relates to the use of a new antibody or a fragment thereof for the identification of neuronal precursor cells.
  • the invention further relates to the use of the TF-1 cell line for the production of antibodies or fragments thereof for the isolation and / or identification of neuronal precursor cells.
  • the invention further relates to the use of the WERI-RB-1 cell line for the production of antibodies or fragments thereof Isolation and / or identification of neuronal progenitor cells.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing one or more of the above-mentioned antibodies according to the invention.
  • such a pharmaceutical composition can contain other suitable substances, such as, for example, diluents, solvents, stabilizers, etc. These include, for example, physiological saline solutions, water, alcohols and other suitable substances, which are described, for example, in A. Kibble, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
  • the invention further relates to a kit which contains at least one of the new antibodies.
  • Neural precursor cells were purchased from CellSystems, St. Katharinen, Germany.
  • W8B2, W8C3, W4A5 and W7C5 were used for the fluorometric analyzes: W8B2, W8C3, W4A5 and W7C5 (CD109), all of which were obtained from the retinoblastoma cell line WERI-RB-1. This cell line is available from the DSMZ under the number ACC90.
  • the monoclonal antibody 57D2 which was obtained by immunizing mice with the TF-1 erythroleukaemic cell line (DSMZ: ACC334), was also used.
  • CD10-PE, CD13-PE, CD34-PE, CD45-PE, CD56-PE, CD61-PE, CD117-PE were used as antibodies with known specificities.
  • PE Physicalerythrin conjugated monoclonal antibodies specific for CD90, CD140B and CD164 were purchased from PharMingen (San Diego, USA).
  • the antibody against the nerve growth factor receptor (NGFR) was purchased from Sigma (Munich, Germany).
  • CD133-PE (clone W6B3C1), CD167a (Kon 48B3), CD172a-PE (clone SE5A5), the CD15-specific antibody W6D3 and the CDl05-specific monoclo- Antibodies 43A3 were produced in the inventors' laboratory. Non-conjugated antibodies were stained with isotype-specific PE-conjugated goat anti-mouse antisera (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, USA).
  • the commercially available neuronal progenitor cells were incubated in 96-well microtiter plates with 10 ⁇ l phyco-erythrin-conjugated antibodies or 25 ⁇ l culture supernatant at 4 ° C. for 20 minutes.
  • Non-conjugated monoclonal antibodies were washed in a FACS buffer (PBS; 0.5% BSA; 0.1% NaN 3 ) with goat anti-mouse IgGl-PE (1: 100) or goat anti-mouse IgG3-PE (1:20) Antisera stained.
  • the cells were analyzed with a flow cytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson) using the Cell Quest software (Bacton Dickinson).
  • the neuronal precursor cells were fixed on 8-well chamber slides with acetone for 2 minutes and labeled with the primary antibody for 60 minutes. Staining was then stained with Alexa 488-conjugated goat anti-mouse IgG or goat anti-rabbit IgG antisera.
  • cells were labeled with either an isotype-matched control antibody or with a pre-immune rabbit serum. The fluorescence of the cells was evaluated using a fluorescence microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany). Results
  • NPC fetal neuronal progenitor cells
  • NPC populations of different sizes could be detected in the double scatter plot. Large NPCs exhibited stronger CD133, CDl72a and W8C3 antigen expression than the smaller NPCs, whereas CD13 v.a. was identified on a small NPC subpopulation. All NPC subpopulations expressed CD56, CD90, CD164, NGFR and the antigens to which the antibodies 57D2, W4A5, W6D3 (CD15) produced by the inventors bind. These cells were negative for CD45, CD105 (Endoglin) and CD140b (PDGF-RB), as well as for the antigens W7C5 (CD109) and W8B2.
  • Histograms D and E of FIG. 1 clearly show that the NPCs are positive for CD90 and CD56, histograms I, J, K and L of FIG. 1 show the positive result for W8C3, 57D2, W4A5 and W6D3 (CD15) shown.
  • mesenchymal stem cells were used the inventors were isolated from bone marrow cells in the pelvic area of voluntary donors and, on the other hand, commercially available mesenchymal stem cells (CellSystems, St. Katharinen, Germany). In most cases, the expression patterns of the commercial mesenchymal stem cells and those of the specially isolated mesenchymal stem cells (hereinafter: MSC) were identical or similar. The MSC was clearly negative for W4A5, W6D3 and CDi.33 and only - a small subpopulation of the MSC showed a weakly positive reaction for 57D2.
  • NPCs expressed the antigens of the new antibodies W4A5, 57D2 and W8C3 and consisted mainly of a CD133 + population (25 - 40% compared to ⁇ 1% BMMNC). If the NPC were cultivated in serum-free media in the presence of neuronal progenitor cell medium (CellSystems), the growth of neurospheres could be observed. When 10% fetal calf serum (FCS) was present and in the absence of growth factors, the spheres adhered to the plastic surface of the culture dishes. NPCs cultivated in growth medium for astrocytes differentiated in astrocytes with long pseudopodia. NPCs that were kept on chamber slides in the presence of astrocyte medium expressed nestin, MAP2, neurofilaments, GFAP, W4A5 and ⁇ 2 chain laminin.
  • CellSystems neuronal progenitor cell medium
  • FCS fetal calf serum
  • Central nervous system stem cells such as neuronal progenitor cells, are an important source for therapeutic applications in order to develop strategies for therapies to restore injured or diseased brain tissue.
  • NPCs can be isolated from both adult and fetal brains. A large subpopulation of these cells is CD133 positive and negative for CD34, CD45 and CD24. In culture, these cells differentiate into neurospheres.
  • NPCs were found to be positive for CD56, CD90, CD133, W4A5, W6D3 (CD15), W8C3 and 57D2, and negative for CD45, CD10, W7C5 (CD109) and W8B2. Similar to the NPC expressed bone marrow subpopulations CD133, CD56, CD90 and CD15, whereby it is rather unlikely that these markers are also suitable as markers for NPC. The most promising markers are W4A5 and 57D2, which do not react with bone marrow populations as a whole. The antigens produced by the antibodies W4A5, 57D2 and W8C3 are excellent surface markers with pronounced specificity for NPC. Since these are expressed in particular on mainly Nestin-positive NPC, they are apparently selectively expressed on immature NPC.

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Abstract

Die Erfindung betrifft monoklonale Antikörper oder Fragmente davon zur Isolierung und/oder Identifizierung neuronalen Vorläuferzellen. Die Antikörper oder Fragmente davon binden dabei an ein gleiches Antigen wie ein Antikörper, der von den am 14.08.2002 bei der unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien W4A5, W8C3 und` 57D2 produziert wird.

Description

Antikörper zur Isolierung und/oder Identifizierung neuronaler Stammzellen und Verfahren zur Isolierung und/oder
Identifizierung neuronaler Vorläuferzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
Im Gegensatz zu vielen anderen Geweben hat das zentrale Nervensystem nur ein limitiertes Regenerationspotential. Reife Nervenzellen, die zugrunde gegangen sind, regenerieren nicht. Obwohl neuronale Stammzellen sogar im adulten zentralen Nerven- System (ZNS) vorhanden sind, haben diese nur eine limitierte Kapazität nach Verletzungen neue, funktioneil aktive Nervenzellen zu generieren.
Aus diesem Grund besteht großes Interesse an der Möglichkeit, das Nervensystem zu reparieren, indem neue Zellen transplan- tiert werden, welche die durch Verletzung oder Krankheit verloren' gegangenen Zellen ersetzen können.
Insbesondere bei Erkrankungen oder Verletzungen, die mit neurologischen Defiziten verbunden sind, sind momentan keine geeigneten Heilungsmöglichkeiten vorhanden. Derartige Krankheiten sind bspw. Morbus Parkinson, Chorea Huntington, Alzheimer Krankheit, Epilepsie, Schlaganfälle oder Rückenmarksverletzungen. Aus heutiger Sicht erscheint eine Transplantation die vielversprechendste Therapieform zu sein.
Aufgrund der hoch komplizierten Architektur des Gehirns und der komplexen Verbindungen der einzelnen Hirnregionen werden bei Zellersatzstrategien im Nervensystem unreife Vorläuferzellen verwendet, welche sich in die bestehenden Strukturen einbauen müssen und sich erst dort ausdifferenzieren.
Multipotente Stammzellen mit der Kapazität, in neuronale Zellen zu differenzieren wurden u.a. im menschlichen zentralen Nervensystem gefunden. Solche neuronalen Vorläuferzellen exprimieren als typischen Oberflächenmarker Nestin und können bspw. in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten differenzieren.
Rao MS., "Multipotent and restricted precursors in the central nervous System", Anat. Rec . 257: 137-148 (1999), konnte multi- potente Vorläuferzellen aus adulten menschlichen Gehirnregionen isolieren, einschließlich u.a des Schläfen- und Stirnbereichs, der Mandeln und des Hippocampus. Ferner zeigten Barami et al., "An efficient method for the culturing and generation of neu- rons and astrocytes from second trimester human central nervous System tissue", Neurol . Res . 23: 321-326 (2001), daß neuronale Vorläuferzellen (engl. : neural progenitor cells (NPC)) aus dem zentralen Nervensystem von menschlichem fetalem Gewebe CD133- positiv waren und darüber hinaus mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor und dem Leukä- mie-inhibierenden Faktor in vitro in Neuronen und Astrozyten differenziert werden konnten.
Der Zelloberflächenmarker CD133 wurde ursprünglich auf hämato- poetischen Stamm- und Vorläuferzellen gefunden, neuere Studien zeigten aber, daß dieser Marker auch in verschiedenen neuronalen Geweben und Skelettmuskelgeweben exprimiert wird. Aus diesen Gründen ist dieser Marker alleine für Unterscheidungszwecke verschiedener Stamm- oder Vorläuferzellen nicht geeignet.
Ein großes Problem bei der Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen besteht darin, daß neuronale Vorläuferzellen und mesenchymale Stammzellen bezüglich Morphologie und Phänotyp homogene Populationen darstellen. Dies ist insbesondere der begrenzten Anzahl der bisher untersuchten und identifizierten An- tigene zuzuschreiben.
Mesenchymale Stammzellen können aus dem Knochenmark adulter Menschen gewonnen und isoliert werden. Sie sind multipotent und tragen zur Regeneration von Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Fettgewebe sowie Stroma bei. Kopen et al . , "Marrow stromal cells migrate throughout fore- brain and cerebellum, and they differenciate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains", Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 96: 10711-10716 (1999) und Brazelton et al., "From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mi- ce", Science 290: 1775-1779 (2000), konnten sogar zeigen, daß mesenchymale Stammzellen, die aus Knochenmark isoliert wurden, sich auch in nicht-mesenchymale Zellen wie Leberzellen, neuro-' nale und gliale Zellen differenzieren konnten. Darüber hinaus konnte erst kürzlich gezeigt werden, daß mesenchymale Stammzellen aus adultem menschlichem Knochenmark in neurale Zellen in vitro differenzieren konnten. Woodbury et al., "Adult rat and human bone marrow stromal cells differenciate into neurons", J. Neurosci. Res. 61: 364-370 (2000), zeigten, daß in Anwesenheit von Dimethylsulfoxid (DMSO) und ß-Mercaptoethanol (BME) mesenchymale Stammzellen in Zellen differenziert werden konnten, die Neurofilament und Neuronen-spezifische Enolase exprimierten.
Andere Forschergruppen beschrieben die Differenzierung von Stroma-Knochenmarkszellen mittels des epidermalen Wachstumsfaktors und dem "brain-derived neurotrophic factor" (BDNF) in Nervenzellen, die Nestin, das gliale fibrilläre saure Protein ("glial fibrillary acedic proteine", GFAP) und das Neuronen- spezifische nucleäre Protein (Neu-N) exprimierten.
Die Tatsache, daß mesenchymale Stammzellen unter bestimmten Bedingungen auch in Nervenzellen differenzieren können, bringt das Bedürfnis mit sich, neuronale Vorläuferzellen von mesenehy- malen Stammzellen unterscheiden zu können. Trotz des großen Interesses ist die Forschung an diesen neuronalen Vorläuferzellen durch das Fehlen von eindeutig definierten Markern für diese Zellen stark beeinträchtigt: Gerade die Fähigkeit, relevante Zellarten zu identifizieren, ermöglicht erst die Analyse, auf welche Weise die verschiedenen Zellpopulationendes zentralen Nervensystems generiert werden.
Als Marker für neuronale Vorläuferzeilen werden insbesondere- Antikörper gegen das Protein Nestin eingesetzt, das typischerweise von neuronalen Vorläuferzellen exprimiert wird. Dieses Protein wird aber auch von anderen Zellen, wie bspw. Astrocyten (siehe Clarke et al., "Reactive astrocytes express the embryo- nic intermediate neurofilament nestin", Neuroreport 5: 1885 - 1888 (1994)) und Muskelzellen (siehe Sejersen und Lendahl, "Transient expression of the intermediate neurofilament nestin during skeletal muscle development" , J. Gell Sei. 106: 1291- 1300 (1993)) exprimiert.
Aus diesen Gründen ist die Immunreaktivität mit Nestin nicht als einziges Kriterium geeignet, eine bestimmte Zelle als neuronale Vorläuferzelle zu identifizieren.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, monoklonale Antikörper bereitzustellen, mit denen es möglich ist, bspw. aus einer Probe einer Zellsuspension neuronale Vorläuferzellen zu identifizieren und ggf. zu trennen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch einen Antikörper oder ein Fragment davon gelöst, der an ein gleiches Antigen bindet wie ein Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden, am 14.08.2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach dem Budapester unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzel- linien W4A5 , W8C3 und 57D2.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, daß es mit den neuen erfindungsgemäßen Antikörpern möglich ist, selektiv neuronale Vorläuferzellen zu isolieren und zu charakterisieren.
Den Erfindern ist es darüber hinaus gelungen, mit Hilfe der neuen Antikörper neuronale Vorläuferzellen bspw. von mesenchy- malen Stammzellen ausgezeichnet zu unterscheiden.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Antikörper oder ein Fragment davon, der von der Hybridomzellinie W4A5 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2571 hinterlegt wurde.
Ferner betrifft die Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon, der von der Hybridomzellinie W8C3 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2570 hinterlegt wurde.
Weiterhin betrifft die Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon, der von der Hybridomzellinie 57D2 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2568 hinterlegt wurde. Die Erfinder konnten die Antikörper W8C3 und W4A5 unter Verwendung der Zellinie WERI-RB-1 erzeugen.
Diese Zellinie ist eine aus einem Retinoblastom isolierte Zellinie, die z.B. bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Nummer DSMZ ACC 90 geführt wird. Es war nicht zu erwarten - und im Fachgebiet fand sich auch kein Hinweis darauf -, daß- unter Verwendung dieser Zellinie Antikör- ' per zur Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen generiert werden können.
Der Antikörper 57D2 wurde unter Verwendung der Zellinie TF-1 erzeugt.
Diese Zellinie ist eine Erythroleukamie-Zellinie, die z.B. bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen unter der Nummer DSMZ ACC 334 geführt wird. In der Literatur findet sich kein Hinweis darauf, daß unter Verwendung dieser Zellinie Antikörper generiert werden können, die für neuronale Vorläuferzellen spezifisch und daher zu deren Identifizierung und/oder Isolierung geeignet sind.
Insofern war es überraschend, daß die Antikörper W8C3, W4A5 und 57D2 an Antigene binden, die für neuronale Vorläuferzellen derart charakteristisch sind, daß sie eine ausgezeichnete Möglichkeit bieten, neuronale Vorlauferzellen aus einer verschiedene Zellpopulationen enthaltenden Probe selektiv zu identifizieren. Die zur Immunisierung verwendeten Zellinien sind bereits ausdifferenziert, weshalb nicht zu erwarten war, daß eine multipotente neuronale Vorläuferzelle aufgrund ihrer unterschiedlichen Oberflächenmarker von den erfindungsgemäßen Antikörpern erkannt werden würde.
Die Produktion von monoklonalen Antikörpern durch die Fusion von Milzzellen von immunisierten Mäusen und Myelomzellen wurde bereits 1975 von Kohler und Milstein ("Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity" , Na- ture 256: 495-497) beschrieben. ' Die Techniken für die chemische Selektion der Hybridome, die aus einer solchen Fusion resultieren, und die nachfolgende Isolation von Zeilklonen, die einzelne Antikörper sekretieren, für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern sind ebenso im Fachgebiet bekannt.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, daß die obengenannten Antikörper spezifisch für neuronale Vorläuferzellen sind. Die Erfinder konnten ferner in eigenen Versuchen zeigen, daß neuronale Vorläuferzellen, die einen bekannten Immunophäno- typ aufwiesen (jeweils positiv für CD15, CD56, CD90, CD133, CD164, CDl72a, NGFR (Rezeptor für den neuronalen Wachtumsfak- tor)) mit den neuen Antikörpern in Subpopulationen fraktioniert werden konnten.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann statt des jeweils angesprochenen Antikörpers auch ein Fragment des Antikörpers verwendet werden, ohne daß das jeweils ausdrücklich erwähnt wird. Unter "Fragment" wird dabei jedes Fragment eines Antikörpers verstanden, das die Antigenbindungsfunktion des Antikörpers beibehält. Solche Fragmente sind bspw. Fab, F(ab,)2, Fv und andere Fragmente wie CDR-Fragmente. Die genannten Fragmente weisen die Bindungsspezifität des Antikörpers auf und können auch bspw. mit bekannten Verfahren hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper ermöglichen es jetzt auch, weitere Antikörper herzustellen, die an das gleiche Antigen binden. Durch den erfindungsgemäßen Antikörper ist es möglich, die entsprechende Antigenstruktur mit allgemein bekannten Verfahren zu isolieren und weitere monoklonale Antikörper gegen die gleiche Antigenstruktur zu entwickeln, wobei auch hier die bekannten Verfahren Anwendung finden.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzellinien, die die Fähigkeit besitzen, derartige Antikörper zu produzieren und freizusetzen, und insbesondere die Hybridomzellinien W8C3, W4A5 und 57D2.
Die Erfinder haben mit den neuen Antikörpern erstmals monoklonale Antikörper sowie diese produzierende und freisetzende Hybridomzellinien hergestellt, die eine gezielte Erkennung von neuronalen Stammzellen ermöglichen. Die Antikörper stellen somit ein bisher einzigartiges Mittel für den Arzt und Forscher dar, um einerseits derartige Zellen nachzuweisen und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte Reagenzien.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Stammzellen, bei dem ein Antikörper oder ein Fragment davon verwendet wird, der an das gleiche Antigen bindet wie ein Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien 57D2, W8C3 und W4A5. Dabei werden insbesondere Antikörper oder Fragmente davon verwendet, die von einer Hybridomzellinie produziert werden, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien 57D2, W8C3 und W4A5.
Die Erfinder haben erkannt, daß es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, insbesondere neuronale Vorläuferzellen zu identifizieren und bspw. gegen mesenchymale Stammzellen abzugrenzen.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen mit einem Antikörper, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension, die neuronale Vorläuferzellen enthält, mit den neuen monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon, und b) Identifizieren solcher Zellen in der Probe, die die neuen monoklonalen Antikörper, oder Fragmente davon binden.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen mit einem Antikörper, mit den folgenden Schritten:
(a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension, die neuronale Vorlauferzellen enthält, mit den neuen monoklonalen Antikörper, oder Fragmenten davon, und (b) Isolieren solcher Zellen aus der Probe, die an den neuen monoklonalen Antikörper, oder an ein Fragment davon binden.
Die Probe kann ausgewählt sein aus jeder Quelle, die neuronale Stammzellen enthält, also bspw. einer Probe aus dem' Knochenmark oder peripherem Blut. Diese Zellen werden nach im Stand der Technik bekannten Labormethoden erhalten und sind vielfach kommerziell erhältlich.
Das In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension, die neuronale Stammzellen enthält, kann dabei in Lösung vollzogen werden, wie es bspw. bei Anwendung eines Durchflußzytometers (= fluorescent-activated cell sorter (FACS)) der Fall ist.
Bei der Durchflußzytometrie werden Zellen mit Antikörpern beladen, die einerseits spezifisch für einen Oberflächenmarker und andererseits mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind. Diejenigen Zellen, die Marker-positiv sind, fluoreszieren, während die negativen Zellen dunkel bleiben. Es kann also festgestellt werden, welcher Anteil einer Zellpopulation Markerpositiv ist. Gleichzeitig erlaubt ein Durchflußzytometer, die Größe und Granularität von Zellen zu erfassen.
Eingesetzt werden kann auch ein Verfahren zur magnetischen Zellseparation (MACS, magnetic cell sorting). Bei diesem Verfahren werden die Zellen mit magnetischen Beads markiert, wobei diese Beads bspw. an die Antikörper gekoppelt sein können. Ferner kann das In-Verbindung-Bringen auch dadurch durchgeführt werden, daß der monoklonale Antikörper an einem Träger immobilisiert wird, wie es bspw. bei der Säulenchromatographie der Fall ist.
Die Zellsuspension kann irgendeine Lösung mit Knochenmarkszellen, Blut- oder Gewebezellen sein.
Nach Mischen der Zellsuspension mit dem Antikörper binden diejenigen Zellen den Antikörper, die das betreffende Antigen exprimieren, woraufhin diese Zellen von den Zellen, die kein Antikörper gebunden haben, nach dem beschriebenen Verfahren i- dentifiziert und/oder isoliert werden können.
Die auf diese Weise identifizierten/isolierten neuronalen Vorläuferzellen können dann bspw. für eine Transplantation eingesetzt werden, um die Regeneration von neurologischen Schädigungen zu erreichen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines neuen Antikörpers oder eines Fragmentes davon zur Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Zellinie TF-1 zur Herstellung von Antikörpern oder Fragmenten davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der Zellinie WERI- RB-1 zur Herstellung von Antikörpern oder Fragmenten davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen oder mehrere der obengenannten erfindungsgemäßen Antikörper.
Eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung kann neben dem einen oder mehreren Antikörpern weitere geeignete Substanzen enthalten, wie bspw. Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Stabilisatoren usw. Hierzu zählen bspw. physiologische Kochsalzlösungen, Wasser, Alkohole, und weitere geeignete Substanzen, die bspw. in A. Kibble, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press, zu finden sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit, das zumindest einen der neuen Antikörper enthält.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den beigefügten Figuren und der Beschreibung.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung oder in anderen Kombinationen verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele sind in der beigefügten Zeichnung dargestellt und werden in der Beschreibung näher erläutert. Es zeigt : Fig. 1 FACS-Analysen, die zeigen, daß neuronale Vorläuferzellen CD15, CD56, CD90, CD133, CD164, CDl72a expri- mieren;
Beispiel
Material und Methoden
Neuronale Vorläuferzellen wurden bei der Firma CellSystems, St. Katharinen, Deutschland, käuflich erworben.
Die folgenden monoklonalen Antikörper oder Antikörper-Konjugate wurden für die fluorometrischen Analysen eingesetzt: W8B2, W8C3, W4A5 und W7C5 (CD109), die allesamt ausgehend von der Re- tinoblastomzellinie WERI-RB-1 erhalten wurden. Diese Zellinie ist bei der DSMZ unter der Nummer ACC90 erhältlich.
Ferner eingesetzt wurden der monoklonale Antikörper 57D2, der durch die Immunisierung von Mäusen mit der TF-1 erythroleukämi- schen Zellinie (DSMZ: ACC334) erhalten wurde.
Als Antikörper mit bekannten Spezifitäten wurden CD10-PE, CD13- PE, CD34-PE, CD45-PE, CD56-PE, CD61-PE, CD117-PE eingesetzt (alle erhältlich bei Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland). PE (Phycoerythrin) -konjugierte monoklonale Antikörper mit einer Spezifität für CD90, CD140B und CD164 wurden von PharMingen (San Diego, USA) erworben. Von Sigma (München, Deutschland) wurde der Antikörper gegen den Rezeptor des Ner- venwachstumsfaktor (NGFR) käuflich erworben. CD133-PE (Klon W6B3C1), CD167a (Kon 48B3), CD172a-PE (Klon SE5A5 ) , der CD15- spezifische Antikörper W6D3 und der CDl05-spezifische monoklo- nale Antikörper 43A3 wurden in dem Labor der Erfinder hergestellt. Nicht-konjugierte Antikörper wurden mit Isotypspezifischen PE-konjugierten Ziege-Antimaus-Antiseren gefärbt (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, USA).
Anfärben der Zellen und Durchflußzytometrie
Für die zytoπietrischeή Analysen' wurden die kommerziell erhältlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPC) mit 10 μl Phycoe- rythrin-konjugierten Antikörpern oder 25 μl Kulturüberstand bei 4°C für 20 Minuten in 96-Well-Mikrotiterplatten inkubiert. Nicht-konjugierte monoklonale Antikörper wurden nach einem Waschschritt im FACS-Puffer (PBS; 0,5 % BSA; 0,1 % NaN3) mit Ziege-Antimaus-IgGl-PE (1:100) oder Ziege-Antimaus-IgG3-PE (1:20) Antiseren gefärbt. Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen mit einem Durchflußzytometer (FACSCalibur , Bec- ton Dickinson) unter Verwendung der Cell-Quest-Software (Bacton Dickinson) analysiert.
Für die immunzytochemische Analyse von intrazellulären Antige- nen und extrazellulären Matrixproteinen wurden die neuronalen Vorläuferzellen auf 8-Well-Kammerobjektträgern mit Aceton für 2 Minuten fixiert und mit dem primären Antikörper für 60 Minuten markiert. Anschließend wurde mit Alexa 488-konjugierten Ziegen-Antimaus-IgG- oder Ziegen-Antikaninchen-IgG-Antiseren gefärbt. Für die Kontrollen wurden Zellen entweder mit einem Isotypen-passenden Kontrollantikörper oder mit einem Prä-Immun- Kaninchenserum markiert. Die Fluoreszenz der Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) e- valuiert . Ergebnisse
Immunophänotvp von neuronalen Vorläuferzellen
Kommerziell erhältliche fetale neuronale Vorläuferzellen (im folgenden NPC, neural progenitor cells) (CellSystems, St. Ka- tharinen, Deutschland) wurden auf ihren Immunphänotyp untersucht .
Es konnten zwei NPC-Populationen unterschiedlicher Größe im zweifach-Scatter-Plot detektiert werden. Große NPC wiesen eine stärkere CD133-, CDl72a- und W8C3-Antigen-Expression als die kleineren NPC auf, wohingegen CD13 v.a. auf einer kleinen NPC- Subpopulation identifiziert wurde. Alle NPC-Subpopulationen exprimierten CD56, CD90, CD164, NGFR und die Antigene, an die die von den Erfindern hergestellten Antikörper 57D2, W4A5 , W6D3 (CD15) binden. Dies Zellen waren für CD45, CD105 (Endoglin) und CD140b (PDGF-RB) negativ, außerdem auch für die Antigene W7C5 (CD109) und W8B2.
In Fig. 1 sind ausgewählte Beispiele dieser Analysen dargestellt. In den Histogrammen D und E der Fig. 1 ist eindeutig zu erkennen, daß die NPC positiv für CD90 und CD56 sind, in den Histogrammen I, J, K und L der Fig. 1 ist das positive Ergebnis für W8C3, 57D2, W4A5 und W6D3 (CD15) dargestellt.
In anderen Versuchen wurde untersucht, in wie weit die neuen Antikörper bspw. an mesenchymale Stammzellen binden. Hierzu wurden zum einen mesenchymale Stammzellen eingesetzt, die von den Erfindern aus Knochenmarkzellen des Beckenraumes freiwilliger Spender isoliert wurden und andererseits käuflich erhältliche mesenchymale Stammzellen (CellSystems, St. Katharinen, De- tuschland) . In den meisten Fällen waren die Expressions-Muster der kommerziellen mesenchymalen Stammzellen und die der eigens isolierten mesenchymalen Stammzellen (im folgenden: MSC) identisch oder ähnlich. Die MSC erwiesen sich als eindeutig negativ für W4A5, W6D3 und CDi.33 und lediglich- eine kleine Subpopulati- on der MSC zeigte eine schwach positive Reaktion für 57D2.
In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Untersuchungen zusammengefaßt, wobei hier die Antigen-Expression auf kommerziell erworbenen neuronalen Vorläuferzellen (NPC, komm.) und die auf mononuclären Zellen aus dem Knochenmark gesunder Spender (BMMNC) untersucht wurde.
In der Tabelle bedeuten - negativ, d.h. keine Expression auf den betreffenden Zellen, + positiv, d.h. eine Expression auf den Zellen, (+) zumindest in einer Analyse positiv, S geringe bis nicht detektierbare Expression, P Zellpopulation < 5 %.
Antigen/ NPC BMMNC
Antikörper komm.
CD13 P P
CD34 S P
CD45 - +
CD56 + P
CD90 + P
CD105 - P
CD117 S P
CD133 + P
CD140B - P
CD164 + +
CD167 s -
CDl72a + +
W4A5 + -
W6D3 (CD15) + +
W7C5 (CD109)
W8B2
W8C3 P
57D2 +
NGFR +
Im Vergleich zu BMMNC exprimierten NPC somit die Antigene der neuen Antikörper W4A5 , 57D2 und W8C3 und bestanden hauptsächlich aus einer CD133+ Population (25 - 40 % im Vergleich zu < 1 % BMMNC ) . Wurden die NPC in Serum-freien Medien in Anwesenheit von neuronalem Vorläuferzellen-Medium (CellSystems) kultiviert, so konnte das Wachstum von Neurosphäroiden beobachtet werden. Bei Vorliegen von 10% fetalem Kälberserum (FCS) und unter Abwesenheit von Wachstumsfaktoren hefteten sich die Sphären an die Plastikoberfläche der Kulturschalen. NPC, die in Wachstumsmedium für Astrocyten kultiviert wurden, differenzierten in Astro- ■ cyten mit- langen Pseudopodien. NPC, die unter Anwesenheit von Astrocyten-Medium auf Kammer-Objektträger gehalten wurden, exprimierten Nestin, MAP2, Neurofilamente, GFAP, W4A5 und ß2- Ketten-Laminin .
Zusammenfassung
Stammzellen des zentralen Nervensystems wie neuronale Vorläuferzellen stellen im Hinblick auf therapeutische Einsätze eine wichtige Quelle dar, um Strategien für Therapien zur Wiederherstellung von verletztem oder erkranktem Hirngewebe zu entwickeln. NPC können sowohl aus adultem als auch aus fetalem Gehirn isoliert werden. Eine große Subpopulation dieser Zellen ist CD133-positiv und für CD34, CD45 und CD24 negativ. In Kultur differenzieren diese Zellen in Neurosphären.
NPC erwiesen sich als positiv für CD56, CD90, CD133, W4A5 , W6D3 (CD15), W8C3 und 57D2, und als negativ für CD45, CD10, W7C5 (CD109) und W8B2. Ähnlich zu den NPC exprimierten Knochenmark- Subpopulationen CD133, CD56, CD90 und CD15, wobei es eher unwahrscheinlich ist, daß diese Marker auch als Marker für NPC geeignet sind. Die vielversprechendsten Marker sind W4A5 und 57D2, die mit Knochenmark-Populationen insgesamt nicht reagieren. Die Antigene, die durch die Antikörper W4A5 , 57D2 und W8C3 definiert werden, stellen ausgezeichnete Oberflächenmarker mit ausgesprochener Spezifität für NPC dar. Da diese insbesondere auf hauptsächlich Nestin-positiven NPC exprimiert werden, werden sie offenbar selektiv auf unreifen NPC exprimiert.

Claims

Patentansprüche
Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder das Fragment davon an ein gleiches Antigen bindet wie ein Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden am 14.08.2002 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach dem Budapester Vertrag unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM' ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien W4A5 , W8C3 und 57D2.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon zur Identifizierung und/oder Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridomzellinie W4A5 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2571 hinterlegt wurde.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon zur Identifizierung und/oder Isolierung von mesenchymalen Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridomzellinie W8C3 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2570 hinterlegt wurde.
Monoklonaler Antikörper oder Fragment davon zur Identifizierung und/oder Isolierung von mesenchymalen Stammzellen, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridomzellinie 57D2 produziert wird, die am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter der Nummer DSM ACC2568 hinterlegt wurde.
Hybridomzellinie, die eirien Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 produziert.
Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung neuronalen Vorläuferzellen mit einem Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper oder ein Fragment davon verwendet wird, der an das gleiche Antigen bindet wie ein Antikörper, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien W4A5 , W8C3 und 57D2.
Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorlauferzellen mit einem Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß ein Antikörper oder ein Fragment davon verwendet wird, der von einer Hybridomzellinie produziert wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe der folgenden am 14.08.2002 bei der DSMZ nach dem Budapester Vertrag unter den Nummern DSM ACC2571, DSM ACC2570 und DSM ACC2568 hinterlegten Hybridomzellinien W4A5 , W8C3 und 57D2.
. Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen mit einem Antikörper mit den folgenden Schritten:
(a) In-Verbindung-Bringen einer Probe einer Zellsuspension, die neuronale Vorläuferzellen enthält, mit einem monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Fragment davon, und
(b) Identifizieren solcher Zellen in der Probe, die den monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon binden.
9. Verfahren zur Isolierung von neuronalen Vorläuferzellen mit einem Antikörper, mit den folgenden Schritten:
(a) in Verbindung bringen einer Probe einer Zellsuspension, die neuronalen Vorläuferzellen enthält, mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Fragment davon, und
(b) Isolieren solcher Zellen aus der Probe, die den monoklonalen Antikörper oder das Fragment davon binden.
10. Verwendung eines Antikörpers oder eines Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
11. Verwendung der bei der DSMZ unter der Nummer ACC 90 hinterlegten Zellinie WERI-RB-1 zur Herstellung von Antikörpern oder Fragmenten davon zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorläuferzellen.
12. Verwendung der bei der DSMZ unter der Nummer ACC 334 hinterlegten Zellinie TF-1 zur Herstellung von Antikörpern oder Fragmenten davon, zur Isolierung und/oder Identifizierung von neuronalen Vorlauferzellen.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
14. Kit enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
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