WO1997007204A1 - Antikörper 105a5 gegen 'peanut agglutinin' (pna)-bindendes glykoprotein an zelloberflächen - Google Patents

Antikörper 105a5 gegen 'peanut agglutinin' (pna)-bindendes glykoprotein an zelloberflächen Download PDF

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WO1997007204A1
WO1997007204A1 PCT/EP1996/003508 EP9603508W WO9707204A1 WO 1997007204 A1 WO1997007204 A1 WO 1997007204A1 EP 9603508 W EP9603508 W EP 9603508W WO 9707204 A1 WO9707204 A1 WO 9707204A1
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antibody
cells
hybridoma cells
antibody according
pna
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PCT/EP1996/003508
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Hans-Jörg BÜHRING
Andrew Zannettino
Paul J. Simmons
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Eberhard-Karls-Universität Tübingen
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to an antibody against peanut agglutinin (PNA) -binding glycoprotein on cell surfaces.
  • PNA peanut agglutinin
  • PNA peanut agglutinin
  • An antibody which specifically binds to this glycoprotein MGC-24 is particularly suitable as a mediator for a corresponding, target-specific diagnostic or therapeutic agent.
  • Such an antibody can be coupled both with simple detection reagents such as fluorescent dyes or radioactive substances and with special therapeutically active reagents.
  • the present invention is therefore based on the object of providing an antibody which specifically binds to the native, unmodified peanut agglutinin (PNA) -binding cell surface glycoprotein MGC-24 and which is available in practically unlimited amounts.
  • This object is achieved by the provision of a monoclonal antibody which specifically binds to the native, unmodified peanut agglutinin (PNA) -binding cell surface glycoprotein MGC-24.
  • PNA peanut agglutinin
  • Such a monoclonal antibody is produced and released by hybridoma cells, which are deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, according to the Budapest Treaty. It is named 105A5.
  • the hybridoma cells were received by the DSMZ on August 11, 1995.
  • This antibody is the subject of the parallel German patent application DE 195 30 272.0 "Antibody 103B2".
  • a monoclonal antibody was provided for the first time, which can be reproduced in a standardized manner and thus can be produced potentially indefinitely, and which specifically binds to a special epitope on the cell surface glycoprotein MGC-24 .
  • the antibody according to the invention enables targeted recognition and influencing of cells which have an extra-cellular domain of this protein MGC-24. It thus represents a hitherto unique and versatile means for the doctor and researcher to detect such cells on the one hand, both in the cell culture and in the patient's organism, and on the other hand to possibly include these cells manipulate, either by the antibody itself or by specific reagents coupled to it.
  • the invention further relates to hybridoma cells which generate a monoclonal antibody against the protein MGC-24. It includes in particular the hybridoma cells which are deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, according to the Budapest Treaty and which produce the antibody with the designation 105A5.
  • the invention also relates to a method for producing hybridoma cells which synthesize and release an antibody against the native, unmodified cell surface glycoprotein MGC-24.
  • This method comprises the steps which are fundamentally familiar in the prior art, as described, for example, by Bendinging et al. Hybridoma 1991, Volume 10, No. 1, pp. 77-78:
  • this cell line shows a strong expression of MGC-24, as was shown during the experiments leading to the antibody 105A5.
  • hybridoma cells that produce stem cell-specific antibodies When looking for hybridoma cells that produce stem cell-specific antibodies, it is preferred in the isolation of the hybridoma cells if those hybridoma cells are selected that produce antibodies with a specificity for bone marrow cells, it being further preferred if only those hybridoma cells are specific for the Antibodies produced by them are tested with bone marrow cells which have previously been shown to have a weak or preferably a negative reaction with peripheral blood cells.
  • the advantage here is that rapid screening is possible without many cells having to be tested in vain.
  • MGC-24 is also expressed on stem cells, so that the fact that the presence of increased undifferentiated cells including hematopoietic stem cells in the bone marrow, which have the antigen to be recognized by the antibody, can be used in the screening .
  • the pre-test for reaction with peripheral blood cells can be used to easily obtain antibodies which bind selectively to antigens on bone marrow cells and which are not or only poorly expressed on peripheral blood cells. In other words, the specificity in the selection is thereby increased significantly in a simple manner.
  • the invention also relates to the use of a monoclonal antibody against the cell surface glycoprotein MGC-24 for the diagnostic and / or therapeutic treatment of tumors, in particular gastric and colon carcinomas.
  • Tumor cells in particular cells from gastric and colon carcinomas, are distinguished by a comparatively high content of cell surface glycoprotein MGC-24.
  • An antibody according to the invention which is coupled to a detection means, for example a radioactive marker, binds this detection means indirectly to these cells and thus enables the direct detection of these cells, for example using X-ray diagnostic / scintigraphic methods. A very early tumor diagnosis may even be possible in vivo.
  • the antibody can be coupled to a therapeutically active agent and thereby enable a direct and targeted influencing or even elimination of cells carrying MGC-24, in particular tumor cells.
  • an antibody which is produced and released by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, is used for such a diagnostic and / or therapeutic treatment.
  • the antibody can be mixed with correspondingly suitable auxiliary substances in a pharmaceutical preparation.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical agent for the diagnostic and / or therapeutic treatment of tumors, the contains an antibody according to the invention which binds to the cell surface glycoprotein MGC-24.
  • This pharmaceutical composition preferably contains an antibody such as that produced and released by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ.
  • MGC-24-carrying cells can be extracted from a suspension of different types of cells using the test methods known in the art, such as e.g. the enzyme linked immunosorbet assay, ELISA for short, or the Radioi ⁇ imunoassay, RIA for short.
  • the present invention therefore also relates to a kit for the detection of peanut agglutinin (PNA) -binding cell surface glycoprotein, which comprises a monoclonal antibody which specifically binds to the native glycoprotein MGC-24.
  • PNA peanut agglutinin
  • kits comprises an antibody such as that produced by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ.
  • the monoclonal antibody with the designation 105A5 which is generated by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ , binds to stem cells.
  • the invention therefore also relates to the use of an antibody according to the invention, preferably the antibody 105A5, for the detection of hamatopoetic cells, and a kit for the detection of hamatopoetic cells, which contains an antibody according to the invention, preferably the antibody 105A5.
  • an antibody according to the invention preferably the antibody 105A5
  • a kit for the detection of hamatopoetic cells which contains an antibody according to the invention, preferably the antibody 105A5.
  • the invention therefore also relates to the use of an antibody according to the invention, preferably antibody 105A5, for inhibiting hematopoiesis.
  • Example 1 Production and characterization of monoclonal antibodies against the cell surface glycoprotein MGC-24 Cells of the undifferentiated, megakaryoblastic cell line MOLM-1 are used as antigen (Matsuo Y, Adachi T, Tsubota T, Imanishi J, Minowada J. Establishment and characterization of a novel megakaryoblastoid cell line, MOLM-1, from a patient with chronic myelogenous leukemia, Human Cell 1991; 4: 261-264).
  • mice Eight-week-old Balb / c mice are immunized intraperitoneally with IO 7 cells of the cell line MOLM-1 twice at intervals of 10 days. Four days before the fusion, 5 x IO 5 cells are applied directly to the spleen to strengthen the immune response.
  • the antibody formation in the mouse organism is checked by examining the blood serum of the animal in question in the ELISA test known to the person skilled in the art for binding properties with the antigen.
  • the lymphocytes of the successfully immunized animal are obtained by operating out the spleen and crushing it into a cell suspension.
  • the suspended spleen cells are fused with myeloma cells of the known strain SP2 / 0 in the presence of polyethylene glycol.
  • the fusion culture is cultivated in medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT), here in HAT-RPMI-1640, in which only hybrid cells can multiply, since these have both the property of the myeloma cells to the unlimited ability to divide and that Property of the antibody-producing lymphocytes to grow in HAT-containing medium.
  • the cells are plated out in well plates and incubated at 37 ° C., 5% Co 2 .
  • the culture supernatants are screened on the MOLM-1 cell line in the flow cytometer after 10-14 days.
  • the supernatants are tested for reactivity with peripheral blood cells, since these do not express selective stem cell antigens.
  • Supernatants that show a negative or weak reaction with peripheral blood cells are then tested for reactivity with bone marrow cells.
  • Hybridomas that produce antibodies with specificity for bone marrow cells are selected and separated and cultivated, ie cloned, according to the known limit dilution method.
  • This screening strategy takes advantage of the fact that undifferentiated cells, including hematopoietic stem cells, are increasingly present in the bone marrow.
  • Hybridoma cell cultures which react positively are further cultivated, the antibodies are enriched, purified and characterized.
  • the monoclonal antibody 105A5 was obtained according to the screening strategy above.
  • the isotype was determined via PE-conjugated anti-isotype-specific antisera by direct immunofluorescence to IgG3.
  • the antibody 105A5 which is produced by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, has the following characteristic features:
  • Immunoglobulin class IgM specific binding affinity to: MGC-24
  • Example 2 Identification of the antigen recognized by the monoclonal antibody 105A5.
  • the antigen was identified via a stroma expression library.
  • a retroviral expression library was created according to the method described by Rayner and Gonda in Mol.Cell.Biol. 1994, volume 14, page 880. In the method used here, mRNA from cultivated stromal cells of the human bone marrow was used.
  • cDNA transcripts were cloned directly into the retroviral plasmid vector pRUF.Neo. DNA from the library was used to transfect an amphotropic host cell line (PA317). Transition-generated retroviral particles were harvested and used to stably infect an ecotropic host cell line. Viruses produced by these cells were then used to infect the factor-dependent hematopoietic murine cell line FDC-Pl.
  • Infected FDC-Pl cells were selected for G418 resistance, whereupon cells were isolated and enriched that express the antigen recognized by antibody 105A5.
  • the cells that were recognized by the antibody were enriched by using several passes of an immuno-magnetic cell sorting (Dynabeads). After this FACS sorting, clonal populations of the transfected cells were established.
  • the proviral cDNA inserts were then recovered from genomic DNA from the infected cells. For this purpose, PCR amplification was carried out using specific retroviral primers which flank the cloning site in the plasmid vector. In this way it was possible to isolate a cDNA insert of approximately 3 kBp.
  • Example 3 Use of the 105A5 monoclonal antibody to inhibit hematopoiesis in vitro
  • the antibody was examined for its ability to disrupt the hematopoietic cell development.
  • the CD34 + cells were cultured for 14 days at an initial concentration of 1000 cells per milliliter in IMDM by L-glutamine, penicillin, streptomycin, beta-mercaptoethanol, 0.9% (w / v) methyl cellulose , 1% bovine serum albumin, 30% (volume / volume) fetal calf serum and 10 ng / ml of the following purified recombinant human Cytokines were supplemented: IL-1, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, SCF and erythropoietin.
  • the antibody was tested to see if it could interfere with hematopoiesis in a long-term stromal cell-dependent culture.
  • the antibody 105A5 or a control antibody was added to cultures of stromal cells from the bone marrow. These cultures were made from bone marrow derived from normal donors.
  • the cultured stromal cells were irradiated (1500 rad) to kill hematopoietic cells one week before the start of the experiment.
  • the long-term culture was then established by adding 3 x IO 4 CD34 + cells per culture in the presence of the above-mentioned antibodies in a concentration of 10 ⁇ g / ml.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch an das Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 bindet. Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzellen, die einen derartigen Antikörper erzeugen, sowie ein Verfahren zur Herstellung solcher Hybridomzellen.

Description

ANTIKÖRPER 105A5 GEGEN "PEANUT AGGLUTININ" (PNA) -BINDENDES GLYKOPROTEIN AN ZELLOBERFLÄCHEN
Die Erfindung betrifft einen Antikörper gegen Peanut Agglutinin (PNA) -bindendes Glykoprotein an Zelloberflächen.
Maligne Zellen von vielen menschlichen Tumoren besitzen an ihrer Zelloberfläche Peanut Agglutinin (PNA) -bindende Glykoproteine . Diese PNA-bindenden Glykoproteine bieten u.a. die Möglichkeit, Nachweisreagenzien und/ oder therapeutisch wirksame Reagenzien direkt an die betreffenden Zellen heranzuführen und daran zu binden. Seit einigen Jahren bekannt sind die nach der inzwischen eingeführten MUC-Nomenklatur benannten Glykoproteine MUCl, MUC2 und MUC3. Ein kürzlich identifiziertes Zelloberflachen-Glyko¬ protein ist das Protein MGC-24, dessen Aminosäuresequenz und dazugehörige Nukleotidsequenz von Masuzawa, et al., J. BIOCHEM. 112, 609 - 615, (1992) vollständig aufgeklärt wurde. Dieses Glykoprotein MGC-24 eignet sich daher besonders gut als Angriffs¬ punkt für eine gezielte zelluläre Diagnose bzw. Therapie.
Als Vermittler für ein dementsprechendes, zellulär ziel¬ gerichtetes Diagnostikum bzw. Therapeutikum kommt insbesondere ein Antikörper in Betracht, der spezifisch an dieses Glykoprotein MGC-24 bindet.
Ein solcher Antikörper kann sowohl mit einfachen Nachweis- reagenzien wie Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Stoffen als auch mit speziellen therapeutisch wirksamen Reagenzien gekoppelt sein.
Bisher ist jedoch nur ein polyklonaler und damit nur begrenzt verfügbarer und nicht identisch reproduzierbarer Antikörper bekannt, der zudem gegen eine modifizierte, nämlich deglykosi- lierte Form des MGC-24-Proteins gerichtet ist.
Mit einem derartigen Antikörper ist eine gezielte Behandlung bzw. ein gezielter Nachweis von MGC-24 tragenden Zellen u.a. im lebenden Organismus nicht möglich.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA) -bindende Zelloberflachen- glykoprotein MGC-24 bindet und der in praktisch unbegrenzter Menge zur Verfügung steht. Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gelöst, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA) -bindende Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 bindet. Ein solcher monoklonaler Antikörper wird von Hybridomzellen produziert und freigesetzt, die unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt sind. Er ist mit der Bezeichnung 105A5 benannt. Die Hybridomzellen sind am 11. August 1995 bei der DSMZ eingegangen.
Ein weiterer monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zellober- flächenglykoprotein MGC-24 bindet, allerdings an ein anderes Epitop, wird von Hybridomzellen produziert und freigesetzt, die unter der Nummer DSM ACC 2221 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegt sind. Er ist mit der Bezeichnung 103B2 benannt. Dieser Antikörper ist Gegenstand der parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 272.0 "Antikörper 103B2".
Mit dem erfindungsgemäßen Antikörper und dem Antikörper aus der parallelen Patentanmeldung wurde erstmals jeweils ein mono¬ klonaler Antikörper bereitgestellt, der standardisiert re¬ produzierbar ist und somit potentiell unbegrenzt hergestellt werden kann, und der spezifisch an jeweils ein spezielles Epitop auf dem Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 bindet.
Der erfindungsgemäße Antikörper ermöglicht eine gezielte Erkennung und Beeinflussung von Zellen, die eine extra¬ zelluläre Domäne dieses Protein MGC-24 aufweisen. Er stellt damit ein bisher einzigartiges und vielseitig einsetzbares Mittel für den Arzt und Forscher dar, um einerseits solche Zellen nach¬ zuweisen, und zwar sowohl in der Zellkultur als auch im Pati¬ entenorganismus, und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte spezifische Reagenzien.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzellen, die einen mono¬ klonalen Antikörper gegen das Protein MGC-24 erzeugen. Sie umfaßt insbesondere die Hybridomzellen, die unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt sind und den Antikörper mit der Bezeichnung 105A5 produzieren.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellen, die einen Antikörper gegen das native, unmodifizierte Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 synthetisieren und freisetzen. Dieses Verfahren umfaßt die im Stand der Technik grundsätzlich geläufigen Schritte, wie sie bspw. von Bühring et al. in Hybridoma 1991, Band 10, Nr. 1, S. 77-78 beschrieben wurden:
1. Irraπunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres, vorzugs¬ weise einer Maus vom Balb/c-Stamm, mit dem Antigen bzw. Immunogen;
2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen, vorzugsweise der Milzlymphozyten dieses Tieres;
3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, itπmortalisierten Zellinie, vorzugsweise einer Myelomzellinie, zu Hybridomzellen; und
4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridom¬ zellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet. Das erfindungsgemäß gefundene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das Tier mit Zellen der undifferenzierten, megakaryo- blastären Zellinie MOLM-1 immunisiert wird.
Dabei erwies sich als Vorteil, daß diese Zellinie eine starke Expression von MGC-24 zeigt, wie sich während der zu dem Antikörper 105A5 führenden Versuche zeigte.
Wenn Hybridomzellen gesucht werden, die stammzellspezifische Antikörper produzieren, ist es bei der Vereinzelung der Hybridom¬ zellen bevorzugt, wenn solche Hybridomzellen ausgewählt werden, die Antikörper mit einer Spezifität für Knochenmarkzellen produzieren, wobei es ferner bevorzugt ist, wenn nur solche Hybridomzellen auf die Spezifität der von ihnen produzierten Antikörper mit Knochenmarkzellen getestet werden, bei denen zuvor nachgewiesen wurde, daß diese Antikörper eine schwache oder bevorzugt eine negative Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen.
Hier ist von Vorteil, daß ein schnelles Screening möglich ist, ohne das viele Zellen vergebens getestet werden müssen. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß MGC-24 auch auf Stammzellen exprimiert ist, so daß bei dem Screening die Tatsache ausgenutzt werden konnte, daß im Knochenmark verstärkt undiffe- renzierte Zellen einschließlich von hämatopoetischen Stammzellen vorkommen, die das von dem Antikörper zu erkennende Antigen aufweisen. Durch den Vortest auf Reaktion mit peripheren Blutzellen können dabei solche Antikörper auf einfache Weise gewonnen werden, die selektiv an Antigene auf Knochenmarkzellen binden und nicht bzw. nur schwach auf peripheren BlutZeilen exprimiert sind. Mit anderen Worten, die Spezifität bei der Auswahl wird hierdurch auf einfache Weise deutlich erhöht. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Zelloberflachenglykoprotein MGC-24 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Magen- und Coloncarcinomen.
Tumorzellen, insbesondere Zellen von Magen- und Coloncarcinomen, zeichnen sich durch einen vergleichsweise hohen Gehalt an Zelloberflachenglykoprotein MGC-24 aus. Ein erfindungsgemäßer Antikörper , der mit einem Nachweismittel, beispielsweise einem radioaktiven Marker, gekoppelt ist, bindet dieses Nachweismittel indirekt an diese Zellen und ermöglicht damit den direkten Nachweis dieser Zellen, beispielsweise mit röntgendiagnostischen /szintigraphischen Methoden. Damit ist eine sehr frühe Tumor¬ diagnose unter Umständen sogar in-vivo möglich.
In entsprechender Art und Weise kann der Antikörper mit einem therapeutisch wirksamen Mittel gekoppelt sein und dadurch eine direkte und gezielte Beeinflussung oder gar Eliminierung von MGC-24 tragenden Zellen, insbesondere Tumorzellen, ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Antikörper, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, zu einer solchen diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung verwendet.
Um die therapeutische und/oder diagnostische Applikation des erfindungsgemäßen Antikörpers zu erleichtern, kann der Anti¬ körper mit entsprechend geeigneten Hilfssubstanzen in einer pharmazeutischen Zubereitung vermischt sein. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein pharmazeutisches Mittel zur diagno¬ stischen und/oder therapeutischen Behandlung von Tumoren, das einen erfindungsgemäßen, an das Zelloberflachenglykoprotein MGC-24 bindenden Antikörper enthält. Vorzugsweise enthält dieses pharmazeutische Mittel einen Antikörper, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikro¬ organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridom¬ zellen produziert und freigesetzt wird.
Mit einem erfindungsgemaßen Antikörper können MGC-24 tragende Zellen aus einer Suspension verschiedenartiger Zellen mit den im Stand der Technik bekannten Testverfahren, wie z.B. dem Enzyme linked immunosorbet assay, kurz ELISA, oder dem Radioiπimunoassay, kurz RIA, nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch einen Kit zum Nachweis von Peanut Agglutinin (PNA) - bindendem Zelloberflachenglykoprotein, der einen monoklonalen Antikörper umfaßt, der spezifisch an das native Glykoprotein MGC-24 bindet.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Kits ist dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Kit einen Antikörper umfaßt, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde - wie bereits erwähnt - überraschenderweise gefunden, daß der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung 105A5, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganis¬ men und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, an Stammzellen bindet.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, vorzugsweise des Antikörpers 105A5, zum Nachweis von hamatopoetischen Zellen, sowie einen Kit zum Nachweis von hamatopoetischen Zellen, der einen erfin¬ dungsgemäßen Antikörper, vorzugsweise den Antikörper 105A5, enthält. Dadurch ist es möglich, undifferenzierte CD 34+ Subpopulationen aufzutrennen und für funktionelle Analysen Zellen der erythroiden Reihe bzw. aus dem Knochenmark zu selektieren und aufzureinigen.
Als weiterer überraschender Effekt wurde gefunden, daß die Zugabe von monoklonalem Antikörper 105A5 zu unausgereiften erythroiden Zellen die in-vitro Hämatopoese hemmt.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, vorzugsweise des Antikörpers 105A5, zur Hemmung der Hämatopoese.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach¬ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen das Zelloberflachenglykoprotein MGC-24 Als Antigen werden Zellen der undifferenzierten, megakaryo- blastären Zellinie MOLM-1 verwendet (Matsuo Y, Adachi T, Tsubota T, Imanishi J, Minowada J. Establishment and characterization of a novel megakaryoblastoid cell line, MOLM-1, from a patient with chronic myelogenous leukemia. Human Cell 1991; 4: 261-264) .
Acht Wochen alte Balb/c-Mäuse werden zweimal in Intervallen von 10 Tagen intraperitoneal mit IO7 Zellen der Zellinie MOLM-1 immunisiert. Vier Tage vor der Fusion werden 5 x IO5 Zellen direkt in die Milz appliziert, um die Immunantwort zu verstärken.
Die Antikörper-Bildung im Mausorganismus wird dadurch überprüft, daß das Blutserum des betreffenden Tieres in dem dem Fachmann geläufigen ELISA-Test auf Bindungseigenschaften mit demAntigen untersucht wird.
Nach ca. 3 Wochen werden die Lymphozyten des erfolgreich immunisierten Tieres gewonnen, indem die Milz herausoperiert und zu einer Zellsuspension zerkleinert wird.
Die suspendierten Milzzellen werden in Anwesenheit von Poly¬ ethylenglykol mit Myelomzellen des bekannten Stammes SP2/0 fusio¬ niert. Die Fusionskultur wird in Hypoxanthin-, Aminopterin- und Thymidin- (HAT-)haltigem Medium, hier in HAT-RPMI-1640, kultiviert, in dem sich nur Hybridzellen vermehren können, da diese sowohl die Eigenschaft der Myelomzellen zur unbegrenzten Teilungsfähigkeit als auch die Eigenschaft der Antikörper produzierenden Lymphozyten zum Wachstum in HAT-haltigem Medium haben.
Nach der Fusion werden die Zellen in Napfplatten ausplattiert und bei 37 °C, 5 % Co2 inkubiert. Die Kulturüberstände werden nach 10-14 Tagen auf der MOLM-1 Zellinie im Durchflußzytometer gescreent. In einem zweiten Schritt werden die Überstände auf Reaktivität mit peripheren Blutzellen getestet, da diese keine selektiven Stammzellantigene exprimieren. Überstände, die eine negative oder schwache Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen, werden anschließend auf Reaktivität mit Knochenmarkzellen getestet. Hybridome, die Antikörper mit Spezifität für Knochenmarkzellen produzieren, werden ausgewählt und nach dem bekannten Grenzverdünnungs- verfahren vereinzelt und kultiviert, d.h. kloniert.
Bei dieser Screening-Strategie wird Nutzen aus der Tatsache gezogen, daß im Knochenmark verstärkt undifferenzierte Zellen einschließlich von hamatopoetischen Stammzellen vorkommen.
Positiv reagierende Hybridomzellkulturen werden weiter kulti¬ viert, die Antikörper angereichert, gereinigt und charakte¬ risiert.
Nach der obigen Screening-Strategie wurde der monoklonale Anti¬ körper 105A5 erhalten. Die Isotype wurde über PE-konjugierte Anti-Isotyp-spezifische Antiseren durch direkte Immunfluoreszenz zu IgG3 bestimmt.
Die Produktion, Reinigung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte mit den in Fachkeisen allgemein bekannten Methoden.
Der Antikörper 105A5, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, weist die folgenden charakteristischen Merkmale auf:
Immunglobulinklasse: IgM spezifische Bindungsaffinität an: MGC-24 Beispiel 2: Identifizierung des von dem monoklonalen Anti¬ körper 105A5 erkannten Antigens.
Die Identifizierung des Antigens erfolgte über eine Stroma- Expressionsbibliothek.
Um das Gen zu isolieren, das für das Antigen codiert, das von dem monoklonalen Antikörper 105A5 erkannt wird, wurde eine retro- virale Expressionsbibliothek nach dem Verfahren erstellt, das von Rayner und Gonda in Mol.Cell.Biol. 1994, Band 14, Seite 880 beschrieben wurde. Bei dem hier verwendeten Verfahren wurde mRNA aus kultivierten Stromazellen des menschlichen Knochenmarks verwendet.
cDNA-Transkripte wurden direkt in den retroviralen Plasmid-Vektor pRUF.Neo kloniert. DNA aus der Bibliothek wurde verwendet, um eine amphotrope Wirtszellinie (PA317) zu transfizieren. Über¬ gangsweise erzeugte retrovirale Partikel wurden geerntet und dazu verwendet, eine ecotrope Wirtszellinie stabil zu infizieren. Von diesen Zellen produzierte Viren wurden daraufhin verwendet, um die faktorabhängige hämatopoetische murine Zellinie FDC-Pl zu infizieren.
Infizierte FDC-Pl-Zellen wurden bezüglich der G418-Resistenz ausgewählt, woraufhin Zellen isoliert und angereichert wurden, die das von dem Antikörper 105A5 erkannte Antigen exprimieren. Die Anreicherung von Zellen, die von dem Antikörper erkannt wurden, erfolgte dabei durch Einsatz mehrerer Durchläufe einer immuno-magnetischen Zellsortierung (Dynabeads) . Nach dieser FACS-Sortierung wurden klonale Populationen der transfizierten Zellen etabliert. Daraufhin wurden die proviralen cDNA-Inserts von genomischer DNA der infizierten Zellen zurückgewonnen. Zu diesem Zweck wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei spezifische retro- virale Primer verwendet wurden, die die Klonierungsstelle in dem Plasmidvektor flankieren. Auf diese Weise war es möglich, ein cDNA-Insert von ungefähr 3 kBp zu isolieren.
Eine Sequenzanalyse ergab, daß dieses Insert ein zuvor kloniertes Gen identifizierte, das zu der mucin-Familie gehört, nämlich das MGC-24, das von Masuzawa et al., J. Biochem. 112, 609-615 (1992) , vollständig aufgeklärt wurde.
Beispiel 3: Verwendung des monoklonalen Antikörpers 105A5 zur Hemmung der Hämatopoese in vitro
Um die Funktion der Antigene zu untersuchen, die von dem monoklonalen Antikörper 105A5 erkannt werden, wurde der Anti¬ körper auf seine Fähigkeit hin untersucht, die hämatopoetische Zellentwicklung zu stören.
In einem ersten Versuch wurden gereinigte monoklonale Antikörper in zunehmenden Konzentrationen über den Bereich von 0,01-30 μg/ml zu halb-festen Klonierungslösungen von hamatopoetischen mensch¬ lichen Vorläuferzellen zugegeben. Diese Lösungen wurden unter Verwendung von normalen menschlichen Knochenmarkzellen herge¬ stellt, die das CD34-Antigen exprimieren. Die Reinheit dieser Zellpopulation betrug in allen Versuchen 95-98,5 %.
Die CD34+-Zellen wurden für 14 Tage mit einer anfänglichen Konzentration von 1000 Zellen pro Milliliter in IMDM kultiviert, das durch L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin, Beta-Mercapto- ethanol, 0,9 % (Gewicht/Volumen) Methyl-Zellulose, 1 % Rinder¬ serumalbumin, 30 % (Volumen/Volumen) fötales Kälberserum und 10 ng/ml der folgenden, gereinigten rekombinanten menschlichen Zytokine ergänzt wurde: IL-1, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, SCF und Erythropoetin.
Nach 14 Tagen wurden die Kulturen in Übereinstimmung mit Standardkriterien nach der Anwesenheit von Kolonien durchgezählt, die sich aus Vorlauferzellen von Knochenmarkzellen (CFU-GM) oder erythroiden Zellen (BFU-E) ergaben. Verglichen mit einem bindenden (P4C2) und einem nicht bindenden (AA6) Kontroll- antikörper vom gleichen Isotyp IgG3, der in gleichen Konzen¬ trationen zugegeben wurde, führte der Antikörper 105A5 zu einer dosisabhängigen Inhibierung der Koloniebildung sowohl bei CFU-GM als auch bei BFU-E.
Als zweites wurde der Antikörper daraufhin untersucht, ob er die Hämatopoese in einer Stromazell-abhängigen Langzeitkultur stören kann. Der Antikörper 105A5 oder ein Kontrollantikörper wurden zu Kulturen von Stromazellen aus dem Knochenmark hinzu¬ gegeben. Diese Kulturen wurden aus Knochenmark hergestellt, das von normalen Spendern stammte. Die kultivierten Stromazellen wurden bestrahlt (1500 rad) , um hämapoetische Zellen eine Woche vor dem Start des Experimentes abzutöten. Die Langzeitkultur wurde dann etabliert, indem 3 x IO4 CD34+-Zellen pro Kultur unter Anwesenheit der oben erwähnten Antikörper in einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugegeben wurden.
Eine Woche nach der Zugabe der Antikörper konnte eine voll¬ ständige Blockierung der Hämatopoese in diesem System beobachtet werden, was durch das vollständige Fehlen von nachweisbaren hamatopoetischen Vorläuferzellen und durch den Tod der Stroma¬ zellen angezeigt wurde.

Claims

Patentansprüche
1. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zelloberflachenglykoprotein MGC-24 bindet.
2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß er von Hybridomzellen produziert und frei¬ gesetzt wird, die unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt sind.
3. Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Fähigkeit aufweisen, einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 zu erzeugen.
4. Hybridomzellen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt sind.
5. Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellen, die einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 freisetzen, mit den Schritten:
1. Immunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres, vorzugsweise einer Maus vom Balb/c-Stamm, mit dem Antigen bzw. Immunogen;
2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen, vorzugswseise der Milzlymphozyten dieses Tieres; 3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, immortalisierten Zellinie, vorzugsweise einer Myelomzellinie, zu Hybridomzellen; und
4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridomzellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet,
dadurch gekennzeichnet, daß das Tier mit Zellen der undifferenzierten, megakaryoblastären Zellinie MOLM-1 immunisiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Vereinzelung solche Hybridomzellen ausgewählt werden, die Antikörper mit einer Spezifität für Knochen¬ markzellen produzieren.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß nur solche Hybridomzellen auf die Spezifität der von ihnen produzierten Antikörper mit Knochenmarkzellen getestet werden, bei denen zuvor nachgewiesen wurde, daß dieser Antikörper eine schwache oder bevorzugt eine negative Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigt.
8. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur diagnostischen Behandlung von Tumoren, insbeson¬ dere von Magen- und Coloncarcinomen.
9. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur therapeutischen Behandlung von Tumoren, insbe¬ sondere von Magen- und Coloncarcinomen.
10. Pharmazeutisches Mittel zur diagnostischen Behandlung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
11. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 10, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Antikörper an ein zellulär zielgerichtetes Therapeutikum gekoppelt ist.
12. Pharmazeutisches Mittel zur therapeutischen Behandlung von Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
13. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß der Antikörper an ein zellulär zielgerichtetes Diagnostikum gekoppelt ist.
14. Kit zum Nachweis von Peanut Agglutinin (PNA) -bindendem Zelloberflachenglykoprotein, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
15. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zum Nachweis von hamatopoetischen Zellen.
16. Kit zum Nachweis von hamatopoetischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 oder 2 enthält.
17. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Hemmung der Hämatopoese.
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