EP1407040A2 - Device and method for detecting photosynthesis inhibition - Google Patents

Device and method for detecting photosynthesis inhibition

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Publication number
EP1407040A2
EP1407040A2 EP02743243A EP02743243A EP1407040A2 EP 1407040 A2 EP1407040 A2 EP 1407040A2 EP 02743243 A EP02743243 A EP 02743243A EP 02743243 A EP02743243 A EP 02743243A EP 1407040 A2 EP1407040 A2 EP 1407040A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
planar layer
cells
cell parts
layer
photosynthesis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02743243A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Wolfgang Kreiss
Mark Wilhelm Drewes
Günther EBERZ
Norbert Caspers
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Innovation GmbH
Original Assignee
Bayer CropScience AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer CropScience AG filed Critical Bayer CropScience AG
Publication of EP1407040A2 publication Critical patent/EP1407040A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5097—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics

Definitions

  • the geometry of the test device is an obstacle to massive parallelization and miniaturization. Again, mixtures of substances can only be assessed summarily.
  • EP 588 139 AI describes a test for mixtures of substances. The biological
  • the effect of the substances in a mixture of substances is checked by a combination of chromatographic separation of the mixture of substances into the substances to be tested into chromatographic zones and a subsequent test of the biological effect (toxicity) of the individual separated fractions.
  • the individual fractions are in contact with
  • Luminous microorganisms brought by a local change in their bio luminescence on the individual fractions indicate the biological effect of this fraction.
  • EP 1 043 582 A2 The possibility of parallelizing and miniaturizing effect tests is described in EP 1 043 582 A2.
  • a sensor layer which consists of a diffusion-controlling matrix and effect sensors suspended therein. When this sensor layer comes into contact with samples, the biological activity of the test substances is indicated by optical signals.
  • the object of the invention is to provide a device and a method for the detection of photosynthesis-inhibiting substances, which enables a significantly higher sample throughput and a miniaturization compared to the prior art.
  • the object of the invention is achieved by a method for detecting the photosynthesis-inhibiting action of substances comprising the steps
  • test substance to the planar layer or in the planar
  • the cells can be made from algae, microalgae, bacteria, in particular cyanobacteria with a photosynthesis system, plant cell cultures or plant homogenates come.
  • the procedure also works with cells that are damaged in their vitality as long as an intact Photosystem II (PS II) is present.
  • PS II Photosystem II
  • the cells can also come from selected mutants or from genetically modified organisms.
  • the planar layer is preferably a gel layer.
  • the planar layer preferably has a thickness in the range from 0.1 mm to 10 mm.
  • the introduction of the cells or the cell parts into a planar layer can be done by embedding e.g. of green algae in agarose or acrylate gels or other gel formers or viscous media.
  • test substance is applied to the planar layer or into the planar layer, for example by means of syringe techniques or by pin tools or suitable printing techniques (jet systems etc.), preferably in the form of spots.
  • Luminescence is fluorescence and / or phosphorescence (time-delayed luminescence).
  • the measurement of the phosphorescence offers advantages compared to the fluorescence measurement, since there is no effort for the discrimination of excitation and emission.
  • fluorescence measurement has the advantage of greater sensitivity to detection.
  • Both white light sources are suitable as excitation light sources, e.g. Halogen light or fluorescent tubes as well as light sources that emit in a narrow spectral range, e.g. LEDs.
  • Daylight can also serve as the excitation light source.
  • the excitation can take place continuously or in a pulsed mode (pulse modulation technique).
  • the detection is carried out with instruments which are capable of imaging the emitted luminescence in the wavelength range of> 680 nm with sufficient sensitivity (eg Vidicon system, CCD camera, scanner, phosphor imager, photographic film). Time-resolved light measurements can also be carried out, if necessary, together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
  • instruments which are capable of imaging the emitted luminescence in the wavelength range of> 680 nm with sufficient sensitivity (eg Vidicon system, CCD camera, scanner, phosphor imager, photographic film).
  • Time-resolved light measurements can also be carried out, if necessary, together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
  • an additional exposure or a dark phase can be used to control the photosynthetic activity.
  • Photosynthesis-inhibiting test substances which are applied to or in the planar layer according to the invention influence the luminescence behavior of the photosynthesis pigment complex. Spots of
  • Photosynthesis inhibitors such as atrazine can be e.g. by significantly weakening the time-delayed luminescence (phosphorescence) with video imaging methods, simply and simultaneously prove its effect for a large number of spots.
  • the increased fluorescence of the photopigments when the photosynthesis system II is inhibited can also serve to image the PS II-active substance spots.
  • the invention further relates to a system for the detection of the photosynthesis-inhibiting action of substances according to the method according to the invention, containing
  • Excitation light source for excitation of the luminescence of the cells or of the cell parts in the planar layer
  • Detector for measuring the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer - evaluation means for assigning the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition.
  • the means for applying the test substance to the planar layer or into the planar layer can be, for example, syringe systems, steel needles (pin tools) or suitable pressure stamps and jet systems.
  • the evaluation can be done visually or by means of suitable image processing techniques.
  • the invention further relates to a test strip or sensor chip for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of substances according to the inventive method containing a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem, after the application of the test substance to the planar layer or in the planar layer, and subsequent excitation of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by an excitation light source, and measurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer with a detector from which the degree of photosynthesis inhibition can be determined from the detector signal.
  • the planar layer of the test strip or sensor chip preferably consists of green algae in agarose or acrylate gels. In this way, stable detection layers can be produced, which retain their function as a test system for the photosynthesis-inhibiting effect even when stored for longer periods.
  • An advantage of the method according to the invention is a high level of miniaturization and parallelization of the detection method for photosynthesis-inhibiting substances.
  • a high sample throughput can be achieved by the parallelization.
  • the spatially resolving action detection enables photosynthesis-inhibiting substances as components of mixtures of substances to be identified without interference in thin-layer chromatograms or electropherograms by first subjecting the mixture of substances to a chromatographic or electrophoretic separation on a thin-layer chromatography plate or an electrophoresis layer and then using the process according to the invention Claim 15 the photosynthesis-inhibiting effect of the fractions is examined.
  • the spatially resolving action detection also makes it possible to apply photosynthesis-inhibiting substances to different locations on a support and to investigate the photosynthesis-inhibiting action of these spots using the method according to the invention.
  • the method according to the invention can be used in drug discovery to optimize photosynthesis inhibitors.
  • Another area of application is, for example, the specific measurement of herbicidal activity in wastewater and environmental samples due to pollutants.
  • a thin agarose layer (approx. 4 mm layer height) in which green algae (Scenedesmus subspicatus) had been suspended was used to detect the photosynthesis-inhibiting effect.
  • the green algae were grown as follows:
  • the algae are inoculated from a preserve of Scenedesmus subspicatus into a sterile 100 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of culture medium.
  • the solution is then incubated at 23 ° C. and at 125 rpm in a climatic cabinet equipped with fluorescent tubes under the action of light for 7 days.
  • the growth medium contains: 58 mg / 1 sodium carbonate
  • 25 ml of the algae suspension (optical density approx. 2 mAU) are homogeneously mixed with 15 ml of 1% agarose MP solution (Boehringer Mannheim GmbH Art. No. 1388983) at temperatures below 40 ° C. Before cooling, this suspension is placed in a single well plate (Nalge Nunc, Omni Tray Single Well 86 x 128 mm).
  • a gel layer with uniformly suspended algae forms there on cooling.
  • This detection layer can be used immediately or after several weeks of storage to measure the photosynthesis inhibitory effect.
  • test substances from a microtiter plate were stamped onto the algal layer using a 96-fold pin tool (Nalge Nunc 96 pin replicator).
  • the sample assignment of the microtiter plate (see Table 1) also defines the position of the respective substance on the algal layer.
  • the test substances were in the microtiter plate as a DMSO solution (100 ⁇ mol
  • Table 1 Parallel detection of the effect of substances by fluorescence imaging on a 96-well microtiter plate with an algae layer
  • a video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the fluorescence image.
  • the single well plate was placed on a light table, the white light source of which was limited to a wavelength below 475 nm using a filter (Omega 475 RDF 40).
  • the camera lens was equipped with a filter that allows light above 680 nm to pass (Andover P / N: 680FS 10-50). The fluorescence excitation and the camera recording took place simultaneously for a period of 1 second. The evaluation of the
  • the fluorescence image shows 22 bright spots (see Figure 1).
  • the substances deposited there cause an increase in fluorescence due to their interaction with the photosystem.
  • Metamitron a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. All noticed in this parallel assay
  • the algae layer was produced as in Example 1.
  • the same test substances as in Example 1 and in identical positioning were applied to the algal layer.
  • the incubation was also carried out for 15 minutes.
  • a video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the phosphorescence image.
  • the NUNC plate was placed on a light table that was equipped with a white light source. No filters were used in front of the camera lens to record the phosphorescent light.
  • the algae layer was exposed for 90 seconds to stimulate phosphorescence. After a waiting time of 15 seconds, the camera was recorded with a recording time of 30 seconds.
  • the phosphorescence image was evaluated visually on the screen of the video imaging system.
  • TIFF files were formatted and labeled with suitable graphics programs (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint
  • the phosphorescence image shows 22 dark spots (see Figure 2).
  • the substances deposited there cause a faster decay of the phosphorescence due to their interaction with the photosystem.
  • Metamitron a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. The results are in good agreement with the results of fluorescence imaging (see also Example 1). All substances found in this parallel assay are inhibitors of the

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Abstract

A method, system and test strip for detecting photosynthesis inhibition in substances by providing cells or parts of cells with an intact photosystem, inserting said cells or cell parts into a planar layer, placing the test substance on the planar layer or inside the planar layer, exciting the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by an exciting light source, measuring the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by means of a detector and associating the detector signal with the degree of photosynthesis inhibition.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-HemmungDevice and method for the detection of photosynthesis inhibition
Die Inhibierung der Photosynthese von Pflanzen durch herbizid wirksame Substan- zen ist ein wichtiger Parameter für die ökotoxikologische Bewertung von Substanzen einerseits und für die Suche nach herbizid wirksamen Substanzen in der Pflanzenschutzforschung andererseits. Leistungsfähige Messtechniken für die rasche Erfassung der Photosynthese-hemmenden Wirkung besitzen daher bei der ökotoxikologischen Bewertung von Substanzen und als Screeningverfahren für die Suche nach neuen Pflanzenschutzwirkstoffen eine große Bedeutung.The inhibition of photosynthesis of plants by herbicidally active substances is an important parameter for the ecotoxicological evaluation of substances on the one hand and for the search for herbicidally active substances in crop protection research on the other hand. Efficient measuring techniques for the rapid detection of the photosynthesis-inhibiting effect are therefore of great importance in the ecotoxicological evaluation of substances and as a screening process for the search for new crop protection agents.
Zur Prüfung auf Photosynthese-hemmende Wirkung sind verschiedene Tests sowohl an höheren Pflanzen wie auch an Mikroalgen bekannt. Die bekannten Messprinzipien beruhen dabei u. a. auf der Chlorophyll-Fluoreszenz oder auf der Messung der photo- synthetischen Sauerstoffproduktion (B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbizide,Various tests are known for testing plants for inhibiting photosynthesis, both on higher plants and on microalgae. The known measuring principles are based u. a. on chlorophyll fluorescence or on the measurement of photosynthetic oxygen production (B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, herbicides,
Georg Thieme Verlag, 1995, 54 u. 112-114; D. Merz, M. Geyer, D. A. Moss, H.-J. Ache, Fresenius J. Anal. Chem, 1996, 354: 299-305). Diese den Stand der Technik repräsentierenden Verfahren weisen durchweg Begrenzungen auf, die Hochdurchsatzmessungen, wie sie beim Wirkstoffscreening durchgeführt werden, Miniaturisie- rungen z.B. Hochparallelisierung oder eine direkte Kopplungen mit analytischenGeorg Thieme Verlag, 1995, 54 a. 112-114; D. Merz, M. Geyer, D.A. Moss, H.-J. Ache, Fresenius J. Anal. Chem, 1996, 354: 299-305). These methods, which represent the state of the art, all have limitations, the high-throughput measurements, such as are carried out during drug screening, miniaturization e.g. High parallelization or a direct coupling with analytical
Separationstechniken zur Wirkungsdetektion in Stoffgemischen nicht zulassen.Do not allow separation techniques for effect detection in substance mixtures.
Die Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz ist als Standard-Verfahren zur Untersuchung des Photosynthese-Prozesses etabliert. Die hier angewendeten Verfahren arbeiten mit Fluorimetern, die wegen ihrer auf Sonden- oder Küvetten-Messungen beruhenden Methodik lediglich serielle Messungen zulassen und damit für Hochdurchsatz-Anwendungen nicht geeignet sind. Darüber hinaus lassen sich solche Verfahren auch nur schwer miniaturisieren. Typische Instrumente für diese Technik werden u. a. von den nachfolgend genannten Herstellern angeboten: ADC BioScientific Ltd., Hansatech Instruments, Heinz Walz GmBH, Qubit Systems Inc. Beim DF-Algentest werden Wasserproben mit Grünalgen versetzt und anschließend luminometrisch vermessen (Methoden der biologischen Wasseruntersuchung, Band 2: Biologische Gewässeruntersuchung, G. Fischer Verlag, 1999, Seite 386-388). Dabei wird zunächst die Abklingkinetik für die zeitverzögerte Lumineszenz des Photosynthese-Pigmentkomplexes ermittelt. Durch Vergleich mit der entsprechendenThe measurement of chlorophyll fluorescence has been established as the standard method for studying the photosynthesis process. The methods used here work with fluorimeters which, because of their method based on probe or cuvette measurements, only allow serial measurements and are therefore not suitable for high-throughput applications. In addition, such processes are also difficult to miniaturize. Typical instruments for this technology are offered by the following manufacturers, among others: ADC BioScientific Ltd., Hansatech Instruments, Heinz Walz GmBH, Qubit Systems Inc. In the DF algae test, green algae are added to water samples and then measured luminometrically (Methods of biological water analysis, Volume 2: Biological water analysis, G. Fischer Verlag, 1999, pages 386-388). First, the decay kinetics for the time-delayed luminescence of the photosynthetic pigment complex are determined. By comparison with the corresponding one
Abklingkinetik für eine unbelastete Referenzprobe wird auf die Gegenwart von Photosynthese-hemmenden Substanzen geschlossen. Dieses Verfahren kann Proben lediglich seriell bearbeiten und ist daher für Hochdurchsatzmessungen nicht geeignet.Decay kinetics for an unloaded reference sample are concluded from the presence of photosynthesis-inhibiting substances. This method can only process samples in series and is therefore not suitable for high-throughput measurements.
Eine weitere Einschränkung betrifft das für den DF-Algentest notwendige Probenvolumen, das bedingt durch die Dimensionierung der Messapparatur in der Größenordnung von Millilitern liegt. Eine Miniaturisierung ist mit diesem Verfahren nicht möglich. Weiterhin werden Stoffgemische, wie sie für reale Proben typisch sind, von diesem Verfahren lediglich summarisch erfasst. Auf Grund möglicher Interaktionen zwischen den Probeninlialtsstoffen besteht das Risiko für falsch positive Resultate.Another limitation concerns the sample volume required for the DF algae test, which, due to the dimensioning of the measuring apparatus, is of the order of milliliters. Miniaturization is not possible with this procedure. Furthermore, mixtures of substances that are typical for real samples are only summarized by this method. Due to possible interactions between the sample materials, there is a risk of false positive results.
Bekannt sind auch Tests an höheren Pflanzen (siehe z.B. W. Bilger, U. Schreiber, M. Bock, Oecologia 102, 1995, S. 425-432) . Diese Tests machen eine Aussage» zur Photosynthese-Hemmung über ein Fluoreszenz-Messverfahren. Auch hier stellt dieTests on higher plants are also known (see, for example, W. Bilger, U. Schreiber, M. Bock, Oecologia 102, 1995, pp. 425-432). These tests make a statement »about photosynthesis inhibition using a fluorescence measurement method. Here too, the
Geometrie der Testvorrichtung ein Hindernis für die massive Parallelisierung und die Miniaturisierung dar. Stoffgemische können wieder nur summarisch beurteilt werden.The geometry of the test device is an obstacle to massive parallelization and miniaturization. Again, mixtures of substances can only be assessed summarily.
In EP 588 139 AI wird ein Test für Stoffgemische beschrieben. Die biologischeEP 588 139 AI describes a test for mixtures of substances. The biological
Wirkung der Substanzen in einem Stoffgemisch wird geprüft durch eine Kombination von chromatographischer Auftrennung des Stoffgemischs in die zu testenden Substanzen in chromatographische Zonen und einem anschließenden Test der biologischen Wirkung (Toxizität) der einzelnen aufgetrennten Fraktionen. Bei dem Test der biologischen Wirkung werden die einzelnen Fraktionen in Kontakt mitThe effect of the substances in a mixture of substances is checked by a combination of chromatographic separation of the mixture of substances into the substances to be tested into chromatographic zones and a subsequent test of the biological effect (toxicity) of the individual separated fractions. When testing the biological effect, the individual fractions are in contact with
Leuchtmikroorganismen gebracht, die durch eine lokale Änderung ihrer Bio- lumineszenz an den einzelnen Fraktionen die biologische Wirkung dieser Fraktion anzeigen.Luminous microorganisms brought by a local change in their bio luminescence on the individual fractions indicate the biological effect of this fraction.
Die Möglichkeit der Parallelisierung und Miniaturisierung von Wirkungstests wird in EP 1 043 582 A2 beschrieben. Nach dem in EP 1 043 582 A2 offenbarten Verfahren wird eine Sensorschicht eingesetzt, die aus einer diffusionskontrollierenden Matrix und darin suspendierten Wirkungssensoren besteht. Beim Kontakt dieser Sensorschicht mit Proben wird die biologische Aktivität der Prüfsubstanzen durch optische Signale angezeigt.The possibility of parallelizing and miniaturizing effect tests is described in EP 1 043 582 A2. According to the method disclosed in EP 1 043 582 A2, a sensor layer is used which consists of a diffusion-controlling matrix and effect sensors suspended therein. When this sensor layer comes into contact with samples, the biological activity of the test substances is indicated by optical signals.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erfassung von Photosynthese-hemmenden Substanzen bereitzustellen, das einen gegenüber dem Stand der Technik deutlich höheren Probendurchsatz und eine Mmiaturisierung ermöglicht.The object of the invention is to provide a device and a method for the detection of photosynthesis-inhibiting substances, which enables a significantly higher sample throughput and a miniaturization compared to the prior art.
Die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe besteht in einem Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend die SchritteThe object of the invention is achieved by a method for detecting the photosynthesis-inhibiting action of substances comprising the steps
- Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,Provision of cells or cell parts with an intact photosystem,
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht,Placing the cells or cell parts in a planar layer,
Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planareApplication of the test substance to the planar layer or in the planar
Schicht,Layer,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle,Excitation of the luminescence of the cells or of the cell parts in the planar layer by an excitation light source,
Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planarenMeasurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar
Schicht mit einem DetektorLayer with a detector
Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.Assignment of the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition.
Die Zellen können aus Algen, Mikroalgen, Bakterien insbesondere Cyanobakterien mit einem Photosynthesesystem, Pflanzenzellkulturen oder Pflanzenhomogenisat stammen. Das Verfahren arbeitet auch mit Zellen, die in ihrer Vitalität geschädigt sind, solange ein intaktes Photosystem II ( PS II) vorliegt.The cells can be made from algae, microalgae, bacteria, in particular cyanobacteria with a photosynthesis system, plant cell cultures or plant homogenates come. The procedure also works with cells that are damaged in their vitality as long as an intact Photosystem II (PS II) is present.
Die Zellen können auch aus selektionierten Mutanten oder aus gentechnisch veränderten Organismen stammen.The cells can also come from selected mutants or from genetically modified organisms.
Die planare Schicht ist vorzugsweise eine Gelschicht. Die planare Schicht hat vorzugsweise eine Dicke im Bereich von 0,1 mm bis 10 mm. Das Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht kann durch Einbettung z.B. von Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgele oder andere Gelbildner oder viskose Medien erfolgen.The planar layer is preferably a gel layer. The planar layer preferably has a thickness in the range from 0.1 mm to 10 mm. The introduction of the cells or the cell parts into a planar layer can be done by embedding e.g. of green algae in agarose or acrylate gels or other gel formers or viscous media.
Das Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht erfolgt zum Beispiel mittels Spritzentechniken oder durch Pin-Tools oder geeignete Drucktechniken (Jetsysteme etc.), bevorzugt in Form von Spots.The test substance is applied to the planar layer or into the planar layer, for example by means of syringe techniques or by pin tools or suitable printing techniques (jet systems etc.), preferably in the form of spots.
Bei der Lumineszenz handelt es sich um Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz (zeitverzögerte Lumineszenz). Die Messung der Phosphoreszenz bietet im Vergleich zur Fluoreszenzmessung Vorteile, da kein Aufwand für die Diskriminierung von Anregung und Emission entsteht. Andererseits besitzt die Fluoreszenzmessung den Vor- teil größerer Nachweisempfindlichkeit.Luminescence is fluorescence and / or phosphorescence (time-delayed luminescence). The measurement of the phosphorescence offers advantages compared to the fluorescence measurement, since there is no effort for the discrimination of excitation and emission. On the other hand, fluorescence measurement has the advantage of greater sensitivity to detection.
Als Anregungslichtquelle eignen sich sowohl Weißlichtquellen, z.B. Halogenlicht oder Leuchtstoffröhren wie auch Lichtquellen, die in einem schmalen Spektralbereich emittieren, z.B. Leuchtdioden. Als Anregungslichtquelle kann auch Tageslicht dienen. Die Anregung kann kontinuierlich oder in einem gepulsten Modus (Pulsmodulationstechnik) erfolgen.Both white light sources are suitable as excitation light sources, e.g. Halogen light or fluorescent tubes as well as light sources that emit in a narrow spectral range, e.g. LEDs. Daylight can also serve as the excitation light source. The excitation can take place continuously or in a pulsed mode (pulse modulation technique).
Die Detektion erfolgt mit Instrumenten, die zu einer Abbildung der emittierten Lumineszenz im Wellenlängenbereich von > 680 nm mit hinreichender Empfindlich- keit in der Lage sind (z.B. Vidicon-System, CCD-Kamera, Scanner, Phosphorimager, photographischer Film). Es können auch zeitaufgelöste Lichtmessungen gegebenenfalls zusammen mit gepulster Anregung und Korrelation von Anregung und Messung durchgeführt werden.The detection is carried out with instruments which are capable of imaging the emitted luminescence in the wavelength range of> 680 nm with sufficient sensitivity (eg Vidicon system, CCD camera, scanner, phosphor imager, photographic film). Time-resolved light measurements can also be carried out, if necessary, together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
Unabhängig von der Anregungsbelichtung kann eine zusätzliche Belichtung oder eine Dunkelphase zur Steuerung der Photosyntheseaktivität eingesetzt wird.Regardless of the excitation exposure, an additional exposure or a dark phase can be used to control the photosynthetic activity.
Photosynthese-hemmende Prüfsubstanzen, die auf oder in die erfindungsgemäße planare Schicht aufgebracht werden, beeinflussen das Lumineszenzverhalten des Photosynthese-Pigment-Komplexes. Auf die planare Schicht aufgegebene Spots vonPhotosynthesis-inhibiting test substances which are applied to or in the planar layer according to the invention influence the luminescence behavior of the photosynthesis pigment complex. Spots of
Photosynthese-Hemmern wie Atrazin lassen sich z.B. durch signifikante Schwächung der zeitverzögerten Lumineszenz (Phosphoreszenz) mit Video-Imaging- verfahren einfach und für eine große Zahl von Spots gleichzeitig über ihre Wirkung nachweisen. Alternativ hierzu kann auch die verstärkte Fluoreszenz der Photo- pigmente bei Inhibierung des Photosynthesesystems II zur Abbildung der PS II- aktiven Substanzspots dienen.Photosynthesis inhibitors such as atrazine can be e.g. by significantly weakening the time-delayed luminescence (phosphorescence) with video imaging methods, simply and simultaneously prove its effect for a large number of spots. As an alternative to this, the increased fluorescence of the photopigments when the photosynthesis system II is inhibited can also serve to image the PS II-active substance spots.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein System zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Ver- fahren, enthaltendThe invention further relates to a system for the detection of the photosynthesis-inhibiting action of substances according to the method according to the invention, containing
eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht,a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem, means for applying the test substance to the planar layer or into the planar layer,
Anregungslichtquelle zur Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht,Excitation light source for excitation of the luminescence of the cells or of the cell parts in the planar layer,
Detektor zur Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht, - Auswertemittel zur Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung. Die Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht können z.B. Spritzensysteme, Stahlnadeln (Pin-Tools) oder geeignete Druckstempel sowie Jet-Systeme sein.Detector for measuring the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer, - evaluation means for assigning the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition. The means for applying the test substance to the planar layer or into the planar layer can be, for example, syringe systems, steel needles (pin tools) or suitable pressure stamps and jet systems.
Die Auswertung kann visuell oder mittels geeigneter Bildverarbeitungstechniken erfolgen.The evaluation can be done visually or by means of suitable image processing techniques.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Teststreifen oder Sensor-Chip zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren enthaltend eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, wobei nach dem Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht, und nachfolgender Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle, und Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor, aus dem Detektorsignal der Grad der Photosynthese-Hemmung bestimmbar ist.The invention further relates to a test strip or sensor chip for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of substances according to the inventive method containing a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem, after the application of the test substance to the planar layer or in the planar layer, and subsequent excitation of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by an excitation light source, and measurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer with a detector from which the degree of photosynthesis inhibition can be determined from the detector signal.
Die planare Schicht des Teststreifens oder Sensor-Chips besteht bevorzugt aus Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgelen. Auf diese Weise lassen sich stabile Detek- tionsschichten herstellen, die ihre Funktion als Testsystem für die Photosynthese- Hemmwirkung auch bei Lagerung über längere Zeiträume beibehalten.The planar layer of the test strip or sensor chip preferably consists of green algae in agarose or acrylate gels. In this way, stable detection layers can be produced, which retain their function as a test system for the photosynthesis-inhibiting effect even when stored for longer periods.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine hohe Miniaturisierung und Parallelisierung des Nachweisverfahrens für Photosynthese-hemmende Substanzen.An advantage of the method according to the invention is a high level of miniaturization and parallelization of the detection method for photosynthesis-inhibiting substances.
Durch die Parallelisierung kann ein hoher Probendurchsatz erzielt werden. Durch dieA high sample throughput can be achieved by the parallelization. Through the
Miniaturisierung kann ein erheblich geringerer Verbrauch an Materialien erreicht werden.Miniaturization can achieve a significantly lower consumption of materials.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, mehrere tausend Substanzspots auf einer Fläche von 9 cm * 12 cm aufzubringen und damit neben der Paralleli- sierung einen Miniaturisierungsgrad von < 10 ng Prüfsubstanz in weniger als 500 nl Testvolumen zu erreichen.With the method according to the invention, it is possible to apply several thousand substance spots on an area of 9 cm * 12 cm and thus in addition to the parallel a degree of miniaturization of <10 ng test substance in less than 500 nl test volume.
Die ortsauflösende Wirkungserfassung erlaubt es, Photosynthese-hemmende Sub- stanzen als Komponenten von Stoffgemischen störungsfrei in Dünnschichtchromato- grammen oder Elektropherogrammen zu identifizieren, indem zunächst das Stoffgemisch einer chromatographischen oder elektrophoretischen Trennung auf einer Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektrophoreseschicht unterworfen wird und anschließend nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 15 die Photosynthese-hemmende Wirkung der Fraktionen untersucht wird.The spatially resolving action detection enables photosynthesis-inhibiting substances as components of mixtures of substances to be identified without interference in thin-layer chromatograms or electropherograms by first subjecting the mixture of substances to a chromatographic or electrophoretic separation on a thin-layer chromatography plate or an electrophoresis layer and then using the process according to the invention Claim 15 the photosynthesis-inhibiting effect of the fractions is examined.
Die ortsauflösende Wirkungserfassung erlaubt es auch, Photosynthese-hemmende Substanzen auf verschiedene Orte eines Trägers aufzugeben und Photosynthese- hemmende Wirkung dieser Spots mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu untersuchen.The spatially resolving action detection also makes it possible to apply photosynthesis-inhibiting substances to different locations on a support and to investigate the photosynthesis-inhibiting action of these spots using the method according to the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Wirkstoffforschung zur Optimierung von Photosynthese-Hemmern eingesetzt werden. Ein weiteres Einsatzfeld bildet zum Beispiel die spezifische Messung der auf Schadstoffe zurückzuführenden herbiziden Aktivität in Abwässern und Umweltproben. The method according to the invention can be used in drug discovery to optimize photosynthesis inhibitors. Another area of application is, for example, the specific measurement of herbicidal activity in wastewater and environmental samples due to pollutants.
Figuren und BeispieleFigures and examples
Beispiel 1example 1
In Beispiel 1 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der spezifische Nachweis photosynthesehemmender Substanzen mittels induzierter Fluoreszenz in dem erfindungsgemäßen Schichtsystem gezeigt.In example 1, the specific detection of photosynthesis-inhibiting substances by means of induced fluorescence in the layer system according to the invention is shown by the method according to the invention.
Zur Detektion der Photosynthese-Hemmwirkung wurde eine dünne Agaroseschicht (ca. 4 mm Schichthöhe), in die Grünalgen (Scenedesmus subspicatus) suspendiert worden waren, eingesetzt.A thin agarose layer (approx. 4 mm layer height) in which green algae (Scenedesmus subspicatus) had been suspended was used to detect the photosynthesis-inhibiting effect.
Die Grünalgen wurden folgendermaßen angezüchtet:The green algae were grown as follows:
Aus einer Stammkonserve Scenedesmus subspicatus werden die Algen in einen sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben, der 50 ml Anzucht-Medium enthält überimpft.The algae are inoculated from a preserve of Scenedesmus subspicatus into a sterile 100 ml Erlenmeyer flask containing 50 ml of culture medium.
Anschließend wird die Lösung bei 23 °C und bei 125 rpm in einem mit Leuchtstoffröhren ausgerüsteten Klimaschrank unter Lichteinwirkung für 7 Tage inkubiert.The solution is then incubated at 23 ° C. and at 125 rpm in a climatic cabinet equipped with fluorescent tubes under the action of light for 7 days.
Das Anzucht-Medium enthält: 58 mg/1 NatriumcarbonatThe growth medium contains: 58 mg / 1 sodium carbonate
496 mg/1 Natriumnitrat496 mg / 1 sodium nitrate
39 mg/1 Kaliumhydrogenphosphat39 mg / 1 potassium hydrogen phosphate
75 mg/1 Magnesiumsulfatheptahydrat75 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate
36 mg/1 Calciumchloriddihydrat 10 mg/1 Titriple III36 mg / 1 calcium chloride dihydrate 10 mg / 1 Titriple III
3 mg/1 Zitronensäure und wird mit Hilfe von 1 N HC1 bzw. 1 N NaOH auf pH 7,5 ± 0,2 eingestellt. Das3 mg / 1 citric acid and is adjusted to pH 7.5 ± 0.2 with the aid of 1 N HC1 or 1 N NaOH. The
Medium wird vor Gebrauch bei 121 °C für 20 min autoklaviert. Herstellung der Algenschicht:Medium is autoclaved at 121 ° C for 20 min before use. Production of the algae layer:
25 ml der Algensuspension (optische Dichte ca. 2 mAU) werden bei Temperaturen unter 40°C mit 15 ml 1 % Agarose MP -Lösung (Boehringer Mannheim GmbH Art. Nr. 1388983) homogen gemischt. Diese Suspension wird vor dem Erkalten in eine Single Well-Platte (Nalge Nunc, Omni Tray Single Well 86 x 128 mm) gegeben.25 ml of the algae suspension (optical density approx. 2 mAU) are homogeneously mixed with 15 ml of 1% agarose MP solution (Boehringer Mannheim GmbH Art. No. 1388983) at temperatures below 40 ° C. Before cooling, this suspension is placed in a single well plate (Nalge Nunc, Omni Tray Single Well 86 x 128 mm).
Dort bildet sich beim Abkühlen eine Gelschicht mit gleichförmig suspendierten Algen aus. Diese Detektionsschicht kann sofort oder auch nach mehreren Wochen Lagerung zur Messung der Photosynthese-Hemmwirkung eingesetzt werden.A gel layer with uniformly suspended algae forms there on cooling. This detection layer can be used immediately or after several weeks of storage to measure the photosynthesis inhibitory effect.
Substanztransfer auf Detektionsschicht und Inkubation:Substance transfer to the detection layer and incubation:
Für den erfindungsgemäßen parallelen Wirkungstest wurden Testsubstanzen aus einer Mikrotiterplatte mit einem 96-fach Pintool (Nalge Nunc 96 Pin Replicator) auf die Algenschicht gestempelt. Die Probenbelegung der Mikrotiterplatte (siehe Tabelle 1) legt damit auch die Position der jeweiligen Substanz auf der Algenschicht. Dabei lagen die Testsubstanzen in der Mikrotiterplatte als DMSO-Lösung (100 μMolFor the parallel activity test according to the invention, test substances from a microtiter plate were stamped onto the algal layer using a 96-fold pin tool (Nalge Nunc 96 pin replicator). The sample assignment of the microtiter plate (see Table 1) also defines the position of the respective substance on the algal layer. The test substances were in the microtiter plate as a DMSO solution (100 μmol
Substanz in 100 μl je Well) vor. Mit dem Pin Tool wurden jeweils ca. 0,5 μl Probelösung je Pin auf die Detektionsschicht übertragen. Vor der Fluoreszenzmessung wurde die bestempelte Detektionsschicht bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Substance in 100 μl per well). Approx. 0.5 μl sample solution per pin was transferred to the detection layer using the Pin Tool. Before the fluorescence measurement, the stamped detection layer was incubated at room temperature for 15 minutes.
Tabelle 1: Parallele Detektion der Wirkung von Substanzen durch Fluoreszenzimaging auf 96er-Mikrotiterplatte mit AlgenschichtTable 1: Parallel detection of the effect of substances by fluorescence imaging on a 96-well microtiter plate with an algae layer
Parallele Detektion der Wirkung durch Fluoreszenzimaging: Parallel detection of the effect by fluorescence imaging:
Zur Aufnahme des Fluoreszenz-Bildes wurde ein Videoimaging System (Molecular Light Imager NightOWL von PerkinElmer Life Sciences) eingesetzt. Für die Messung wurde die Single Well-Platte auf einen Leuchttisch plaziert, dessen Weißlichtquelle mit einem Filter (Omega 475 RDF 40) auf Wellenlängen unterhalb von 475 nm begrenzt wurde. Zur selektiven Erfassung des Fluoreszenzlichts wurde das Kameraobjektiv mit einem Filter ausgerüstet, der Licht oberhalb 680 nm passieren lässt (Andover P/N: 680FS 10-50). Die Fluoreszenzanregung und die Kameraauf- nähme erfolgten simultan für einen Zeitraum von 1 Sekunde. Die Auswertung desA video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the fluorescence image. For the measurement, the single well plate was placed on a light table, the white light source of which was limited to a wavelength below 475 nm using a filter (Omega 475 RDF 40). To selectively record the fluorescent light, the camera lens was equipped with a filter that allows light above 680 nm to pass (Andover P / N: 680FS 10-50). The fluorescence excitation and the camera recording took place simultaneously for a period of 1 second. The evaluation of the
Fluoreszenzbildes erfolgte visuell am Bildschirm des Videoimagingsystems. Zur Dokumentation wurden TIFF-Files mit geeigneten Grafikprogrammen formatiert und beschriftet (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint 97).Fluorescence image was made visually on the video imaging system screen. For documentation purposes, TIFF files were formatted and labeled with suitable graphics programs (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint 97).
Ergebnisse:Results:
Das Fluoreszenz-Image zeigt 22 helle Spots (siehe Figur 1). Die dort deponierten Substanzen bewirken auf Grund ihrer Wechselwirkung mit dem Photosystem eine Steigerung der Fluoreszenz. Auf den Positionen F12,G12, H12 war als Referenzsubstanz Metamitron, ein bekannter Photosynthesehemmer, mit den Mengen 50 ng, 125 ng und 250 ng aufgetragen worden. Alle in diesem Parallelassay aufgefallenenThe fluorescence image shows 22 bright spots (see Figure 1). The substances deposited there cause an increase in fluorescence due to their interaction with the photosystem. Metamitron, a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. All noticed in this parallel assay
Substanzen und in Tabelle 1 mit X gekennzeichneten Substanzen sind als Hemmstoffe des Photosystems II bekannt.Substances and substances marked with X in Table 1 are known as inhibitors of Photosystem II.
Beispiel 2Example 2
In Beispiel 2 wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der spezifische Nachweis photosynthesehemmender Substanzen mittels Phosphoreszenz in dem erfindungsgemäßen Schichtsystem gezeigt.In example 2, the specific detection of photosynthesis-inhibiting substances by means of phosphorescence in the layer system according to the invention is shown by the method according to the invention.
Die Algenschicht wurde analog Beispiel 1 hergestellt. Es wurden die gleichen Testsubstanzen wie in Beispiel 1 und in identischer Positionierung auf die Algenschicht aufgebracht. Die Inkubation erfolgte ebenfalls für 15 Minuten.The algae layer was produced as in Example 1. The same test substances as in Example 1 and in identical positioning were applied to the algal layer. The incubation was also carried out for 15 minutes.
Parallele Detektion der Wirkung durch Phosphoreszenzimaging:Parallel detection of the effect by phosphorescence imaging:
Zur Aufnahme des Phosphoreszenz-Bildes wurde ein Videoimaging System (Molecular Light Imager NightOWL von PerkinElmer Life Sciences) eingesetzt. Für die Messung wurde die NUNC-Platte auf einen Leuchttisch plaziert, der mit einer Weißlichtquelle ausgerüstet war. Zur Erfassung des Phosphoreszenzlichts wurden keine Filter vor dem Kameraobjektiv eingesetzt. Zur Phosphoreszenzanregung wurde die Algenschicht für 90 Sekunden belichtet. Nach einer Wartezeit von 15 Sekunden erfolgte die Kameraaufiiahme mit einer Aufhahmezeit von 30 Sekunden. Die Auswertung des Phosphoreszenzbildes erfolgte visuell am Bildschirm des Videoimagingsystems. Zur Dokumentation wurden TIFF-Files mit geeigneten Grafikprogrammen formatiert und beschriftet (Adobe Photoshop 5.0, MS PowerpointA video imaging system (Molecular Light Imager NightOWL from PerkinElmer Life Sciences) was used to record the phosphorescence image. For the measurement, the NUNC plate was placed on a light table that was equipped with a white light source. No filters were used in front of the camera lens to record the phosphorescent light. The algae layer was exposed for 90 seconds to stimulate phosphorescence. After a waiting time of 15 seconds, the camera was recorded with a recording time of 30 seconds. The phosphorescence image was evaluated visually on the screen of the video imaging system. For documentation purposes, TIFF files were formatted and labeled with suitable graphics programs (Adobe Photoshop 5.0, MS Powerpoint
97).97).
Ergebnisse:Results:
Das Phosphoreszenz-Image zeigt 22 dunkle Spots (siehe Figur 2). Die dort deponierten Substanzen bewirken auf Grund ihrer Wechselwirkung mit dem Photosystem ein rascheres Abklingen der Phosphoreszenz. Auf den Positionen F12,G12, H12 war als Referenzsubstanz Metamitron, ein bekannter Photosynthesehemmer, mit den Mengen 50 ng, 125 ng und 250 ng aufgetragen worden. Die Resultate stimmen gut mit den Ergebnissen des Fluoreszenzimagings überein (siehe auch Beispiel 1). Alle in diesem Parallelassay aufgefallenen Substanzen sind als Hemmstoffe desThe phosphorescence image shows 22 dark spots (see Figure 2). The substances deposited there cause a faster decay of the phosphorescence due to their interaction with the photosystem. Metamitron, a known photosynthesis inhibitor, with the amounts 50 ng, 125 ng and 250 ng was applied to positions F12, G12, H12 as reference substance. The results are in good agreement with the results of fluorescence imaging (see also Example 1). All substances found in this parallel assay are inhibitors of the
Photosystems II bekannt. Photosystems II known.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend die Schritte1. A method for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of substances containing the steps
Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,Provision of cells or cell parts with an intact photosystem,
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht, Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht,Introducing the cells or the cell parts into a planar layer, applying the test substance onto the planar layer or into the planar layer,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht durch eine Anregungslichtquelle, Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor und - Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photo synthese-Excitation of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer by an excitation light source, measurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar layer with a detector and - assignment of the detector signal to the degree of photo synthesis
Hemmung.Inhibition.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen aus Algen, Mikroalgen, Cyanobakterien, anderen Bakterien mit einem Photo- synthesesystem, Pflanzenzellkulturen, Pflanzenhomogemsat, selektionierten2. The method according to claim 1, characterized in that the cells selected from algae, microalgae, cyanobacteria, other bacteria with a photosynthesis system, plant cell cultures, plant homogenate
Mutanten oder aus gentechnisch veränderten Organismen stammen.Mutants or come from genetically modified organisms.
3. Verfahren nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um avitale Zellen handelt, bei denen das Photosynthese U-System noch intakt ist.3. The method according spoke 1 or 2, characterized in that the cells are avital cells in which the photosynthetic U-system is still intact.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix der planaren Schicht bevorzugt aus Agarose oder Acrylat, oder anderen Gelbildnern oder anderen viskosen Medien besteht. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the matrix of the planar layer preferably consists of agarose or acrylate, or other gel formers or other viscous media.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Schicht eine Dicke im Bereich von 0,1 mm bis 10 mm hat.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the planar layer has a thickness in the range of 0.1 mm to 10 mm.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Einbringen der Zellen oder der Zellteile in die planare Schicht durch Einbettung von Grünalgen in Agarose erfolgt.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the cells or cell parts are introduced into the planar layer by embedding green algae in agarose.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht durch Pin-Tools, Spritzensysteme oder geeignete Drucktechniken in7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the application of the test substance to the planar layer or in the planar layer by pin tools, syringe systems or suitable printing techniques in
Form von Spots erfolgt.Form of spots takes place.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Lumineszenz um Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz handelt.8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the luminescence is fluorescence and / or phosphorescence.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle eine Weißlichtquelle oder aber eine Lichtquelle mit enger spektraler Verteilung (z.B. Leuchtdioden) darstellt und für die konti- nuierliche Anregung und/oder für Pulsmodulationstechniken eingesetzt wird.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the excitation light source is a white light source or a light source with a narrow spectral distribution (e.g. light emitting diodes) and is used for continuous excitation and / or for pulse modulation techniques.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtquelle Tageslicht ist.10. The method according to claim 9, characterized in that the excitation light source is daylight.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor auch in einem Wellenlängenbereich von > 680 nm empfindlich ist und bildgebende Eigenschaften hat.11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the detector is sensitive even in a wavelength range of> 680 nm and has imaging properties.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor z.B. ein Vidicon-System, eine CCD-Kamera, ein Scanner, ein12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that as a detector e.g. a Vidicon system, a CCD camera, a scanner, a
Phosphorimager oder ein photographischer Film eingesetzt wird. Phosphorimager or a photographic film is used.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zeitaufgelöste Lichtmessungen gegebenenfalls zusammen mit gepulster Anregung und Korrelation von Anregung und Messung durchgeführt werden.13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that time-resolved light measurements are optionally carried out together with pulsed excitation and correlation of excitation and measurement.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass unabhängig von der Anregungsbelichtung eine zusätzliche Belichtung oder eine Dunkelphase zur Steuerung der Photosyntheseaktivität eingesetzt wird.14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that an additional exposure or a dark phase is used to control the photosynthetic activity regardless of the excitation exposure.
15. Verfahren zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von15. Method for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of
Substanzen enthaltend die SchritteSubstances containing the steps
Bereitstellung von Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,Provision of cells or cell parts with an intact photosystem,
Bereitstellung einer Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektro- phoreseschicht oder eines anderen Trägers mit darauf deponiertenProvision of a thin layer chromatography plate or an electrophoresis layer or another support with deposited thereon
Substanzzonen,Substance zones
Einbringen der Zellen oder der Zellteile in eine planare Schicht,Placing the cells or cell parts in a planar layer,
Aufbringen der planaren Schicht mit den Zellen oder Zellteilen auf die bereitgestellte Dünnschichtchromatographieplatte oder Elektrophoreseschicht oder den anderen Träger,Applying the planar layer with the cells or cell parts to the provided thin-layer chromatography plate or electrophoresis layer or the other support,
Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planarenExcitation of the luminescence of the cells or of the cell parts in the planar
Schicht durch eine Anregungslichtquelle,Layer by an excitation light source,
Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planarenMeasurement of the luminescence of the cells or cell parts in the planar
Schicht mit einem Detektor und - Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.Layer with a detector and assignment of the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzzonen durch chromatographische oder elektrophoretische Trennung erzeugt worden sind. 16. The method according to claim 15, characterized in that the substance zones have been generated by chromatographic or electrophoretic separation.
17. System zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen, enthaltend17. System for detecting the photosynthesis-inhibiting effect of substances containing
eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem,a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem,
Mittel zum Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht oder auf einen Träger, der die planare Schicht trägt, Anregungslichtquelle zur Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht, - Detektor zur Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht,Means for applying the test substance on the planar layer or in the planar layer or on a carrier which carries the planar layer, excitation light source for exciting the luminescence of the cells or the cell parts in the planar layer, - detector for measuring the luminescence of the cells or the Cell parts in the planar layer,
Auswertemittel zur Zuordnung des Detektorsignals zum Grad der Photosynthese-Hemmung.Evaluation means for assigning the detector signal to the degree of photosynthesis inhibition.
18. System nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum18. System according to claim 17, characterized in that the means for
Aufbringen der Prüfsubstanz auf die planare Schicht oder in die planare Schicht oder auf den Träger der planaren Schicht ein Spritzensystem, ein Pin- Tool oder ein geeigneter Drackstempel sowie ein Jet-System sein kann.Applying the test substance onto the planar layer or into the planar layer or onto the carrier of the planar layer can be a syringe system, a pin tool or a suitable drain stamp and a jet system.
19. System nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Detektor z.B. ein Vidicon-System, eine CCD-Kamera, ein Scanner, ein Phosphor- imager oder ein photographischer Film eingesetzt wird.19. System according to claim 17 or 18, characterized in that as a detector e.g. a Vidicon system, a CCD camera, a scanner, a phosphor imager or a photographic film is used.
20. System nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung mittels Bildverarbeitung oder visuell erfolgt.20. System according to one of claims 17 to 19, characterized in that the evaluation is carried out by means of image processing or visually.
21. System nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Träger für die planare Schicht eine Dünnschichtchromatographieplatte oder einer Elektrophoreseschicht mit darauf deponierten Substanzzonen ist. 21. System according to one of claims 17 to 20, characterized in that the carrier for the planar layer is a thin layer chromatography plate or an electrophoresis layer with substance zones deposited thereon.
22. Teststreifen oder Sensor-Chip zum Nachweis der Photosynthese-hemmenden Wirkung von Substanzen enthaltend eine planare Schicht mit Zellen oder Zellteilen mit einem intakten Photosystem, wobei nach dem Aufbringen der Prüfsubstanz auf den Teststreifen oder Sensor-Chip, und nachfolgender Anregung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren22. Test strip or sensor chip for the detection of the photosynthesis-inhibiting effect of substances containing a planar layer with cells or cell parts with an intact photosystem, after the application of the test substance to the test strip or sensor chip and subsequent excitation of the luminescence of the cells or the cell parts in the planar
Schicht durch eine Anregungslichtquelle, und Messung der Lumineszenz der Zellen oder der Zellteile in der planaren Schicht mit einem Detektor, aus dem Detektorsignal der Grad der Photosynthese-Hemmung der Prüfsubstanz bestimmbar ist.Layer by an excitation light source, and measurement of the luminescence of the cells or the cell parts in the planar layer with a detector, from the detector signal, the degree of photosynthesis inhibition of the test substance can be determined.
23.' Teststreifen oder Sensor-Chips nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die planare Schicht des Teststreifen oder Sensor-Chips aus Grünalgen in Agarose- oder Acrylatgelen oder anderen Gelmatrices oder viskosen Lösungen besteht.23. ' Test strip or sensor chip according to claim 22, characterized in that the planar layer of the test strip or sensor chip consists of green algae in agarose or acrylate gels or other gel matrices or viscous solutions.
24. Teststreifen oder Sensor-Chips nach Ansprach 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um avitale Zellen handelt, bei denen das Photosynthese II-System noch intakt ist. 24. Test strips or sensor chips according to spoke 22 or 23, characterized in that the cells are avital cells in which the photosynthesis II system is still intact.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1698885A4 (en) * 2003-12-19 2012-11-14 Hamamatsu Photonics Kk Harmful substance evaluating method and harmful substance evaluation kit
DE102004027118B4 (en) * 2004-06-03 2006-05-11 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for detecting the photocatalytic degradation of organic dyes by fluorescence analysis
US8821431B2 (en) * 2007-09-07 2014-09-02 Beta O2 Technologies Ltd. Air gap for supporting cells
US20100022393A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 Bertrand Vick Glyphosate applications in aquaculture
WO2010032242A1 (en) * 2008-09-17 2010-03-25 Beta O2 Technologies Ltd. Optimization of alginate encapsulation of islets for transplantation
US8940340B2 (en) * 2009-01-22 2015-01-27 Aurora Algae, Inc. Systems and methods for maintaining the dominance of Nannochloropsis in an algae cultivation system
US9187778B2 (en) 2009-05-04 2015-11-17 Aurora Algae, Inc. Efficient light harvesting
US20100325948A1 (en) * 2009-06-29 2010-12-30 Mehran Parsheh Systems, methods, and media for circulating and carbonating fluid in an algae cultivation pond
US8940520B2 (en) 2010-05-20 2015-01-27 Pond Biofuels Inc. Process for growing biomass by modulating inputs to reaction zone based on changes to exhaust supply
US11512278B2 (en) 2010-05-20 2022-11-29 Pond Technologies Inc. Biomass production
US8889400B2 (en) 2010-05-20 2014-11-18 Pond Biofuels Inc. Diluting exhaust gas being supplied to bioreactor
US20120156669A1 (en) 2010-05-20 2012-06-21 Pond Biofuels Inc. Biomass Production
US8969067B2 (en) 2010-05-20 2015-03-03 Pond Biofuels Inc. Process for growing biomass by modulating supply of gas to reaction zone
WO2011154941A2 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Beta-O2 Technologies Ltd. Multiple-layer immune barrier for donor cells
US20120276633A1 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Pond Biofuels Inc. Supplying treated exhaust gases for effecting growth of phototrophic biomass
US8752329B2 (en) 2011-04-29 2014-06-17 Aurora Algae, Inc. Optimization of circulation of fluid in an algae cultivation pond
WO2013166065A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Aurora Algae, Inc. ACP Promoter
US9534261B2 (en) 2012-10-24 2017-01-03 Pond Biofuels Inc. Recovering off-gas from photobioreactor
JP7193087B2 (en) * 2019-02-15 2022-12-20 国立研究開発法人国立環境研究所 Photosynthesis inhibitor contamination detection device and photosynthesis inhibitor contamination detection method

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0242225B1 (en) * 1986-04-16 1993-11-18 Water Research Centre Pollutant detector
DE4230264A1 (en) 1992-09-10 1994-03-17 Bayer Ag Analytical method for the investigation of mixtures for toxic components
FR2749389B1 (en) * 1996-06-03 1998-08-07 Arnatronic Plus BIOLOGICAL SENSOR AND WATER QUALITY MONITORING METHOD
US6060327A (en) * 1997-05-14 2000-05-09 Keensense, Inc. Molecular wire injection sensors
EP1027723B1 (en) * 1997-10-14 2009-06-17 Patterning Technologies Limited Method of forming an electric capacitor
AU5667599A (en) * 1998-07-27 2000-02-21 Ljl Biosystems, Inc. Apparatus and methods for time-resolved spectroscopic measurements
DE19915310A1 (en) * 1999-04-03 2000-10-05 Bayer Ag Diffusion-controlling sensor layer
DE19957638A1 (en) * 1999-11-30 2001-05-31 Merck Patent Gmbh Detecting antibiotics uses thin layer chromatography, a DC plate and bacterial cultures
IT1315854B1 (en) * 2000-03-03 2003-03-26 Consiglio Nazionale Ricerche PORTABLE SYSTEM FOR SELECTIVE ENVIRONMENTAL MONITORING OF POLLUTING HERBICIDES BASED ON THE APPLICATION OF A PHOTOSYSTEM BIOSENSOR

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03006684A3 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004533853A (en) 2004-11-11
DE10133273A1 (en) 2003-01-30
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US20080169431A1 (en) 2008-07-17

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